JPH0383595A - ヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子工学技術を用いて得られたヒト血清アル
ブミン（以下、Ｆ（ＳＡともいう）産生酵母をフェッド
ーパッチ培養（または半回分培養）で培養することによ
りＨ３Ａを製造する方法に間する。

〔従来技術〕

培養の形態はバッチ培養、フェッドーパッチ培養、連続
培養の３種類に大きく分類できる。

バッチ培養は回分培養とも呼ばれる、最も簡単な培養法
で、通常の試験管やフラスコを用いる培養もバッチ培養
に該当する。すなわち、バッチ培養とは培ＩＩ開始から
終了まで培地の流入および流出は行わず、閉鎖的に行う
ものである。

連続培養は、バッチ培養を行っている培養槽の一方から
連続的に滅菌した同じ培地を投入し、同時に他方から等
量の培養液を排出させ、長時間にわたって培養を継続さ
せるものをいう。

連続培養では、培地中の菌濃度、基質濃度、生産物濃度
などを一定に維持することができるので、微生物の動的
状態の生理活性の研究手段としては都合良いが、連続培
養中の菌株の変異による劣化や雑菌汚染の危険性が高い
ため工業的実例は限られている。

一般に、酵母をグルコース濃度の高い培養液で培養する
と好気的条件下でもエタノールを生成しＩｇ当たりのグ
ルコースから得られる菌体量が低下する。バッチ培養は
操作が容易である反面、基質の濃度が限られているので
高い濃度の生産物を得ることができない。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで、本発明者らは上記事情に鑑み、各種研究を重ね
た結果、Ｉ　Ｓ　Ａ産生酵母をフェッドーパッチ培養に
より、高濃度のグルコースを適度に少量づつ供給するこ
とにより、Ｈ５Ａ産生酵母に対する高濃度基質阻害を避
けて、高濃度の菌体と生産物を得ることができ、特に合
成培地を使用した場合には菌体量たりのＨ３Ａ産生量を
格段に向上させることを見出して本発明を完成した。

〔課題を解決するための手段］ 即ち、本発明の要旨は下記の■、■のとおりである。

■　ヒト血清アルブ旦ン遺伝子を担持するプラスミドを
用いて形質転換した酵母をフェッドーバッチ培養により
培養してＩＳＡを採取することを特徴とするＩＳＡの製
造方法。

■　酸素消費量と二酸化炭素生成量の比である呼吸商と
して０．９〜１．２の任意の数値を設定し、呼吸商が当
該設定数値を越えない場合には酵母濃度の上昇に合わせ
てグルコース含有培地の補充を増加させ、呼吸商が当該
設定数値以上の場合はグルコース含有培地の補充を減ら
すことを特徴とする上記■のヒト血清アルブミンの製造
方法。

（ｉ）Ｈ３Ａ産生酵母 本発明においてＩＳＡ産生酵母とは、Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子
を担持したプラスくドを用いて形質転換した酵母である
。

Ｈ３Ａ遺伝子を担持したプラスミドは公知の手法により
得られる。

具体的には、ＨＳＡ遺伝子、プロモーターシグナル配列
、ターミネータ−等を含む。

プラスミドが含有するアルブミンコード領域は、特にＩ
ＳＡと同一または相同なりＮＡ配列であり、例えばＨＳ
Ａを生産することができる任意のヒト細胞から得られる
。該ＤＮＡは染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡである。染色
体ＤＮＡはＩＳＡ遺伝子を含有する遺伝子ライブラリー
から分離することができ、そしてＨＳＡ　　ｃＤＮＡは
公知の方法を用いてｍＲＮＡ経路を介して調製すること
ができる。

プロモーターは酵母、好適には世＝仁＃Ｏ？−（−＆−
ス０セレビシェ　５ａｃｃｈａｒｏ＋ｇ　ｃｅｓ　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡに由来する。好まし
くは、高発現酵母遺伝子のプロモーターをＩＳＡの発現
のために使用する。即ち、ＴＲＰＩ遺伝子、ＡＤＨＩも
しくはＡＤＨｎ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ヱ旦０３
もしくはＰＨ０５）遺伝子、またはイソチトクロームＣ
遺伝子のプロモーター、ガラクトース代謝系のプロモー
ター（ＧＡＬＩ、ＣＡＬ　１０もしくはＣＡＬ７）、イ
ンベルターゼのプロモーター（ＳＵＣ２）あるいは解糖
系酵素をコードする遺伝子のプロモーター、例えばエノ
ラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカル
ボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−
６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレー
トムクーゼ、ピルベートキナーゼ、トリホスフェートイ
ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグル
コキナーゼの遺伝子のプロモーター、あるいはａ−ファ
クターまたはα−ファクターをコードする酵母接合フェ
ロモン遺伝子のプロモーターを使用することができる。

他の好ましい態様においては、構成物中にシグナル配列
を導入する。シグナル配列は、酵母インベルターゼ、α
−ファクター遺伝子のような酵母由来のシグナル配列を
使用することができる。また、ＨＳＡのシグナル配列は
好適であり、好ましくは酵母での分泌発現のために特に
台底されたシグナル配列（特願昭６３−１０３３３９号
または特願昭６３−３３６５７号）を用いることもでき
る。

このシグナル配列の導入により、ＩＳＡ遺伝子の発現の
後、遺伝子産物は分泌経路に入り、そしてペリプラズム
空間に輸送される。さらに細胞壁を通しての培地中への
分泌を達成することができる。これはより収量の相当な
増加が可能となる。

さらに、細胞を破壊する必要がないので回収工程を単純
化することが可能である。

また、プラスミドは転写停止のための適当なターミネー
タ−１例えばＰＨ０５もしくはＧＡＰ−ＤＨターξネー
ターを含有する。

本発明において、宿主としては酵母、特にサツカロマイ
セス属もしくはピキア属が使用される。

好ましくは、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用で
きる。かつＧ４１８感受性株であるサツカロマイセス・
セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）　Ａ　Ｈ２２株（ａ＋　ｈｉｓ　４＋　Ｉ
ｅｕ　２＋　ｃａｎ　１）等が好適に用いられる。

