CN101605883B - 促进乳酸菌产维生素k2的培养方法及其在食品生产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过培养至少一种产维生素K2的乳酸菌提高所得到维生素K2量的方法，其中所述菌株培养在“静息细胞”状态下进行，以致由“静息细胞”培养产生的维生素K2量高于在标准发酵条件下培养所述菌株所达到的维生素K2量，其比率至少等于约1.2。另外，本发明涉及根据上述方法由产维生素K2乳酸菌培养所得到的生物质。本发明还涉及产维生素K2的方法，涉及食品，特别地富含维生素K2的发酵产品和/或新鲜乳制品生产方法，还涉及如此得到的食品。

Description

促进乳酸菌产维生素K2的培养方法及其在食品生产中的应用

本发明涉及为了改善给人类营养供给的含量和质与量平衡而富含营养素、维生素和/或微量元素的食品的技术领域。

更具体地，本发明涉及富集维生素K食品的方法。

更确切地，本发明涉及通过培养至少一种产维生素K2的乳酸菌而增加所得维生素K2量的方法，其中所述菌株培养是在“静息细胞”状态下进行的，以致通过“静息细胞”培养产生的维生素K2的量大于在一些标准发酵条件下培养所述菌株所得到的量，其比率至少等于约1.2。

另外，本发明还涉及根据上述方法由产维生素K2的乳酸菌培养物得到的生物质。

本发明还涉及维生素K2的生产方法，富含维生素K2的食品特别是发酵产品和/或鲜乳制品的生产方法，以及如此得到的食品。

维生素K是一种脂溶性的维生素，它以两种自然形态存在：维生素K1(即叶绿醌)和维生素K2(即甲基萘醌)。

维生素K1是由植物合成的。它主要存在于绿色蔬菜(叶类蔬菜)和大豆油中。

维生素K1更直接地参与凝血过程。

维生素K2本身是由肠菌群细菌产生的。在发酵过程后的某些食品(奶酪，典型的亚洲食品，例如发酵大豆基日本豆面酱和纳豆等)中有少量的维生素K2。许多细菌能合成维生素K2。因此，除肠菌群细菌，特别是大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和类杆菌属的种外，可以列举某些乳酸菌的种或亚种，例如乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis spp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(lactococcus lactis spp.cremoris)、乳明串珠菌、肠膜明串珠菌和丙酸杆菌的种。使用这些细菌合成的维生素K2的量一般是约29～90μg/l发酵乳(Morishita等人，1999年)。重要的是要强调，往往由细胞沉淀物冻干物进行测量产生的维生素K2，这些测量结果表明，产量水平的高度不均匀性随试验菌株而可能由一到三重以上进行改变(Morishita等人，1999年；Parker等人，2003年)。关于生物活性，维生素K2尤其通过它对软组织钙化作用而为人们所知。

开始人们描述了维生素K在血液凝固过程中的基本作用。于是，严重缺少维生素K会引起出血，并且非正常地延长凝血时间以及淤血。人们长久都一直认为，成年人严重缺少维生素K相当稀少，对维生素K的需求可以靠多样平衡的膳食以及体内肠细菌的生产来大大满足。在这一方面，这些危险人群典型地是：

-新生儿，他们的体内没有出现产维生素K的细菌；

-肝、胆或肠功能紊乱的人群(肝病患者、先天性粘液稠厚症患者、结肠炎患者、痢疾患者等)；以及

-长期服用抗生素的人群。

最近，人们发现，维生素K对人的血液的影响不限于其在这些凝血机制中的作用。事实上，从80年代以来，人们还确认维生素K在骨代谢中的作用(Hart等人，1984年；Hart等人，1985年)。

这种维生素在骨形成中的调整骨钙蛋白活性的酶反应中起到辅助因子的作用(Hauschka PV等人，1989年；Ducy P等人，1996年)。更确切地，其作用在于调整骨钙蛋白羧基化，骨钙蛋白是调节骨形成过程的关键蛋白。缺乏维生素K时，这个反应不能进行，因此导致血液中脱羧基骨钙蛋白对羧基化骨钙蛋白比的增加(

等人，1999年)。

西方国家人口变化表现在人口逐渐老龄化，这种老龄化后果与变性病理流行病增加相关，特别地与骨质疏松增加相关。因此，骨质疏松从此以后认为是公众健康的主要问题。

90年代建立的人口评估为人们敲响了警钟，预计未来50年这种病的影响大量增长，尤其是对老年人。因此，所以采取措施预防这种疾病成为当务之急，直到之后稀少地筛查并随后处理。

自此以后，人们知道预防骨质疏松应该从儿童开始，通过最佳骨生长期，并在一生中继续维护骨量(bone mass)骨量。人们知道，这些营养因子在发展和保持骨储备(bone reverse)方面起到重要的作用。直到现在，为防止骨质疏松而期待或提出的营养策略主要基于两个关键因素，它们是钙和维生素D。可是，人们今天知道，一些其它营养因子会具有值得注意的好处。

由于维生素K在骨形成中的主要作用，它在文献中越来越多地出现作为一种保持在人整个生命中骨骼健康的有效途径。

只是考虑维生素K在这些凝血现象中作用时确定了推荐人们对维生素K营养摄入量(1.5μg/j/kg体重)。然而，最近的一些研究提出，如果还考虑维生素K在骨代谢中的活性，则这些推荐营养摄入量最后被低估了(Ronden等人，1998年)。

虽然对维生素K的需要还认识不够，然而低摄入量与低骨量和成年人骨折危险增加相关(Hart等人，1985年；Knapen等人，1989年；Szulc等人，1993年；Booth et al，2000年)。此外，对绝经期妇女的治疗研究表明，维生素K能够允许降低这种目标的骨损失(Shiraki等人，2000年；Braam等人，2003年)。最后，动物研究表明，它在骨量增长的高峰过程中能够起到有利的作用，在与维生素D协同联合作用的情况下更加有利。但是，在目前情况下只是用动物明确进行过将维生素K与骨生长结合研究。

