JP4353484B2 - アシルコエンザイムaを用いるアシル基転移酵素反応方法 - Google Patents
アシルコエンザイムaを用いるアシル基転移酵素反応方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4353484B2 JP4353484B2 JP2005508108A JP2005508108A JP4353484B2 JP 4353484 B2 JP4353484 B2 JP 4353484B2 JP 2005508108 A JP2005508108 A JP 2005508108A JP 2005508108 A JP2005508108 A JP 2005508108A JP 4353484 B2 JP4353484 B2 JP 4353484B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- acyltransferase
- acyl
- coa
- acyl group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims description 152
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 94
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 title claims description 66
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 title claims description 66
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 126
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 77
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 76
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 58
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 claims description 49
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 claims description 47
- -1 acyl ester Chemical class 0.000 claims description 46
- 150000007970 thio esters Chemical group 0.000 claims description 46
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 42
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 40
- RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N thiophenol Chemical compound SC1=CC=CC=C1 RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 claims description 18
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 claims description 18
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 17
- 108010010718 poly(3-hydroxyalkanoic acid) synthase Proteins 0.000 claims description 15
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 claims description 13
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 claims description 12
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 claims description 8
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims description 8
- PQDSZMWXZDOGQE-UHFFFAOYSA-N thiophen-2-yl 3-hydroxybutanoate Chemical group CC(O)CC(=O)OC1=CC=CS1 PQDSZMWXZDOGQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 claims description 6
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 6
- 229920000739 poly(3-hydroxycarboxylic acid) polymer Polymers 0.000 claims description 5
- 229920000070 poly-3-hydroxybutyrate Polymers 0.000 claims description 5
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 4
- 108020004714 Sphingosine N-acyltransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002579 Sphingosine N-acyltransferase Human genes 0.000 claims description 3
- 150000001783 ceramides Chemical class 0.000 claims description 3
- 241000252867 Cupriavidus metallidurans Species 0.000 claims 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 111
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 44
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 28
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 24
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 24
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 23
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 22
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 22
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 150000003410 sphingosines Chemical class 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 17
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 16
- WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-M (R)-3-hydroxybutyrate Chemical compound C[C@@H](O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-M 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 15
- 102000015785 Serine C-Palmitoyltransferase Human genes 0.000 description 14
- 108010024814 Serine C-palmitoyltransferase Proteins 0.000 description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 14
- REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCC(O)CC(O)=O REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 12
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 12
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxybutyrate Chemical compound CC(O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N R3HBA Natural products CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 11
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 11
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 11
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 11
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 10
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 10
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 10
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 9
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 7
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KBUNOSOGGAARKZ-KRWDZBQOSA-N 3-dehydrosphinganine Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)[C@@H](N)CO KBUNOSOGGAARKZ-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 6
- 241001528539 Cupriavidus necator Species 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- PQDSZMWXZDOGQE-ZCFIWIBFSA-N thiophen-2-yl (3r)-3-hydroxybutanoate Chemical compound C[C@@H](O)CC(=O)OC1=CC=CS1 PQDSZMWXZDOGQE-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 6
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100037458 Dephospho-CoA kinase Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 108010049285 dephospho-CoA kinase Proteins 0.000 description 4
