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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von
Mikroorganismen, die einen Methanolstoffwechselweg aufweisen, worin
eine Expressionseinheit eingeführt
wurde, worin ein Zielgen stromabwärts an einen Promotor gebunden
ist, der durch Methanol induziert werden kann, wobei das Verfahren
ermöglicht,
dass das Zielgenprodukt effizient erzeugt wird.
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Die
Produktion von Polypeptiden und anderen Genprodukten unter Verwendung
von Mikroorganismen als Wirt wurde ganz grundlegend aufgrund den
in der rekombinanten DNA-Technologie gemachten Fortschritten möglich. Eine
Polypeptidproduktion wird durch Einführung einer Expressionseinheit
durchgeführt,
worin das Gen für
ein Zielpolypeptid stromabwärts
an einen geeigneten Promotor gebunden ist. Mikroorganismen, wie
E. coli, Hefen und tierische Zellen werden typischerweise als Wirt
verwendet.
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Genexpressionssysteme
unter Verwendung von E. coli als Wirt sind die gebräuchlichsten
Systeme, und diese Systeme weisen im typischen Fall eine hohe Produktivität auf. Da
es jedoch etliche Fälle
gibt, worin das exprimierte Polypeptid unlösliche Einschlusskörper bildet,
was zu einer unlöslichen
Form führt,
hängt die Möglichkeit
der Verwendung dieses Systems größtenteils
von den Eigenschaften des Ziel-Polypeptids ab.
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Andererseits
sind Genexpressionssysteme, die tierische Zellen als Wirt verwenden,
zum Zweck einer Bestätigung
einer Aktivität
eines Genprodukts usw. geeignet, da das exprimierte Polypeptid in
vielen Fällen seine
Aktivität
beibehält.
Die Menge des Ziel-Polypeptids ist jedoch typischerweise gering
und es sind etliche Bemühungen
nötig,
um in diesem Fall eine Reinigung durchzuführen. Da tierische Zellen sich
außerdem
langsam reproduzieren und die verwendeten Medien teuer sind, benötigt die
Kultivierung sowohl etliche Zeit als auch Kosten. Es ist außerdem schwierig,
den Umfang der Kultivierung zu erhöhen. Dementsprechend sind tierische
Zellen als Wirt für
einen industriellen Erhalt eines Ziel-Polypeptids in großem Volumen
nicht wünschenswert.
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Hefezellen
sind eukaryontische Zellen mit einem endoplasmatischen Retikulum,
Golgi-Apparat und anderen zellulären
Bestandteilen, die tierischen Zellen ähnlich sind. Es ist auch bekannt,
dass sie in der Lage sind, Polypeptide mit besonderen tertiären Strukturen
in von eukaryontischen Zellen abgeleiteten Polypeptiden zu bilden
und zu exprimieren. Außerdem
reproduzieren sie sich schneller als tierische Zellen und können einfach
in großem
Volumen kultiviert werden. Genetische Analysen wurden besonders
extensiv an Saccharomyces cerevisiae durchgeführt und dieser wird weit verbreitet
auf einem Laborniveau als Wirt für
eine Genexpression verwendet.
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Da
es jedoch schwierig ist, Saccharomyces cerevisiae zu einer hohen
Zelldichte anzuzüchten
und der Ertrag pro Kulturmedium nicht hoch ist, reichte dieser für eine industrielle
Produktion von Ziel-Polypeptiden nicht aus. Um dieses Problem zu
lösen,
werden methylotrophe Hefen, wie Pichia pastoris, Hansenula polymorpha
und Candida boidinii verwendet.
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Gellissen
et al. waren z.B. bei der Erzeugung von 1,4 g Glucoamylase mit einer
Zelldichte von 100 bis 130 g Trockenzellgewicht pro Liter des Kulturmediums
unter Verwendung eines Ameisensäure-Dehydrogenase-Promotors
erfolgreich, für
den die Expression durch Methanol induziert wird und wobei Hansenula
polymorpha die Wirtszelle war (Gellissen et al. BIO/TECHNOLOGY,
9, 291–295,
1991). Zusätzlich
waren Barr et al. erfolgreich bei der Erzeugung von 4 g menschlichem
Serumalbumin pro Liter des Kulturmediums unter Verwendung eines
Alkoholoxidase-Promotors, für
den die Expression durch Methanol induziert wurde und wobei Pichia
pastoris der Wirt war (Barr et al. Pharm. Eng., 12(2), 48–51, 1992).
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Die
unten beschriebenen Probleme sind jedoch selbst im Fall von Verfahren
unter Verwendung methylotropher Hefen noch vorhanden. Im Fall einer
Hefe mit einem Methanolstoffwechselweg in einem heterogenen Genexpressionssystem
unter Verwendung einer Hefe, repräsentiert durch die oben erwähnten drei
Arten methylotropher Hefen und einem Promotor, der durch Methanol
induziert werden kann, nimmt das Methanol in dem Kulturmedium schnell
ab, wenn die Hefe in einem Medium, das Methanol enthält, kultiviert
wird. Bei dieser Kultivierungsart muss Methanol als Kohlenstoffquelle
zugeführt
werden, um gleichzeitig eine Transkription von dem Promotor und
ein Zellwachstum zu erhalten.
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Wenn
die Methanolkonzentration in dem Kulturmedium jedoch während der
Zufuhr des Methanols plötzlich
ansteigt, kann die Hefe getötet
werden. Zusätzlich
wird die Messung der Methanolkonzentration in einer Kultur einer
Hefe mit einem Methanolstoffwechselweg im allgemeinen dadurch durchgeführt, dass
der Überstand
einer Gaschromatographie und ähnlichem
unterzogen wird. Bei diesem Verfahren besteht jedoch zusätzlich zu
einem Bedarf an einer Spezialausrüstung der zusätzliche
Nachteil, da eine bedeutende Zeitspanne notwendig ist, bis eine
Methanolkonzentration bestimmt werden kann, das ei ne schnelle Beurteilung
im Hinblick auf eine Notwendigkeit eines Wiederauffüllens von
Methanol verhindert wird.
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Als
Beispiel für
ein Verfahren zum Erhalt einer Methanolkonzentration in einem Kulturmedium
für die Expression
eines Zielgens wird ein Verfahren verwendet, das die Methanol-Verbrauchsrate
unter Verwendung einer Hefe reduziert, worin das Enzym Alkoholoxidase
im Stoffwechselweg fehlt. Dieses Verfahren involviert das Anzüchten von
Hefe unter Verwendung von Glycerin usw. als Kohlenstoffquelle und
dann die Induktion einer Transkription durch einen Promotor durch
Zugabe einer fixierten Menge Methanol zu dem Kulturmedium, um das
Zielgen zu exprimieren. Aufgrund der niedrigen Rate des Methanolverbrauchs
ist es einfach, die Methanolkonzentration aufrechtzuerhalten. Obwohl
es möglich
ist, eine stabile Kultur zu erhalten, hat dieses Verfahren den Nachteil,
dass es eine lange Kultivierungszeit benötigt, da die Kultivierung separat
für eine
Zellwachstumsperiode und eine Zielgenexpressionsperiode durchgeführt wird.
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In
der WO 95/21928 wird ein Verfahren offenbart, wobei die Methanolkonzentration
in einem Kulturmedium auf ein konstantes Niveau kontrolliert wird,
um ein Zielgen durch Kultivieren einer methylotrophen Hefe zu exprimieren,
worin der Methanol-Stoffwechsel durch teilweise Veränderung
von Enzymen des Stoffwechselwegs verlangsamt wurde, ohne die Anzahl
der Zellen zu erhöhen.
Dieses Verfahren involviert die Messung einer Methanolkonzentration
in der Luft innerhalb des Kulturbehälters in einem Zustand, in
dem eine Methanolkonzentration in der Luft innerhalb des Kulturbehälters die
Methanolkonzentration im Kulturmedium reflektiert und dann Bestimmung
der Methanolzugaberate aus diesen Ergebnissen, um die Methanolkonzentration
im Kulturmedium zu kontrollieren.
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Die
Methanolkonzentration in einem Kulturmedium einer methylotrophen
Hefe, die im Hinblick auf ein Alkoholoxidasegen defizient ist, kann
durch Anwendung dieses Verfahrens auf ein konstantes Niveau gesteuert
werden. Um jedoch die Methanolkonzentration im Kulturmedium aus
der Methanolkonzentration in der Luft innerhalb des Kulturtanks
vorherzusagen ist es notwendig, dass beide sich im Gleichgewicht
befinden. Um dieses Gleichgewicht zu erreichen, müssen Kulturbedingungen,
einschließlich
der Belüftungsrate,
dem Druck und der Temperatur konstant gehalten werden und die Methanolkonzentration
im Kulturmedium darf sich nicht plötzlich ändern. Aufgrund dieser Restriktionen
konnte das oben erwähnte
Verfahren zur Kontrolle der Methanolkonzentration nur für eine Kultivierung
in der Genexpressions-Induktionsphase
angewandt werden, nachdem die Zellen vorher gezüchtet wur den unter Verwendung
einer Hefe, die keinen Methanolstoffwechselweg aufweist.
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Andererseits
ist es in einem heterogenen Genexpressionssystem unter Verwendung
eines Promotors, der durch Methanol induziert werden kann und eines
Mikroorganismus mit einem Methanolstoffwechselweg als Wirt nicht
notwendig, die Mikroorganismus-Wachstumsphase und die Induktionsphase
für die
Genexpression zu isolieren, wenn die Rate der Methanoladdition und
die Konzentration von Methanol im Kulturmedium in geeigneter Weise
kontrolliert werden. Dementsprechend verkürzt sich die Kultivierungszeit,
was dazu führt, dass
das Zielprotein in einer kurzen Zeitspanne erhalten werden kann.
So besteht bei der Kultivierung von Mikroorganismen mit einem Methanolstoffwechselweg
ein Bedarf, ein Verfahren zum Erhalt einer geeigneten Rate einer
Methanoladdition oder Methanolkonzentration zu etablieren, das sowohl
der Produktion des Zielgenprodukts als auch dem Wachstum der Mikroorganismen
genügt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Einstellung der Methanolkonzentration
in einem Kulturmedium bereit, so dass die Induktion eines Promotors
durch Methanol und das Wachstum eines Wirts parallel in einem heterogenen
Genexpressionssystem unter Verwendung eines Methanol-induzierbaren
Promotors und von Mikroorganismen als Wirt durchgeführt werden
können,
die einen Methanolstoffwechselweg aufweisen und ein Verfahren zur
Kultivierung eines Wirts unter Verwendung dieses Verfahrens.