此外，最近研究在维生素K对骨代谢，特别对骨量的组成与维持上的有利影响方面提供了有利论据(Booth等人，2000；Shiraki等人，2000；Braam等人，2003；Hirano et Ishi，2002)。

与成年人的情况不同，获得有关涉及维生素K对儿童骨代谢有益影响的数据还不多。人们仅仅知道，很重要的是优化在其生长期的骨量，以便构建最大的骨储备，防止将来成年人出现骨质疏松危险。

总之，由直到今天所有可获得的数据得出，提高食品维生素K含量是能够让个体构建和保持良好骨组织的特别有利的大有希望的途径。

在这种情况下，在食品市场上已经有一些含有显著量维生素K的工业产品。特别可以列举含有一些乳酸菌的乳制品，例如由本申请人在法国销售的“Petits Gervais aux Fruits”。不过应指出，一方面，这些产品的维生素K含量一般取决于使用酵母类型，另一方面，在这些乳制品中通常使用的乳球菌属的菌株产生的维生素K量不足以真正满足人们需求，甚至不足以有助于暂时减轻可能缺少的维生素K。

因此，在目前的技术中还需要含有维生素K的食品，特别是发酵产品和/或鲜乳制品，它们含有维生素K的量足以能满足这些需求，如果必要，弥补儿童和青少年以及成年人和老年人缺少的维生素K。

在下文中，术语“维生素K2”和“维生素K”毫无差别地用于表示维生素K2。

因此，本发明的目的是符合这种需求，首次提出制备食品，例如发酵产品和/或鲜乳制品，其中在与通常产生维生素K的条件相比非常显著地有利于产生维生素K的条件下进行能产生维生素K的发酵。

另外，在其加工过程中，本发明人获得了自然乳酸菌菌株的新自然变异株，它们产生的维生素K的量比衍生它们的那些天然菌株高得多(参见下面“实施例”部分)。于是，在特别有利于产生构成本发明目标维生素K的实施条件下，能够有利地使用这些“过多产生”维生素K的变异株。

根据第一个方面，本发明涉及通过培养至少一种产维生素K2的乳酸菌，提高维生素K2量的方法，其中所述菌株在“静息细胞”状态下培养，所述的方法至少包括：

a)适当培养基接种活菌细胞量为约10⁸-约10¹¹cfu/ml；以及

b)如此接种的培养基在温度约4℃-约50℃，优选约4℃-约40℃下发酵约4小时-约48小时，优选约8小时-约48小时，以便在步骤b)结束时，由“静息细胞”培养产生的维生素K2的量大于通过在标准发酵条件下培养所述菌株所产生的维生素K2的量，其比率至少等于约1.2。

术语“静息细胞培养”或“在静息细胞状态下培养”是在本发明技术领域中的常用语。因此，“静息细胞”概念对于本技术领域的技术人员而言是十分清楚的。在法国，该领域的技术人员理解并经常使用这些英语术语“静息细胞”，它们因此不需要翻译。应明确指出为应急需，术语“静息细胞”的恰当而不太用法文翻译是“非增殖细胞”。

“标准发酵条件”正如其名称所显示的意思，是指标准的并且是本技术领域的技术人员熟知的条件(也可以说“实验室条件”)。在本发明的意义上这些优选“标准发酵条件”如下：使用市售的M17培养基(Difco^TM M17Agar)或在补充20μl/ml 0.5mg/ml氯化红血素在0.1M氢氧化钠中的溶液的等效培养基上进行这种菌株预培养。为了接下来的培养，使用该预培养物按照1％进行接种。培养温度约30℃。采用简单搅拌进行通气。应考虑到如果需要，本技术领域的技术人员可以根据其一般知识，任选地在进行常规实验后可以改变这些发酵条件。然而，应注意始终保持下述三个主要标准：(i)这种培养基是适于培养乳酸菌菌株，特别是乳球菌属的种的培养基；(ii)往预培养物和/或培养基(优选地，同时往该预培养基中与该培养基中)中添加至少一种含有血红素核(haemcore)(例如氯高铁血红素(haemin)、催化酶或叶绿素衍生物)的化合物；以及(iii)在搅拌下进行预培养和/或培养(优选地，仅仅预培养)。

本发明方法的一些特定实施方式如下：

-在步骤a)中，该培养基接种活菌细胞量约5×10⁸至10¹⁰cfu/ml，特别是约2×10⁹至6×10⁹cfu/ml；

-在步骤b)中，该培养基在标准条件下发酵约12小时-约36小时，优选约15小时-约24小时；

-在步骤b)中，该培养基在这些标准条件下在温度约15℃-约35℃，优选约20℃-约30℃进行发酵。

优选地，在步骤b)结束时，通过静息细胞培养产生的维生素K2的量大于所述菌株在标准发酵条件下培养所得到的量，其比率至少等于约1.5。还优选地，这个比率至少等于约1.7，更优选地至少等于约1.8，还更优选地至少等于约1.9。这个比率值还更优选地是约2、约2.2、约2.4、约2.5、约2.7、约2.8、约2.9、约3。

因此，借助本发明的方法，优选地寻求达到在标准发酵条件下每100g发酵乳的产维生素K2水平为约30μg维生素K2。更好地，这些生产水平可以达到约40μg维生素/100g发酵乳，更优选地，它们可以达到，甚至超过约45μg或约50μg维生素K2/100g发酵乳。因此，约55、约60、约65、约70、约75μg维生素K2/100g发酵乳的生产水平或更高水平是特别优选的。

