ES2253767T3 - Metodo para cultivar microorganismos que tienen una ruta metabolica de metanol. - Google Patents
Metodo para cultivar microorganismos que tienen una ruta metabolica de metanol.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION, DESCRIBE UN METODO DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS QUE TIENEN UNA VIA METABOLICA DE UTILIZACION DE METANOL, EN EL QUE SE INTRODUCE UNA UNIDAD DE EXPRESION, QUE COMPRENDE UN GEN DIANA, UNIDO AGUAS ABAJO RESPECTO DE UN PROMOTOR QUE PUEDE SER INDUCIDO POR METANOL. DURANTE EL PERIODO DE CULTIVO, E INCLUYENDO EL PERIODO DURANTE EL CUAL SE AÑADE METANOL PERIODICAMENTE, LA VELOCIDAD DE ADICION SE AJUSTA A UNA VELOCIDAD IGUAL O INFERIOR A LA MAXIMA VELOCIDAD DE CONSUMO DE ETANOL DE DICHOS MICROORGANISMOS.
Description
Método para cultivar microorganismos que tienen
una ruta metabólica de metanol.
La presente invención se refiere a un método para
cultivar microorganismos que tienen una ruta metabólica del metanol
en los que se ha introducido una unidad de expresión en la que un
gen diana está unido por debajo de un promotor que es capaz de
inducirse por metanol, dicho método permite que el producto del gen
diana se produzca de manera eficaz.
La producción de polipéptidos y de otros
productos génicos utilizando microorganismos como anfitriones ha
resultado posible básicamente debido a los avances realizados en la
tecnología del ADN recombinante. La producción de polipéptidos se
lleva a cabo mediante la introducción de una unidad de expresión en
la que el gen del polipéptido diana está unida por debajo de un
promotor adecuado. Típicamente, se utilizan microorganismos como
E. coli, levaduras y células animales como un anfitrión.
Los sistemas de expresión génica que utilizan
E. coli como el anfitrión son los sistemas más comúnmente
utilizados, y estos sistemas proporcionan típicamente una
productividad alta. Sin embargo, debido a que existen muchos casos
en los que el polipéptido expresado forma cuerpos de inclusión
insolubles que resultan en una forma insoluble, la posibilidad de
utilizar este sistema depende en gran medida de las propiedades del
polipéptido diana.
Por otra parte, los sistemas de expresión génica
que utilizan células animales como un anfitrión son útiles para el
fin de confirmar una actividad de un producto génico etc, debido a
que en muchos casos el polipéptido expresado retiene la actividad.
Sin embargo, la cantidad del polipéptido diana es típicamente baja
y, en este caso, se requieren unos esfuerzos considerables para la
purificación. Además, debido a que las células animales se
reproducen lentamente y a que el medio utilizado es caro, el cultivo
requiere un tiempo y un coste considerables. Más aún, también
resulta difícil incrementar la escala del cultivo. Por lo tanto, las
células animales no son deseables como un anfitrión para obtener de
manera industrial un polipéptido diana en un volumen grande.
Las células de levadura son células eucariotas
que tienen retículo endoplásmico, aparato de Golgi y otros
componentes celulares similares a los de las células animales.
También se sabe que son capaces de formar y de expresar
polipéptidos que tienen estructuras terciarias particulares en
polipéptidos derivados a partir de células eucariotas. Además, se
reproducen más rápidamente que las células animales y pueden
cultivarse en volúmenes grandes fácilmente. Los análisis genéticos
se han llevado a cabo de manera más extensiva en Saccharomyces
cerevisiae, y ésta se utiliza ampliamente a nivel de laboratorio
como un anfitrión para la expresión génica.
Sin embargo, debido a que es difícil crecer
Saccharomyces cerevisiae en una densidad célular alta y a
que el rendimiento por medio de cultivo no es alto, no resulta
suficiente para la producción industrial del polipéptido diana. Con
el fin de resolver este problema, se utilizan levaduras
metilotróficas tales como Pichia pastoris, Hansenula polymorpha
y Candida boidinii.
Por ejemplo, Gellisen et al. consiguieron
producir 1,4 g de glucoamilasa a una densidad celular de 100 a 130
g de peso seco celular por litro de medio de cultivo utilizando un
promotor de fórmico deshidrogenasa cuya expresión está inducida por
metanol y Hansenula polymorpha como anfitrión (Gellisen et
al., BIO/TECHNOLOGY, 9, 291-295, 1991). Además,
Barr et al. consiguieron producir 4 g de albúmina sérica
humana por litro de medio de cultivo utilizando un promotor de
alcohol oxidasa cuya expresión está inducida por metanol y Pichia
pastoris como anfitrión (Barr et al., Pharm. Eng.,
12(2), 48-51, 1992).
Sin embargo, los problemas descritos más abajo
todavía son posibles incluso en el caso de los métodos que utilizan
levaduras metilotróficas. En el caso de una levadura que tiene una
ruta metabólica del metanol en un sistema de expresión génica
heterogéneo utilizando una levadura representada por las tres
especies de levaduras metilotróficas mencionadas más arriba y un
promotor capaz de inducirse por metanol, el metanol del medio de
cultivo desciende rápidamente cuando la levadura se cultiva en un
medio que contiene metanol. En este tipo de cultivo, el metanol
debe suministrarse como una fuente de carbono con el fin de
mantener, de manera simultánea, la transcripción a partir del
promotor y el crecimiento celular.
Sin embargo, si la concentración de metanol del
medio de cultivo se incrementa bruscamente durante el suministro de
metanol, la levadura puede morir. Además, la determinación de la
concentración de metanol en un cultivo de levaduras que tienen una
ruta metabólica del metanol se lleva a cabo generalmente sometiendo
el sobrenadante a cromatografía de gases. Este método, sin embargo,
además de requerir un equipamiento especial debido a que se
requiere una cantidad considerable de tiempo hasta que puede
determinarse la concentración de metanol, tiene la desventaja de
evitar establecer un juicio rápido respecto a la necesidad de
reponer el metanol.
Como ejemplo de un método para mantener la
concentración de metanol en un medio de cultivo para la expresión
de un gen diana, se utiliza un método que reduce la velocidad del
consumo del metanol utilizando una levadura en la que está ausente
de su ruta metabólica la enzima alcohol oxidasa. Este método
implica crecer las levaduras utilizando glicerol etc, como fuente
de carbono, y después inducir la transcripción a partir de un
promotor mediante la adición de una cantidad fija de metanol al
medio de cultivo para expresar el gen diana. Debido a la baja
velocidad del consumo de metanol, resulta fácil mantener la
concentración de metanol. Aunque resulta posible obtener un cultivo
estable, este método tiene la desventaja de requerir un tiempo de
cultivo largo debido a que el cultivo se lleva a cabo de manera
separada para un periodo de crecimiento celular y para un periodo
de expresión del gen diana.
En el documento WO 95/21928 se describe un método
en el que la concentración de metanol en un medio de cultivo se
controla hasta un nivel constante con el fin de expresar un gen
diana mediante el cultivo de una levadura metilotrófica, en la que
el metabolismo del metanol se ha ralentizado mediante la alteración
parcial de las enzimas de la ruta metabólica sin incrementar el
número de células. Este método implica determinar una concentración
de metanol en el aire dentro del tanque de cultivo en un estado en
el que una concentración de metanol en el aire dentro del tanque de
cultivo refleja la concentración de metanol en el medio de cultivo,
y después determinar la velocidad de la adición del metanol a
partir de esos resultados para controlar la concentración de
metanol en el medio de cultivo.
La concentración de metanol en un medio de
cultivo de levaduras metilotróficas deficientes en el gen de la
alcohol oxidasa puede controlarse hasta un nivel constante mediante
la aplicación de este método. Sin embargo, con el fin de predecir
la concentración de metanol en el medio de cultivo a partir de la
concentración de metanol en el aire dentro del tanque de cultivo,
es necesario que ambas estén en equilibrio. Con el fin de conseguir
este equilibrio, las condiciones del cultivo que incluyen velocidad
de aireación, presión y temperatura deben mantenerse constantes, y
la concentración de metanol en el medio de cultivo no debe cambiar
bruscamente. Debido a estas restricciones, el método mencionado más
arriba para controlar la concentración de metanol sólo puede
aplicarse al cultivo en la fase de inducción de la expresión génica
después de que las células se hayan crecido previamente utilizando
una levadura que no tiene una ruta metabólica del metanol.
Por otra parte, en un sistema de expresión génica
heterogéneo que utiliza un promotor capaz de inducirse con metanol
y un microorganismo que tiene una ruta metabólica del metanol como
anfitrión, no es necesario aislar la fase de crecimiento del
microorganismo y la fase de inducción de la expresión génica si se
controlan de manera adecuada la velocidad de la adición de metanol
y la concentración de metanol en el medio de cultivo. Por
consiguiente, el tiempo de cultivo se acorta lo que resulta en que
se puede obtener la proteína diana en un periodo de tiempo corto.
Por lo tanto, en el cultivo de microorganismos que tienen una ruta
metabólica del metanol, existe una necesidad de establecer un
método para mantener una velocidad adecuada de adición de metanol o
una concentración de metanol que satisfaga tanto la producción del
producto del gen diana como el crecimiento de los
microorganismos.
La presente invención proporciona un método para
ajustar la concentración de metanol en un medio de cultivo de
manera que la inducción de un promotor por metanol y el crecimiento
de un anfitrión pueden llevarse a cabo en paralelo en un sistema de
expresión génica heterogéneo utilizando un promotor inducible por
metanol y microorganismos que tienen una ruta metabólica del
metanol como un anfitrión, y un método para cultivar un anfitrión
utilizando ese método.