形質転換法としては、プラスミドを直接宿主細胞内に導
入する方法と、プラスミドを酵母染色体に組み込む方法
等が挙げられる。

前者は公知の手法により行われる。具体的には、リン酸
カルシウム微少沈澱法、プロトプラストポリエチレング
リコール法、エレクトロボレー、ジョン法等が例示され
る。

後者は、例えば下記の方法によって行われ、本発明にお
いては、このようにプラスごドが酵母染色体に組み込ま
れたＩＳＡ産生酵母がより好適に使用される。

後者の方法においてプラスミドは、宿主酵母染色体中に
存在する遺伝子の一部のＤＮＡ配列（例えば、ＬＥＵ２
、ＨＩＳ４、ＴＲＰＩ、ＵＲＡ３、ｒｉｂｏｓｏｍｅＤ
Ｎ＾遺伝子等）を含有する。相同な配列により、全プラ
スミドまたはその線状断片は組換により宿主染色体に安
定に導入することができる。

即ち、増殖中、子孫細胞は選択圧が存在しない場合でも
導入された遺伝物質を安定に保持する。

例えば、酵母染色体遺伝子中の天然に存在する配列およ
びＨ５Ａ遺伝子を含むプラスミドは、前記染色体遺伝子
の座に安定に組み込まれ得る。

宿主酵母染色体配列に相同な配列は、特にアミノ酸また
は核酸合成系遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍｅＤＮＡ　、　Ｔ
ｙ因子等が使用できる。特に、ア壽ノ酸または核酸合成
系遺伝子は、宿主酵母がアごノ酸または核酸栄養要求性
株である時、すなわち、該アミノ酸または核酸合成系遺
伝子が欠損している株においては、宿主の変異を補完す
る遺伝子であるので、形質転換体の選択マーカーとして
使用することができる。この際、宿主酵母の栄養要求性
に原栄養性をもたらす。アミノ酸または核酸合成系遺伝
子としては、例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ４、ＴＲＰＩまた
はＵＲＡ３がある。

酵母用の選択遺伝子マーカーとしては、上記のように、
宿主酵母が栄養要求性株である時、アミノ酸または核酸
合成系遺伝子のようなものが使用できるほか、宿主が抗
生物質感受性株である時は、該抗生物質耐性を発現する
遺伝子が使用できる。

例えば、シクロヘキシド、Ｇ４１８、クロラムフェニコ
ール、プレオマイシンまたはハイグロマイシン等の抗生
物質に対して耐性を付与する遺伝子があげられる。

プラスミドが含有するアルブミンコード領域は、特にヒ
ト血清由来のアルブ果ン（ＩＳＡ）と同一または相同な
りＮＡ配列であり、例えばＩＳＡを生産することができ
る任意のヒト細胞から得られる。該ＤＮＡは染色体ＤＮ
ＡまたはｃＤＮＡである。染色体ＤＮＡはＩＳＡ遺伝子
を含有する遺伝子ライブラリーから分離することができ
、そしてＩＳＡ　　ｃＤＮＡは公知の方法を用いてｍＲ
ＮＡ経路を介して調製することができる。

プロモーターは酵母、りＹ適には世：仁左３二仁王よ一
ス０セレビシェ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡに由来する。好ましく
は、高発現酵母遺伝子のプロモーターをＩＳＡの発現の
ために使用する。即ち、ＴＲＰＩ遺伝子、Ａ　Ｄ　Ｈ，
ＩもしくはＡＤＨ汀遺伝子、酸性ホスファターゼ（１旦
０３もしくはＰＨ０５）遺伝子、または、イソチトクロ
ームＣ遺伝子のプロモーター、ガラクトース代謝系のプ
ロモーター（ＧＡＬｌ、ＣＡＬ　Ｉ　ＯもしくはＣＡＬ
７）、インベルターゼのプロモーター（ＳＵＣ２）ある
いは解糖系酵素をコードする遺伝子のプロモーター、例
えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセ
レートキナーゼ（ＰＧＫ）　、ヘキソキナーゼ、ピルベ
ートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グ
ルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３ホスホグ
リセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリホスフ
ェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼお
よびグルコキナーゼの遺伝子のプロモーター、あるいは
ａ−ファクターまたはα−ファクターをコードする酵母
接合フェロモン遺伝子のプロモーターを使用することが
できる。

また、プラスミドは宿主酵母内で自律的に複製できない
、すなわち、宿主酵母内での自律複製開始領域、例えば
２μｍ　　ＤＮＡの複製開始領域やＡ　ＲＳ　ｗＩ域（
＾ｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ）を実質的に含まない。

他の好ましい態様においては、構成物中プラスミド中に
シグナル配列を導入することもできる。

シグナル配列は、酵母インベルターゼ、α−ファクター
遺伝子のような酵母由来のシグナル配列を使用すること
ができる。また、Ｈ３Ａのシグナル配列は好適であり、
好ましくは酵母での分泌発現のために特に合成されたシ
グナル配列（特願昭６３−１０３３３９号または特願昭
６３−３３６５７号）を用いることもできる。

このシグナル配列の導入により、ＩＳＡ遺伝子の発現の
後、遺伝子産物は分泌経路に入り、そしてペリプラズム
空間に輸送される。さらに細胞壁を通しての培地中への
分泌を達成することができる。これはより収量の相当な
増加が可能となる。

さらに、細胞を破壊する必要がないので回収工程を単純
化することが可能である。

また、プラスミドは転写停止のための適当なターミネー
タ−１例えばＰＨ０５もしくはＧＡＰ−ＤＨターξネー
ターを含有する。

このプラスミドはプロモーター、Ｈ３Ａコード領域およ
び宿主染色体相同領域とは別に、細菌宿主、特に大腸菌
のための複製開始点、および遺伝的選択マーカーを含有
することもできる。大腸菌復製開始点および大腸菌のた
めの選択マーカーを酵母バイブリドベクター中に使用す
ることに関して有用な特徴が存在する。まず、大腸菌に
おける増殖および複製により大量のバイブリドベクター
ＤＮＡを得ることができ、そして第２に、大腸菌に基礎
を置くクローニング技法のすべてを用いてバイブリドベ
クターの構築を容易に行うことができる。大腸菌プラス
ミド、例えばｐＢＲ３２２等は大腸・菌複製開始点、お
よび抗生物質、例えばテトラサイタリンおよびアンピシ
リンに対する耐性をもたらす大腸菌遺伝マーカーを含有
し、そして酵母バイブリドベクターの部分として有利に
使用される。