根据一种实施方式，在本发明方法的范围内使用的产维生素K2的乳酸菌菌株选自乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)。特别是，使用的乳酸菌菌株选自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，葡聚糖明串珠菌、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、丙酸杆菌属的种。有利地，该乳酸菌菌株选自产维生素K2的乳酸乳球菌乳脂亚种的自然变异株，它们是本发明人在下述实施例涉及的工作范围内所得到的：2006年1月20日在国家微生物菌种保藏中心(la Collection Nationale de Cultruedes Microorganismes，CNCM，法国，25胡博士大街(Docteur Roux)，15巴黎投递编码75724，巴斯德研究所)保藏的变异株I-3557、2006年1月20日在CNCM保藏的变异株I-3558和2006年6月19日在CNCM保藏的变异株I-3626。

术语“变异株”这里包括：

-自然变异株，即在选择压力的作用下由标准乳酸菌菌株自发得到的变异株；自然变异株因此没有经受任何遗传学操作，而主要是由参考菌株通过突变和选择得到的；以及

-突变株，在其基因组中包含一个或多个突变，这些突变是采用基因工程诱发的，即采用定向诱导突变形成技术，特别地借助应用于该参考菌株的运载体通过遗传转化诱发的。

在所有这些情况下，这些“变异株”在本发明的意义上是能产生维生素K2的菌株。有利地，如果产生水平是在标准发酵条件(也称之“实验室条件”)下每100g发酵乳至少约5.5μg维生素K2，则能够讲它是“过多产生”维生素K2的变异株。

应该指出，在某些国家(特别是在欧洲)，食品工业家在研制加入微生物，特别是加入活微生物的人类和/或动物食用产品时要采取一些预防措施。事实上，在遗传学上修饰(转基因体OGM或突变体)的生物(这里是微生物)可能使这些消费者产生畏惧和担忧的感觉。这种对转基因体不利的负面形象在某些国家表现为公众倾向于“抵制”含有转基因体的食品。另外，在这些消费者始终要求对提供的食品内容物含量与这些产品含有成分来源更透明的情况下，这些企业可能几乎唯一地，甚至是唯一地提出无OGM的产品。在本发明的情况下，只是使用天然菌株或天然菌株的天然变异株能制备出含有一些微生物的工业食品，这可能是有利的。

根据一种实施方式，在步骤a)中，合适的培养基含有脂肪。它优选地含有至少约0.5％，更优选至少约1.5％，还更优选至少约3.5％的脂肪。这样一种培养基例如可以是乳脂或大豆汁。还可能涉及纯乳或已提高缓冲能力的乳。很显然，还可能期望这些不同培养基的组合。作为“已提高缓冲能力的乳”实例，特别地列举添加了β-甘油磷酸酯和/或柠檬酸酯和/或乳蛋白质和/或任何具有缓冲能力的适当食品配料的乳。

例如，半-脱脂乳典型地含有约1.5％脂肪；全乳一般含有约3.5％脂肪。

在一个优选实施方式中，本发明目标方法还包括至少一个步骤a)的预备步骤，该步骤是在含有至少一种最终浓度至少约0.5μg/ml卟啉的适当预培养基中，在呼吸状态下预培养所述菌株。卟啉浓度和/或浓度范围还更优选地是至少约1μg/ml，进一步优选至少约5μg/ml，尤其优选至少约10μg/ml。

有利地，该预培养物在温度约4℃-约40℃，优选地在温度约18℃-约35℃，其中优选值为约30℃进行保温培养。

预培养物保温培养时间可以随菌株与其它使用条件而改变。该保温培养时间优选地是至少约8小时，更优选地至少约12小时，进一步优选地至少约16小时。

可以采用搅拌或通气进行预培养物的氧合作用。

还可以在预培养预备步骤与本发明目标方法的步骤a)之间进行一个中间步骤。这个中间步骤为，例如通过离心预培养物接着回收细菌沉淀物的方式，对预培养后得到的生物质进行浓缩。

应该指出，考虑到本发明目标在食品领域中的应用，优选地同时满足下述条件：(i)以工业规模应用与开发(在可行性、生产率、成本、设备等方面)，和(ii)适合于食品(在成品的物理和能刺激感官性能方面(味道、气味、质地、外观等))。

本发明第二方面涉及在根据前面描述方法的“静息细胞”状态下，通过培养至少一种产维生素K2的乳酸菌菌株能得到的富集的生物质。

在本发明的第三方面中，使用前面提到的生物质，制备富含维生素K2的食品。

本发明第四方面涉及生产维生素K2的方法，该方法至少包括：

a)按照前面的描述，培养至少一种产维生素K2的乳酸菌，实施提高所得维生素K2的量的方法；以及

b)回收如此得到的维生素K2。

根据第五个方面，本发明涉及制备富含维生素K2的食品或丰富维生素K2食品的方法。

根据第一个实施方式，这样一种方法至少包括：

a)根据本发明第四方面的方法生产维生素K2；

b)往所述食品或往其中间产品添加如此生产的维生素K2；以及

c)获得所述的富含维生素K2的食品。

根据第二个实施方式，制备富含维生素K2的食品的方法至少包括：

a)按照提高由产维生素K2的乳酸菌菌株培养得到维生素K2的量的方法(本发明第一方面内容的方法)，在静息细胞状态下培养至少一种所述的乳酸菌菌株；

b)往所述食品或其中间产品中添加在a)培养所得到的生物质；以及

c)得到所述的富含维生素K2的食品。

或者，可以考虑同时实施上述步骤a)和b)：

a)根据提高在所述食品中或在其中间产品中由这种菌株培养物所得到的维生素K2的量(本发明的第一个方面)的方法，在“静息细胞”状态下培养至少一种产维生素K2的乳酸菌菌株；以及

b)得到富含维生素K2的食品。

在这种情况下，所述菌株可以通过使用就地(在食品生产地)预培养细菌浓缩物，或使用由酵母供应者预培养然后包装并送到一个或多个食品生产地的菌来获得。这些供应者可以包装新鲜或冷冻状态的菌；或者，这些菌可以进行干燥或冻干。在所有这些情况下，人们经常地把这些细菌添加到大量乳(作为任何其它已知乳酸酵母)中。对于接下来的在有利于产维生素K2的条件下培养的步骤，应用了构成本发明其中一个目的的实施条件。