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Als
Ergebnis einer sorgfältigen Überprüfung der
Beziehungen zwischen dem Verfahren der Methanoladdition, der Methanolkonzentration
im Kulturmedium und der Menge von gelöstem Sauerstoff bei der Kultivierung
von Hefe mit einem Methanolstoffwechselweg haben die Erfinder der
gegenwärtigen
Erfindung festgestellt, dass wenn Methanol periodisch zugefügt wird,
wenn die Methanolkonzentration 0,1 % (V/V) oder weniger in einer
Kultur beträgt,
worin die Menge von gelöstem
Sauerstoff im Kulturmedium auf ein konstantes Niveau kontrolliert
wird (z.B. 2 ppm), die Menge von gelöstem Sauerstoff synchron mit
dem Zugabezyklus von Methanol fluktuiert. Es wurde auch festgestellt,
dass, wenn die Methanol-Additionsrate in dem Zustand angehoben wird,
in dem diese periodischen Fluktuationen in der Menge von gelöstem Sauerstoff
beobachtet werden, die Rate des Anstiegs der Menge von gelöstem Sauerstoff
abnimmt und die periodischen Fluktuationen in der Menge von gelöstem Sauerstoff
schließlich
nicht weiter beobachtet werden und dass, wenn die Methanol-Additionsrate
weiterhin angehoben wird, das Methanol sich im Kulturmedium anhäuft und
die Hefe getötet wird.
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Wenn
diese periodischen Fluktuationen in der Menge des gelösten Sauerstoffs
beobachtet werden, wächst
die Hefe und die Transkription von einem mit Methanol induzierbaren
Promotor wird induziert. Die Rate der Methanoladdition zum Kulturmedium
zu diesem Zeitpunkt ist nämlich
eindeutig eine Additionsrate, die sowohl der Produktion des Zielgenprodukts
als auch dem Wachstum der Hefe genügt. Weiterhin wurde während der
Zeit, in der die periodischen Fluktuationen beobachtet wurden bestätigt, dass
eine schnellere Rate einer Methanoladdition zu einem schnelleren
Zellwachstum führt
sowie zu einer größeren Produktion
des Zielgenprodukts.
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Unter
Einbeziehung der oben beschriebenen experimentellen Ergebnisse stellt
die gegenwärtige
Erfindung ein Verfahren, wie definiert in den Ansprüchen zur
Kultivierung von Mikroorganismen mit einem Methanolstoffwechselweg
bereit, worin eine Expressionseinheit eingeführt wird, die ein Zielgen,
stromabwärts
an einen Promotor gebunden, der durch Methanol induziert werden
kann, umfasst; worin während
der Kultivierungsperiode, einschließlich der Periode, während derer
Methanol zugefügt
wird, die Addition von Methanol periodisch durchgeführt wird
und die Additionsrate auf eine Rate eingestellt wird, die der maximalen
Methanol-Verbrauchsrate der Mikroorganismen entspricht oder darunter
liegt und worin die Konzentration von gelöstem Sauerstoff in dem Kulturmedium
synchron mit der Periode der Methanol-Addition fluktuiert.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 ist
eine Illustration, die schematisch die Struktur des Kex2-Proteasegens anzeigt,
die Sequenzen der für
die Synthese des NKEX2-660-Gens verwendeten Primer und die Genregionen,
an die die Primer angeklebt wurden.
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2 ist
eine Illustration, die ein Verfahren zur Konstruktion von pCU660
angibt.
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3 ist
eine Grafik, die die Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte angibt,
synchron zu der periodischen Zugabe von Methanol, beobachtet, wenn
die Methanolkonzentration im Kulturmedium 0,1 % (V/V) oder weniger
beträgt
und die periodische Veränderung
im Fluktuationsmuster von gelöstem
Sauerstoff, wenn die Glycerinkonzentration 0,1 % (G/V) oder weniger
beträgt.
Die obere Grafik zeigt die Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte im Kulturmedium.
Die untere Grafik zeigt die Glycerinkonzentrationen im Kulturmedium mit
einer durchgezogenen Linie und die Methanolkonzentrationen mit einer
unterbrochenen Linie. Der Zeitpunkt, wenn Methanol- und Glycerinkonzentrationen
auf 0,1 % (V/V) oder weniger abgenommen haben und der Zeitpunkt,
wenn Glycerin zugegeben wird, sind in der Grafik angegeben.
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4 ist
eine Grafik, die die Beziehung zwischen Methanol-Additionsrate und periodischen Fluktuationen
in gelösten
Sauerstoffwerten illustriert. Die Methanol-Additionsrate ist als
Menge von Methanol, zugefügt pro
Liter Kulturmedium pro Stunde definiert und ist mit den Additionszeiten
angegeben (dargestellt mit Pfeilen).
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5 ist
eine Grafik, die ein Beispiel der Produktion von Kex2-660 beim Kultivieren
unter Verwendung einer Methanol-Additionsrate von 4,5 ml/L·h illustriert.
OD600-Werte sind mit ausgefüllten
Quadraten, Kex2-Aktivität (Fluoreszensintensität) mit ausgefüllten Kreisen
und die Methanolkonzentration im Kulturmedium mit ausgefüllten Dreiecken
angegeben.
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6 ist
eine Fotografie eines Elektrophoresemusters, das das Ergebnis einer
Durchführung
von 10 % SDS-PAGE an 5 μl
des Kulturüberstands
ist, genommen an den angegebenen Kultivierungszeiten beim Kultivieren
unter Verwendung einer Methanol-Additionsrate von 4,5 ml/L·h.
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Detaillierte Beschreibuag
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Die
maximale Methanol-Verbrauchsrate bezieht sich auf eine Rate eines
Methanolverbrauchs durch Mikroorganismen für eine bestimmte Kultivierungszeitspanne
und unter bestimmten Bedingungen dieser Mikroorganismen und unter
Bedingungen, unter denen die Methanolkonzentration die Rate des
Methanolverbrauchs nicht bestimmt. Da die Methanolkonzentration
auf einem konstanten Niveau gehalten wird oder graduell ansteigt,
wenn Methanol mit einer Rate zugefügt wird, die der maximalen
Methanol-Verbrauchsrate entspricht oder schneller ist, betrifft
die Rate der Methanol-Addition, die der maximalen Methanol-Verbrauchsrate der
Mikroorganismen entspricht oder geringer ist, einer Methanol-Additionsrate,
bei der die Methanolkonzentration im Medium auf einem Niveau gehalten
wird, das im wesentlichen nahe bei Null liegt, in der Praxis auf einem
Niveau, auf dem die Methanolkonzentration bei 0,1 % (V/V) oder niedriger
erhalten wird.
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Um
die oben beschriebene Methanol-Additionsrate zu erhalten, involviert
das Verfahren eine periodische Zugabe von Methanol. Dieses periodische
Additionsverfahren betrifft die Zugabe einer bestimmten Menge Methanol
nach einem bestimmten Zeitintervall über eine bestimmte Zeitspanne
während
der Kultivierung. Dieser Zyklus, nämlich das Zeitintervall, liegt
bei 1 bis 20 Minuten und vorzugsweise 5 bis 10 Minuten. Wie später beschrieben,
fluktuiert gemäß den neuen
Feststellungen der Erfinder der vorliegenden Erfindung, wenn die
Rate der Methanoladdition, nämlich
die Menge des zugefügten Methanols,
innerhalb einer bestimmten Zeiteinheit (ausgedrückt als die Anzahl von Millilitern
Methanol pro Stunde pro Liter des Kulturmediums der vorliegenden
Erfindung) niedrig ist, das Niveau der gelösten Sauerstoffkonzentration
im Kulturmedium synchron mit dem Methanoladditionszyklus und die
Methanolkonzentration im Kulturmedium liegt dann z.B. bei 0,1 %
(V/V) und im wesentlichen nahe 0 %.
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Demgegenüber, für den Fall,
in dem die Rate der Methanoladdition der der maximalen Methanol-Verbrauchsrate
der Mikroorganismen entspricht oder höher liegt, treten Fluktuationen
im Niveau der gelösten
Sauerstoffkonzentration synchron zum Methanoladditionszyklus im
wesentlichen nicht auf. In diesem Fall wird beobachtet, dass sich
Methanol in einem bestimmten Konzentrationsniveau im Kulturmedium
anhäuft.
Durch Einstellung der Rate der Methanoladdition, so dass das Konzentrationsniveau
von gelöstem
Sauerstoff im Kulturmedium synchron mit dem Methanoladditionszyklus
fluktuiert, kann so die Methanol-Additionsrate auf eine Rate eingestellt
werden, die der maximalen Rate des Methanolverbrauchs durch die
Mikroorganismen entspricht oder niedriger liegt.
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Bei
den oben erwähnten
periodischen Fluktuationen des Konzentrationsniveaus von gelöstem Sauerstoff
ist zusätzlich
der Anstieg des Konzentrationsniveaus von gelöstem Sauerstoff ein Ergebnis
einer Verringerung, die durch Verbrauch von zugesetztem Methanol
ausgelöst
wird. Wenn die Abnahme des Konzentrationsniveaus von gelöstem Sauerstoff
als Ergebnis des Verbrauchs von gelöstem Sauerstoff durch Verbrauch von
frisch zugefügtem
Methanol angenommen wird, kann die Rate der Methanoladdition auf
eine Rate eingestellt werden, die der maximalen Rate des Methanolverbrauchs
durch Mikroorganismen entspricht oder niedriger liegt, indem der
Zyklus wiederholt wird, der aus einem Nachweis des Anstiegs des
Konzentrationsniveaus von gelöstem
Sauerstoff, der Zugabe einer konstanten Menge von Methanol und der
Zugabe von Methanol des nächsten
Zyklus besteht, nachdem das Konzentrationsniveau von gelöstem Sauerstoff
durch den Verbrauch von zugesetztem Me thanol abgenommen und durch
den Verbrauch von Methanol wieder angestiegen war.
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Die
Bezeichnung "induzierbarer
Promotor", wie hier
verwendet, wird einfach verstanden und betrifft einen Genpromotor,
der für
ein Enzym kodiert, das an einem Methanol-Metabolismus in einem Mikroorganismus,
wie z.B. einer Hefe beteiligt ist, wobei Beispiele hierfür einen
Promotor des Alkoholoxidasegens beinhalten (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung
Nr. 5-344895; Ellis, S.B. et al., Mol. Cell. Biol. 5, 1111–1112, 1985),
einen Promotor eines Ameisensäure-Dehydrogenasegens
(Hollenberg, C.P. et al., EPA Nr. 0299108, 1988) und einen Promotor
des Methanol-Oxidasegens (Ledeboer, A.M, et al., Nucleic Acids Res.
13, 3063–3082,
1985).
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Die
Bezeichnung "Expressionseinheit" bezeichnet einen
Expressionsvektor, wie z.B. ein Expressionsplasmid.
