DE4427486C2

DE4427486C2 - Verfahren zur enzymatischen Synthese von L-Tryptophan mit einem computergesteuerten Bioreaktorsystem

Info

Publication number: DE4427486C2
Application number: DE4427486A
Authority: DE
Inventors: Chein-Shyong Su; Zen-Jen Chan; Wuen-Hsian Huang; Hsin Tsai
Original assignee: Development Center for Biotechnology
Current assignee: Development Center for Biotechnology
Priority date: 1994-08-03
Filing date: 1994-08-03
Publication date: 2003-03-27
Anticipated expiration: 2014-08-04
Also published as: FR2723379A1; FR2723379B3; DE4427486A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzyma tischen Synthese von L-Tryptophan mit einem automatischen computergesteuerten Bioreaktorsystem und das computergesteu erte Bioreaktorsystem dafür.

Tryptophan ist eine der essentiellen Aminosäuren, die Körper der Tiere bilden, und ist als Medikament, Nährstoff oder Zu satz für Tierfutter von Bedeutung. Bekannte Verfahren zur Herstellung von Tryptophan umfassen Fermentationsverfahren und enzymatische Verfahren. Durch Fermentationsverfahren kann Tryptophan aus seinen Vorstufen hergestellt werden, indem entweder Anthranilat oder Indol mit Zucker einer Kultur zu gesetzt werden, oder indem eine direkte Fermentation von Glukose in der Kultur vorgenommen wird. Für enzymatische Verfahren kann Tryptophan aus Indol, Brenztraubensäure und einem Ammoniumion hergestellt werden, wobei von Mikroorga nismen erzeugte Tryptophanase verwendet wird. Das enzymati sche Verfahren hat den Vorteil, daß für die Reinigung ein einfacheres Verfahren zur Verfügung steht, und daß Tryptophan mit größerer Reinheit erreicht werden kann, und dieses Ver fahren wurde als Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan mit medizinischer Qualität gewählt.

Bei der Herstellung von L-Tryptophan mit Bakterien, die hohe Werte von Tryptophanase erzeugen, ist eines der Substrate, Indol, für Bakterien toxisch und verursacht selbst bei einer geringen Konzentration (18 mM) eine Substrat-Inhibition. Es ist deshalb nicht vor Vorteil, wenn diese Indol konzentration als treibende Kraft für die synthetische Reak tion verwendet wird. Tryptophan mit mehr als 50 mM verur sacht ebenfalls eine Produkt-Inhibierung, und Natrium pyruvat zersetzt sich in Gegenwart des NH₄ ⁺-Ions bei einem alkalischen pH-Wert (pH = 9,0). Somit können Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan mit hoher Konzentration er halten werden, wenn konzentriertes Indol kontinuierlich oder schrittweise zugeführt wird, damit die Grenzwertkonzentra tion von Indol beibehalten wird, und mit Hilfe des Fällungs mittels für Tryptophan - Inosin - ist eine höheren Konzentra tion an L-Tryptophan erreichbar (< 80 g/l).

Es gibt viele bekannte Verfahren zur Herstellung von L-Tryp tophan mit Tryptophanase. Das Japanische Patent 56 085 291 beschreibt die Herstellung von L-Tryptophan durch Reaktion von Indol mit Serin oder mit Brenztraubensäure und einem Am moniumion mit einem Stamm der Gattung Aeromonas, Vibrio oder Bacillus. US Patent 4 349 627 beschreibt ein Verfahren, bei dem L-Tryptophan aus Indol und Serin oder aus Indol, Brenz traubensäure und einem Ammoniumion mit einem bestimmten Mi kroorganismus der Gattung Enterobacter hergestellt wird. Tryptophanase erzeugende Stämme, einschließlich Proteus rettgeri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus mor ganil und Escherichia coli, wurden im Japanischen Patent 62 134 094 zur Herstellung von L-Tryptophan verwendet. Das Ja panische Patent 63 137 689 beschreibt die Verwendung von mit Wärme behandelten Mikroorganismen, einschließlich verschie dener Arten von Escherichia coli, um L-Tryptophan aus Indol, Brenztraubensäure und einem Ammoniumion herzustellen.

