JPS59501772A - 二次代謝産物の生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はバッチ培養の微生物による二次代謝産物の生産を増加又は延長させる方 法に関する。原核および真核微生物の双方を含む微生物は生体の発育、すなわち バイオマスの生産に必要な栄養素が消費されるまで栄養素溶液中で発育する。こ れは一般に栄養期（トロホフエーズ）と称される。発育栄養素が消費されると、 生体は一般に静止期（イデイオ　フェーズ）に入り、ここでは相対的にほとんど バイオマスの生産はないが、生存細胞は生きのび、代謝する。多数の微生物はこ のような静止期中に二次代謝産物を生産する。これらの二次代謝産物は一般に生 体の正常発育に必須の化合物ではなく、生体が静止期にある場合、又は非制限発 育に関連する代謝径路に何らかの制限のある場合にのみ生産される。二次代謝産 物の例は抗生物質、薬理的活性化合物および毒素である。

背景技術 バッチ培養では、二次代謝産物生産の特定割合は早期の最高後急速に低下する。

二次代謝産物の生産に必須であることがわかった栄養素の連続添加により早期の 最高割合を持続する試みは、二次代謝産物の長期間の生産割合に限定された改良 のみしか示さなかった。

発明の開示 本発明は、二次代謝産物の長期間の生産割合における一層の実質的改良は、二次 代謝産物生産に必要な栄養素を培養培地に周期的に添加することにより達成でき ろことを見出した。

本発明は適当な微生物を所望の二次代謝産物の生産に必須の栄養素を含む培養培 地に培養し、時間的に間をおいて所望代謝産物の生産に必須の栄養素の追加量を 添加する工程を含む、微生物による二次代謝産物の生産を増加させる方法にある 。

本発明はさらに前記方法により生産された二次代謝産物にある。

二次代謝産物前駆体の定期的供給により得られる利点に対する十分な理由は完全 に明らかにされないが、次の説明は正しいと考えられる。この説明は本発明の理 解を助けるためになされ、本発明の範囲を限定するものとして見るべきではない 。栄養期中二次代謝産物合成は抑止さり、、静止期中二次代謝産物合成割合はピ ークとなり、次に低下する。二次代謝産物合成割合のこの低下は二次代謝産物前 駆体の消耗によると一般に推測される。二次代謝産物合成割合は反応培地に小濃 度のこれらの前、＠体化合物を維持するために培養培地に必要な前駆体を連続供 給することにより長期間高レベルに維持できることを以前の提案は示唆したつこ のような連続供給は規定時間にわたって二次代謝産物の全体的生産を増加させる が、本発明方法を使用して得ることかできる程改良は犬きくなかった。前駆体化 合物の培養培地への周期的又は定期的供給により高レベルの栄養素は急速に細胞 中に入り、こうして栄養素を得た細胞は前駆体化合物の供給により二次代謝産物 の抑制が生じ、細胞による前駆体化合物の摂取後これが低下すると次に烈しい二 次代謝産物の合成に戻る。異化代謝産物の抑制および低下の周期を使用すること による二次代謝産物合成のこの増加は、実際にすべての二次代謝産物生産システ ムは微生物が二次代謝産物生産に対し異化代謝産物抑制を示すことを学んなとき に広範囲の二次代謝産物生産微生物にわたって適用性を有すると考えられろ。

本発明方法は二次代謝産物を生産することができる任意の微生物に適用できる。

このような微生物は糸状菌、ストレプトマイセスおよびある種の単細胞細菌のよ うな糸状原核菌を含む。多数のこれらの微生物は、Ｄｒ、　Ｓ、Ｌ、　Ｎｅｉｄ ｌｍａｎによる［Ｈａｎｄ　ｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｊ　Ｖｏｌ、　［１（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｃｏ ｍｐａｎｙ。

Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏ、　ＵＳＡ、　１９７３　）　、９９９〜１０ ０６頁、　［Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　Ａｃｔｉｖｅ　Ａｇｅｎｔ ｓｆｒｏｍ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　５ｏｕｒｃｅｓ　Ｊの項にリストされる。