富含维生素K2食品制备方法的另一个实施方式至少包括：

a)把本发明的生物质添加到所述的食品中或其中间产品中；以及

b)得到所述的富含维生素K2食品。

典型地，以相同方式使用该生物质作为通常的乳酸酵母。

本发明的第六个方面涉及能通过实施如上所述方法得到的富含维生素K2的食品。

或者，本发明富含维生素K2的食品含有上述的生物质。

本发明涉及人类和/或动物食品，优选是人类食用的食品。有利地，这样一种富含维生素K2食品增强食用其食品的人类的骨的坚固性。人类优选是儿童。

优选地，在本发明的食品选自发酵产品、发酵或未发酵的鲜乳制品、发酵或未发酵的植物(水果、蔬菜、谷物、大豆等)汁的产品及其组合。更特别优选地，在本发明意义上的食品是发酵产品和/或鲜乳制品。

在本发明的范围内，“鲜乳制品”特别是表示供人类消费的鲜乳制品和发酵乳制品，即鲜乳食品和发酵乳食品。在本申请中，更特别地涉及发酵乳和酸奶。所述的鲜乳食品和发酵乳食品可以是软干酪或瑞士式干酪。

术语“发酵乳”和“酸奶”具有在乳品工业领域中通常的含意，即来自乳品基质酸化乳酸发酵的、供人类食用的产品。这些产品可以含有次要组分，例如水果、植物、糖组分等。例如可以参阅1988年12月31日法兰西共和国官方日报发表的有关发酵乳和酸奶或酸奶的1988年12月30日第88-1203号法国法令。

还可以参阅《食品法典》(由食品法典委员会以FAO和OMS的名义制定，FAO新闻局发布，可由http://www.codexalimentarius.net在线获得；更具体地参见《食品法典》第12卷《乳与乳制品的法典标准》和标准《CODEX STAN A-11(a)-1975》)。

因此，在本申请中“发酵乳”指使用乳基质制备的乳制品，该乳基质进行至少与巴斯德灭菌法等效的处理，用属于每种产品特征种的微生物来接种。“发酵乳”没有经历会减少使用乳基质组成元素的任何处理，特别没有经历凝固脱水处理。采用除由微生物活性得到的方法之外的其它办法都不应该使“发酵乳”凝结。

术语“酸奶”本身是根据始终如一的地方习惯通过所谓特定嗜热乳酸菌保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌培育所得到的发酵乳，它们在其成品中应该是活的，在其乳部分中每克有至少10⁷个细菌。

在某些国家，条例允许在生产酸奶时添加其它的乳酸菌，特别是补充使用双歧杆菌和/或嗜酸奶杆菌和/或干酪乳杆菌菌株。这些补充的乳酸菌菌株用于使该成品具有各种不同的性质，例如有利于肠菌丛平衡或调节免疫系统的性质。

实践中，术语“发酵乳”因此一般用于表示除这些酸奶之外的发酵乳。按照这些国家，它还可以使用各种各样名称，例如“Kefir”、“Kumiss”、“Lassi”、“Dahi”、“Leben”、

“ViIIi”、“Acidophilus milk”。

关于发酵乳，卖给消费者时，在发酵乳基质中含有的游离乳酸量应该是每100g发酵乳基质中不低于0.6g，在乳部分中的蛋白质含量不应该低于标准乳的含量。

最后，名称“软干酪”或“瑞士式干酪”在本申请中是指一种无盐的非精制奶酪，它只是用乳酸菌进行发酵(除乳酸发酵外无任何其它发酵)。根据是否每100g软干酪的脂肪含量高于20g，软干酪的干物质含量可以降低直到每100g软干酪中为15g或10g，或完全干燥后至多等于每100g软干酪中为20g。软干酪的干物质含量是13-20％。瑞士式干酪本身的干物质含量可以低于每100g瑞士式干酪为23g。它一般是25-30％。这些软干酪和瑞士式干酪一般置于在本发明技术领域中通常使用的名称“新鲜奶酪”下。

下面附图说明本发明，既不限制其主题，也不限制其保护范围

-图1：说明乳脂肪浓度对乳酸菌产生的维生素K2的影响的直方图。菌株1和2：乳酸乳球菌乳脂亚种的天然菌株的实例。

-图2：使用全乳产生维生素K2的动力学与乳酸菌天然菌株(1号株)酸化动力学(左上框插入)的实例。

-图3：在不同温度下通过静息细胞培养产生的维生素K2的直方图。对照：在标准生长条件下培养。

-图4：预培养条件对菌株产生的维生素K2的影响的直方图。

-图5：说明自然变异株I-3558起始菌群对用通常乳或缓冲乳进行的在静息细胞期产生维生素K2的影响图。“无呼吸”：通常预培养，然后用全乳在静息细胞状态的培养。“实验室呼吸”：在试管中在呼吸状态下进行预培养，然后用全乳在静息细胞状态下培养。“在缓冲乳中实验室呼吸”：在呼吸状态下预培养，然后用β-甘油磷酸酯缓冲乳在静息细胞状态下培养。“在发酵罐中呼吸”：在发酵罐中进行在呼吸状态下预培养，接着用通常乳在静息细胞状态下培养。

-图6：在静息细胞期自然变异株I-3558的细菌活力对产生维生素K2的影响的直方图。VitK STZ：用链脲菌素处理的在呼吸状态下预培养，然后用添加有红霉素的全乳在静息细胞状态下培养。VitK R+：在试管中在呼吸状态下进行预培养，然后用全乳在静息细胞状态下培养。