Das Japanische Patent 1 104 186 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan aus Indol und L- oder D,L-Serin mit Tryptophan-Synthase. Das Französische Patent 2 581 654 beschreibt ein Verfahren zur Reaktion von Indol mit Pyruvat und einem Ammoniumion durch immobilisierte Tryptophanase und zur Gewinnung von L-Tryptophan durch Fällung mit Inosin. Das Japanische Patent 64 051 093 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan mit Tryptophanase bei stufen weiser Zufuhr von Indol, damit dessen Konzentration unter 4 mM gehalten werden kann, und innerhalb von 10 Stunden der Reaktion können 39 mM L-Tryptophan hergestellt werden. Das Japanische Patent 01 191 692 beschreibt ein Verfahren mit immobilisierten Zellen zur Herstellung von L-Tryptophan aus Indol und Brenztraubensäure, wobei Indol kontinuierlich zugeführt wird, damit 17 mM erhalten bleiben, und L-Trypto phan durch einen Abscheider kontinuierlich oder schrittweise entfernt wird; innerhalb von 120 Stunden dieses Verfahrens können aus einem 1 L Reaktor 36,49 g L-Tryptophan erhalten werden, wobei die fraktionelle Umwandlung von Indol und Py ruvat 92 bzw. 84% betragen. Das Europäische Patent 381 744 beschreibt ein mehrstufiges Verfahren zur Herstellung von L- Tryptophan, wobei eine bakterielle Wirtszelle umgewandelt wurde, so daß sie Tryptophanase enthielt, diese wurde an schließend beim Schritt der biologischen Umwandlung verwen det, damit sich L-Tryptophan ansammelt, dies erfolgte durch kontinuierliche geregelte Zufuhr von Indol, damit dessen Konzentration in der diskontinuierlichen Reaktion unter 10 mM blieb, und es wurden innerhalb von 75 Minuten 24 g/l Tryptophan erzeugt, dies ergab eine fraktionelle Umwandlung von Indol von mehr als 99%.

Obwohl kostengünstige Rohmaterialien, z. B. Ammoniak, für die Synthese von L-Tryptophan mit Indol und Pyruvat verwendet werden können, die ökonomische Vorteile haben, gibt es bei dies Verfahren immer viele ernste Probleme, z. B. die Hem mung durch Indol, die Hemmung durch L-Tryptophan und die Zerset zung des Pyruvats. Heute gibt es einige enzymatische Verfah ren, die L-Tryptophan mit ziemlich hoher Ausbeute und hoher Geschwindigkeit erzeugen, indem Indol und/oder Brenztrauben säure kontrolliert zugeführt werden; es gibt jedoch keinen Hinweis auf die Zufuhr von Indol, Pyruvat und NH₄Cl durch gleichzeitig durchgeführte direkte Rückkopplungssteuerung.

Zusätzlich zu den bekannten Problemen wurde bei dieser Er findung das Phänomen beobachtet, daß Tryptophanase, außer bei frei wählbaren Bedingungen, zerfällt, wenn sie mit zwei der Substrate - Natriumpyruvat, NH₄Cl - inkubiert wird.

Es ist folglich Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur enzymatischen Synthese von L-Tryptophan bereitzustellen, das die obengenannten Nachteile und Probleme vermeidet.

Um die oben genannten Probleme zu lösen, wird die Zufuhr von Indol, Natriumpyruvat und NH₄Cl von einem Computer gesteuert, der mit der erfindungsgemäßen Einrichtung zur di rekten Bestimmung von Indol ausgestattet ist. Der Computer steuert die Zufuhr von Indol und NH₄Cl nach einem vorher festgelegten Profil, das mit dem Aktivitätsprofil von Tryp tophanase übereinstimmt. Natriumpyruvat wird zu einem be stimmten Zeitpunkt während der Reaktion zugesetzt. Die Un terdrückung des Produktes wird durch den Zusatz des Fäl lungsmitels für L-Tryptophan - Inosin - überwunden, das L-Tryptophan durch Bildung eines unlöslichen Komplexes mit L-Tryptophan aus dem Reaktionssystem entfernen kann. Die Kombination aus Rückkoppelungssteuerung der Zufuhr des Substrats und der Einführung von Inosin in das Reaktions gefäß führt zu einem sehr wirksamen Verfahren zur enzymatischen Synthese von L-Tryptophan.