従って、本プラスミドは、プロモーター、該プロモータ
ーに制御されるアルブミンコード領域、それに続く転写
停止のためのターミネーターを含み、かつ宿主酵母染色
体配列に相同な配列を含むものである。また、本プラス
ミドは、所望により、分泌生産のためのシグナル配列、
酵母用の選択遺伝子マーカー、大腸菌の復製開始領域、
大腸菌用選択遺伝子マーカーを含有することができる。

そして、酵母の複製開始領域は実質的に含まないもので
ある。

宿主としては酵母、特にサツカロマイセス属もしくはピ
キア属が使用される。好ましくは、栄養要求性株や、抗
生物質感受性株が使用できる。

この組換えプラスミドを用いて形質転換体を作製する方
法、ひいてはアルブミンを製造する方法は以下の通りで
ある。

組換えプラスミドを宿主酵母細胞の染色体上に導入する
。具体的には、挿入するプラスミドの有する、宿主酵母
細胞の染色体に相同な配列中の任意の部位を制限酵素処
理により切断し、直線化したプラスミドを宿主に導入す
ることが望ましい。

直線化されたプラスミドは、宿主酵母細胞染色体上のプ
ラスミドに組み込まれた領域と相同な領域に組み込まれ
る。直線化されたプラスミドは環状プラスミドより、宿
主染色体上に組み込まれる頻度が上昇する。この時使用
する宿主酵母は、挿入されるプラス果ドが担持する酵母
用選択マーカー遺伝子によって相補する変異を持った変
異株、例えば、ロイシンおよびヒスチジン要求性変異株
でかつＧ４１８感受性株であるサツカロマイセス・セレ
ビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｔｓ
ｉａｅ）　Ａ　Ｈ２２株（ａ、　ｈｉｓ　４．　ｌｅｕ
　２＋　ｃａｎ　１）等が好適に用いられる。

宿主酵母細胞の形質転換は公知の方法、例えばプロトプ
ラストポリエチレングリコール法、エレクトロポレーシ
ョン法などにより行う。

次に期待した部位へプラスくドが導入されているか否か
、および導入した遺伝子が安定であるか否かを調べる。

具体的には、サチンブロッティング法により、形質転換
に利用した宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列をプ
ローブとして、期待通りの部位へプラス砒ドが導入され
ていることを確認する。またアルブミンをコードする遺
伝子の安定性を、アルブミン産生量および栄養要求性の
回復維持を指標に調べ、形質転換体を非選択培地で数十
化培養した後でも、変化しないことを確認する。

この形質転換体を宿主として使用し、再度、アルブ逅ン
コード領域を含むプラスミドで形質転換させることがで
きる。この場合、酵母細胞染色体相同領域としては、初
めの形質転換で使用した領域以外の相同領域も使用でき
る。

この他、宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列として
、ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ＤＮＡや’ｒｙ因子（Ｔｒａｎｓ
ｐｏｓｏｎｏｆ　Ｙｅａｓｔ　ｅｌｅ＋ｍｅｎｔ）　　
も挙げられる。これらの遺伝子は細胞当り、複数個存在
するので、１回の形質転換で、複数個の目的遺伝子を宿
主染色体に組み込むことができる。

宿主として、何種類もの栄養要求変異株が取得できれば
、または何種類もの抗生物質に対して感受性を示す株が
取得できれば、それに応した領域に有用遺伝子を複数導
入することができる。

このように、宿主染色体上の複数領域に目的遺伝子を挿
入することができる。これら染色体に組み込まれた遺伝
子は、脱落することなく安定に維持され、かつ複数の遺
伝子を組み込むことにより、目的生産物を多量に取得す
ることが可能となる。

（１１）培養方法 培養はフエソドーパッチ培養によって行われる。

即ち、まず、初期培地内で（１）のＩＳＡ産生酵母を培
養し、状況に合わせて補充培地を追加していく。

初期培地はグルコースを含むものであれば特に限定され
ない。その濃度としては、１００〜１．ＯＯＯＯｍｇ／
Ｌ程度である。その他の成分としてはイーストエクスト
ラクト、バクトペブトン、カザミノ酸類（以上は、天然
培地に特有の成分である）塩類（例えば、硫安、酢酸ア
ンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグ
ネシウム、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化第
二鉄等）、ビタミン（例えば、ビオチン、ビタミンＢ１
、ビグ２ンＢ４、パントテン酸ナトリウム等）、イノシ
トール等が例示される。培地のｐＨとしては６〜７程度
が挙げられる。

補充培地もグルコースを含むものであれば特に限定され
ない。その濃度としては１０万〜１００万■／Ｌ程度で
ある。その他の成分は初期培地で例示したのと同じもの
を同様に例示することができる。培地のｐＨとしては６
〜７程度が挙げられる。

培養方法としては、Ｈ３Ａ産生酵母をまず適当な濃度で
初期培地中に存在させる。具体的な細胞濃度として０．
０１〜５０　ｇ／Ｌ程度である。

培養を始めた後は酸素消費量と二酸化炭素生成量の比で
ある呼吸商に応じて補充培地の添加量を決定していく。

具体的には呼吸商が０．９〜１．２の間で設定した数値
以下の場合は酵母（細胞）濃度の上昇に合わせて、補充
培地の添加量を決定する。具体的には、以下の式に基づ
き、補充培地の添加量を決定する。

■ Ｆ＝　−ｐＸ、ｅｕｔ （式中、Ｘｏは初期菌体濃度（ｇ／Ｌ）　、Ｖは培地！
（Ｌ）、Ｆはフィールド流速（Ｌ／ｈｒ）　、Ｙは増殖
収率（ｇ細胞／ｇグルコース）、μは比増殖速度（ｈｒ
−’）　、ｔは時間（ｈｒ）を示す）コノうち、Ｖｌ；
ｔｌ　〜１０５　Ｌ、　Ｙは０．１〜１、μは０．０１
〜０．２ｈｒ−’、Ｘｏは０．０５〜３ｇ／Ｌ。