Como resultado de un examen cuidadoso de la
relación entre el método de la adición de metanol, la concentración
de metanol en el medio de cultivo y la cantidad de oxígeno disuelto
en el cultivo de levaduras que tienen una ruta metabólica del
metanol, los inventores de la presente invención encontraron que si
el metanol se añade de manera periódica cuando la concentración de
metanol es 0,1% (v/v) o menos a un cultivo en el que la cantidad de
oxígeno disuelto en el medio de cultivo está controlada a un nivel
constante (por ejemplo, 2 ppm), la cantidad de oxígeno disuelto
fluctúa de manera sincrónica con el ciclo de adición del metanol.
Además, también se vio que cuando la velocidad de adición del
metanol se incrementa en el estado en el que se observan estas
fluctuaciones periódicas de la cantidad de oxígeno disuelto, la
velocidad del incremento de la cantidad de oxígeno disuelto
disminuye, y finalmente no se observan las fluctuaciones periódicas
de la cantidad de oxígeno disuelto incrementadas, y que cuando la
velocidad de adición del metanol se incrementa más el metanol se
acumula en el medio de cultivo y las levaduras mueren.
Cuando se observan estas fluctuaciones periódicas
de la cantidad de oxígeno disuelto, la levadura crece y se induce
la transcripción a partir de un promotor inducible con metanol. Es
decir, la velocidad de la adición del metanol al medio de cultivo
en este punto es claramente una velocidad de adición que satisface
tanto la producción del producto del gen diana como el crecimiento
de las levaduras. Más aún, durante el tiempo en el que se observan
fluctuaciones periódicas, se confirmó que una velocidad mayor de la
adición de metanol resulta en un crecimiento celular más rápido y
en una producción mayor del producto del gen diana.
Teniendo en cuenta los resultados experimentales
descritos más arriba, la presente invención proporciona un método,
como se define en las reivindicaciones, para cultivar
microorganismos que tienen una ruta metabólica del metanol en los
que se introduce una unidad de expresión que comprende un gen diana
unido por debajo de un promotor que puede inducirse por metanol; en
el que, durante el periodo de cultivo que incluye el periodo
durante el cual se añade el metanol, la adición de metanol se lleva
a cabo de manera periódica y la velocidad de la adición se ajusta
hasta una velocidad que es igual a o menor que la velocidad máxima
de consumo de metanol de los microorganismos mencionados, y que es
tal que la concentración de oxígeno disuelto en el medio de cultivo
fluctúa de manera sincrónica con el periodo de la adición del
metanol.
La Fig.1 es una ilustración esquemática que
indica la estructura del gen de la proteasa Kex2, las secuencias de
los cebadores utilizados para la síntesis del gen
NKEX2-660, y las regiones génicas en las que se
alinean los cebadores.
La Fig. 2 es una ilustración que indica un
proceso para la construcción de pCU660.
La Fig. 3 es un gráfico que indica las
fluctuaciones de los valores de oxígeno disuelto sincrónicas con la
adición periódica de metanol observadas cuando la concentración de
metanol en el medio de cultivo es 0,1% (v/v) o menos y el cambio
periódico del patrón de las fluctuaciones del oxígeno disuelto
cuando la concentración de glicerol es 0,1% (p/v) o menos. El
gráfico superior muestra las fluctuaciones de los valores de oxígeno
disuelto en el medio de cultivo. Los gráficos inferiores indican la
concentración de glicerol en el medio de cultivo con una línea
negra, y la concentración de metanol con una línea punteada. En el
gráfico se muestran el tiempo en el que las concentraciones de
metanol y glicerol descienden hasta 0,1% (v/v) o menos, y el tiempo
en el que se añade el glicerol.
La Fig. 4 es un gráfico que ilustra la relación
entre la velocidad de la adición del metanol y las fluctuaciones
periódicas de los valores de oxígeno disuelto. La velocidad de la
adición del metanol se define como la cantidad de metanol añadido
por litro de medio de cultivo por hora, como se indica con los
tiempos de adición (mostrados con flechas).
La Fig. 5 es un gráfico que ilustra un ejemplo de
la producción de Kex2-660 en cultivo utilizando una
velocidad de la adición del metanol de 4,5 ml/L.h. los valores
DO600 se indican con cuadrados negros, la actividad de Kex2
(intensidad de la fluorescencia) con círculos negros, y la
concentración de metanol en el medio de cultivo con triángulos
negros.
La Fig. 6 es una fotografía de un patrón de
electroforesis que es el resultado de realizar 10%
SDS-PAGE con 5 \mul del sobrenadante del cultivo
tomados en los tiempos de cultivo indicados utilizando una velocidad
de adición del metanol de 4,5 ml/L.h.
La velocidad máxima del consumo del metanol se
refiere a una velocidad del consumo del metanol por los
microorganismos para un determinado periodo de cultivo y bajo
determinadas condiciones de esos microorganismos, y bajo condiciones
en las que la concentración del metanol no determina la velocidad
del consumo de metanol. Debido a que la concentración del metanol
se mantiene a un nivel constante o se incrementa gradualmente si el
metanol se añade a una velocidad igual a o mayor que la velocidad
máxima del consumo del metanol, la velocidad de la adición del
metanol que sea igual a o mayor que la velocidad del consumo del
metanol de dicho microorganismo se refiere a una velocidad de la
adición del metanol en a que la concentración del metanol en el
medio se mantiene a un nivel próximo de manera sustancial a cero,
en la práctica a un nivel en el que la concentración del metanol se
mantiene a 0,1% (v/v) o menos.
Con el fin de obtener una velocidad de la adición
del metanol como se describe más arriba el método utilizado implica
la adición periódica del metanol. Esta adición periódica del metanol
se refiere a la adición de una cantidad de metanol determinada en
un intervalo de tiempo determinado durante un periodo de tiempo
determinado durante el cultivo. Este ciclo, es decir el intervalo
de tiempo, es 1 a 20 minutos y, preferiblemente, 5 a 10 minutos.
Como se describirá más adelante, de acuerdo con los descubrimientos
nuevos de los inventores de la presente invención, cuando la
velocidad de la adición del metanol, es decir la cantidad de metanol
añadida en una determinada unidad de tiempo (expresada en la
presente invención como el número de mililitros de metanol por hora
por litro de medio de cultivo), es baja, el nivel de la
concentración de oxígeno disuelto en el medio de cultivo fluctúa de
manera sincrónica con el ciclo de la adición del metanol; y la
concentración de metanol en el medio de cultivo es entonces, por
ejemplo, 0,1% (v/v) y es sustancialmente cercana a 0%.
Por el contrario, en el caso en el que la
velocidad de la adición del metanol es igual a o mayor que la
velocidad máxima del consumo del metanol de los microorganismos, no
se producen las fluctuaciones del nivel de la concentración de
oxígeno disuelto sincrónicas con el ciclo de la adición del metanol.
En este caso, se observa que el metanol a un nivel de concentración
determinado se acumula en el medio de cultivo. Por lo tanto,
mediante el ajuste de la velocidad de la adición del metanol de
manera que el nivel de concentración del oxígeno disuelto en el
medio de cultivo fluctúe de manera sincrónica con el ciclo de la
adición del metanol, la velocidad de la adición del metanol puede
ajustarse hasta una velocidad igual a o menor que la velocidad
máxima del consumo del metanol por los microorganis-
mos.
mos.
Además, en las fluctuaciones periódicas del nivel
de la concentración de oxígeno disuelto mencionadas más arriba, la
elevación del nivel de concentración del oxígeno disuelto es un
resultado de la desaparición producida por el consumo del metanol
añadido. Si el descenso del nivel de la concentración del oxígeno
disuelto se toma como el resultado del consumo del oxígeno disuelto
por el consumo del metanol fresco añadido, la velocidad de la
adición del metanol puede ajustarse a una velocidad igual a o menor
que la velocidad máxima del consumo del metanol por los
microorganismos mediante la repetición del ciclo que consiste en
detectar el incremento del nivel de la concentración del oxígeno
disuelto, la adición de una cantidad constante de metanol y la
adición del metanol del ciclo siguiente después de que el nivel de
la concentración del oxígeno disuelto ha disminuido por el consumo
del metanol añadido y se vuelve a incrementar por la desaparición
del metanol.
El término "promotor inducible" tal y como
se utiliza en la presente memoria se entiende fácilmente y se
refiere a un promotor de un gen que codifica una enzima que está
implicada en el metabolismo del metanol en un microorganismo como
levaduras, los ejemplos de los cuales incluyen un promotor del gen
de la alcohol oxidasa (Publicación de Patente Japonesa sin Examinar
No. 5-344895; Ellis, S.B. et al., Mol. Cell.
Biol. 5, 1111-1112, 1985), un promotor del gen de
la fórmico deshidrogenasa (Hollenberg, C.P. et al., EPA No.
0299108, 1988), y un promotor del gen de la metanol oxidasa
(Ledeboer, A.M. et al., Nucleic Acids Res. 13,
3063-3082, 1985).
El término "unidad de expresión" se refiere
a un vector de expresión como un plásmido de expresión.
El término "gen diana" se refiere a un gen
que codifica, por ejemplo, una proteína útil. En la presente
memoria, proteína útil se refiere, por ejemplo, a una enzima o a
otra proteína activa desde un punto de vista fisiológico. Varios
ejemplos de enzimas incluyen proteasa Kex 2, prohormona convertasa
1/3 (PC1/3), prohormona convertasa 2 (PC2), furina, péptido C
\alpha-amidasa terminal, proteasa estafilococal
V8, proteasa I de achromobacter (API), leucina aminopeptidasa
placentaria, acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas
citoplásmico y sus derivados.
Además, los ejemplos de otras sustancias activas
desde un punto de vista fisiológico incluyen hormonas de
crecimiento, hormona liberadora de la hormona de crecimiento,
hormona liberadora de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH),
glucagón, péptido I semejante al glucagón, péptido II semejante al
glucagón, Interferón \alpha, Interferón \beta, Interferón
\gamma, eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (TPO),
G-CSF, HGF, activador del plasminógeno tisular
(tPA), factor de células madre, familia TGF y sus derivados.