Der vorliegenden Erfindung liegt folglich die Erkenntnis zugrunde, dass zur Lösung obengenannter Aufgabe ein Ver fahren sowie eine Vorrichtung zur enzymatischen Synthese von L-Tryptophan ein automatisches computergesteuertes Bioreaktorsystem umfassen muß, womit die Zufuhr von Indol, Brenztraubensäure und/oder deren Salz und Ammoniumsalz geregelt und die Reak tion durch Rückkoppelung gesteuert werden.

Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 8 zur Verfügung. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Ver fahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 7, der erfindungsgemäßen Vorrichtung in den Ansprüchen 9 bis 12 wiedergegeben.

Diese und weitere Aufgaben, Vorteile und Merkmale dieser Er findung werden anhand der folgenden Beschreibung deutlicher.

Die beigefügten Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 das Zufuhrprofil der Substrate bei der enzymatischen Synthese von L-Tryptophan mit einer computer gesteuerten mehrfach ansteigenden Zufuhr von Indol; die Anfangsbedingungen des Bioreaktors waren wie folgt: 48, 60, 72 mmol NH₄Cl, Natriumpyruvat bzw. Inosin; 1 g Naßzellen in einem Volumen von 120 ml;

Fig. 2 das Zufuhrprofil der Substrate bei der enzymatischen Synthese von L-Tryptophan mit einem automatischen - computergesteuerten Bioreaktor; die Anfangsbedingun gen waren wie folgt: 180, 300, 390 mmol NH₄Cl, Natri umpyruvat bzw. Inosin, 100 ml roher Enzymextrakt (15000 E) und 9 mmol L-Tryptophan in einem Volumen von 600 ml; die Zufuhr von weiterem Pyruvat begann bei 40 Minuten und dauerte 3,3 Minuten;

Fig. 3 das automatische computergesteuerte Bioreaktorsystem;

Fig. 4 die enzymatische Synthese von L-Tryptophan mit der autmatischen Zufuhr durch den Computer und der Steue rung durch Rückkoppelung durch die direkte Bestimmung von Indol.

Diese Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur enzymati schen Herstellung von L-Tryptophan. Große Mengen L-Trypto phan (< 100 g/l) können in einem Bioreaktor vom diskontinu ierlichen Typ durch eine von Tryptophanase katalysierte Ak kumulationsreaktion in Gegenwart von Inosin erhalten werden. Es wird das neu gestaltete automatische computergesteuerte Bioreaktorsystem erstellt, das die direkte Bestimmung von Indol und die Steuerung der Zufuhr durch Rückkoppelung um faßt, und die optimalen Reaktionsprofile werden bestimmt. Eine typische diskontinuierliche Reaktion in einem Umfang von 600 ml mit rohem Enzym ergibt erfolgreiche Ergebnisse, es wurden z. B. innerhalb von 4 Stunden etwa 66,2 g (324 mmol) L-Tryptophan aus 38,3 g (327 mmol) Indol, 50,8 g (462 mmol) Natriumpyruvat und 104,6 g (390 mmol) Inosin erhalten. Das gesamte Verfahren kann automatisch vom Computer gesteuert werden.

Bei dieser Erfindung wird ein Bioreaktor vom diskontinuier lichen Typ gestaltet, der eine kontinuierliche automatische Zufuhr von Indol, Brenztraubensäure und/oder deren Salz und Ammoniumsalz durch einen Computer umfaßt, und so betrieben, daß die optimale Reaktionsbedingung erhalten wird. Durch dieses System kann ein ziemlich hoher Titer (< 100 g/l) L-Tryptophan erreicht werden, und eine Umwandlung von Indol von über 96% und eine Umwandlung von Pyruvat von 65 bis 82% können aufrechterhalten werden. Der erhaltene Komplex von L-Tryptophan-Inosin kann zur weiteren Reinigung leicht durch Filtration abgetrennt werden und Inosin kann zur Verwendung zurückgeführt werden. Dies stellt ein neues und vorteilhaf tes System für die industrielle Produktion von L-Tryptophan mit hoher Reinheit dar.

