KR0173845B1

KR0173845B1 - 산소의존형 유도성 프로모터에 의한 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR0173845B1
Application number: KR1019960002893A
Authority: KR
Inventors: 이종원; 조무환; 이진태
Original assignee: 이종원; 조무환
Priority date: 1996-02-07
Filing date: 1996-02-07
Publication date: 1999-02-01
Also published as: KR970061912A

Abstract

본 발명은 산소의존형 유도성 프로모터에 의한 단백질의 제조방법에 관한 것으로, nar 프로모터의 발현은 배양초기에 1% 질산염(NaNO₃) 존재하에서 대장균을 키우는 것이 최적이었으며, 몰리브데늄염의 농도에는 별 영향이 없었다. 최대의 유도율은 하룻밤 배양액을 발효기에 접종하기 전에 플라스크에서 2.5시간(OD₆₀₀=1.3될 때까지)배양한 경우에 얻어졌다. 단위 세포당 뿐만 아니라, 단위 배지부피당 최대의 베타 유당분해효소는 대장균을 OD₆₀₀=1.7까지 호기적인 조건(용존산소를 80% 이상)으로 키우다가 용존산소을 1-2%로 낮추어 유도시킨 경우에 얻어졌다. 이상에서 얻은 최적의 조건에서 회분실험한 결과, 유도 6시간 후에 세포농도는 OD₆₀₀-3.2가 되었고, 베타 유당분해효소의 비활성도는 36,000 밀러 단위였으며, 유도율은 300이었다. 이것을 SDS-PAGE한 결과 발현된 베타 유당분해효소는 전체 세포단백질의 약 35%에 해당하였다. 이 nar 프로모터를 현재 사용되고 있는 다른 유도성 프로모터인 tac 프로모터나 VHb 프로모터들과 비교한 결과 이 nar 프로모터로부터 단위 세포당으로는 약 2-3배, 단위 배지 부피당으로는 약 10배 이상의 베타 유당분해효소가 더 많이 생성되었다.

Description

산소의존형 유도성 프로모터에 의한 단백질의 제조방법

제1도는 본 발명에 사용된 플라스미드 pMW61의 유전자 지도.

제2도는 대장균의 성장에 따른 베타 유당분해효소의 발현정도를 나타내는 그래프.

제3도는 대장균의 생장상태가 베타 유당분해효소의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프.

제4도는 질산염의 농도가 대장균의 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프.

제5도는 질산염의 농도가 베타 유당분해효소의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프.

제6도는 몰리브데늄염의 농도가 베타 유당분해효소의 발현에 미치는영향을 나타내는 그래프.

제7도는 혐기상태에서의 nar 프로모터의 발현정도를 나타내는 그래프.

제8도는 대장균의 생장상태가 베타 유당분해효소의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프.

제9도는 성장기간 동안의 용존산소가 베타 유당분해효소의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프.

제10도는 성장기간 동안의 용존산소가 베타 유당분해효소의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프.

제11도 a는 연속적으로 희석된 하룻밤 배양액이 베타 유당분해효소의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프.

제11도 b는 발현된 베타 유당분해효소의 밴드를 나타내는 사진.

본 발명은 산소의존형 유도성 프로모터에 의한단백질의 제조방법에 관한 것이다.

현재 의약품으로 쓰이는 여러가지 단백질들이 재조합 DNA 기술의 덕분으로 대장균으로부터 대량으로 생산되고 있다. 이때 발현운반체(expression vector)로는 유동성 프로모터를 가지는 플라스미드가 주로 이용된다.

유도성 프로모터를 가지는 플라스미드를 사용하면 다음과 같은 장점이 있다.

첫째, 발현단계와 성장단계를 분리함으로써 세포내에서 플라스미드를 더 안정적으로 유지시킬 수 있다(Biotechonol. Bioeng, 27, 28-33,1985; Biotechonol, Bioeng.,31, 805-820, 1988; Biotechnol, Prog., 6, 403-407, 1990). 둘째, 인슐린 생산의 경우에서와 같이 발현된 단백질이 그 세포에 독성을 띠는 경우 대장균이 자라는 동안 죽는 것을 방지할 수 있다(Gene, 27, 161-172, 1984).