No resulta necesario añadir el metanol de manera
periódica durante el periodo completo del cultivo en la presente
invención. De acuerdo con una realización preferida de la presente
invención, un medio contiene 1 a 2% (v/v) de metanol al comienzo
del cultivo después de lo cual el cultivo se realiza durante al
menos 12 horas, por ejemplo, 15 a 20 horas, sin añadir metanol.
Después se comienza la adición periódica del metanol cuando la
concentración de metanol desciende hasta aproximadamente 0,5% (v/v)
o menos, y, por ejemplo, 0,2 a 0,5% (v/v). En este punto, debido a
que los microorganismos han crecido de manera bastante extensa y de
que existe un consumo activo del metanol, la concentración del
metanol en el medio continuará descendiendo, finalmente hasta 0% a
0,1% si la velocidad de la adición del metanol es adecuada.
La adición de metanol se continúa bajo estas
condiciones. Durante el tiempo de la adición del metanol de esta
manera, el promotor se induce por el metanol produciendo la
expresión del gen diana. En paralelo a esto, el metanol añadido se
utiliza al menos como parte de los materiales de crecimiento que
resultan en el crecimiento de los microorganismos. Es decir,
mediante las técnicas descritas en la presente memoria se lleva a
cabo la expresión de un gen debido a la inducción de un promotor
por metanol y, particularmente, la producción de una proteína diana
útil, junto al crecimiento de los microorganismos, de manera
simultánea y en paralelo durante al menos un determinado periodo de
tiempo durante el periodo del cultivo.
Los microorganismos utilizados en el método de la
presente invención son preferiblemente levaduras metilotróficas y,
preferiblemente, microorganismos que pertenecen a los géneros
Pichia, Hansenula o Candida. Los ejemplos de
levaduras que pertenecen a estos géneros incluyen Pichia
pastoris, Hansenula polymorpha y Candida boidinii.
Posteriormente, lo siguiente proporciona una
explicación más detallada de cómo pueden utilizarse estos métodos
para producir de manera eficaz un producto de un gen diana en un
sistema de expresión génica utilizando un promotor inducible por
metanol y microorganismos que tienen una ruta metabólica de metanol,
como el anfitrión. En la presente invención, aunque Candida
boidinii se ha indicado como un ejemplo específico de un
microorganismo que tiene una ruta metabólica del metanol, se ha
indicado un promotor del gen de la alcohol oxidasa de Candida
boidinii como un ejemplo específico de un promotor, y se ha
indicado un derivado de Kex2 que se secreta como un ejemplo
específico de un producto de un gen diana, éstos no están limitados
a los ejemplos específicos indicados.
Se llevó a cabo un estudio de las condiciones de
cultivo utilizando la cepa TK62 (pCU660) #10 de Candida
boidinii. La cepa TK62 (pCU660) #10 es una cepa que produce gran
cantidad de un derivado de Kex2 que se secreta que se seleccionó en
base a la producción y secreción del derivado de Kex2 en un cultivo
a escala de tubo de ensayo a partir de 20 clones de la cepa TK62
que contiene el vector de expresión pCU660 del derivado Kex2 que se
secreta. Lo siguiente proporciona una explicación de la producción
del vector de expresión del derivado Kex2 y de la cepa TK62 del
anfitrión.
El plásmido pCU660 es un plásmido que es capaz de
expresar el derivado Kex2 que se secreta mediante el promotor AOD,
y se preparó mediante la inserción de un fragmento de ADN que
contiene el gen del derivado Kex2 que se secreta en el sitio Not I
de pNOTelI (Publicación de Patente Japonesa sin Examinar No.
5-344895). El polipéptido desde el extremo
N-terminal hasta el resto de aminoácido 660 que no
presenta el dominio de membrana presente en el extremo
C-terminal de la proteasa Kex2 (814 restos de
aminoácidos) de Saccharomyces cerevisiae (referido como
Kex2-660) se utilizó para el derivado Kex2 que se
secreta.
El fragmento de ADN que contiene el gen
NKEX2-660 (-132 a 1.980 nucleótidos; tomando A del
codón inicial de la metionina del gen KEX2 (gen estructural de la
proteasa Kex2) como 1; Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 156, pp. 246-254, 1988) se preparó mediante
amplificación con PCR utilizando NKEX2 y KM088 como cebadores y el
ADN que codifica el gen KEX2 como molde.
\newpage
El cebador NKEX2 es un oligómero de ADN que
contiene una secuencia de ADN que corresponde a los 107 a 132
nucleótidos por encima del codón inicial de la metionina del gen
KEX2, y la secuencia que resulta de la adición de un sitio de
reconocimiento de la enzima de restricción NotI a su región
flanqueante 5'. KM088 es un oligómero de ADN que tiene una
secuencia complementaria a una secuencia de nucleótidos que resulta
de la adición de un codón de parada de la traslación TAA al ADN que
se corresponde con los aminoácidos 654 a 660 de la proteasa Kex2.
Además, pCU660 es un vector de expresión que se inserta en los
cromosomas que tiene un gen URA3 como un marcador de selección (el
único sitio de la enzima de restricción BamHI está localizado en
este gen). Si se utiliza como anfitriona una cepa que requiere
uracilo obtenida mediante mutación URA, los transformantes pueden
seleccionarse de acuerdo con la complementariedad del requerimiento
de uracilo.
La cepa TK62 es una cepa que requiere uracilo
derivada a partir de la cepa de Candida boidinii S2
AOU-1, obtenida mediante mutación URA3 y tiene un
grupo de enzimas de una ruta metabólica del metanol, que incluye
alcohol oxidasa, y que por lo tanto le permite crecer utilizando
metanol como su fuente de carbono. Además, la cantidad de alcohol
oxidasa expresada por la cepa TK62 es alta, aproximadamente un 40%
de las proteínas intracelulares, en cultivo utilizando metanol como
fuente de carbono, y se ha descrito previamente un sistema de
expresión génica heterogéneo que utiliza este promotor (Publicación
de Patente Japonesa sin Examinar No. 5-344895).
Posteriormente, se llevó a cabo un estudio de las
condiciones del cultivo utilizando la cepa TK62 (pCU660) #10
mencionada más arriba. La concentración de metanol en el medio de
cultivo es un parámetro extremadamente importante para el
crecimiento de los microorganismos que tienen una ruta metabólica de
metanol y para la inducción eficaz de la transcripción a partir de
un promotor inducible por metanol. Por lo tanto, se cultivó la cepa
TK62 (pCU660) #10 utilizando un fermentador para estudiar las
condiciones que afectan el crecimiento del anfitrión tales como las
condiciones bajo las cuales se añade el metanol al medio de
cultivo.
En primer lugar, el cultivo se llevó a cabo
utilizando metanol y glicerol como fuentes de carbono. Al comienzo
del cultivo, la densidad celular se fijó en una turbidez del medio
de cultivo de DO600 = 0,2, mientras que las fuentes de carbono
iniciales se fijaron en una concentración de metanol de 1,5% (v/v)
considerando la toxicidad celular, y en una concentración de 3%
(p/v) de glicerol considerando la presión osmótica. La concentración
del metanol del medio de cultivo se determinó cada 3 horas, y los
tiempos y las cantidades de la adición del metanol al medio de
cultivo se determinaron en referencia a la concentración que existía
2 a 3 horas antes. El metanol y el glicerol se añadieron de manera
periódica mediante la operación de una bomba peristáltica que tiene
una administración de volumen constante por unidad de tiempo para
una cantidad de tiempo fija una vez cada 7,5 minutos.
La velocidad de la adición se representó mediante
la cantidad de metanol (ml/L.h) o de glicerol (g/L.h) añadida por 1
litro de medio de cultivo por hora. Debido a que la concentración
del metanol del medio de cultivo 15 horas después de comenzar del
cultivo descendió hasta 0,42% (v/v), se comenzó la adición de
metanol a una velocidad de 0,75 ml/L.h 18 horas después del
comienzo del cultivo. Aún más, la concentración de metanol del
medio de cultivo descendió hasta 0,26% (v/v) 18 horas después del
comienzo del cultivo inmediatamente antes del comienzo de la
adición.
Debido a que la concentración de metanol en el
medio de cultivo 21 horas después de comenzar el cultivo disminuyó
hasta 0,1% (v/v) o menos, la velocidad de la adición del metanol se
incrementó hasta 7,5 ml/L.h comenzando 23 horas después del
comienzo del cultivo. Inmediatamente después de esta adición, la
velocidad de la agitación descendió rápidamente y se observó una
disminución brusca de la velocidad del consumo de oxígeno de las
levaduras, es decir, una disminución de la actividad celular.
Después de estas disminuciones, se esperaba que la densidad celular
disminuyera y que las levaduras se lisaran. La concentración de
metanol del medio de cultivo 1 hora después del incremento de la
velocidad de la adición del metanol (24 horas después del comienzo
del cultivo) fue 0,76% (v/v), y se vio que el metanol se estaba
acumulando.
En base a los resultados que aparecen más arriba,
se encontró que 1) un buen tiempo para comenzar la adición del
metanol al medio de cultivo es en la hora 18 después de comenzar el
cultivo (DO600 = aprox. 50), 2) debido a que la concentración del
metanol en el medio de cultivo disminuye hasta 0,1% (v/v) o menos en
3 horas a una velocidad de la adición del metanol de 0,75 ml/L.h,
existe una posibilidad de una escasez de metanol como fuente de
carbono, 3) existe una posibilidad de que se produzca toxicidad
celular debida a la acumulación del metanol en el medio de cultivo
debido a que la velocidad de la adición de 7,5 ml/L.h sea
excesivamente alta. Además, en el cultivo de la cepa de levadura
TK62 (pCU660) #10 que tiene una ruta metabólica del metanol se vio
que después de un estado continuo en el que la concentración de
metanol del medio de cultivo es 0,1% (v/v) o menos, la adición
rápida de metanol produce la muerte de la cepa TK62 (pCU660)
#10.
