JP2004512825A - ポリオールからのポリヒドロキシルアルカノエートの生成 - Google Patents
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Abstract
Description
(関連出願に対する相互参照)
2000年7月21日出願の米国仮出願番号60/219,995号に対する優先権を主張する。
【0002】
(発明の背景)
本発明は、一般的には、細菌の遺伝子工学によるポリヒドロキシアルカノエート(PHA)の生成の分野にある。
【0003】
モノマー4−ヒドロキシブチレート(4HB)を含むPHAポリマー(例えば、ポリ(3−ヒドロキシブチレート−co−4−ヒドロキシブチレート(PHB4HB))(Doi、1995、Macromol.Symp.98:585〜99))の合成、または4−ヒドロキシバレレートと4−ヒドロキシヘキサノートとを含む、PHAポリエステルの合成が、例えば、Valentinら、1992、Appl.Microbiol.Biotechnol.36:507〜14およびValentinら、1994、Appl.Microbiol.Biotechnol.40:710〜16に記載されている。例えば、PHB4HBの生成は、グルコースと4HBとをか、またはグルコースと、4−ヒドロキシブチレートへと変換される基質とを、Ralstonia eutrophaへと(Kuniokaら、1988、Polym.Commun,29:174;Doiら、1990、Int.J.Biol.Macromol.12:106;Nakamuraら、1992、Macromolecules 25:423)、Alcaligenes latusへと(Hiramitsuら、1993、Biotechnol.Lett.15:461)、Pseudomonas acidovorans(Kimuraら、1992、Biotechnol.Lett.14:445)へと、およびComamonas acidovoransへと(SaitoおよびDoi、1994、Int.J.Biol.Macromol.16:18)供給することによって達成された。4HBへと変換される基質としては、1,4−ブタンジオール、1,6−ヘキサンジオール、1,8−オクタンジオール、1,10−デカンジオール、1,12−ドデカンジオールおよびγ−ブチロラクトンが挙げられる。これらのPHB4HBコポリマーは、一定範囲のポリマー特性を提供する、一定範囲のモノマー組成物を用いて生成され得る。特に、4HBの量が15重量%を超えると、融解温度(Tm)が130℃未満に減少し、そして分解するまでの伸長(elongation to break)が、400%を超える(Saitoら、1996、Polym.Int.39:169)。
【0004】
しかし、生物学的系によって、4HBを含むPHAを生成するための、より費用効果が高い方法を開発することが、非常に有利である。PHAの経済的な生成のために、いくつかの要因が、重要であり、その要因としては、基質の費用、発酵時間、および下流処理の効率が挙げられる。野生型PHA生成細菌の一般的特徴は、その増殖速度が低いこと、それらの細菌を破壊することがしばしば困難であること、および遺伝子操作に対するそれらの細菌の利用し易さが制限されていることである。従って、PHA生成の経済性を改善するトランスジェニック生物を開発することが、望ましい。
【0005】
組換えE.coliにおけるコポリマーPHB4HBの生成が、記載されている(例えば、HuismanらによるPCT WO 00/011188;HeinらによるPCT WO 98/39453)。組換えE.coliにおいて生成された、生物学的に生成された一定範囲の新規な4HBポリマーが、SkralyおよびPeoples(例えば、PCT WO 99/61624)によって記載されている。これらの研究において、参考文献Huismanのみが、1,4−ブタンジオールからの小量の4HBコモノマーの組み込みを示した。4HBモノマーの供給源として1,4−ブタンジオールを使用して、一定範囲の4HBコポリマーおよびポリ4HBホモポリマーを生成することができる遺伝子操作された系を開発することが、非常に有利である。
【0006】
従って、種々の単純な糖および単純なアルコールを基質として使用して、PHA(例えば、4HBモノマーを含むPHA)を生成するための改善された組換え系および方法を提供することが、本発明の1つの目的である。
【0007】
(発明の要旨)
PHAを生成するように遺伝子操作されたE.coli中にさらなる遺伝子を導入して、その改良菌株が、ジオールから直接PHAホモポリマーおよびPHAコポリマーを生成するようにする、組換えプロセスが、提供される。好ましい実施形態において、4−ヒドロキシブチレート(4HB)モノマーを含むPHAが、1,4−ブタンジオールから直接生成され;5−ヒドロキシバレレート(6HV)を含むPHAが、1,5−ペンタンジオールから生成され;6−ヒドロキシヘキサノエート(6HH)を含むPHAが、1,6−ヘキサンジオールから生成され;3−ヒドロキシプロピオネート(3HP)を含むPHAが、1,3−プロパンジオール(プロピレングリコールともいう)から生成され;2−ヒドロキシプロピオネート(2HP、ラクテート)を含むPHAが、1,2−プロパンジオール(プロピレングリコール)から生成され;2−ヒドロキシエタノエート(2HE、グリコレート)を含むPHAが、1,2−エタンジオール(エチレングリコール)から生成される。これらの同じ酵素活性をコードする遺伝子が野生型PHA生成株に導入されるか、またはその遺伝子の発現が野生型PHA生成株において増幅されて、ジオールおよび他のアルコール供給原料から直接PHAホモポリマーおよびPHAコポリマーを生成することが、改善され得る。このPHAポリマーは、容易に回収され、そしてポリマーとしてか、または一定範囲の化学物質中間体のための出発物質として、産業上有用である。
【0008】
(発明の簡単な説明)
PHAを生成するように遺伝子操作された微生物中にさらなる遺伝子を導入して、その改良菌株が、単純なアルコール基質および単純な糖基質から直接、PHAホモポリマーおよびPHAコポリマーを生成するようにする、プロセスが提供される。これらのプロセスは、生成生物として組換え細菌(例えば、Escherichia coli)に、そしてPHA生成微生物(例えば、Ralstonia eutrophaまたはAlcaligenes latus)由来のPHA生合成遺伝子に基づくが、今や、他の多くのPHA遺伝子供給源が公知である(MadisonおよびHuisman、1999、Microbiol.& Molecular Biology Reviews 63:21〜53)。組換えE.coliは、野生型PHA生成生物を超える多くの利点を有し、その利点としては、遺伝子操作の容易さ、ゲノム配列を完全に利用できること、速い増殖速度、増殖基質の自由度および溶菌のし易さが、挙げられる。