Das Verfahren umfaßt die Reaktion von Indol mit Brenztrauben säure und/oder deren Salz und einem Ammoniumsalz in Gegen wart von Tryptophanase mit einem automatischen computer gesteuerten Bioreaktorsystem, das einen Bioreaktor umfaßt, der mit einem Computer verbunden ist, der mit einer Einrichtung zur direkten Bestimmung von Indol ausgestattet ist, wobei dieser Computer die Zufuhr von Indol, Brenz traubensäure und/oder deren Salz und Ammoniumsalz in den Bioreaktor regelt und die Reaktion im Bioreaktor durch die Rückkoppelung der Indolkonzentration steuert, die durch die Einrichtung zur direkten Bestimmung von Indol bestimmt wurde, wobei die Zufuhr von Indol und Ammoniumsalz durch ein vordefiniertes Profil gesteuert werden, das mit dem Aktivitätsprofil von Tryptophanase übereinstimmt, und Brenztraubensäure und/oder deren Salz zu einem bestimmten Zeitpunkt zugegeben wird. Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist die Zufuhrmenge des Indols eine Funktion der Zeit und Ammoniumsalz wird gleichzeitig mit Indol zugesetzt. Brenztraubensäure und/oder deren Salz wird vorzugsweise 40 bis 60 Minuten nach Beginn der Reaktion zugesetzt.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Tryptopha nase kann durch einen Tryptophanase erzeugenden Mikroorga nismus erzeugt werden, z. B. durch E. coli. In den folgenden Beispielen wurde für die Erzeugung von Tryptophanase E. coli PGT 67/N 4830 verwendet.

I) Fermentation von E. coli PGT 67/N 4830 mit einem 5 l Fermentor 1. Kulturbedingungen

E. coli PGT 67/N 4830 wurde über Nacht bei 30°C auf einer Trp I Agarplatte gezüchtet, die 1% Soja-Pep ton, 0,5% Hefextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 1% Tween 80, 10 mM Tryptophan, 100 mg/ml Ampicillin und 1,5% Agar enthielt. Es wurde eine einzelne Kolonie ent nommen, die in 15 ml des Mediums Trp I geimpft und unter kräftigem Schütteln über Nacht bei 30°C gezüchtet wurde. In die Zellösung wurde Glycerol gegeben, damit eine Endkonzentration von 50% erhalten wurde, danach wurde die Zellösung auf verschiedene kleine Röhrchen verteilt (1,0 ml/Röhrchen) und bei -70°C aufbewahrt.

2. Fermentation in einem 5-l-Fermentor

2 ml der Stammzellösung wurden in 200 ml des Mediums Trp I geimpft und unter kräftigem Schütteln (150 U/min) über Nacht bei 30°C gezüchtet, danach wurde diese über Nacht gezüchtete Kultur in einen 5 l Fer mentor gegeben, der 3,5 l des Mediums Trp I enthielt, und bei 30°C und 350 U/min gezüchtet. Die Temperatur wurde auf 42°C angehoben, bis der Wert für OD₆₀₀ nahezu 0,6 betrug. Nach 5 Stunden wurden die Zellen 20 Minuten bei 8000 U/min und 4°C zentri fugiert, anschließend mit 0,9% NaCl gewaschen (die Zellen wurden erneut mit 0,9% NaCl suspendiert und 10 Minuten bei 16000 U/min und 4°C zentrifugiert) und schließlich bei -20°C aufbewahrt.

