Λ 6 Β6 Q134S^- 五、發明説明（i) (請先閲讀背面之注意事项再填窝本頁) 發明背景 本發明係闞於利用接種物之連網發酵作用，经》長時間 得到連續高產量的萘達徽素之萘達徽素的產製。 萘達》素是多烯類之抗鼸菌素中的一員。此化合物萘達 徽素是具有分子量約666的四嫌（tetraene) ’其實驗式一 般相當於C33IU7N〇13，且含有—個塘苷鐽结的部分，胺基 徽糖（nycosanine)。蔡達徽素具有約pH6.5之等電點’且 其構造K兩種结構代表性地存在：烯酵结構以及酮（基）结 構。 Μ傳统之爐式（batch-type)發酵方法來產製萘達徽素已 描述於美國氰胺之大不列顛専利846,933號中。（大不列 顛暨北愛爾蘭）睇合王國專利846 , 933號中的公告事項亦 合併於此Μ作為參考。 不論萘達*素之抗生素或抗興菌的價值•而此種產品卻 很少被用於商業上的使用。Μ於此種限制的一個主要原因 為其具有非常昂貴的製造價格。 經濟部屮央櫺準局貝工消#合作社印製 本發明之目的為克眼傅统方法的無效率，並於成本一效 益方面，搮供一種為了產製有效量的萘逋徽素，利用在預 定培養液中Κ殖並發酵接種物的連續方法。 發明槪述 本發明係Μ於萊埋徽紫之發酵製備，此處為連續地完成 發酵作用。埴種發酵方法包括兩個基本階段，第一俚階段 由培養物R殖所姆成，而第二個陏段為蔡達徽紫之產製所 構成。此方法之结果為赛達徽紫的連績高量生毫·即在整 -3 ~ 本紙5fc尺度边用中國國家櫺準(CNS)甲4規格(210x297公釐） Λ 6 Β6 213489 五、發明説明（2 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 届長時間的發酵期間内，約為4克/升到少約12克/升。 本發明使一種能夠產生萘達徽素的微生物連績發酵。本 發明並特別針對製備（例如：孢子生成）及繁殖接種物’包 括鍵徽菌種，它能在發酵期間產製萘達徽素° 萘達徽素之高量產生在烴濟上是重要的’因為可埔進從 發酵肉湯中回收萘達徽素的容易性。更進一步地*藉本連 鑕產製作用可提供發酵設備的成本一效益，並對產製培養 液更有效地利用。連續發酵法比起一系列之爐式培養操作 法，亦減少製備所需要之接種物的數量。 圖表說明 匾一為對於接棰物之繁殖，本發明所使用之方法的方塊 概要圖。 圈二為本發明之連續萘達徽素發酵遇程期間内，發生的 兩個階段之座標式描述。 發明說明 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 依據本發明將能夠產生萘達嫌素之微生物放置與預定培 養液接觸，來產生接棰物*然後再放人一種預定的發酵產 生培養液，其將在稍後的繁殖及埋續產製萘達讖素之期間 中·支持微生物之最大限度的代謝活動。在連續發酵的期 間•微生物至少轉變一部分的預定產生培養液成為萘逹徽 本發明之發酵«程包括兩0階段。第一倨階段包括含有 培養物鏈讖Η種之接種物的K殖，它伴《著有許多赛埋徽 素的產製。萘達徽素之產製速率在第一俚階段的期間内， -4- 本紙51尺度遑用中ΒΒ家樣準(CNS)甲4規格(210x297公*) " 213469 Λ6 _Bj6 五、發明説明（3 ) 從零增加至第二價階段的穩定吠態速宰。第二届睹段主要 針對在高速率之平衡或穩定吠態的萘達微素產製》埴樣可 獲得的發酵肉滿濃度約為4克/升到至少約12克/升。當 培養物的繁殖為最大活性之時，這兩俚階段可以於一些萘 達霣素正在進行產製處形成重疊，且在萘達徽索產製的整 儸期間中，培養锋也持續地生長。 在第二個階段期間*會達到預定的平衡狀態，並維持下 去，以使得培養物之繁殖和高萘達徽素的產製速率保持大 約固定不變。