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- IFODXZMDEZNKBQ-UHFFFAOYSA-N thiophen-2-yl 3-hydroxypentanoate Chemical compound CCC(O)CC(=O)OC1=CC=CS1 IFODXZMDEZNKBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 4
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007805 chemical reaction reactant Substances 0.000 description 3
- XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N ethyl acetoacetate Chemical compound CCOC(=O)CC(C)=O XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 3
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)CO WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 3
- JLTRXTDYQLMHGR-UHFFFAOYSA-N trimethylaluminium Chemical compound C[Al](C)C JLTRXTDYQLMHGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- REKYPYSUBKSCAT-SCSAIBSYSA-N (R)-3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CC[C@@H](O)CC(O)=O REKYPYSUBKSCAT-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- YXIWHUQXZSMYRE-UHFFFAOYSA-N 1,3-benzothiazole-2-thiol Chemical compound C1=CC=C2SC(S)=NC2=C1 YXIWHUQXZSMYRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FHSUFDYFOHSYHI-UHFFFAOYSA-N 3-oxopentanoic acid Chemical compound CCC(=O)CC(O)=O FHSUFDYFOHSYHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108010006229 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000005345 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 235000019502 Orange oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 208000037534 Progressive hemifacial atrophy Diseases 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000481518 Ralstonia eutropha H16 Species 0.000 description 2
- 241000736131 Sphingomonas Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 2
- LUCKFPBUROIZRT-BLPRJPCASA-N [Na].CC(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@H]1O[C@H]([C@H](O)[C@@H]1OP(O)(O)=O)n1cnc2c(N)ncnc12)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS Chemical compound [Na].CC(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@H]1O[C@H]([C@H](O)[C@@H]1OP(O)(O)=O)n1cnc2c(N)ncnc12)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS LUCKFPBUROIZRT-BLPRJPCASA-N 0.000 description 2
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 2
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- UDRCONFHWYGWFI-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-oxopentanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(=O)CC UDRCONFHWYGWFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XIRNKXNNONJFQO-UHFFFAOYSA-N ethyl hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC XIRNKXNNONJFQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- GXHFUVWIGNLZSC-UHFFFAOYSA-N meldrum's acid Chemical compound CC1(C)OC(=O)CC(=O)O1 GXHFUVWIGNLZSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000010502 orange oil Substances 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012017 passive hemagglutination assay Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- OTKJDMGTUTTYMP-ZWKOTPCHSA-N sphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@@H](N)CO OTKJDMGTUTTYMP-ZWKOTPCHSA-N 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YHMYGUUIMTVXNW-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydrobenzimidazole-2-thione Chemical compound C1=CC=C2NC(S)=NC2=C1 YHMYGUUIMTVXNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OXFSTTJBVAAALW-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydroimidazole-2-thione Chemical compound SC1=NC=CN1 OXFSTTJBVAAALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LXUNZSDDXMPKLP-UHFFFAOYSA-N 2-Methylbenzenethiol Chemical compound CC1=CC=CC=C1S LXUNZSDDXMPKLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWOBDMNCYMQTCE-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzenethiol Chemical compound SC1=CC=CC=C1Cl PWOBDMNCYMQTCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NRENOZNSHMLGOF-UHFFFAOYSA-N 2-sulfanyltriazole Chemical compound SN1N=CC=N1 NRENOZNSHMLGOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710161460 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase Proteins 0.000 description 1
- OCVLSHAVSIYKLI-UHFFFAOYSA-N 3h-1,3-thiazole-2-thione Chemical compound SC1=NC=CS1 OCVLSHAVSIYKLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010049926 Acetate-CoA ligase Proteins 0.000 description 1
- 102100035709 Acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 102000006589 Alpha-ketoglutarate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004306 Alpha-ketoglutarate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010032178 Amino-acid N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000007610 Amino-acid N-acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 0 CC(C)(COP([O-])(OP([O-])(OCC(C(C1O)OP([O-])([O-])=O)OC1[n]1c(ncnc2N)c2nc1)=O)=O)[C@](C(NCCC(NCCS*)=O)=O)O Chemical compound CC(C)(COP([O-])(OP([O-])(OCC(C(C1O)OP([O-])([O-])=O)OC1[n]1c(ncnc2N)c2nc1)=O)=O)[C@](C(NCCC(NCCS*)=O)=O)O 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066477 Carnitine O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100036357 Carnitine O-acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000190831 Chromatium Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- AERBNCYCJBRYDG-UHFFFAOYSA-N D-ribo-phytosphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(N)CO AERBNCYCJBRYDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000190986 Ectothiorhodospira Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N Malonyl CoA Natural products S(C(=O)CC(=O)O)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- RFMMMVDNIPUKGG-YFKPBYRVSA-N N-acetyl-L-glutamic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O RFMMMVDNIPUKGG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 229920001273 Polyhydroxy acid Polymers 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000736110 Sphingomonas paucimobilis Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108070000030 Viral receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001276012 Wickerhamomyces ciferrii Species 0.000 description 1
- WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N acetoacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(O)=O WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000003647 acryloyl group Chemical group O=C([*])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 150000001263 acyl chlorides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003855 acyl compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229920006237 degradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- OTKJDMGTUTTYMP-UHFFFAOYSA-N dihydrosphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(N)CO OTKJDMGTUTTYMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- OMSUIQOIVADKIM-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-hydroxybutyrate Chemical compound CCOC(=O)CC(C)O OMSUIQOIVADKIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YESYELHMPYCIAQ-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-hydroxypentanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(O)CC YESYELHMPYCIAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N ethyl chloroformate Chemical compound CCOC(Cl)=O RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N malonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- SOOARYARZPXNAL-UHFFFAOYSA-N methyl-thiophenol Natural products CSC1=CC=CC=C1O SOOARYARZPXNAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- MNBKLUUYKPBKDU-BBECNAHFSA-N palmitoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MNBKLUUYKPBKDU-BBECNAHFSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- AERBNCYCJBRYDG-KSZLIROESA-N phytosphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](N)CO AERBNCYCJBRYDG-KSZLIROESA-N 0.000 description 1
- 229940033329 phytosphingosine Drugs 0.000 description 1
- 150000003038 phytosphingosines Chemical class 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- RZWZRACFZGVKFM-UHFFFAOYSA-N propanoyl chloride Chemical compound CCC(Cl)=O RZWZRACFZGVKFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001501 propionyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-thiol Chemical compound SC1=CC=CC=N1 WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012492 regenerant Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006829 sphingolipid biosynthesis Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 125000003696 stearoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- BCNZYOJHNLTNEZ-UHFFFAOYSA-N tert-butyldimethylsilyl chloride Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)Cl BCNZYOJHNLTNEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/001—Amines; Imines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
その一つであるポリヒドロキシアルカノエート(以下、PHAと略記することがある。)は、一般には微生物の発酵生産により製造され、生分解性が高いことから注目を集めているポリエステルであり、90種以上の種類のものが知られている(FEMS Microbiol. Lett., 1995, 128, 219-228)。その中でもポリ(3−ヒドロキシブチレート)(以下、PHBと略記することがある。)、ポリ(3−ヒドロキシバレレート)(以下、PHVと略記することがある。)、ポリ(3−ヒドロキシブチレート−co−3−ヒドロキシバレレート)(以下、PHB−co−PHVと略記することがある。)は、その製造のしやすさ、及びその特性が良好であったことから研究開発が進んだ(特開昭57-150393号公報(米国特許第4393167号)、特開昭59-220192号公報(欧州特許公開第0114086号)、特開昭63-226291号公報(欧州特許公開第0274151号)、特開昭63-269989号公報)。しかし微生物の発酵生産では微生物体内にPHAを蓄積するためにその生産性は低く、また微生物を粉砕してPHAを抽出し、精製するためにコストもかかるなど問題点も多かった。
そのためアシルCoAの使用量を極めて少量に抑えることや、工業的に容易に合成可能な他の化合物を出発物質として用いる高分子化合物の製造方法の開発が望まれている。
1. アシルコエンザイムA(アシルCoA)のアシル基を転移するアシル基転移酵素反応において、チオール化合物のアシルエステルであるアシル基供与体との化学的チオエステル交換反応によって、コエンザイムAよりアシルコエンザイムAを反応系内で生成および/または再生させて反応させることを特徴とするアシル基転移酵素反応方法。
2. 反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムA、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムAに転移させてアシルコエンザイムAとし、アシルコエンザイムAのアシル基をアシル基受容体に転移させる前項1に記載のアシル基転移酵素反応方法。
3. アシル基供与体のアシル基でアシルコエンザイムAを生成および/または再生しながら行う前項2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
4. チオール化合物が芳香族チオールである前項2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
5. 芳香族チオールが置換基を有していてもよいチオフェノールである前項4に記載のアシル基転移酵素反応方法。
6. アシル基受容体がアミノ酸および/またはその誘導体である前項2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
7. アシル基受容体がセリンおよび/またはその誘導体である前項2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
8. アシル基転移酵素がセリン C−パルミトイルトランスフェラーゼである前項1または2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
9. セリン C−パルミトイルトランスフェラーゼがスフィンゴモナス(Sphingomonas)属細菌由来のものである前項8に記載のアシル基転移酵素反応方法。
10. アシル基転移酵素がスフィンゴシン N−アシルトランスフェラーゼである前項1または2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
11. 反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムA、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムAに転移させてアシルコエンザイムAとし、アシルコエンザイムAのアシル基をアシル基受容体に転移させる反応において、アシル基転移酵素が高分子重合酵素であり、高分子化合物を合成する前項2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
12. アシルコエンザイムAまたはアシル基転移酵素反応による生成物をアシル基受容体としてアシル基転移酵素反応を繰り返すことにより高分子化合物を生成する前項11に記載のアシル基転移酵素反応方法。
13. アシルチオエステルが芳香族チオールのアシルエステルである前項11に記載のアシル基転移酵素反応方法。
14. 芳香族チオールのアシルエステルがヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである前項13に記載のアシル基転移酵素反応方法。
15. ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが3−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである前項14に記載のアシル基転移酵素反応方法。