显然本发明不限于只是在前面所作的描述。通过阅读作为纯说明性给出的下述实施例能够得出本发明的其它实施方式和优点。

实施例

部分A：获得能产生有利量的维生素K的乳酸菌天然菌株的自然变异株

作为初步意见，应该指出获得下述自然变异株的方案可应用于任何类型的乳酸菌起始菌株。根据本技术领域的技术人员使用的起始菌株，主要由于应用的理由而可能任选地改变由本发明人研制的某些试验条件。不管怎样，本技术领域的技术人员能为下述方法提供的修改应是小的，应只是不涉及任何有创造性活动的简单常规操作。

A-I-耐杆菌肽(bacitracin)的自然变异株的获得与应用

尽管人们知道暴露于例如杆菌肽或过氧化物之类的制剂能用于选择对这些制剂具有增强的抗性的细菌菌株，但文献中从未将耐杆菌肽或过氧化物性与由这些细菌产生维生素K2的水平之间建立联系。

在这些文献中，发明人完全出乎意外地发现了，细菌能对某些制剂(例如杆菌肽或过氧化物)的抗性原有机制加以发挥，涉及到提高维生素K2产量的。发明人充分利用这个发现，为了得到能过多产生维生素K2的乳酸菌菌株的自然变异株(特别地乳酸乳球菌)，例如使用杆菌肽或过氧化物作为选择剂。

A-I-1-获得耐杆菌肽性变异株的方案

在添加有5g/l乳糖(在下文，记为M17 Lac培养基)和氯高铁血红素(20μL/mL)(在下文，记为M17 Lac+氯高铁血红素培养基)的2ml通常销售的M17培养基(M17 Agar培养基，Difco^TM)存在下，由乳酸乳球菌天然菌株晶体进行预培养。在搅拌与30℃条件下进行保温培养。

该预培养物接种到添加有(4μg/mL)杆菌肽的2mL M17 Lac+氯高铁血红素。接种比例是1％。然后该培养物在搅拌与30℃条件下进行保温培养48小时。

然后，把100μL这种悬浮液加到M17 Lac的琼脂上。将浸渍有2.5mg杆菌肽的纸盘放在培养皿中心。该琼脂在30℃保温培养48小时。在2mLM17 Lac+氯高铁血红素中在杆菌肽(4μg/mL)存在下培养接近该纸盘的单细胞系。在搅拌与30℃条件下进行保温培养24小时。

在30℃保温培养48小时后，从在杆菌肽(2μg/mL)存在下的琼脂M17 Lac中分离这些细胞。分离的单细胞系在M17 Lac+氯高铁血红素中进行培养，然后在搅拌与30℃条件下进行保温培养24小时。这种悬浮液用于生产冷冻储备物。

这些实验能让发明人选择乳酸乳球菌乳脂亚种自然变异株I-3557，它于2006年1月20日被保藏在CNCM。

A-1-2-制造有“杆菌肽”变异株的乳制品的实例的方案

在2mL M17 Lac中由菌株晶体进行预培养。

该预培养物按1％接种到50mL UHT全乳，它在30℃保温培养2小时。

下表I列出耐杆菌肽变异株和相应野生菌株的维生素K2定量结果，以μg当量MK-4/100g产物表示。

表I

菌株	I-3557	野生
			维生素K2，μg/100g	8.90	3.32

因此，该耐杆菌肽变异株与起始野生菌株相比，它过多产生维生素K的比率为3。

A-II-耐过氧化物性自然变异株的获得与应用

最近充分证明了乳酸乳球菌的呼吸作用(Duwat等人，2001年)。乳酸乳球菌株(IL1403)基因组序列证实了编码需氧呼吸所需要的官能的基因存在(Bolotin等人，2001年)。乳酸乳球菌事实上具有编码合成甲基萘醌类维生素和细胞色素D生物发生所需要的蛋白质的men和cytABCD操纵子。这个种还具有在血红素(氧化卟啉而将铁与血红素连接时所需要的hemH、hemK和hemN)合成的最后步骤中涉及的三种基因，但不具有在这个过程前面步骤中涉及的基因。不过，乳酸乳球菌能在原卟啉原存在下进行氧化性磷酸化作用。

人们还证明，乳酸乳球菌能够在该培养基中在氧和血红素存在下进行呼吸。这种呼吸能够使这些细胞获得更大量的生物质，最后观测到的pH比通常的高。在氧和/或血红素存在下的培养在发酵过程的约前6或7小时期间能够得到可比较的生长曲线。然后，在有氧和血红素进行培养的情况下葡萄糖消耗降低，而这时产生的乳酸酯也比较少。这说明在其培养过程中相当晚地发生代谢“位移”。乳酸乳球菌的呼吸因此进行到生长指数期结束(Duwat等人，2001年)。

乳酸乳球菌呼吸的作用目前还不知道，也不知道维生素K2在这一菌种发酵型新陈代谢中的作用。发明人还观察到，维生素K2由乳酸乳球菌产生，而这种呼吸在这些试验条件下没有被诱发(在这种培养基中没有血红素，并且没有能使该培养基充分氧化的搅拌)。

在这种细胞质内，与细胞外不同的是，蛋白质只是具有少量的二硫化键。它存在一个非常普遍的能够限制二硫键数的酶系统。S-S键通过酶(硫氧还蛋白)被还原成SH。这种酶是由硫氧还原蛋白还原酶产生的。Vido等人(2005年)通过遗传工程制造了乳酸乳球菌的trxB1突变体。trxB1基因编码硫氧还原蛋白还原酶。采用双-维电泳研究通过这种突变体合成的蛋白质表明，它在维生素K2合成途径中过多地产生某些酶，即MenB和MenD酶。