本発明は特に抗性物にの二次代謝産物の生産に、さらに詳細にはマクロライド系 抗生物質の生産に適用できる。マクロライド系抗生物質はストレプトマイセス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　）種により生産され１構造的に関係のある抗生物質 群であり、これらすべては１２〜２２個の原子を含み、はとんど二重結合を有せ ず、窒素原子を含まない大きなラクトン環を含む。これらの抗生物質は一般にラ クトン環に結合する１個又はそれ以上の糖残基を有する。

任意の特別の微生物およびこの微生物により生産される任意の特別の二次代謝産 物に関しても、二次代謝産物の合成を規制する栄養素を決定することは必要であ る。これは化学的に規定された培地を使用して微生物の慣例的化学状態の培養に より行なうことができる。

培地組成を変えることにより二次代謝産物の動的パターンを変え、二次代謝産物 の初めの高い特定生産割合の値が認められる場合を観察することがてきる。この 素が決定されろと本発明方法は行なうことができる。

複合培地を二次代謝産物生産に対し栄養期に使用することは珍しくないが、二次 代謝産物合成に必要な追加の規定栄養素を静止期に供給できろ本方法は、複合培 地に発育する微生物による二次代謝産物の生産に適応させることもできる。これ らの追加補給に対する微生物の要求は決定された場合、本発明は周期的補給を行 ない、二次代謝産物の生産を刺激するために使用す場合に、基質吸収に対するマ ス　バランスおよび酸素と二酸化炭素の生産は微生物の代謝状態を測定するため に栄養期および静止期に行なう必要がある。本発明はブドウ糖のような炭素源、 およびアミノ酸、又は他の窒素源を、リピツド源は常に過剰に存在すると仮定し て、周期様式で供給するために使用することができる。本明細書に示したデータ は、複合培地により供される基本的吸収割合の知識と関連して添加割合および量 の処方に適用することができる。

本方法は二次代謝産物生産に必須の栄養素が培養培地に濃厚形で添加され、培養 培地から何も除去されない厳格なバッチ方法で行なうことができる。別法では一 部の培養培地は栄養素の添加時に除去することができろ。

栄養素の周期的添加量は栄養素の周期的供給間の期間、培養培地中にその栄養素 の残留量が存在しないように調整すべきである。しかし、すべての必要栄養素を 周期的に供給することが必要でないことも認められるであろう。異化代謝産物抑 制を生ずるすべてのこれらの栄養素は周期的に供給されろことが好ましい。

栄養素添加の最適度数は、しかし、各微生物／二次代謝産物システムに対し決定 されなげればならなし・。

６〜４８時間、好ましくは２４〜４８時間の間隔で栄養素を添加することが好ま しい”ように思われろ。

図面の簡単な説明 図１はバッチ醗酵における細胞乾燥重量、グルタメート吸収タイロシン合成およ びタイロシン生産割合を示す。

図２は図１のパラメーターおよび２４時間の間隔で供給する本発明方法による周 期的供給−バッチ醗酵に対するブドウ糖吸収を示す。

図６は６６時間の間隔で供給する本発明方法による周期的供給−パッチ醗酵に対 する図２のパラメーターを示す。

図４は本発明による周期的供給バッチ醗酵で供給間隔を変える効果を示す。

図５は本発明による周期的供給バッチ醗酵で供給期間を変えろ効果を示す。

本発明実施の最良様式 抗生物質タイロシンの生産増加を示すために行なった試験結果は以下に例により 示す。

ラブイエＮＲＲＬ　２７０２であった。

１７８５（１９８０）に記載された。使用培地は１ｐの蒸溜水中に、食塩１ｇ、 硫酸マグネシウム２．５９、塩化コバルト０．０００５９、硫酸亜鉛［１，００ ０５り、クエン酸第−鉄アンモニウム１．５り、ベタイン塩酸塩２．５ｇ、Ｌ− グルタミン酸ナトリウム１７．５り、リン酸二力１，１１．１５シを含有した。