【0009】
(操作される生物)
1つの実施形態において、図1に示される経路全体についての遺伝子が、生成生物中に導入される。天然にてPHAを生成しないすべての生物(例えば、Escherichia coli)が、使用され得る。多数の組換えE.coli PHB生成系が、記載されている(MadisonおよびHuisman、1999、Microbiology & Molecular Biology Reviews 63:21〜53)。ジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子およびアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、この宿主中に導入される。1,4−ブタンジオールの場合、そのジオールオキシドレダクターゼが、この基質を4−ヒドロキシブチルアルデヒドへと変換し、その後これが、アルデヒドデヒドロゲナーゼによって4−ヒドロキシブチレートへと変換される。1,3−プロパンジオールの場合、そのジオールオキシドレダクターゼが、この基質を3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへと変換し、その後これが、アルデヒドデヒドロゲナーゼによって3−ヒドロキシプロピオネートへと変換される。他のジオールも、同様の様式で処理され得る。いくつかの場合において、そのジオール供給原料よりも炭素が2つ短いヒドロキシ酸をPHAに組み込むことが、生じ得る。これは、脂肪酸異化のβ酸化経路と似た内因性異化に起因する。例えば、4HB単位、または4HB単位と6HH単位の両方が、1,6−ヘキサンジオールを供給した結果として、ポリマー中で生成され得る。必要に応じて、内因性アシル−CoAトランスフェラーゼまたは内因性アシル−CoAシンテターゼが、補酵素Aによるヒドロキシ酸の活性化を促進するように含められ得る。その後、活性化したモノマーは、生成宿主中に存在する適切なPHAシンターゼの作用によって、PHA中に組み込まれ得る。この酵素活性は、1つ以上のモノマー型を含むポリマーの生成宿主における合成系を提供し、そのモノマー型は、ジオール供給原料に依存する。
【0010】
しばしば、上記のようなモノマーと3HBとを含む、コポリマーを合成することが、非常に有用である。この場合、その生成宿主は、β−ケトチオラーゼ遺伝子およびアセトアセチル−CoAレダクターゼ遺伝子もまた含み、これらの遺伝子の生成物は、アセチル−CoAを3HB−CoAへと変換する。アセチル−CoAは、ジオールに由来し得るし、または別の炭素供給源(例えば、糖)に由来し得る。3HB−CoAとヒドロキシアシル−CoA(例えば、上記のもの)との両方が、種々のPHAシンターゼ(例えば、その組換え宿主において発現されるもの)によって受容され得、従って、PHBのコポリマーが、その組換え宿主によって合成される。所望のPHA組成物が何であっても、そのジオールは、増殖の間にかまたは個々の増殖相の後のいずれかにて、単独にかまたは少なくとも1つの他の供給原料(例えば、糖)と組み合わせてかのいずれかで細胞に供給され得、そしてPHAが、その細胞中に蓄積される。
【0011】
別の実施形態において、図1に示される経路のうちの少なくとも一部を天然にて含む組換え生物が、使用され得る。この実施形態において、上記の活性(ジオールオキシドレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−CoAトランスフェラーゼまたはアシル−CoAシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、PHAシンターゼ、およびアセトアセチル−CoAレダクターゼ)のうちの1つ以上が、その宿主の内因性機構に由来し得る。例えば、ジオールオキシドレダクターゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼのみが、R.eutropha(天然のPHA生成生物)において発現されて、そのR.eutrophaが1,4−ブタンジオールを4HBへと変換する能力を増強し得、そしてこの宿主が、必要な代謝段階の残りを達成する天然の能力が、頼みにされ得る。天然の多くのPHA生成生物が、当業者に周知である(Brauneggら、1998、J.Biotechnology 65:127〜61)。その宿主がPHAを生成することができない場合、PHAシンターゼまたはPHB生合成経路全体と、必要に応じて外因性アシル−CoAトランスフェラーゼまたは外因性アシル−CoAシンテターゼとが導入され、この生物がPHA生成することができるようなり得る。これを行うための技術は、当該分野において周知である(例えば、Dennisら、1998、J.Biotechnology 64:177〜86)。ここでまた、そのジオールは、増殖の間にかまたは個々の増殖相の後のいずれかに、単独でかまたは少なくとも1つの他の供給原料(例えば、糖)と組み合わせてかのいずれかで細胞に供給され得、そしてPHAがその細胞中に蓄積される。
【0012】
ジオール供給原料を用いるPHA生成を実施することは、本実施例において記載される細菌に限定されない。同じ遺伝子が、真核生物細胞(酵母細胞および培養植物細胞を含むが、これらに限定されない)中へと導入され得る。
【0013】
(基質の利用のための遺伝子)
本明細書中に記載の使用に適切な組換えPHA産生株を開発するための遺伝子および技術は、一般に、当業者に公知である(Madison & Huisman、1999、Microbiology and Molecular Biology Reviews、63:21−53;PCT WO99/14313)。ジオールおよび糖のような供給材料からPHA産生を行うために必要な遺伝子の全ては、クローニングされており、そして遺伝子操作可能な形態で入手可能であるので、プラスミドに保持された遺伝子および組み込まれた遺伝子の任意の組み合わせが使用され得、そして従って、この経路の実行は、本明細書中に概要が示されているスキームに限定されない。多くの異なる実行が、当業者に明らかである。
【0014】