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Die
Bezeichnung "Zielgen" bezeichnet ein Gen,
das z.B. für
ein nützliches
Protein kodiert. Hier bezeichnen nützliche Proteine z.B. ein Enzym
oder andere physiologisch aktive Proteine. Verschiedene Beispiele für Enzyme
beinhalten die Kex2-Protease, Prohormon-Konvertase 1/3 (PC1/3),
Prohormon-Konvertase 2 (PC2), Furin, Peptid C-terminale α-Amidase,
Staphylokokken-Protease V8, Achromobakterprotease I (API), die Plazenta-Leucinaminopeptidase,
den zytoplasmischen Thrombozyten-Aktivierungsfaktor Acetylhydrase und
ihre Derivate.
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Zusätzlich beinhalten
Beispiele für
andere physiologisch aktive Substanzen Wachstumshormone, Wachstumshormon
freisetzendes Hormon, adrenokortikotrophes Hormon (ACTH) freisetzendes
Hormon, Glucagon, Glucagon-ähnliches
Peptid I, Glucagon-ähnliches
Peptid II, Interferon-α,
Interferon-β,
Interferon-γ,
Erythropoietin (EPO), Trombopoietin (TPO), G-CSF, HGF, Gewebsplasminogenaktivator
(tPA), Stammzellfaktor, die TGF-Familie und ihre Derivate.
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Es
ist nicht notwendig, dass das Methanol über die gesamte Kultivierungsperiode
gemäß der vorliegenden
Erfindung periodisch zugefügt
wird. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung enthält
ein Medium 1 bis 2 % (V/V) Methanol zu Beginn der Kultivierung,
woraufhin die Kultivierung für mindestens
12 Stunden, z.B. 15 bis 20 Stunden, ohne Zugabe von Methanol durchgeführt wird.
Die periodische Zugabe von Methanol beginnt dann, wenn die Methanolkonzentration
auf ungefähr
0,5 % (V/V) oder weniger abnimmt und z.B. bei 0,2 bis 0,5 % (V/V).
Zu diesem Zeitpunkt wird, da die Mikroorganismen sehr extensiv gewachsen
sind und ein aktiver Verbrauch an Methanol vorliegt, die Methanolkonzentration
im Medium weiter hin abnehmen, und schließlich auf im wesentlichen 0
% bis 0,1 % fallen, wenn die Methanol-Additionsrate geeignet gewählt ist.
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Die
Addition von Methanol wird dann unter diesen Bedingungen fortgesetzt.
Während
der Zeit der Methanoladdition auf diese Weise ist der Promotor durch
Methanol induziert, um die Expression des Zielgens auszulösen. Parallel
hierzu wird das zugesetzte Methanol mindestens zum Teil als Wachstumsmaterial
verwendet, was zu einem Wachstum der Mikroorganismen führt. Durch
die hier beschriebenen Verfahren werden nämlich die Expression eines
Gens aufgrund einer Induktion eines Promotors durch Methanol und
insbesondere die Produktion eines geeigneten Zielproteins zusammen
mit dem Wachstum der Mikroorganismen simultan und parallel über mindestens
eine bestimmte Zeitspanne während
der Kultivierungsperiode durchgeführt.
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Die
in dem Verfahren der gegenwärtigen
Erfindung verwendeten Mikroorganismen sind vorzugsweise methylotrophe
Hefen und bevorzugt Mikroorganismen, die zu der Gattung Pichia,
Hansenula oder Candida gehören.
Beispiele für
Hefen, die zu diesen Gattungen gehören, beinhalten Pichia pastoris,
Hansenula polymorpha und Candida boidinii.
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Im
folgenden wird eine detaillierte Erklärung bereitgestellt, wie diese
Verfahren verwendet werden können,
um effizient ein Zielgenprodukt in einem Genexpressionssystem unter
Verwendung eines Methanol-induzierbaren Promotors und unter Verwendung
von Mikroorganismen mit einem Methanolstoffwechselweg als Wirt zu
erzeugen. Die vorliegende Erfindung ist, obwohl Candida boidinii
als spezifisches Beispiel eines Mikroorganismus mit einem Methanolstoffwechselweg
angegeben wurde, ein Promotor eines Alkoholoxidasegens von Candida
boidinii als spezifisches Beispiel für einen Promotor angegeben
werden und ein sekretorisches Kex2-Derivat als spezifisches Beispiel
für ein
Zielgenprodukt angegeben wurde, nicht auf die angegebenen spezifischen
Beispiele begrenzt.
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Eine
Untersuchung der Kultivierungsbedingungen wurde unter Verwendung
des Candida boidinii Stamms TK62 (pCU660) #10 durchgeführt. Der
Stamm TK62 (pCU660) #10 ist ein sekretorisches Kex2-Derivat hoch
produzierender Stamm, der basierend auf der Produktion und Sekretion
des Kex2-Derivats in einer Teströhrchenkultur
von 20 Klonen des Stamms TK62, die den sekretorischen Kex2-Derivat-Expressionsvektor pCU660
enthielten, selektiert wurde. Im folgenden wird eine Erklärung der
Produktion des Kex2-Derivat-Expressionsvektors
pCU660 und des Stamms TK62 des Wirts bereitgestellt.
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Das
Plasmid pCU660 ist ein Plasmid, das das sekretorische Kex2-Derivat durch einen
AOD-Promotor exprimieren kann und wurde durch Insertion eines DNA-Fragments
hergestellt, enthaltend das sekretorische Kex2-Derivat-Gen in die Not I-Stelle
von pNOTelI (japanische ungeprüfte
Patentveröffentlichung
Nr. 5-344895). Das Polypeptid vom N-terminalen Ende zu dem 660ten
Aminosäurerest,
wobei die Membran übergreifende
Domäne
fehlt, die am C-terminalen
Ende der Kex2-Protease vorliegt (814 Aminosäurereste) von Saccharomyces
cerevisiae (hier als Kex2-660 bezeichnet) wurde als sekretorisches
Kex2-Derivat verwendet.
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Das
DNA-Fragment, das das NKEX2-660-Gen enthielt (-132 bis 1.980 Nukleotide;
wobei A des beginnenden Methionincodons des KEX2-Gens als 1 genommen
wurde (Strukturgen von Kex2-Protease); Mizuno, et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 156, Seiten 246–254, 1988) wurde durch Amplifizieren
mit PCR unter Verwendung von NKEX2 und KM088 als Primer und DNA,
die das KEX2-Gen kodierte als Matrize, hergestellt.
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Der
Primer NKEX2 ist ein DNA-Oligomer, enthaltend eine DNA-Sequenz,
die zu den Nukleotiden 107 bis 132 stromaufwärts vom Start-Methionincodon
des KEX2-Gens korrespondieren und die Sequenz, die sich aus der
Zugabe einer NotI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle zum 5'-Flankierungsbereich
ergibt. KM088 ist ein DNA-Oligomer mit einer Sequenz, die zu einer
Nukleotidsequenz komplementär
ist, resultierend aus der Zugabe eines Translations-Stopcodons TAA zu
der DNA, korrespondierend zu den 654ten bis 660ten Aminosäuren der
Kex2-Protease. Zudem ist pCU660 ein Chromosom-Insertions-Expressionsvektor
mit einem URA3-Gen als Selektionsmarker (die einzigartige BamHI-Restriktionsenzymstelle
ist in diesem Gen lokalisiert). Wenn ein Uracil benötigender
Stamm, erhalten durch URA-Mutation, als Wirt verwendet wird, können Transformanten
gemäß der Komplementarität des Uracilbedarfs
selektiert werden.
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Stamm
TK62 ist ein Uracil benötigender
Stamm, abgeleitet von Candida boidinii Stamm S2 AOU-1, erhalten
durch eine URA3-Mutation und weist eine Gruppe von Enzymen für einen
Methanolstoffwechselweg auf, die eine Alkoholoxidase beinhalten,
wodurch es ihnen möglich
ist, unter Verwendung von Methanol als Kohlenstoffquelle zu wachsen.
Zusätzlich
ist die Menge der Alkoholoxidase, die von dem Stamm TK62 exprimiert
wird, hoch, nämlich
bei ungefähr
40 % des intrazellulären
Proteins bei der Kultivierung unter Verwendung von Methanol als
Kohlenstoffquelle und ein heterogenes Genexpressionssystem unter
Verwendung dieses Promotors wurde bereits offenbart (japanische
ungeprüfte
Patentveröffentlichung
Nr. 5-344895).
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Als
nächstes
wurde eine Studie von Kultivierungsbedingungen unter Verwendung
des oben erwähnten Stamms
TK62 (pCU660) #10 durchgeführt.
Die Methanolkonzentration im Kulturmedium ist ein sehr wichtiger Parameter
für das
Wachstum von Mikroorganismen mit einem Methanolstoffwechselweg und
für eine
effiziente Induktion einer Transkription von einem Methanol-induzierbaren
Promotor. Daher wurde der Stamm TK62 (pCU660) #10 unter Verwendung
eines Gefäßfermenters
zur Untersuchung der Bedingungen kultiviert, die das Wirtswachstum
beeinflussen wie auch der Bedingungen, unter denen Methanol dem
Kulturmedium zugefügt wird.
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Zunächst wurde
die Kultivierung unter Verwendung von Methanol und Glycerin als
Kohlenstoffquellen durchgeführt.
Zum Beginn der Kultivierung wurde die Zelldichte auf eine Kulturmediumstrübheit von
OD600 = 0,2 eingestellt, während
die anfänglichen
Kohlenstoffquellen auf eine Methanolkonzentration von 1,5 % (V/V) unter
Einbeziehung der Zelltoxizität
und eine Konzentration von 3 % (G/V) für Glycerin unter Einbeziehung
des osmotischen Drucks eingestellt wurden. Die Methanolkonzentration
des Kulturmediums wurde alle 3 Stunden gemessen und die Zeiten und
Mengen der Methanolzugabe zum Kulturmedium wurden unter Einbezug
der Konzentration 2 bis 3 Stunden früher bestimmt. Methanol und
Glycerin wurden periodisch durch Betreiben einer peristaltischen
Pumpe mit einem konstanten Zufuhrvolumen pro Einheitszeit für eine bestimmte
Zeitspanne alle 7,5 Minuten zugefügt.
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Die
Additionsrate wurde durch die Menge von Methanol (ml/L·h) oder
Glycerin (g/L·h),
zugefügt
pro 1 Liter Kulturmedium pro Stunde, repräsentiert. Da die Methanolkonzentration
des Kulturmediums 15 Stunden nach Beginn der Kultivierung auf 0,42
% (V/V) abnahm, wurde die Methanoladdition mit einer Rate von 0,75 ml/L·h 18 Stunden
nach Beginn der Kultivierung begonnen. Weiterhin hatte die Methanolkonzentration
des Kulturmediums auf 0,26 % (V/V) 18 Stunden nach Beginn der Kultivierung
direkt vor Beginn der Addition abgenommen.
