CN108251375A - 一种发酵生产重组人白介素-12的方法 - Google Patents

一种发酵生产重组人白介素-12的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108251375A
CN108251375A CN201611232173.1A CN201611232173A CN108251375A CN 108251375 A CN108251375 A CN 108251375A CN 201611232173 A CN201611232173 A CN 201611232173A CN 108251375 A CN108251375 A CN 108251375A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
cell
medium
rhil
fermenting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611232173.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108251375B (zh
Inventor
郑彬彬
卢世香
黄冰
姜会春
赵毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kanglitai biomedical (Qingdao) Co.,Ltd.
Original Assignee
Kang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kang Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Kang Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201611232173.1A priority Critical patent/CN108251375B/zh
Publication of CN108251375A publication Critical patent/CN108251375A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108251375B publication Critical patent/CN108251375B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种发酵生产重组人白介素‑12的方法，属于生物制品生产工艺领域，其包括，1)利用无血清培养基将含有重组人白介素‑12表达基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)复苏活化，并放大培养获得种子细胞；2)待种子细胞正常生长后，将种子细胞进行适应性扩大培养；3)将所得的种子细胞接种到生物反应器中进行培养；4)培养过程中定期添加无血清补料培养基和谷氨酰胺，并监测细胞生长情况；5)待细胞存活率低于80％时，结束培养收获细胞。本发明的方法可以高量的表达重组人白介素‑12，且易于下游纯化。