1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(EC1.1.1.202)は、いくつかの種の細菌において見出される。しばしば、これは、グリセロール存在下の嫌気条件下で誘導される(Forage & Foster、1982、J.Bacteriol.149:413−419)。この酵素は、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドおよび他のヒドロキシアルデヒドが、対応するジオールから可逆的形成するのを触媒する。生理学的に、そのアルデヒドが、NADHを消費して電子受容体として必要とされる場合に、この酵素は、ジオール形成において主に使用されると考えられる(Johnson & Lin、J.Bacteriol.169:2050−54)。1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含む生物は、代表的に、グリセロールを1,3−プロパンジオールに変換し得るが、類似の活性が、他の生物において見出される。グリセロールを1,3−プロパンジオールに変換する能力が示されている細菌種としては、Klebsiella pneumoniae(Streekstraら、1987、Arch.Microbiol.147:268−75)、Klebsiella oxytoca(Homannら、1990、Appl.Microbiol.Biotechnol.33:121−26)、Klebsiella planticola(同書)およびCitrobacter freundii(Boenigkら、1993、Appl.Microbiol.Biotechnol.38:453−57)が挙げられるが、他の多くの例が、一般的に公知である。
【0015】
アルデヒドデヒドロゲナーゼは、生物学的系において極めて一般的である。相同性についてのE.coliゲノムデータベースの探索は、この生物が単独で、少なくとも7つのこのタイプの推定酵素を含むことを示す。これらは、非常に多くかつ多様であるので、これら全てを分類する試みでさえ複雑である(例えば、Vasiliouら、1999、Pharmacogenetics 9:421−34)。これらの酵素のタイプおよび生理学的役割の全ての考察は、本考察の範囲を超える。代謝工学における使用のための適切なアルデヒドデヒドロゲナーゼの選択は、いくつかの候補の基質特異性の評価後に行われるべきである。Baldoma & Aguilar(1987、J.Biol.Chem.262:13991−6)に記載のアッセイのような酵素アッセイが、このような診断に有用である。
【0016】
アシル−CoAトランスフェラーゼ(EC 2.8.3.x)およびアシル−CoAシンテターゼ(EC 6.2.1.x)の両方は、補酵素Aと有機酸とのチオエステルの形成を触媒する。アシル−CoAトランスフェラーゼ(例えば、OrfZ(HbcTとも呼ばれる)(SoehlingおよびGottschalk、1996、J.Bacteriol 178:871−80))は、ドナー(例えば、アセチル−CoA)から遊離の有機酸(例えば、脂肪酸)へCoA部分を転移する。アシル−CoAシンテターゼ(例えば、AlkK(van Beilenら、1992、Mol.Microbiol.6:3121−36)は、遊離の有機酸と遊離の補酵素Aを連結し、ATPから反応のためのエネルギーを誘導し、そしてAMPおよびピロリン酸を副生成物として生じる。
【0017】
(経路中の酵素の改善)
本明細書中に記載されるジオール−PHA経路における酵素の比活性または基質特異性を改善することは、有利であり得る。例えば、特定のジオールが、特定の生物において受容可能な速度でPHAへと変換されないかもしれない。この性質を改善することは、一般的に、変異誘発およびスクリーニングを包含し;改善されるべきDNA配列が、1回以上の変異誘発に供され、その後、なされた改善を評価される。
【0018】
当業者に公知な種々の方法(例えば、エラープローンPCRまたはカセット変異誘発、細菌変異誘発遺伝子株を通す継代、化学的変異原による処理)のいずれかを使用して、変異誘発が実施され得、そのような方法は、例えば、Cadwellら、1992、PCR Methods and Applications 2:28〜33;Ericksonら、1993、Appl.Environ.Microbiol.59:3858〜62;Hermesら、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:696〜700;Hoら、1989、Gene 77:51〜59;Kellogら、1981、Science 214:1133〜35;Reidhaar−Olsonら、19988、Science 241:53〜57;Stemmer、1994、Nature 370:389〜91;およびStemmer、1994、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747〜51に記載されるものである。
【0019】
改善されたジオール−PHA経路についてのスクリーニングは、上記のようにして生成された変異体の集団を、その経路に関連するいくつかの特性が改善した細胞を容易に選択し得るような様式で、培養する工程を包含する。1つの実施形態は、目的のジオールに対する増殖の改善についての選択である。特定のジオールの取り込みまたは利用が欠損した生物は、唯一の炭素源としてそのジオールを用いては十分に増殖しない。変異体のプールが、問題の生物の増殖に必要な他の全ての栄養素とともに、唯一の炭素源としてジオールを含む、液体培地中または寒天プレート上に、接種され得、そして増殖可能な細胞が、容易に単離され得る。別の実施形態は、そのジオールの存在下で培養された場合に、ポリマーを生成することができる細胞を選択することである。生物が、そのジオールを、後に重合され得るモノマー前駆体へと有意な速度で変換することができない場合、(添加されるすべての複合補充物(例えば、酵母抽出物)に含まれる炭素以外の)唯一の炭素原としてそのジオールを含む寒天上に、その生物をプレーティングすると、PHAをほとんど含まないかまたはPHA含量がない、細胞を生じる。そのようなプレート上の変異体のプールを培養することにより、そのジオールを重合可能な中間体へと変換する能力を得た株が、同定され得る。これらの細胞は、非PHA生成細胞よりも不透明でありかつ白色に見える。あるいは、別の炭素原(例えば、グルコース)が、スクリーニングされるべき細胞がその炭素原からポリマーを合成できない場合には、添加され得る。プレートはまた、そのプレートが存在する条件において増殖できない菌株を排除するために役立ち得;例えば、変異誘発を介して、ジオールからPHAを生成する能力を得たが産業上重要な特徴(例えば、最小グルコース培地上で増殖する能力)を失った細胞は、ジオールとグルコースとを含むプレート上では、特にその細胞がそのジオールを唯一の炭素原として増殖できない場合は、増殖しない。この場合はジオールからPHAを生成し得かつ最小グルコース上で増殖し得る細胞のみが、不透明なコロニーとして出現する。PHAは、細胞(特にプレート上の細胞)中に、未処理のコロニーの可視的スクリーニングより感度の良い方法(例えば、(例えば、Spiekermannら、1999、Arch Microbiol.171:73〜80におけるような)ナイルレッドによる染色)によって、可視化され得る。上記のような方法は、このジオール−PHA経路をさらに最適化するために、数回反復され得る。スクリーニング方法は、上記の局面によって例示されるが、これらの局面に限定されず、そして他の有用なスクリーニング手順が、当業者に明らかである。
