DE69214654T2

DE69214654T2 - Kontinuierliche natamycinproduktion

Info

Publication number: DE69214654T2
Application number: DE69214654T
Authority: DE
Inventors: Phillip Olson
Original assignee: BIO TECH RESOURCES
Current assignee: BIO TECH RESOURCES
Priority date: 1991-08-05
Filing date: 1992-08-03
Publication date: 1997-04-30
Anticipated expiration: 2012-08-04
Also published as: CA2115036A1; DE69214654D1; ZA925869B; IL102728A; CN1041536C; WO1993003171A1; NZ243827A; EP0598009A1; AU2408092A; MX9204520A; TW213489B; IL102728A0; EP0598009B1; JPH06508763A; CN1070688A; CA2115036C; JP2801966B2; ES2093272T3

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Natamycin durch kontinuierliche Fermentation eines Inokulums, um kontinuierlich hohe Ausbeuten von Natamycin über einen ausgedehnten Zeitraum zu erhalten.
Natamycin ist ein Mitglied der Polyen-Familie von Antimykotika. Die Verbindung Natamycin ist ein Tetraen mit einem Molekulargewicht von etwa 666, die empirische Formel entspricht im allgemeinen C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub7;NO&sub1;&sub3;, und sie enthält eine glycosidisch verknüpfte Kohlehydratgruppierung, Mycosamin. Natamycin (auch Pimaricin genannt) besitzt einen isoelektrischen Punkt von etwa pH 6,5, und die Struktur existiert typischerweise in zwei Konfigurationen: der Enolstruktur und der Ketostruktur.
Ein herkömmliches, diskontinuierliches Fermentationsverfahren zur Herstellung von Natamycin ist in der britischen Patentschrift Nr. 846 933 (1960) von American Cyanamid beschrieben.
Trotz des antibiotischen und fungiziden Wertes von Natamycin wurde bisher sehr wenig kommerzielle Verwendung von diesem Produkt gemacht. Ein Hauptgrund für die eingeschränkte Verwendung sind die unverhältnismäßig hohen Herstellungskosten.
Aufgabe der Erfindung ist es, diese Unzulänglichkeiten der herkömmlichen Verfahren zu beseitigen und ein kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von geeigneten Natamycinmengen auf kostensparende Weise durch Vermehren und Fermentieren eines Inokulums in einem festgelegten Medium bereitzustellen.
Die EP-A-600 989 und die EP-A-597 988 wurden am selben Tag und durch denselben Anmelder wie die Erfindung eingereicht, sie betreffen beide die Gesichtspunkte der Herstellung von Natamycin durch Fermentation.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die fermentative Herstellung von Natamycin, bei der die Fermentation kontinuierlich durchgeführt wird. Das Fermentationsverfahren umfaßt zwei Grundphasen. Die erste Phase umfaßt die Kulturvermehrung, wohingegen die zweite Phase die Natamycinproduktion umfaßt. Das Verfahren ergibt kontinuierliche, hohe Natamycinausbeuten, nämlich etwa 4 bis wenigstens etwa 12 g/l über einen ausgedehnten Fermentationszeitraum.
Die Erfindung fermentiert kontinuierlich einen Organismus, der zur Natamycinproduktion in der Lage ist. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung (Z.B. Sporulation) und Vermehrung eines Inokulums, welches eine Streptomyces-Spezies umfaßt, die während der Fermentation Natamycin produziert.
Eine hohe Ausbeute an Natamycin ist aufgrund der leichteren Gewinnung von Natamycin aus der Fermentationsbrühe wirtschaftlich wichtig. Außerdem sind durch die erfindungsgemäße kontinuierliche Produktion ein verbesserter Kosten-Nutzen- Wirkungsgrad für die Fermentationsapparatur und eine effektivere Verwendung des Produktionsmediums erreichbar. Ein kontinuierliches Fermentationsverfahren verringert auch die Anzahl von Inokulum-Präparationen, die zu einer Reihe von diskontinuierlichen Vorgängen erforderlich sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 ist ein schematisches Blockdiagramm des Verfahrens, welches erfindungsgemäß zur Inokulumvermehrung angewendet werden kann.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung der zwei Phasen, die während des erfindungsgemäßen kontinuierlichen Natamycin- Fermentationsverfahrens auftreten.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wird ein Organismus, der Natamycin zu produzieren vermag, zur Herstellung eines Inokulums mit einem zuvor festgelegten Medium und anschließend mit einem zuvor festgelegten Fermentationsproduktionsmedium, welches die maximale metabolische Aktivität des Organismus während der weiteren Vermehrung fördert und kontinuierlich Natamycin produziert, in Kontakt gebracht. Während der kontinuierlichen Fermentation wandelt der Organismus wenigstens einen Teil des zuvor festgelegten Produktionsmediums zu Natamycin um.