16. 3−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが3−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルである前項15に記載のアシル基転移酵素反応方法。
17. 高分子重合酵素がポリヒドロキシアルカノエートシンターゼである前項11に記載のアシル基転移酵素反応方法。
18. ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼがラルストニア(Ralstonia)属由来である前項17に記載のアシル基転移酵素反応方法。
19. ラルストニア(Ralstonia)属がラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)である前項18に記載のアシル基転移酵素反応方法。
20. ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)がラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)ATCC17699である前項19に記載のアシル基転移酵素反応方法。
21. 前項7乃至9のいずれかに記載のアシル基転移酵素反応を用いるスフィンゴイド塩基類の製造方法。
22. スフィンゴイド塩基類が3−ケトジヒドロスフィンゴシンである前項21に記載の製造方法。
23. 前項10に記載のアシル基転移酵素反応を用いるセラミド類の製造方法。
24. 前項11乃至20のいずれかに記載のアシル基転移酵素反応を用いる高分子化合物の製造方法であって、高分子化合物がポリエステル類であるポリエステル類の製造方法。
25. ポリエステル類がポリヒドロキシアルカノエートである前項24に記載のポリエステル類の製造方法。
26. ポリヒドロキシアルカノエートがポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)である前項25に記載のポリエステル類の製造方法。
27. ポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)がポリ(3−ヒドロキシブチレート)である前項26に記載のポリエステル類の製造方法。
(1-1)CoA酵素
この態様において使用するCoA酵素には、アシルCoAを補足因子(補酵素)とするものである以外に特に制限は無い。これらの酵素の例としては、アセチルグルタミン酸シンターゼ(EC 2.3.1.1)、アセトアセチルCoAチオラーゼ(EC 2.3.1.9)、セリン C−パルミトイルトランスフェラーゼ(EC 2.3.1.50)等、「EC 2.3.1.x」シリーズに属するトランスフェラーゼ類が挙げられる。これらの酵素類は既に多くの生物に存在することが明らかにされており、各種の生物から分離精製がなされている(Enzyme Nomenclature, 178-199, Academic Press, INC.(1992))。中でも、中性〜弱塩基性域に至適pHを示す酵素がさらに好適である。これらCoA酵素は精製酵素であってもよいが、CoA酵素活性を有する触媒菌体あるいはその処理物を用いることもできる。但し、この場合は、アシルCoAを補欠因子とする目的以外の酵素の影響を、欠損変異株の使用、活性阻害、失活処理等により回避することが望ましい。
本発明による高効率アシル基転移において使用するアシル基供与体は、CoAと非触媒的にチオエステル交換反応が起こり得るチオール化合物のアシルエステル(本願において単に「アシルチオエステル」ともいう。)であれば制限は無いが、芳香族チオールのアシルエステルが好ましい。芳香族チオールの例としては、チオフェノール、メチルチオフェノール、クロロチオフェノール、2−メルカプトチアゾール、2−メルカプトイミダゾール、2−メルカプトトリアゾール、2−メルカプトベンゾチアゾール、2−メルカプトベンゾイミダゾール、2−メルカプトピリジン等を挙げることができる。特に好適な例として、チオフェノールのアシルエステル類(フェニル基が置換基を有する場合も含め、本願において単に「チオフェニルエステル」ともいう。)が挙げられる。
また、本発明による高効率アシル基転移反応において使用するアシル基受容体は、上記CoA酵素の基質としうる限り制限は無い。酵素の基質特異性を反応条件によって変化させることや、タンパク質工学的に基質特異性を変化させた変異体などを用いることにより、酵素の通常の好適な基質でない物質をもアシル基受容体とし得る。
本発明による高効率アシル基転移反応において使用するCoAは、化学合成法、半合成法、生物発酵法などいずれの方法で製造されたものでもよく、CoAとして機能し得るものであれば良い。
本発明の反応は、濃度に関してもCoA酵素の安定性が確保され、反応が進行するならば、特に制限はない。
反応系は開放型でも密閉型でも良く、臭気等が問題になる場合には密閉系において反応を行えば良い。
(2-1)高分子化合物
前述のように、本発明は、高分子生成反応としても有用であり、具体的にはチオエステル交換反応と高分子重合酵素反応を共存させた溶液中でチオエステルから高分子化合物を合成する高分子化合物の製造方法に関するものである。
本発明で使用する高分子重合酵素としては、本発明のチオエステル交換反応で生成する物質を基質として高分子化合物を合成する高分子重合酵素であればよい。例えば、ヒドロキシアルカノエートCoAを基質とし、PHAとする場合、酵素であるポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ(PHAS)を用いることが出来る。高分子重合酵素の取得方法は生物細胞から抽出精製する方法、あるいは生物培養物から抽出精製する方法など多種多様の方法が使われるが、例としてはPHASは微生物細胞から抽出精製することが出来る。しかし通常の抽出精製方法では取得出来る酵素量が極めて少量に限られることから、近年は遺伝子組換え技術を利用してPHASの遺伝子を単離し(J. Biol. Chem., 1989, 264, 15298-15303、J. Bacteriol., 1988, 170, 4431-4436、J. Bacteriol., 1988, 170, 5837-5847)、高発現させることで高分子重合酵素を大量に分離精製できる(J. Biochemistry, 1994, 33, 9311-9320、Protein Expression Purif., 1996, 7, 203-211)。また本発明の高分子重合反応で使用される酵素は、そのまま用いる場合のほかに、固定化酵素などの手法で修飾した酵素を用いることもできる。
本発明による高分子生成反応において使用するアシル基供与体は、アシル基が高分子の構造単位となり得るものであるという点を除いて、前述の高効率アシル基転移反応と同様であり、芳香族チオールのアシルエステルが好ましい。芳香族チオールの例は、前記の通りである。
チオエステルの製法は例えば、J. Am. Chem. Soc., 1973, 22, 5829に記載されている。
インビトロ重合方法では酵素の基質としてCoAチオエステルを用い、酵素が反応してPHAが重合されると共に、反応系内には遊離したCoAが放出される。CoAチオエステルは反応当初に投入されるものと反応の進行により生じたものの両者が含まれるが、いずれにせよ、生成物は重合体とCoAである(下記式)。
よく乾燥させて窒素置換したフラスコに無水ジクロロメタン6mLを添加し、氷上で冷やしながらよく撹拌した。そこに2Mトリメチルアルミニウム2mLをゆっくりと添加した。さらにチオフェノールをゆっくりと添加した。室温で1時間30分撹拌を続けた後、無水ジクロロメタン6mLに溶解したパルミチン酸エチルエステルをゆっくりと添加して反応させた。反応はTLCでモニターした。反応終了後、反応液にジクロロメタン20mLを加え、更に気泡発生が無くなるまで3%塩酸水溶液を添加した。この溶液を分液漏斗に移して、3%塩酸水溶液で3回、飽和食塩水で2回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過して硫酸マグネシウムを除去した後、エバポレーションで濃縮し、濃黄色のオイル状溶液を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=2/1)によって分離精製してチオフェニルパルミテートを得た。
Sphingomonas属由来の上記酵素を大腸菌にクローン化した形質転換体からSPT粗酵素抽出液を得た。本形質転換体の作成法、SPT精製法はIkushiro, H.らによる「The Journal of Biological Chemistry 276, 18249-18256 (2001)」の記載に従った。
まず、上記SPTの全塩基配列から、N末端配列とC末端配列をコードするプライマー(配列番号1及び配列番号2)を作成し、Sphingomonas paucimobilisの染色体DNAを鋳型として、以下の条件でPCRによりSPTコード領域に相当するDNA断片を作成した。このとき、N末端用プライマーにはベクターへの接続のためNcoIサイトを、C末端用プライマーにはHind IIIサイトを設けた。
[プライマー]
N末端用プライマー 5’−accatgaccgaagccgccgctca−3’(配列番号1)
C末端用プライマー 5’−taagctttcagccgatgacgccg−3’(配列番号2)
[反応液組成]
LA Taqポリメラーゼ(Polymerase)、
同酵素添付の標準緩衝液、
鋳型染色体 <1μg、
プライマー 各1μM、
dNTP 各200μM、
液量 25μL〜100μL。
[反応条件]
変成温度 94℃、30秒、
アニール温度 40+0.25℃/サイクル、30秒、
伸張温度 72℃、90秒。
作成したPCR断片をアガロースゲル電気泳動した後ゲルより抽出し、カラムにより回収した。この断片を制限酵素NcoI−Hind IIIで処理し、プラスミドpET21dのNcoI−Hind III断片とライゲーションし、宿主大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。
作成した形質転換体をアンピシリン50ppmを含むLB培地5mLで、35℃、16時間培養した後、菌体を遠心分離して回収し、生理食塩水で洗浄した。洗浄菌体をSPT用緩衝液(20mMリン酸緩衝液(pH6.5,0.1mM EDTA, 5mM DTT, 0.1mM AEBSF(プロテアーゼ阻害剤), 0.02mM PLPを含む))2mLに再懸濁し、氷冷しながら超音波破砕機で約10分間破砕した後、未破砕物を遠心分離(12,000rpm×10分間)して除去し粗酵素抽出液を得た。
CoAナトリウム塩2mgとL−セリン1mgを100mM HEPES−NaOH緩衝液(10μM PLPを含む、pH8.0)5mLに溶解し、マグネチックスターラーでよく撹拌した。そこにチオフェニルパルミテート3.5mgをアセトニトリル0.1mLで溶解させた溶液を混合した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落としてSPT粗酵素液0.5mLを添加し、24時間、37℃で反応させた。この溶液を2Nアンモニア溶液1mLでアルカリ性とした後、クロロホルム/メタノール(2:1(v/v))5mLで溶液中の生成物を抽出、回収した。抽出液をフィルターろ過した後適当に濃縮し、下記の分析法に従って3−ケトジヒドロスフィンゴシンを定量したところ、生成量は約1.0mgであった。
[スフィンゴシン類の分析法]
Tanaka, M.らによる Journal of Chromotography 284, 433-440 (1984)に記載の方法に従いTLC-FID(Iatroscan)を用いてスフィンゴシン類の定量分析を行った。すなわち、標準試料として1〜10mgのジヒドロスフィンゴシン(スフィンガニン)または3−ケトジヒドロスフィンゴシンをメタノール1mLに溶解した溶液1μLを、クロマトロッドS II(シリカゲル)に供し、一次展開液(クロロホルム−メタノール−15Nアンモニア溶液=60:10:1で展開した。展開後のロッドをIATROSCAN TH−10TLC/FID Analyser(IATRON社製)に供することでスフィンゴシン類を検出定量した。