【0020】
(発現の調節)
上記の実施形態のいずれかにおいて、ジオールオキシドレダクターゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼとの発現を制御することによってか、またはジオールの利用性を制御することによって、生成されるポリマーの組成を制御することが可能である。ジオールオキシドレダクターゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼとの活性が高いほど、その活性の結果として、別の要因(例えば、基質利用性またはこれらの下流の酵素活性)が制限的になるまで、活性化されたモノマーがより多く誘導される。種々の生物における遺伝子発現(従って酵素活性)を調節する方法は、当業者に周知である。培養される細胞に供給されるジオールの速度は、発酵および細胞培養における当業者に周知の種々の技術によって、制御され得る。
【0021】
いくつかの微生物の場合、これらの遺伝子のいくつかまたは全てが、宿主染色体に組み込まれ得、そしていくつかまたは全てが、プラスミドに提供され得る。いくつかの場合、適合性のプラスミド系(例えば、その経路のいくつかの段階が、1つのプラスミドにコードされ、そして他の段階が、第2のプラスミドにコードされる)が、使用され得る。これらの2つのアプローチの組み合わせもまた、使用され得る。
【0022】
(基質)
上記に考察されるように、本明細書中に記載の系の状況下でPHAを生成するために使用され得る基質としては、アルコール、好ましくは、ジオールが挙げられる。適切なジオールの例としては、1,6−ヘキサンジオール、1,5−ペンタンジオール、1,4−ブタンジオール、1,3−プロパンジオール、1,2−エタンジオールおよび1,2−プロパンジオールが挙げられる。
【0023】
これらのジオールは、多くの場合において、高濃度においてさえ、多くの微生物に対して非毒性である。これらは、有機酸(これらは、しばしば、多くの微生物に対して低濃度で毒性となる)と比較して、発酵のための優れた供給材料であり得る。多くのジオールは、容易に入手可能であり、比較的安価である。例えば、1,4−ブタンジオールは、1995年に約10億ポンドの世界的需要があった。そしてこれは、そして合成ポリマー生産に非常に広範に使用されている(Morgan、Chemistry & Industry、3 March 1997、166−8頁)。
【0024】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、さらに理解される。
【0025】
(実施例1:Escherichia coli AldHの酵素アッセイ)
他のアルデヒドデヒドロゲナーゼとのその相同性に基づいて、aldH遺伝子を、E.coliゲノムからのPCRによってクローン化した。プラスミドpMS33は、trcプロモーターの制御下にあるaldHを含む。E.coli DH5αを、ネガティブコントロールとしてpMS33またはpFS14を用いて形質転換した。プラスミドpFS14は、SohlingおよびGottschalk(1996,J.Bacteriol.178:871−80)に記載されるように、Clostridium kluyveri 4hbD(4HBデヒドロゲナーゼ)遺伝子を含む。
【0026】
DH5α/pMS33およびDH5α/pFS14を、37℃にて、Luria−Bertani(LB;Difco;Detroit,Mich.)ブロス中で振盪しながら、0.5の吸光度(600nm)まで増殖させ、そして引き続いて、1mMイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いて誘導した。インキュベーションを3時間続けた後、細胞を遠心分離(2000g、10分)によって培地から取り出し、0.1M Tris(pH8.0)で洗浄し、再度、再度遠心分離し、そして細胞ペレットのサイズにほぼ等しい容量の0.1M Tris(pH8.0)中に再懸濁した。各サンプルを、3mLのアリコートのマイクロチップを用いて、氷上で2分間(各々、1秒間隔の70%サイクルで)超音波処理した(XLソニケーター、Heat Systems−Ultrasonics,Inc.,Farmingdale,NY)。溶解物を、14,000gにて10分間マイクロ遠心分離でスピンし、そして上清を、収集し、そして粗細胞抽出物と命名した。
【0027】
酵素アッセイを、100mM ナトリウムグリシン(pH9.5)、1mM 3−ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3HPA)、1mM NAD+またはNADP+、6mM ジチオスレイトール(DTT)、および20〜100μgの総タンパク質を含む一定容量の粗細胞抽出物を含む、1mLの総容量で行った。ベースラインを、3HPAを添加する(このことにより反応を開始する)前に確立した。DH5α/pFS14抽出物により得られた活性は、NAD+を用いた場合、0.00U/mg、およびNADP+を用いた場合0.03U/mgであった。DH5α/pMS33抽出物により得られた活性は、NAD+を用いた場合、1.89U/mg、およびNADP+を用いた場合0.32U/mgであった。従って、E.coli AldHタンパク質を発現する細胞は、補助因子として、NAD+またはNADP+のいずれかを用いて、3HPAを3−ヒドロキシプロピオン酸へと転換する能力を得る。
【0028】
(pFS14の構築)
4hbD遺伝子を、テンプレートとして、プラスミドpCK3(SohlingおよびGottschalk,1996,J.Bacteriol.178:871−80)を用いるPCRによりクローン化した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた:
【0029】
【化1】