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Da
die Methanolkonzentration des Kulturmediums 21 Stunden nach Beginn
der Kultivierung auf 0,1 % (V/V) oder weniger abgenommen hatte,
wurde die Methanol-Additionsrate auf 7,5 ml/L·h, beginnend 23 Stunden nach
Beginn der Kultivierung angehoben. Direkt nach dieser Addition nahm
die Rührrate
stark ab und eine plötzliche
Abnahme der Sauerstoffverbrauchsrate der Hefe, nämlich eine Abnahme der zellulären Aktivität, wurde
beobachtet. Nach diesen Abnahmen wurde angenommen, dass die Zelldichte
abnahm und die Hefe lysierte. Die Methanolkonzentration des Kulturmediums
1 Stunde nach Anstieg der Methanol-Additionsrate (24 Stunden nach
Beginn der Kultivierung) betrug 0,76 % (V/V) und es wurde festgestellt,
dass sich Methanol anhäufte.
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Basierend
auf den obigen Ergebnissen wurde festgestellt, dass 1) ein guter
Zeitpunkt für
den Beginn der Addition von Methanol zum Kulturmedium die 18. Stunde
nach Beginn der Kultivierung ist (OD600 = ungefähr 50), 2) da die Methanolkonzentration
des Kulturmediums auf 0,1 % (V/V) oder weniger innerhalb von 3 Stunden
bei einer Methanol-Additionsrate von 0,75 ml/L·h abnimmt, eine Möglichkeit
besteht, dass es zu wenig Methanol als Kohlenstoffquelle gibt und
3) dass es eine Möglichkeit
einer Zelltoxizität
gibt, die aufgrund einer Anhäufung
von Methanol im Kulturmedium aufgrund einer Additionsrate von 7,5
ml/L·h
die zu hoch liegt, gibt. Zusätzlich
wurde bei der Kultivierung des Hefestamms TK62 (pCU660) #10 mit
einem Methanolstoffwechselweg festgestellt, dass nach der Fortsetzung
eines Zustands, in dem die Methanolkonzentration im Kulturmedium
0,1 % (V/V) oder weniger beträgt,
die schnelle Zugabe von Methanol dazu führt, dass der Stamm TK62 (pCU660)
#10 getötet
wird.
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Weiterhin
wurden die Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten synchron
zum Methanoladditionszyklus (bestehend aus einer Wiederholung eines
plötzlichen
Anstiegs, eines Erhalts der hohen Werte und einer plötzlichen
Abnahme) in der 20. bis 23. Stunde nach Beginn der Kultivierung
beobachtet. Da diese Zeitspanne mit der Zeit übereinstimmte, in der die Methanolkonzentration
des Kulturmediums auf 0,1 % (V/V) oder weniger abnahm zu der Zeit,
wenn sich Methanol aufgrund einer schnellen Zugabe von Methanol
zum Kulturmedium anzuhäufen
begann (nämlich
die Zeit, während
derer die Methanolkonzentration des Kulturmediums 0,1 % (V/V) oder
weniger betrug), wurde vorgeschlagen, dass es eine Beziehung zwischen
den periodischen Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten und der
Methanolkonzentration im Kulturmedium gab.
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Die
Menge an gelöstem
Sauerstoff ist ein Parameter, der in der Regel für eine Kultivierungskontrolle überwacht
wird und wird unter Verwendung einer Elektrode für gelösten Sauerstoff gemessen. Wenn
es möglich
wäre, die
benötigte
Menge von Methanol, basierend auf den Veränderungen der Menge an gelöstem Sauerstoff
bei der Kultivierung von Mikroorganismen mit einem Methanolstoffwechselweg
vorherzusagen, wäre
es möglich,
einfach stabile und effiziente Kulturbedingungen einzustellen. Um
daher im Detail die Beziehung zwischen den Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte,
synchronisiert mit dem Methanoladditionszyklus und der Methanolkonzentration
des Kulturmediums zu untersuchen, wurde eine Kultivierung durch
Einstellung der Methanol-Additionsrate
auf 2,25 ml/L·h,
zwischen der Rate von 0,75 ml/L·h, bei der die Methanolkonzentration im
Kulturmedium schnell abnahm und der Rate von 7,5 ml/L·h, bei
der sich Methanol im Kulturmedium bei der oben erwähnten Kultivierung
anhäufte,
durchgeführt.
-
Methanol
wurde mit Glycerin (0,15 ml/L·h),
beginnend in der 18. Stunde nach Beginn der Kultivierung, zugefügt. Die
Fluktuationen in den gelösten
Sauerstoffwerten, synchronisiert mit dem Additionszyklus der Kohlenstoffquellen
wurden, beginnend von der 23. Stunde nach Beginn der Kultivierung
bis zum Abschluss der Kultivierung (49 Stunden nach Beginn der Kultivierung)
beobachtet.
-
Die
Methanolkonzentration im Kulturmedium während dieser Zeitspanne betrug
0,1 % (V/V) oder weniger. Während
der Zeit, während
derer Fluktuationen in den gelösten
Sauerstoffwerten, die synchron mit dem Methanoladditionszyklus waren,
beobachtet wurden, häufte
sich Methanol im Kulturmedium nicht an und die Konzentration konnte
als bei 0,1 % (V/V) oder weniger liegend bestätigt werden. Außerdem wurde
deutlich, dass während
der Zeit, in der die Methanolkonzentration 0,1 % (V/V) oder weniger
betrug (23 bis 49 Stunden nach dem Beginn der Kultivierung), die
Anzahl von Zellen um mehr als das Zweifache anstieg. Anders ausgedrückt, konnten
die Zellen wachsen, obwohl die Methanolkonzentration des Kulturmediums
0,1 % (V/V) oder weniger betrug.
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Wenn
die Methanolkonzentration des Kulturmediums 0,1 % (V/V) oder weniger
und die Glycerinkonzentration ebenfalls 0,1 % (G/V) oder weniger
betrug, nahm außerdem
die Menge der Veränderung
der periodischen Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte synchron
zu dem Additionszyklus der Kohlenstoffquellösung zu. Wenn Glycerin so zugefügt wurde,
dass die Endkonzentration im Kulturmedium zu diesem Zeitpunkt 1,25
% (G/V) annahm, setzten sich die periodischen Fluktuationen in den
gelösten
Sauerstoffwerten synchron zu dem Additionszyklus der Kohlenstoffquellösung selbst
fort, obwohl die erhöhte
Menge der Veränderung
auf normal zurückkehrte.
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Außerdem wurde
deutlich, dass die periodischen Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte
anzeigen, dass die Methanolkonzentration des Kulturmediums 0,1 %
(V/V) oder weniger beträgt
und ein Anstieg in dieser Menge der Veränderung zeigt einen Zustand
an, worin die Methanolkonzentration im Kulturmedium 0,1 % (V/V)
oder weniger und die Glycerinkonzentration 0,1 % (G/V) oder weniger
beträgt.
Unter Verwendung dieser Indikatoren kann der Zustand, in dem die
Methanolkonzentration 0,1 % (V/V) oder weniger und die Glycerinkonzentration
0,1 % (G/V) oder weniger beträgt überwacht
werden, wodurch eine geeignete Zugabemenge zum Wiederauffüllen dieser
Kohlenstoffquellen bestimmt werden kann.
-
Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung stellten die Tatsache klar,
dass bei der Kultivierung einer methylotrophen Hefe, die einen Methanolstoffwechselweg
aufweist, die Methanol-Additionsrate, die es der Hefe ermöglicht zu
wachsen ohne abzusterben, mit periodischer Zugabe von Methanol und
den Fluktuationen in den gelösten
Sauerstoffwerten in Synchronisation mit dieser Addition überwacht
werden kann. Weiter wurde deutlich gezeigt, dass während der
Zeitspannen, in denen die periodischen Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten
synchron mit der periodischen Methanoladdition beobachtet wurden,
die Kultur in einem Zustand ist, in dem die Methanolkonzentration
0,1 % (V/V) oder weniger beträgt
und dass es keine Anhäufung
von Methanol im Kulturmedium gibt, nämlich, dem Zustand, in dem
die Menge des zugefügten
Methanols der Menge von Methanol entspricht, die durch die Hefe
verbraucht wird. Daher wurde ein Versuch unternommen, die Rate des
Methanolverbrauchs in einem Zustand zu messen, der eine hohe Zelldichte
aufwies unter Verwendung der periodischen Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte
synchron zu der Addition von Methanol als Indikator.
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Auf ähnliche
Weise wurde während
einer Kultivierung von Stamm TK62 (pCU660) #10 zu einer Zelldichte
von 65 g DCW/L (OD600 = 270), Methanol mit Additionsraten von 1,5,
2,2, 4,7 und 6,4 ml/L·h
(äquivalent zu
Additionen von 0,023 bis 0,098 ml pro Stunde pro 1 g Hefe-Trockengewicht
(ml/g DCW·h))
zugefügt
und die periodischen Fluktuationsmuster der gelösten Sauerstoffwerte und der
Methanolkonzentrationen im Kulturmedium zu diesen Zeitpunkten wurden überprüft. Im Ergebnis
wurde festgestellt, dass die gelösten
Sauerstoffwerte synchron mit der Methanoladdition fluktuierten,
wenn die Methanol-Additionsrate 1,5 bis 4,7 ml/L·h betrug und das die Methanolkonzentrationen
in dem Kulturmedium zu diesen Zeitpunkten alle 0,1 % (V/V) oder weniger
betrugen.
-
Außerdem änderten
sich die Fluktuationsmuster mit dem Anstieg der Methanol-Additionsrate
und es wurde festgestellt, dass der Anstieg der gelösten Sauerstoffwerte
pro Einheitszeit folgend auf die Addition von Methanol gradueller
wurde. Wenn die Methanol-Additionsrate 6,4 ml/L·h annahm, wurden periodische
Fluktuationen in den gelösten
Sauerstoffwerten synchron zu dem Methanoladditionszyklus nicht länger beobachtet. Obwohl
die Methanolkonzentration im Kulturmedium zu diesem Zeitpunkt 0,1
5 (V/V) oder weniger betrug, wurde, wenn die Methanol-Additionsrate
weiter angehoben wurde, festgestellt, dass sich Methanol im Kulturmedium
anhäufte.
-
Wie
oben beschrieben, bestätigten
die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass in einer Kultur, worin die
Methanol-Additionsrate geändert wird,
mindestens wenn die gelösten
Sauerstoffwerte synchron mit der periodischen Addition von Methanol
fluktuieren, das dem Kulturmedium zugefügte Methanol direkt verbraucht wird
und sich im Kulturmedium nicht anhäuft. Anders ausgedrückt wird
ein Zustand erreicht, worin die Menge des zugefügten Methanols der Menge des
durch die Hefe verbrauchten Methanols entspricht. Es wurde auch deutlich
dargestellt, dass das periodische Fluktuationsmuster der gelösten Sauerstoffwerte
sich gemäß der Menge
des zugefügten
Methanols ändert
oder anders ausgedrückt,
gemäß dem Zeitpunkt,
bis zu dem das Methanol vollständig
verbraucht ist und die maximale Menge von Methanol, verbraucht durch
die Hefe zu jedem Zeitpunkt (Menge von Methanol, die direkt vor
der Anhäufung
zugefügt
wird) kann ohne die Entnahme von Proben überwacht werden.