さらに詳細なスフィンゴイド塩基類の定量分析は、文献(Analytical Biochemistry, 298 (2001) 283-292)などを参考にし、生成物を蛍光誘導体化した後高速液体クロマトグラフィーによって分離分析した。
後述の反応液75μLを取り、70.6mMトリエチルアミン/エタノール溶液425μLを添加し撹拌した。5分間遠心して沈殿を除き、上清をHPLCサンプルバイアル(300μL微量インサート)に100μLを取り、AQC試薬(Waters社製)溶液20μLを添加し、直ちに撹拌した。室温で40分以上反応した後、下記のHPLC条件で分析した。
本体:LC-VPシリーズ(島津製作所)(ポンプLC-10ADVP、カラムオーブンCTO-10ACVP、オートサンプラーSIL-10AF、システムコントローラーSCL-10AVP)
検出器:蛍光検出器821-FP(日本分光)Ex.244nm, Em.398nm、Gain x100
カラム:SHODEX F-511A,35℃
溶離液:アセトニトリル/メタノール/水/トリメチルアミン=480/320/190/7、1.5ml/min。
カラム再生方法:文献法の再生法はカラム圧が高くなりすぎエラーが出やすいため、下記の通り変更した。
再生液 アセトニトリル/メタノール=60/40
↓
溶離液より再生液へ1分間のリニアグラディエントで切換え(1.5ml/min)
↓
12分間再生液を通液(1.5ml/min)
↓
再生液より溶離液へ1分間のリニアグラディエントで切換え(1.5ml/min)
↓
2分間溶離液を通液(1.5ml/min)後、分析条件に戻す。
分析サイクル:試料分析毎にカラム再生系を入れる。再生時はサンプル注入しない。
パルミトイルCoA10mgとL−セリン1mgを100mM HEPES−NaOH緩衝液(10μM PLPを含む、pH8.0)5mLに溶解し、マグネチックスターラーでよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落としてSPT粗酵素液0.5mLを添加し、24時間、37℃で反応させた。この溶液を2Nアンモニア溶液1mLでアルカリ性とした後、クロロホルム/メタノール(2:1(v/v))5mLで溶液中の生成物を抽出、回収した。抽出液をフィルターろ過した後適当に濃縮し、実施例3と同様に分析した結果、3−ケトジヒドロスフィンゴシンの生成量は約0.02mgであった。
CoAナトリウム塩2mgとL−セリン1mgを100mM HEPES−NaOH緩衝液(10μM PLPを含む、pH8.0)5mLに溶解し、マグネチックスターラーでよく撹拌した。そこにチオフェニルパルミテート3.5mgをヘキサン5mLで溶解させた溶液を混合した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落としてSPT粗酵素液0.5mLを添加し、24時間、37℃で反応させた。この溶液を2Nアンモニア溶液1mLで酸性化した後、クロロホルム/メタノール(2:1(v/v))5mLで溶液中の生成物を抽出、回収した。抽出液をフィルターろ過した後適当に濃縮し、実施例3と同様にして3−ケトジヒドロスフィンゴシンを定量分析したところ、生成量は約2.2mgであった。
氷上で、乾燥したフラスコ中で3.9gのメルドラム酸を18mlの脱水ジクロロメタンに溶かして撹拌したところへ、18mlの脱水ジクロロメタンに溶解した4.3gのピリジンと2.2gのアセチルクロライドの溶液を窒素気流下でゆっくりと添加した。撹拌は0℃で1時間の後、室温で2時間行った。混合液を分液漏斗に移し、3%塩酸溶液で2回、飽和食塩水で2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションして、ゆっくりと固化する濃オレンジ色でオイル状の3.6gの粗アシル化メルドラム酸を得た。この粗アシル化メルドラム酸を80mlの脱水エタノール中で還流した。この時二酸化炭素の発生が観察された。溶媒をエバポレーションで取り除き、赤色オイル状の1.3gの粗3−オキソブチレートエチルエステルを得た。これをシリカゲル60のカラムクロマトグラフィー(20cm×Φ1cm、溶離液はヘキサン:酢酸エチル=2:1)で精製し、少し黄色でオイル状の0.60gの精製3−オキソブチレートエチルエステルを得た。収率は未精製品に対して46%であった。この化合物のNMR分析結果を以下に示す。
1H NMR (in CDCl3) δ4.20(q, J=7.1Hz, 2H), 3.47(s, 2H), 2.27(s, 3H), 1.28(t, J=7.1Hz, 3H);
13C NMR (in CDCl3) δ201.06, 167.44, 61.52, 50.29, 30.32, 14.29
乾燥したフラスコ中で75.6mgの水素化ホウ素ナトリウムを2mlの脱水エタノールに溶かした溶液を撹拌し、そこへ520mgの3−オキソブチレートエチルエステルを2mlの脱水エタノールに溶解した溶液をゆっくりと添加した。撹拌は室温で2時間行い、その後4mlの水を添加した。混合溶液を分液漏斗へ移し、ジクロロメタンで2回抽出した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下でエバポレーションして、薄い黄色のオイル状の282mgの3−ヒドロキシブチレートを得た。この化合物のNMR分析結果を以下に示す。
1H NMR (in CDCl3) δ4.17(q, J=7.1Hz, 2H), 4.17(m, 1H), 2.46(m, 2H), 1.28(t, J=7.1Hz, 3H), 1.23(d, J=6.3Hz, 3H);
13C NMR (in CDCl3) δ172.93, 64.28, 60.68, 42.91, 22.49, 14.18
氷上で乾燥したフラスコ中で6mlの脱水ジクロロメタンを撹拌し、そこへ2mlの2Mトリメチルアルミニウムを窒素気流下でゆっくりと添加した。そこへ続けて2mmolのチオフェノールをゆっくりと添加した。室温で30分間撹拌し、続けて6mlの脱水ジクロロメタンに溶解した3−ヒドロキシブチレートを添加した。反応はTLCでモニターした。この混合液に20mlのジクロロメタンを加え、気泡発生が止むまで20mlの3%塩酸溶液を添加した。混合液を分液漏斗へ移し、3%塩酸溶液で2回、飽和食塩水で2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下でエバポレーションして濃黄色のオイル状の532mgの粗3−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを得た。これをシリカゲル60のカラムクロマトグラフィー(20cm×Φ1cm、溶離液はヘキサン:酢酸エチル=2:1)で精製し、透明なオイル状の125mgの3−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを得た。収率は未精製品に対して24%であった。その化合物のNMR分析結果を以下に示す。
1H NMR (in CDCl3) δ7.38(s, 5H), 4.33(m, 1H), 2.83(m, 2H), 1.25(d, 3H);
13C NMR (in CDCl3) δ198.24, 134.90, 130.07, 129.69, 127.61, 65.23, 52.02, 22.85
小さなガラス瓶に39.5mgのコエンザイムAナトリウム塩を0.5mlの100mMリン酸カルシウム緩衝液(pH8.0)に撹拌して溶かした溶液に、9.8mgの3−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを0.1mlのアセトニトリルに溶かした溶液を添加した。撹拌は室温で3時間続け、次に0.13mlの1Mリン酸を添加した。混合液を0.5mlのジエチルエーテルで3回洗浄し、減圧下でエバポレーションして30mMの3−ヒドロキシブチレートCoAチオエステル溶液を得た。
2.53gのt−ブチルジメチルシリルクロライドを無水ジメチルホルムアミドに溶かして撹拌したところへ、3.4gのイミダゾールを添加し、氷上、窒素気流下で15分撹拌した。更に無水ジメチルホルムアミドに溶解した0.5gの(R)−3−ヒドロキシブチレートを添加して室温で一晩撹拌した。反応液に60mlの飽和食塩水を加え、ジエチルエーテル:石油エーテル=1:3溶液での抽出を5回繰り返した。抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションした。これをメタノール:テトラヒドロフラン=2:1溶液に溶解し、1.5gの炭酸カリウムを含む10mlの水溶液を加え、室温で一晩撹拌した。反応液は飽和食塩水で希釈し、更に1M硫酸でpHを3.0に調整し、ジエチルエーテル:石油エーテル=1:3溶液での抽出を5回繰り返した。抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーション後、真空乾燥して3−(t−ブチルジメチルシリル)ブチレートを得た。氷上で、870mgの3−(t−ブチルジメチルシリル)ブチレートと452mgのチオフェノールを6mlのジクロロメタンに溶解し、これに2mlのジクロロメタンに溶解した846mgのジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し撹拌後、室温で10時間撹拌した。20mlのジエチルエーテルを加えてろ過後、溶媒をエバポレーションで取り除き、フラッシュクロマトグラフィー(溶離液は5%酢酸エチルを含むヘキサン)で330mgの3−(t−ブチルジメチルシリル)ブチレートチオフェニルエステルを得た。これを2mlアセトニトリルに溶解し、更に6mlの5%フッ化水素を含むアセトニトリル溶液を加えた。20分の反応後、気泡が発生しなくなるまで飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、ジエチルエーテルで抽出後、飽和食塩水で洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションして81mgの(R)−3−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを得た。
3−ヒドロキシブチレートCoAチオエステルの合成と同様にして、3−ヒドロキシブチレートCoAチオエステル溶液を得た。
氷上で、乾燥したフラスコ中で3.9gのメルドラム酸を18mlの脱水ジクロロメタンに溶かして撹拌したところへ、18mlの脱水ジクロロメタンに溶解した4.3gのピリジンと2.5gのプロピオニルクロライドの溶液を窒素気流下でゆっくりと添加した。撹拌は0℃で1時間の後、室温で2時間行った。混合液を分液漏斗に移し、3%塩酸溶液で2回、飽和食塩水で2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションして、ゆっくりと固化する濃オレンジ色でオイル状の3.4gの粗アシル化メルドラム酸を得た。この粗アシル化メルドラム酸を80mlの脱水エタノール中で還流した。この時二酸化炭素の発生が観察された。溶媒をエバポレーションで取り除き、赤色オイル状の1.7gの粗3−オキソバレレートエチルエステルを得た。これをシリカゲル60のカラムクロマトグラフィー(20cm×Φ1cm、溶離液はヘキサン:酢酸エチル=2:1)で精製し、少し黄色でオイル状の0.50gの精製3−オキソバレレートエチルエステルを得た。収率は未精製品に対して29%であった。この化合物のNMR分析結果を以下に示す。
1H NMR (in CDCl3) δ4.19(q, J=7.1Hz, 2H), 3.40(s, 2H), 2.58(q, J=7.2Hz, 2H), 1.28(t, J=7.2Hz, 3H), 1.08(t, J=7.2Hz, 3H);
13C NMR (in CDCl3) δ203.48, 180.07, 61.33, 49.03, 36.32, 14.13, 7.56
乾燥したフラスコ中で75.6mgの水素化ホウ素ナトリウムを1mlの脱水エタノールに溶かした溶液を撹拌し、そこへ288mgの3−オキソバレレートエチルエステルを1mlの脱水エタノールに溶解した溶液をゆっくりと添加した。撹拌は室温で2時間行い、その後2mlの水を添加した。混合溶液を分液漏斗へ移し、ジクロロメタンで2回抽出した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下でエバポレーションして、薄い黄色のオイル状の212mgの3−ヒドロキシバレレートを得た。この化合物のNMR分析結果を以下に示す。