Description

一种发酵生产重组人白介素-12的方法
技术领域
本发明属于生物制品生产工艺领域，特别是一种利用无血清培养基培养真核细胞中国仓鼠卵巢细胞(CHO)发酵生产重组人白介素-12的方法。
背景技术
白细胞介素-12(IL-12)于1989年和1990由Trinchieri和Gately等发现，起初命名为NK细胞刺激因子(NKSF)和细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF)，1991年统一命名为白介素-12。
白细胞介素-12是一种70kDa的异二聚体，由两条共价连接的亚基组成，一条为35kDa(P35亚基)，另一条为40kDa(P40亚基)。P35亚基由多种细胞产生，包括T、B淋巴细胞、NK细胞和大单核细胞等，而P40链主要由激活的单核细胞和B细胞产生，P35和P40单独存在时均无任何生物活性。
IL-12具有调节和参与免疫应答细胞的活性，刺激NK细胞和T细胞产生干扰素-伽玛(IFN-γ)，促进Th1细胞的分化，是连接固有免疫和获得性免疫的核心因子。同时，IL-12可促进造血功能的恢复，用于机体造血功能的降低导致的疾病。另外，IL-12还具有抗肿瘤，抗病毒的效果，具有良好的临床应用前景。
在目前报道的利用真核细胞表达产生重组IL-12的方法中，重组IL-12的表达强度仍不令人满意。
表1现有技术的培养条件和最高产量
从表1的参考文献可以看出，重组人IL-12蛋白的生产方法中有的使用无血清培养基、有的使用含血清培养。前者较后者有很多优势，主要表现在培养基成分限定明确，能够保证各批产品之间更高的产品质量一致性，易于纯化制备，能够有效控制外源因子的污染。
表1的专利中，虽然有的使用了无血清培养基，但是由于细胞株和培养条件的限制没有实现rhIL-12的高表达。
我们在专利号ZL201210345021.8和ZL201310507082.4中公开了人白介素-12的基因序列和构建的含人白介素-12基因的高效表达工程细胞株CHO。
本发明对白介素-12的生产工艺进行了探索，力求增加重组人白介素-12的产量并保证蛋白的纯度和活性。
发明内容：
为解决上述问题，本发明提供了一种发酵生产重组人白介素-12的方法，所述方法采用含有重组人白介素-12基因的CHO细胞，通过优化无血清培养条件，克服现有的培养方法所致的重组人白介素-12表达量低的问题。所采取的技术方案如下：
一种发酵生产重组人白介素-12的方法，其包括，1)利用无血清培养基将含有重组人白介素-12表达基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)复苏活化，并放大培养获得种子细胞；2)待种子细胞正常生长后，将所述种子细胞进行适应性扩大培养；3)将所得的所述种子细胞接种到生物反应器中进行放大培养，培养条件为：转速100-120rmp、pH为6.8-7.3、溶氧为30％-50％；4)培养过程中定期添加无血清补料培养基和谷氨酰胺，并监测细胞生长情况；5)待所述细胞存活率低于80％时，结束培养收获细胞。
所述步骤3)中所述种子细胞接种到生物反应器中进行培养，进一步的所述培养条件为：转速120rmp、pH为6.85-7.2、溶氧为30％-50％、温度为36.5-37.5℃。所述pH优选为前期7.10±0.05、中后期6.85±0.10；所述溶氧为40％。
所述步骤1)中无血清培养基为CD OptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺，复苏培养条件为：125mL摇瓶，转速110-120rpm，温度37℃，5％CO2培养箱。
所述步骤2)中适应性放大培养采用无血清培养基，所述无血清培养基为CDOptiCHOTM培养基。
所述步骤4)中无血清补料培养基为CHO CD Efficient Feed B。
所述步骤4)中无血清补料培养基在培养的第2、4、6、8天进行补料，补加量为终末培养体积的10％。
所述步骤4)中，监测谷氨酰胺的量，控制其浓度不小于1mM；监测葡萄糖的量，控制葡萄糖浓度不低于2g/L。