Más aún, las fluctuaciones de los valores del
oxígeno disuelto sincrónicas con el ciclo de la adición del metanol
(que consisten en la repetición de un incremento brusco,
mantenimiento de valores altos y una disminución brusca) se
observaron desde la hora 20 a la 23 después del comienzo del
cultivo. Debido a que este periodo coincidía con el tiempo a partir
del cual la concentración de metanol del medio de cultivo disminuía
hasta 0,1% (v/v) o menos hasta el momento en el que el metanol
empezaba a acumularse debido a la rápida adición de metanol al
medio de cultivo (es decir, el momento durante el que la
concentración del metanol en el medio de cultivo era 0,1% (v/v) o
menos), se sugirió que existe una relación entre las fluctuaciones
periódicas de los valores de oxígeno disuelto y la concentración
del metanol en el medio de cultivo.
La cantidad de oxígeno disuelto es un parámetro
que se determina normalmente para controlar el cultivo, y se
determina utilizando un electrodo de oxígeno disuelto. Si fuera
posible predecir la cantidad de metanol requerida en base a los
cambios de la cantidad de oxígeno disuelto del cultivo de
microorganismos que tienen una ruta metabólica del metanol, sería
posible ajustar fácilmente unas condiciones de cultivo estables y
eficaces. Por lo tanto, con el fin de investigar en detalle la
relación entre las fluctuaciones de los valores de oxígeno disuelto
sincrónicas con el ciclo de la adición del metanol y la
concentración del metanol en el medio de cultivo, se llevó a cabo
un cultivo ajustando la velocidad de la adición del metanol a 2,25
ml/L.h, un valor intermedio entre la velocidad de 0,75 ml/L.h en la
que la concentración de metanol del medio de cultivo disminuía
rápidamente, y la velocidad de 7,5 ml/L.h en la que el metanol se
acumulaba en el medio de cultivo en el cultivo mencionado más
arriba.
El metanol se añadió con glicerol (0,15 ml/L.h)
comenzando en la hora 18 después del comienzo del cultivo. Se
observaron fluctuaciones de los valores de oxígeno disuelto
sincrónicas con el ciclo de la adición de las fuentes de carbono
desde la hora 23 después del comienzo del cultivo hasta la
finalización del cultivo (49 horas después del comienzo del
cultivo).
La concentración de metanol del medio de cultivo
durante este tiempo fue 0,1% (v/v) o menos. Es decir, durante el
tiempo en el que se observan fluctuaciones de los valores de oxígeno
disuelto que son sincrónicas con el ciclo de la adición del
metanol, el metanol no se acumuló en el medio de cultivo, y se
confirmó que la concentración era 0,1% (v/v) o menos. Además,
también resultó claro que durante el tiempo en el que la
concentración de metanol fue 0,1% (v/v) o menos
(23-49 horas después del comienzo del cultivo), el
número de células se incrementó más de dos veces. En otras
palabras, las células fueron capaces de crecer a pesar de que la
concentración de metanol del medio de cultivo fue 0,1% (v/v) o
menos.
Más aún, cuando la concentración de metanol del
medio de cultivo fue 0,1% (v/v) o menos y la concentración de
glicerol fue también 0,1% (p/v) o menos, la magnitud del cambio de
las fluctuaciones periódicas de los valores de oxígeno disuelto
sincrónicas con el ciclo de la adición de la disolución de la fuente
de carbono se incrementó. Cuando el glicerol se añadió de manera
que la concentración final en el medio de cultivo en este tiempo
fue 1,25% (p/v), aunque la magnitud incrementada del cambio volviera
a ser normal, las fluctuaciones periódicas de los valores de
oxígeno disuelto sincrónicas con el ciclo de la adición de la
disolución de la fuente de carbono continuaron.
Es decir, resultó claro que las fluctuaciones
periódicas de los valores de oxígeno disuelto indican que la
concentración de metanol del medio de cultivo es 0,1% (v/v) o menos
y que un incremento de la magnitud del cambio indica un estado en
el que la concentración de metanol en el medio de cultivo es 0,1%
(v/v) o menos y que la concentración de glicerol es 0,1% (p/v) o
menos. Mediante la utilización de estos indicadores, puede
determinarse el estado en el que la concentración de metanol es 0,1%
(v/v) o menos y la concentración de glicerol es 0,1% (p/v) o menos,
permitiendo, por lo tanto, determinar una cantidad adecuada de la
adición para reponer estas fuentes de carbono.
Los inventores de la presente invención han
clarificado el hecho de que en el cultivo de levaduras
metilotróficas que tienen una ruta metabólica del metanol, la
velocidad de la adición de metanol que permite a las levaduras
crecer sin morirse puede determinarse mediante la adición periódica
de metanol y las fluctuaciones de los valores de oxígeno disuelto
en sincronización con esta adición. Más aún, también se mostró
claramente que durante el tiempo en el que las fluctuaciones
periódicas de los valores de oxígeno disuelto se observaban de
manera sincrónica con la adición periódica de metanol, el cultivo
está en un estado en el que la concentración de metanol es 0,1%
(v/v) o menos y no existe acumulación de metanol en el medio de
cultivo, es decir, el estado en el que la cantidad de metanol
añadido es igual a la cantidad de metanol consumido por las
levaduras. Por lo tanto, se realizó un intento para determinar la
velocidad del consumo de metanol en un estado de densidad celular
alta utilizando como indicador las fluctuaciones periódicas de los
valores de oxígeno disuelto sincrónicas con la adición del
metanol.
De manera similar, durante el cultivo de la cepa
TK62 (pCU660) #10 hasta una densidad celular de 65 g DCW/L (DO600 =
270), se añadió el metanol a unas velocidades de adición de 1,5,
2,2, 4,7 y 6,4 ml/L.h (equivalentes a adiciones de 0,023 a 0,098 ml
por hora por 1 g de peso seco de levaduras (ml/g DCW.h)), y se
examinaron los patrones de las fluctuaciones periódicas de los
valores de oxígeno disuelto y las concentraciones de metanol en el
medio de cultivo a esos tiempos. Como resultado, se vio que los
valores de oxígeno disuelto fluctuaban de manera sincrónica con la
adición de metanol cuando la velocidad de la adición del metanol era
1,5 a 4,7 ml/L.h, y que las concentraciones del metanol en el medio
de cultivo a esos tiempos fueron todas 0,1% (v/v) o menos.
Más aún, el patrón de las fluctuaciones cambió
con incrementos de la velocidad de la adición del metanol, y se vio
que el incremento de los valores de oxígeno disuelto por unidad de
tiempo después de la adición del metanol se hicieron más graduales.
Cuando la velocidad de la adición del metanol fue 6,4 ml/L.h, no se
observaron más las fluctuaciones periódicas de los valores de
oxígeno disuelto sincrónicas con el ciclo de la adición del
metanol. Aunque la concentración de metanol del medio de cultivo en
ese tiempo era 0,1% (v/v) o menos, cuando se incrementó más la
velocidad de la adición del metanol, se vio que el metanol del medio
de cultivo se acumulaba.
Como se ha descrito más arriba, los inventores de
la presente han confirmado que, en un cultivo en el que se cambia
la velocidad de la adición del metanol, al menos cuando los valores
de oxígeno disuelto fluctúan de manera sincrónica con la adición
periódica de metanol, el metanol añadido al medio de cultivo se
consume inmediatamente y no se acumula en el medio de cultivo. En
otras palabras, se alcanza un estado en el que la cantidad de
metanol añadida es igual a la cantidad de metanol consumida por las
levaduras. Más aún, también se ha mostrado claramente que el patrón
de las fluctuaciones periódicas de los valores de oxígeno disuelto
cambia de acuerdo con la cantidad de metanol añadido o, en otras
palabras, de acuerdo con el momento en el que el metanol se consume
completamente, y la cantidad máxima de metanol consumida por las
levaduras en cada tiempo (cantidad de metanol añadida
inmediatamente antes de la acumulación) puede determinarse sin tomar
muestras.
La velocidad máxima del metanol consumido en el
estado en el que la densidad celular es 65 g DCW/L (DO600 = 270) se
determinó que era 0,098 ml/g DCW.h en base a estos
descubrimientos.
La velocidad máxima del metanol consumido cuando
la densidad celular de la cepa TK62 (pCU660) #10 es DO600 = 270 (65
g de peso seco celular/L de medio de cultivo) es 0,098 ml/g DCW.h, y
en el caso en el que la velocidad de la adición del metanol es
igual a o menor que este valor, el metanol no se acumula en el medio
de cultivo. Sin embargo, aunque puede predecirse fácilmente que la
velocidad adecuada de la adición del metanol para el crecimiento de
la cepa TK62 (pCU660) #10 y para la producción secretada de
Kex2-660 es igual a o menor que la velocidad máxima
del consumo del metanol, no se conoce cual es la velocidad de
adición más adecuada.
Con el fin de investigar la velocidad adecuada de
la adición del metanol para el crecimiento de la cepa TK62 (pCU660)
#10 y para la producción de Kex2-660 secretada, se
llevó a cabo el cultivo utilizando una velocidad de la adición del
metanol de 2,25 ml/L.h ó 4,5 ml/L.h, y se examinaron la velocidad de
crecimiento celular y la producción de Kex2-660
secretada a esos tiempos. Como resultado, se mostró claramente que
el número de células se incrementa y que Kex2-660
se expresa y se secreta en el medio de cultivo durante el tiempo en
el que la concentración de metanol del medio de cultivo en la que
las fluctuaciones de los valores de oxígeno disuelto se observaban
de manera sincrónica con el ciclo de la adición del metanol es 0,1%
(v/v) o menos.