-
Die
Maximalrate des verbrauchten Methanols in dem Zustand, in dem die
Zelldichte 65 g DCW/L (OD600 = 270) beträgt, wurde basierend auf diesen
Feststellungen als bei 0,098 ml/g DCW·h liegend bestimmt.
-
Die
Maximalrate des verbrauchten Methanols, wenn die Zelldichte von
Stamm TK62 (pCU660) #10 OD600 = 270 beträgt (65 g Trockenzellgewicht/l
Kulturmedium) ist 0,098 ml/g DCW·h und in dem Fall, dass die
Methanol-Additionsrate diesem Wert entspricht oder niedriger liegt,
häuft sich
Methanol im Kulturmedium nicht an. Obwohl einfach vorhergesagt werden
kann, dass die für
das Wachstum von Stamm TK62 (pCU660) #10 und die sekretorische Produktion
von Kex2-660 geeignete Methanol-Additionsrate der maximalen Methanol-Verbrauchsrate entspricht
oder niedriger liegt, war unbekannt, welche Additionsrate die besonders
geeignete sein würde.
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Um
die geeignete Methanol-Additionsrate für das Wachstum von Stamm TK62
(pCU660) #10 und die sekretorische Produktion von Kex2-660 geeignete
Methanolrate zu untersuchen, wurde die Kultivierung unter Verwendung
einer Methanol-Additionsrate von 2,25 ml/L·h oder 4,5 ml/L·h durchgeführt und
die Zellwachstumsrate und sekretorische Produktion von Kex2-660
wurde zu diesen Zeitpunkten überprüft. Im Ergebnis
wurde deutlich gezeigt, dass die Zellen während der Zeitspanne, in der
die Methanolkonzentration im Kulturmedium, bei der Fluktuationen
in den gelösten
Sauerstoffwerten synchron zu dem Methanoladditionszyklus beobachtet
wurden, 0,1 % (V/V) oder weniger beträgt, sich vermehren und Kex2-660
exprimiert und in das Kulturmedium sezerniert wird.
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Die
Methanol-Additionsrate, bei der die Methanolkonzentration im Kulturmedium
0,1 % (V/V) oder weniger beträgt
und bei der die gelösten
Sauerstoffwerte synchron mit einer periodischen Methanoladdition
fluktuieren, hat sich als die geeignete Rate für das Zellwachstum und die
Expression des Zielprodukts erwiesen. Weiterhin nahm die Anzahl
von Zellen nach 48 Stunden nach Beginn der Kultivierung um das 1.400fache
bzw. das 1.800fache vom Beginn der Kultivierung aus zu, während die
Menge des produzierten und sezernierten Kex2-660 1.260 MU bzw. 2.850
MU/l Kulturüberstand
betrug (äquivalent
zu ungefähr
150 mg bzw. 340 mg) (Tabelle 1), und zwar als Ergebnis eines Vergleichs
von Kulturen unter Verwendung von Methanol-Additionsraten von 2,25
ml/L·h
und 4,5 ml/L·h.
Es wurde deutlich gezeigt, dass solange die Methanol-Additionsbedingungen
so gehalten wurden, dass periodische Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten
weiter fortgesetzt werden, das Zellwachstum und die Produktion von
Kex2-660 mit ansteigenden Mengen des zugefügten Methanols ansteigt.
-
Bei
der Kultivierung von Stamm TK62 (pCU660) #10, während derer Methanol in Raten
von 2,25 ml/L·h
und 4,5 ml/L·h,
beginnend in der 18. Stunde nach Beginn der Kultivierung zugefügt wurde,
wurde weiterhin deutlich, dass die Rate des Methanolverbrauchs,
wenn das Trockenhefegewicht bei 0,5 g/l (OD600 = 2) oder höher liegt,
0,03 bis 0,16 ml/g DCW·h
beträgt
(Tabelle 2). Tabelle
1
- * Glycerin-Additionsrate ist 5 g/L·h.
-
Die
OD600 Kex2-Aktivität
wurde in der 48. Stunde nach Beginn der Kultivierung gemessen. Tabelle
2
- DCW: Hefetrockenzellgewicht pro Liter
Kulturmedium.
- MeOH-Verbrauchsrate: Mittelwert von 0 bis 6 Stunden im Fall
einer Kultivierungszeit von 6 Stunden und ebenso angewandt auf andere
Kultivierungszeiten.
-
Zusätzlich sind
die 48 Stunden Kultivierungszeit zur Erzeugung des oben erwähnten Kex2
kurz, mit nur 1/3 bis 1/2 der 100 bis 160 Stunden, die benötigt werden,
um das Zielgenprodukt zu erhalten, wenn in die methylotrophe Hefewachstumsphase
(ungefähr
40 Stunden) und die Produktionsphase (60 bis 120 Stunden) unterteilt
wird, wie angegeben in WO 95/21928, wodurch die Nützlichkeit
der gegenwärtigen
Erfindung im Fall einer Substanzproduktion auf Industrieniveau deutlich
angezeigt wird.
-
Weiterhin
werden Beispiele, worin periodische Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte,
erzeugt durch periodische Addition von Methanol, durch Computer
zur automatischen Kontrolle einer Kultivierung bewertet werden,
nicht dargestellt. Bei der Kultivierung unter Verwendung eines Gefäßfermenters
sind jedoch die Menge an gelöstem
Sauerstoff, pH und Temperatur ganz grundlegende Parameter für die Kontrolle
der Kultivierung und ihre Werte werden über die Zeit unter Verwendung
eines DO-Sensors, pH-Sensors bzw. Temperatursensors gemessen, um
diese Werte durch Computer zu bewerten und die Kultivierung automatisch
zu kontrollieren.
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Wenn
diese Parameter kontrolliert werden, wird die Kultivierung nicht
nur mit den Werten von jedem Parameter, sondern auch im Hinblick
auf die Veränderungsmenge
jedes Parameters pro Zeiteinheit kontrolliert. Ein Fachmann auf
dem Gebiet kann so automatisch die zugefügte Methanolmenge kontrollieren,
durch Bestimmung der geeigneten zuzufügenden Methanolmenge, ba sierend
auf den Feststellungen im Hinblick auf die periodischen Fluktuationen
der gelösten
Sauerstoffwerte, synchron zu der periodischen Adition von Methanol
und der Feststellung, dass die Fluktuationsmuster sich gemäß der Methanoladditionsrate
verändern,
wie durch die Erfinder der gegenwärtigen Erfindung klargestellt.
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Beispiele
-
Obwohl
im folgenden eine detaillierte Erklärung der vorliegenden Erfindung
unter Verwendung von Candida boidinii als Beispiel für einen
Mikroorganismus mit einem Methanolstoffwechselweg bereitgestellt wird,
ist die vorliegende Erfindung nicht auf dieses Beispiel begrenzt.
Obwohl der Promotor der Alkoholoxidase als Beispiel eines Promotors
verwendet wird, für
den eine Expression durch Methanol induziert wird und Kex2-660 als
Beispiel eines Genprodukts, das in der detaillierten Erklärung erzeugt
werden soll, verwendet wird, ist die vorliegende Erfindung zusätzlich nicht
auf diese Beispiele begrenzt.
-
Beispiel 1: Herstellung
des NKEX2-660 Geas und des Expressioasvektors pCU660
-
Ein
Gen (NKEX2-660-Gen), kodierend das sekretorische Kex2-Derivat Kex2-660
(Protein, bestehend aus den Aminosäuren vom N-terminalen Ende
zur 660. Aminosäure
der Kex2-Endoprotease) und der NKEX2-660-Expressionsvektor pCU660
wurden auf die unten beschriebene Weise hergestellt.
-
1) Herstellung des NKEX2-660-Gens
(siehe 1)
-
Ein
DNA-Fragment, enthaltend das NKEX2-660-Gen, wurde durch PCR unter
Verwendung des Plasmids pYE-KEX2(5,0)b hergestellt, für die Matrize
mit dem Restriktionsenzym Eco RI gespalten und in eine lineare Kette
geformt (Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 246–254, 1988),
und unter Verwendung von NKEX2 (SEQ ID NO.: 1) und KM088 (SEQ ID
NO.: 2) für
die Primer.
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NKEX2
und KM088 korrespondieren zu den in 1(a) dargestellten
KEX2-Genregionen, NKEX2 enthält
eine Sequenz, korrespondierend zu den Nukleotiden 107 bis 132 stromaufwärts vom
Start-Methionincodon des KEX2-Gens
und KM088 weist eine Nukleotidsequenz auf, die zu der Nukleotidsequenz
komplementär
ist, die sich aus der Addition eines Translationsstopcodons TAA
zu der DNA ergibt, die zu den Aminosäuren von Aminosäure 654 zu
Aminosäure 660 der
Kex2-Protease korrespondiert (Mizuno, et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun. 156, Seiten 246–254,
1988). Zusätzlich
weist NKEX2 eine Nukleotidsequenz der Restriktase Not I-Stelle am
5'-terminalen Ende
auf (unterstrichen), während
KM088 die Nukleotidsequenz des Restriktionsenzyms Sal I aufweist
(unterstrichen) (siehe 1(b)). Diese
Primer wurden unter Verwendung einer automatischen Synthesevorrichtung
synthetisiert (Applied Biosystems Modell 380A) und zwar
gemäß dem Phosphoamididverfahren.
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2) Herstellung des Expressioasvektors
pCU660 (siehe 2)
-
Der
Expressionsvektor pCU660 wurde durch Insertion eines Not I DNA-Fragments hergestellt,
enthaltend das NKEX2-660-Gen, in die Not I-Restriktionsenzymstelle des Expressionsplasmids
pNOTelI (japanische ungeprüfte
Patentveröffentlichung
Nr. 5-344895), wobei Candida boidinii als Wirt verwendet wurde,
so dass das KEX2-660-Gen unter der Kontrolle des Alkoholoxidasegen
(AOD) -Promotors exprimiert werden kann (2).
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Für den Vektor
wurde pNOTelI mit dem Restriktionsenzym Not I gespalten und das
ungefähr
7,4 kb DNA-Fragment wurde gereinigt. Das Not I DNA-Fragment, enthaltend
das NKEX2-660-Gen, wurde durch Klonierung eines DNA-Fragments, enthaltend
das NKEX2-660-Gen von 1) in pCRII (Invitrogen) und dann unter Spaltung
unter Verwendung der Restriktionsenzym Not I -Stellen, die auf NKEX2
und pCRII vorliegen, hergestellt. Weiterhin ist pNOTelI ein Vektor,
der es ermöglicht,
dass das Zielgen durch den AOD-Promotor exprimiert werden kann und
weist ein URA3-Gen als Selektionsmarker im Fall einer Verwendung
von Hefe als Wirt auf sowie eine Ampicillinresistenz im Fall einer
Verwendung von E. coli als Wirt. Dementsprechend können, wenn
Hefe als Wirt verwendet wird, der Uracil benötigt, transformierte Stämme auf
einer Platte, die kein Uracil enthält, selektiert werden.