埴種培養物繁殖/高萘達黴素產製速率的平 衡吠態，可«下列兩項來達成：1)在適當的時間開始將連 績產製培養液，持纗地加人到發酵器（fernenter)中·以 维持培養物繁殖和萘達徽素產製的固定速率，與2)移出含 有發酵肉湯的萘達黴素。於連續或第二個階段中，維持肉 湯濃度與《橫的固定。然而，若需要可藉修改所加入之培 養液的姐成或速率，可獲得不同的萘達徽素之產製速率。 理論上在埋續產製階段中之平衡狀態仍舊不能確定。然 而，在本發明的實行上，此連續階段亦受到污染及設備的 功能不良之限制，而一般被延鑛至少約40夭之久，或直到 萊達徽素之產製減少至不合乎經滴效益的生豪速率。 本發明之容許埋續發酵反應的Μ継狀況具有下列特徽： 1. 將用KSf殖培養物的接種物培養液之組成導入發酵物 (fernentor)中Μ開始發酵作用的第一個陏段。 2. 發酵作用至少有兩儸®段；第一 0®段包括不穩定状戆 的培養物生長/萘達徽素之產製.在埴段期閜内萘達徽索 -5- 本紙張尺度遑用中國家«準(CNS)甲4規格(210父297公货) (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 装. 線.
經濟部屮央梂準妁貝工消#合作社印製 J 2134S3 Λ 6 Β6 五、發明説明u ) 經濟部屮央標準局员工消費合作社印製 之產製速率會增加*而第二β睹段則包括在一預定的平衡 吠態下培養物之繁殖/高萘達徽素之產製。 3. 發酵培養液之组成份。 4. 在第二階段期間中，固定不變的發酵肉湯之體積、組成 及培養物之潇度，可藉著加入發酵培養液並以移出等量體 積的發酵肉湯來平衡後而完成之。 5. 所選擇的培養液加入/肉湯移出速率，要盡可能地使培 _液之消耗及萘達徽素之產製，達到經濟上最大的限度。 6. 若需要可將萘達微素從移出之發酵肉湯中回收或分離出 來。 依據本發明，可使用包括產製萘達黴素之鍵黴菌種的任 何微生物。一較佳的鏈黴菌種中包括土黃色孢子鏈黴菌 (Streptoiayces g i 1 v o s p o r e u s )，它以前已被貯藏於美圃 典型培養物收集中心（American Type Culture Collection) (ATCC) ’ 位於美國 Rockville, Maryland, 並被登記為ATCC 1 3326號。 被發ϋ里種物，是由摩嘗薄子的孢子懸浮液所製備出 ........ .......... . .. ...... 的。當把逋當的鐽靄菌種之接種物置人本發明之連鑛發酵 培餐液中時，此接種物會接著發酵而產製高量的萘達徽素 。使接種物典型地暴II於一系列的κ殖步驟中.其中每個 步明都增加逭偭竈製萘達徽索之鏈徽Μ细胞的ft。在鍵徽 菌佃胞的ft足夠之後，將鍵徽菌暴11於一種當鏈徽菌種在 發酵時.被設計出來用Μ完成連緬之蔡達徽紫產製作用的 環堍及/或馅養液中。 -6- 各紙張尺度制中Β 家料(⑽甲4規格(21GX297公址) 一· (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 213489 A 6 B6 五、發明說明（5) 經濟邡屮央楳準XJ员工消t合作社印製 S-5_JBLSJE_ 開始做接種物是拜著收集由美國典型培養物收集中心獲 得的能產製萘達徽素之鐽徽菌種的孢子。使這孢子發芽來 產生鐽徽菌種的活躍生長之培養物。將活躍生長之鏈黴菌 種培養物（例如土黄色孢子鍵徽菌或任何其他的產製萘達 徽素之種類）濃密地接種於無菌的（例如，經高懕消毒的 )瓊脂斜面上，並培養直到斜面大體上完全覆滿孢子。將 瓊睢斜面上的孢子刮入少量的液體中，像是水（例如蒸》 水），有營養的培養液等等中，以製成液態抱子懸浮液。 繁殖所得的孢子懸浮液，以產生用於發酵作用的接種物。 