ｔは１０〜１００時間程度が例示される。

また、呼吸商が０．９〜１．２の間で設定した数値を越
える場合、適宜補充培地の添加量を滅べしていく。

培養条件としては、温度１０〜３５°Ｃ１液存酸素量Ｏ
〜２０ｐｐｍ、時間１０〜１００時間程度が例示される
。

当該補充培地の増減のコントロールは、好ましくはコン
ピューターにて制御され、それは例えば図１に示した如
きフィードコントロールプログラムおよび図２に示した
如き培養制御システムにて行われる。

（ｉｊ）産生Ｈ３Ａ 本発明により産生されるＨ３ＡＩＩは８００〜１２００
■／Ｌ程度である。

〔作用・効果］ 本発明により、フエツドーパッチ培養による高密度培養
が可能となり、ＩＳＡ産生酵母を乾燥菌体重量１００　
ｇ／Ｌ程度の高密度培養の結果、従来にないＩＳＡの産
生量の増加を実現することができる。特に特に合成培地
を使用した場合には菌体当たりのＨ３Ａ産生量を格段に
増加させることができる。

従って、本発明の方法はＩＳＡを産生ずる工業的製法と
して極めて有用である。

〔実施例〕

参考例 （＋）　Ｉ　Ｓ　Ａ産生酵母の調製 ■プラスミド型ベクター保持株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２ｈ／ｐＹ［０３
２株）ａ、ＡＨ２２ｈ／ｐＹ１０３２株の調製５ＵＣ２
のＵＡＳ、ｍＧＡＰ−ＤＨプロモーター、５ＵＣ２シグ
ナル及びその下流にＩＳＡのＣＤＮＡを持つＨ３Ａ分泌
発現用ベクターであるｐＹＩＯ３２（図３参照）を用い
て合成培地で菌体増殖可能なＡＨ２２ｈ株を形質転換し
、Ｈ３Ａ分泌産生量の高いクローンを選択した。

■組み込み型ベクター保持株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＴＭＳ　３３−１ｈ株〉本
方法において多くの技法、反応および分析方法は当業界
においてよく知られている。特にことわらない限り、全
ての酵素は商業的供給源、たとえば宝酒造：ニューイン
グランド　バイオラプス（ＮＥＢ）　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）　）マサチューセ
ッツ、米国；アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｃｈａｍ）、英
国およびベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅ
ｓ（ＢＲＬ））　、メリーランド、米国から入手するこ
とができる。

酵素反応のための緩衝液および反応条件は特に断らない
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。

プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、プラークハイ
ブリダイゼーション法、電気泳動法およびＤＮＡのゲル
からの回収法は、「モレキュラークローニング」コール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ−（ｒＭｏｌｅｃｕｌ
ｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌ
（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）に
記載されている方法により行った。酵母の形質転換法は
、「メソッド・イン・イースト・ジェネティクスＪコー
ルドスプリングハーバ−ラボラトリ−（’Ｍｅｔｈｏｄ
　ｉｎ　ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ」）　　（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）（１９８１）に記載されている方法で行った。

それぞれ次の文献に記載の方法、それに準じる方法によ
るか、または市販のものを使用した。

ＧＡＰＤ）ｌプロモーター：　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　１１
．Ｊ、　ａｎｄ　Ｈｏ１ｌａｎｄ。

Ｊ、Ｐ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、、　　２
５４．１２．５４６６　（１９７９）Ｈｏｌｌａｎｄ、
　１１．Ｊ、　ａｎｄ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ｊ、Ｐ、、
　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　出、　１９．９８３９　（１９７９）、
　　特開昭６３−８４４９８号明細書 ＳＵＣ２シグナル配列：特開昭６０−４１４８８号明細
書特開昭６３−８４４９８号明細書 ＩＩｓ＾遺伝子：特開昭６２−２９９８５号明細書Ｐ１
１０５ターミネーター：特開昭６２−１５１１８３号明
細書Ｇ−４１８耐性遺伝子：　Ｏｋａ＋　Ａ、　＋　Ｓ
ｕｇｉｓａｋｉ、　Ｉｌ、　ａｎｄＴａｋａｎａｍｉ、
　Ｍ、＋　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、＋　１４７＋　
２１７（１９８１）＋　　Ｊｉｍｅｎｅｚ＋　　Ａ、ａ
ｎｄ　Ｄａｖｉｅｓ、Ｊ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　２８７．８６９　（１９８０）、特開
昭６１−４０７９３号明細書 ＴＲＰ　１　　ニブラスミドｐＢＴｒ−１０由来（ベー
リンガーマンハイム社より市販） ＬＥＵ２ニブラスくドｐＢＴＩ−１由来（ベーリンガー
マンハイム社より市販） 大腸菌複製開始領域及びアンピシリン耐性遺伝子：ｐＨ
ｃ　１９　（宝酒造より入手） ［＋１１ゑ工立ムま上型構築 各プラスミドｐＭＭ−００６およびｐｌ（Ｏ−０１１の
構築はｐＵｃ１９から「モレキュラークロニング」コー
ルドスプリングハーバーラボラト’Ｊ　−（１９８２）
　）に記載の方法に準じて常法通り行った（第４（ａ）
および（ｂ）参照）。

プラスミドＰＭＭ−００６は、宿主酵母細胞の染色体配
列と相同な配列として、ロイシン合成系遺伝子のＬＥＵ
２を含み、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの支配下に５ＵＣ
２シグナル配列、）（ＳＡ構造遺伝子およびＰＨ０５タ
ーミネータ−を連結したものである。

プラスミドｐＨ○−０１１は宿主酵母細胞の染色体配列
と相同な配列として、トリプトファン合成系遺伝子のＴ
ＲＰＩを含み、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの支配下にＳ
、ＵＣ２シグナル配列、Ｈ３Ａ構造遺伝子およびＰＨ０
５ターミネータ−を連結したもので、酵母選択マーカー
遺伝子として、０４１Ｂ耐性遺伝子を含むものである。