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Beispiel 2: Isolierung
des Transformanten und das Kex2-produzierenden Stamms
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Das
Plasmid pCU660, gespalten mit den Restriktionsenzym Bam HI und in
eine lineare Kette geformt, wurde in den Uracil benötigenden
Stamm TK62 eingeführt
und der Chromosomen-Insertions-rekombinante Stamm TK62 (pCU660)
wurde unter Verwendung der Komplementarität zu dem Uracilbedarf selektiert.
Stamm TK62 ist ein Uracil benötigender
Stamm, erzeugt durch eine URA3-Mutation,
der von dem Candida boidinii Stamm S2 AOU-1 abgeleitet ist und das
Transformationsverfahren des Stamms TK62 wurde von Sakai, et al. berichtet
(Sakai, Y. et al., J. Bacteriol., 173, 7458–7463, 1991). Der Stamm S2
AOU-1 wurde Candida boidinii SAM1958 genannt und wurde im Institute
of Bioengineering and Human Technology Agency of Industrial Science
and Technology am 25. Februar 1992 als FERM BP-3766 hinterlegt).
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pCU660
ist ein Chromosom-Insertions-Expressionsvektor und für den resultierenden
Transformanten TK62 (pCU660) kann die Menge des exprimierten Kex2-Derivats
und die sezernierte Menge abhängig
von der Chromosomeninser tionsstelle des Gens differieren, ebenso
von der Zahl der Kopien usw. Zwanzig transformierte Klone (#1 bis
#20) wurden auf dem Teströhrchenniveau
kultiviert und die Menge des in das Kulturmedium sezernierten Kex2-Derivats
(Kex2-Proteaseaktivität)
wurde überprüft, um Klone
zu selektieren, die große Mengen
Kex2-Derivat sezernierten.
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Zunächst wurden
20 Stämme
TK62 (pCU660) #1 bis #20 bei 27°C
in BMGY-Medium (1
% (G/V) Hefeextrakt, 2 % (G/V) Pepton, 1 % (G/V) Glycerin, 1,34
% (G/V) YNB ohne AS: Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 0,4
mg/L Biotin und 100 mM Kaliumphosphat (pH 6,0)) auf einem Schüttler kultiviert.
Zwei Tage später
wurde das Kulturmedium in 1 ml BMMY-Medium (1 % (G/V) Hefeextrakt,
2 % (G/V) Pepton, 0,5 % (G/V) Methanol, 1,34 % (G/V) YNB ohne AS,
0,4 mg/l Biotin und 100 mM Kaliumphosphat (pH 6,0)) inokuliert,
so dass die OD600 10 betrug, gefolgt von einer Schüttel-Kultivierung
bei 27°C.
Dreißig
Stunden später
wurde die Kex2-Aktivität
des Überstands
gemessen und fünf
Stämme
mit der höchsten
Aktivität
wurden selektiert. Diese fünf
Stämme
wurden auf ähnliche
Weise kultiviert, woraufhin der TK62 (pCU660) Stamm #10 selektiert
und in dem folgenden Experiment aufgrund seines konstistent hohen
Niveaus an Kex2-Aktivität
verwendet wurde.
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Die
Messung der Kex2-Aktivität
wurde gemäß dem Verfahren
von Mizuno, et al. durchgeführt
(Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 156, 246–254, 1988).
Es wurden nämlich
100 μl Kex2-600,
verdünnt mit
100 mM Tris-HC1 (pH 7,0) zu 100 μl
200 mM Tris-HC1 (pH 7,0) Lösung
zugefügt,
enthaltend 2 mM CaCl2, 0,2 % (G/V) Luburol
und 100 μM
Boc-Leu-Arg-Arg-MCA (Peptide Research), und man ließ diesen
Ansatz bei 37°C
30 Minuten stehen. Nach einer Zugabe von 50 μl 25 mM EGTA wurde die Fluoreszenzintensität des gespaltenen
AMC unter Verwendung des PANDEX FCA-Systems (Baxter-Travenol: Modell
10-015-1, Anregung = 365 nm, Emission = 450 nm) gemessen. Die Menge
an Kex2-Aktivität,
die 1 pmol AMC in 1 Minute unter den oben erwähnten Bedingungen freisetzt,
wurde als 1 U Aktivität
definiert.
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Beispiel 3: Eiastellen
der Kultivierungsbedingungen (siehe 3)
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1) Zugrundeliegende Kultivieruagsbedingungen
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Eine
Vorkultur wurde durch Inokulieren von 1 ml des Stamms TK62 (pCU660)
#10 aus einer Glycerin-eingefrorenen Lagerlösung in einen 300 ml Erlenmeyer
Kolben, enthaltend 25 ml YPD-Medium (1 % (G/V) Hefeextrakt, 2 %
(G/V) Pepton, 2 % (G/V) Glucose) und Kultivieren bei 27°C für 16 Stunden
auf einem Schüttler
durchgeführt.
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Die
Hauptkultur wurde durch Inokulieren der oben erwähnten Vorkulturen in 2 Liter
Kulturmedium (1,5 % (V/V) Methanol, 3 % (G/V) Glycerin, 1 % (G/V)
Hefeextrakt, 2 % (G/V) Pepton, 50 mM Kaliumphosphat (pH 6,0) und
1,34 % (G/V) YNB ohne AS), durchgeführt, so dass die Zelldichte
zum Beginn der Kultivierung OD600 = 0,2 betrug und unter Rühren unter
Belüftung
bei 27°C
unter Verwendung eines 5 l Volumenfermenters (Mitsuwa Scientific
Instruments, Modell KMJ-5B-4U-FP). Die Belüftungsrate wurde auf 4 l/min
eingestellt und die Rührrate
wurde so eingestellt, dass die Menge des gelösten Sauerstoffs nicht unter
2,5 ppm abfiel. Der Stickstoff der Kultur wurde in geeigneter Weise
mit 80 ml einer Stickstoffquellauffüllösung aufgefüllt (5 % (G/V) Hefeextrakt,
10 % (G/V) Pepton, 6,7 % (G/V) YNB ohne AS) und der pH wurde so
eingestellt, dass er nicht auf unterhalb von 5,5 abfiel, und zwar
durch Zugabe von 7,5 % Ammoniakwasser.
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0,5
ml/l Antischaummittel (Disfoam CC-222, Nippon Yushi) wurde zu Beginn
der Kultivierung zugefügt und
wurden nach dieser Zeit zugefügt,
falls nötig.
Die Auffüllung
der Kohlenstoffquelle wurde unter Verwendung von einer 15 bis 45%igen
(V/V) Methanollösung
und einer 10 bis 50%igen (G/V) Glycerinlösung durchgeführt (Die
Konzentrationen wurden gemäß der Kultivierung
verändert).
Methanol und Glycerin wurden periodisch durch Betreiben einer peristaltischen
Pumpe mit einem konstanten Zufuhrvolumen pro Zeiteinheit für eine fixierte
Zeitmenge alle 7,5 Minuten zugefügt.
Die Additionsrate wurde durch die Menge von Methanol (ml/L·h) oder
die Menge von Glycerin (g/L·h)
zugefügt
pro Liter Kulturmedium pro Stunde, dargestellt.
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2) Uatersuchuag der Methanoladditioasbediagungen
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Die
Konzentration von Methanol in dem Kulturmedium ist ein wichtiger
Parameter für
das Wachstum des methylotrophen Hefestamms TK62 (pCU660) #10 mit
einem Methanolstoffwechselweg und für die Expression von Kex2-660
von einem AOD-Promotor, für
den die Expression durch Methanol induziert wird. Die Erfinder der
gegenwärtigen
Erfindung haben zuerst versucht, die Bedingungen für die Addition
von Methanol einzustellen, um die Methanolkonzentration im Kulturmedium
auf einer Konzentration zu erhalten, die, als Kohlenstoffquelle
für das
Hefewachstum ausreicht, und die außerdem keine Zelltoxizität ausübt. Die
Kultivierung wurde gemäß den zugrundeliegenden
Kultivierungsbedingungen durchgeführt.
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Die
Methanolkonzentration des Kulturmediums wurde alle 3 Stunden gemessen
und die Zeit und Mengen der Methanolzugabe zum Kulturmedium wurden
im Hinblick auf Konzentrationen 2 bis 3 Stunden früher bestimmt.
Da die Methanolkonzentration im Kulturmedium auf 0,42 % (V/V) 15
Stunden nach Beginn der Kultivierung (OD600 = 22) abgenommen hatte,
wurde die Addition von Methanol mit einer Rate von 0,75 ml/L·h 18 Stunden
nach Beginn der Kultivie rung (OD600 = 52) begonnen. Weiterhin hatte
die Methanolkonzentration im Kulturmedium 18 Stunde nach Beginn
der Kultivierung direkt vor Zugabe des Methanols auf 0,26 % (V/V) abgenommen.
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Da
die Methanolkonzentration im Kulturmedium 21 Stunden nach Beginn
der Kultivierung weiter auf 0,1 % (V/V) oder weniger abgenommen
hatte, wurde die Rate der Methanoladdition auf 7,5 ml/L·h 23 Stunden nach
Beginn der Kultivierung angehoben (10mal schneller als die ursprüngliche
Additionsrate). Direkt nach diesem Anstieg der Additionsrate nahm
die Rührrate
deutlich ab und die Rate des Sauerstoffverbrauchs durch die Hefe
nahm plötzlich
ab. Eine Abnahme der Zellaktivität
wurde nämlich
beobachtet. Später
nahm die Zelldichte ab und es wurde angenommen, dass die Hefen lysiert
waren. Die Methanolkonzentration des Kulturmediums 1 Stunde nach
Anstieg der Methanol-Additionsrate (24 Stunden nach Beginn der Kultivierung)
betrug 0,76 % (V/V) und zeigte so an, dass sich Methanol im Kulturmedium
anhäufte.