1H NMR (in CDCl3) δ4.17(q, J=7.1Hz, 2H), 3.94(m, 1H), 2.45(m, 2H), 1.57(m, 2H), 1.27(t, J=7.1Hz, 3H), 0.96(t, J=7.3Hz, 3H);
13C NMR (in CDCl3) δ173.30, 69.64, 60.91, 41.46, 29.77, 14.40, 10.07
氷上で乾燥したフラスコ中で3mlの脱水ジクロロメタンを撹拌し、そこへ1mlの2Mトリメチルアルミニウムを窒素気流下でゆっくりと添加した。そこへ続けて1mmolのチオフェノールをゆっくりと添加した。室温で30分間撹拌し、続けて3mlの脱水ジクロロメタンに溶解した3−ヒドロキシバレレートを添加した。反応はTLCでモニターした。この混合液に10mlのジクロロメタンを加え、気泡発生が止むまで10mlの3%塩酸溶液を添加した。混合液を分液漏斗へ移し、3%塩酸溶液で2回、飽和食塩水で2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下でエバポレーションして濃黄色のオイル状の258mgの粗3−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステルを得た。これをシリカゲル60のカラムクロマトグラフィー(20cm×Φ1cm、溶離液はヘキサン:酢酸エチル=2:1)で精製し、透明なオイル状の44mgの3−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステルを得た。収率は未精製品に対して17%であった。その化合物のNMR分析結果を以下に示す。
1H NMR (in CDCl3) δ7.39(s, 5H), 4.04(m, 1H), 2.82(m, 2H), 1.60(m, 2H), 0.98(t, J=7.1Hz, 3H);
13C NMR (in CDCl3) δ198.30, 134.67, 129.83, 129.46, 127.31, 70.04, 50.03, 29.67, 9.96
小さなガラス瓶に79mgのコエンザイムAナトリウム塩を2mlの100mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に撹拌して溶かした溶液に、42mgの3−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステルを1mlのアセトニトリルに溶かした溶液を添加した。撹拌は室温で3時間続け、次に0.53mlの1Mリン酸を添加した。混合液を2mlのジエチルエーテルで3回洗浄し、減圧下でエバポレーションして33mMの3−ヒドロキシブチレートCoAチオエステル溶液を得た。
ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)ATCC17699のゲノムDNAから制限酵素EcoRIとSmaI断片(約5kbp)を切り出し、pUC18にクローニングしてPHA合成酵素遺伝子(PHAS)を含むプラスミドpTI305を取得した。次にpTI305のNotI・StuI断片(1.6kbp)と、pTI305をテンプレートとして下記2種のプライマーでPCRにより増幅したDNAのBamHI・NotI断片(140bp)と、ベクターpQE30(キアゲン社製)のBamHIとSmaI断片の3種類を混合してライゲーションし、プラスミドpQERECを調整した。これを大腸菌BL21(pREP4)に導入して、酵素調製用の大腸菌BL21(pQEREC)を作製した。この大腸菌を1000mlのLB培地中、30℃で16時間培養し、菌体内に酵素を蓄積させ、超音波処理によって菌体を破壊した後、菌体内の可溶性タンパク質を回収した。このタンパク質をNi−NTAアガロースゲルカラムに通し、(His)−PhaC(N末端にヒスチジンが6個付加されている)を特異的にカラムに吸着させた。洗浄後、イミダゾールを用いて(His)−PhaCを溶出し、透析後に精製酵素として10mgを得た。酵素の分子量はSDS−PAGEで65kDaであった。
PCRの条件
センスプライマー:aaggatccatggcgaccggcaaaggcgcgg(配列番号3)、
アンチセンスプライマー:tgcagcggaccggtggcctcggcctgccc(配列番号4)、
サイクル:(94℃45秒、58℃30秒、72℃60秒)×30サイクル。
5mlの100mMリン酸カリウム溶液に0.015mgの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を30℃に保ち、ここに5mlの1mMCoAナトリウム溶液と、0.5mlの20mM3−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステル溶液(100mMリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの1:1溶液に溶解)を少しずつ添加し、さらに30℃で24時間反応させた。次にこの溶液を20mlのヘキサンで3回洗浄し、更に10mlのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを3回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、300mlのメタノール中に滴下して24時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、0.4mgのポリ((R)−3−ヒドロキシブチレート)を得た。分子量(ポリスチレン換算のGPC)はMw=970000であった。その化合物のNMR分析結果を以下に示す。
1H NMR (in CDCl3) δ5.26(m, H), 2.53(m, 2H), 1.25(s, 3H);
13C NMR (in CDCl3) δ169.53, 67.99, 41.16, 20.15
5mlの100mMリン酸カリウム溶液に0.015mgの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を30℃に保ち、ここに5mlの1mMCoAナトリウム溶液を少しずつ添加し、さらに30℃で24時間反応させた。次にこの溶液を20mlのヘキサンで3回洗浄し、更に10mlのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを3回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、300mlのメタノール中に滴下して24時間放置した。しかし沈殿物は得られなかった。
5mlの100mMリン酸カリウム溶液に0.015mgの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を30℃に保ち、ここに5mlの1mM3−ヒドロキシブチレートCoA溶液と、0.5mlの20mM3−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステル溶液(100mMリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの1:1溶液に溶解)を少しずつ添加し、さらに30℃で24時間反応させた。次にこの溶液を20mlのヘキサンで3回洗浄し、更に10mlのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを3回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、300mlのメタノール中に滴下して24時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、0.3mgのポリ((R)−3−ヒドロキシブチレート)を得た。
5mlの100mMリン酸カリウム溶液に0.015mgの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を30℃に保ち、5mlの1mM3−ヒドロキシブチレートCoAを少しずつ添加し、さらに30℃で24時間反応させた。次にこの溶液を20mlのヘキサンで3回洗浄し、更に10mlのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを3回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、300mlのメタノール中に滴下して24時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、0.2mgのポリ((R)−3−ヒドロキシブチレート)を得た。
5mlの100mMリン酸カリウム溶液に0.015mgの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を30℃に保ち、ここに0.5mlの20mM3−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステル溶液(100mMリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの1:1溶液に溶解)を少しずつ添加し、さらに30℃で24時間反応させた。次にこの溶液を20mlのヘキサンで3回洗浄し、更に10mlのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを3回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、300mlのメタノール中に滴下して24時間放置した。しかし沈殿物は得られなかった。
5mlの100mMリン酸カリウム溶液に0.015mgの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、ここに5mlの1mM(R,S)−3−ヒドロキシバレレートCoAと、0.5mlの20mM3−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステル溶液(100mMリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの1:1溶液に溶解)を少しずつ添加し、さらに室温で24時間反応させた。次にこの溶液を20mlのヘキサンで3回洗浄し、更に10mlのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを3回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、300mlのメタノール中に滴下して24時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、0.3mgのポリ((R)−3−ヒドロキシバレレート)を得た。その化合物のNMR分析結果を以下に示す。
1H NMR (in CDCl3) δ5.12(m, H), 2.56(m, 2H), 1.53(m, 2H), 0.81(t, 3H);
13C NMR (in CDCl3) δ169.71, 72.26, 39.17, 27.23, 9.76
5mlの100mMリン酸カリウム溶液に0.015mgの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として5mlの1mM(R,S)−3−ヒドロキシバレレートCoAを少しずつ添加し、さらに室温で24時間反応させた。次にこの溶液を20mlのヘキサンで3回洗浄し、更に10mlのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを3回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、300mlのメタノール中に滴下して24時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、0.1mgのポリ((R)−3−ヒドロキシバレレート)を得た。