3. Fermentation in einem 20-l-Fermentor

7 ml der Stammkultur wurden in 700 ml eines Mediums geimpft, das 1% Tween 80, 1% Soja-Pepton, 0,5% Hefe extrakt, 0,5% NaCl, 0,01% Ampicillin und 0,2% Tryp tophan enthielt, und wurde über Nacht bei 30°C gezüchtet. Diese über Nacht gezüchtete Kultur wurde in 13,3 l des Mediums geimpft und unter Rühren (600 U/min) bei 30°C inkubiert, die Durchlüftung betrug etwa 0,5 vvm, die Temperatur wurde auf 42°C angeho ben, wenn der OD-Wert 1,2 erreichte, und es wurde weitere 5 Stunden gezüchtet und die Durchlüftung wurde auf 0,63 vvm eingestellt. Die Zellen wurden durch 20 Minuten langes Zentrifugieren bei 6000 U/min gewonnen, einmal mit 0,9% NaCl gewaschen und danach wieder 30 Minuten lang bei 13000 U/min zen trifugiert und bei -20°C aufbewahrt.

II) Herstellung der rohen Enzymlösung

Ruhende E. coli PGT 67/N 4830 (10 g) wurden in 200 ml einer Lösung suspendiert, die 3% Tween 80, 20 mM Kali umphosphat (pH = 9,0) und 0,2 mM PLP enthielt und wurden in einer French-press behandelt. Die rohe Enzymlösung wurde durch 15 Minuten langes Zentrifugieren bei 13000 U/min erhalten und wurde anschließend bei -20°C aufbe wahrt.

III) Bestimmung der spezifischen Aktivität von Tryptophanase

50 mg der Zellen wurden in 1 ml einer Lösung suspen diert, die 0,2 mM PLP, 20 mM Kaliumphosphat (pH = 9,0) und 3% Tween 80 enthielt, und wurden 30 s lang bei 4°C mit einem Wert von 14 beschallt, es wurde eine Minute unterbrochen, und das Verfahren wurde 5 mal wiederholt. Der Überstand, d. h. der rohe Enzymextrakt, wurde durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 13000 U/min er halten. Die Proteinkonzentration wurde nach dem Brad ford-Verfahren bestimmt.

0,395 ml destilliertes Wasser und 0,1 ml 1 m Kalium phoshpat (pH 9,0) wurden in einer 1 ml Küvette (curvett) aus Quarz gemischt und das Absorptionsmaß wurde durch Drücken des Autozero-Knopfes auf Null ge bracht, danach wurden der Küvette 0,5 ml SOPC (S-O-Ni trophenyl-L-cystein) zugesetzt und es wurde gemischt, die Reaktion begann durch die Zugabe von 5 ml der Probe und die Änderung des OD-Wertes bei 370 nm wurde gemes sen. Die spezifische Aktivität wurde als 1 µmol des Substrats definiert, das pro Minute pro mg Protein hy drolisiert worden war.

IV) Synthese von L-Tryptophan

Die Synthese von L-Tryptophan erfolgte in einem diskon tinuierlichen Reaktor durch verschiedene Verfahren der Zufuhr von Indol, wodurch sich auf der Basis der hohen enzymatischen Umwandlung aus Indol und Natriumpyruvat große Mengen von L-Tryptophan innerhalb eines sehr kur zen Zeitraums ansammeln.

1. Manuelle schrittweise Zufuhr - In den Versuchen 1 bis 3 wurde festes Indol (Versuche 1 und 2) oder kon zentriertes Indol (4,6 m in Ethanol im Versuch 3) ma nuell und schrittweise in die Reaktionslösung einge führt, die 0,2 mM PLP, 20 mM Kaliumphosphat (pH = 9,0), 3% Tween 80 und einen oder keinen Inosinzusatz enthielt, und die Reaktion erfolgte bei 30°C und pH = 9,0.
2. Kontinuierliche Zufuhr durch eine manuell betriebene Pumpe - In den Versuchen 4 bis 6 waren die Bedingun gen die gleichen wie unter 1 beschrieben, außer daß das konzentrierte Indol (4 m in Ethanol) durch eine manuell betriebene Pumpe in die Reaktionslösung ein geführt wurde.
3. Computergesteuerte kontinuierliche Zufuhr durch einen mehrfach ansteigenden Gradienten - Bei den Versuchen 7 bis 12 wurde konzentriertes Indol (4 m in Ethanol) kontinuierlich in die Reaktionslösung einge führt, dies wurde durch Software mit mehrfach anstei gendem Gradienten in einem Computer gesteuert, und das typische Profil dieses Gradienten ist in Fig. 1 gezeigt.
Die Bedingungen der Versuche 1 bis 12 sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Zusammenfassung der Bedingungen der Versuche 1 bis 12