Das erfindungsgemäße Fermentationsverfahren umfaßt zwei Phasen. Die erste Phase umfaßt die Vermehrung eines Inokulums, welches eine Kultur von Streptomyces-Spezies enthält, und von etwas Natamycinproduktion begleitet werden kann. Die Natamycinproduktionsgeschwindigkeit während der ersten Phase nimmt von Null auf die Geschwindigkeit des Gleichgewichtszustands der zweiten Phase zu. Die zweite Phase betrifft hauptsächlich eine Natamycinproduktion im Gleichgewichtsoder Stationärzustand bei hoher Geschwindigkeit, die eine Fermentationsbrühenkonzentration von etwa 4 bis wenigstens etwa 12 gil erzielt. Diese beiden Phasen können sich mit etwas Natamycinproduktion überschneiden, die stattfindet, wenn die Kulturvermehrung die Hauptaktivität ist und sich das Kulturwachstum während der Natamycinproduktion fortsetzt.
Während der zweiten Phase wird ein zuvor bestimmtes Gleichgewicht erreicht und aufrechterhalten, so daß die Kulturvermehrung und die hohen Natamycinproduktionsgeschwindigkeiten ungefähr konstant bleiben. Dieses Gleichgewicht von Kulturvermehrung/hoher Natamycinproduktionsgeschwindigkeit wird erreicht durch 1) kontinuierliche Zugabe, beginnend bei der geeigneten Zeit, des kontinuierlichen Produktionsmediums zu dem Fermenter, um eine konstante Geschwindigkeit der Kulturvermehrung und Natamycinproduktion aufrechtzuerhalten und 2) Entfernung der Natamycin-haltigen Fermentationsbrühe. In der kontinuierlichen oder zweiten Phase werden die Brühenkonzentrationen und das Volumen konstant gehalten. Falls gewünscht, kann jedoch eine unterschiedliche Natamycinproduktionsgeschwindigkeit entweder durch Modifizieren der Zusammensetzung oder der Geschwindigkeit der Mediumzugabe erreicht werden.
Theoretisch kann das Gleichgewicht während der kontinuierlichen Produktionsphase unendlich lange andauern. In der Praxis der Erfindung ist die kontinuierliche Phase jedoch durch Verunreinigung oder Apparaturfehlfunktionen beschränkt und wird normalerweise wenigstens etwa 40 Tage lang oder bis die Natamycinproduktion auf eine unwirtschaftliche Ausbeutengeschwindigkeit abnimmt fortgeführt.
Die Schlüsselgesichtspunkte der Erfindung, welche die kontinuierliche Fermentation erlauben, sind gekennzeichnet durch:
1. Die Zusammensetzung des Inokulummediums, welches zur Vermehrung der Kultur verwendet wird, die in den Fermenter eingebracht wird, um die erste Phase der Fermentation zu starten.
2. Wenigstens 2 Fermentationsphasen, eine erste Phase, die ein nichtstationäres Kulturwachstum/eine nichtstationäre Natamycinproduktion umfaßt, währenddessen die Natamycinproduktionsgeschwindigkeit zunimmt, und eine zweite Phase, die eine Kulturvermehrung/hohe Natamycinproduktion in einem zuvor bestimmten Gleichgewicht umfaßt.
3. Die Zusammensetzung der Fermentationsmedien.
4. Die Konstanz von Fermentationsbrühenvolumen, Zusammensetzung und Kulturkonzentration während der zweiten Phase, die erzielt wird durch Zugabe des Fermentationsmediums, die durch Entfernung eines gleichen Volumens der Fermentationsbrühe ausgeglichen wird.
5. Die Geschwindigkeit von Mediumzugabe/Brühenentfernung, die ausgewählt wird, um den wirtschaftlichen Mediumverbrauch und die Natamycinproduktion zu maximieren.
6. Falls gewünscht, kann das Natamycin gewonnen oder aus der entfernten Fermentationsbrühe abgetrennt werden.
Jeder Organismus, welcher eine Natamycin-produzierende Streptomyces-Spezies umfaßt, kann erfindungsgemäß verwendet werden. Eine bevorzugte Streptomyces-Spezies umfaßt Streptomyces gilvosporeus, welche bereits bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland, USA, hinterlegt und als ATCC Nr. 13326 registriert worden ist.
Ein zu fermentierendes Inokulum wird aus einer Sporensuspension der geeigneten Sporen hergestellt. Das Inokulum der geeigneten Streptomyces-Spezies wird anschließend fermentiert, welches hohe Ausbeuten an Natamycin produziert, wenn es in das kontinuierliche, erfindungsgemäße Fermentationsmedium gegeben wird. Typischerweise wird das Inokulum einer Reihe von Vermehrungsstufen unterzogen, wobei jede Stufe die Menge der Natamycin-produzierenden Streptomyces-Zellen vergrößert. Nachdem die Menge an Streptomyces-Zellen passend ist, wird Streptomyces einer Umgebung und/oder einem Medium ausgesetzt, welches gedacht ist, um eine kontinuierliche Natamycinproduktion zu erzielen, wenn die Streptomyces- Spezies fermentiert.

