KR20120129953A - 연료, 화학물질, 그리고 아미노산의 향상된 생산을 위한 감소된 부산물 축적을 갖는 효모 미생물 - Google Patents

연료, 화학물질, 그리고 아미노산의 향상된 생산을 위한 감소된 부산물 축적을 갖는 효모 미생물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물, 그리고 다양한 유익한 대사산물을 생산하기 위해 상기 재조합 미생물을 이용하는 방법에 관계한다. 본 발명의 다양한 측면에서, 재조합 미생물은 3 케토산(가령, 아세토락테이트와 2-아세토-2-히드록시부티레이트) 및/또는 알데히드-유래된 부산물의 감소 또는 제거를 유발하는 하나 또는 그 이상의 변형을 더욱 포함할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 재조합 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces) 계통분기의 미생물, 크랩트리-음성 효모 미생물, 크랩트리-양성 효모 미생물, WGD (전체 유전체 복제)-이후 효모 미생물, WGD (전체 유전체 복제)-이전 효모 미생물, 그리고 비-발효 효모 미생물일 수 있다.

Description

연료, 화학물질, 그리고 아미노산의 향상된 생산을 위한 감소된 부산물 축적을 갖는 효모 미생물{YEAST MICROORGANISMS WITH REDUCED BY-PRODUCT ACCUMULATION FOR IMPROVED PRODUCTION OF FUELS, CHEMICALS, AND AMINO ACIDS}
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2010년 2월 12일 제출된 U.S. 가출원 일련 번호 61/304,069; 2010년 2월 26일 제출된 U.S. 가출원 일련 번호 61/308,568; 2010년 3월 10일 제출된 U.S. 가출원 일련 번호 61/282,641; 2010년 6월 7일 제출된 U.S. 가출원 일련 번호 61/352,133; 2010년 11월 9일 제출된 U.S. 가출원 일련 번호 61/411,885; 그리고 2011년 1월 7일 제출된 U.S. 가출원 일련 번호 61/430,801에 우선권을 주장하고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
정부 후원에 대한 사사
본 발명은 미국 농무부 (United States Department of Agriculture)에 의해 수여된 계약 번호 2009-10006-05919 하에, 그리고 미국 무기재료위원회 (United States Army Research Laboratory)에 의해 수여된 계약 번호 W911NF-09-2-0022 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
기술 분야
재조합 미생물 및 이런 생명체를 생산하는 방법이 제시된다. 또한, 적절한 기질을 재조합 미생물 및 이들로부터 효소 제조물 (enzymatic preparation)과 접촉시킴에 의해 연료, 화학물질, 그리고 아미노산을 비롯한 유익한 대사산물을 생산하는 방법이 제시된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일에 관한 설명
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용물은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다: 서열 목록 (파일명: GEVO_045_03WO_SeqList_ST25.txt, 기록 일자: 2011년 2월 9일, 파일 크기: 306 킬로바이트)의 컴퓨터 판독가능 형식의 사본.
배경 기술
연료, 화학물질, 그리고 아미노산을 비롯한 유익한 대사산물로 피루베이트를 전환시키는 미생물의 능력은 근년의 문헌에서 폭넓게 보고되었다 (참조: Alper et al., 2009, Nature Microbiol. Rev. 7: 715-723). 재조합 조작 기술은 다수의 유용한 산물, 예를 들면, 발린, 이소류신, 류신, 그리고 판토텐산 (비타민 B5)을 생산할 수 있는 생합성 경로를 발현하는 미생물의 산출을 가능하게 하였다. 이에 더하여, 이소부탄올과 같은 연료가 이종기원성 대사 경로를 발현하는 미생물에서 재조합 방식으로 생산되었다 (참조: WO/2007/050671 (Donaldson et al.), 그리고 WO/2008/098227 (Liao, et al.)). 비록 조작된 미생물이 연료, 화학물질, 그리고 아미노산의 재생가능 생산을 위한 잠재적으로 유용한 도구를 대표하긴 하지만, 이들 미생물 중에서 대다수는 낮은 생산성 (productivity), 낮은 역가 (titer), 그리고 낮은 수율 (yield)을 비롯한 낮은 성능 특성 (performance characteristics)으로 인하여 상업적 관련성 (commercial relevance)이 부족하다.
많은 현존하는 미생물에서 관찰되는 최적하 성능 (sub-optimal performance)에 대한 일차적인 이유 중의 하나는 경로 중간물질의 원치 않는 부산물로의 바람직하지 않은 전환이다. 본 발명자들은 연료, 화학물질, 그리고 아미노산을 생산하는데 이용되는 생합성 경로의 다양한 중간물질로부터 유래되는, 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB) (CAS #14868-24-7), 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트, 2,3-디히드록시-2-메틸-부타노에이트, 이소부티레이트, 3-메틸-1-부티레이트, 2-메틸-1-부티레이트, 그리고 프로피오네이트를 비롯한 다양한 부산물을 확인하였다. 이들 부산물의 축적은 다양한 발효 반응에서 바람직한 대사산물의 합성과 수율에 부정적인 영향을 준다. 지금까지, 이들 원치 않는 부산물의 생산을 책임지는 효소적 활성은 특성화되지 않았다. 더욱 구체적으로, 본 출원은 3-케토산 환원효소 (3-KAR)와 알데히드 탈수소효소 (ALDH)의 활성이 중요한 생합성 경로 중간물질로부터 이들 부산물의 형성을 가능하게 한다는 것을 증명한다.
본 발명은 이들 효소적 활성의 연구로부터 결과이고, 그리고 3-KAR 및/또는 ALDH 효소의 억제가 원치 않는 부산물의 형성을 현저하게 감소시키거나 제거하고, 이와 동시에 유익한 대사산물의 수율과 역가를 향상시킨다는 것을 증명한다. 게다가, 본 출원은 3-KAR 및/또는 ALDH 효소적 활성의 증강이 다양한 부산물, 예를 들면, 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB), 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트, 2,3-디히드록시-2-메틸-부타노에이트, 이소부티레이트, 3-메틸-1-부티레이트, 2-메틸-1-부티레이트, 그리고 프로피오네이트의 생산을 증가시키는데 이용될 수 있다는 것을 증명한다.
본 발명의 요약