為了得到最佳的结果•用於闋始接種物繁殖作用的孢子》 浮液應含有約15 S-IO1。群落形成單位（CFU) /奄升的孢子濃 度，而一般至少要含有約10'群落形成單位/奄升。 許多可用於促進鐽徽菌種（例如：土黃色孢子鏈鼴菌） 培養物之孢子生成作用的瓊脂斜面培養基，將能被用於形 成孢子懸浮液。通當的瓊脂斜面培養基，至少由下列集團 中的一員代表性地構成：酵母麥脂、Hickey-Turner 瓊脂、GYA瓊脂、P「idhan瓊脂、禺妗薯右旋耱瓊脂、 Bennett's瓊脂等等。 在p f懸浮液中之高濃度（例如·· _丨_〇_1群落形成單位/ *升）有發菏能力的孢子，是本發明的明蹲巧況◊首先， 若孢子的濃度太低•將在接種物K殖的轚俚期間中*躭萘 達黴素發酵產製作用的成本一效益而言•花费非常長的時 間以獲得足夠量的鏈鼸菌细胞。其次，在®浮液中滅少了 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂_ 線- 本紙張尺度逍用中《 *家樣率(CNS)甲4規格(210x297公釐) Λ 6 Β6 2ΐ34β^ 五、發明説明（6) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 的孢子量•延長了鍪届接種物繁殖的時間，而增加污染的 可能性（例如：被不想要的有檐物污染）。再者，懸浮液 中的低孢子濃度可能傾向於促進大而緊密包袤之菌躲Η園 球的形成。這類圚球對於獲得萘達黴素的高霣生產是不遘 合的，因為與氧之轉移*養份大量轉移至匾球中等問覼有 闥聃。萬一菌躱《圇球的大小變成不符合需要的，可將圚 球以物理性地弄破使之分開，像是使用剪力（例如：攪碎 )° 接種物的g猪 使上述討論的液態孢子《浮液（例如：土黃色孢子鍵徽 菌）發甭*並使细胞持績增加至足夠數量的微生物來為萘 達緻素之發酵產製作用，被用作液態接棰物。逋當的接種 物细胞密度包括約1至5克/升之乾细胞重，並以約佔萘達 徽素產製培養液體積0.1至10!»；的體積來使用。 經濟部中央櫺準局貝工消費合作社印製 接種物繁殖所用的液態培養基決定了接種物的细胞密度 及代3|咕JI (例如··想要的是適當密度之健康佃胞）。足 量的含有複合生長因子（例如：維生素群）之蛋白氮、無機 元素（例如：鉀、納、鈣等）*以及撤置元素（例如：硼 、鈷、撖、綢、鋅等）·需要這些物質以普通程度存在於 蛋白氮源之中| Μ使得接棰物能維持想要的细胞密度及代 謝吠態。將使孢子》浮液繁殖而變成將發酵產製出想要的 高產最萘達徽紫之接種物的蛋白氮源，可以是任何來源的 〇 必須Μ —足夠來完成想要的接種物佃胞密度之最來供 給可代謝碳源予液態接種物培養基。為了得到最佳的結果 -8- 參紙張尺度边用中國家樣準(CNS)甲4規格(210X297公龙) 五、發明説明（7 ) Λ 6 B6 •這類碳源在接種物繁殖期間不應完全被用完。碳灌消耗 殆盡易傾向使接種物的代謝狀態進行不利的轉變，造樣可 等致在發酵期間減少萘達嫌素的產量。 雖然依據本發明，可有效地使用各棰液態接種物培養基 •但要獲得高產量的萘達鼸素，使用預先決定量之培養基 成份是有利的。 以水（例如：低碾物成分水、蒸籣水等等）製備對接種句 繁殖而言邂當的培養液*並包括： -η a) 蛋白氮源之结[量從約2至16克/升，一般約為8克/升 :以及 b) 存在之可代謝碳湄的缌量，需足夠以避免所有的碳消耗 殆盡，通常為5-30克/每升培養液，而一般為約15克/升 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝· J4 . 