Sporensuspension

Das Inokulum wird gestartet, indem die Sporen einer Natamycin-produzierenden Streptomyces-Spezies gesammelt werden, die aus der American Type Culture Collection erhalten worden ist. Die Sporen werden gekeimt, um eine aktiv wachsende Kultur der Streptoinyces-Spezies zu erzeugen. Eine sterilisierte (z.B. autoklavierte) Agar-Schrägkultur wird gut mit der aktiv wachsenden Kultur der Streptoinyces-Spezies (z.B. streptoinyces gilvosporeus oder eine andere Natamycin-produzierende Spezies) angeimpft und inkubiert, bis die Schrägkultur im wesentlichen vollständig mit Sporen bedeckt ist. Die Sporen der Agar-Schrägkultur werden in eine kleine Menge einer Flüssigkeit wie Wasser (z.B. destilliertes Wasser), Nährmedium etc. abgekratzt, um eine wäßrige Sporensuspension herzustellen. Die resultierende Sporensuspension wird vermehrt, um das Inokulum für den Fermentationsbetrieb (d.h. Natamycinproduktion) herzustellen. Zum Erreichen der besten Ergebnisse sollte die Sporensuspension, die zum Start der Inokulumvermehrung verwendet wird, eine Sporenkonzentration von etwa 10&sup5;-10¹&sup0; CFU/ml und normalerweise wenigstens etwa 10&sup8; CFU/ml enthalten.
Eine Reihe von Agar-Schrägkulturmedien kann zur Beschleunigung der Sporulation der Kultur der Streptoinyces-Spezies (z.B. S. gilvosporeus) verwendet werden, die zur Bildung der Sporensuspension verwendet wird. Geeignete Schrägkulturmedien umfassen typischerweise wenigstens ein Glied aus der folgenden Gruppe: Hefe-Malz-Agar, Hickey-Turner-Agar, GYA-Agar, Pridham-Agar, Kartoffeldextrose-Agar, Bennett's Agar etc.
Eine hohe Konzentration (z.B. 10&sup8; CFU/ml) von lebensfähigen Sporen innerhalb der Sporensuspension ist ein Schlüsselgesichtspunkt der Erfindung. Erstens dauert es, falls die Sporenkonzentration zu gering ist, viel länger, um durch eine Inokulumvermehrung die Menge an Streptomyces-Zellen zu erhalten, die für eine kostensparende fermentative Natamycinproduktion ausreicht. Zweitens vergrößert eine verringerte Menge an Sporen innerhalb der Suspension die gesamte Inokulumvermehrungszeit und vergrößert die Wahrscheinlichkeit einer Verunreinigung (z.B. durch einen unerwünschten Organismus). Außerdem kann eine geringe Sporenkonzentration in der Suspension zur Beschleunigung der Bildung großer, eng gepackter Mycelpellets neigen. Diese Pellets sind zum Erhalt hoher Ausbeuten von Natamycin aufgrund der mit der Sauerstoffübertragung verbundenen Probleme der Massenübertragung von Nährstoffen in die Pellets etc. ungeeignet. Sollte die Größe der Mycelpellets unerwünscht werden, so können die Pellets physikalisch auseinandergebrochen werden, wie unter Verwendung einer Scherkraft (z.B. Mischen).

Inokulumvermehrung

Die wäßrige Sporensuspension (z.B. S. gilvosporeus), die vorstehend diskutiert worden ist, wird gekeimt und die Zellmultiplikation fortgesetzt, bis die Anzahl der Organismen adäquat ist, um als ein wäßriges Inokulum zur fermentativen Produktion von Natamycin verwendet zu werden. Eine geeignete Inokulum-Zelldichte umfaßt ein Trockenzellgewicht von etwa 1-5 g/l und wird bei einem Volumen von 0,1-10 % des Natamycinproduktionsmediumvolumen verwendet.
Das wäßrige zur Inokulumvermehrung verwendete Medium bestimmt die Zelldichte und den metabolischen Zustand des Inokulums (Z.B. ist eine angemessene Dichte von gesunden Zellen wünschenswert). Eine ausreichende Menge an Proteinstickstoff, der die komplexen Wachstumsfaktoren (z.B. Vitamine), anorganische Elemente (z.B. Kalium, Natrium, Calcium etc.) und Spurenelemente (z.B. Bor, Kobalt, Eisen, Kupfer, Zink etc.) enthält, die im allgemeinen in der Proteinstickstoffquelle vorhanden sind, wird benötigt, um ein Inokulum zu erhalten, welches die gewünschte Zelldichte und den gewünschten metabolischen Zustand besitzt. Die Proteinstickstoffquelle kann jede Quelle sein, die die Sporensuspension zu einem Inokulum vermehrt, das unter Produktion der gewünschten hohen Aus beuten an Natamycin fermentiert.
Dem wäßrigen Inokulummedium muß auch eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle in einer Menge bereitgestellt werden, die ausreicht, um die gewünschte Inokulum-Zelldichte zu erhalten. Für beste Ergebnisse sollte die Kohlenstoffquelle während der Inokulumvermehrung nicht vollständig erschöpft werden. Die Erschöpfung der Kohlenstoffquelle führt leicht zu einer nachteiligen Veränderung des metabolischen Zustandes des Inokulums, was während der Fermentation zu verringerten Natamycinausbeuten führen kann.