优选的，所述发酵生产重组人白介素-12的方法，其具体步骤为：1)利用无血清培养基CD OptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺，将低温保存的含有重组人白介素-12表达基因的CHO细胞复苏活化，并放大培养获得种子细胞，复苏培养条件为：125mL摇瓶，转速110-120rpm，温度37℃；2)待种子细胞正常生长后，利用无血清基础培养基CDOptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺将所述种子细胞进行适应性扩大培养；3)将所得的所述种子细胞接种到生物反应器中进行培养，培养基为CD OptiCHOTM，培养条件为：转速120±10rpm、pH为前期7.10±0.05、中后期6.85±0.10、溶氧40％；4)在培养的第2、4、6、8天分别补充10％的无血清补料培养基CHO CD Efficient Feed B，控制葡萄糖浓度不低于2g/L，添加谷氨酰胺，控制其浓度不小于1mM，控制代谢废物乳酸浓度不高于3g/L，氨浓度不高于20mmol/L；5)待所述细胞存活率下降至80％时，结束培养收获细胞。
所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，其具体步骤为：1)利用无血清培养基CDOptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺，将低温保存的含有重组人白介素-12表达基因的CHO细胞复苏活化，并放大培养获得种子细胞，复苏培养条件为：125mL摇瓶，转速110-120rpm，温度37℃；2) 待种子细胞正常生长后，利用无血清基础培养基CD OptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺将种子细胞进行适应性扩大培养；3)将所得的种子细胞接种到生物反应器中进行培养，培养基为CD OptiCHOTM，培养条件为：转速120±10rpm、温度36.5-37.5℃、pH值6.85-7.20、溶氧30％-50％；4)在培养的第2、4、6、8天分别补充10％的无血清补料培养基CHO CD Efficient Feed B，控制葡萄糖浓度不低于2g/L，添加谷氨酰胺，控制其浓度不小于1mM，控制代谢废物乳酸浓度不高于3g/L，氨浓度不高于20mmol/L；5)待细胞存活率下降至80％时，结束培养收获细胞。
有益效果：
通过优化重组人白介素-12表达基因的CHO细胞的发酵生产工艺，能够使重组人白介素-12蛋白高效表达，生产工艺能够保证细胞较高的存活率，发酵天数适中，同时获取的发酵上清易于纯化得到重组人白介素-12，并且所表达蛋白具有高生物活性，该发酵生产工艺节约时间和培养基成本。
附图说明
图1为发酵罐生产工艺流程。
图2为重组人白介素-12的纯度检测结果。A.纯度检测图谱(SDS-PAGE非还原电泳法)，B.反向高效液相色谱法(RP-HPLC)，C.分子筛液相色谱法(SEC-HPLC)。
具体实施方式：
本发明的具体实施进一步在下列实例中示明。在这些实例中，仅用举例说明具体的实施过程和产生的效果。通过上述讨论和具体事例，本领域的专业人员可以查明本发明的基本特征，经过各种改变和修改将本发明应用于多种用途，并不偏离本发明主体和范围。因此，除了本专利表述和讨论的各种修改外，本领域内的专业人员所做的不偏离本发明主题的修改也将落入本专利的权利要求范围内。
以下实施例所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1、5L规模细胞培养工艺开发
根据前期试验探索，选择CD OptiCHO培养基作为基础培养基，CHO CD EfficientFeed B作为补料培养基，进行5L(罐体积，工作体积3L)赛多利斯发酵罐补料分批发酵培养，建立发酵罐培养的工艺流程，并对5L发酵罐搅拌桨不同转速对细胞的生长、生产和代谢参数的影响进行比较分析，选出表现性能较优的参数值。
补料添加方案为每2-3天添加一次补料FeedB，并控制FeedB添加总量为培养终体积的40％；根据Nova Bioprofile400生化分析仪检测，适时添加谷氨酰胺(Gln)和葡萄糖(Gluc)，控制Gluc浓度在2g/L以上，Gln含量在1.5-5mM之间。针对培养转速、pH和溶氧(DO)参数设计表2的分组。
表2. 5L培养工艺开发试验设计及参数控制