兩種通用於接種物繁殖的特殊姐成之培養液提供於下： 線 經濟部中央楳準/{.;貝工消货合作杜印製 姐成1 量 Difco”Bacto”蛋白課 5克/升 王米浸潢液 3 ” 氛化钠 1〇" «萄糖 15” 姐成2 fi Hormel蛋白 WPSR5 8克 / 升 氯化納 1〇” 葡萄粞 15" 本紙5t尺度遑用中《困家楳华(CNS)甲4規格(210x297公龙) Λ 6 B6 五、發明説明（8 ) 能提供促進鍵徽菌细胞之鏖生速率之營養的接種物培餐 液，可蕕傳統技術來製備（例如：在約120°至140°的溫 度下，分離或同時將碳及氮源滅菌）。於接棰物培養液滅 菌後，必須使其具有約為7的pH值。將孢子懸浮液引導入 接種物培養液中，並加热此接種物培養液至約25至40 t：之 溫度，而一般約為28至351C。 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事项再填寫本頁) 為了得到就萘達》素之連續發酵產製作用而言，想要大 最應稹的液態接種物，需要_[届接棰物繁殖步矚，且每僩 步《實行後得到的體積均會多於前一個步》。例如，以一 種在綑胞數量上能獲得指數增加的方法，來烴營接種物的 繁殖。在繁殖期間*藉著於》殖作用的每一儷步驟之中有 效地增加接棰物的體積，是特別有益於使培養物保持在一 抱數生長的横式内。埴棰做法可利用將每届步驟的期間減 至最少，或將步睇的次數減至最少來完成。例如，一旦已 達到接種物之預定佃胞密度時，便將接種物轉移至較大的 環堍（例如：容器）中，以進行更進一步的繁殖。藉著有 效地控制接種物的繁殖，僅需貢獻最低限度的時間及花費 予接種物之繁殖，因此在發酵期間，成本一效益上之萘達 徽素量會增加。 一糸列接種物«殖步《中·個別步《所能容許持續的時 間畏度依賴於培養液的姐成、想要的鍵讖菌细胞ft、溫度 等等。每個的K殖步W·代表性地可被經營約6到至少約 24小時。 接種物K殖的《程中需要對接種物通氣。例如：可將容 -10- 本紙張尺度边用中家樣準(CNS)甲4規格(210x297公 A 6 B6 2134B9 五、發明説明（9) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 器或燒瓶置於旋轉攪拌器上，以約200「pm之速度來攪拌之 。於本發明的一種吠況下，可»著放置葉輪於容纳接種物 的容器之中，當強行使無菌的空氣進入容器的底部時•便 攪拌了接種物。 現在參看圈一，此圈為可用於產生被發酵後產製桊達黴 素之接種物的《要方法。一說明了於接種物中，以繁殖 作用而達成的测定髓積之增加，此種繁殖作用，必須得到 的液態接種物的霣，要在成本一效益方面足夠產製萘達緻 素。例如：藉著將25升的接種物加入含有1225升的液態接 種物培養基的容器中，使接種物之《積由25升增至12 50升 Ο 經濟部屮央揼準而貝工消費合作社印製 將繁殖好的接種物導入容纳有發酵培養基的發酵物中。 在發酵作用的第一個階段之期間内，培養物迅速持縯進行 繁殖作用，並伴《著漸增的萘達黴素之產製。而在發酵作 用第二個階段的期間，萘達*累產製的速率通常約於一天 中穩定至高產量*並持續數天之久。肉湯中萘達霣素的濃 度大致上以固定的速度增加，直到萘達«素的產製速率開 始降低，埴經常是因為接種物培養液成分中有一樣或多樣 消耗殆盡。 發酵作用的第二階段開始於萘達徽素產製速率開始衮退 之前或衮退不久之後。可繭邃緬地監視發酵肉塥中萘埵霣 紫之濃度*來決定桊達徽紫的產製速率。當巳到達第二階 段時，加入培養液與移出肉湯的速率為同等的。拜著監視 -1 1 - 各紙51尺度逍用中B B家樣竿(CNS)甲4規格(210x297公货）_ 五、發明説明豕Ο) Λ 6 Β6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 移出發酵肉湯的姐成份，可調整培養液加入/肉湯移出之 速率，Μ得到發酵培養液之最佳利用。