1. Kontinuierliche Zufuhr mit Steuerung durch Rückkoppelung - In einen 1,5 l Glasreaktor wurden 20 ml Tween 80, 13,3 ml 1 m Kaliumphosphat, pH = 9,0, 13,3 ml 10 mM PLP, 620 ml destilliertes Wasser und 60 ml 5 n NH₄Cl (der pH-Wert wurde durch NH₄OH auf pH = 9,0 eingestellt) gegeben, und danach wurde gut gerührt. 174,3 g (650 mmol) Inosin und 3,06 g L-Tryptophan (15 ml) wurden der Lösung zugegeben, die Reaktion wurde durch den Zusatz von 55,03 g (500 mmol) Natriumpyruvat und 166,7 ml rohe Enzymlösung (150 /ml) eingeleitet. Die Lösung aus 5 n NH₄Cl und 4 m Indol (in Ethanol hergestellt) wurde vom Beginn bis zum Ende der Reaktion nach der in Fig. 2 gezeigten Kurve in das Reaktionssystem eingeführt. Nach 40 mit der Reaktion wurden innerhalb von 2 min weitere 110 ml (270 mmol) Natriumpyruvat (wässrige 2,45 m Lösung) durch eine Pumpe in die Reaktions lösung eingeführt, wie es in Fig. 2 gezeigt ist. In Intervallen wurden Proben entnommen, um die restliche Konzentration an Indol durch HPLC zu überwachen. Der Reaktor war nach der Skizze von Fig. 3 aufgebaut. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Mischung filtriert und mit kaltem Wasser gewaschen, wodurch ein weißer fester Kuchen erhalten wurde, der als Tryptophan-Inosin-Komplex identifiziert wurde.

Der Gradient des Zufuhrprofils, das in Fig. 2 gezeigt ist, wurde durch einen Computer simuliert, so daß er dem Abnahme profil der Enzymaktivität folgt, und wurde durch ein "Labtech Notebook"-Programm gesteuert. Die detaillierten in Fig. 3 gezeigten Ausrüstungen waren wie folgt:

- Computer: IBM-PC - kompatibel, tragbar, 80486-33, Computer mit 32 Bit
- Schnittstellen: Leiterplatte für Hochgeschwindigkeits- Datenerfassung AXIOM (AX-5412-LG), Kanal 2 und 3 für die Pumpe 1 und 2 für die Zufuhrkontrolle, D/A-Leiterplatte mit 8 Kanälen (AX5212) Kanal 2 für den Signaleingabeverstärker des Detektors/Multiplex-Tafel (AX-751) Allzweck-Platte mit Schraubanschluß (AX750)
- Software: LTN Labtech Notebook
- Pumpen:
- "P1 Masterflex Drive" Model Nr. 7523-10, 1-100 U/min mit einem Pumpen kopf 7523-10 (8-Kanalwalze) für die Zufuhr von Indol und NH₄Cl, Leitung 7624-22 (Silicon) oder 7605-26 (Viton)
- "P2 Masterflex Drive" Model Nr. 7520-35, 1-100 U/min mit einem Pumpen kopf 7518-10 (langsame Belastung, ss (einstufig)) für die Zufuhr von flüssigem Natriumpyruvat, Leitung "Masterflex" 6411-16
- "P3 Eyela" Mikroleitungspumpe MP-3
- "P4 Pharmacia" Peristalticpumpe P-1
- "P5 Eyela" Mikroleitungspumpfe MP-3
- P6 ist das gleiche wie P2

Die vorher bestimmte Zufuhrrate des Indols ist eine Funktion der Zeit, wie es in der Gleichung (1) ausge drückt wird, und das Verhältnis zwischen dem Rückkoppelungs- Signalausgang des Computers und der optischen Dichte des Photodetektors wird in der Gleichung (3) ausgedrückt.