从液氮罐中冻存的重组人白介素-12(rhIL-12)工程细胞株(CHO细胞株2-294克隆)中取出一支细胞，立即在37℃水浴中进行复苏，无菌转移到10mL新鲜培养基重新悬浮细胞，复苏培养基采用CD OptiCHOTMAGT(Gibco)+0.18％F68(Gibco)+8mM L-Gln(Gibco)，经过3次传代培养后，细胞活力和密度恢复到了冻存前的生长水平。复苏培养的细胞密度为4.0-5.0×105个/mL。培养条件为：T-125摇瓶，转速110-120rpm，温度37℃，5％CO2培养箱。细胞每2天传代一次，适应2-3代，直至细胞倍增时间恢复正常。待细胞生长正常后，进行细胞扩种，细胞扩至所需体积时，接种到5L发酵罐中，接种细胞密度为5.0×105个/mL，接种后培养液体积为1.8L，开始进行补料分批发酵培养，并依次对5L规模的细胞培养过程进行转速、pH值和溶氧等参数优化。每天从发酵罐中取样，计算细胞密度和细胞存活率，并离心留取培养上清备用。待细胞存活率≤50％时收样，结束补料分批发酵培养。将每天所取的样品进行蛋白表达量检测。
(1)最佳转速的摸索
按照表2设计方案进行第一轮最佳转速的摸索，细胞培养周期、细胞的最高密度以及上清中目的蛋白表达量的检测结果见表3。
第一轮试验结果分析：
表3.不同转速下细胞的相关参数差异
从表3可知，其他参数相同的条件下，120rpm的转速时细胞生长和蛋白生产状况要优于100rpm转速条件。
(2)最佳pH的摸索
按照表2的设计进行第二轮的最佳pH的摸索，转速为120rpm。pH值分比为：前期(约为培养的前三天)7.10±0.05和中后期(约为三天以后至培养结束前)6.85±0.10、全程6.85±0.10。细胞培养周期、细胞的最高密度以及上清中目的蛋白表达量的检测结果见表4。
第二轮试验(pH摸索)结果分析：
表4.不同pH条件下细胞的相关参数差异
从表4可知，G2-5L-1和G2-5L-2的最高活细胞密度和培养周期基本相同，但蛋白表达量差异较大，G2-5L-1明显高于G2-5L-2。因此，选择的pH至为“前期pH7.10±0.05，中后期pH6.85±0.10”。
(3)最佳溶氧(DO)的摸索
按照表2的设计进行第三轮的最佳溶氧的摸索，转速为120rpm，pH值为前期pH7.10±0.05，中后期pH 6.85±0.10。细胞培养周期、细胞的最高密度以及上清中目的蛋白表达量的检测结果见表5。
第三轮试验(DO参数摸索)结果分析：
表5.不同DO条件下细胞的相关参数差异
从表5可知，G3-5L-1比G3-5L-2的最高活细胞密度高，培养周期长1天，且G3-5L-1的蛋白表达量明显高于G3-5L-2。因此，选择溶氧为40％。
细胞培养过程中的代谢物水平的变化表明，三个优化组的L-Gln残留量被控制在1.5mM以上；随着培养过程中补料的补加，Gluc维持在2-12g/L之间，其含量能够满足细胞需要。表明培养过程中L-Gln和Gluc的补充方案能够适合细胞的生长要求。
综合三轮5L赛多利斯发酵罐参数优化试验的结论，确定第四轮5L赛多利斯发酵罐工艺参数为：搅拌桨转速120rpm；pH值前期7.10±0.05，中后期6.85±0.10；DO水平为40％。
(4)所有参数稳定后整体培养观察
取种子细胞进行复苏，待细胞生长正常后，进行细胞扩种，细胞扩至所需体积时进行接种，接种细胞密度为5.5×105个/mL，以120rpm的转速，pH前期7.10±0.05，中后期6.85±0.10，DO值为40％的条件下进行发酵培养，并设计两组平行试验进行对比(G4-5L-1、G4-5L-2)。此轮培养的细胞培养周期、细胞的最高密度以及上清中目的蛋白表达量的检测结果见表6。
第四轮试验结果分析：
表6.所有优化参数综合培养条件下细胞的相关参数差异
从表6可知，第四轮得到较为稳定的两个批次培养，细胞密度、培养周期、表达量等差异均不明显，基本达到参数优化的目的。
第4轮培养结果表明，G4-5L-1和G4-5L-2的FeedB、L-Gln、Gluc的补加和控制比较适合细胞生长，而且G4-5L-1和G4-5L-2的细胞生长曲线、代谢曲线、目的蛋白表达曲线相似。因此认为，G4-5L-1和G4-5L-2很好的综合了前3轮发酵罐参数优化结果，并较稳定的重现了细胞生长、代谢、目的蛋白表达等参数变化情况。证实经前3轮5L发酵罐参数优化试验得到的5L发酵罐补料分批发酵生产工艺稳定，适合工程细胞株在5L赛多利斯发酵罐水平上的rhIL-12蛋白质生产。
实施例2、7L中试规模细胞培养工艺优化
在前期5L赛多利斯发酵罐补料分批发酵培养工艺基础上，按照5L发酵罐工艺进行了7L(10L罐体积，7L实际培养体积)规模的工艺摸索，确定7L中试规模的发酵工艺。生产工艺如图1所示。