プラスミドｐＭＭ−００６およびｐＨｏ−０１１は、平
成元年（１９８９）４月２８日に通産省工業技術院微生
物工業技術研究所へ各々次のとおり国際寄託されている
。

■微生物名：ピーエムエム００６／イー・コーリジエイ
エム１０９ （Ｐ１０９（Ｐ／Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９）受託番号
：微工研条寄第２４０４号 （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２４０４） ■微生御名：ビーエッチオー０１１／イー・コーリエッ
チビー１０１ （ｐＨＯＯ１１／Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ）受託番号
；微工研条寄第２４０Ｔ′４ （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２４０５） 宿主として、サツカロマイセス・セレビシェＡＨ２２株
を用いた。

サツカロマイセス・セレビシェＡＨ２２株は、接合型が
ａ型であり、ヒスチジン合成系遺伝子（ｈｉｓ　４）、
およびロイシン合成系遺伝子（ｌｅｕ　２）に変異を持
つ。従って、培養液中に、ヒスチジンおよびロイシンを
添加しなければ増殖することができない。

ＩＳＡ分泌発現用プラスミドｐＨｏ−０１１を酵母サツ
カロマイセス・セレビシェＡ１１２２株の染色体中に以
下の方法により導入した。

後記［Ｖ］　に記載の方法と同様の方法によった。

但し、次の点で［Ｖ］　に記載の方法と異なる。

宿主：ＡＨ２２ プラスミド：ｐＨｏ−０１１ プラスミド導入時：　ｐＨｏ−０１１中のＴＲＰ　ｌ遺
伝子上のユニークサイトであるＥｃｏ　ＲＶで消化し、
プラスミドを線状にして導入。

形質転換培地：　ｙｐｏメディウムに１．２Ｍソルビト
ール、３％ノープルアガー、０．２％リン酸１カリウム
添加したものに形質転換ブラストを懸濁。

プレートはＹＰＤメディウムに１．２　Ｍソルビトール
、３％ノープルアガー、１００μｇ／ｍｌ　Ｇ−４１８
を添加したもの。

ヒト血清アルブミン産生Ｎ：６０μｇ／ｍｌかくして得
られた形質転換体をＴＭＳ−２６−１０と命名した。

［ＩＶ］　　　　　　　ＴＭＳ−２６−１０のスクＩ−
ニン■サザンブロッティング法により、Ｈ３Ａ遺伝子が
どこに導入されたかを調べたところ、確かに染色体中の
Ｔ　ＲＰ　ｌ　？ｉ１域に導入されていることが確認で
きた。

■Ｈ３Ａ遺伝子の安定性をＩＳＡ産生量とＧ４約６０世
代培養した後でも、１００％のＨ３Ａ遺伝子が保持され
ていた。

［Ｖ］　　−スミ　　ＭＭ−に ＹＰＤメディウム（イーストエキストラクト１０ｇ、バ
タトペプトン２０　ｇを水に溶解し９００ｄとした後オ
ートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌した２０
％グルコース１ｏｏｙと混合した。）５０戚中３７°Ｃ
１−夜振盪培養したサツカロマイセスセレビシェＡＨ２
２を遠心し、得られた細胞を水２０ｍ１に懸濁後、再度
遠心して細胞を得た。これを１０ｍ１ｌの５０ｍＭジチ
オスレイトール、１．２門ソルビト一ル２５ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８，５に懸濁し、３０°Ｃで１０分分間中か
に振盪した。遠心により細胞を集め、１．２門ソルビト
ールｌ〇−に懸濁し、再度遠心により細胞を集めた。細
胞をｌ〇−の１．２Ｍソルビトールに懸濁し、遠心によ
り細胞を集めた。細胞を１０Ｗ１の０．２ｍｇ／ａｆｆ
ｉザイモリアーゼ１００Ｔ、　１．２Ｍソルビトール、
１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．１　Ｍクエン酸ナトリウ
ム、ＰＨ５，８に懸濁後、３０°Ｃで１時間穏やかに振
盪した。

遠心で細胞を集め、１．２Ｍソルビトール、次いで１０
ｍＭ塩化カルシウム、１．２門ソルビトール各１０ｄで
洗浄し、遠心で細胞を集めた。細胞を１ｍｌの１０−門
塩化カルシウム、１．２Ｍソルビトールに懸濁した。懸
濁液１００μｌを滅菌試験管にとり、５μｌのＤＮＡ溶
液（ＴＲＰ　１遺伝子上のユニークサイトであるＫｐｎ
　ｌで消化し、を線状にして（５μｇのｐｔ＋ｏ−。

１１を５μｇ含む。）と混合し、室温に１５分間静置し
た。更に、１．２ｍの２０％ポリエチレングリコール４
０００．１〇−塩化カルシウム、１０１Ｍトリス−塩酸
、ｐＨ７，５を加え穏やかに混合後、室温で２０分間静
置した。遠心で細胞を集め、０．１　ｄの１．２Ｍソル
ビトール、１０ｍＭ塩化カルシウム含有ＹＰＤメディウ
ムに懸濁し、３０°Ｃで３０分分間中かに振盪した。懸
濁液１．５．１０．２０および５０μｌをそれぞれ寒天
培地と混合して、４５℃に保温した１０成のロイシン不
含培地からなるプレートに拡げた。プレートが固化した
ら、３０°Ｃで３日間静置培養した。形成したコロニー
を爪楊枝で採取し、３Ｉｎ１の０．７％イーストナイト
ロジェンベース、２％グルコースに懸濁後、３０°Ｃで
２日間振盪培養した。そのうちの１．５７を遠心し、細
胞を集め、３−のＹＰＤメディウム（イーストエキスト
ラクト１０ｇ、バタトベプトン２０ｇを水に溶解し、９
００　ｄとした後オートクレーブ滅菌し、別にオートク
レーブ滅菌した２０％デキストロース１００　ｄと混合
した。〉に懸濁し、３０°Ｃで振盪培養した。培養上清
のｌ５Ａ４度をＩＩＰＩＩＡ法にて測定したところ、３
日日で最高８０μｇ／ｄのＨ３Ａが検出された。

かくして得られた形質転換体をＴＭＳ−３３−１と命名
した。

■サザンブロッティング法によりＩＳＡ遺伝子がどこに
導入されたかを調べたところ、確かに染色体中のＬＥＵ
　２領域に導入されていることが確認できた。

■Ｈ３＾遺伝子の安定性をＨ５＾産生量とロイシン非要
求性を指標に測定したところ、非選択培地で約６０世代
培養した後でも、１００％のＩＳＡ遺伝子が保持されて
いた。