得られたPCR産物をEcoRIおよびSacIを用いて消化し、そしてプラスミドpTrcN(これは、同じ酵素を用いて消化されている)に連結した。pTrcNは、pTrc99a(Pharmacia;Uppsala,Sweden)の誘導体であり;pTrcNを区別する改変は、NcoIを用いる消化、T4 DNAポリメラーゼを用いる処理、および自己連結による、NcoI制限部位の除去である。
【0030】
(pMS33の構築)
他のアルデヒドデヒドロゲナーゼとのその相同性に基づいて、aldH遺伝子を以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてE.coliゲノムからPCRによりクローン化した:
【0031】
【化2】
得られたPCR産物をAcc65IおよびNotIを用いて消化し、そしてpSE380(Invitrogen;Carlsbad,CA)(これは、同じ酵素を用いて消化されている)に連結して、pMS33を形成した。
【0032】
(実施例2:唯一の炭素供給源として1,4−ブタンジオールを用いる、Ecoliの増殖)
E.coli株LS5218(株CGSC6966として、Yale E.coli Genetic Stock Center,New Haven,Conn.から入手した)を、2つのプラスミド(pFS76またはpFS77)のいずれかを用いて形質転換した。pFS76は、Valentinら(1995,Eur.J.Biochem.227:43−60)に記載されるように、Ralstonia eutropha由来の4HBデヒドロゲナーゼ(gbd)遺伝子を含む。プラスミドpFS77は、単一のオペロンに配置された、gbd遺伝子、ならびにE.coliアルデヒドデヒドロゲナーゼ(aldH)遺伝子、およびKlebsiella pneumoniae 1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)遺伝子を含む。両方のプラスミドは、遺伝子の転写のためのtrcプロモーターを含む。
【0033】
LS5218/pFS76およびLS5218/pFS77を、4HB(ナトリウム塩として、4−ヒドロキシブチレート)または1,4−ブタンジオールのいずれかを5g/L含む、最少培地プレート上に画線した。このプレート培地はまた、1リットルあたり以下のものを含んでいた:15g寒天;1mmol MgSO4;10mgチアミン;25.5mmol Na2HPO4;33.3mmol K2HPO4;27.2mmol KH2PO4;2.78mg FeSO4・7H2O;1.98mg MnCl2・4H2O;2.81mg CoSO4・7H2O;0.17mg CuCl2・2H2O;1.67mg CaCl2・2H2O;0.29mg ZnSO4・7H2O;100μgアンピシリン;および0.1mmol IPTG。これらのプレートを37℃で一晩インキュベートした。両方の株を、4HBプレートで増殖したが、LS5218/pFS77のみが、1,4−ブタノールプレート上で増殖した。従って、gbd遺伝子、aldH遺伝子、およびdhaT遺伝子からなる経路が、唯一の炭素供給源として、1,4−ブタンジオールを用いるE.coli LS5218の増殖に十分であることが示された。
【0034】
(pFS76の構築)
gbd遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、R.eutropha H16(株ATCC17699として、American Type Culture Collection,Rockville,Md.,から入手した)のゲノムからPCRにより増幅した:
【0035】
【化3】
得られたPCR産物をEcoRIおよびSacIを用いて消化し、そしてpSE380(Invitrogen;Carlsbad,CA)(これは、同じ酵素を用いて消化されている)に連結して、pFS76を形成した。
【0036】
(pFS77の構築)
aldH−dhaT領域を、NheIおよびHindIIIを用いる消化により、pMS59から取り出した。プラスミドpFS76を、SpeIおよびHindIIIを用いて消化した。NheIおよびSpeIは、適合性の接着末端を形成する。pMS59由来のaldH−dhaTフラグメントおよびpFS76の大きなフラグメントを、共に連結してpFS77を得た。pFS77は、gbd遺伝子、aldH遺伝子、およびdhaT遺伝子(全ての遺伝子がtrcプロモーターの制御下にある)を含んでいた。
【0037】
(実施例3:1,4−ブタンジオールからのポリ(4HB)の生成)
Esherichia coli株LS5218(CGSC6966)を、2つのプラスミド(pFS30またはpMS60)のいずれかを用いて形質転換した。pFS30は、Ralstonia eutropha PHAシンターゼ(phaC)遺伝子およびClostridium kluyveri 4HB−CoAトランスフェラーゼ(hbcT)遺伝子(両方ともtrcプロモーターの制御下にある)を含む。pMS60は、aldH遺伝子およびdhaT遺伝子に加えて、pFS30の2つの遺伝子(全ての遺伝子がtrcプロモーターの制御下にある)を含む。この実験の目的は、aldH遺伝子およびdhaT遺伝子の添加が、PHAポリマーにおける1,4−ブタンジオールの4HBへの転換に役立つか否かを決定することであった。
【0038】
各株を、100μg/mLのアンピシリンを補充したLBブロス中で、37℃にて一晩、250rpmで振盪しながら増殖させた。次いで、細胞を、遠心分離(2000g、10分)により培地から取出し、そして1リットルあたり以下のものを含む培地の100mLに再懸濁した:2.5g LB粉末;50mmolリン酸カルシウム、pH7.0;2g グルコース;5g 1,4−ブタンジオール;100μgアンピシリン;および0.1mmol IPTG。これらのインキュベーションは、30℃にて250rpmで振盪しながら、25時間であった。フラスコの容量の4分の1に由来する細胞を、上記のように遠心分離し、水で洗浄し、再び遠心分離し、そして凍結乾燥した。各フラスコに由来する凍結乾燥した細胞集団の約20mgを同時抽出、および(容量で)90%1−ブタノールおよび10%濃塩酸を含む混合物の2mL(内部標準として添加した2mg/mLの安息香酸を有する)中で、110℃にて3時間のブタノール分解に供した。得られた混合物の水溶性成分を、3mLの水を用いる抽出により取出した。有機相(2mL/分の総流速にて1:50の分割比で1μL)を、以下の温度プロフィール:80℃、2分;10℃/1分、250℃まで;250℃、2分を用いてSPB−1石英ガラスキャピラリーGCカラム(30m;0.32mm ID;0.25μmフィルム;Supelco;Bellefonte,PA)で分析した。ポリマー中の4−ヒドロキシブチレート単位の存在について試験するために用いた標準は、γ−ブチロラクトン(Aldrich Chemical Co.;Milwaukee,WI)であった。