通常供給−パッチ醗酵はグルタメートおよびブドウ糖溶液を含むカルチャーを連 続供給することにより行なった。周期的供給−パンチ試験に対してはグルタメー トおよびブドウ糖は異る醗酵試験で所定かつ一定の時間間隔で供給した。これら 添加間の時間間隔は１２〜４８時間で変動した。

グルタメートおよびブドウ糖はＷａｊＳＯ＋］　−Ｍａｒｌｏｗポンプ（モデル ５０１）およびシリンジ　ポンプ（ＳａｇｅＩｎｓｔｒｕ、ｍｅｎｔｓ　、モデ ル３５２）を使用して供給した。

追加のオレイン酸メチルは醗酵中を通して５９／石以上の濃度を維持するために 添加した。供給サイクルはＡ、ｐｐｌｅミクロコンピューターにより調整した。

結果 タイロシンのパッチ醗酵のパノーンは図１および表１（対照バッチ　カラム）に 示す。タイロシン合成の割合は醗酵の２４〜４８時間の間で最高であり、その時 カルチャーは活溌に発育した。ブドウ糖およびグルタミン酸ナトリウムは４８時 間１でに急速に代謝され、オレイン酸メチルはブドウ糖およびグルタメートが消 費されるとすぐに利用された。ｑタイエラ、は発育期中１゜２■／９／時間の高 さであったが、醗酵の終りまでに経時的に０．０５■／９／時間に減少した。高 度の特定生産割合の期間を延長する努力において、グルタミン酸ナトリウムおよ びブドウ糖の供給割合は４８時間から醗酵の終了まで直線的に供給した。グルタ ミン酸す）　ＩＪウムおよびブドウ糖の供給割合はそれぞれ０．８ｍｌ／時間（ 培養液の０．１８９７ｍ１）およびＱ、４ｍｌ／時間（培養液の０．０２５９７ ｍｉ　）であった。この試験の結果は供給−パンチ醗酵の動的パターンは通常バ ッチのものと同じであったが、生産性は改良され、タイロシン合成の特定割合は 醗酵の終了までに０．２８　ｒａｙ／９／時間の値に到達した（この値は通常バ ッチの特定割合より約６倍の高さである）ことを表１（直線的供給カラム）に示 した。グルタミン酸ナトリウムおよびブドウ糖を４８時間から醗酵の終了までに 各種周期で周期的供給する周期−供給パンチ醗酵により一層の改良を得た。各周 期で２０ｍ１のグルタメー）　（０，１８ｑ／ｍｆ）および１０ｍ７！のブドウ 糖（０，０２５り／　ｍｌ）をそれぞれ０．５一時間および０．２５一時間の間 に醗酵容器に供給した。２４一時間周期供給−バッチ醗酵の結果は図２および表 １に示す。タイロシンの総濃度は対照より約１００係多く増加した。タイロシン 合成の特定割合に約０．５１ｎ９／９／時間に維持し、これはパツチ培養で得た 最高値の６０％であった。醗酵の終了までに周期的供給−バッチ培地におけるタ イロシン合成の特定割合は直線的供給−バッチおよび対照バッチ培養におけるも のよりそれぞれ２倍および１０倍の高さであった。表１では、各種周期の周期的 供給−バッチ醗酵で観察したｑＪイ。、／７随を表示する。ｑクイ。

、／７の最高値は周期的供給−バッチ醗酵を３６一時間周期を使用し行なった場 合に得た。

ｑ、イ。７７値、通常および周期的 供給−バッチ醗酵のバッチで観察 図３は上記の、６６時間周期でブドウ糖およびグルタメートを供給した醗酵の細 胞乾燥重量、ブドウ糖濃度、グルタメート濃度およびタイロシン濃度を示す。