當在發酵肉湯中的 > 任何成份•且那些是正被加於培養液中的成份，減少至0 之穩定狀態濃度時，可達成最大限度可能的培養液利用。 依據培養液與設備的成本*有時Μ比起提供最大限度可能 的培養液利用上較快的速率來加入培養液並移出肉湯，可 能是經濟上所想要的。 可利用任何能接受的技術，來執行培養液的加入與肉湯 的移出。例如：利用幫浦（如：真空幫浦）、壓力、重力等 •完成培着液的加入及/或肉湯的移出。 對連纗產製最適宜的產製經濟學而言，若需要則可將第 二階段的發酵培養液於姐成上或在任何時機的供給速率上 加Μ調整，或甚至對其進行重大的改變。主要也依賴所用 的設備，使得間歆地加入培養液及/或移出肉湯可以是令 人想望的，只要全部的平均肉湯體積大約维持固定。而且 可使第二階段培養液的加入早點開始’約在第一階段的末 期；但直到達成上述討論的平衡或穩定狀態•才能開始第 二階段。 在第二階段期間中，將含有萘1S*素產物、生物集團（ 例如：鍵》团佃胞），以及產製培養液的發酵肉湯連續地 移出•並從移出的肉满中回收莱逹鼸紫產物（例如：過濂 、離心等）•或是混雜著有生物集團的萘達》紫產物’再 /或將莱達《素提取出來（例如：W结晶形態學）。可播 任何能獲得有用形式及數霣之萘達緻紫的適當技術來回收 -12- t (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝< 訂_ 線. 本紙張疋度逍用中《家樣準(CNS)甲4規格(210x297公救) ai34S^___ 五、發明説明（11) 案達»素。一旦萘達徽素與生物集團混雜在一起’若需要 貝丨j可使用任何應當的技術，將萘達徽素從生物集團中回收 出0 可使持績穩定狀態的第二倨發酵階段維持一段延長的時 期，而主要僅受污染的傅入或設<備的功能不良限制（例如 :本發明可持續至少約40天之久）。 連績的萘達嫌素之產製，是在能夠容納發酵過程的發酵 容器中受到處理。對於達到萘達徽素的最大限度之產生而 言，一個重要的要素是液態發酵培養基的姐成份。這類發 酵培養液必須含有逋當量的可代謝碳及蛋白氮。培餐液含 有複合生長因子（例如··維生素群）、無機元索（例如： 鉀、納、鈣等），以及微霣元素（如··硼、鈷 '娥 '铜、 鋅等），這些是Μ普通程度出現在蛋白氮源中•這樣亦是 令人想要的。 Μ水（例如：低碾物成分之自來水、蒸皤水等）製備對 發酵作用而言通當的培養液，並包括： (⑴約佔80 -250克/升的可代謝碳源；Μ及 (b)至少15克/升，而一般約從20克/升至80克/升的蛋白 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝- 訂_ 線· 經濟部屮央樣準沿貝工消费合作社印製 酵氮般 及白一 份蛋， 成棰在 氮兩存 白逭來 蛋，画 母容範 酵内 非之 由K 可白 源蛋 氮抽 白依 蛋。5 種成約 谙構由 。 所以 素份別 元成分 最氮常 微白通 及蛋份 霣母成 至 例 比 的 届酵 鳖發 持在 維。 地霣 續的 持氮 K 白 . 蛋 源及 來碳 之謝 當代 遘可 入中 加液 的養 等培 對酵 且發 讀在 連段 著階 佳賴二 最 第 為 約 果 结 本紙51尺度逡用中面β家樣準(CNS)甲4規格(210x297公ft) 2134B3 A 6 B6 五、發明説明（12) .經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 培養液中之特定來源的量，可躇監視移出之肉湯來決定· 並進行任何迪切的調整。 蛋白氮源可由廣泛範園的來源迪緬地補充。