Es decir, se vio que la velocidad de la adición
del metanol a la que la concentración de metanol en el medio de
cultivo es 0,1% (v/v) o menos y a la que los valores de oxígeno
disuelto fluctúan de manera sincrónica con la adición periódica de
metanol es la velocidad adecuada para el crecimiento celular y para
la expresión del producto diana. Más aún, como resultado de
comparar cultivos utilizando velocidades de la adición del metanol
de 2,25 ml/L.h y 4,5 ml/L.h, el número de células a las 48 horas
después del comienzo de los cultivos se incrementó 1.400 veces y
1.800 veces, respectivamente, respecto al cultivo inicial, mientras
que la cantidad de Kex2-660 producida y secretada
fue 1.260 MU y 2.850 MU, respectivamente, por litro de sobrenadante
del cultivo (equivalente a aproximadamente 150 mg y 340 mg,
respectivamente) (Tabla 1). Se mostró claramente que mientras se
mantengan las condiciones de la adición del metanol de manera que
las fluctuaciones periódicas de los valores de oxígeno disuelto
continúen, el crecimiento celular se incrementa y la producción de
Kex2-660 se incrementa con cantidades crecientes de
metanol
añadido.
añadido.
Más aún, en el cultivo de la cepa TK62 (pCU660)
#10 durante el cual el metanol se añadió a las velocidades de 2,25
ml/L.h y 4,5 ml/L.h comenzando en la hora 18 después del comienzo
del cultivo, resultó claro que la velocidad del consumo del metanol
cuando el peso seco de las levaduras es 0,5 g/L (DO600 = 2) o mayor
es 0,03 a 0,016 ml/g DCW.h (Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
| Velocidad de la adición | Actividad Kex2 (kU/ml de | |
| (ml/L.h) | DO_{600} | sobrenadante) |
| 2,25 | 284 | 1.260 |
| 4,5 | 353 | 2.850 |
| * La velocidad de la adición del glicerol es 5 g/L.h. | ||
| DO600 actividad Kex2 se determinaron en la hora 48 después del comienzo del cultivo. |
| DCW (g/L) | Velocidad del consumo del MeOH | |||
| (ml/g DCW.h) | ||||
| Velocidad de la adición | ||||
| del MeOH (ml/L.h) | 2,25 | 4,5 | 2,25 | 4,5 |
| Tiempo de cultivo (h) | ||||
| 6 | 0,2 | 0,5 | 4,24 | 1,77 |
| 12 | 2,4 | 3,3 | 0,10 | 0,05 |
| 18 | 12 | 13 | 0,11 | 0,09 |
| 24 | 28 | 31 | 0,09 | 0,16 |
| 30 | 43 | 48 | 0,05 | 0,09 |
| 36 | 44 | 59 | 0,05 | 0,08 |
| 42 | 60 | 71 | 0,04 | 0,06 |
| 48 | 68 | 85 | 0,03 | 0,05 |
| DCW: peso seco celular de las levaduras por litro de medio de cultivo. | ||||
| \begin{minipage}[t]{155mm}Velocidad del consumo del MeOH: Valor medio de 0 a 6 horas en el caso de un tiempo de cultivo de 6 horas, y aplicado de manera similar a otros tiempos de cultivo.\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Además, el tiempo de cultivo de 48 horas para
producir la Kex2 mencionada más arriba es poco representando de 1/3
a un 1/2 las 100 a 160 horas requeridas para obtener el producto del
gen diana que se dividen en la fase de crecimiento de las levaduras
metilotróficas (aprox. 40 horas) y la fase de producción (60 a 120
horas) indicado claramente en el documento WO 95/21928, indicando
claramente por lo tanto la utilidad de la presente invención en el
caso de producción de una sustancia a un nivel industrial.
Además, no se muestran los Ejemplos en los que
las fluctuaciones periódicas de los valores de oxígeno disuelto
producidas por la adición periódica de metanol se evalúan mediante
un ordenador para controlar el cultivo de manera automática. Sin
embargo, en el cultivo utilizando un fermentador, la cantidad de
oxígeno disuelto, pH y temperatura son parámetros básicos para
controlar el cultivo, y sus valores se determinan en el tiempo
utilizando un sensor de DO, sensor de pH y sensor de temperatura,
respectivamente, para evaluar estos valores mediante ordenador y
para controlar el cultivo de manera automática.
Cuando se controlan estos parámetros, el cultivo
no se controla únicamente con los valores de cada parámetro sino
también con la magnitud del cambio de cada parámetro por unidad de
tiempo. Es decir, una persona especializada en el campo puede
controlar automáticamente la cantidad de metanol añadida mediante la
determinación de la cantidad adecuada de metanol que debe añadirse
en base a las observaciones referidas a las fluctuaciones periódicas
de los valores de oxígeno disuelto sincrónicas con la adición
periódica del metanol y a la observación de que el patrón de
fluctuación cambia de acuerdo con la velocidad de la adición del
metanol como han clarificado los inventores de la presente
invención.
Aunque lo que sigue proporciona una explicación
detallada de la presente invención utilizando Candida
boidinii como un ejemplo de un microorganismo que tiene una ruta
metabólica del metanol, la presente invención no se limita a este
ejemplo. Además, aunque en la explicación detallada se utiliza el
promotor de la alcohol oxidasa como un ejemplo de un promotor cuya
expresión está inducida por metanol, y Kex2-660 se
utiliza como un ejemplo de un producto génico que se va a producir,
la presente invención no está limitada a estos ejemplos.
\newpage
Se prepararon de la manera que se describe más
abajo un gen (gen NKEX2-660) que codifica el
derivado de Kex2 Kex2-660 que se secreta (proteína
que consiste en los aminoácidos desde el extremo
N-terminal hasta el aminoácido 660 de la
endoproteasa Kex2), y el vector de expresión de
NKEX2-660, pCU660.
Se preparó mediante PCR un fragmento de ADN que
contiene el gen NKEX2-660 utilizando el plásmido
pYE-KEX2 (5,0)b, digerido con la enzima de
restricción Eco RI y construido en una cadena lineal (Mizuno et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 156,
246-254, 1988), como molde y utilizando NKEX2 (SEQ
ID NO.: 1) y KM088 (SEQ ID NO.: 2) como cebadores.
NKEX2 y KM088 corresponden a las regiones del gen
KEX2 mostradas en la Fig. 1(a), NKEX2 contiene una secuencia
que corresponde a los nucleótidos 107 a 132 por encima del codón de
comienzo de la metionina del gen NKEX2, y KM088 tiene una secuencia
de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos que
resulta de la adición de un codón de parada de la traslación TAA al
ADN que corresponde a los aminoácidos desde el aminoácido 654 hasta
el aminoácido 660 de la proteasa Kex2 (Mizuno, et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, p. 246-254,
1988). Además, NKEX2 tiene la secuencia de nucleótidos del sitio de
la restrictasa Not I en su extremo 5' terminal (subrayada),
mientras que KM088 tiene la secuencia de nucleótidos del sitio de la
enzima de restricción Sal I (subrayada) (véase la Fig.
1(b)). Estos cebadores se sintetizaron con un sintetizador
automático (modelo 380A Applied Biosystems) de acuerdo con el
método de la fosfamidida.
El vector de expresión pCU660 se preparó mediante
la inserción de un fragmento de ADN Not I que contiene el gen
NKEX2-660 en el sitio de la enzima de restricción
Not I del plásmido de expresión pNOTelI (Publicación de Patente
Japonesa sin Examinar No. 5-344895) utilizando
Candida boidinii como anfitrión de manera que el gen
KEX2-660 pueda expresarse bajo el control del
promotor del gen de la alcohol oxidasa (AOD) (Fig. 2).
Para el vector, pNOTelI se digirió con la enzima
de restricción Not I y el fragmento de ADN de aproximadamente 7,4
kb se purificó. El fragmento de ADN Not I que contiene el gen
NKEX2-660 se preparó mediante la clonación de un
fragmento de ADN que contiene el gen NKEX2-660 de 1)
en pCRII (Invitrogen), y después mediante digestión utilizando los
sitios de la enzima de restricción Not I presentes en NKEX2 y en
pCRII. Además, pNOTelI es un vector que permite que el gen diana se
exprese mediante el promotor AOD, y tiene un gen URA3 como marcador
de selección en el caso de utilizar levaduras como anfitriones, y
resistencia a ampicilina en el caso de utilizar E. coli como
anfitrión. Por consiguiente, si se utiliza como anfitrión una
levadura que requiere uracilo, las cepas transformantes pueden
seleccionarse en una placa que no contiene uracilo.
El plásmido pCU660 digerido con la enzima de
restricción Bam HI y construido como una cadena lineal se introdujo
en la cepa TK62 que requiere uracilo, y se seleccionó la cepa
recombinante TK62 (pCU660) utilizando la complementariedad del
requerimiento de uracilo. La cepa TK62 es una cepa que requiere
uracilo producida mediante mutación URA3 que se deriva a partir de
la cepa de Candida boidinii S2 AOU-1, y el
método de transformación de la cepa TK62 ha sido publicado por
Sakai, et al. (Sakai, Y. et al., J. Bacteriol., 173,
7458-7463, 1991). La cepa S2 AOU-1
ha sido denominada Candida boidinii SAM1958 y se depositó en
el Institute of Bioengineering and Human Technology Agency of
Industrial Science and Technology el 25 de Febrero, 1992 como FERM
BP-3766).
pCU660 es un vector de expresión que se inserta
en los cromosomas, y en el caso del transformante resultante TK62
(pCU660) la cantidad de derivado de Kex2 expresada y la cantidad
secretada puede ser diferente de acuerdo con el sitio de inserción
cromosómico del gen, del número de copias. Se cultivaron veinte
clones transformantes (de #1 a #20) a escala de tubo de ensayo y se
investigó la cantidad de derivado de Kex2 secretado en el medio de
cultivo (actividad de la proteasa Kex2) para seleccionar los clones
que secretan grandes cantidades del derivado de Kex2.
En primer lugar, se cultivaron con agitación 20
cepas de TK62 (pCU660) de la #1 a la #20 a 27ºC en medio BMGY (1%
(p/v) extracto de levadura, 2% (p/v) peptona, 1% (p/v) glicerol,
1,34% (p/v) YNB sin AA: Base Nitrogenada de Levaduras sin
Aminoácidos, 0,4 mg/L biotina y 100 mM fosfato potásico (pH 6,0)).