5mlの100mMリン酸ナトリウム溶液(pH7.5)、1mMCoAナトリウム塩溶液に0.015mgの酵素を添加して溶液温度を30℃に保ち撹拌した。その上に10mM(R)−3−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを5mlのヘキサン溶液を重層した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、30℃で24時間反応させた。反応後にヘキサン層を除去し、次に水層中から5mlのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出した。これを2回繰り返した。抽出溶液をフィルターろ過した後、200mlのメタノール中に滴下して4℃で24時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、1.5mgのポリ((R)−3−ヒドロキシブチレート)を得た。分子量(ポリスチレン換算のGPC)はMw=1070000であった。また、添加したCoAのチオエステル化と遊離の反応回転数は3.4回である。
5mlの100mMリン酸ナトリウム溶液(pH7.5)、1mM(R)−3−ヒドロキシブチレートCoAチオエステル溶液に0.015mgの酵素を添加して溶液温度を30℃に保ち撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、30℃で24時間反応させた。反応後にヘキサン層を除去し、次に水層中から5mlのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出した。これを2回繰り返した。抽出溶液をフィルターろ過した後、200mlのメタノール中に滴下して4℃で24時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、0.4mgのポリ((R)−3−ヒドロキシブチレート)を得た。
5mlの100mMリン酸ナトリウム溶液(pH7.5)に0.015mgの酵素を添加して溶液温度を30℃に保ち撹拌した。その上に10mM(R)−3−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを5mlのヘキサン溶液を重層した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、30℃で24時間反応させた。反応後にヘキサン層を除去し、次に水層中から5mlのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出した。これを2回繰り返した。抽出溶液をフィルターろ過した後、200mlのメタノール中に滴下して4℃で24時間放置した。沈殿物は観察されなかった。
また、PHAの製造方法において、インビトロ(in vitro)重合方法にチオエステル交換反応を組み合わせることにより、反応出発物質を容易に合成可能なチオフェニルエステルに代替し、さらに重合反応で必須である補酵素アシルCoAについてもその再生反応を同一反応液系内で行うことが可能となり、補酵素の消費量を劇的に減少でき、様々なPHAを安価に効率よく工業的に製造でき、その用途が飛躍的に広がる。
Claims (20)
- アシルコエンザイムA(アシルCoA)のアシル基を転移するアシル基転移酵素反応において、芳香族チオール化合物のアシルエステルであるアシル基供与体との化学的チオエステル交換反応によって、コエンザイムAよりアシルコエンザイムAを反応系内で生成および/または再生させて反応させることを特徴とするアシル基転移酵素反応方法。
- 反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムA、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムAに転移させてアシルコエンザイムAとし、アシルコエンザイムAのアシル基をアシル基受容体に転移させる請求項1に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- アシル基供与体のアシル基でアシルコエンザイムAを生成および/または再生しながら行う請求項2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- 芳香族チオール化合物が置換基を有していてもよいチオフェノールである請求項1または2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- アシル基受容体がアミノ酸である請求項2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- アシル基転移酵素がスフィンゴシン N−アシルトランスフェラーゼである請求項1または2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- 反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムA、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムAに転移させてアシルコエンザイムAとし、アシルコエンザイムAのアシル基をアシル基受容体に転移させる反応において、アシル基転移酵素が高分子重合酵素であり、高分子化合物を合成する請求項2に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- アシルコエンザイムAまたはアシル基転移酵素反応による生成物をアシル基受容体としてアシル基転移酵素反応を繰り返すことにより高分子化合物を生成する請求項7に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- 芳香族チオール化合物のアシルエステルがヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである請求項7に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが3−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである請求項9に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- 3−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが3−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルである請求項10に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- 高分子重合酵素がポリヒドロキシアルカノエートシンターゼである請求項7に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼがラルストニア(Ralstonia)属由来である請求項12に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- ラルストニア(Ralstonia)属がラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)である請求項13に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)がラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)ATCC17699である請求項14に記載のアシル基転移酵素反応方法。
- 請求項6に記載のアシル基転移酵素反応を用いるセラミド類の製造方法。
- 請求項7乃至15のいずれかに記載のアシル基転移酵素反応を用いる高分子化合物の製造方法であって、高分子化合物がポリエステル類であるポリエステル類の製造方法。
- ポリエステル類がポリヒドロキシアルカノエートである請求項17に記載のポリエステル類の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエートがポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)である請求項18に記載のポリエステル類の製造方法。
- ポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)がポリ(3−ヒドロキシブチレート)である請求項19に記載のポリエステル類の製造方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003013762 | 2003-01-22 | ||
JP2003013762 | 2003-01-22 | ||
JP2003094881 | 2003-03-31 | ||
JP2003094881 | 2003-03-31 | ||
PCT/JP2004/000500 WO2004065609A1 (ja) | 2003-01-22 | 2004-01-21 | アシルコエンザイムaを用いるアシル基転移酵素反応方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2004065609A1 JPWO2004065609A1 (ja) | 2006-05-18 |
JP4353484B2 true JP4353484B2 (ja) | 2009-10-28 |
Family
ID=32775174
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005508108A Expired - Fee Related JP4353484B2 (ja) | 2003-01-22 | 2004-01-21 | アシルコエンザイムaを用いるアシル基転移酵素反応方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7476521B2 (ja) |
EP (1) | EP1591531B1 (ja) |
JP (1) | JP4353484B2 (ja) |
WO (1) | WO2004065609A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
UA94038C2 (ru) * | 2005-03-18 | 2011-04-11 | Майкробиа, Инк. | Продуцирование каротиноидов в маслянистых дрожжах и грибах |
JP2009138174A (ja) * | 2007-11-14 | 2009-06-25 | Agri Bioindustry:Kk | 高分子化合物の製造方法 |
EP2060594B1 (en) * | 2007-11-14 | 2011-03-09 | National University Corporation Hokkaido University | Method for producing polymer |
FR2963362B1 (fr) | 2010-07-30 | 2012-08-17 | Pcas Biosolution | Procede d'acylation enzymatique avec un donneur acyl-phosphonate |
CN109896955A (zh) | 2019-03-26 | 2019-06-18 | 沈阳金久奇科技有限公司 | 一种β-羟基羧酸酯的制备方法 |
DE202019105611U1 (de) | 2019-10-11 | 2019-10-30 | Shenyang Gold Jyouki Technology Co., Ltd. | beta-Hydroxycarbonsäureester, hergestellt durch eine Carbonylierungsveresterungsreaktion in einer Kohlenmonoxidatmosphäre mittels eines Co-Katalysators |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3168826D1 (en) | 1980-11-18 | 1985-03-21 | Ici Plc | Polymer blends |