Obwohl eine Vielzahl von wäßrigen Inokulummedien erfindungsgemäß wirksam verwendet werden kann, um hohe Ausbeuten an Natamycin zu erhalten, ist es zweckmäßig, zuvor festgelegte Mengen von Medienbestandteilen zu verwenden.
Ein geeignetes Medium zur Inokulumvermehrung kann in Wasser, (z.B. Wasser mit niedrigem Mineralgehalt, destilliertem Wasser etc.) hergestellt werden, und umfaßt:
a) eine Proteinstickstoffquelle in einer Menge von etwa 2-16 g/l, normalerweise etwa 8 g/l und
b) eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle, die in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um eine Verarmung an Gesamtkohlenstoff zu vermeiden, im allgemeinen 5-30 g/l Medium und normalerweise etwa 15 g/l.
Zwei spezielle Zusammensetzungen eines Mediums, die zur Inokulumvermehrung geeignet sind, sind nachstehend angegeben.
Das Inokulummedium, welches die Nährstoffe bereitstellt, die die Produktionsgeschwindigkeit der streptomyces-Zellen steigern, kann durch herkömmliche Techniken (Z.B. getrennte oder gleichzeitige Sterilisation der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle bei Temperaturen von etwa 120-140 ºC) hergestellt werden. Das Inokulummedium besitzt nach der Sterilisation wünschenswerterweise einen pH-Wert von etwa 7. Die Sporensuspension wird in das Inokulummedium eingebracht, und das Inokulummedium wird auf eine Temperatur von etwa 25-40 ºC und normalerweise etwa 28-35 ºC erhitzt.
Um große Volumina eines wäßrigen Inokulums zu erreichen, die für die kontinuierliche fermentative Produktion von Natamycin wünschenswert sind, sind mehrere Inokulum-Vermehrungsstufen erforderlich, die jeweils in einem Volumen durchgeführt werden, das größer ist als dasjenige der vorhergehenden Stufe. Beispielsweise kann die Inokulumvermehrung auf eine Weise durchgeführt werden, die eine exponentielle Zunahme in der Menge der Zellen erreicht. Insbesondere ist es vorteilhaft, die Kultur während der Vermehrung in einem exponentiellen Wachstumsmodus zu halten, indem das Volumen des Inokulums während jeder Vermehrungsstufe wirksam vergrößert wird. Dies kann entweder durch Minimierung der Dauer jeder Stufe oder durch Minimierung der Anzahl der Stufen erfolgen. Beispielsweise wird, wenn eine zuvor bestimmte Zelldichte des Inokulums erreicht worden ist, das Inokulum zur weiteren Vermehrung in eine größere Umgebung (z.B. Gefäß) übergeführt. Durch wirksame Kontrolle der Inokulumvermehrung wird ein Minimum an Zeit und Kosten zur Inokulumvermehrung verwendet, und demgemäß werden die kostensparenden Natamycinausbeuten während der Fermentation gesteigert.
Die Zeitdauer einer einzelnen Stufe in der Reihe der Inokulum-Vermehrungsstufen, deren Fortführung ermöglicht wird, hängt ab von der Zusammensetzung des Mediums, der gewünschten Menge an streptomyces-Zellen, der Temperatur etc. Typischerweise wird eine einzelne Vermehrungsstufe etwa 6 bis etwa wenigstens 24 Stunden lang durchgeführt.
Der Inokulum-Vermehrungsprozeß erfordert die Belüftung des Inokulums. Beispielsweise kann das Gefäß oder der Kolben an einem Rotationsschüttler mit einer Geschwindigkeit von etwa 200 upm geschüttelt werden. Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung kann das Inokulum durch einen Impeller, der innerhalb des Gefäßes angeordnet ist, der das Inokulum beinhaltet, gerührt werden, während sterile Luft in den Boden des Gefäßes gepreßt wird.
Wird nun auf Figur 1 Bezug genommen, so stellt diese Figur ein Schema des Verfahrens dar, welches zur Herstellung des Inokulums angewendet werden kann, welches zur Natamycinproduktion fermentiert wird. Figur 1 erläutert die Volumen- Zunahmen in dem Inokulum, die durch die Vermehrung erreicht werden, die notwendig ist, um eine Menge des Inokulums zu erhalten, die ausreicht, um Natamycin auf kostensparende Weise herzustellen. Beispielsweise wird das Volumen des Inokulums von 25 l auf 1 250 l gesteigert, indem die 25 l des Inokulums in ein Gefäß gegeben werden, welches 1 225 l eines wäßrigen Inokulummediums enthält.
Das vermehrte Inokulum wird in einen Fermenter eingeleitet, der ein Fermentationsmedium beherbergt. Die schnelle Kulturvermehrung setzt sich während der ersten Fermentationsphase zusammen mit einer zunehmenden Natamycinproduktion fort. Die Natamycinproduktionsgeschwindigkeit während der zweiten Fermentationsphase stabilisiert sich im allgemeinen in etwa 1 Tag bei einer hohen Ausbeute, die sich mehrere Tage lang fortsetzt. Die Natamycinkonzentration in der Brühe nimmt ungefähr mit konstanter Geschwindigkeit zu, bis die Natamycinproduktionsgeschwindigkeit beginnt abzunehmen, im allgemeinen aufgrund der Verarmung von einem oder mehreren der Inokulummediumbestandteile.