考虑到这些数据以及根据人们观测结果，发明人假定，改进乳酸乳球菌产维生素K2的可能途径之一可以是诱发这种呼吸。另一个途径可以是试图使维生素K2流动起来，以对氧化应激产生反应。

发明人因此寻求获得抗氧化应激性的自然变异株。

A-II-1抗氧化应激性的变异株的获得方案

选择过氧化物作为可使用的氧化剂的例子。当然，在类似条件下可以使用其它的氧化剂，例如高氯酸离子、铁离子、甲萘醌、对草快、氧或任何其它合适的氧化性化合物。

在用M17 Lac培养基预培养后，将这些起始天然菌株转移到同样的培养基中，该培养基含有浓度逐渐增加的过氧化物(例如由至少约20mg/l到至少约25mg/l、约27mg/l、约28.5mg/l的范围)。这些培养物在30℃下进行保温培养。在24小时后，浓度范围没有增加的原样试管再补充保温培养24小时。然后，琼脂培养基排干，分离出这些单细胞系。对过氧化物浓度27mg/l选择一种单细胞系。发明人注意到，过氧化物浓度超过28.5mg/l，则没有增加。

这些实验因此允许发明人选择乳酸乳球菌乳脂亚种自然变异株I-3558，它于2006年1月20日在CNCM保藏。

A-II-2-有“过氧化物”变异株的乳制品实例的制造方案

让所选择的单细胞系在全乳中生长24小时。然后，抽取一些试样，在-80℃进行冷冻，以便以后测定维生素K。

下表II列出由该抗过氧化物性变异株产生的维生素K2的量，并与由起始菌株产生的量进行比较(以μg当量MK-4/100g发酵乳表示的量).

表II

菌株	维生素K(μg/100g)
		野生	2.92±0.45
I-3558	5.94±0.76

如上表II所表明的，该变异株产生的维生素K2比相应野生菌株高1倍。

A-III-对芳族氨基酸结构类似物有抗性的自然变异株的获得与应用

在与维生素K和叶酸盐合成途径的共同步骤处，芳族氨基酸对其固有合成途径施加负“反馈”。该培养基中有这些氨基酸时，这些途径没有被激活。发明人因此寻求消除这种负调节。

A-III-1-对芳族氨基酸结构类似物有抗性的变异株的获得方案

把乳酸乳球菌自然株散布在化学定义的琼脂培养基上(Cocaign-Bousquet，M.等人，1995年)，该培养基既不含有色氨酸，也不含有苯丙氨酸、酪氨酸。术语“化学定义的培养基”是本技术领域的技术人员能充分理解的。与含有复杂化合物(例如酵母提取物、酪蛋白水解物等)的半合成培养基相反，它只是含有明确限定的简单化合物的培养基(例如维生素B9、维生素B12、腺嘌呤、酪氨酸等)。

把一片吸墨水纸盘放在Petri培养皿中央，用80μl含有50mM下述化合物的溶液浸湿：间氟苯丙氨酸、对氟苯丙氨酸、间氟酪氨酸和苯丙氨酸酰胺。这些化合物是芳族氨基酸的结构类似物。这些培养皿在30℃进行保温培养。在纸盘周围出现生长抑制区域。48小时后，一些抗性单细胞系出现在这个区域中。把这些单细胞系放在不含有芳族氨基酸的化学定义的培养基上再进行生长。该培养基添加有含有这些氨基酸结构类似物的溶液。在这些化合物中，每种化合物的最终浓度是1mM。

A-111-2-有“芳族氨基酸”单细胞系的乳制品实例的制造方案

将按照上述A-III-1得到的培养物接着接种50ml M17 Lac培养基(接种比例为1％)，该培养基添加有1ml氯高铁血红素溶液(500mg/l)。这些同样的培养物接着接种不含有氯高铁血红素的培养基，但进行搅拌。制造最后一类培养物。接种M17L培养基，并在30℃下进行搅拌。这些培养物在30℃搅拌(250rpm)一夜。然后，这些培养物以6000g进行离心5分钟。除去上清液，用50ml全乳替换。24小时后，把该发酵乳置于-80℃，同时测定维生素K2(参见下面B-VI部分)。

这些维生素K2定量实验能让发明人选择其中一种单细胞系作为过多产生维生素K2的自然变异株(参见下面B-VI部分)：涉及乳酸乳球菌乳脂亚种自然变异株1-3626，它于2006年6月19日在CNCM保藏。

部分B：调节促进产生维生素K的乳酸菌实施条件

B-I-培养基中的脂肪的影响

使用不同产品进行定量测定时，发明人观察到含有最多维生素K2的产品是发酵奶油(fermented cream)。此外，维生素K2是强疏水的。发明人因此提出设想，脂肪的存在或脂肪最少时疏水环境都有利于产生维生素K2。

因此，使用含有不同浓度脂肪的乳进行发酵。使用M17Lac培养基进行这些预培养。这些乳接种1％。在30℃保持发酵24小时。然后，一些试样进行冷冻，并等候后续定量测定。

图1列出乳酸乳球菌乳脂亚种的两个天然菌株(菌株1和2)结果。

如果考虑使用被研究的两种天然菌株中的一种菌株所得到的结果作为实例，使用半脱脂乳(约1.5％脂肪)代替乳脱脂能够增加产维生素K2，其比率为4。由半脱脂乳转换到全乳(约3.5％脂肪)能够以比率2增加产量。