하지만, 좋은 유도성 프로모터로 쓰이기 위해서는 다음과 같은 조건들이 만족되어야 한다. 첫째 그 프로모터가 강해야 하며, 둘째 성장단계 동안에는 가능한한 발현되지 않아야 하며, 마지막으로 유도가 간단하고 값싸야 한다.

현재 이용되고 있는 유도성 프로모터에는 tac, lac, trpA, 그리고 λP_L프로모터들이 있다. 그러나, 이들 프로모터들은 유도되는 과정에서 다음과 같은 문제점들이 존재한다. Lac 프로모터와 tac 프로모터인 경우에는 유도시키기 위해서 값비싼 화학약품인 이소프로필티오-β-D-갈락토사이드(IPTG)를 사용해야 하며, trpA 프로모터인 경우에는세포의 성장에 최적이지 못한 성장배지를 써야 한다는 단점이 있으며, λP_L프로모터인 경우에는 유도시키기 위해서 온도를 높여야 하는데 이것 때문에 발현된 단백질이 변성되는 경우가 있다(Nature, 273, 411-416, 1980; Gene, 15, 81-93, 1981; Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 80, 21-25, 1983).

최근에는 혐기성 박테리아인 비트레오실리아(Vitreoscillia)로부터 산소의존형 프로모터가 발견되어 이것이 유도성 프로모터로 개발되었다(J. Bacteriol., 171, 5995-6004, 1989; Biotechniques, 7, 1026-1028, 1989). 하지만, 이 프로모터는 유도는 간단하고 싼 장점이 있었지만, 유도되는 특성이 그리 좋지 않았다(Biotechniques, 7, 1026-1028, 1989). 본 연구에서는 질산염 존재하에서 혐기적인 조건이 되면 최대로 발현되는 nar 프로모터가 염색체상에 비정상적인 nar 오페론을 가지는 대장균안에서 유도되는 계(system)가 현재 사용되고 있는 유도성 프로모터보다 좀 더 나은 유도성 프로모터로 쓰일 수 있는지를 조사하였다.

대장균은 혐기와 호기조건하에서 각각 호흡과정(respiratory process)과 발효과정(frementative process)에 의해 자랄 수 있는 통성(facultative) 박테리아이다. 하지만, 대장균이 산소가 없는 조건하에서 자라게 되면 호기조건하에서는 발현되지 않는 여러 유전자들이 발현된다(Cell, 66, 5-7, 1991).

이 중에는 질산염 환원효소를 발현하는 nar 오페론이 있다. 질산염 환원효소는 산소가 없을 때 산소 대신에 질산염(NO3-)을 전자수용체(electron acceptor)로 이용하여 아질신염(nitrite)(NO2-)으로 바꾸면서 그 대사를 발효과정에서 호흡과정으로 바뀌게 한다(Gottschalk, G., Bacterial Metabolism, 2nd ed., Springer-Verlag, NewYor, 1986). 이 nar 오페론은 호기조건하에서는 산소가 전자수용체로 쓰이므로 발현되지 않다가 혐기 조건하에서 질산염이 존재하면 이 질산염을 전자수용체로 쓰기 위해 최대로 발현된다.

배양 조건이 호기상태에서 혐기상태로 바뀌면 조절단백질(regulatory protein)인 FNR이 nar 오페론의 프로모터(nar 프로모터)에 붙어 발현이 일부분되고, 질산염까지 배지에 존재하면 또 다른 조절단백질인 NARL이 nar 프로모터에 붙어 이 nar 프로모터가 최대로 발현된다(J. Biol. Chem., 263, 13700-13705, 1988). 이러한 2개의 조절단백질들이 nar 프로모터에 있는 자신의 결합부위에 각각 붙게 되면 nar 오페론의 전사의 개시(initiation)가 중가되고, 따라서 구조적 유전자들인 narG, narH, narI의 발현이 촉진된다(J. Bacteriol., 164, 25-32, 1985; J. Bacteriol., 169, 4614-4620, 1987). 이 nar 프로모터의 유도 연구를 쉽게 하기 위해 구조적 유전자들 대신에 nar 프로모터의 하류측(downstream)에 lacZ 유전자가 클로닝되었다(J. Biol. Chem., 263, 13700-13705, 1988). 본 발명자들은 본 연구에 앞서 염색체상에 정상적인 nar 오페론을 가지고 있는 대장균내에 클로닝되어 있는 nar 프로모터가 들어있는 계(Mv1190/pXR8971)에 대한 특성을 조사한 바 있다(Biotechnology Letters, Accepted, 1995). 이 Mv1190/pXR8971계에서는 대장균내 염색체상의 nar 오페론으로부터 발현된 질산염 환원효소가 질산염을 아질산염으로 변환시키면서 발생시키는 산소에 의해 클로닝된 nar 프로모터로부터의 발현은 억제되었다. 따라서, 본 실험에서는 이 영향을 없애기 위해 염색체상에 비정상적인 nar 오페론을 가지는 대장균에 들어 있는 계에 대해 특성연구를 하였다. 이 비정상적인 nar 오페론은 질산염 환원효소를 이루는 한 소단위가 돌연변이되어 만들어진 것이다(J.Bacteriol., 151, 788-799, 1982).