【0039】
株LS5218/pFS30は、3.9の吸光度(600nm)に達し、そして乾燥細胞重量の3.3%までポリ−4HBを蓄積したが、株LS5218/pMS60は、6.5の吸光度(600nm)に達し、そして乾燥細胞重量の12.3%までポリ−4HBを蓄積した。従って、aldH遺伝子およびdhaT遺伝子の発現は、E.coli LS5218の、1,4−ブタンジオールからポリ−4HBを合成する能力を増大させるのに十分である。
【0040】
(pFS16の構築)
Clostridium kluyveri orfZ(hbcTともよばれる)PCR産物をpTrcNに連結することにより、プラスミドpFS16を構築した。このorfZ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてプラスミドpCK3からPCRにより増幅した(SohlingおよびGottschalk,1996,J.Bacteriol.178:871−80):
【0041】
【化4】
得られたPCR産物をAvrIIおよびSalIで消化し、XbaI(これは、AvrIIと適合する)およびSalIで消化したpTrcNに連結して、pFS16を形成した。
【0042】
(pSF30の構築)
Ralstonia eutropha PHAシンターゼ(phaC)遺伝子を付加することにより、pFS16からプラスミドpFS30を得た。プラスミドpAeT414を、R.eutrophaプロモーターおよび構造性phaC遺伝子が1つのフラグメントに存在するように、XmaIおよびStuIで消化した。pFS16をBamHIで切断し、T4 DNAポリメラーゼで処理して、平滑末端を作製し、次いでXmaIで消化した。このようにして得た2つのDNAフラグメントをともに連結して、pFS30を形成した。
【0043】
(pMS59の構築)
SpeIおよびBglIIで消化することにより、pMS33からaldH遺伝子を除去した。プラスミドpTC42(Skralyら、1998,Appl.Environ.Microbiol.64:98−105)(これは、trcプロモーターの制御下にあるKlebsiella pneumoniae dhaT遺伝子を含む)を、NheIおよびBglIIで消化した。SpeIおよびNheIは、適合性の粘着末端を生成する。pMS33のaldH含有フラグメントおよびpTC42の大きなフラグメントをともに連結して、pMS59を形成した。
【0044】
(pMS60の構築)
aldH−dhaT領域を、SpeIで消化し、続いてDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントで処理し、続いてMfeIで消化することにより、pMS59から単離した。このフラグメントは、1つの平滑末端と1つの粘着末端を有し、EcoRIが生成する粘着末端と適合する。pFS30をXmaIで消化し、続いて、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントで処理し、続いてEcoRIで消化した。pFS30の大きなフラグメントおよびpMS59のaldH−dhaT含有フラグメントをともに連結して、pMS60を得た。
【0045】
(実施例4:グルコースおよび1,4−ブタンジオールからのポリ(3HB−コ−4HB)の合成)
E.coli株MBX1493は、ポリ(3HB−コ−4HB)生成株であり、その染色体に、C.kluyveri orfZ(hbcTともよばれる)遺伝子(SohlingおよびGottschalk,1996,J.Bacteriol.178:871−80)が組み込まれている。この株は、MBX1335(PHB生成株であり、その染色体にphaA、phaBおよびphaC遺伝子が組み込まれている)から生成された。MBX1335は、それ自体、株LS5218にphaA、phaBおよびphaC遺伝子のバクテリオファージP1での形質導入によるMBX820(MetabolixによるPCT WO00/011188を参照のこと)から得られた。
【0046】
株MBX1493を、別々の手順を用いて以下の4つのプラスミドで形質転換した:pTrcN、pTC42、pMS33およびpMS59。これらのプラスミドは、それぞれ、trcプロモーターの制御下にある以下の遺伝子を含む:なし、dhaTのみ、aldHのみ、aldHおよびdhaT両方。これらの株の各々を、100μg/mLのアンピシリンを補充した3mLのLB中で、37℃で振盪しながら一晩増殖させた。これらの培養物各1mLの容量を、1Lあたり以下を含む培地50mLへの接種物として用いた:1mmolのMgSO4;10mgのチアミン;25.5mmolのNa2HPO4;33.3mmolのK2HPO4;27.2mmolのKH2PO4;2.78mgのFeSO4・7H2O;1.98mgのMnCl2・4H2O;2.81mgのCoSO4・7H2O;0.17mgのCuCl2・2H2O;1.67mgのCaCl2・2H2O;0.29mgのZnSO4・7H2O;10gのグルコース;5gの4−ヒドロキシブチレートまたは10gの1,4−ブタンジオール;100μgのアンピシリン;25μgのクロラムフェニコール;および0.01mmolのIPTG。これらの培養物を、250rpmで30℃で88時間振盪しながらインキュベートした。細胞を遠心分離(2000g,10分間)により、この培地から除去し、これらを凍結乾燥し、PHA含有量およびGC組成について分析した。表1は、これらの株により生成されたポリマーの組成およびこの培養物の最終的な光学密度(600nm)を示す。
【0047】
表1に示されるように、4HBを供給された場合、全ての株が有意な%の4HBを有するコポリマーを生成する。しかし、1,4−ブタンジオールを供給した場合、pMS59含有細胞(すなわち、aldHとdhaTの両方を発現する細胞)のみが、ポリマーへの有意なレベルの4HB取り込みを達成した。従って、aldH−dhaT経路により、1,4−ブタンジオールから4HBへの変換が可能になるが、細胞の状態(cell health)も、4HBのPHAへの引き続く取り込みも有意には妨げないことが示された。
【0048】
【表1】
(実施例5:1,3−プロパンジオールからのポリ(3HP)の生成)
Escherichia coli株LS5218(CGSC 6966)を、2つのプラスミド(pFS30またはpMS60)のいずれかで形質転換した。この実験の目的は、aldH遺伝子およびdhaT遺伝子の付加が1,3−プロパンジオールの3HPへの変換に有益か否かを決定することである。
【0049】