用预热的CD OptiCHOTMAGT+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺培养基进行rhIL-12生产用细胞复苏，复苏培养的细胞密度4.0-5.0×105个/mL。培养条件为：T-125摇瓶，转速110-120rpm，温度37℃，5％CO2培养箱。细胞每2天传代一次，适应2-3代，直至细胞倍增时间恢复正常。待细胞生长正常后，进行细胞扩种，细胞扩至所需体积时进行接种。接种细胞密度为5.0×105个/mL，接种后培养液体积为4.2L，发酵罐培养条件为搅拌桨转速120rpm；pH值前期7.10±0.05，中后期6.85±0.10；DO值40％；温度37±0.5℃；有效体积7L。发酵过程中，每2-3天添加补料培养基，并控制FeedB添加总量为培养终体积的40％；根据Nova检测，适时添加Gln，控制Gln在1.5‐5.0mM。每天计算细胞密度、细胞存活率，并离心留取培养上清备用。待细胞存活率≤50％时收样，结束补料分批培养。将每天所取的样品进行表达量检测。
7L中试生产的最高活细胞密度可达到9-10×106个/mL，且活细胞密度变化趋势与5L中试生产一致，到达平台期的时间在第8-9天；细胞活率下降较缓，并且第10天之前，细胞活率在90％以上；当培养周期达到14天时，细胞活率在60％以上，7L中试预试验的rhIL-12累积表达量达到了230mg/L。说明此工艺条件适合7L中试生产。
L-谷氨酰胺(L-Gln)、乳酸(Lac)、铵(NH4 +)、渗透压(Osm)等参数反映了发酵培养过程中细胞的代谢情况。Gluc和L-Gln是为细胞提供碳源和能源的重要营养成分，因该细胞系对于Gluc消耗量较少，无需额外补加；L-Gln消耗量较快，需要在培养过程中根据L-Gln的代谢情况适时补加，本补料工艺下发酵液中L-Gln的残留量控制在1mM以上，能够满足细胞生长的需要。
乳酸(Lac)和氨(NH4 +)作为细胞的代谢废物，对细胞有毒害，该两种产物的积累容易造成细胞的存活率降低，进而增加细胞内溶物的释放，使蛋白的纯化难度加大，从目前的试验结果看，随着细胞培养周期的推移，Lac最高积累量在2-3g/L之间，NH4 +积累量逐渐升高，最高值在13mM左右，在细胞正常生长代谢的可接受范围内。
从渗透压(Osm)采集数据看，在整个细胞培养周期大部分时间，渗透压基本上维持在250-300mOsm/kg，属于细胞正常生长代谢可接受的渗透压范围。
综上所述，7L中试生产预试验的FeedB、L-Gln的补加和控制方案能够适应细胞生长和蛋白表达，而且稳定的重现了5L发酵规模的细胞生长、代谢、目的蛋白表达等参数的变化情况。
Elisa方法检测上清中的rhIL-12(P70)含量在150-200mg/L之间，表达量较高的批次则能够达到200mg/L，这远远超过目前其他rhIL-12生产工艺的表达水平。
实施例3. 7L三批连续生产
本实施例三批7L连续生产试验采用的赛多利斯发酵罐(BIOSTAT B plus10L)。发酵罐先用自来水冲洗至无可见异物，再用0.2M氢氧化钠浸泡6-24h，使附着物软化或被溶解；浸泡后的发酵罐体用自来水刷洗至少3遍，并冲洗直至肉眼看不到任何残留物；再用纯水冲洗3遍；最后用Mill-Q超纯水清洗3遍。罐体组装完成后，配制1/3罐体积PBS溶液加入发酵罐，完成电极校正后接入罐体，依据罐体说明书及灭菌器验证参数进行121℃灭菌35min。
取种子细胞CHO细胞，用预热的CD OptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺培养基进行复苏，复苏培养的细胞密度为4.0-5.0×105个/mL。复苏培养条件为：125mL摇瓶，转速110-120rpm，温度37℃，5％CO2培养箱。细胞每2天传代一次，适应3代，直至细胞倍增时间恢复正常。对细胞进行扩增，接种细胞密度为5.0×105个/mL。待细胞扩增至所需体积时，向发酵罐内注入所需体积CD OptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺培养基，并进行种子细胞接种，接种细胞密度约5.0×105个/mL，接种后体积为4.2L。发酵罐的条件为：开始接种前设定发酵罐转速在120rpm，培养过程中保持此设定值不变，转速波动范围应控制在120±10rpm范围内；设定发酵罐温度37.0℃，中间控制过程中随接种和补料温度会有所波动，温度波动上限不超过37.5℃，以保证不对细胞造成伤害。