对于所有被考虑的天然菌株，这种趋势都是相同的。

但是，以这种培养基脂肪含量趋势所产生维生素K2量的增加似乎是渐近线式的，因为约40％脂肪的奶油发酵得到维生素K2的量不会高于使用全乳得到的量(未列出数据)。

B-Il-乳酸菌生长率的影响

乳酸乳球菌乳脂亚种的天然菌株(天然菌株1)在乳中生长时，发明人进行了维生素K2产量动力学跟踪。

如图2表明的，这种生长减缓时，维生素才开始产生。生长速度可以通过跟踪酸化动力学得到。达到最高酸化速度时，这种细菌进入减缓期。

二次代谢物合成时，这类行为是相对经典的。为了降低生长率，可以研究不同的参数：次最佳物理化学条件(pH、温度等)、抑菌化合物(抗菌素)、静息细胞培养。这最后一种技术是使用至少相当于正常地在通常发酵结束时所得到的细胞量的细胞量进行接种。在这种情况下，没有细菌生长，生长率是零。

发明人因此试图将静息细胞培养与温度影响结合起来。

一种全乳按照10g/l接种含有10¹¹cfu/g的FED(直接接种酵母)。这种乳然后在不同温度下进行保温培养。

如图3表明的，温度降低对产维生素K2没有正影响。相反地，培养静息细胞培养细菌能够使产量增加比率约2∶20μg/100g，而通常发酵与生长为10μg/100g。

B-III-在呼吸条件下实施预培养的影响

维生素K2参与呼吸链。乳酸乳球菌是能呼吸的，但这种呼吸只是在发酵结束后才参与，即代谢流减缓时才参与。这种性质可能接近于在产生维生素K2动力学时所观察的性质。

重要的是要指出，完全在呼吸状态下生产食品显现出难以工业规模实施。事实上，这时存在使用通常的生产设备和方法时难以克服通气、搅拌、泡沫等的问题，这样需要非常大量的投资，并且发生农业-食品工业不可接受的生产超额费用。

相反地，如果必要，这种预培养能够在呼吸状态下进行，这样不会给企业带来太多的困难。

因此，发明人研究了在呼吸状态下的预培养对这些乳酸菌产维生素K2的影响。

最终，预培养物在M17 Lac培养基上产生，该培养基添加有20μl/ml的0.5mg/ml氯高铁血红素在0.1M氢氧化钠中的溶液。按照1％进行接种，保温培养的温度是30℃。采用简单搅拌方式保证通气。

首先，这些预培养物可以按照1％接种全乳，即通常发酵。在这些条件下，没有观察到对产维生素K2的任何正影响(未列出数据)。

这些预培养物然后用于在静息细胞状态下进行发酵。这些预培养物如前面所描述的那样产生，并且保持一夜。50ml试样在6000g下离心5分钟。除去上清液，用全乳代替。这种乳然后在30℃保温培养24小时。这些试样在-80℃冷冻，以便之后的定量测定。

如图4表明的，所观察的行为随这些菌株而不同。在呼吸状态下预培养对由乳酸乳球菌乳脂亚种天然菌株1产生维生素K2没有影响。相反地，它能够使自然变异株I-3558产生的维生素K2增加，其比率为2。

因此，这种在呼吸状态下预培养途径对于至少某些菌株显现出是有意义的。

不过在实际中，重要的不是拥有新预培养物而是冷冻酵母。此外，为了实施在静息细胞状态下发酵，合适的是拥有浓酵母。

B-IV-有关呼吸对产维生素K2刺激作用的补充结果

将这些结果与上面A-III关联起来。

如上面A-III-2中所指出的，在芳族氨基酸结构类似物存在下选择的自然变异株I-3626的培养物接着接种50ml的M17 Lac培养基(接种率1％)，该培养基添加有1ml氯高铁血红素溶液(500mg/l)。同样的培养物接着接种没有含有氯高铁血红素的培养基，但进行搅拌。产生了最后一类型的培养物。M17 Lac培养基进行接种并在30℃且无搅拌的条件下放置。这些培养物在30℃与搅拌(250rpm)的条件下放置一夜。这些培养物然后在6000g下进行离心5分钟。取出上清液，再用50ml全乳代替。24小时后，这些发酵乳置于-80℃，等待之后定量测定维生素K2。

下表III列出了自然变异株I-3626产生维生素K2随实施条件变化的结果。其维生素K2的量用每100g发酵乳μg当量MK-4表示。

表III

预培养物类型	无搅拌无氯高铁血红素	有搅拌有氯高铁血红素
			维生素K2	0.77	25.77

这些结果表明，呼吸(在搅拌下，存在氯高铁血红素)对产生维生素K2有非常重要的影响。在这些条件下，维生素的产量增加4倍。在无呼吸预培养后产生主菌株(master strain)21.5μg/100g(未列出数据)。在呼吸状态下进行预培养时，维生素产量降到10.3μg/100g(未列出数据)。因此，对于主菌株，在呼吸状态下预培养对维生素K2产量有负影响。

B-V-接种剂量、最后细菌群体与乳pH的影响

在前面描述呼吸预培养的静息细胞状态下，该起始细菌群体提高到约10¹⁰cfu/ml。

由于这个接种剂量在工业方法的范围内是难以应用的，发明人研究了在乳发酵阶段起始细胞量对维生素K2产量的确切影响。

另外，在呼吸状态下预培养时细胞量高于通常预培养，因此发明人寻求确定在呼吸状态下预培养时所观察的产量增加是否是因单一增加接种剂量或特别提供呼吸过程所致。

发明人还寻求确定在静息细胞期后，最后的细菌群体对得到维生素K2的量是否起到决定性的作用。已知特别是由于发酵期间pH降低而有一定的细菌死亡率，发明人研究了使用缓冲乳对产维生素K2水平的影响。

为了回答这些不同的问题，使用通常乳或缓冲乳在静息细胞状态下进行一些试验，其中接种剂量为约10⁶cfu/mL-约10¹⁰cfu/mL，由通常预培养或在呼吸下培养也进行了同样试验。

在30℃使用M17Lac培养基进行菌株I-3558的预培养。对于在呼吸状态下的试验，该培养基添加有20μL/ml的0.5mg/ml氯高铁血红素溶液(在0.1M氢氧化钠中)，该预培养物在保温培养期间进行搅拌一夜。然后，不同体积的这些预培养物(参见下表IV)在10000g下进行离心10分钟。