Kontinuierliche Natamycinproduktion

Die zweite Phase der Fermentation beginnt vor oder kurz nachdem die Geschwindigkeit der Natamycinproduktion abzufallen beginnt. Die Natamycinproduktionsgeschwindigkeit wird bestimmt durch kontinuierliches Aufzeichnen der Natamycinkonzentration in der Fermentationsbrühe. Nach Erreichen der zweiten Phase werden die Geschwindigkeit der Medienzugabe und der Brühenentfernung aufeinander abgestimmt. Durch Aufzeichnung der entfernten Fermentationsbrühen-Zusammensetzung können die Geschwindigkeiten der Medienzugabe/Brühenentfernung eingestellt werden, um eine optimale Ausnutzung des Fermentationsmediums zu erhalten. Die maximal mögliche Mediumausnutzung wird erreicht, wenn jeder Bestandteil, der dem Medium zugegeben wird, auf eine Gleichgewichtskonzentration von 0 in der Fermentationsbrühe abnimmt. In Abhängigkeit von den Kosten für Medium und Apparatur kann es wirtschaftlich erwünscht sein, Medium zuzugeben und Brühe zu entnehmen, bei einer Geschwindigkeit die etwas schneller ist als diejenige, die die maximal mögliche Mediumausnutzung ergibt.
Die Mediumzugabe und Brühenentfernung kann durch jede annehmbare Technik durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Mediumzugabe und/oder Brühenentfernung unter Verwendung einer Pumpe (z.B. einer Vakuumpumpe), durch Druck, Schwerkraft etc. erreicht werden.
Falls gewünscht, kann das Fermentationsmedium der zweiten Phase eingestellt werden oder sogar in der Zusammensetzung oder der Zufuhrgeschwindigkeit zu jeder Zeit zur Optimierung der Produktionswirtschaflichkeit einer kontinuierlichen Produktion deutlich geändert werden. Ferner kann es hauptsächlich je nach verwendeter Apparatur wünschenswert sein, abwechselnd Medium zuzugeben und/oder Brühe zu entfernen, solange das durchschnittliche Gesamtvolumen der Brühe ungefähr konstant bleibt. Außerdem kann die Mediumzugabe in der zweiten Phase früh gestartet werden, gegen Ende der ersten Phase, jedoch beginnt die zweite Phase nicht, bis der vorstehend diskutierte Gleichgewichts- oder Sttationärzustand erreicht worden ist.
Während der zweiten Phase werden Biomasse (z.B. Streptomyces- Zellen) und Produktionsmedium kontinuierlich entfernt, und das Natamycinprodukt wird aus der entfernten Brühe gewonnen (z.B. filtriert, zentrifugiert etc.), entweder gemischt mit der Biomasse und/oder extrahiert als Natamycin (Z.B. in kristalliner Morphologie). Das Natamycin kann durch jede geeignete Technik gewonnen werden, die Natamycin in einer geeigneten Form und Menge erzielt. Sollte, falls gewünscht, das Natamycin mit der Biomasse vermischt sein, kann das Natamycin aus der Biomasse durch jedes geeignete Verfahren gewonnen werden.
Die kontinuierliche zweite Gleichgewichtsfermentationsphase kann für längere Zeit aufrechterhalten werden, wobei sie hauptsächlich nur durch das Einbringen von Verunreinigungen oder durch eine Apparaturfehlfunktion beschränkt wird (z.B. kann die Erfindung für wenigstens etwa 40 Tage andauern).
Die kontinuierliche Natamycinproduktion wird in einem Fermentationsgefäß durchgeführt, welches in der Lage ist, den Fermentationsprozeß zu umfassen. Ein Element, das wichtig ist zum Erzielen maximaler Ausbeuten an Natamycin ist die Zusammensetzung des wäßrigen Fermentationsmediums. Das Fermentationsmedium muß die richtigen Mengen an metabolisierbarem Kohlenstoff und Proteinstickstoff enthalten. Ferner ist es wünschenswert, daß das Medium komplexe Wachstumsfaktoren (z.B. Vitamine) und anorganische Elemente (z.B. Kalium, Natrium, Calcium etc.) und Spurenelemente (Z.B. Bor, Cobalt, Eisen, Kupfer, Zink etc.) enthält, die im allgemeinen in der Proteinstickstoffquelle vorhanden sind.
Ein geeignetes Medium zur Fermentation kann in Wasser (z.B. Leitungswasser mit niedrigem Mineralgehalt, destilliertem Wasser etc.) hergestellt werden und umfaßt:
(a) etwa 80-250 g/l einer metabolisierbaren Kohlenstoffquelle und
(b) wenigstens 15 g/l und normalerweise etwa 20 g/l bis 80 g/l eines Proteins und Spurenbestandteilen. Die Proteinstickstoffquelle kann eine Nichthefe-Proteinstickstoffkomponente und eine Hefe-Proteinstickstoffkomponente umfassen. Diese beiden Proteinstickstoffkomponenten sind im allgemeinen in dem Verhältnis, das, bezogen auf den Proteingehalt, von etwa 5:1 bis 11:1 reicht und für beste Ergebnisse im allgemeinen etwa 8:1 beträgt, vorhanden.
Diese metabolisierbaren Kohlenstoffquellen- und Proteinstickstoffquellen-Mengen werden in dem Fermentationsmedium während der zweiten Phase durch kontinuierliche und koordinierte Zugabe der geeigneten Quelle(n) aufrechterhalten. Die Menge einer bestimmten Quelle in dem Fermentationsmedium kann durch Überwachen der Brühe, die entfernt wird, und Vornehmen einer geeigneten Einstellung bestimmt werden.
Die Proteinstickstoffquelle kann kontinuierlich von einem breiten Bereich von Quellen geliefert werden. Beispielsweise können Sojaproteinprodukte (Z.B. Isolate, Stäube, Mehle etc.) die Nichthefe-Proteinstickstoffquelle umfassen (z.B. werden wünschenswerte Natamycinausbeuten mit einer Sojaproteinquelle erhalten, die 80-95 % Protein umfaßt). Der Proteinstickstoff kann auch Fleischextrakt, Proteinhydrolysate (z.B. Peptone) und/oder Hefe (z.B. Extrakte, Autolysate etc.) umfassen.
Wie vorstehend diskutiert, muß das Produktionsmedium auch eine Kohlenstoffquelle umfassen, die durch die Streptomyces- Spezies metabolisierbar ist. Die Kohlenstoffquelle kann in jeder zugänglichen Form wie Glucose, Polysaccharid, Mais- und Kartoffelstärke etc. bereitgestellt werden.