Auf Basis der obigen Ergebnisse wurde festgestellt, dass 1) ein
guter Zeitpunkt zum Beginn der Addition von Methanol zum Kulturmedium die
18. Stunde nach Beginn der Kultivierung ist (OD600 = ungefähr 50),
2) da die Methanolkonzentration des Kulturmediums auf 0,1 % (V/V)
oder weniger, bei einer Methanol-Additionsrate von 0,75 ml/L·h innerhalb
von 3 Stunden abnimmt, die Möglichkeit
eines Mangels an Methanol als Kohlenstoffquelle besteht und 3) eine
Möglichkeit
einer Zelltoxizität
auftritt, die aufgrund einer Anhäufung
von Methanol im Kulturmedium auf der Grundlage einer Additionsrate
von 7,5 ml/L·h,
die deutlich zu schnell ist, auftritt. Zusätzlich wurde festgestellt,
dass bei Fortsetzung eines Zustandes, worin die Methanolkonzentration
im Kulturmedium 0,1 % (V/V) oder weniger beträgt, die schnelle Zugabe von
Methanol dazu führt,
dass der Stamm TK62 (pCU660) #10 getötet wird.
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Fluktuationen
in den gelösten
Sauerstoffwerten synchron zum Zyklus der Methanoladdition wurden von
der 20. bis 23. Stunde nach Beginn der Kultivierung beobachtet.
Da diese Periode mit der Zeit übereinstimmte,
in der die Methanolkonzentration des Kulturmediums auf 0,1 % (V/V)
oder weniger abnahm bis zu der Zeit, als das Methanol sich aufgrund
der schnellen Zugabe von Methanol zum Kulturmedium anzuhäufen begann
(nämlich
während
der Zeit, während
derer die Methanolkonzentration im Kulturmedium 0,1 % (V/V) oder weniger
betrug) wurde vorgeschlagen, dass es eine Beziehung zwischen den
periodischen Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten und der
Methanolkonzentration im Kulturmedium gibt.
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3) Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte
und der Methanolkonzentration im Kulturmedium
-
In
der Kultur, zu der Methanol periodisch in dem vorherigen Bereich
zugefügt
wurde, wurde vorgeschlagen, dass Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten,
synchron mit dem Additionszyklus beobachtet werden, wenn die Methanolkonzentration
im Kulturmedium 0,1 % (V/V) oder weniger betrug und sie werden nicht
länger
beobachtet, wenn sich Methanol im Kulturmedium anzuhäufen beginnt.
Die Menge von gelöstem Sauerstoff
ist ein routinemäßig überwachter
Parameter für
eine Kulturkontrolle und wird unter Verwendung einer Elektrode für gelösten Sauerstoff
gemessen. Wenn es möglich
wäre, die
benötigte
Menge des Methanols vorherzusagen, basierend auf Veränderungen
der Menge von gelöstem
Sauerstoff bei der Kultivierung von Mikroorganismen mit einem Methanolstoffwechselweg,
wäre es
möglich,
einfach stabile und effiziente Kulturbedingungen einzustellen.
-
Daher
wurde eine detaillierte Untersuchung im Hinblick auf die Beziehung
zwischen den Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten in Synchronisation
mit dem Methanoladditionszyklus und der Methanolkonzentration des
Kulturmediums durch Kultivierung unter Verwendung einer Methanol-Additionsrate von
2,25 ml/L·h,
die zwischen der Rate von 0,75 ml/L·h liegt, bei der die Methanolkonzentration
im Kulturmedium schnell abnahm und der Rate von 7,5 ml/L·h liegt,
bei der das Methanol sich im Kulturmedium bei der oben erwähnten Kultivierung
in Sektion 2) anhäufte,
durchgeführt.
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Basierend
auf den Ergebnissen von Sektion 2) wurde der Zeitpunkt, zu dem die
Methanoladdition begonnen wurde, auf den Zeitpunkt gelegt, zu dem
OD600 ungefähr
50 erreicht (ungefähr
18 Stunden nach Beginn der Kultivierung) und die Additionsraten
der Kohlenstoffquellen wurden auf 2,25 ml/L·h für Methanol und 0,15 g/L·h für Glycerin
eingestellt. Die Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten, synchron
zum Zyklus der Kohlenstoffquellenaddition wurden beobachtet, beginnend
in der 23. Stunde nach Beginn der Kultivierung (OD600 = 97) und
bis zum Abschluss der Kultivierung fortgesetzt (49 Stunden nach
Beginn der Kultivierung; OD600 = 198).
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Die
Methanolkonzentration im Kulturmedium während dieser Zeit betrug 0,1
% (V/V) oder weniger. Zusätzlich
nahm die Menge der Veränderung
in der periodischen Fluktation in den gelösten Sauerstoffwerten synchron
zum Additionszyklus der Kohlenstoffquelladditionslösung zu
(3), wenn die Methanolkonzentration im Kulturmedium
0,1 % (V/V) oder weniger und die Glycerinkonzentration auch 0,1
% (G/V) oder weniger annahm. Wenn Glycerin so zugefügt wurde,
dass die endgültige
Konzentration im Kulturmedium zu diesem Zeitpunkt auf 1,25 % (G/V)
anstieg, wurde festgestellt, obwohl die erhöhte Menge einer Veränderung
auf normal zurückkehrte,
dass die periodischen Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte synchron
zum Additionszyklus der Kohlenstoffquelladditionslösung sich
selbst fortsetzten (3).
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Es
war nämlich
klar, dass die periodischen Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte
anzeigen, dass die Methanolkonzentration des Kulturmediums 0,1 %
(V/V) oder weniger betrug und ein Anstieg der Menge der Veränderung
zeigt einen Zustand an, worin die Methanolkonzentration im Kulturmedium
0,1 % (V/V) oder weniger und die Glycerinkonzentration 0,1 % (G/V)
oder weniger beträgt.
Durch Verwendung dieser Indikatoren kann der Zustand überwacht
werden, worin die Methanolkonzentration 0,1 % (V/V) oder weniger
und die Glycerinkonzentration 0,1 % (G/V) oder weniger beträgt.
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Zusätzlich wurde
auch deutlich, dass während
der Zeit, in der die Methanolkonzentration 0,1 % (V/V) oder weniger
beträgt
(23 bis 49 Stunden nach Beginn der Kultivierung), die Zahl der Zellen
auf mehr als das 2fache ansteigt. Anders ausgedrückt waren die Zellen in der
Lage zu wachsen, obwohl die Methanolkonzentration des Kulturmediums
0,1 % (V/V) oder weniger betrug.
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Beispiel 4: Optimierung
der Methanol-Additionsrate, basierend auf dem periodischen Fluktuatioasmuster
der gelösten
Sauerstoffwerte
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Die
Erfinder der gegenwärtigen
Erfindung haben deutlich demonstriert, dass während der Zeit, in der die
Methanolkonzentration im Kulturmedium in Beispiel 3 0,1 % (V/V)
oder weniger beträgt
und der Zeit, in der sich Methanol im Kulturmedium nicht anhäuft, Fluktuationen
in gelösten
Sauerstoffwerten beobachtet werden, die synchron zu der periodischen
Addition von Methanol sind und dass die Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten
nicht länger
beobachtet werden, wenn Methanol sich anzuhäufen beginnt. Weiterhin wurde
deutlich dargestellt, dass Zellen in einem Zustand wachsen, in dem
die Fluktuationen in den gelösten
Sauerstoffwerten synchron zu der Addition von Methanol beobachtet
werden. Daher wurde eine Studie durchgeführt, um die Beziehung zwischen
der Methanol-Additionsrate und den periodischen Fluktuationen der
gelösten
Sauerstoffwerte zu bestimmen und die Beziehung zwischen der Methanol-Additionsrate
und der Menge an sezerniertem Kex2-660-Produkt klarzustellen.
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1) Korrelation zwischen
der Methanol-Additionsrate und dem periodischen Fluktuationen der
gelösten
Sauerstoffwerte
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Die
Veränderungen
der Fluktuationsmuster der gelösten
Sauerstoffwerte, synchron zu der periodischen Methanoladdition,
wenn die Methanol- Additionsrate
verändert
wurde, wurden überprüft, um zu
bestimmen, ob die Veränderungen
als Indikator zur Kontrolle der Addition von Methanol zu einem Kulturmedium
verwendet werden können.
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Wenn
die Zelldichte nach Beginn der Kultivierung OD600 = 270 erreichte
(65 g DCW/L des Kulturmediums), wurde die Methanol-Additionsrate
auf 1,5, 2,2, 4,7 und 6,4 ml/L·h
verändert
und die periodischen Fluktuationsmuster der gelösten Sauerstoffwerte und die
Methanolkonzentrationen im Kulturmedium zu diesem Zeitpunkt wurden überprüft. Glycerin
wurde simultan mit einer Rate von 5 g/L·h zugefügt. Es wurde festgestellt, dass
die Fluktuationen in den gelösten
Sauerstoffwerten in Synchronisation mit der Methanoladdition beobachtet
werden, wenn die Methanol-Additionsrate 1,5, 2,2 oder 4,7 ml/L·h betrug,
dass die Methanolkonzentrationen in dem Kulturmedium zu diesen Zeitpunkten
alle 0,1 % (V/V) oder weniger betrugen und dass sich Methanol nicht
anhäufte.
Weiterhin wurde festgestellt, dass sich das Fluktuationsmuster mit
einem Anstieg in der Methanol-Additionsrate veränderte und das die Anstiegsrate
in den gelösten
Sauerstoffwerten pro Zeiteinheit, folgend auf die Addition von Methanol
gradueller wurde (4).
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Wenn
die Methanol-Additionsrate 6,4 ml/L·h annahm, wurden weiterhin
keine periodischen Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte synchron
zum Methanoladditionszyklus mehr beobachtet (4). Obwohl die
Methanolkonzentration in dem Kulturmedium zu diesem Zeitpunkt 0,1
% (V/V) oder weniger betrug, häufte sich
Methanol im Kulturmedium an, wenn die Methanol-Additionsrate weiter anstieg. Obwohl
die Fähigkeit
von Hefe zum Verbrauch von Methanol nicht nur durch Messung der
Methanolkonzentration im Kulturmedium bestimmt werden kann, wurde
basierend auf den obigen Ergebnissen und denjenigen der Sektion
2) von Beispiel 3 bestimmt, dass Hefen einen sehr breiten Bereich
zum Verbrauch von Methanol aufweisen, wenn der Anstieg der gelösten Sauerstoffwerte
pro Zeiteinheit schnell ist und einen geringen Bereich eines Methanolverbrauchs, wenn
dieser Anstieg graduell erfolgt.
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Anders
ausgedrückt
kann der Bedarf an einer Einstellung der Rate der Methanoladdition
durch Beobachtung des periodischen Fluktuationsmusters der gelösten Sauerstoffwerte
bestimmt werden. Weiterhin wurde deutlich gezeigt, dass in dem Zustand,
in dem die Zelldichte OD600 = 270 beträgt, solange die Methanol-Additionsrate
nicht 4,7 ml/L·h übersteigt,
periodische Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten beobachtet
werden, sich Methanol nicht anhäuft
und der Stamm TK62 (pCU660) #10 ohne abgetötet zu werden, wächst.