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

(1) 박테리아 균주 및 플라스미드

염색체상에 비정상적인 nar 오페론(J. Bacteriol. 151, 788-799, 1982)을 가지는 대장균(Escherichia coli) 균주 RK5265(narC202::Tn10 araD139 gyrA ΔlacU169 non rpsL thi)와 nar 프로모터를 가지는 플라스미드 pMW61(J. Bacteriol., 174, 1119-1123, 1992)은 텍사스 의과대학(U.S.A)의 John DeMoss 교수로부터 분양받았다. 플라스미드 pMW61은 pBR322을 기초로 하며, nar 프로모터로부터 유도되는 정도를 쉽게 측정하기 위하여 질산염 환원효소를 발현하는 구조적 유전자 대신에 베타 유당분해효소를 발현하는 lacZ 유전자가 nar 프로모터의 하류측에 클로닝된 것이다(제1도).

본 발명에 따른 균주인 대장균 RK5265/pMW61는 플라스미드 pMW61가 대장균 RK5265에 형질전환된 것이며, 1996년 1월 11일자로 한국과학기술연구원에 수탁번호 KCTC8723P로 기탁하였다.

pMW61은 플라스미드 pBR322에 항생물질 저항성 마커로 암피실린 저항성 유전자를 지니고 있으며, nar 프로모터와 lacZ 유전자가 그 하류측에 클로닝되어 있다.

이 플라스미드 pMW61은 대장균 RK5265내에 들어 있다.

(2) 배양조건

대장균의 배양배지로는 루리아 브로스(LB)(10g/1 박토트립톤, 5g/1 이스트 추출물, 10g/1 염화나트륨)가 사용되었고, 모든 배지에는 50㎍/㎖ 암피실린(뵈링거 만하임)이 첨가되었다. 진탕 플라스크(shake flask)실험은 250㎖ 플라스크에 50㎖배지를 넣고 하룻밤 배양액을 1㎖ 접종하여 이루어졌다. 이 때, 배양온도는 37℃, 교반속도는 250rpm으로 하여 진탕배양기에서 배양되었다. Nar 프로모터에 대한 유도는 600nm에서 흡광도로 표시된(OD₆₀₀) 대장균 농도가 적절한 값이 되었을 때 이루어졌다. 초기 접종시에 절신염이 첨가된경우에 nar 프로모터는 교반속도 250rpm으로 교반되는 동안에 자연스럽게 유도되거나, 또는 인위적으로 만들어진 혐기적인 조건하에서 유도되었다. 또한, 접종시 질산염이 첨가되지 않고 배양된 경우에는 단지 질산염만이 첨가되어 유도되거나, 질산염이 첨가되는 동시에 혐기적인 조건을 만들어 유도되었다. 혐기적인 조건은 교반을 중단하고 플라스크의 주둥이를 사라필름으로 밀봉하여 만들어졌다.

발효기실험은 5L 발효기에서 행하였으며, 2L 배지에 하룻밤 배양액 40㎖을 접종하였다. 대장균의 배양온도는 37℃, pH=7∼7.5, 공기공급속도 1vvm으로 하여 배양하였다. 배지중의 용존산소(DO)는 교반속도를 0-500rpm으로 변화하여 원하는 농도로 조절하였으며, 혐기적인 조건은 공기공급 줄여서 만들었다.

(3) 베타 유당분해효소의 비활성도의 측정

Nar 프로모터로부터 발현된 베타 유당분해효소의 비활성도의 측정은 밀러의 방법(Miller, J. H., Experiments In Molecular Genetics, 2nd ed., cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)을 따랐다. 베타 유당분해효소의 비활성도는 밀러 단위로 나타내었다.

(4) SDS-폴리아크일아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)

발현된 베타 유당분해효소의 양은 삼브록의 방법(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold spring Harbor Laboratory, New York, 1989)에 따라 SDS-PAGE로 확인되었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

[진탕 플라스크 실험]

pBR322에 클로닝되어 있는 nar 프로모터가 염색체상에는 정상적인 nar 오페론을 가지고 있는 대장균에서(Mv1190/pXR8971) 발현되는 실험으로부터 세포농도 OD₆₀₀-1.7일 때까지 용존산소를 80% 이상으로 유지하면서 대장균을 배양하다가 1% 질산염을 첨가하면서 공기대신에 질소기체를 불어넣었을 때 단위 배지 부피당 최대의 베타 유당분해효소를 얻을 수 있었다(Biotechnology Letters, Accepted, 1995).

본 실험은 pBR322에 클로닝되어 있는 nar 프로모터가 염색체상에 비정상적인 nar 오페론을 가지고 있는 대장균에 들어 있는 경우에(RK5265/pMW61) 앞서 행한 실험과 같은 결과를 얻을 수 있는지를 조사하였다.

이를 위해 배양초기에 1% 질산염을 첨가한 경우(●)와 질산염을 전혀 첨가하지 않은 경우(■)에 대하여 대장균이 성장하는 동안에 nar 프로모터로부터 발현된 베타 유당분해효소의 비활성도(베타 유당분해효소/세포)를 측정하였다(제2도). 제2도에서 보는 바와 같이 이 계(RK5265/pMW61)는 Mv1190/pXR8971계와는 대조적으로 1% 질산염 존재하에서 세포농도가 OD₆₀₀=3.5로 되었을 때 최대의 베타 유당분해효소의 비활성도인 16,000 밀러 단위를 나타내었다. 이 값은 Mv1190/pXR8971계의 OD₆₀₀=1.7에서 유도시킨 경우인 4,500 밀러 단위보다 훨씬 큰값이었다.

OD₆₀₀과 베타 유당분해효소의 비활성도는 250㎖ 플라스크에서 대장균이 성장하는 동안에 특정되었다. 대장균은 LB 배지내에서 1% 질산염이 첨가되거나(●) 또는 질산염이 첨가되지 상은 상태(■)에서 자랐으며, 베타 유당분해효소의 비활성도는 혐기조건에 의해 유도되지 않는 상태에서 각각 다른 성장시각에서 측정되었다.

RK5265/pMW61계의 특성을 더 알기 위해 다른 OD₆₀₀에서 베타 유당분해효소의 비활성도가 측정되었다(제3도). 각각에 대한 실험조건은 다음과 같디; 대장균은 1%의 질산염이 존재하거나(제3도a) 또는 없는 상태에서 자랐다(제3도b).

대장균은 플라스크내에서 배양초기에 1% 질산염이 첨가된 상태와(제3도 a) 질산염이 첨가되지 않은 상태에서(제3도 b) 자랐으며, 각각 다른 OD₆₀₀에서 베타 유당분해효소의 비활성도가 측정되었다. 여기서 베타 유당분해효소의 비활성도는 유도없이 측정된 경우(○)와 6시간 유도된 경우(●)에 대해 그값이 각각 측정되었다. 또 대장균이 1% 질산염 존재하에서 자랐을 때 nar 프로모터는 혐기적인 조건을 만들어서 유도되었다(제3도 a, ●), 대장균이 질산염이 없이 자랐을 때 nar 프로모터는 1% 질산염이 첨가되고 이와 동시에 혐기적인 조건이 만들어져서 유도되었ㄷ(제3도 b, ●).

질산염이 없이 자랄 경우 하룻밤 배양액으로부터 접종될 때의 베타 유당분해효소의 비활성도는 상당히 높았으며(약 8,000 밀러 단위), 이 값은 대장균이 자람에 따라 감소하였다(제3도 a, b, ○). 그러다가, 세포농도가 높아지면 그 활성도가 다시 증가하기 시작하는데 이는 대장균이 자라면서 생긴 혐기조건 때문에 생긴 것으로 추정된다. 한편, nar 프로모터가 낮은 OD₆₀₀에서 유도되었을 때 베타 유당분해효소의 비활성도가 급격하게 증가하였다(제3도 a,b, ●). 그러나 높은 OD₆₀₀에서는 유도되더라도 유도되지 않는 경우에 비해 그 값이 많이 증가하지 않았으며, 이 경향은 특히 대장균이 초기부터 1% 질산염 존재하에서 배양되었을 때 심하였다(제3도 a, ●). 발현된 베타 유당분해효소의 값은 대장균이 질산염 존재하에서 자을 때가(제3도 a) 질산염없이 자랐을 때 보다(제3도 b) 훨씬 높았다.

배양초기부터 질산염을 첨가하여 배양하는 경우에는 유도없이는 세포성장 말기에서 극발현이 최대가 되었으므로 ,이 후의 nar 프로모터의 특성연구에서는 이 조건들이 이용되었다.

제4도는 질산염의 농도가 대장균의 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프로서 대장균은 LB 배지에서 0(●), 1(■), 2(▲), 또는 3%(▼)의 질산염이 첨가된 상태에서 자랐다. 대장균은 250㎖ 플라스크내에서 유도없이 자랐다.

대장균을 질산염 존재하에서 키울 때는 그 성장이 질산염의 온도가 1%까지는 별영향을 받지 않다가, 2% 이상이 되면 그 성장이 크게 저해되었다.

최적의 질산염농도를 구하기 위해 여러 다른 질산농도에서 대장균을 유도없이 6시간동안 키워 베타 유당분해효소의 비활성도를 얻었다(제5도). 베타 유당분해효소(●) 및 세포농도(○)는 유도없이 6시간 동안 자란 후 각각 다른 질산염농도에서 측정되었다. 대장균은 플라스크에서 자랐다. 질산염농도가 0.25-1.5% 범위에서 세포성장(○)은 별 영향을 받지 않으면서 베타 유당분해효소의 비활성도(●)는 최대가 되었다.

한편, 몰리브데늄염은 nar 프로모터의 발현에 별 영향을 미치지 않았다(제6도). 베타 유당분해효소의 비활성도가 1%의 질산염이 첨가된 상태에서 각각 다른 몰리브데늄농도에서 측정되었다. 대장균은 250㎖ 플라스크에서 유도없이 6시간동안 자랐다. 따라서, 향후 실험에서는 몰리브데늄염은 없이 1% 질산염만을 배양초기에 첨가하여 행하였다.

[실시예 2]

[발효기 실험]

Nar 프로모터의 발현에 용존산소(DO)가 미치는 영향을 알아보기 위해 1% 질산염을 첨가한 다음 높은 용존산소상태(80% 이상)에서 대장균을 키운 후, 용존산소값을 1-2%로 낮추어 nar 프로모터를 유도하였다. 이 중 대표적인 예가 제7도에 표시되어 있다. 하룻밤 배양액으로부터 온 대장균이 1%의 질산염이 첨가된 발효기에 접종되어 호기상태(용존산소가 80% 이상)에서 OD₆₀₀이 1.7이 될 때까지 자란 후, 용존산소(□)를 1-2%로 낮춤으로써 nar 프로모터가 유도되었다. 동시에 베타 유당분해효소의 비활성도(●)와 OD₆₀₀(○)도 측정되었다. 이 실험에서는 대장균을 1% 질산염 존재하에서 세포농도 OD₆₀₀=1.7일 때까지 용존산소(□)를 80% 이상으로 유지하면서 키우다가, 용존산소를 1-2%로 떨어뜨린 후, 계속하여 이 용존산소하에서 1-2%로 유지하며 유도시켰다. 베타 유당분해효소의 비활성도는 유도시킨 후, Od₆₀₀이 3.2가 될 때까지 급격히 그 발현이 증가하였으며 이때 얻은 최종비활성도(●)는 29,000 밀러 단위였다.

한편, 1.7 이외의 여러 다른 Od₆₀₀에서 얻은 최종 베타 유당분해효소의 비활성도를 시간이 아닌 OD₆₀₀에 대해 도시한 결과 제8도를 얻었다. OD₆₀₀이 0.25-2.0일 때 베타 유당분해효소의 비활성도가 증가하였으며, 최대 베타 유당분해효소의 비활성도는 유도시의 OD₆₀₀이 1.7이었을 때 얻어졌다. 이 때 최종 OD₆₀₀은 유도시킬때의 OD₆₀₀과는 상관없이 대략 2.9-3.2이었으므로, 단위 배지당의 최대 베타 유당분해효소의 비활성도도 여전히 유도시의 OD₆₀₀이 1.7일 때 얻어졌다.

[실시예 3]

[발효기 실험]

이 계의 특성을 더 밝히기 위해 다음과 같은 두 가지의 실험을 더 행하였다.

지금까지의 실험은 유도시키기 위하여 용존산소를 1-2%로 유지하였으나, 용존산소 를더 높여도 유도가 그대로 되는지를 알아보기 위해 용존산소가 베타 유당분해효소의 발현에 미치는 영향을 알아보았다(제9도). 하룻밤 배양액으로부터 온 대장균이 1%의 질산염이 첨가된 발효기에 접종되어 호기상태(용존산소가 80% 이상)에서 OD₆₀₀이 1.7이 될 때까지 자란 후, 용존산소를 필요한 수준으로 낮춤으로써 nar 프로모터가 유도되었다. 베타 유당분해효소의 비활성도는 OD₆₀₀이 3.2-3.5가 되었을 때 측정되었다. 대장균을 용존산소를 80% 이상으로 유지한 채 키우다가 OD₆₀₀=1.7이 되었을 때 각각 다른 용존산소를 유지하며 유도시켰다. 용존산소가 20% 이하가 될 때까지를베타 유당분해효소가 많이 발현되지 않았으며, 최대의 베타 유당분해효소의 비활성도는 낮은 용존산소 수준(1-2%)에서 얻어졌다. 그리고, 용존산소를 0%로 유지하기 위해 공기대신에 질소기체를 불어 넣으면 대장균이 잘 자라지 않았다. 따라서, 베타 유당분해효소의 발현을 최대로 하기 위해서는 용존산소가 항상 1-2% 유지되어야 한다.

한편, 이제까지의 실험에서 유도전까지 대장균을 키울 동안에는 용존산소를 80% 이상으로 유지시켜 베타 유당분해효소의 발현을 억제하였으나, 실제 용존산소 수준을 더 낮추어도 그 발현이 여전히 억제되는가를 알아보았다(제10도). 하룻밤 배양액으로부터 온 대장균이 1%의 질산염이 첨가된 발효기에 접종되어 용존산소가 35-50%에서 OD₆₀₀이 1.7이 될 때까지 자란 후, 용존산소(□)를 1-2%로 낮춤으로써 nar 프로모터가 유도되었다. 동시에 베타 유당분해효소의 비활성도(●)와 OD600(○)도 측정되었다. 유도직전의 베타 유당분해효소의 비활성도(●)는 720 밀러 단위로 그 발현이 여전히 억제되었으며, 유도후의 최종 베타 유당분해효소의 비활성도는 용존산소를 80%로 유지하였을 때 얻은 값과 같았다.

지금까지의 실험에서는 접종을 위해서 하룻밤 배양액을 사용하였으나, 이 하룻밤 배양액은 플라스크에서 얻어졌으므로 배지내부가 혐기적인 조건으로 되어 베타유당분해효소가 발효기에 넣기 전에 이미 많이 발현되어 있었다(8,000 밀러 단위). 이로 인하여 OD₆₀₀=1.7에서 유도시키기 직전의 베타 유당분해효소도 400 밀러 단위로 여전히 높아 유도율(최대로 발현될 때의 베타 유당분해효소의 비활성도/유도전의 베타 유당분해효소의 비활성도)이 약 70밖에 되지 않았다.

이 유도율을 높이기 위해 하룻밤 배양액을 발효기에 접종시키기 전에 250㎖ 플라스크에서 2.5시간 배양시킨 후(최종 OD₆₀₀=1.3), 이 새로운 배양액 40㎖를 취하여 발효기에 접종시킨 후 대장균이 호기상태(용존산소가 80% 이상)에서 OD₆₀₀이 1.7이 될 때까지 자란 후, 용존산소(□)를 1-2%로 낮춤으로써 nar 프로모터가 유도되었다(제11도). 제11도 a에서는 베타 유당분해효소의 비활성도(●)와 OD₆₀₀(○)이 측정되었다.

이 경우 OD₆₀₀=1.7에서 유도직전의 베타 유당분해효소의 비활성도(●)가 115 밀러 단위로 떨어졌으며, 동시에 유도 6시간 후 세포농도(○)는 OD₆₀₀=3.2로 되면서 베타 유당분해효소의 비활성도는 36,000 밀러 단위(제11도의 b의 lanc 5)로 다른 어떤 조건에서 보다 많이 발현되었다(제11도 a). 따라서, 유도율은 약 300으로 증가하였다.

한편, 발현된 베타 유당분해효소의 양을 측정하기 위해 SDS-PAGE 실험을 하였다(제11도 b). 이 실시예에서는 8% SDS 폴리아크릴아미드 젤이 사용되었고, 0.25% 쿠마시 브릴런트 블루로 45분간 염색하였다. Lanel은 단백질 마터(200Kd: 미오신, 97Kd: 포스토릴라제B, 68Kd: 소혈청알부민, 42Kd: 난알부민)이고, lane2는 유도전(115밀러 단위), lane3, 4, 5, 5은 각각 2, 4, 6(36,000밀러 단위), 8시간 배양한 시료이다. 베타 유당분해효소가 최대로 발현되었을 때인 36,000 밀러 단위에서 전체 세포단백질 중 베타 유당분해효소가 차지하는 양을 젤 스캐너로 확인한 결과 그 값이 약 35%였다.

RK5265/pMW61계에서 pBR322에서 클로닝된 이 nar 프로모터는 대장균의 성장에 저해를 일으키지 않는 질산염 농도 0.25-1.5% 범위에서 베타 유당분해효소가 최대로 발현되었다(제5도). 한편, 이우치 등은(Proc. Nat1.Acad.Sci.USA, 84, 3901-3905, 1987) 몰리브데늄염이 nar 프로모터의 발현에 영향을 미친다고 보고하였으나, 본 실험에서는 몰리드데늄염의 영향은 관찰되지 않았다(제6도). 따라서, nar 프로모터를 유도하기 위해서는 값비싼 화학제품인 IPTG를 사용하여야 하는 tac 프로모터와 lac 프로모터와는 달리 값싼 질산염만 넣으면 되는 장점이 있다.

배양초기부터 질산염을 넣고 키워 나중에 유도시키는 것이 초기에는 질산염을 넣지 않고 키우다가 유도시킬 때 질산염을 넣는 것 보다 베타 유당분해효소가 더 많이 생성되었다(제3도). 따라서, 이 방법은 배양 도중에 질산염을 첨가함으로써 발생될 수 있는 오염가능성을 줄어 들게 한다.

발효기실험으로부터 대장균을 1% 질산염 존재하에서 호기성 조건(용존산소 80%이상)하에서 세포농도를 Od₆₀₀=1.7될 때까지 배양한 후, 용존산소를 1-2%로 떨어뜨려 배양을 계속하면 베타 유당분해효소가 최대로 발현됨을 알 수 있었다(제7도 및 제9도). 이 때 호기성 조건하에서는 nar 프로모터의 유도가 크게 억제되었다(제7도 및 제10도).

한편, 유도를 최대로 하기 위해 공기공급을 중단하여 용존산소농도를 0%로 하였을 때는 대장균의 성장이 중단되었다. 그러나, 용존산소를 1-2%로 하여 nar 프로모터를 유도한 경우 세포농도가 세포성장 말기인 Od₆₀₀=3.2에서 단위 배지 부피당 베타 유당분해효소가 최대로 되었다. 이는 생물공학자의 관점에서 보면 매우 편리한 계이다. 왜냐하면, nar 프로모터의 발현을 원하지 않는 성장기간 동안에는 대장균을 호기성 조건하에서 빨리 키우다가, 발현을 원할 때는 산소공급만을 줄여도 nar 프로모터의 발현이 일어나기 때문이다(Biotechnol. Prog., 6, 403-407, 1990).

Nar 프로모터를 최대로 발현시키기 위해서는 용존산소를 1-2%로 유지하는 것이 필요하였으며, 실제 공정에서 이 상태를 유지하는 것이 용이하였다(제9도). 한편, 세포성장 기간동안에 용존산소가 40%까지 낮아지더라도 na그리고 프로모터의 발현이 여전히 억제되므로(제1010도) 실제 산업적인 규모에서 운영하더라도 세포성장 기간동안의 산소공급은 문제가 되지 않는다.