对于温度波动下限，除去接种和补料对温度短时间影响外，应控制温度不低于36.5℃；发酵过程中控制发酵液pH在6.85-7.20，通过通入CO2和加入7.5％碳酸氢盐溶液维持其在设定范围内；种子细胞接种后，随着细胞生长和代谢，DO值逐渐下降。向罐体内通入氧气和空气的混合气体，使DO值维持在30％-50％的平均水平。控制发酵过程中补料、葡萄糖(Gluc)和谷氨酰胺：培养过程中通过补加CHO CD Efficient Feed B促进细胞生长，维持细胞存活率，分别在发酵培养的第2、4、6、8天进行补料，补加量为终末培养体积的10％，即在中试规模为7L培养工艺过程中，每次补加700mL；Nova系统实时监测，根据L-谷氨酰胺的代谢速率和剩余量确定其补加量，控制其浓度不小于1mM；根据葡萄糖消耗速率和剩余葡萄糖量确定补加量，控制葡萄糖浓度不低于2g/L。根据工艺摸索过程，补料培养基中含有葡萄糖，随着补料的添加，葡萄糖也一并得到补充，因此无需单独对其进行添加。生化分析仪(Nova BioProfie400)实时监测，根据工艺摸索的经验，乳酸Lac浓度最高在3g/L左右，氨浓度最高20mmol/L左右。根据细胞生长情况确定发酵终点，在细胞存活率下降至80％左右即可终止发酵并进行收样，但是应保证发酵培养的天数至少能够达到11天。
表7为三批7L连续生产的白介素-12的产量，表明其细胞生长、存活率和代谢情况具有一致性和稳定性，且目的蛋白的表达能够满足预期目标。说明目前的中试发酵工艺可控、稳定，且具有可重复性。
表7.三批7L连续生产的白介素-12的产量
批号 结果(mg/L)
第一批次 211.852
第二批次 258.765
第三批次 258.912
实施例4.生产的重组人白介素-12的纯度和活性检测
采用三种方法：SDS-PAGE非还原电泳法、反向高效液相色谱(RP-HPLC) 和分子筛高效液相色谱(SEC-HPLC)对于生产的白介素-12进行纯度检测以进行质量控制。SDS-PAGE非还原电泳法，依药典方法测定(通则0541第五法，见附录3)，用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为10％，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0％。高效液相色谱(HPLC)-反相色谱(RP)法，依药典方法测定(通则0512，见附录4)，色谱柱采用丁烷基硅烷键合硅胶为填充剂；上样量约为20μg，检测波长为280nm。理论板数按人白介素-12峰计算不低于1500。按面积归一化法计算，重组人白介素-12主峰面积应不低于总面积的95.0％。高效液相色谱(HPLC)-分子排阻色谱(SEC)法，依药典方法测定(通则0512，见附录5)，色谱柱以适合分离分子质量为5-100kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；按面积归一化计算，人白介素-12主峰面积应不低于总面积的95.0％。检测结果如图2所示，图2.A中，蛋白上样量为10μg，电泳检测只出现目的条带一个条带，未检测到除目的条带外的其他条带，通过灰度扫描可知，蛋白纯度为100％；图2.B中，使用反向高效液相色谱法检测,上样量为20μg，出峰图显示，在接近目的蛋白主峰位置有微小杂质峰出现，面积积分显示蛋白纯度为98.769％；图2.C中，使用分子筛液相色谱法，上样量为20μg，图中只有一个目的峰出现，没有杂质峰，后面的波动为溶剂交换峰，结果表明蛋白纯度检测结果为100％。
我们检测了本工艺所生产的重组人白介素-12(P70)的活性，测定方法为体外诱生法，该方法以WHO/IL-12国际标准品(NIBSC)作为活性测定的标准品，检测样品的EC50值，EC50值为半数有效浓度，其值越低说明蛋白活性越高。对一批次上清中蛋白活性检测结果为结果为0.56ng/ml，其中对照品的EC50值为0.52ng/ml，两者十分接近。经纯化后的重组人白介素-12蛋白的活性也接近或好于WHO标准品。进一步表明本公开的生产工艺比其他已知工艺要好。
本发明的生产工艺可以获取高表达量的重组白介素-12蛋白，批次间表达量稳定，生产的发酵上清经过纯化获取的重组人白介素-12原液纯度达到98％以上。发酵时间控制适中，不但节省生产时间，而且保证细胞存活率，同时生产工艺培养基中不含有血清，能够降低重组白介素-12蛋白的纯化难度，保证工艺稳定性和质量可控性，且获得蛋白活性好。