従って、ＴＭＳ−３３−１は宿主酵母サツカロマイセス
・セレビシェＡＨ２２株の染色体の３箇所、すなわちＬ
　Ｅ　Ｕ　２６Ｍ域およびＴＲＰ１６１域にＨ３Ａ遺伝
子が導入されたものであることが確認できた。

従って、Ｔ？ｌＳ−３３−１は宿主酵母サツカロマイセ
ス・セレビシェＡＨ２２株染色体の３箇所、すなわちＬ
ＥＵ２領域およびＴＲＰＩ領域にＨ５Ａ遺伝子が導入さ
れたものであること力＋Ｅ１認できた。

さらにＴＭＳ−３３４株のヒスチジン要求復帰変異株Ｔ
ＭＳ−３３−１ｈを次の要領で取得した。即ち、ＴＭＳ
−３３１株を非選択培地にて一晩成育させた後、集菌し
、十分洗浄後選択プレート（即ち、ヒスチジンを含まな
い培地からなるプレート）を塗布する。選択プレートを
３０’Ｃにて培養し、生育したヒスチジン要求復帰変異
候補株よりＴＭＳ−３３−１株を取得した。

（２）培地組成 （ａ）前培養用培地（ＹＮＢ　　ｂｒｏｔｈ）Ｂａｃｔ
ｏ−Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ（ＤＩＦ
ＣＯ製）６．７ｇを１００ｄの蒸留水に溶解し、除菌濾
過したものと、グルコース２０ｇを蒸留水に溶解し９０
０　ｍｌとした後、加熱滅菌したものを混合した。

（ｂ）　　表１　（ＢＡＴＣＨ培養用天然培地）成分 濃度（■／１） グルコース Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ Ｂａｃｔｏ−Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ Ｈｚｐｏ４ ＭｇＳＯａ　　・７Ｈ２Ｏ ＺｎＳＯａ　　’ＩＨｔＯ ＣｕＳＯｇ　　・５ＨｚＯ ビオチン ビタミンＢ１ ビタミンＢ。

パントテン酸ナトリウム イノシトール ２０．０００ ７．５００ ６．５００ ９．０００ １０．０００ ２．０００ ００ ０．１ ０ ０ ０ ｐｌ＋６．５ （Ｃ）表２ （ ＢＡＴＣＩ＋培養用合戒培地） 合成 濃度（■／１） グルコース Ｎ１１４Ｃ８３ＣＯＯ ＫＨ２ＰＯ４ ＣａＣＩｇ　　・２８！０ にＣＩ ａＣ１ 陶Ｓ０４　　・７Ｈ２０ ＺｎＳＯ，・マＬＯ ＣｕＳＯ４・５１１ｇ０ ＦｅＣｌ２・６ＦｌｚＯ ビオチン ビタミンＢ ビタミンＢ。

パントテン酸ナトリウム イノシトール ２０．０００ ０００ ００００ ００ ０００ ００ ０００ ００ ０ ０．１ ０ ０ ０ 成分 グルコース Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ Ｂａｃｔｏ−Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ Ｋｌ！ＰＯ４ ＣＩ ａＣＩ 門ｇｓＯ４・７１１２０ ＣａＣ１゜ Ｚｎ５Ｏａ　　７８ｚＯ ＣｕＳＯａ　　Ｈ５１１ｔＯ ｅＣＩｓ ビオチン ビタミンＢ ビタミンＢ。

パントテン酸ナトリウム イノシトール 濃度（■／ｆｆ１） １　、０００ １５．５００ ３０００ １８．０００ ２０．０００ ４．０００ ００ ４　、０００ ００ ００ ０ ９ ０．１ ０ ０ ０ ｐｌ＋６．５ （ｄ）−２ 表４ （ ＦＥＥＤ用培地組戒） 成分 濃度（ｍｇ／ｌ） グルコース Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ Ｂａｃｔｏ−Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ ＭｇＳＯａ　　・７ＨｔＯ ＺｎＳＯｓ　　’　７１１．０ Ｃａｃｌ＊ Ｃｕ５Ｏｎ　　・５８ｉＯ ビオチン ビタミンＢ ビタミンＢ。

パントテン酸ナトリウム イノシトール ５０．０００ ６０００ ６０００ ８０００ ００００ １．０００ ００ ０ ００ ０ ００ ００ （ｅ）、　ＦＥＤ−ＢＡＴＣＩ（培養用合成培地（ｅ）
−１表５　（ＢＡＴＣＨＩ＠養用培地組成）グルコース （Ｎｔ１４）ｚｓＯａ Ｉ２ＰＯ４ ＣＩ ａＣ１ 門ｇｓｏ、　　・７Ｈ２０ ａＣ１ｚ ＺｎＳＯｎ　　・７８２０ ＣＩＩＳＯ４・５１ｈＯ ｅＣ１３ ビオチン ビタミンＢ１ ビタミンＢ６ パントテン酸ナトリウム ｉ　、　ｏｏ。

２．０００ ２ｏ、ｏｏ。

４　、０００ ００ ０００ ００ ００ ０ ９ ０．２ ０ ０ ｐＨ６，０ （ｅ）−２ 表６ （ ＦＥＥＤ用培地組戒） 成分 濃度（■／１） グルコース Ｍｇ５Ｏ，・ＩＨｚＯ ＺｎＳＯａ　　’１１１ｔＯ ａＣ１ｇ ＣｕＳＯｓ　　・５１１ｚＯ ビオチン ビタミンＢ１ ビタミンＢ。

パントテン酸ナトリウム イノシトール ５００．０００ ２０．０００ ０００ ００ ０ ００ ０ ００ ００ 実施例１ ａ、使用菌株 ５ａｃｃｈａｒｏ−ｙｃｅｓ 使用した。

ｂ、使用培地 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｔｔ２２ｈ／ｐＹ１０３２株
をＢＡＴＣ）！培養用天然培地（表１）を使用した。