GB8301344D0 (en) | 1983-01-18 | 1983-02-16 | Ici Plc | Poly(beta-hydroxybutyric acid) |
NL8603073A (nl) | 1986-12-02 | 1988-07-01 | Rijksuniversiteit | Werkwijze voor het bereiden van polyesters door fermentatie; werkwijze voor het bereiden van optisch actieve carbonzuren en esters; polyester omvattende voortbrengselen. |
JPS63269989A (ja) | 1987-04-28 | 1988-11-08 | Yoshiharu Doi | 共重合体の製造法 |
JPH07103230B2 (ja) | 1987-12-15 | 1995-11-08 | 三菱化学株式会社 | ポリエステル共重合体およびその製造方法 |
JPH0819227B2 (ja) | 1987-08-18 | 1996-02-28 | 三菱化学株式会社 | ポリエステル共重合体およびその製造法 |
JPH0714352B2 (ja) | 1988-03-02 | 1995-02-22 | 三菱化学株式会社 | ポリエステル共重合体の製造方法 |
JPS6448821U (ja) | 1987-09-18 | 1989-03-27 | ||
JP2777757B2 (ja) | 1991-09-17 | 1998-07-23 | 鐘淵化学工業株式会社 | 共重合体およびその製造方法 |
JPH07265065A (ja) | 1994-03-29 | 1995-10-17 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 共重合体の合成遺伝子による形質転換体および共重合体の製造方法 |
JP3062459B2 (ja) | 1996-08-14 | 2000-07-10 | 理化学研究所 | ポリエステル重合酵素遺伝子及びポリエステルの製造方法 |
EP1015565B1 (en) | 1997-09-19 | 2006-04-12 | Metabolix, Inc. | Biological systems for manufacture of polyhydroxyalkanoate polymers containing 4-hydroxyacids |
AU2001275996B2 (en) * | 2000-07-21 | 2005-08-04 | Cj Cheiljedang Corporation | Production of polyhydroxyalkanoates from polyols |
WO2002016627A2 (en) * | 2000-08-18 | 2002-02-28 | Tepha, Inc. | Sulfur containing polyhydroxyalkanoate compositions and method of production |
-
2004
- 2004-01-21 US US10/542,733 patent/US7476521B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-01-21 JP JP2005508108A patent/JP4353484B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-01-21 WO PCT/JP2004/000500 patent/WO2004065609A1/ja active Application Filing
- 2004-01-21 EP EP04703935.9A patent/EP1591531B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-11-25 US US12/277,622 patent/US7943351B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1591531A4 (en) | 2010-01-27 |
US20090111153A1 (en) | 2009-04-30 |
WO2004065609A1 (ja) | 2004-08-05 |
EP1591531A1 (en) | 2005-11-02 |
EP1591531B1 (en) | 2016-03-23 |
US7476521B2 (en) | 2009-01-13 |
JPWO2004065609A1 (ja) | 2006-05-18 |
US7943351B2 (en) | 2011-05-17 |
US20060148048A1 (en) | 2006-07-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ruth et al. | Efficient production of (R)-3-hydroxycarboxylic acids by biotechnological conversion of polyhydroxyalkanoates and their purification | |
Chen et al. | Microbial production and applications of chiral hydroxyalkanoates | |
CA2527940C (en) | Nutritional supplements and therapeutic compositions comprising (r)-3-hydroxybutyrate derivatives | |
US6011144A (en) | PHA E and PHA C components of poly(hydroxy fatty acid) synthase from thiocapsa pfennigii | |
Parthasarathy et al. | Substrate specificity of 2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase from Clostridium symbiosum: toward a bio-based production of adipic acid | |
JP2006204255A (ja) | アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊ポリヒドロキシアルカノエート生産菌、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 | |
US7943351B2 (en) | Method for acyltransferase reaction using acyl coenzyme A | |
EP2669365B1 (en) | Method for producing high-molecular-weight pha | |
CN104755623A (zh) | 自油底物制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法 | |
JP6948595B2 (ja) | α−ヒドロムコン酸の製造方法 | |
Volova et al. | Effects of intracellular poly (3-hydroxybutyrate) reserves on physiological–biochemical properties and growth of Ralstonia eutropha | |
Le Meur et al. | Improved productivity of poly (4-hydroxybutyrate)(P4HB) in recombinant Escherichia coli using glycerol as the growth substrate with fed-batch culture | |
Thakor et al. | Application of the BPEC pathway for large-scale biotechnological production of poly (3-mercaptopropionate) by recombinant Escherichia coli, including a novel in situ isolation method | |
Habulin et al. | Enzymatic synthesis of citronellol laurate in organic media and in supercritical carbon dioxide | |
CA2558189C (en) | Biocatalytic manufacturing of (meth)acrylylcholine or 2-(n,n-dimethylamino)ethyl (meth)acrylate | |
Villeneuve et al. | Synthesis of pyroglutamic acid fatty esters through lipase-catalyzed esterification with medium chains alcohols | |
JPS62272984A (ja) | L−(−)−カルニチンクロライドのバイオテクノロジ−による製造方法 | |
Wei et al. | Enzymatic esterification for glycoside lactate synthesis in organic solvent | |
Hacking et al. | Lipase catalysed acylation of hydroxylamine and hydrazine derivatives | |
EP2896701A1 (en) | Method for producing polyhydroxyalkanoate using modified fat or oil composition | |
JP4405631B2 (ja) | 共役リノール酸異性体の精製方法 | |
KR102657359B1 (ko) | 항산화 활성 및 항염증 활성을 갖는 신규한 화합물 및 이에 따른 항산화 활성용 및 항염증용 조성물 | |
KR102657363B1 (ko) | 화학적 합성방법을 통한 항산화 활성 및 항염증 활성을 갖는 신규한 나린진 화합물의 합성방법 및 합성용 키트 | |
JP2004041146A (ja) | ホモグルタチオンの製造方法 | |
JP4078465B2 (ja) | 光学活性アルコール化合物の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060904 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20070705 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090430 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090625 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090723 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090724 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120807 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120807 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150807 Year of fee payment: 6 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |