KR20010073720A

KR20010073720A - 변이주 대장균내에서의 변형된 ｎａｒ 프로모터로이루어진 산소의존형 프로모터계의 개발 및 이에 의한단백질 제조 방법

Info

Publication number: KR20010073720A
Application number: KR1020000002513A
Authority: KR
Inventors: 이종원; 장호남; 한세종
Original assignee: 이종원; 장호남; 이우기; 이원바이오텍주식회사
Priority date: 2000-01-19
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2001-08-01
Also published as: KR100352058B1

Abstract

본 발명은 미호기 조건 (microaerobic condition)에서 유도되는 변형된 산소의존형 nar 프로모터를 가진 변이형 대장균의 유가식 배양에 의한 단백질 제조방법에 관한 것으로 nar 프로모터는 -10, -35 지역을 변형시킨 pMW618과 대장균은 질산염환원효소의 발현에 관여하는 조절단백질의 하나인 NARL이 발현되지 못하도록 변이된 narL^-변이주를 이용하여 질산염이 첨가되지 않은 조건에서 흡광농도(OD₆₀₀)로 35 수준까지 대장균을 호기조건에서 배양한 후 낮은 용존산소 수준인 미호기 조건과 호기조건을 교대로 적용하여 OD₆₀₀=160에서 베타유당분해효소 비활성도가 58,000 밀러 단위가 되며 이 값은 전체 단백질의 약 45%에 달하는 양이다.

Description

변이주 대장균내에서의 변형된 ｎａｒ 프로모터로 이루어진 산소의존형 프로모터계의 개발 및 이에 의한 단백질 제조 방법 {Development of an oxygen-dependent inducible promoter system, the modified nar promoter in a mutant Escherichia coli and its application to porduce recombinant proteins}

본 발명은 미호기조건 (microaerobic conditions)에서 발현 유도되는 변형된 nar 프로모터를 갖는 변이형 대장균의 유가배양에 의한 단백질제조방법에 관한 것이다. 본 발명자가 이미 특허등록 (등록번호 특 0173845, 등록일 : 1998년 11월 02일)한 '산소의존형 유도성 프로모터에 의한 단백질의 제조방법' 및 출원한 (출원번호 제97-58550) '유가식 배양에 의한 산소의존형 유도성 프로모터로부터의 단백질 제조방법'에서 제시한 바와 같이 nar 프로모터를 가지는 플라즈미드 pMW61이 대장균 RK5265에 형질전환된 대장균계 (pMW61/RK5265, 한국과학기술연구원 수탁번호 KCTC8723P)를 이용한 회분식 단백질 제조방법에서는 1%의 질산염이 포함되고 용존산소 (dissolved oxygen, DO) 수준이 80%인 호기조건에서 OD₆₀₀=1.7까지 상기 대장균을 배양할 때까지는 nar 프로모터의 유도 (induction)는 억제되지만 이후 용존산소 수준을 1-2%로 낮추면 단위세포 당, 단위부피 당 nar 프로모터의 유도는 극대화 되었다. 유가식 배양에서도 1% 질산염이 포함되고 용존산소 수준이 80%인 호기조건에서 OD₆₀₀=35 까지 대장균을 배양한 후 미호기조건과 호기조건을 번갈아 적용시키면 nar 프로모터가 최대로 유도되었다.

회분식 배양의 경우 유도 6시간 후에 세포농도가 OD₆₀₀=3.2가 되었고, 베타유당분해효소의 비활성도는 36,000 밀러단위였고 유도율은 300 이였으며 이것은 발현된 베타유당분해효소가 전체 단백질의 약 35%에 해당되는 것이었다. 유가식 배양의 경우 유도 15시간 후에 세포농도가 OD₆₀₀=135가 되었고, 베타유당분해효소의 비활성도는 40,000 밀러단위였고, 유도율은 40이였으며 이것은 발현된 베타유당분해효소가 전체 세포단백질의 약 35%에 해당되는 것이었다.

본 발명자는 상기와 같은 nar 프로모터를 가진 대장균의 회분식 및 유가식 배양을 통한 단백질 제조 방법에서 질산염의 첨가가 단백질의 최대 발현이 필수적이라는 점에 착안하여 본 발명을 완성하였다. 질산염은 비록 저렴한 가격이지만 첨가하지 않는 편이 첨가하는 것보다는 유리하고, 질산염에 의한 토양 및 수질의 오염 가능성을 줄일 수 있기 때문에 산소농도의 조절만으로 유도 가능한 nar 프로모터/대장균 시스템을 구상하고 이를 제작하여 그 특성을 회분식 및 유가식 배양을 통해 조사하였다.

용존산소농도의 조절만으로 nar 프로모터를 유도시키기 위하여 nar 프로모터를 변형시키고 대장균도 변이된 균주를 이용하여 각각의 조합에 대하여 유도·발현특성을 회분식 및 유가식 배양을 이용하여 규명하고 단백질 생산을 위한 최적의 조건을 찾아야 한다.

표 1은 본 발명에 사용된 대장균 및 플라즈미드의 종류를 나타내는 표

도 1은 회분식 배양에서 다양한 종류의 플라즈미드와 대장균의 조합이 nar 프로모터의 유도에 미치는 영향을 나타내는 그래프

도1a, b: 대장균 RK4353과 이로부터 유도된 돌연변이 균주들을 이용한 경우에서의 베타유당분해효소의 발현율 (a)과 그 유도율 (b)

도1c, d: 대장균 W3110과 이로부터 유도된 돌연변이 균주들을 이용한 경우에서의 베타유다분해효고의 발현율 (a)과 그 유도율 (b)

도 2는 유가식 배양에서 대장균 종류가 nar 프로모터의 유도에 의한 베타유당분해효소의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프

도2a: pMW618/RK5278

도2b: pMW618/W3110narL^-

도2c: pMW618/JM107narL^-

도 3은 유가식 배양에서 세포농도 및 유도 전후 용존산소 수준이 nar 프로모터의 유도에 미치는 영향을 나타내는 그래프

도3a: pMW618/W3110narL^-계에서 발현전 세포농도가 600nm에서의 흡광도가 18에서의 발현정도

도3b: pMW618/W3110narL^-계에서 발현전 세포농도가 600nm에서의 흡광도가 80에서의 발현정도

도3c: pMW618/W3110narL^-계에서 발현전의 용존산소농도를 50%로 유지하였을 때의 발현정도

도3d: pMW618/W3110narL^-계의 발현 후의 용존산소농도를 10%로 유지하였을 때의 발현정도

도 4는 발현된 베타유당분해효소의 밴드를 나타내는 사진

본 발명은 상기와 같은 여러 조건들을 검토하여 nar 프로모터를 이용하여 용존산소농도의 조절만으로 단백질을 제조하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

이하 본 발병의 구성을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하고자 하나, 본 실시예에 국한되는 것은 물론 절대 아니다. 우선, 본 발명에서 사용된 균주, 플라즈미드, 배양조건, 측정방법을 서술한 후에 구체적인 실시예를 기술하고자 한다.

1. 박테리아 균주 및 플라즈미드

본 발명에 사용된 균주 및 플라즈미드는 표 1에 잘 정리되어 있다. 이중 pMW61은 특허 등록된 등록번호 특 0173845호에서 이용된 플라즈미드이며 대장균 RK5265에 형질전환된 형태로 1996년 1월 11일 자로 한국과학기술연구원에 수탁번호 KCTC8723P로 기탁되어있다. 플라즈미드 pMW61과 pMW618은 pBR322를 기본 골격으로저항성 마커로 암피실린 저항성 유전자를 지니고 있으며, nar 프로모터와 베타유당분해효소를 발현하는 lacZ 유전자가 하류에 클로닝된 것이다. pMW618은 pMW61의 -35 및 -10 지역을 콘센서스 서열 (consensus sequence)로 바꾼 것이다

2. P1 형질도입 (transduction)에 의한 변이 대장균 제작

W3110, JM107 등의 narL^-, narG^-, narL^-narG^-변이주는 박테리오파아지 P1을 이용한 일반적인 형질도입을 통해 제작하였다. 변이주 narL^-를 만들기 위한 형질전환 파아지는 narL유전자에 삽입된 Tn10 트랜스포존을 가진 대장균 RK5268에 감염함으로써 준비되었다. 변이주 narG^-를 만들기 위한 형질전환 파아지는 narG 유전자에 삽입된 Tn5 트랜스포존을 가진 대장균 EE1에 감염함으로써 준비되었다. 그리고 나서 W3110, JM107을 형질전환 파아지로 감염시키고 항생제가 있는 고체배지에서 원하는 균주를 선택하였다.

3. 배지 및 배양조건

루리아브로스 (LB) 배지 (10 g/L 박토트립톤, 5 g/L 이스트추출물, 10 g/L 염화나트륨), 변형된 R배지 ((NH₄)₂HPO₄4 g/L, KH₂PO₄13.3 g/L, 구연산 (citric acid) 1.7 g/L, FeSO₄·7H₂O 0.1 g/L, CaCl₂·2H₂O 0.02 g/L, ZnSO₄·7H₂O 0.0225 g/L, MnSO₄·4-5H₂O 0.05 g/L, (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.001 g/L, Na₂B₄O₇·10H₂O 0.0002 g/L, CuSO₄·5H₂O 0.01 g/L, HCl 10 mL/L, MgSO₄·7H₂O 1.2 g/L, 포도당 2 g/L, 이스트추출물 5 g/L)를 사용하여 회분식 및 유가식 배양을 수행하였다.

본 배양은 2.5 L 배양기에서 37℃에서 수행되었다. 초기 배양 부피는 하룻밤 배양액 1 mL를 LB 배지 100 mL에 접종하여 2시간 동안 배양한 종배양액 (seed culture) 100 mL를 첨가하여 1 L로 조정하였다. 배양액의 용존산소 (DO) 수준은 교반속도를 200-1200 rpm으로 변화시키고 공기공급속도를 0.3-4 vvm으로 하여 원하는 수준을 유지하였고 교반속도와 공기공급속도를 낮추어 미호기조건 (DO=1-2%)을 유지하였다. 유가식 배양에서의 주입액 (feeding solution)은 포도당 500 g/L, MgSO₄·7H₂O 15 g/L, 이스트추출물 50 g/L, 박토트립톤 15 g/L 및 KH₂PO₄5 g/L로 구성되고, 상기 주입액 500 mL가 상기 초기 배양 배지에 pH를 일정하게 유지한 한 채로 지수적으로 주입하는 방법 (exponential feeding with pH-stat method)으로 첨가되었다. 이러한 주입방법 (exponential feeding with pH-stat method)은 아세트산과 같은 유기산의 농도를 낮추기 위하여, 포도당의 농도를 낮게 유지시키기 위하여 이용되었다.

4. 베타유당분해효소의 분석방법

베타유당분해효소의 비활성도(세포 당 발현된 베타유당분해효소의 총량)는 밀러방법에 의해 측정되었고, 밀러단위는 베타유당분해효소의 비활성도를 표시하는데 사용되었다. 세포 내에서 발현된 베타유당분해효소의 양은 Laemmli에 의해 제안된 방법(Nature 227, 680-685, 1970)으로 SDS-PAGE 에 의해 확인되었고, 전체 세포단백질에 대한 발현된 베타유당분해효소의 백분율은 젤 스캐너로 SDS-PAGE 플레이트를 스캐닝하여 얻은 자료로부터 계산되었다.

이미 기술된 바와 같이 질산염이 첨가되지 않은 조건에서 용존산소농도의 조절만으로 재조합 단백질의 합성을 유도할 수 있는 변형된 nar 프로모터 및 변이형 대장균을 찾고 이를 이용한 단백질제조의 최적조건을 찾기 위하여 여러 가지 주요 변수들을 결정하기 위해 다음과 같은 실시예를 구체적으로 제시하고자 한다.

<실시예>

실시예 1

최적 조합의 nar 프로모터와 대장균을 선택하기 위한 실시예

질산염의 첨가 없이 용존산소 농도에만 의존하는 유도성 프로모터로서 사용될 수 있는 nar 프로모터 시스템을 찾기 위하여 질산염이 없거나 1% 첨가된 조건에서 용존산소 농도를 변화시키면서 플라즈미드 pMW61 또는 pMW618을 가진 다양한 변이형 대장균을 회분식 배양하였다. 세포는 발효기를 이용하여 LB 배지에서 배양되었으며 세포농도가 OD₆₀₀=1.5까지는 높은 용존산소 농도를 유지시키다가 (DO>80%)이후 용존산소 농도를 2%이하로 낮게 유지시켜서 nar 프로모터를 유도하였다.

① 대장균 RK4353의 경우

야생형 nar 프로모터 (pMW61)와 염색체상의 narG 유전자가 변이된 RK5265 (RK4353narG^-)의 조합의 경우 질산염이 첨가되지 않은 조건에서도 도 1a 와 같이 회분식 배양의 경우 상당수준 높은 발현양을 보이나 (20,000 밀러단위; 도 1a, 컬럼 1) 선행 연구 (특허 출원번호 제 97-58550)에서 유가 배양에서는 발현되는 베타유당분해효소의 양이 매우 낮았다 (4,000 밀러단위). 야생형 nar 프로모터가 (pMW61)염색체상의 narL 유전자가 변이된 RK5278 (RK4353narL^-) 또는 RK5278narG^-(RK4353narL^-narG^-)에 형질전환된 경우 회분식 배양에서도 베타유당분해효소의 발현양이 매우 적었다 (도 1a, 컬럼 3, 컬럼 5). 변형된 nar 프로모터인 pMW618의 경우 RK5265와의 조합은 질산염이 존재하지 않는 조건에서 높은 발현양을 보였지만 유도율이 매우 낮았다 (도 1a, 컬럼 2; 도 1b, 컬럼 2). 반면 RK5278과의 조합에서는 질산염이 없는 조건에서 발현양 및 유도율이 모두 높은 값을 보였다(도 1a, 컬럼 4, 컬럼 6; 도 1b, 컬럼 4, 컬럼 6).

② 대장균 W3110의 경우

대장균 W3110을 사용한 경우에도 대장균 RK4353과 비슷한 경향이 나타났다 (도 1c; 도 1d). W3110narG^-에 야생형 플라즈미드 pMW61이 형질전환된 경우 (도 1c, 컬럼 1; 도 1d, 컬럼 1) 질산염이 있는 조건과 없는 조건에서 발현양이 차이가 났고, 변형된 플라즈미드 pMW618이 형질전환된 경우는 (도 1c, 컬럼 2; 도 1d, 컬럼 2) 유도율이 낮았다. W3110narL^-에 pMW61이 형질전환된 경우 (도 1c, 컬럼 3; 도 1d, 컬럼 3) 발현양 및 유도율이 매우 낮은 반면, pMW618이 형질전환된 경우 (도 1c, 컬럼 4; 도 1d, 컬럼 4) 발현양 및 유도율이 높았다. W3110narL^-narG^-에 pMW61이 형질전환된 경우 (도 1c, 컬럼 5; 도 1d, 컬럼 5)와 pMW618이 형질전환된 경우 (도 1c, 컬럼 6; 도 1d, 컬럼 6)는 각각 W3110narL^-에 형질전환된 경우와 같은 경향이 나타났다. 한편, 야생형 균주의 경우 pMW61/W3110계는 질산염에 심한 영향을 받았으며 (도 1c, 컬럼 7; 도 1d, 컬럼 7), 플라즈미드 pMW618을 가진 야생형 W3110의 경우 pMW618/W3110narL^-계에 비견할 만한 발현양을 보였지만 유도율은 낮았다 (도 1c, 컬럼 8; 도 1d, 컬럼 8).

이와 같은 결과를 토대로 pMW618/narL^-계가 질산염이 없는 조건에서 산소 의존형 유도성 계로 이용될 수 있는 우수한 성질을 가짐을 알 수 있었고 더 세부적인 실험에 이용되었다.

실시예 2

유가식 배양에서 대장균에 따른 변형된 nar 프로모터의 유도 특성

대장균 종류에 따라 프로모터의 유도 성능이 차이가 날 수 있으므로, 염색체상의 narL 유전자가 변이된 몇몇 대장균 균주들 (RK5278(narL^-), W3110narL^-, JM107narL^-)과 변형된 nar 프로모터 pMW618의 조합에 대하여 질산염이 없는 조건에서 최대로 발현되는 산소의존형 유도성 프로모터계를 찾기 위하여 유가식 배양이 수행되었다. 유가식 배양 전략은 선행된 pMW61/RK5265계의 최적조업 조건을 따랐으며 질산염이 없는 조건에서 수행되었다. 세포는 OD₆₀₀=35 정도까지 호기조건에서 배양되다가 이후 호기 및 미호기조건을 번갈아 적용시키는 전략으로 nar 프로모터에 의한 발현을 유도하였다. 도 2a 는 pMW618/RK5278 (narL^-)계에 대한 유가배양 결과도이며 유도 수행 후 최대 비활성도가 10,000 밀러단위 이하로 낮음을 알 수 있다.도 2b는 pMW618/W3110narL^-계에 대한 유가배양 결과도이며 이 경우 최대 비활성도는 OD₆₀₀=160에서 58,000 밀러단위이고 이것은 시험된 균주 중에서 최대값이다. 도 2c는 pMW618/JM107narL^-계에 대한 유가배양 결과도이며 최대 비활성도는 OD₆₀₀=130에서 약 52,000밀러단위였다.

이와 같은 3개의 계에서 pMW618/W3110narL^-계가 가장 높은 세포 농도 (OD₆₀₀=160)에서 가장 높은 발현양 (58,000 밀러단위)을 나타냈으므로 더 구체적인 실험에 이를 이용하였다.

실시예 3

유가배양에서 변형된 nar 프로모터계에 대한 세포농도 및 용존산소 농도의 영향

선행연구에서 유도시점에서 세포농도와 유도 전후 용존산소 농도가 pMW61/RK5265계의 유도 특성에 어떠한 형태로든 영향을 미친다는 것을 밝힌 바 있다. 따라서 pMW618/W3110narL^-계에 대해서도 이러한 조건들의 영향을 조사할 필요가 있다.

① 질산염이 없는 조건에서 pMW618/W3110narL^-계의 유도 특성에 대한 세포농도의 영향

유도시점에서 세포농도의 영향을 알아보기 위하여 세포는 유가식 배양 방법으로 서로 다른 농도까지 (OD₆₀₀=18, 80: 10, 20시간 배양) 높은 용존산소 농도 (DO>80%)에서 배양되다가 호기·미호기 조건을 번갈아 적용시키면서 nar 프로모터를 유도시켰다. 세포농도가 OD₆₀₀=80에 이를 때까지 용존산소 농도를 80% 이상 유지시키기 위하여 특별히 순수한 산소가 사용되었고, 그렇지 않은 경우는 공기가 주입되었다. 세포배양 10 시간 후 세포농도가 OD₆₀₀=18 일 때 변형된 nar 프로모터계(pMW618/W3110narL^-계)를 유도시킨 경우 유도 후 17시간이 지나면서 OD₆₀₀=134에서 54,000 밀러단위의 최대 베타유당분해효소의 발현을 보였다. 이러한 조건에서 최대 세포농도는 OD₆₀₀=160에 도달하였고 유도율은 21 이였다 (도 3a). 세포 배양 20시간 후 세포농도가 OD₆₀₀=80에서 유도시킨 경우 유도 13시간 후 OD₆₀₀=170에서 51,000 밀러단위의 최대 베타유당분해효소의 발현을 나타냈다. 이 경우 최대 세포농도는 OD₆₀₀=190 이였으며 유도율은 13이였다 (도 3b). 서로 다른 세포농도(OD₆₀₀=18, 35, 80)에서의 변형된 nar 프로모터계의 유도결과 최대 발현은 OD₆₀₀=35 정도에서 유도시킨 경우임을 알 수 있었다.

② 질산염이 없는 조건에서 nar 프로모터의 유도 전후 용존산소 농도의 영향

본 발명에 이용된 pMW618/W3110narL^-계가 질산염의 첨가 없이 용존산소 농도만의 조절로 재조합 단백질을 발현하는 것이므로 용존산소 농도의 영향은 매우 중요하다. 우선 유도 전 용존산소 농도의 영향을 조사하기 위하여 세포를 OD₆₀₀=35 까지 용존산소 농도를 50% 로 낮추어 배양하다가 이후 호기·미호기 조건을 번갈아 적용시키며 변형된 nar 프로모터의 발현을 유도하였다. 이러한 조건에서 최대 베타유당분해효소의 발현은 OD₆₀₀=150에서 47,000밀러단위로 유도전의 용존산소 농도가 80%일때보다 낮은 값을 나타냈다 (도 3c). 한편, 발현 유도후의 용존산소 농도의 영향을 알아보기 위하여 유도 후 용존산소 농도를 높여서 약 10% 내외로 일정하게 유지시키면서 pMW618/W3110narL^-계의 발현 특성을 조사하였다. 그 결과, 최대 베타유당분해효소는 OD₆₀₀=180에서 약 30,000 밀러단위에 지나지 않았다 (도 3d). 따라서 이와 같은 용존산소 농도의 영향에 대한 실험 결과 본 발명에 이용된 변형된 nar 프로모터의 경우 재조합 단백질의 발현양을 높이기 위해서 적용되어야 할 용존산소농도 조절의 전략은 발현 유도 전 높게 유지시키고, 유도 후는 낮게 유지시키는 것임을 알 수 있다.

실시예 4

최적조건에서 베타유당분해효소의 발현 수준 측정

상기 최적의 유도조건에서 발현되는 단백질의 양을 알아보기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다 (도 4). 제 1 레인은 사이즈마커 (마이오신, 212 kDa; 알파-2-매크로글로블린, 170 kDa; 베타유당분해효소, 116 kDa; 트랜스페린, 76 kDa; 글루타메이트 디하이드로지네이즈, 53 kDa) 이며, 제 2레인은 유도전의 결과이고, 제 3레인은 유도 후 1시간 경과후의 결과이며, 제 4레인은 유도 후 3시간 경과, 제 5레인은유도 후 6시간 경과, 제 6레인은 유도 후 9시간 경과, 제 7레인은 유도 후 12시간 경과, 제 8레인은 유도 후 15시간 경과, 제 9레인은 유도 후 18시간 경과, 제 10레인은 유도 후 21시간 경과후의 결과를 각각 나타낸다.

베타유당분해효소가 최대로 발현되는 시점(OD₆₀₀=160, 58,000 밀러단위, 제 8 레인)에서는 베타유당분해효소가 세포 내 전체 단백질의 약 45%를 차지하였다.

재조합 단백질의 발현에 관계된 nar 프로모터의 기작은 이미 선행연구에서 (등록번호 특0173845, 등록일: 1998년 11월02일) 밝힌 바 있다. 플라즈미드 pBR322에 클로닝된 동일한 nar 프로모터라도 숙주세포인 대장균 종류, 숙주세포의 염색체의 변이, nar 프로모터의 염기서열에 따라 유도 특성이 달라짐을 알 수 있었다. (Biotechnol. Bioeng. 59, 400-406, 1998; Biotechnol. Lett. 18, 129-134, 1996; Biotechnol. Bioeng. 52, 572-578, 1996; Korean J. Biotechnol. Bioeng. 11, 431-437, 1996). 예를 들면 야생형 nar 프로모터 (pMW61)의 경우 미호기조건 뿐만 아니라 질산염의 첨가가 최대발현을 유도하는데 필수적 이였다. 이 경우 대장균 염색체 상에 질산염환원효소를 발현시키는 narG 유전자를 변이 시킴으로써 (RK5265), 세포 내 환원전위가 낮아짐으로써 발생할 수 있는 질산염 환원효소의 발현에 의한 자동규제(autoregulation)를 억제시켜 발현을 최대로 유도할 수 있었다.

본 발명에서는 nar 프로모터와 숙주 대장균 세포, 대장균 염색체상의 변이의 조합을 통해 회분식, 유가식 배양에서 질산염의 첨가 없이 용존산소 농도의 조절만으로 사용될 수 있는 nar 프로모터계를 찾고자 하였다. 질산염에 관계없이 최대발현을 위해서 pMW618이라는 변형된 nar 프로모터가 사용되었다. 유도전의 발현을 억제시켜 유도 발현 효율을 높이기 위해서 염색체상의 narL 유전자를 변이 시킨 대장균 균주를 숙주세포로 이용하였다. 이것은 호기조건에서 NARL이 nar 프로모터에 결합하면서 발생할 수 있는 nar 프로모터의 유도를 제거했기 때문이다. 따라서 호기조건에서 발현을 상당히 억제시킬 수 있었다.

대장균 균주에 따라 염색체 상에 동일한 변이가 있더라도 발현 특성이 차이가 났다. 이것은 nar 프로모터를 이용하는 재조합 단백질의 생산 시 이용되는 대장균 종류를 여러 가지 시도해야 함을 의미한다. 재조합 단백질의 발현을 최대로 유도하기 위해서 적절한 세포농도가 존재하였다. 야생형이나 변형된 nar 프로모터의 경우 약 OD₆₀₀=35 근처에서 유도 발현시키는 경우가 최적이었으나 그 이전 혹은 그 후에 유도를 해도 상당수준 발현이 가능하였다. 성장기간 동안 낮은 용존산소 농도는 발현 수준을 감소시켰다. 따라서 발현 유도 전 용존산소 농도를 가능한 높게 유지시키는 것이 발현유도 후 유전자 발현에 필요한 효소들의 충분한 생산을 위해서 필요한 것으로 사료된다. 발현 유도 후 용존산소 농도를 가능한 낮추는 것이 nar 프로모터를 이용한 재조합 단백질의 최대 발현에 필요하였다.

요약하면, 변형된 nar 프로모터에 의한 재조합 단백질의 생산 시 최적 유도조건은 변형된 nar 프로모터계 pMW618/W3110narL^-를 OD₆₀₀=35 정도까지 호기조건에서 배양하다가 그 후 용존산소 농도를 1-2%로 유지시키며 호기 및 미호기조건을 번갈아 적용시키면서 배양하는 것이다. 이러한 조건에서 최대 베타유당분해효소의 비활성도는 OD₆₀₀=160의 세포농도에서 58,000 밀러단위까지 높아졌으며 이는 전체 세포 내 단백질의 45%에 해당하는 양이었고, 유도율은 20 이였다.

본 발명의 변형된 nar 프로모터계를 다른 산소 의존형 프로모터인 VHb 프로모터와 비교해 보면 대장균에 클로닝된 VHb 프로모터계의 경우 최종 세포 농도는 OD₆₀₀=40-50 정도였고 발현된 베타유당분해효소는 전체 단백질의 10%에 불과하였다 (Bio/Technology 8, 554-558, 1990). 결론적으로 본 발명에서 제시한 변형된 nar 프로모터계는 간단히 용존산소 농도의 조절만으로 강력하고, 값싸며 쉽게 외래단백질을 유도 발현시키는 좋은 특성을 가지며 이는 산업 생산의 발효에 널리 이용될 것으로 전망된다.

Claims

산소의존형 유도성 프로모터인 nar 프로모터를 변형하고, 숙주세포인 대장균을 변이 시킨 pMW618/narL^-계를 이용한 재조합 단백질의 발현 및 생산에서 호기조건에서 대장균을 성장시킨 후 용존산소 농도를 1-2%로 낮추어 nar 프로모터를 유도하는 전략으로 회분식 및 유가식 배양에 의한 재조합 단백질 제조방법
제 1항에 있어서 nar 프로모터를 변형시키거나 대장균을 변이 시켜 만든 변형된 nar 프로모터계에 의한 재조합 단백질의 제조방법
제 1항에 있어서 호기조건은 용존산소 농도 약 20% 이상이며 이 상태에서 대장균을 흡광농도로 OD₆₀₀=20내지 80까지 성장시킨 후 재조합 단백질의 발현을 유도하는 공정을 특징으로 하는 재조합 단백질의 제조방법
제 1항에 있어서 nar 프로모터를 유도하기 위하여 용존산소 농도를 1-2%로 낮추되 호기조건과 미호기조건을 번갈아 적용하는 전략으로 재조합 단백질을 제조하는 공정을 특징으로 하는 재조합 단백질의 제조방법