Außerdem ist es gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung nicht notwendig, zu Beginn die gesamte Menge der Kohlenstoffquelle, die zur Natamycinproduktion erforderlich ist, als Ausgangskomponente des Natamycinproduktionsmediums einzubringen (z.B. reicht die Ausgangsmenge der Kohlenstoffquelle nicht für die Beendigung der Fermentation aus). Bei diesem Gesichtspunkt der Erfindung kann während Phase 1 die Kohlenstoffquellen- Zugabe während der Natamycinproduktion durchgeführt werden, so daß eine Menge an Kohlenstoffquelle von etwa 5-40 g/l und im allgemeinen 20 g/l beibehalten wird. Somit wird eine geeignete Menge einer geeigneten Kohlenstoffquelle dem Fermentationsmedium zu Beginn und erneut nach Beginn der Fermentation zugesetzt. Während Phase 2, der kontinuierlichen Natamycinproduktion, wird die Kohlenstoffquelle mit einer zuvor festgelegten Geschwindigkeit zugesetzt, die proportional ist zu der Geschwindigkeit der Zugabe des Natamycinproduktionsmediums. Vorzugsweise reicht die Zugabegeschwindigkeit der Kohlenstoffquelle aus, um eine Menge der Kohlenstoffquelle bereitzustellen, um eine kontinuierliche hohe Geschwindigkeit der Natamycinproduktion beizubehalten, ohne daß unverbrauchte Kohlenstoffquelle aus dem Fermenter entfernt wird (z.B. entspricht die Menge der Kohlenstoffquelle im wesentlichen der bestimmten Menge der Kohlenstoffquelle in dem Fermentationsmedium, welche notwendig ist, um den Fermentationsprozeß zu unterhalten).
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung kann die Kohlenstoffquelle als Teil des Produktionsmediums zugesetzt werden, in welchem Falle die Geschwindigkeit der Kohlenstoffquellenzugabe durch die Geschwindigkeit der Zugabe des Produktionsmediums bestimmt wird.
Das Natamycinproduktionsmedium, welches Nährstoffe für die streptomyces-Fermentation und die Natamycinproduktion bereitstellt, wird durch herkömmliche Techniken (z.B. getrenntes oder gleichzeitiges Sterilisieren der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle bei Temperaturen von etwa 120-140 ºC) hergestellt. Das Produktionsmedium besitzt nach der Sterilisation wünschenswerterweise einen pH-Wert von etwa 7. Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung kann das Fermentationsmedium auf dem Wege zu dem Fermenter sterilisiert werden. Beispielsweise kann das Fermentationsmedium, welches dem Reaktor kontinuierlich zugeführt wird, durch ein Rohr, eine Leitung oder durch ein anderes geeignetes Mittel geleitet werden, welches in der Lage ist, das Fermentationsmedium zu sterilisieren (z.B. ein kontinuierlicher Sterilisator).
Das Inokulum wird in ein Fermentationsgefäß eingefüllt, bis eine Konzentration von etwa 0,1-10 %, im allgemeinen etwa 2 %, bezogen auf das Volumen in dem Produktionsmedium, erreicht ist (Z.B. kann die Menge des Inokulums ausreichen, um eine Vielzahl von kontinuierlichen Fermentern anzuimpfen). Der Rest des Volumens des Fermenters umfaßt das Fermentationsmedium. Jede Technik ist annehmbar, um das Inokulum in das Produktionsmedium in den Fermenter einzubringen, welcher das Inokulum in einem aktiven metabolischen Zustand abgibt.
Das Fermentations- oder Produktionsmedium wird auf eine Temperatur von etwa 25 º-40 ºC und normalerweise 28 º-35 ºC gebracht.
Dem Natamycinproduktionsmedium wird während der Fermentation Sauerstoff zugeführt. Es ist zweckmäßig, ein Niveau an aufgelöstem Sauerstoff in dem Produktionsmedium von etwa 20 % bis 80 % Luftsättigung während des Hauptteils der Fermentation beizubehalten. Die Fähigkeit, ein geeignetes Niveau an gelöstem Sauerstoff zu erreichen, kann durch richtige Koordination der Belüftung und/oder Rührgeschwindigkeit verstärkt werden. Beispielsweise wird das Fermentations- oder Produktionsmedium belüftet, indem Luft (z.B. sterile Luft) durch das Fermentationsmedium im allgemeinen mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,3 bis wenigstens etwa 1,0 Volumina Luft pro Volumen Fermentationsmedium gepreßt wird. Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung ist es wünschenswert, das Fermentationsmedium während der Belüftung zu rühren. Außerdem kann die Belüftungsgeschwindigkeit auch ausreichen, um eine Bewegung des Fermentationsmediums zu verursachen.
Wirdnun auf Figur 2 Bezug genommen, so ist die Beziehung zwischen Zeit und Natamycinproduktionsgeschwindigkeit für jede der beiden erfindungsgemäßen Grundphasen gezeigt. Die erste Phase umfaßt die Vermehrung der Streptomyces-Spezies, die von etwas Natamycinproduktion begleitet wird. Die zweite Phase, die kontinuierliche Natamycinproduktion, ist erreicht, wenn ein Gleichgewicht zwischen Mediumzugabe und Brühenentfernung erreicht worden ist. Die zweite Phase wird fortgesetzt, bis kein Natamycin mehr auf kostensparende Weise produziert wird (Z.B. macht eine Verunreinigung das Verfahren ineffektiv).
Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung kann es wünschenswert sein, dem Fermentationsmedium ein Antischaummittel (z.B. einen Silikonentschäumer) in einer Menge von etwa 0,01 %- 1 Vol.-% der Fermentation oder des Natamycinproduktionsmediums zuzusetzen, wenn es erwünscht ist, das Schäumen zu kontrollieren.
Das Natamycinproduktionnsmedium besitzt nach der Inokulumzugabe einen pH-Wert von etwa 7,0, der typischerweise während der Fermentation langsam auf etwa 4,5 abnimmt. Der abgesenkte pH-Wert ist ein Ergebnis der metabolischen Aktivitäten der Streptomyces-Spezies. In Abhängigkeit von der Endanwendung der Fermentationsbrühe kann es wünschenswert sein, daß das Fermentationsmedium einen niedrigeren pH-Wert besitzt. Jedoch kann der pH-Wert, falls erwünscht, durch zeitliche Zugabe einer basischen Substanz gesteigert oder kontrolliert werden (z.B. kann Kaliumhydroxid dem Fermentationsmedium kontinuierlich oder von Zeit zu Zeit zugegeben werden, um einen bestimmten pH-Wert beizubehalten). Ferner kann der pH-Wert durch Ändern der Mediumzusammensetzung und/oder der Geschwindigkeit der Medienzugabe/Brühenentfernung vergrößert oder verkleinert werden.
Wird die Erfindung richtig durchgeführt (z.B. wirksame Handhabung des Streptomyces-Inokulums, koordinierte Zugabe von Medien und Brühenentfernung etc.), so umfaßt die resultierende Fermentationsbrühe normalerweise wenigstens 4 g/l Natamycin. In bestimmten Fällen kann die Natamycinproduktionskonzentration von etwa 7 g/l bis wenigstens etwa 12 g/l reichen.
Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels gezeigt, welches zur Erläuterung, nicht zur Einschränkung des Umfangs der betrachteten Äquivalente gedacht ist. Wenn nicht anders angegeben, wurden käuflich erhältliche, analysenreine Materialien zur Durchführung der folgenden Beispiele verwendet.

BEISPIEL 1

In dem folgenden Beispiel werden Agar-Schrägkulturen der folgenden allgemeinen Zusammensetzung in destilliertem Wasser hergestellt. Sterilisiert wird etwa 15 min lang bei etwa 121 ºC.
3 g/l Hefeextrakt (Difco "Bacto" Hefeextrakt)
3 g/l Malzextrakt (Difco Malzextrakt)
5 g/l Pepton (Difco "Bacto" -Pepton)
10 g/l Glucose
15 g/l Agar
Es wurde ein Inokulummedium der folgenden allgemeinen Zusammensetzung in destilliertem Wasser hergestellt, und der pH-Wert wurde mit Kaliumhydroxid auf etwa 7,0 eingestellt. Sterilisiert wird etwa 15 min lang bei etwa 121 ºC.
15 g/l Glucose
10 g/l Natriumchlorid
6 g/l Maisquellwasser (PPM, Maisquellflüssigkeit)
5 g/l Pepton (Difco "Bacto" pepton).
Streptomyces gilvosporeus ATCC, Reg.Nr. 13326, erhalten von der ATCC als gefriergetrocknete Sporensuspension, wurde als Kulturquelle verwendet. Die Kultur wurde in dem Inokulummedium angezogen und auf den Agar-Schrägkulturen bei etwa 25 ºC zur Sporulation gehalten. Die Entwicklung des Inokulums begann mit den Agar-Schrägkulturen.
Die Agar-Schrägkulturen für diesen Produktionsdurchlauf des Inokulums sporulierten sehr stark innerhalb von etwa 10 Tagen. Die Sporen wurden von diesen Agar-Schrägkulturen in ein Inokulummedium abgekratzt, um eine Sporensuspensionskonzentration von etwa 10 CFU/ml zu erreichen. Ungefähr 2 ml der Sporensuspension wurden zu etwa 100 ml Inokulummedium in einen 500-ml-Schleusenkolben gegeben. Diese Kultur wurde in 3 Stufen für eine Gesamtinkubation von etwa 48 Stunden bei etwa 29 ºC inkubiert und bei etwa 240 upm auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Die ersten beiden Stufen dauern jeweils 12 Stunden, und die dritte Stufe dauert etwa 24 Stunden. Für die zweite und dritte Stufe wurde frisches Inokulummedium zu etwa 2 Vol.-% von der vorhergehenden Stufe eingebracht. Die so hergestellte Inokulum-Endkultur wurde zum Animpfen des Produktionsmediums bei der erforderlichen Inokulumkonzentration verwendet.
Das Erstphasen-Natamycinproduktionsmedium besaß die folgende allgemeine Ausgangszusammensetzung:
19,5 g/l Sojaproteinisolat (ADM, "Profam "S970)
4,5 g/l Hefeextrakt (Stauffer, Typ KAT)
0,2 m/l Entschäumer (Mazu, DF289)
Ungefähr 600 ml Medium wurden in destilliertem Wasser in einem 1-Liter-Fermenter hergestellt, und der pH-Wert wurde mit Kaliumhydroxid auf etwa 7,6 eingestellt. Der 1-Liter-Fermenter wurde anschließend etwa 15 min lang bei etwa 121 ºC sterilisiert. Glucose, die ebenfalls Teil des Erstphasenme diums ist, wurde getrennt als ungefähr 50%ige Lösung in destilliertem Wasser sterilisiert und wurde dem Ausgangsmedium in einer Konzentration von etwa 40 g/l zugesetzt.
Vor dem Animpfen wurde das Produktionsmedium auf etwa 29 ºC erhitzt, die Belüftungsgeschwindigkeit wurde auf etwa 250 ml/min eingestellt, und die Rührgeschwindigkeit betrug etwa 500 upm.
Das Inokulum, das Streptomyces gilvosporeus, ATCC Reg. Nr. 13326, umfaßte, etwa 2 Vol.-% des Produktionsmediums, wurde anschließend dem Fermentationsgefäß zum Starten der Phase 1 des Produktionscyclus zugesetzt. Die Glucose wurde beginnend bei etwa 40 Stunden nach dem Animpfen zugesetzt, um in der ersten Fermentationsphase eine Konzentration von etwa 20 g/l Glucose beizubehalten. Dies erfolgte durch Einleiten von Glucose in das Fermentationsgefäß mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 g/l-h.
Ungefähr 72 Stunden nach Beginn der Animpfung der Erstphasen- Fermentation begann die Natamycinproduktionsgeschwindigkeit abzufallen. Die Konzentration der Brühe betrug etwa 3,9 g/l. Das Zweitphasenmedium wurde zugesetzt, und die Fermentationsbrühe wurde mit einer Geschwindigkeit von etwa 12 ml/h aus dem Fermenter abgezogen, um ein konstantes Brühenvolumen von etwa 600 ml beizubehalten. Das Produktionsmedium umfaßte ungefähr 19,5 g/l Sojaproteinisolat, 4,5 g/l Hefeextrakt, 50 g/l Glucose und 0,2 ml/l Entschäumer.
Die Zugaben und das Abziehen wurden bei etwa 12 ml/h fortgesetzt und die Fermentation weitergeführt, bis etwa 200 Stunden nach Beginn der ersten Fermentationsphase. Die Natamycinproduktion war während dieses Zeitraums nur mittelmäßig, wobei die Konzentration an Natamycin in der Brühe etwa 4,5 g/l betrug. Dieses Produkt wurde aus der abgezogenen Brühe gewonnen.
Zur Steigerung der Natamycinproduktionsgeschwindigkeit wurde das Medium zu der folgenden allgemeinen Zusammensetzung umgeändert: 26 g/l Sojaproteinisolat, 6 g/l Hefeextrakt, 80 g/l Glucose und 0,3 ml/l Entschäumer. Die Zugaben des gesteigerten Nährmediums und der Abzug von Brühe erfolgten kontinuierlich mit etwa derselben Geschwindigkeit. Nach etwa 250 Stunden von Beginn der Phase 1 hatte das Natamycin in der abgezogenen Brühe in der Konzentration bis auf die hohe Ausbeute von etwa 8,5 g/l zugenommen, wobei die Konzentration während des Restes der Fermentation ungefähr konstant blieb. Nach etwa 450 Stunden wurde der Prozeß abgebrochen.