Ｃ１培養方法 （１）前培養 適当量の保存菌株を２木の１００　ｍＶＮＢ　ｂｒｏｔ
ｈを含むバッフル付３００　ｍｆｔ容三角フラスコに植
菌、３０　’Ｃにて２４時間振盪培養し、遠心集菌後、
１０戚の滅菌水に懸濁して１１０回分培養用培地に植菌
した。

（２）本培養 回分培養用培地（表１）ｔｚに菌体を接種し、３１容も
ニジャーーファーメンター（バイオマスターＤ型、ＡＢ
ＬＥ社製）を用いて通気攪拌培養した。

通気量を１　ｖｖｍに設定し、攪拌速度は溶存酸素濃度
が１０ρｐｌＩ１以上となるように制御した。攪拌速度
が上限に達した後は、上限値に固定した。培養中、ｐＨ
は３Ｎ　　ＮａＯＨを添加することによりｐＨ６，５で
定値制御した。消泡は消泡剤（アデカノール、旭電化工
業）を必要に応じて少量添加することで実施した。

（３）菌体濃度の測定 任意の培養時間で培養液をサンプリングし、蒸留水で適
当に希釈したのち分光光度計（島津製、ＵＶ２４０型）
を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。乾燥菌
体濃度への換算は予め求めておいた較正直線を用いて実
施した。

（４）Ｈ５ＡｉＪ度の測定 任意の培養時間で培養液をサンプリングし、１５．００
０ｒｐｍ　、５分間遠心後、得られた上清を用いてＲＰ
ＨＡ法により測定し、標準Ｉ　Ｓ　Ａ　（Ｍｉｌｅｓ社
）との比較によりサンプル中のＩＳＡ４度をｍｇ／ｌで
表示した。

この条件にて得られた菌体量は１０　ｇ　−ｄｒｙ　ｃ
ｅｌｌ／１であり、その時のＨ３Ａ産生量は８０ｍｇ／
ｆであった。（表７） 実施例２ 使用菌株をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　ＴＭＳ　３３−１ｈ株とした以外、実施例１
と同し方法にてＩＳＡを産生させた。本菌株を使用した
場合も得られた菌体量は１０　ｇ　−ｄｒｙ　ｃｅｌｌ
／　ｌであり、その時のＩ　Ｓ　Ａ産生量は８０■／１
であった。（表７）実施例３ 使用培地組成をＢＡＴＣＨ培養用合戊培地脅威２）とし
た以外、実施例２と同じ方法にてＨＳＡを産生させた。

本菌株を使用した場合も得られた菌体量はｌ　Ｏｇ　　
ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／　ｉ！であり、その時のＩＳＡ産生
量は２０■／１であった。（表７）実施例４ 使用菌株をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　Ａｌ１２２ｈ／ｐＹ＋０３２株とした以外、
実施例３と同じ方法にてＨＳＡを産生させた。本菌株を
使用した場合も得られた菌体量は１０　ｇ　　ｄｒｙ　
ｃｅｌｌ／　ｌであり、その時のＩＳＡ産生璽は２０■
／ｌであった。（表７）実施例５ （１）使用菌株 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　
ＡＨ２２ｈ／ｐＹ１０３２株を使用した。

（２）使用培地組成 ＦＥＤ−ＢＡＴＣＨ培養用天然培地（表３、表４）を使
用した。

（３）培養方法 （１）前培養 適当量の保存菌株を２本の１００　ｒｎＩＹＮＢ　ｂｒ
ｏｔｈを含むバッフル付３００−容三角フラスコに植菌
、３０℃にて２４時間振盪培養し、遠心集菌後、１〇−
の滅菌水に懸濁して１１の回分培養用培地に植菌した。

（２）本培養 回分培養用培地（表３）１Ｎに菌体を接種し、３１容ミ
ニジャー−ファーメンタ−（バイオマスターＤ型、ＡＢ
ＬＥ社製）を用いて通気撹拌培養した。

通気量を２　ｖｖｍに設定し、攪拌速度は溶存酸素濃度
がｘｏｐｐ−以上となるように制御した。攪拌速度が上
限に達した後は、上限値に固定した。培養中、ｐＨは３
Ｎ　　ＮａＯＨを添加することによりｐｌ＋６．５で定
値制御した。消泡は消泡剤（アデカノール、旭電化工業
）を必要に応して少量添加することで実施した。

また、呼吸商（ＲＱ）が任意の値で一定となるように制
御用プログラムにまり流加培地（表４）を添加した。呼
吸商はＥＸＨＡｕＳＴ　０ＸＧＥＮ　ＣＡＲＢＯＮＤＩ
ＯＸＩＤＥＭＥＴＥＲ（ＥＸ１５６２型、ＡＢＬＥ）を
用イテ測定したＯ８、ＣＯ，濃度をパーソナルコンピュ
ータ（ＦＭＲ−６０ＨＤ型、富士通）により３０秒毎に
データ収集後計算した。その結果によりＦＥＥＤ用培地
の添加量の増減を実施した。

また、式中の各パラメーターは Ｖ＝２　（Ｌ） Ｙ＝０．４（ｇ細胞／ｇグルコース） μ＝０．１２　（ｈ　ｒ−’） Ｘ　ｅ　−０，３（ｇ　／　Ｌ　） に設定した。

（４）菌体濃度の測定 任意の培養時間で培養液をサンプリングし、蒸留水で適
当に希釈したのち分光光度計（品性製、ＵＶ２４０型）
を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。乾燥菌
体濃度への換算は予め求めておいた較正直線を用いて実
施した。

（５）　　ＨＳ　Ａ　１度の測定 任意の培養時間で培養液をサンプリングし、１５．００
Ｏｒｐｍ　、５分間遠心後、得られた上清を用いて逆受
身ヒツジ赤血球凝集反応（ＲＰＨＡ）により測定し、標
準Ｉ　Ｓ　Ａ　（Ｍｉｌｅｓ社）との比較によりサンプ
ル中のＨＳＡＩ度を■／ｌで表示した。