例如：大豆 蛋白質產物（如：分蘼物、粉末、碎粉等），可由非酵母蛋 白氮源所構成（例如：用含有80-9 5%蛋白霣的大豆蛋白霣 來源，可獲得想要的萘達徽素的產生）。這種蛋白氮也可 包括牛肉萃取物、蛋白質水解產物（例如：朦類）*及/或 酵母（例如：萃取物、自溶產物等）。 如上文中所討論的，產製培養液也必須含有可被鐽徽菌 種代謝的碳源。造種碳源可Μ任何便利之形式來供給，諸 如«萄糖、多_、玉米及馬钤薯澱粉等等。 此外•在本發明的一種狀況下，不必一開始就將產製萘 達徽素所需的碳源總量全部導入於萘達徽素產製培養液的 起始成分中（例如：起初的碳源量對完成發酵而言是不足 的）。在本發明的此種狀況下，於第一階段的期間中•可 在萘達緻素產製期間來執行碳源的加入· Μ致能夠使碳源 数量維持在約5 — 30克/升*且經常為20克/升。因此 一開始就在發酵培養液中加入固定量迪當的碳源，並在 發酵作用閬始之後再次加入。在第二階段、連緬萘達臌素 產製的期間内，W預定之速宰加入見渾.此速宰與萘壤雪 零孝製培f里之加入速率里fcb逆。較佳的碳源加入速率為 足以提供維持連續高速之萘達鼸紫產製的破源最•且沒有 從發_物中移出未綬消耗完的磺源（例如：*際上《(源的 量與必須維持發酵過程之發酵培養液中的特定量碳源相等 - ..._ _________ 一 — —·— - - — ..... -14 - 本紙Λ尺度遑用中覼國家#Jf(CNS)甲4規格(210X297公ϋ) ' ~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂· 線· Λ 6 Β (3 2134S9 五、發明説明（15) )° 在本發明的其他狀況下，可把碳源當作是產製培養液的 —部分來加入，在這類案例中’碳源加人的速率由產製培 養液加入的速率來抉定。 為了鏈黴菌發酵和產製萘連徽素*提供營養的萘達徽素 產製培養液，可《傅统之技術來製備（例如：在約120至 140=C 的溫度下，將碳及氮源分難或同時進行滅菌）。滅 菌後的產製培養液必須具有約為7之pH值。在本發明的一 棰狀況中，發酵培養液可在置於發酵物的途中加Μ滅菌。 例如，被連纗供給於發酵物中的發酵培養液，可使其通過 管茼、導管•或其他能將發酵培養液滅菌的逋當方法（例 如：連續滅菌器）。 哆接種物導入發酵容器中直到在產製培養液中達成ϋ «計約為0 . 1至1 0¾的濃度，..通常約碜(例如：接棰物的 量可足夠接種大部份的連缅發酵物）。發酵物的剌餘體積 則含有發酵培養液。任何為了將接種物等人發酵物中之產 製培養液的•並以活性代謝狀態來傅埋接棰物的技術部能 被接受。 使發酵或產製培養液達到約25°至40。的通度，且一般 在 28° 至 35C。 在發酵期間供*氧予萘達徽紫產製培養液。迫樣有益於 在發酵作用的主要部份期間•能維持約佔飽和氣體20¾至 80X的產製培養液中之溶氧量。逹到通當溶氧量的能力， 可藉著通氣與/或攪拌埋率进當的調整來促進之。例如， -1 5 - 本紙Λ尺度边用中《«家«準（CNS)甲4規怙（210x297公；¢) (請先閲讀背而之注意事項再艰-¾木Π) 裝· 線- 經濟部屮央標準处1:1工消«-合作杜印54 81. 6. 10,000¾ (II) 213 4&^· 經ifr部屮央標準而R工消作合作社印製 五、發明説明ΟΛ) Κ強迫灌氣（例如：無菌的空氣）使發酵或產製培養液通氣 ，通常Μ每體積發酵培養液對約0.3到至少約1.0體積空氣 的速率來通過發酵培養液。於本發明的一種狀況下，當通 氣時攪拌發酵培養液是想要的。更進一步也可使通氣速率 足Μ引起發酵培養液的攪拌。 / 現在參看圈二，就本發明的兩《基本階段顯示出時間與 萘達徽素產製速率之間的相醑性。