F = 5,51 - 5,44.10^-2T + 2,79.10^-4T² - 7,05.10^-7T³ + 7,0.10^-10T⁴ (1)

S = (F.6 - 33,167)/3,7257 (2)

S_fb = S + 3,492.O_d - 29,34.O_d ² + 0,0308 (3)

wobei
F: Zufuhrmenge von Indol (mmol/min/l)
T: Reaktionszeit (min)
S: ursprüngliches Signal
S_fb: Rückkoppelungssignal
O_d: Optische Dichte des Photodetektors

Wie es in Tabelle II gezeigt ist, wurde bei der Anwendung der manuellen schrittweisen Zufuhr von Indol in den Versu chen I und 2 ohne die Zugabe von Inosin eine geringe Kon zentration an L-Tryptophan erhalten, im Versuch 3 wurde je doch in Gegenwart von Inosin eine ziemlich große Menge L-Tryptophan angesammelt (57,2 g/l oder 280 mM). Mit Hilfe der Zufuhr von Indol mit einem mehrfachen Anstieg mit dem Computer nahm die Menge an L-Tryptophan in den Versuchen 4 bis 6 innerhalb von 7 Stunden der Reaktion offensichtlich auf über 122,6 g/l (600 mM) zu und ergab eine vernünftige Umwandlung von Natriumpyruvat (etwa 60%). Durch die Anwendung des exakteren Profils der Indolzufuhr, das vorher nach dem Aktivitätsprofil des Enzyms bestimmt worden war, wurde schließlich in den Versuchen 7 bis 12 der Wirkungsgrad der Biosynthese weiter verbessert, wodurch innerhalb von 3,5 Stunden der Reaktion über 102 g/l (500 mM) L-Tryptophan erhalten wurden (Versuch 11), und die 70%-ige Umwandlung von Natriumpyruvat beibehalten. Durch dieses Verfahren wurde im Versuch 12 die größte Menge an L-Tryptophan erhalten (188,6 g/l oder 923 mM).

Wenn die Zufuhr von Indol mit der Steuerung durch Rück koppelung der direkten Bestimmung des Indols durch einen Photodetektor kombiniert wurde, konnte im gesamten Reaktionszeitraum das Indol in der Reaktionsmischung bei weniger als 0,59 g/l (5 mM) gehalten werden, und schließlich wurde das vorteilhafte Ergebnis erhalten, daß sich 108,3 g/l (540 mM) L-Tryptophan angesammelt hatten, wobei die Konzentration von Indol unter 4 mM gehalten wurde; die Ausbeute auf der Basis von Indol und Natriumpyruvat betrug 99,4 bzw. 62,7%. Die Werte dieser Versuche sind in Fig. 4 gezeigt.

Claims

1. Verfahren zur enzymatischen Synthese von L- Tryptophan durch die Reaktion von Indol mit Brenztraubensäure und/oder deren Salz und einem Ammoniumsalz in Gegenwart von Tryptophanase, gekennzeichnet durch ein automatisches computergesteuertes Bioreaktorsystem, das einen Bioreaktor umfasst, der mit einem Computer verbunden ist, der mit einer Einrichtung zur direkten Bestimmung von Indol ausgestattet ist, wobei der Computer die Zufuhr von Indol, Brenztraubensäure und/oder deren Salz und Ammoniumsalz in den Bioreaktor regelt und die Reaktion im Bioreaktor durch Rückkoppelung der Indolkonzentration steuert, die von der Einrichtung zur direkten Bestimmung von Indol bestimmt wurde, wobei die Zufuhr von Indol und Ammoniumsalz nach einem Profil gesteuert wird, das entsprechend der Aktivität von Tryptophanase definiert ist, der Computer die Zufuhr von Indol nach der folgenden Gleichung steuert:
F = 5,51 - 5,44.10^-2T + 2,79.10^-4T² - 7,05.10^-7T³ + 7, 0.10^-10T⁴
wobei
F die Zufuhrrate von Indol ist (mmol/min/l) und
T die Reaktionszeit (min) ist
und Brenztraubensäure und/oder deren Salz zu Beginn der Reaktion sowie während des Reaktionsprozesses zu einem bestimmten Zeitpunkt zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zur direkten Bestimmung von Indol ein Photodetektor ist.