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2) Methanol-Additionsrate
und Menge von erzeugtem serzerniertem Kex2-660
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Wenn
die Zelldichte des Stamms TK62 (pCU660) #10 OD600 = 270 ist (65
g DCW/L-Kulturmedium) lag die Methanol-Additionsrate, bei der sich
Methanol im Kulturmedium nicht anhäuft und die Hefe nicht abgetötet wird,
im Bereich von 1,5 bis 4,7 ml/L·h. Um zu untersuchen, welche
dieser Methanol-Additionsraten,
bei denen sich Methanol im Kulturmedium nicht anhäuft, für die Wachstumsrate
des Stamms TK62 (pCU660) #10 und für die Menge des sezernierten
erzeugten Kex2-660 optimal ist, wurde daher eine Kultivierung unter
Verwendung einer Methanol-Additionsrate von 2,25 ml/L·h oder
4,5 ml/L·h
durchgeführt
und die Zellwachstumsraten und die Mengen der sezernierten Kex2-660-Produktion
zu diesen Zeitpunkten wurden bestimmt. Die Glycerin-Additionsrate betrug
in beiden Fällen
5 g/L·h.
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Während der
Kultivierung unter Verwendung der Methanol-Additionsraten von 2,25
und 4,5 ml/L·h
begannen die gelösten
Sauerstoffwerte synchron mit der periodischen Addition von Methanol,
beginnend 22 bzw. 25 Stunden nach Beginn der Kultivierung zu fluktuieren
und die Fluktuationen setzten sich bis zur 48. Stunde fort, zu der
die Kultivierung abgeschlossen war. Die Methanolkonzentrationen
im Kulturmedium während
dieser Zeit betrugen beide 0,1 % (V/V) oder weniger.
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Während der
Zeit, während
derer Fluktuationen in den gelösten
Sauerstoffwerten beobachtet wurden, nahm in jedem Zustand sowohl
die Zelldichte als auch die Menge des erzeugten sezernierten Kex2-660
zu (z.B. nahm die Zelldichte und die Menge des sezernierten erzeugten
Kex2-660 um das ungefähr
2,5fache bzw. ungefähr
7,4fache während
der Zeit von der 24. bis zur 48. Stunde nach Beginn der Kultivierung
bei einer Methanol-Additionsrate von 4,5 ml/L·h zu; 5) und während der
Periode, während
derer die Methanolkonzentration im Kulturmedium 0,1 % (V/V) oder
weniger betrug, wenn Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten beobachtet
wurden, die zu dem Methanoladditionszyklus synchron waren, war deutlich,
dass die Zahl der Zellen anstieg und dass Kex2-660 in das Kulturmedium
unabhängig
von der Rate der Methanoladdition exprimiert und sezerniert wurde
(5 und 6). Es wurde nämlich festgestellt,
dass die Methanol-Additionsrate, bei der die Methanolkonzentration
im Kulturmedium 0,1 % (V/V) oder weniger beträgt und die gelösten Sauerstoffwerte
synchron zu der periodischen Addition von Methanol fluktuieren,
die geeignete Rate für
ein Zellwachstum und die Expression des Zielprodukts ist.
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Während der
Kultivierung unter Verwendung von Methanol-Additionsraten von 2,25
und 4,5 ml/L·h stieg
die Anzahl der Zellen um das 1.400fache bzw. 1.800fache, und zwar
in der 48. Stunde nach Beginn der Kultivierung, während 1.260
MU bzw. 2.850 MU (äquivalent
zu ungefähr
150 mg und 340 mg) Kex2-660 pro Liter Kulturüberstand exprimiert und sezerniert
wurden (Tabelle 1). So wurde deutlich, dass solange die Methanoladditionsbedingungen
so gehalten werden, dass periodische Fluktuationen in den gelösten Sauerstoffwerten
sich fortsetzen (anders ausgedrückt,
bei einer Rate, die der maximalen Methanol-Verbrauchsrate der Hefe
entspricht oder niedriger liegt) die Zellwachstumsrate ansteigt
und die Menge des erzeugten Kex2-660 ansteigt, wenn die Menge des
zugefügten
Methanols ansteigt.
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Weiterhin
war die Zeitspanne, die für
diese Kulturen benötigt
wurde (48 Stunden) kurz im Vergleich mit der Zeitspanne (100 bis
160 Stunden) für
eine Kultivierung, die in eine Wachstumsphase und eine Produktionsphase
für methylotrophe
Hefen unterteilt war, die im Hinblick auf Enzyme eines Methanolstoffwechselwegs defizient
sind, was die Nützlichkeit
der vorliegenden Erfindung bestätigt.
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6 zeigt
die Ergebnisse eines SDS-PAGE, durchgeführt gemäß dem Verfahren von Laemmli
(Laemmli et al:, Nature, 227, 680–685, 1970). Es wurden nämlich 7 μl 4 × SDS-Probenpuffer
(375 mM Tris-HCl (pH 6.8), 30 % (G/V) Glycerin, 7 % (G/V) SDS, 15
% (V/V) 2-Mercaptoethanol, 0,1 % (G/V) Bromphenol blau) zu 20 μl Kulturüberstand
zugefügt,
gefolgt von einer Erwärmung
auf 95°C
für 5 Minuten,
um die SDS-PAGE-Probe herzustellen. 6 % SDS-PAGE wurde unter Bedingungen
von 18 mA und 90 Minuten unter Verwendung von 7 μl der oben erwähnten Probe
durchgeführt.
Folgend auf die Elektrophorese wurde das Gel mit einer Färbelösung angefärbt (10
% (V/V) Essigsäure,
40 % (V/V) Methanol, 0,25 % (G/V) Coumassie's brilliant blue R250). Diese Ergebnisse
sind in 6 dargestellt.
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3) Methanol-Verbrauchsrate
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Während der
Kultivierung unter Verwendung von Methanol-Additionsraten von 2,25
und 4,5 ml/L·h wurden
die Methanol-Verbrauchsraten pro 1 g DCW Hefe (Mittelwert alle 6
Stunden) bestimmt (Tabelle 2). Die Methanol-Verbrauchsrate pro Liter Kulturmedium
wurde als der Wert genommen, der sich aus der Subtraktion der Menge
von Methanol ergab, die von der Menge des zugefügten Methanols verblieb, während das
Hefe-Trockenzellgewicht (DCW) berechnet wurde, indem der OD600-Wert
des Kulturmediums in eine Konversionsformel eingetragen wurde, die
im vorhinein basierend auf der Beziehung zwischen den beiden bestimmt wurde.
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Da
es vorhergesagt war, dass die Wirkungen von Faktoren, wie z.B. Belüftung und
Wärmeerzeugung, ausgelöst durch
Rühren,
im Fall einer DCW von 0,5 g oder weniger signifikant sein könnten, wurde
dies weiterhin aus der Berechnung eliminiert, da es eine hohe Möglichkeit
gab, dass die korrekte Menge des Methanolverbrauchs nicht berechnet
werden könnte.
Während
der Kultivierung von Stamm TK62 (pCU660) #10, basierend auf den
periodischen Fluktuationen der gelösten Sauerstoffwerte wurden
die Methanol-Verbrauchsraten
als bei 0,03 bis 0,16 ml/gDCW·h
liegend bestimmt, wenn DCW 0,5 g oder mehr betrug.
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Gemäß den vorliegenden
Feststellungen kann die Menge des zugefügten Methanols, die sowohl
für das
Wachstum der Mikroorganismen als auch für die Expression eines heterogenen
Gens, kontrolliert durch einen Promotor, geeignet ist, aus der Menge
des Methanols bestimmt werden, verbraucht durch Mikroorganismen
mit einem Methanolstoffwechselweg ohne Messung der Konzentration
des Methanols im Kulturmedium, in einem heterogenen Genexpressionssystem
unter Verwendung eines Methanol-induzierbaren Promotors und eines
Wildstamms von Mikroorganismen mit einem Methanolstoffwechselweg
als Wirt, ohne Verwendung eines Stamms, der im Hinblick auf ein
Methanolstoffwechselwegenzym defizient ist. Während der Zeit, während derer
Fluktuationen in gelösten
Sauerstoffwerten synchron zu der periodischen Addition von Methanol
beobachtet werden, wenn die Methanolkonzentration im Kulturmedium
0,1 % (V/V) oder weniger beträgt,
ist weiterhin die maximale Rate des Methanolverbrauchs der Mikroorganismen
größer als
die Rate der Methanoladdition oder entspricht dieser und das Methanol
häuft sich
im Kulturmedium nicht an, wodurch eine stabile Kultur ermöglicht wird,
worin die Mikroorganismen durch die Zelltoxizität, die durch das Methanol ausgelöst wird,
nicht zerstört
werden.
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Wenn
der Unterschied zwischen der maximalen Rate des Methanolverbrauchs
durch die Mikroorganismen und der Methanol-Additionsrate abnimmt,
so dass die beiden gleich werden, kann außerdem, da das Fluktuationsmuster
der gelösten
Sauerstoffwerte sich ändert,
eine geeignete Methanol-Additionsrate für das Mikroorganismenwachstum
und die Expression eines heterogenen Gens, kontrolliert durch einen
Promotor, bestimmt und kontrolliert werden, wobei diese Veränderung
als Indikator verwendet wird. Da die gelösten Sauerstoffwerte Parameter
sind, die normalerweise für
die Kontrolle der Kultivierung verwendet werden und da die Methanol-Additionsrate
aus ihrem Fluktuationsmuster bestimmt werden kann, kann Methanol
gemäß einer
automatischen Feedback-Kontrollschleife zugefügt werden, was in der Vergangenheit
bei der Kultivierung von Mikroorganismen mit einem Methanolstoffwechselweg
nicht möglich
war.
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So
können
die vorliegenden Techniken ein Kultivierungsverfahren bereitstellen,
das sowohl im Hinblick auf das Wachstum der Mikroorganismen als
auch die Produktion des Zielprodukts effizient ist, während es
außerdem
einen hohen Grad der Reproduzierbarkeit bereitstellt, indem die
Methanol-Additionsrate
auf die maximale Methanol-Verbrauchsrate der Mikroorganismen eingestellt
wird oder niedriger liegt und nahe dieser maximalen Verbrauchsrate
liegt (was eine starke Transkriptionsinduktion von dem Promotor
ohne Inhibition des Wachstums des Wirts ermöglicht). Zusätzlich kann
die Kultivierung von Mikroorganismen mit einem Methanolstoffwechselweg,
die Methanol als Kohlenstoffquelle verwenden, schnell durchgeführt werden
und eine effiziente Produktion erlauben. In dem Fall, in dem ein
Genprodukt in das Kulturmedium sezerniert wird, kann weiterhin angenommen
werden, dass die Abnahme der Mengen von Methanol und Glycerin, enthalten
im Kulturmedium, zu einer verbesserten Stabilität des Genprodukts und einer
größeren Einfachheit
des Reinigungsverfahrens beiträgt.
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