各株を、100μg/mLアンピシリンを補充したLBブロス中、250rpmで振盪しながら37℃で一晩増殖させた。次いで、この細胞を遠心分離(2000rpm、10分)により培地から除去し、1Lあたり以下を含有する培地50mLに再懸濁した:2.5gのLB粉末;50mmolのリン酸カリウム(pH7.0);5gのグルコース;0gまたは10gの1,3−プロパンジオール;100μgのアンピシリン;および0.1mmolのIPTG。これらのインキュベーションは、250rpmで25時間振盪しながら30℃であった。これらの細胞を、上記のように遠心分離により培地から除去し、水で洗浄し、再び遠心分離し、凍結乾燥し、PHA含有量およびGC組成について分析した。ポリマー中の3−ヒドロキシプロピオネートユニットの存在について試験するために用いた標準物質は、β−プロピオラクトン(ALdrich Chemical Co.;Milwaukee,WI)であった。
【0050】
1,3−プロパンジオール添加なしのフラスコ中では、PHP形成は検出されなかった;株LS5218/pFS30およびLS5218/pMS60は、それぞれ、4.6および8.2の光学密度(600nm)に達した。1,3−プロパンジオールを添加したフラスコ中では、株LS5218/pFS30は5.2の光学密度(600nm)に達し、検出可能なレベルまでポリ−3HPを蓄積しなかったが、株LS5218/pMS60は、6.6の光学密度(600nm)に足し、乾燥細胞重量の5.0%までポリ−3HPを蓄積した。従って、aldH遺伝子およびdhaT遺伝子の発現は、E.coli LS5218が1,3−プロパンジオールからポリ−3HPを合成する能力を増大させるに十分である。
【0051】
(実施例6:グルコースおよび1,3−プロパンジオールからのポリ(3−HB−コ−3HP)の合成)
株MBX1493を別々の手順で以下の4つのプラスミドで形質転換した:pTrcN、pTC42、pMS33およびpMS59。これらの株の各々を、100μg/mLのアンピシリンを補充した100mLのLB中で、37℃で一晩振盪しながら増殖させた。これらの細胞を各フラスコからデカントし、残りの液体を維持した、次いで、各フラスコに、1Lあたり以下を含む培地80mLを添加した:6.25gのLB粉末;1mmolのMgSO4;10mgのチアミン;25.5mmolのNa2HPO4;33.3nmolのK2HPO4;27.2mmolのKH2PO4;2.78mgのFeSO4・7H2O;1.98mgのMnCl2・4H2O;2.81mgのCoSO4・7H2O;0.17mgのCuCl2・2H2O;1.67mgのCaCl2・2H2O;0.29mgのZnSO4・7H2O;10gのグルコース;100μgのアンピシリン;25μgのクロラムフェニコール;および0.01mmolのIPTG。これらの培養物を、250rpmで7時間振盪しながら37℃でインキュベートした。次いで、この培地において、LBが12.5g/Lに増加し、グルコースが100g/Lに増加し、IPTGが0.25mMに増加し、1,3−プロパンジオールが50g/Lで添加された以外は、上記と同じ培地20mLを各フラスコに添加した。従って、この段階で添加した最終濃度は、2.5g/LのLB、20g/Lのグルコース、10g/Lの1,3−プロパンジオール、および0.05mMのIPTGであった。これらのフラスコを、250rpmで振盪しながら24時間30℃でインキュベートした。次いで、細胞を、遠心分離(2000g,10分間)によりこの培地から除去し、これらを凍結乾燥し、PHA含有量およびGC組成について分析した。表2は、これらの株により生成されたポリマーの組成およびこの培養物の最終的な光学密度(600nm)を示す。
【0052】
1,3−プロパンジオールの非存在下では、各株は、PHBのみを合成した。1,3−プロパンジオールが供給された場合、pMS59含有細胞(すなわち、aldHとdhaTの両方を発現する細胞)のみが、ポリマーへの有意なレベルの3HPの取り込みを達成した。pMS33、またはaldH単独を含む細胞は、3HP取り込みを達成したが、ごくわずかであった。従って、aldH−dhaT経路により、1,3−プロパンジオールから3HPへの変換が可能になることが示された。dhaT遺伝子(pTC42およびpMS59)を含む細胞は、1,3−プロパンジオールが存在する場合に、全体としてあまり多くのポリマーを作らず、このことは、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの毒性に起因する可能性が最も高い。aldH 対 dhaTの発現の比が増大および/または1,3−プロパンジオール濃度が減少すると、この現象は抑えられるはずである。
【0053】
【表2】
(実施例7:1,4−ブタンジオールからのポリ(4HB)合成のための、アシル−CoAシンテターゼの使用)
Tn10由来のテトラサイクリン耐性マーカーと共に、オペロンとしてその染色体中に組み込まれたaldH遺伝子およびdhaH遺伝子を有する株MBX1668を、2つのプラスミド(pFS73またはpMS92)のいずれかで形質転換した。プラスミドpFS73は、アンピシリン耐性マーカーがpACYC177(GenBank登録番号X06402)由来のカナマイシン耐性マーカーで置換されている点を除いて、先の実施例に記載されたpFS30と同じである。プラスミドpMS92は、pFS73に由来し、そのorfZ遺伝子は、Pseudomonas oleovorans由来のalkK遺伝子で置換されている(van Beilenら、1992、Mol.Microbiol.6:3121−36)。これらの株の各々を、50μg/mLのカナマイシンおよび10μg/mLのテトラサイクリンを補充した3mLのLB中で、37℃で一晩振とうしながら増殖させた。1ミリリットルの各培養物を、200mLの角瓶に接種材料として添加した。各瓶は、1リットルあたり、0.1gのカザミノ酸;5mmolのMgSO4;10mgのチアミン;25.5mmolのNa2HPO4;33.3mmolのK2HPO4;27.2mmolのKH2PO4;2.78mgのFeSO4・7H2O;1.98mgのMnCl2・4H2O;2.81mgのCoSO4・7H2O;0.17mgのCuCl2・2H2O;1.67mgのCaCl2・2H2O;0.29mgのZnSO4・7H2O;10gのグルコース;10gの1,4−ブタンジオール;50μgのカナマイシン;および10μgのテトラサイクリンを含む培地の50mLを保持した。これらの培養物を、250rpmで振とうしながら、30℃で48時間インキュベートした。次いで、細胞を、遠心分離(2000g、10分間)によってこの培地から回収し、そしてこれらを凍結乾燥し、そしてPHA含量およびGC組成について分析した。pFS73保有の株MBX1668は、乾燥重量で5.8%のポリ(4HB)を含み、一方、pMS92保有の株MBX1668は、乾燥重量で27.7%のポリ(4HB)を含んだ。従って、このalkK遺伝子は、受容可能であり、そしてこのよりよい場合において、ジオールからのPHA合成におけるorfZ遺伝子の代用になる。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、1つの実施形態において使用される、1,4−ブタンジオールから4−ヒドロキシブチリル−CoAへの経路を示す。