第一個階段包括了伴》 著一些萘達徽素產製的鍵黴菌種之繁殖。萘達徽素連續產 製之第二階段，是當在培養液加入肉湯移出之間達到平衡 時確立的。第二階段一直持績到萘達《素不再以合乎成本 效益的方式產生（例如：污染使此過程成為無效率的）。 於本發明的一種狀況下，當想要控制起泡沫時，可以在 發酵培養液中加入去沫劑（例如：矽去沫劑），以按體積 計約佔發酵或萘逹徽素產製培養液0.01%至u的量。 在加入接種物後具有約ΡΗ7.0的萘達纖素產製培養液， 在發酵期間會代表性地媛慢降至約4.5 。降低的pH值是鍵 鼸菌種代謝活勡的结果。依據最後使用的發酵肉場，對於 發酵培養液而言，具有降低約pH值亦可為想要的。然而， 若痛要則可《著適時的加入酿性物霣，來增加或控制pH值 (例如：可在發酵培養液中持網地或間敢地加入氳氣化鉀 ，以維持某種pH值）。也可藉改變培養液姐成及/或培養 液加入/肉湯移出的速宰，來增加或減少pH值。 當將本發明遘當地實施時（例如：有效的處理踺徽菌接 種物，同時加入培養液並移出肉湯等等），因而產生的發 16- (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂- 線· 本紙ft尺度遑Λ中《«家《準（CNS)肀4規格(210x297公龙） 81. 6. 10,000« (I!) 2 經濟部屮央標準XJCX工消IV合作社印32. ___^ 五、發明説明（15) 酵肉湯中一般將含有至少4克/升的蔡達霣素。在某些莱 例中，萘達徽素產製量可在約7克/升到至少約丨2克升的 範圍内。 本發明Μ下列實例証明，此實例企圖以圈解說明，並不 限於這類打算之同等範圍。除了其他特別指定的，係用可 經商業上獲得之製劑等级的材料來經營下列寶例。 實例1 在下列賁例中，Κ蒸皤水來製備下列一般姐成的瓊脂斜 面。約在121= 下進行滅菌15分鐘。 3克/升酵母萃取物（Difco”Bacto”酵母萃取物） 3克/升麥芽声取物（Difco麥芽萃取物） 5克/升蛋白** (Difco”Bacto”蛋白課） 10克/升葡萄糖 1 5克/升瓊脂 U 以蒸豳水製備下列一般姐成的接種物培養液，並以氫氣 化鉀調整pH值至約7.0 。在121 C下進行滅菌約15分鐘。 1 5克/升《每糖 I 1 0克/升氛化納 I ί 6克/升玉米 1 1^5克/升蛋白W (Difco”Bacto”蛋白課） 由ATCC獲得的土薈ft孢芊HiaiM · ATCC登記1*碼1 3326 ’ W冷凍乾埭孢子》浮液用作為培養來源。使培«物在 接種物培養液中生長，並以瓊脂斜面支持，在約25 1C下來 進行孢子生成。以瓊脂斜面之培養物為接種物發育的闋始 -17- (請先閱讀背而之注意事項#蜞寫木好) 裝· 訂_ 線 本紙张尺度遑用中《明家4J毕（CNS)T4規彷（210x297公*) 81. 6. 10,000ft (!!) Λ 6 η 6 213482 五、發明説明孚6) (請先閲誚背而之;£.意卞項外蜞寫木頁) 為了產製作用的瓊脂斜面，進行接種物瀠密的孢子生成 作用在約10天的範圏内。為了得到約10β群落形成單位/ 奪升的孢子懸浮液濃度，將孢子從埴些瓊脂斜面上刮至接 種物培養液中。在500橐升折流燒瓶（baffled flask)中 ，約100奄升的接種物培養液加入大約2奄升的孢子憑浮 液。K三個步驟來培養此培養物，鳌個培養遇程約48小胃 •並於約291C下在旋轉攪拌器上Μ約240rpm攪拌之。前兩 涠步驟合為12小時，而第三個步明約為24小時。對於第二 及第三個步驟，將前項步驟之2S；體積的新鲜接種物培楽液 導入。因而產生的最終接種培養物，以所需要的接棰灌度 用於接種產製培養液。 