Dos días después, el medio de cultivo se inoculó en 1 ml de medio
BMMY (1% (p/v) extracto de levadura, 2% (p/v) peptona, 0,5% (p/v)
metanol, 1,34% (p/v) YNB sin AA, 0,4 mg/L biotina y 100 mM fosfato
potásico (pH 6,0)) de manera que la DO600 fue 10, seguido de
cultivo con agitación a 27ºC. Treinta horas después, se determinó la
actividad Kex2 del sobrenadante y se seleccionaron cinco cepas que
tenían la actividad mayor. Estas cinco cepas se cultivaron de manera
similar después de lo cual TK62 (pCU660) cepa #10 se seleccionó y
se utilizó en el experimento siguiente debido a sus niveles
consistentemente altos de actividad Kex2.
La determinación de la actividad Kex2 se llevó a
cabo de acuerdo con el método de Mizuno, et al. (Mizuno et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 156, 246-254,
1988). Es decir, se añadieron 100 \mul de Kex2-600
diluído con 100 mM Tris-HCl (pH 7,0) a 100 \mul
de una disolución 200 mM Tris-HCl (pH 7,0) que
contiene 2 mM CaCl_{2}, 0,2% (p/v) luburol y 100 \muM
Boc-Leu-Arg-Arg-MCA
(Peptide Research) y se mantuvo durante 30 minutos a 37ºC. Después
de añadir 50 \mul de 25 mM EGTA, se determinó la intensidad de la
fluorescencia del AMC degradado utilizando el sistema PANDEX FCA
(Baxter-Travenol: Modelo
10-015-1, excitación = 365 nm,
emisión = 450 nm). La cantidad de actividad Kex2 que libera 1 pmol
de AMC en 1 minuto bajo las condiciones mencionadas más arriba se
definió como 1 U de actividad.
El precultivo se llevó a cabo mediante el inóculo
de 1 ml de la cepa TK62 (pCU660) #10 a partir de una muestra
congelada en glicerol en un matraz Erlenmeyer de 300 ml que contiene
25 ml de medio YPD (1% (p/v) extracto de levadura, 2% (p/v)
peptona, 2% (p/v) glucosa) y cultivando con agitación durante 16
horas a 27ºC.
El cultivo principal se llevó a cabo mediante el
inóculo de los precultivos mencionados más arriba en 2 litros de
medio de cultivo (1,5% (v/v) metanol, 3% (p/v) glicerol, 1% (p/v)
extracto de levadura, 2% (p/v) peptona, 50 mM fosfato potásico (pH
6,0) y 1,34% (p/v) YNB sin AA) de manera que la densidad celular en
el comienzo del cultivo fue DO600 = 0,2, y se agitó mientras se
aireaba a 27ºC utilizando un fermentador de 5 litros (Mitsuwa
Scientific Instruments, Modelo
KMJ-5B-4U-FP). La
velocidad de aireación se fijó en 4 L/min, y la velocidad de la
aireación se controló de manera que la cantidad de oxígeno disuelto
no bajara por debajo de 2,5 ppm. El nitrógeno del cultivo se repuso
de manera adecuada con 80 ml de una disolución de reposición de la
fuente de nitrógeno (5% (p/v) extracto de levadura, 10% (p/v)
peptona, 6,7% (p/v) YNB sin AA), y el pH se controló para que no
bajara por debajo de 5,5, mediante la adición de 7,5% agua
amónica.
Se añadieron 0,5 ml/L de agente antiespumante
(Disfoam CC-222, Nippon Yushi) al comienzo del
cultivo, y se añadió después de este momento cuando resultó
necesario. La reposición de la fuente de carbono se llevó a cabo
utilizando una disolución 15 a 45% (v/v) de metanol y una disolución
10 a 50% (p/v) de glicerol (las concentraciones se cambiaron de
acuerdo con el cultivo). El metanol y el glicerol se añadieron de
manera periódica mediante la operación de una bomba peristáltica
que tiene un volumen de administración constante por unidad de
tiempo durante una cantidad de tiempo fija una vez cada 7,5 minutos.
La velocidad de la adición de representó con la cantidad de metanol
(ml/L.h) o la cantidad de glicerol (g/L.h) añadida por litro de
medio de cultivo por hora.
La concentración de metanol del medio de cultivo
es un parámetro importante para el crecimiento de la cepa de
levadura metilotrófica TK62 (pCU660) #10 que tiene una ruta
metabólica del metanol y para la expresión de
Kex2-660 a partir de un promotor AOD cuya expresión
se induce por metanol. Los inventores de la presente invención
intentaron en primer lugar ajustar las condiciones para la adición
del metanol con el fin de mantener la concentración de metanol del
medio de cultivo a una concentración que es suficiente como fuente
de carbono para el crecimiento de las levaduras así como para no
presentar toxicidad celular. El cultivo se llevó a cabo de acuerdo
con las condiciones básicas de cultivo.
La concentración del metanol en el medio de
cultivo se determinó cada 3 horas, y los tiempos y las cantidades
de la adición de metanol al medio de cultivo se determinaron en
referencia a las concentraciones existentes 2 a 3 horas antes.
Debido a que la concentración de metanol en el medio de cultivo
disminuyó hasta 0,42% (v/v) 15 horas después del comienzo del
cultivo (DO600 = 22), se comenzó la adición del metanol a una
velocidad de 0,75 ml/L.h, comenzando en la hora 18 después del
comienzo del cultivo (DO600 = 52). Es más, la concentración de
metanol del medio de cultivo en la hora 18 inmediatamente antes de
que la adición de metanol disminuyó hasta 0,26% (v/v).
Debido a que la concentración de metanol en el
medio de cultivo en la hora 21 después del comienzo del cultivo
disminuyó más hasta 0,1% (v/v) o menos, la velocidad de la adición
del metanol se incrementó hasta 7,5 ml/L.h comenzando en la hora 23
después del comienzo del cultivo (10 veces más rápido que la
velocidad de la adición inicial). Inmediatamente después de este
incremento de la velocidad de la adición, la velocidad de la
agitación disminuyó rápidamente y la velocidad del consumo del
oxígeno por las levaduras disminuyó bruscamente. Es decir, se
observó una disminución de la actividad celular. Después, disminuyó
la densidad celular y se pensó que las levaduras se habían lisado.
La concentración de metanol en el medio de cultivo 1 hora después de
que la velocidad de la adición del metanol se incrementó (24 horas
después del comienzo del cultivo), era 0,76% (v/v), indicando, por
lo tanto, que el metanol se estaba acumulando en el medio de
cultivo).
En base a los resultados descritos más arriba, se
vio que 1) un buen momento para comenzar la adición de metanol al
medio de cultivo es en la hora 18 después del comienzo del cultivo
(DO600 = aprox. 50), 2) debido a que la concentración de metanol en
el medio de cultivo disminuye hasta 0,1% (v/v) o menos en 3 horas a
una velocidad de la adición del metanol de 0,75 ml/L.h existe una
posibilidad de que exista una escasez de metanol como fuente de
carbono, y 3) existe la posibilidad de que se produzca toxicidad
celular debida a la acumulación de metanol en el medio de cultivo
debido a que la velocidad de adición de 7,5 ml/L.h es excesivamente
rápida. Además, se vio que después de un estado continuo en el que
la concentración de metanol en el medio de cultivo es 0,1% (v/v) o
menos, la adición rápida de metanol produce la muerte de la cepa
TK62 (pCU660) #10.
Las fluctuaciones de los valores de oxígeno
disuelto sincrónicas con el ciclo de la adición del metanol se
observaron desde la hora 20 hasta la 23 después del comienzo del
cultivo. Debido a que este periodo coincidió con el tiempo a partir
del cual la concentración de metanol en el medio de cultivo
disminuyó hasta 0,1% (v/v) o menos hasta el tiempo en el que el
metanol empezaba a acumularse debido a la rápida adición de metanol
al medio de cultivo (es decir, el tiempo durante el cual la
concentración de metanol en el medio de cultivo era 0,1% (v/v) o
menos), se sugirió que existe una relación entre las fluctuaciones
periódicas de los valores de oxígeno disuelto y la concentración de
metanol en el medio de cultivo.
En el cultivo de la sección previa al que se
añadió metanol de manera periódica, se sugirió que las fluctuaciones
de los valores de oxígeno disuelto sincrónicas con el ciclo de esa
adición se observan cuando la concentración de metanol del medio de
cultivo era 0,1% (v/v) o menos, y que no se siguen observando cuando
el metanol comienza a acumularse en el medio de cultivo. La
cantidad de oxígeno disuelto es un parámetro que se determina de
manera rutinaria con el fin de controlar el cultivo, y se determina
utilizando un electrodo de oxígeno disuelto. Si fuera posible
predecir la cantidad de metanol requerida en base a los cambios de
la cantidad de oxígeno disuelto en el cultivo de microorganismos
que tienen una ruta metabólica de metanol, sería posible ajustar
fácilmente las condiciones de cultivo estables y eficaces.
Por lo tanto, se llevó a cabo una investigación
detallada respecto a la relación entre las fluctuaciones de los
valores de oxígeno disuelto en sincronización con el ciclo de la
adición del metanol y con la concentración del metanol en el medio
de cultivo utilizando una velocidad de adición del metanol de 2,25
ml/L.h, que es un valor intermedio entre la velocidad de 0,75
ml/L.h a la que la concentración de metanol del medio de cultivo
disminuye rápidamente y la velocidad de 7,5 ml/L.h a la que el
metanol se acumula en el medio de cultivo en el cultivo de la
sección 2) mencionado más arriba.