Claims (21)
- ポリヒドロキシアルカノエートを生成するための方法であって、該方法は、
ジオールオキシドレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼおよびPHAシンターゼからなる群より選択される酵素を発現する、遺伝的に操作された生物を提供する工程、
該生物によって発現される酵素によってヒドロキシアルカノエートモノマーに変換され得るジオールを提供する工程、および
該ヒドロキシアルカノエートモノマーが重合されてポリヒドロキシアルカノエートを形成する条件下で、該生物を培養する工程、
を包含する、方法。 - 前記ジオールが、1,6−ヘキサジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、6−ヒドロキシヘキサノエートである、請求項1に記載の方法。
- 前記ジオールが、1,5−ペンタンジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、5−ヒドロキシバレレートである、請求項1に記載の方法。
- 前記ジオールが、1,4−ブタンジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、4−ヒドロキシブチレートである、請求項1に記載の方法。
- 前記ジオールが、1,3−プロパンジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、3−ヒドロキシプロピオネートである、請求項1に記載の方法。
- 前記ジオールが、1,2−エタンジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、2−ヒドロキシエタノエートである、請求項1に記載の方法。
- 前記ジオールが、1,2−プロパンジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、2−ヒドロキシプロピオネートである、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法における使用のために、遺伝学的に操作された生物であって、aldH遺伝子およびdhaT遺伝子を発現する生物を含む、生物。
- 前記生物が、Escherichia coli、Ralstonia eutropha、Klebsiella spp.、Alcaligenes latus、Azotobacter spp.およびComamonas spp.からなる群より選択される、請求項8に記載の生物。
- ポリヒドロキシアルカノエートを作製するためのシステムであって、該システムは、ジオールオキシドレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼおよびPHAシンターゼからなる群より選択される酵素を発現するように遺伝的に操作された生物を含み、
ここで、該生物は、ジオールを、重合されてポリヒドロキシアルカノエートを形成するヒドロキシアルカノエートモノマーに変換し得る、システム。 - ポリヒドロキシアルカノエートコポリマーを含む組成物であって、該組成物は、
2−ヒドロキシプロピオネートもしくは2−ヒドロキシエタノエートまたはこれら両方、ならびに
少なくとも300,000の重量平均分子量(Mw)を有する、3−ヒドロキシブチレート、4−ヒドロキシブチレート、3−ヒドロキシプロピオネート、2−ヒドロキシブチレート、4−ヒドロキシバレレート、5−ヒドロキシバレレート、6−ヒドロキシヘキサノエート、および3−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される、少なくとも1つのコモノマーを含む、組成物。 - 前記コモノマーが、3−ヒドロキシブチレートである、請求項11に記載の組成物。
- 前記コモノマーが、4−ヒドロキシブチレートである、請求項11に記載の組成物。
- 前記コモノマーが、3−ヒドロキシプロピオネートである、請求項11に記載の組成物。
- 前記コモノマーが、2−ヒドロキシブチレートである、請求項11に記載の組成物。
- 前記コモノマーが、4−ヒドロキシバレレートである、請求項11に記載の組成物。
- 前記コモノマーが、5−ヒドロキシバレレートである、請求項11に記載の組成物。
- 前記コモノマーが、6−ヒドロキシヘキサノエートである、請求項11に記載の組成物。
- 前記コモノマーが、3−ヒドロキシヘキサノエートである、請求項11に記載の組成物。
- ジオールオキシドレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼおよびPHAシンターゼからなる群より選択される酵素を発現するように遺伝的に操作された生物体を用いて、ポリヒドロキシアルカノエートを作製するための生物学的システムを改善するための方法であって、該生物体は、ジオールを、重合されてポリヒドロキシアルカノエートを形成するヒドロキシアルカノエートモノマーに変換し得、該方法は、
i)特定の宿主に変異を導入する工程、および
ii)選択されたジオールからPHAを合成する増大した能力について、生成された変異体のプールをスクリーニングする工程、
によって酵素活性が増大された変異体について選択する工程を包含する、方法。 - ジオールオキシドレダクターゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするDNAフラグメントであって、発現された酵素が、ジオールから、3−ヒドロキシブチレート、4−ヒドロキシブチレート、3−ヒドロキシプロピオネート、2−ヒドロキシブチレート、4−ヒドロキシバレレート、5−ヒドロキシバレレート、6−ヒドロキシヘキサノエート、3−ヒドロキシヘキサノエート、2−ヒドロキシプロピオネートおよび2−ヒドロキシエタノエートからなる群より選択されるヒドロキシアルカノエートモノマーを生成し得る、DNAフラグメント。
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