대장균이 성장하는 동안에 nar 프로모터의 발현을 좀 더 확실하게 억제시키기 위해 하룻밤 배양액을플라스크에서 전배양(preculture)한 후 이 새로운 배양액을 발효기에 접종하였다(제11도). 이 방법으로 하여 실험한 결과 유도율이 300으로 증가하였으며, 이 값은 배일리 그룹이 개발한 VHb 프로모터에 대해 얻은 유도율인 15보다 약 20배 높은 값이었다(J. Bacteriol., 171, 5995-6004-1989). 또한, 베타 유당분해효소가 최대로 발현되었을 때의 그 비활성도가 36,000 밀러 단위로 VHb 프로모터로부터 얻은 값보다 약 2.5배 이상이었으며, 단위 배지 부피당 베타 유당분해효소의 양도 VHb 프로모터에 비해 약 10배 이상이었다(J. Bacteriol., 171, 5995-6004, 1989). 이 때 nar 프로모터로부터 발현된 베타 유당분해효소가 최대로 발현되었을 때는 이 베타 유당분해효소가 전체 세포 단백질중의 약 35%를 차지하였다.

한편, Hughes 등은 VHb 프로모터와 기존의 잘 알려진 유도성 프로모터인 tac 프로모터를 서로 비교하였다(Biotechniques, 7, 1026-1028, 1989). 여기에서 비교가 타당성을 가지기 위해 두 프로모터들은동일한 플라스미드인 pBR322에 클로닝되었다. 이 실험으로부터 단위 mg당의 전체세포 단백질 중에 두 프로모터로부터 발현되는 CAT 단백질의 활성도가 거의 같다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이를 근거로 하여 nar 프로모터를 VHb 프로모터뿐만 아니라 tac 프로모터와 비교하면, nar 프로모터는 이 두 프로모터보다 약 2-3배 강함을 알 수 있었다.

이러한 사실은 Labes 등의 결과로부터도 뒷받침된다(Gene, 89, 37-46, 1990). Labes 등은 대장균에 클로닝된 lac 프로모터와 tac 프로모터로부터의 베타 유당분해효소의 발현정도를측정하였다. 이 실험에서는 lac 프로모터와 tac 프로모터가 pBR322h다 더 많은 복제수(copy number)를 가지는 플라스미드에 클로닝되었음에도 불구하고 베타 유당분해효소의 비활성도는 각각 2,000, 11,300 밀러 단위로 nar 프로모터로부터 얻은 값인 36,000 밀러 단위에 비해 각각 1/19 및 1/3에 불과하였다. 이 실험으로부터 얻은 tac 프로모터에 대한 활성도 값은 Hughes 등이 tac 프로모터에 대해 얻은 값과 거의 바슷하였다. 더구나, Hughes나 Labes의 실험에서는 Od₆₀₀이 1.0 미만에서 그 활성도 값이 얻어졌으나, nar 프로모터의 경우에서는 이 보다 훨씬 높은 Od₆₀₀=3.2에서 최대값이 얻어졌다.

결론적으로, nar 프로모터는 tac 프로모터와 VHb 프로모터에 비해 베타 유당분해효소의 비활성도는 약 2-3배 높았으며, 단위 배지 부피당 베타 유당분해효소는 약 10배 이상으로 기존의 여러 유도성 프로모터보다 우수하였다.

Claims

산소의존형 유도성 nar 프로모터와 단백질의 유전자를 함유하는 플라스미드가 형질전환된 그러므로 색체상에 비정상적인 nar 오페론을 가지는 대장균 RK5265을 0.25-1.5%의 질산염이 포함된 배양액에서 용존산소가 40%이상인 호기적인 조건에서 흡광도가 0.25-2.0이 될 때까지 배양한 후 용존산소를 1-2%로 낮춘 미세호기조건에서 유도하는 것을 특징으로 하는, 산소의존형 유도성 프로모터에 의한 단백질의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기한 대장균 RK5265의 하룻밤 배양액을 흡광도 1.3이 될 때까지 배양한 후 발효기에 접종하여 상기한 흡광도 0.25-2.0이 될 때 까지 배양하는 것을 특징으로 하는, 산소의존형 유도성 프로모터에 의한 단백질의 제조방법.
제1항 내지 제2항중 어느 한 항에 있어서, 상기한 대장균 RK5265을 배양초기부터 질산염이 포함된 배양액에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 산소의존형 유도성 프로모터에 의한 단백질의 제조방법.