Claims (12)

1.一种发酵生产重组人白介素-12的方法，其包括，1)利用无血清培养基将含有重组人白介素-12表达基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)复苏活化，并放大培养获得种子细胞；2)待种子细胞正常生长后，将所述种子细胞进行适应性扩大培养；3)将所得的所述种子细胞接种到生物反应器中进行培养，培养条件为：转速100-120rmp、pH为6.8-7.3、溶氧为30％-50％；4)培养过程中定期添加无血清补料培养基和谷氨酰胺，并监测细胞生长情况；5)待所述细胞存活率低于80％时，结束培养收获细胞。
2.根据权利要求1所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，所述步骤3)的培养条件为：转速120rmp、pH为6.85-7.2、溶氧为30％-50％。
3.根据权利要求2所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，所述pH为前期7.10±0.05、中后期6.85±0.10。
4.根据权利要求2所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，所述溶氧为40％。
5.根据1-4任一权利要求所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，所述步骤1)中无血清培养基为CD OptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺，复苏培养条件为：125mL摇瓶，转速110-120rpm，温度37℃，5％CO2培养箱。
6.根据1-4任一权利要求所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，所述步骤2)中所述适应性放大培养采用无血清培养基，所述无血清培养基为CD OptiCHOTM培养基。
7.根据1-4任一权利要求所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，所述步骤4)无血清补料培养基为CHO CD Efficient Feed B。
8.根据1-4任一权利要求所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，所述步骤4)中无血清补料培养基在培养的第2、4、6、8天进行补料，补加量为终末培养体积的10％。
9.根据1-4任一权利要求所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，所述步骤4)中，监测的谷氨酰胺的量，控制其浓度不小于1mM。
10.根据1-4任一权利要求所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，所述步骤4)中，监测的葡萄糖的量，控制葡萄糖浓度不低于2g/L。
11.根据权利要求1所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，其具体步骤为：1)利用无血清培养基CD OptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺，将低温保存的含有重组人白介素-12表达基因的CHO细胞复苏活化，并放大培养获得种子细胞，复苏培养条件为：125mL摇瓶，转速110-120rpm，温度37℃；2)待种子细胞正常生长后，利用无血清基础培养基CDOptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺将所述种子细胞进行适应性扩大培养；3)将所得的所述种子细胞接种到生物反应器中进行培养，培养基为CD OptiCHOTM，培养条件为：转速120±10rpm、pH为前期7.10±0.05、中后期6.85±0.10、溶氧40％；4)在培养的第2、4、6、8天分别补充10％的无血清补料培养基CHO CD Efficient Feed B，控制葡萄糖浓度不低于2g/L，添加谷氨酰胺，控制其浓度不小于1mM，控制代谢废物乳酸浓度不高于3g/L，氨浓度不高于20mmol/L；5)待所述细胞存活率下降至80％时，结束培养收获细胞。
12.根据权利要求1所述的发酵生产重组人白介素-12的方法，其具体步骤为：1)利用无血清培养基CD OptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺，将低温保存的含有重组人白介素-12表达基因的CHO细胞复苏活化，并放大培养获得种子细胞，复苏培养条件为：125mL摇瓶，转速110-120rpm，温度37℃；2)待种子细胞正常生长后，利用无血清基础培养基CDOptiCHOTM培养基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺将所述种子细胞进行适应性扩大培养；3)将所得的所述种子细胞接种到生物反应器中进行培养，培养基为CD OptiCHOTM，培养条件为：转速120±10rpm、温度36.5-37.5℃、pH值6.85-7.20、溶氧30％-50％；4)在培养的第2、4、6、8天分别补充10％的无血清补料培养基CHO CD Efficient Feed B，控制葡萄糖浓度不低于2g/L，添加谷氨酰胺，控制其浓度不小于1mM，控制代谢废物乳酸浓度不高于3g/L，氨浓度不高于20mmol/L；5)待所述细胞存活率下降至80％时，结束培养收获细胞。
CN201611232173.1A 2016-12-28 2016-12-28 一种发酵生产重组人白介素-12的方法 Active CN108251375B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611232173.1A CN108251375B (zh) 2016-12-28 2016-12-28 一种发酵生产重组人白介素-12的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611232173.1A CN108251375B (zh) 2016-12-28 2016-12-28 一种发酵生产重组人白介素-12的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108251375A true CN108251375A (zh) 2018-07-06
CN108251375B CN108251375B (zh) 2021-05-07