En base a los resultados de la sección 2), se
ajustó el tiempo en el que se comienza la adición del metanol en el
momento en el que la DO600 alcanza el valor de aproximadamente 50
(aproximadamente 18 horas después del comienzo del cultivo), y las
velocidades de la adición de las fuentes de carbono se ajustaron a
2,25 ml/L.h para el metanol y 0,15 g/L.h para el glicerol. Las
fluctuaciones de los valores de oxígeno disuelto sincrónicas con el
ciclo de la adición de la fuente de carbono se empezaron a observar
empezando en la hora 23 después del comienzo del cultivo (DO600 =
97), y continuaron hasta que se terminó el cultivo (49 horas después
del comienzo del cultivo; DO600 = 198).
La concentración de metanol en el medio de
cultivo durante este tiempo fue 0,1% (v/v) o menos. Además, cuando
la concentración de metanol en el medio de cultivo alcanzó el valor
de 0,1% (v/v) o menos y la concentración de glicerol también
alcanzó el valor de 0,1% (p/v) o menos, la magnitud del cambio de
las fluctuaciones periódicas de los valores de oxígeno disuelto
sincrónicas con el ciclo de la adición de la disolución de adición
de la fuente de carbono se incrementó (Fig. 3). Cuando el glicerol
se añadió de manera que la concentración final en el medio de
cultivo a ese tiempo se incrementó hasta 1,25% (p/v), aunque la
magnitud del cambio incrementada volvió a valores normales, se vio
que las fluctuaciones periódicas de los valores de oxígeno disuelto
sincrónicas con el ciclo de la adición de la disolución de adición
de la fuente de carbono continuaron (Fig. 3).
Es decir, resultó claro que las fluctuaciones
periódicas de los valores de oxígeno disuelto indican que la
concentración de metanol en el medio de cultivo es 0,1% (v/v) o
menos, y que un incremento de la magnitud del cambio indica un
estado en el que la concentración de metanol del medio de cultivo es
0,1% (v/v) o menos y que la concentración de glicerol es 0,1% (p/v)
o menos. Mediante la utilización de estos indicadores, puede
determinarse el estado en el que la concentración de metanol es 0,1%
(v/v) o menos y la concentración de glicerol es 0,1% (p/v) o
menos.
Además, también resultó claro que durante el
tiempo en el que la concentración de metanol era 0,1% (v/v) o menos
(23-49 horas después del comienzo del cultivo), el
número de células se incrementa más de dos veces. En otras
palabras, las células fueron capaces de crecer incluso a pesar de
que la concentración de metanol del medio de cultivo era 0,1% (v/v)
o menos.
Los inventores de la presente invención han
demostrado claramente que durante el tiempo en el que la
concentración de metanol en el medio de cultivo en el Ejemplo 3 es
0,1% (v/v) o menos y durante el tiempo en el que el metanol no se
acumula en el medio de cultivo, se observa que las fluctuaciones de
los valores de oxígeno disuelto son sincrónicas con la adición
periódica del metanol, y que las fluctuaciones de los valores de
oxígeno disuelto no se observan cuando el metanol comienza a
acumularse. Más aún, también resultó claro que las células crecen
en el estado en el que se observan fluctuaciones de los valores de
oxígeno disuelto sincrónicas con la adición del metanol. Por lo
tanto, se llevó a cabo un estudio para determinar la relación entre
la velocidad de adición del metanol y las fluctuaciones periódicas
de los valores de oxígeno disuelto, y para clarificar la relación
entre la velocidad de la adición del metanol y la cantidad del
producto secretado Kex2-660.
Se estudiaron los cambios en los patrones de las
fluctuaciones de los valores de oxígeno disuelto sincrónicas con la
adición periódica de metanol cuando se cambió la velocidad de la
adición del metanol con el fin de determinar si los cambios pueden
servir como un indicador para controlar la adición de metanol a un
medio de cultivo.
Cuando la densidad celular alcanzó DO600 = 270
(65 g DCW/L de medio de cultivo) después del comienzo del cultivo,
se cambió la velocidad de la adición del metanol a 1,5, 2,2, 4,7 y
6,4 ml/L.h, y se examinaron los patrones de las fluctuaciones
periódicas de los valores de oxígeno disuelto y las concentraciones
de metanol en el medio de cultivo a esos tiempos. El glicerol se
añadió de manera simultánea a la velocidad de 5 g/L.h. Se vio que
las fluctuaciones de los valores de oxígeno disuelto en
sincronización con la adición de metanol se observaban cuando la
velocidad de adición de metanol era 1,5, 2,2 ó 4,7 ml/L.h, que las
concentraciones de metanol en el medio de cultivo a esos tiempos
fueron todas 0,1% (v/v) o menos, y que el metanol no se acumula.
Más aún, se vio que el patrón de las fluctuaciones cambiaba con
incrementos de la velocidad de la adición del metanol, y que la
velocidad del incremento de los valores de oxígeno disuelto por
unidad de tiempo después de la adición del metanol se hacía más
gradual (Fig. 4).
Más aún, cuando la velocidad de la adición del
metanol era 6,4 ml/L.h, las fluctuaciones periódicas de los valores
de oxígeno disuelto sincrónicas con el ciclo de la adición del
metanol no se volvieron a observar (Fig. 4). Aunque a ese tiempo la
concentración de metanol en el medio de cultivo era 0,1% (v/v) o
menos, cuando se incrementó más la velocidad de la adición del
metanol, se vio que el metanol se acumulaba en el medio de cultivo.
Aunque no se puede determinar la capacidad de las levaduras para
consumir metanol únicamente determinando la concentración de
metanol en el medio de cultivo, en base a los resultados descritos
más arriba y a los de la sección 2) del Ejemplo 3, se determinó que
las levaduras tienen un margen considerable para consumir metanol
si el incremento de los valores de oxígeno disuelto por unidad de
tiempo es rápido, y un margen pequeño para el consumo de metanol si
el incremento es gradual.
En otras palabras, la necesidad de ajustar la
velocidad de la adición del metanol puede determinarse mediante la
observación del patrón de las fluctuaciones periódicas de los
valores de oxígeno disuelto. Más aún, se ha mostrado claramente que
en el estado en el que la densidad celular es DO600 = 270, siempre
que la velocidad de la adición del metanol no supere 4,7 ml/L.h, se
observan fluctuaciones periódicas de los valores de oxígeno
disuelto, el metanol no se acumula y la cepa TK62 (pCU660) #10 crece
sin morirse.
Cuando la densidad celular de la cepa TK62
(pCU660) #10 es DO600 = 270 (65 g DCW/L de medio de cultivo), la
velocidad de la adición del metanol a la que el metanol no se
acumula en el medio de cultivo y a la que las levaduras no mueren
estaba en el intervalo de 1,5 a 4,7 ml/L.h. Por lo tanto, con el fin
de investigar cual de estas velocidades de la adición del metanol a
la que el metanol no se acumula en el medio de cultivo es óptima
para la velocidad del crecimiento de la cepa TK62 (pCU660) #10 y
para la cantidad de Kex2-660 secretada producida,
se llevó a cabo un cultivo utilizando una velocidad de la adición
del metanol de 2,25 ml/L.h ó 4,5 ml/L.h, y se determinaron a esos
tiempos las velocidades del crecimiento celular y las cantidades de
Kex2-660 secretada producida. La velocidad de la
adición del glicerol fue 5 g/L.h en ambos casos.
Durante el cultivo en el que se utilizan
velocidades de adición de 2,25 y 4,5 ml/L.h, los valores de oxígeno
disuelto comenzaron a fluctuar de manera sincrónica con la adición
periódica de metanol comenzando 22 y 25 horas después del comienzo
del cultivo, respectivamente, y las fluctuaciones continuaron hasta
la hora 48 cuando el cultivo se completó. Las concentraciones de
metanol en el medio de cultivo durante este tiempo fueron ambas
0,1% (v/v) o menos.
Durante el tiempo en el que se observaban
fluctuaciones de los valores de oxígeno disuelto, en cualquier
condición, se incrementaron tanto la densidad celular como la
cantidad de Kex2-660 secretada producida (por
ejemplo, la densidad celular y la cantidad de
Kex2-660 secretada producida se incrementaron
aproximadamente 2,5 veces y aproximadamente 7,4 veces,
respectivamente, durante el tiempo desde la hora 24 hasta la 48
después del comienzo del cultivo a una velocidad de la adición del
metanol de 4,5 ml/L.h; Fig. 5), y durante el periodo en el que la
concentración de metanol en el medio de cultivo era 0,1% (v/v) o
menos cuando las fluctuaciones de los valores de oxígeno disuelto se
vieron que eran sincrónicas con el ciclo de adición de metanol,
resultó claro que el número de células se incrementó y que
Kex2-660 se expresó y se secretó en el medio de
cultivo independientemente de la velocidad de la adición del metanol
(Fig. 5 y 6). Es decir, se vio que la velocidad de adición de
metanol a la que la concentración de metanol en el medio de cultivo
es 0,1% (v/v) o menos y a la que los valores de oxígeno disuelto
fluctúan de manera sincrónica con la adición
periódica del metanol es la velocidad adecuada para el crecimiento celular y para la expresión del producto diana.
periódica del metanol es la velocidad adecuada para el crecimiento celular y para la expresión del producto diana.
Durante el cultivo en el que se utilizan
velocidades de adición del metanol de 2,25 y 4,5 ml/L.h, el número
de células se incrementó 1.400 veces y 1.800 veces, respectivamente,
en la hora 48 después de comenzar el cultivo, mientras que se
expresaron y se secretaron 1.260 MU y 2.850 MU (equivalentes a
aproximadamente 150 mg y 340 mg), respectivamente, de
Kex2-660 por litro de sobrenadante de cultivo (Tabla
1). Por lo tanto, resultó claro que mientras se mantengan las
condiciones de la adición del metanol de manera que continúen las
fluctuaciones periódicas de los valores de oxígeno disuelto (en
otras palabras, a una velocidad igual a o menor que la velocidad
máxima del consumo del metanol de las levaduras), la velocidad del
crecimiento celular se incrementa y la cantidad de
Kex2-660 producida se incrementa mientras la
cantidad de metanol añadido se incrementa.