3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Computer die Reaktion nach dem folgenden Verhältnis zwischen dem Rückkoppelungs- Signalausgang des Computers und der optischen Dichte des Photodetektors durch Rückkoppelung steuert:
S_fb = S + 3,492.O_d - 29,34.O_d ² + 0,0308
wobei S = (F.6 - 33,167)/3,7257 und
F = 5,51 - 5,44.10^-2T + 2,79.10^-4T² - 7,05.10^-7T³ + 7,0.10^-10T⁴
wobei
F die Zufuhrrate von Indol (mmol/min/l)
T die Reaktionszeit (min)
S das ursprüngliche Signal
S_fb das Rückkoppelungssignal und
O_d die optische Dichte des Photodetektors sind.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Ammoniumsalz gleichzeitig mit dem Indol zugeführt wird.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Brenztraubensäure und/oder das Salz davon 40 bis 60 Minuten nach Beginn der Reaktion zugesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Tryptophanase als ruhende Zellen oder als zellfreier Extrakt von Tryptophanase zugeführt wird.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Inosin während der Reaktion als Fällungsmittel für L-Tryptophan vorhanden ist.

8. Automatisches computergesteuertes Bioreaktorsystem für die enzymatische Synthese von Tryptophan, gekennzeichnet durch einen Bioreaktor, der mit einem Computer verbunden ist, der mit einer Einrichtung zur direkten Bestimmung von Indol ausgestattet ist, wobei der Computer die Zufuhr von Indol, Brenztraubensäure und/oder deren Salz und Ammoniumsalz in den Bioreaktor regelt und die Reaktion im Bioreaktor durch Rückkoppelung der Indolkonzentration steuert, die durch die Einrichtung zur direkten Bestimmung von Indol bestimmt wurde, wobei die Zufuhr von Indol und Ammoniumsalz nach einem Profil gesteuert wird, das entsprechend der Aktivität von Tryptophanase definiert ist, der Computer die Zufuhr des Indols nach der folgenden Gleichung steuert:
F = 5,51 - 5,44.10^-2T + 2,79.10^-4T² - 7,05.10^-7T³ + 7, 0.10^-10T⁴
wobei
F die Zufuhrrate von Indol ist (mmol/min/l) und
T die Reaktionszeit (min) ist
und Brenztraubensäure und/oder deren Salz zu Beginn der Reaktion sowie während des Reaktionsprozesses zu einem bestimmten Zeitpunkt zugesetzt wird.

9. Bioreaktorssystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zur direkten Bestimmung von Indol ein Photodetektor ist.

10. Bioreaktorsystem nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Computer die Reaktion durch das Verhältnis zwischen dem Rückkoppelungs- Signalausgang des Computers und der optischen Dichte des Photodetektors durch Rückkoppelung wie folgt steuert:
S_fb = S + 3,492.O_d - 29,34.O_d ² + 0,0308
wobei S = (F.6 - 33,167)/3,7257 und
F = 5,51 - 5,44.10^-2T + 2,79.10^-4T² - 7,05.10^-7T³ + 7, 0.10^- ¹⁰T⁴
wobei
F die Zufuhrrate von Indol (mmol/min/l)
T die Reaktionszeit (min)
S das ursprüngliche Signal
S_fb das Rückkoppelungssignal und
O_d die optische Dichte des Photodetektors sind.

11. Bioreaktorsystem nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Ammoniumsalz gleichzeitig mit Indol zugeführt wird.

12. Bioreaktorsystem nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Brenztraubensäure und/oder das Salz davon 40 bis 60 Minuten nach Beginn der Reaktion zugesetzt werden.