Family

ID=62720137

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611232173.1A Active CN108251375B (zh) 2016-12-28 2016-12-28 一种发酵生产重组人白介素-12的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108251375B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113355286A (zh) * 2020-03-02 2021-09-07 成都彤琦恩生物科技有限公司 一种高效表达重组猫干扰素ω2的哺乳动物细胞培养工艺
CN113462648A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 成都彤琦恩生物科技有限公司 一种高效表达重组猫干扰素ω2突变体的哺乳动物细胞培养工艺

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102876684A (zh) * 2012-09-17 2013-01-16 青岛康立泰药业有限公司 人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法
CN105462909A (zh) * 2015-12-31 2016-04-06 哈药集团技术中心 一种高效表达人促卵泡激素的cho细胞的培养方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102876684A (zh) * 2012-09-17 2013-01-16 青岛康立泰药业有限公司 人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法
CN103555734A (zh) * 2012-09-17 2014-02-05 青岛康立泰药业有限公司 人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法
CN105462909A (zh) * 2015-12-31 2016-04-06 哈药集团技术中心 一种高效表达人促卵泡激素的cho细胞的培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
游磊等: "流加培养过程中rCHO细胞葡萄糖和谷氨酰胺代谢特性", 《华东理工大学学报(自然科学版)》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113355286A (zh) * 2020-03-02 2021-09-07 成都彤琦恩生物科技有限公司 一种高效表达重组猫干扰素ω2的哺乳动物细胞培养工艺
CN113462648A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 成都彤琦恩生物科技有限公司 一种高效表达重组猫干扰素ω2突变体的哺乳动物细胞培养工艺

Also Published As

Publication number Publication date
CN108251375B (zh) 2021-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107254499B (zh) 改进的细胞培养方法
CN103827292B (zh) 哺乳动物细胞培养
JP2011521660A5 (zh)
AU2011246502A1 (en) Improved cell cultivation process
Adoki Factors affecting yeast growth and protein yield production from orange, plantain and banana wastes processing residues using Candida sp.
CN1309698A (zh) 用于培养动物细胞的培养基和使用该培养基生产蛋白质的方法
CN102443565B (zh) 一种适于培养cho细胞的培养基及其培养工艺
CN102154189A (zh) 一种rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法
CN103320390B (zh) 一种大规模哺乳动物工程细胞培养方法
CN103773732A (zh) 一种化学成分确定的培养基、其应用及大规模培养哺乳动物细胞的生产工艺
CN102382794B (zh) 一种哺乳动物细胞的灌流培养方法
Mankad et al. Model for microbial growth with more than one limiting nutrient
CN108251375A (zh) 一种发酵生产重组人白介素-12的方法
CN103936862A (zh) 猪白细胞介素4/6、2基因共表达及其在制备生物制剂中的应用
CN107604026B (zh) 一种提高蛹虫草菌液体发酵虫草素产量的方法
CN105483014A (zh) 发酵法高密度培养小球藻生产工艺
CN116179356B (zh) 高密度异养培养莱茵衣藻的方法及其应用
CN109576212B (zh) 高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用
CN107312751A (zh) 一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的专用培养基及培养方法
CN115161203B (zh) 一种小球藻异养培养高产蛋白质的方法
EA015498B1 (ru) Способ получения г-ксф человека
TW493003B (en) Process for producing protein
CN102268407A (zh) 一种rhIL-12工程细胞大规模无血清培养方法
CN105695385B (zh) 重组人胰岛素基因工程菌高表达株筛选培养基及制备方法
NZ517547A (en) Method for increasing the yield of recombinant proteins in microbial fermentation processes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211027

Address after: 266112 Room 405, building 6, Qingdao blue biomedical industrial park, No. 368 Hedong Road, high tech Zone, Qingdao, Shandong

Patentee after: Kanglitai biomedical (Qingdao) Co.,Ltd.

Address before: 266001 16th floor, development building, No. 8, Zhongshan Road, Shinan District, Qingdao, Shandong

Patentee before: KANGLITAI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.