第一階段的萘達黴素產製培養液，具有下列—般起始之 组成： 19.5克/升大豆蛋白霣分離物40^「<^3«1”59?0) 4.5克 / 升酵母萃取物（Stauffer, Type KAT) 0.2* 升 / 升去沫劑（Mazu, DF 289) 經濟部屮央樣準·知员工消费合作社印製 在一升的發酵器中以蒸餾水製備約600毫升的培餐液’ 並MM氧化鉀調整pH值至約7.6 °然後在約121 Ό下將1 升發酵器滅菌約15分嫌。也是第一陏段培餐液之一部分的 葡«糖· Μ大約505Ϊ之蒸钃水溶液分開加以滅菌，並以約 40克/升的灞度加人起始培養液中。在接種之前，將產製 馅養液加熱至約29Τ，設定約250«升/分鐘的通氣速率· Κ及約為500rPB的搢拌速率。 —1 8 _
81. 6. 1〇·〇〇〇Λ W 本紙张尺度遑用中««家«準（CNS) 1M規IM210X297公*) 2134S3 Λ 6 It 6 五、發明説明〇?) 經濟部屮央標準局β工消费合作社印$1 伊樗含有+罗ft孢子鰱徽铺 ATCC登記號礓13326 ，之 Μ體積計約21ί的產製培養液，然後加至發酵容器中以闋始 產製循環的階段1 。在接種後約40小時開始加入葡萄糖* 為能維持第一倨發酵階段中約20克/升的葡萄糖濃度°這 件工作可藉著Μ約1克/小時之速率將葡萄糖供給予發酵 容器中來完成。 在發酵作用第一階段開始的接種後約72小時’萘達徽素 產製速率開始衮退。肉湯的濃度約為3.9克/升。复人第 二_^_^之培養液並從發酵器中Κ約12橐升/小時的速率抽 出發_肉揚.，itkm n mj〇〇 .m里定肉湯腾凰。此產製 培養液含有約19.5克/升大豆蛋白質分離物、4.5克/升 酵母萃取物、50克/升莆萄糖Μ及0_2毫升/升的去沫劑 0 Μ約12奄升/小時連缅進行加人及抽出，並持續進行發 酵作用直到第一發酵階段開始後約200小時。在這段期間 内*萘達》素之產製僅是在核心中部，而在肉湯中之萘達 «素濃度約為4 .5克/升。將此產物從抽出的肉湯中移出 〇 為了增加萘達賺素產製的速率•將培養液改為下列~ )¾ 之姐成：26克/升大豆蛋白霣分《物、6克/升酵母萃取 物、80克/升《每糖以及0.3 «升/升的去床劑。Μ約相 同的速率連續進行巳增加營養之培養液的加入及肉滿的抽 出。從階段1開始後的約2 50小時，在抽出肉溻中的蔡達 徽累，於濃度上已增加至約8 哀/升的高產最，在發酵作 -19- 本q尺度逍用中Η Η家樣準（CNS)肀4規格（210x297公龙） (請先閲讀背面之注意带項再填寫本頁) 裝· 訂· 線- c\ a ^ C ' * Λ 6 _ It 6 一 _ _ 五、發明説明（ia) 用的整倨剌餘期間*此瀰度維持大約固定不變。約在450 俚小時，將此過程中止。 窨拥2 此遇程大體上依據實例1 *通遇階段1來完成，除了階 段1的產製培養液大約由26克/升大豆蛋白霣分離物、6 克/升酵母萃取物Μ及0.3毫升/升去沫劑所構成。 由階段1開始後約70小時，萘達徽素之濃度達到約6克 /升，並開始階段2之連續作用。用於階段2的培養液大 略包括：26克/升大豆蛋白質分離物、6克/升酵母萃取 物、80克/升葡萄糖Μ及0.3氅升/升的去沫謂。以約 12奄升/小時的速率加入培養液並從發酵器中抽出發酵肉 湯，Μ維持約600 «升的固定體檟。約在117個小時已達 到穩定態的平衡狀態，且萘達微素之瀰度約為8.0克/升。 維持造種固定吠況直到約250小時，於此時停止發酵作用 〇 雖然很少的本發明具描«施例在上文中被詳娌加Μ描述 ，但箱热此藝者將承認本發明包含了許多姐合及變化。 (請先閱讀背而之注意事項外蜞寫木π) 經濟部中央榀準而^:工消伢合作社印製 本紙Λ疋度遑用中《«家«JMCNS) Τ4規怙（210x297公龙) 81. 6. 10,000¾ (II)