表IV

接种	预培养体积R+	预培养体积R-
			100％	40mL	160mL
75％	30mL	120mL
			50％	20mL	80mL
30％	12mL	48mL
			20％	8mL	32mL
10％	4mL	16mL
			5％	2mL	8mL
1％	0.4mL	1.6mL
			0.01％	0.04mL	0.16mL

除去上清液，用40mL通常全乳(预培养R+和R-)代替，或者添加最终浓度0.075M β-甘油磷酸酯(只是预培养R+)。这些试样然后在30℃下进行保温培养24小时。抽取一份进行计数，然后将这些试样在-80℃冷冻，之后进行定量测定。在静息细胞期前后进行的定量测定与计数结果列于下表V中。这个表提供了由通常预培养或在呼吸下预培养在(T0)前与在静息细胞期(Tf)后进行的维生素K2定量测定与计数结果。

表V

剂量

T0R-

TfR-

VitKR-

T0R+

TfR+

VitKR+

T0R+TP

TfR+TP

VitKR+TP

100％

1.08E+10

9.70E+09

44.47

3.40E+09

2.65E+09

3.40E+09

5.30E+09

35.9

75％

8.10E+09

4.30E+09

29.01

2.55E+09

2.40E+09

2.55E+09

5.80E+09

50％

5.40E+09

4.15E+09

18.58

1.70E+09

1.64E+09

19.82

1.70E+09

6.40E+09

26.7

30％

3.24E+09

4.25E+09

13.72

1.02E+09

1.20E+09

16.75

1.02E+09

7.70E+09

20％

2.16E+09

2.10E+09

9.13

6.80E+08

1.60E+09

14.09

6.80E+08

6.40E+09

18.55

10％

1.08E+09

2.10E+09

3.40E+08

1.17E+09

3.40E+08

4.60E+09

5％

5.40E+08

1.10E+09

6.4

1.70E+08

1.29E+09

9.41

1.70E+08

3.60E+09

13.666

1％

1.08E+08

2.15E+09

6.88

3.40E+07

1.25E+09

6.35

3.40E+07

4.20E+09

0.1％

1.08E+07

1.50E+09

6.26

3.40E+06

1.27E+09

6.19

3.40E+06

4.80E+09

R-＝通常预培养，

R+＝在呼吸下预培养

TP＝用β-甘油磷酸酯缓冲乳发酵

T0＝培养物中的起始细菌群体Cfu/mL

Tf＝培养物中的最终细菌群体Cfu/mL

VitK＝以μg当量MK-4/100g产物表示的维生素K2的浓度.

这些所得结果于图5中所示。作为提示也示出，在发酵罐中实施在呼吸状态下的预培养后在通常乳中静息细胞期(“在发酵罐中呼吸”曲线)所得到的结果。这些结果可与在试管中预培养所得到的结果(曲线“实验室呼吸”)相比。

这些所得结果(表V和图5)表示：

-与接种剂量相关的维生素K2含量；

-在呼吸状态下预培养的曲线“斜率”大于通常预培养的曲线“斜率”。因此，对于一定细菌群体，在呼吸状态下进行这种预培养时产维生素K2更多。在呼吸状态下观察的增加因此似乎是因特别提供呼吸过程而不是因简单增加接种剂量所致，这样证实了这条途径的好处；

-在缓冲乳中进行静息细胞期时，维生素K2产量是更高的。这可能是或者由于一些细菌在这种培养基中存活得更好，因为对于同一起始群体，该最终群体在缓冲乳中比在通常乳中高2-6倍(参见表V)，或者由于在缓冲乳中维生素K2“提取”更好。

参考文献

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受理局保存

国际局保存

Claims (9)

1.增加维生素K2的量的方法，所述维生素K2是通过培养至少一种产维生素K2的乳酸菌菌株而得到的，所述菌株培养是在静息细胞状态下进行的，所述方法至少包括：

a)在含有至少一种最终浓度为至少0.5μg/ml的卟啉的适当预培养基中，在呼吸状态下预培养所述菌株；

b)10⁸至10¹¹cfu/ml范围的活菌细胞量接种于含有脂肪的适当培养基；以及

c)如此接种的培养基在温度范围4℃至50℃发酵4小时至48小时，以便在步骤c)结束时，通过静息细胞培养产生的维生素K2的量大于在标准发酵条件下培养所述菌株所得到的维生素K2的量，其比率至少等于1.2，

所述乳酸菌菌株选自产维生素K2的乳酸乳球菌乳脂亚种的自然变异株：

-乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)CNCM I-3557，

-乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)CNCM I-3558，以及

-乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)CNCM I-3626。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述适当培养基含有至少0.5％的脂肪。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的适当培养基是全乳，或者，添加了β-甘油磷酸酯和/或柠檬酸酯和/或乳蛋白质和/或任何具有缓冲能力的适当食品配料的乳。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的预培养在温度4℃至40℃进行保温。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述预培养通过搅拌或通气进行氧合作用。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的预培养保持至少8小时。

7.生产维生素K2的方法，该方法至少包括：

a)实施权利要求1-6中任一项所述的方法；以及

b)回收如此产生的维生素K2。

8.富含维生素K2的食品的制造方法，该方法至少包括：

a)根据权利要求7所述的方法生产维生素K2；

b)向所述食品或其中间产品中添加如此生产的维生素K2；以及

c)得到所述富含维生素K2的食品。

9.富含维生素K2的食品的制造方法，该方法至少包括：

a)按照权利要求1-6中任一项所述的方法，在静息细胞状态下培养至少一种产维生素K2的乳酸菌菌株；

b)向所述食品或其中间产品中添加由步骤a)培养所得到的乳酸菌；以及

c)得到所述富含维生素K2的食品。

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