Más aún, el tiempo requerido para estos cultivos
(48 horas) fue corto en comparación con el tiempo
(100-160 horas) para el cultivo dividido en una
fase de crecimiento, y una fase de producción para levaduras
metilotróficas deficientes en enzimas de una ruta metabólica del
metanol, confirmando de esta manera la utilidad de la presente
invención.
La Fig. 6 muestra los resultados de
SDS-PAGE realizada de acuerdo con el método de
Laemmli (Laemmli et al., Nature, 227,
680-685, 1970). Es decir, se añadieron 7 \mul de
tampón de muestra 4x SDS (375 mM Tris-HCl (pH 6,8),
30% (p/v) glicerol, 7% (p/v) SDS, 15% (v/v)
2-mercaptoetanol, 0,1% (p/v) azul de bromofenol) a
20 \mul de sobrenadante del cultivo seguido de calentamiento
durante 5 minutos a 95ºC para preparar la muestra de
SDS-PAGE. Se llevó a cabo SDS-PAGE
6% bajo las condiciones de 18 mA y 90 minutos utilizando 7 \mul de
la muestra mencionada más arriba. Después de la electroforesis, el
gel se tiñó con una disolución de tinción (10% (v/v) ácido acético,
40% (v/v) metanol, 0,25% (p/v) azul brillante de Coumassie R250).
Los resultados se muestran en la Fig. 6.
Durante el cultivo en el que se utilizan
velocidades de adición del metanol de 2,25 y 4,5 ml/L.h, se
determinaron las velocidades del consumo del metanol por 1 g DCW de
levadura (valor medio cada 6 horas) (Tabla 2). Se tomó la velocidad
del consumo del metanol por litro de medio de cultivo como el valor
que resulta de restar la cantidad de metanol que queda de la
cantidad de metanol añadida, mientras que el peso seco celular de
las levaduras (DCW) se calculó introduciendo el valor DO600 del
medio de cultivo en una fórmula de conversión determinada
previamente en base a la relación entre los dos.
Es más, debido a que se predijo que los efectos
de factores tales como la ventilación y la generación de calor
producidos por la agitación serían significativos en el caso de una
DCW de 0,5 g o menos, éste se eliminó de la evaluación debido a que
existía una gran posibilidad de que no podría calcularse la cantidad
correcta del consumo de metanol. Durante el cultivo de la cepa TK62
(pCU660) #10 en base a las fluctuaciones periódicas de los valores
de oxígeno disuelto, se vio que las velocidades del consumo del
metanol eran 0,03-0,16 ml/gDCW.h cuando DCW era 0,5
g o más.
De acuerdo con los descubrimientos presentes, la
cantidad de metanol añadida que es adecuada tanto para el
crecimiento de los microorganismos como para la expresión de un gen
heterogéneo controlado con un promotor pueden determinarse a partir
de la cantidad de metanol consumida por los microorganismos que
tienen una ruta metabólica del metanol sin determinar la
concentración de metanol en el medio de cultivo, en un sistema de
expresión génica heterogéneo utilizando un promotor inducible por
metanol y una cepa salvaje de un microorganismo que tiene una ruta
metabólica del metanol como anfitrión, sin utilizar una cepa
deficiente en enzimas de la ruta metabólica del metanol. Además,
durante el tiempo en el que se observa que las fluctuaciones de los
valores de oxígeno disuelto son sincrónicas con la adición
periódica de metanol cuando la concentración del metanol en el
medio de cultivo es 0,1% (v/v) o menos, la velocidad máxima del
consumo del metanol de los microorganismos es mayor que o igual a
la velocidad de la adición del metanol y el metanol no se acumula en
el medio de cultivo, permitiendo por lo tanto un cultivo estable en
el que los microorganismos no se destruyen como consecuencia de la
toxicidad celular producida por el metanol.
Más aún, cuando la diferencia entre la velocidad
máxima del consumo de metanol por los microorganismos y la
velocidad de la adición del metanol disminuye de manera que las dos
son iguales, debido a que cambia el patrón de las fluctuaciones de
los valores de oxígeno disuelto, puede determinarse una velocidad de
la adición del metanol adecuada para el crecimiento de los
microorganismos y para la expresión de un gen heterogéneo controlado
con un promotor y controlarse utilizando este cambio como un
indicador. Debido a que los valores de oxígeno disuelto son
parámetros que se utilizan normalmente para controlar los cultivos y
a que la velocidad de la adición del metanol puede determinarse a
partir de su patrón de fluctuación, el metanol puede añadirse de
acuerdo con un bucle de control automático que no resultaba posible
en el pasado en el caso del cultivo de microorganismos que tienen
una ruta metabólica del metanol.
Por lo tanto, las técnicas presentes pueden
proporcionar un método de cultivo que es eficaz tanto en términos
de crecimiento de microorganismos como de producción del producto
diana, a la vez que ofrece un alto grado de reproducibilidad
mediante el mantenimiento de la velocidad de la adición del metanol
igual a o menor que la velocidad máxima del consumo del metanol de
los microorganismos y cercana a la mencionada velocidad máxima de
consumo (que permite que se induzca una transcripción potente a
partir del promotor sin inhibir el crecimiento del anfitrión).
Además, los microorganismos que tienen una ruta metabólica del
metanol que utilizan metanol como fuente de carbono pueden
cultivarse rápidamente y permitir una producción eficaz. Más aún, en
el caso en el que el producto génico se secrete en el medio de
cultivo, se puede esperar que las disminuciones de las cantidades
de metanol y de glicerol contenidas en el medio de cultivo
contribuyan a una estabilidad mejorada del producto génico y a una
mayor simplicidad del proceso de purificación.
| 1. | SEQ ID NO.: 1 |
| TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 35 bases | |
| CADENA: Lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético | |
| SECUENCIA | |
| GCGGCCGCTT AAACATCCCG TTTTGTAAAA AGAGA | |
| 2. | SEQ ID NO.: 2 |
| TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 35 bases | |
| CADENA: | |
| TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético | |
| SECUENCIA | |
| TAAGTCGACT TAAGGATCGG TACTCGCAGT AGTCG |
Claims (17)
1. Un método para cultivar
microorganismos que tienen una ruta metabólica del metanol en los
que se introduce una unidad de expresión que comprende un gen diana
unido por debajo de un promotor que puede inducirse por metanol; en
el que, durante el periodo de cultivo que incluye el periodo durante
el cual se añade el metanol, la adición del metanol se lleva a cabo
de manera periódica a intervalos de 1 a 20 minutos y la velocidad de
la adición se ajusta en respuesta a la presencia o ausencia de
fluctuaciones en la concentración del oxígeno disuelto a una
velocidad
que:
que:
es igual a o menor que la velocidad máxima del
consumo del metanol de los microorganismos mencionados;
es tal que la concentración del oxígeno disuelto
en el medio de cultivo fluctúa de manera sincrónica con el periodo
de la adición del metanol; y
es tal que durante el periodo durante el cual la
concentración del oxígeno disuelto mencionada fluctúa de manera
periódica, la concentración de metanol en el medio de cultivo es
igual a o menor que 0,1% (v/v).
2. Un método de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que se comienza la adición del metanol en
cada periodo por la detección de una subida de la concentración del
oxígeno disuelto en el medio de cultivo producida por una
disminución de la concentración del metanol.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la adición de metanol se
lleva a cabo a intervalos de 5 a 10 minutos.
4. Un método de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los
microorganismos mencionados son levaduras metilotróficas.
5. Un método de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que las levaduras metilotróficas mencionadas
son levaduras que pertenecen a los géneros Pichia,
Hansenula, o Candida.
6. Un método de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que las levaduras mencionadas son las
especies Pichia pastoris, Hansenula polymorpha o Candida
boidinii.
7. Un método de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la velocidad del
consumo del metanol cuando la densidad celular es un peso seco
celular (DCW) de al menos 0,5 g/litro es 0,01 a 0,20 ml/g
DCW.h.
8. Un método de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el promotor
mencionado capaz de inducirse por metanol es un promotor de un gen
de alcohol oxidasa, un promotor de un gen de fórmico deshidrogenasa
o un promotor de un gen de metanol oxidasa.
9. Un método de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la levadura metilotrófica mencionada es
Candida boidinii, y el promotor mencionado es un promotor de
un gen de alcohol oxidasa de Candida boidinii.
10. Un método de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el gen diana mencionado es
un gen que codifica una proteína útil.
11. Un método de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que la proteína útil mencionada es una
enzima u otra sustancia activa desde un punto de vista
fisiológico.
12. Un método de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que la enzima mencionada es proteasa Kex2,
prohormona convertasa 1/3 (PC1/3), prohormona convertasa 2 (PC2),
furina, péptido C \alpha-amidasa terminal,
proteasa estafilococal V8, protesasa I de achromobacter (API),
leucina aminopeptidasa placentaria, acetilhidrolasa del factor
activador de plaquetas citoplásmico y la seleccionada del grupo que
consiste en sus derivados.
13. Un método de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el derivado de la proteasa Kex2
mencionado se secreta en un medio de cultivo.
14. Un método de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que la sustancia activa desde un punto de
vista fisiológico mencionada es hormona de crecimiento, hormona
liberadora de la hormona de crecimiento, hormona liberadora de la
hormona adrenocorticotrópica (ACTH), glucagón, péptido I semejante
al glucagón, péptido II semejante al glucagón, Interferón \alpha,
Interferón \beta, Interferón \gamma, eritropoyetina (EPO),
trombopoyetina (TPO), G-CSF, HGF, activador del
plasminógeno tisular (PAt), factor de células madre, familia TGF y
la seleccionada del grupo que consiste en sus derivados.
15. Un método de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en el que el metanol se añade con
glicerol.
\newpage
16. Un método de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en el que el metanol se añade a
intervalos fijos.
17. Un método de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, que comprende además purificar el
producto de la expresión del gen diana a partir del cultivo.
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