それぞれの場合に、ブドウ糖は６６時間毎に２５０−”ｆ／２／時間の割合で０ ．２５時間培養培地に供給し、グルタミン酸モノナトリウムは６６時間毎に１８ ００■／看／時間の割合で０．５時間供給した。

タイロシン濃度ばＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄＣｈｅｍ ｏｔｈｅｒａｐｈｙ　Ａｐｒ、１９８０　５１９〜５２５頁記載のようにクロロ ホルム抽出により総タイロシンとして測定した。この抽出液はタイロシンの他に レロマイシンのような成る種の他の 抗生物質を含有した。純粋タイロシンは高圧液体クロマトグラフィにより回収し た。

図４は上記醗酵において１０日間にわたり総タイロシン生産に対するブドウ糖お よびグルタミン酸モノナトリウムの周期的供給間隔を変更する効果を示す。ブド ウ糖量が２４時間につき０．０４９　／１３から上昇又は低下し、グルタミン酸 モノナ）　ＩＪウム量が２４時間につき０．６９７−８から上昇又は低下すると タイロシン濃度も上昇又は低下することがわかるであろう。

図５は上記醗酵において１０時間にわたり総タイロシン濃度に対する周期的供給 時間を変更する効果を示す。グルタミン酸モノナトリウムは１周期につき０．９ ９／２の割合で供給し、ブドウ糖は１周期につき０．０６５９／Ａの割合で供給 した。３６時間の１周期は２．１り／、１３のタイロシン最高生産量を生産する ことがわかる。これはＣＪ、９９／１３のタイロシンを生産する通常のバッチ醗 酵および０．９り／２のグルタミン酸モノナトリウムおよび０．０６５り／！の ブドウ糖を２４時間培養培地に供給する直線的供給状態（１，２ｇ７＃のタイロ シンを生産する）と比較される。

浄書（内容に変更なし） １４ｈ＞＞　Ｍ’ｑ／ｌｒ／ｆｔｍ４ 糾勲向少 Ｆ／θ、４ 〜損駒７ノ４圧ＰＱ＋＝’ｉリクイロジン・蒔ぽ功繁ハ１釘店的イ←メト、１＃ ／１間廂 （ｌ　ｆｆ（ＪＲシ〈７ａ　１４ｆ、’ｌ　％’ｌｓ　＞ｇ：ｉ／　：ｊ　Ｆｑ ｒｙＡ　ｋＪ（ｙ＝　ρ−ｉ／ｌ二〕５／く７−７’ｌ−”７ＪＩ’；’手続補 正書（方式） 昭和５９年ｉ月７６日 特許庁長官殿 １、事件の表示 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 昭和５９年　６月１９日 ６、補正により増加する発明の数 手続補正書（師） 昭和５９年５月−７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 ２、発明の名称 二次代謝産物の生産 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所 氏　名　ユニサーチ　リミテッド （名　称） ４、代理人 昭和　年　月　日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物による二次代謝産物の生産増加方法において、所望の二次代謝産物の 生産に必須の栄養素を含む培養培地に適当な微生物を培養し、時間をおいて待時 所望の代謝産物の生産に必須の栄養素の追加量を添加する工程を含むことを特徴 とする、上記方法。 ２、二次代謝産物は抗生物質である、請求の範囲第１項記載の方法。 ６、二次代謝産物はマクロライド系抗生物質である、請求の範囲第２項記載の方 法。 ４、二次体謝産物はタイロシンである、請求の範囲第３項記載の方法。 ５、微生物はストレプトマイセス種である、請求の範囲第１項記載の方法。 ６、微生物はストレプトマイセス　フラディエの菌株である、請求の範囲第５項 記載の方法。 ７、栄養素は２４〜４８時間の間隔で添加する、請求の範囲第１項記載の方法。 ８、栄養素は３６時間の間隔で添加する、請求の範囲第７項記載の方法。 ９、栄養素の添加は０．２５〜０．５時間の間継続する、請求の範囲第１項記載 の方法。 １０、図２〜図５のいずれか１図を引用し、実質的に上記した二次代謝産物の生 産方法。