BEISPIEL 2

Das Verfahren im wesentlichen wie in Beispiel 1 wurde durch Phase 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Produktionsmedium für Phase 1 ungefähr umfaßte: 26,0 g/l Sojaproteinisolat, 6,0 g/l Hefeextrakt und 0,3 ml/l Entschäumer.
Nach etwa 70 Stunden von Beginn der Phase 1 an erreichte die Natamycinkonzentration etwa 6,0 g/l, und die Phase 2, der kontinuierliche Betrieb, wurde gestartet. Das Medium für die Phase 2 umfaßte ungefähr: 26,0 g/l Sojaproteinisolat, 6,0 g/l Hefeextrakt, 80 g/l Glucose und 0,3 ml/l Entschäumer. Das Medium wurde mit einer Geschwindigkeit von etwa 12 ml/h zugegeben, und die Fermentationsbrühe wurde aus dem Fermenter abgezogen, um ein konstantes Volumen von etwa 600 ml beizubehalten. Bei etwa 117 Stunden war ein stationäres Gleichge wicht erreicht, und die Natamycinkonzentration betrug etwa 8,0 g/l. Diese blieb bis etwa 250 Stunden konstant, wonach die Fermentation beendet wurde.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Natamycin durch Fermentation, welches umfaßt.

(a) wenigstens 2 Fermentationsphasen, wobei die erste Phase ein Nichtgleichgewichtszustand-Kulturwachstum und eine Natamycin-Produktionsphase, während der die Natamycin-Produktion die Konzentration in der Fermentationsbrühe vergrößert, umfaßt, und eine zweite Phase, die eine Gleichgewichts zustand-Kulturvermehrung und eine Natamycin-Produktionsgeschwindigkeit umfaßt, bei der während der zweiten Phase die Fermentationsbrühenzusammensetzung und das Volumen im wesentlichen konstant bleiben;

(b) Verwendung eines Inoculums, welches einen Natamycinproduzierenden Streptomyces-Stamm in einem Inoculummedium umfaßt, welches 2 bis wenigstens 16 g/l einer Proteinstickstoffquelle und eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle in entsprechender Menge umfaßt, um eine völlige Kohlenstoff-Verarmung während der Inoculumherstellung zu vermeiden, wobei das Inoculum dem Erstphasen-Fermentationsmedium in einer Menge von 0,1 bis wenigstens 10 Vol.-% zugesetzt wird;

(c) Verwendung in der ersten Fermentationsphase eines Fermentationsmediums, welches wenigstens 15 g/l Proteinstickstoff und eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle umfaßt, die ausreicht, um eine Kohlenstoffquellenkonzentration in der Fermentationsbrühe im Bereich von 5 bis 40 g/l aufrechtzuerhalten;

(d) kontinuierliche Zugabe zu der Erstphasen-Fermentationsbrühe eines Zweitphasen-Fermentationsmediums, das in der Lage ist, hohe Natamycin-Produktionsgeschwindigkeiten zu unterstützen, wobei das Medium wenigstens 15 g/l Proteinstickstoffquelle und eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle in einer Menge umfaßt, um die Natamycin-Produktion zu unterhalten;

(e) während der Zugabe des Zweitphasenmediums werden die Bedingungen des Gleichgewichtszustandes der Fermentationsbrühenzusammensetzung und des Volumens durch volumengleiche Mediumzugaben und Fermentationsbrühenentnahmen erreicht; und

(f) Gewinnen von Natamycin aus der entnommenen Fermentationsbrühe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem das Belüften des Fermentationsmediums mit einer Geschwindigkeit, die ausreicht, um ein Rühren des Fermentationsmediums zu bewirken, umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das außerdem das Sterilisieren des Fermentationsmediums während des Verfahrens umfaßt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Proteinstickstoffquelle eine Nichthefe-Stickstoffkomponente und eine Hefe-Stickstoffkomponente umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die beiden Proteinstickstoffkomponenten in dem Verhältnis von Nichthefe- Stickstoffkomponente zu Hefe-Stickstoffkomponente von 5:1 bis 11:1 vorhanden sind.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fermentation durchgeführt wird, um eine Natamycin- Konzentration in der Fermentationsbrühe von wenigstens 4 g/1 zu erzielen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Natamycin-Konzentration wenigstens 7 g/l beträgt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Natamycin-produzierende Streptomyces-Spezies Streptomyces gilvosporeus ist.