測定方法は鷲見らの報告に従って実施した。

この条件にて得られた菌体量は８０ｇ　−ｄｒｙ　ｃｅ
ｌｌ／ｌであり、その時のＨ３Ａ産生量は４００ｍｇ／
ｌであった。（表７） 実施例６ 使用菌株をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　ＴＭＳ　３３−１ｈ株とした以外、実施例５
と同じ方法にてＩ　Ｓ　Ａを産生させた。本菌株を使用
した場合も得られた菌体量は８０　ｇ　−ｄｒｙ　ｃｅ
ｌｌ／　Ｉ！、であり、その時のＩＳＡ産生量は８００
■／ｌであった。（表７）実施例７ 使用培地をＦＥＤ−ＢＡＴＣＩ＋培養用合或培地（合成
、表６）とし、培養中ｐｌ＋が６．０となるように１４
％ＮＨ，ＯＨにてｐＨ調整した以外、実施例６と同し方
法にてＩＳＡを産生させた０本菌株を使用した場合も得
られた菌体量は１３０　ｇ　−ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／　１
であり、その時のＨ３Ａ産生量は１，２００　＋ｎｇ／
ｌであった、（表７、図４） 実施例８ 使用菌株をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　ＡＨ２２ｈ／ｐＹｆ０３２株とした以外、実
施例７と同じ方法にてＩＳＡを産生させた。本菌株を使
用した場合も得られた菌体量は８０　ｇ　−ｄｒｙ　ｃ
ｅｌｌ／　Ｑであり、その時のＨ３Ａ産生量は４００１
ｇ／ｌであった。（表７） 実施例９ 実施例７において得られた上清中のＩＳＡの分析を実施
した。

（１）　　サンプル 実施例７の６４時間目の培養液をサンプリングし、１５
．００Ｏｒｐｍ　、５分間遠心後、得られた上清を使用
した。

（２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＴＥＦ
ＣＯ製５ＤＳ−ＰＡＧ［ｉ　ｌ１ｌｌａｔｅ　４　２０
％を使用したサンプルを２−メルカプトエタノールによ
る還元状態で泳動を行った。泳動はフナコシ社製プリキ
ャストゲル電気泳動装置を用い、添付文書に記載の方法
に従って行った。

（３）銀染色 和光純薬製銀染色キットワコーを使用し、添付文書に記
載の方法にて行った。

（４）　　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ−次抗体
として抗ＨＳＡウサギポリクローナル抗体（ｆｌＡＫＯ
製）、二次抗体としてペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩ
ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）ヤギポリクローナル抗体を使用した。

また、発色は４−クロロｌ−ナフトール、および過酸化
水素水を使用した。

上記の方法にて分析した結果、本培養上清にはＨ３Ａ以
外の夾雑蛋白質は少な（、また、培養中のＩＳＡの分解
も非常に少ないことが明らかとなった。

表７　　ｒＨ３Ａ産生量の比較（Ｊａｒ−Ｆｅｒｍｅｎ
ｔｅｒ）ＢＡＴＣＨＦＥＤ−１３ＡＴＣ１１ （ ） 内はＩｇＨ３＾／ｇ−ｃｅｌｌ

【図面の簡単な説明】

図１はフィードコントロールプログラムの概要を示す。 図２は培養制御ｎシステムの概要を示す。 図３はＨ３Ａ分泌発現ベクターｐＹＩ０３２の制御１［
ｔ４［素地図を示す。 図４（ａ）および４山）は、それぞれプラスミドｐＭＭ
−００６およびプラスミドｐＨ○−０１１を示す。 図５は７ＭＳ３３−１０株の台底培地を使用したＦＩｌ
、ＤＢＡＴＣＨ培養の結果を示す。 漫 図 ＲＱＳ　　吟口晟商 手続補正書 Ｃ方式） ％式％ 発明の名称 ヒト血清アルブミンの製造方法 補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　大阪市中央区今橋−丁目３番３号氏名（名称）　
株式会社　くトリ＋字 （場末ビル） 置　　（０６）　２２７−１１５６ ６゜ 平底１年１１月２８日 補正の対象 （発送日） ７゜ 補正の内容 （１）明細書第１８頁第１４〜１５行目に「　　　　　
Ｖ 「 （２）明細書第２０頁第２行目に「特に特に台底台地を
使用した場合には」とあるのを「特に台底培ｔ１を使用
した場合には」と補正する。 （３）明細書第２３頁第１５行目に「第４（ａ）およい
）参照」とあるのを１図４（ａ）および図４（ｂ）参照
」と補正する。 （４）明細書第３０頁第１５行目に「Ｔ門Ｓ−３３−１
株」あるのをｒＴＭＳ−３３−１ｈ株」と補正する。 （５）明細書第３４頁表４中に 「 成分　　　　　　　　　　　濃度（■／１）とあるのを 「 取分 濃度（ｌａｇ／ｌ、４１） と補正する。 （６）明細書第４３頁第１〜２行目に 「あった、（表７、図４） 実施例８　　　　　　　　　　　」とあるのを「あった
（表７）。各項目について４時間毎に測定を行ない、図
５に本実施例の経時変化を表すグラフを示した。尚、図
中Ｆは任意の３分間におけるフィードポンプの作動時間
（秒）を、ＤＣＷは菌体濃度Ｃｇ／ｌ）を表す。 実施例８　　　　　　　　　　　　」と補正する。 （７）明細書第４５頁第１０〜１１行目に「図５は７Ｍ
Ｓ３３−ＩＧ株の合成培地を使用したＦＥＤ−ＢＡＴＣ
Ｈ培養の結果を示す。」とあるのを「図５はＴＭＳ−３
３−１ｈ株を合成培地にてフェト−バッチ培養した際の
経時変化を表すグラフである。」と補正する。 （８）図１および図５を別紙の通り補正する。 図 ＲＱ　：　ロ宇口綾南

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト血清アルブミン遺伝子を担持するプラスミド
   を用いて形質転換した酵母をフェッドーバッチ培養によ
   り培養してヒト血清アルブミンを採取することを特徴と
   するヒト血清アルブミンの製造方法。
2. （２）酸素消費量と二酸化炭素生成量の比である呼吸商
   として０．９〜１．２の任意の数値を設定し、呼吸商が
   当該設定数値を越えない場合には酵母濃度の上昇に合わ
   せてグルコース含有培地の補充を増加させ、呼吸商が当
   該設定数値以上の場合はグルコース含有培地の補充を減
   らすことを特徴とする請求項（１）のヒト血清アルブミ
   ンの製造方法。