본 발명자들은 원치 않는 부산물이 생물연료 후보인 이소부탄올의 발효를 비롯한 다양한 발효 과정 동안 축적될 수 있다는 것을 발견하였다. 이들 원치 않는 부산물의 축적은 3-케토산, 아세토락테이트와 2-아세토-2-히드록시부티레이트, 및/또는 알데히드, 예를 들면, 이소부티르알데히드, 1-부타날, 1-프로파날, 2-메틸-1-부타날, 그리고 3-메틸-1-부타날을 비롯한 경로 중간물질의 바람직하지 않은 전환에 기인한다. 이들 중간물질의 원치 않는 부산물로의 전환은 3-케토산- 및/또는 알데히드-유래된 산물의 최적 생산성과 수율을 방해할 수 있다. 이런 이유로, 본 발명자들은 3-케토산 및/또는 알데히드가 경로 중간물질로서 기능하는 공정 동안 3-케토산 및/또는 알데히드 중간물질의 다양한 발효 부산물로의 전환을 감소시키기 위한 방법을 개발하였다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 3-케토산 및/또는 알데히드가 중간물질(들)인 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 (a) 3-케토산의 3-히드록시산으로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없고; (b) 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없고; (c) 3-케토산의 3-히드록시산으로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 및/또는 (d) 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 한 구체예에서, 3-케토산은 아세토락테이트이다. 다른 구체예에서, 3-케토산은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이다.
한 구체예에서, 본 발명은 3-케토산인 아세토락테이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세토락테이트의 상응하는 3-히드록시산, DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 일부 구체예에서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다.
한 구체예에서, 본 발명은 3-케토산인 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세토락테이트의 상응하는 3-히드록시산, 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 일부 구체예에서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다.
한 구체예에서, 본 발명은 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 일부 구체예에서, 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소는 알데히드 탈수소효소 (ALDH)이다.
한 구체예에서, 본 발명은 3-케토산과 알데히드 둘 모두를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 (a) 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 그리고 (b) 알데히드 중간물질의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 한 구체예에서, 3-케토산은 아세토락테이트이고, 그리고 3-히드록시산 부산물은 DH2MB이다. 다른 구체예에서, 3-케토산은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이고, 그리고 3-히드록시산 부산물은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트이다. 일부 구체예에서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 일부 다른 구체예에서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 일부 다른 구체예에서, 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소는 알데히드 탈수소효소 (ALDH)이다. 또 다른 일부 구체예에서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이고, 그리고 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소는 알데히드 탈수소효소 (ALDH)이다. 또 다른 일부 구체예에서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이고, 그리고 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소는 알데히드 탈수소효소 (ALDH)이다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 결실을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현은 적어도 대략 50% 감소된다. 다른 구체예에서, 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현은 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 결실을 포함하지 않는 재조합 미생물과 비교하여 적어도 대략 60%, 적어도 대략 65%, 적어도 대략 70%, 적어도 대략 75%, 적어도 대략 80%, 적어도 대략 85%, 적어도 대략 90%, 적어도 대략 95%, 또는 적어도 대략 99% 감소된다. 한 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이고, 그리고 3-히드록시산 부산물은 DH2MB이다. 다른 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이고, 그리고 3-히드록시산 부산물은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트이다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 단백질은 케토환원효소이다. 예시적인 구체예에서, 케토환원효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 다른 구체예에서, 단백질은 짧은 사슬 알코올 탈수소효소이다. 또 다른 구체예에서, 단백질은 중간 사슬 알코올 탈수소효소이다. 또 다른 구체예에서, 단백질은 알도오스 환원효소이다. 또 다른 구체예에서, 단백질은 D-히드록시산 탈수소효소이다. 또 다른 구체예에서, 단백질은 락테이트 탈수소효소이다. 또 다른 구체예에서, 단백질은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 및 이들의 동족체의 YAL060W, YJR159W, YGL157W, YBL114W, YOR120W, YKL055C, YBR159W, YBR149W, YDL168W, YDR368W, YLR426W, YCR107W, YIL124W, YML054C, YOL151W, YMR318C, YMR226C, YBR046C, YHR104W, YIR036C, YDL174C, YDR541C, YBR145W, YGL039W, YCR105W, YDL124W, YIR035C, YFL056C, YNL274C, YLR255C, YGL185C, YGL256W, YJR096W, YMR226C, YJR155W, YPL275W, YOR388C, YLR070C, YMR083W, YER081W, YJR139C, YDL243C, YPL113C, YOL165C, YML086C, YMR303C, YDL246C, YLR070C, YHR063C, YNL331C, YFL057C, YIL155C, YOL086C, YAL061W, YDR127W, YPR127W, YCl018W, YIL074C, YIL124W, 그리고 YEL071W 유전자로 구성된 군에서 선택된다.
한 구체예에서, 내생성 단백질은 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 예시적인 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 본 명세서에서 "TMA29"와 교체가능하게 이용되는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226C (서열 번호: 1) 단백질이다. 일부 구체예에서, 내생성 단백질은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226C (서열 번호: 1) 단백질 또는 이의 동족체 또는 변이체일 수 있다. 한 구체예에서, 동족체는 반더왈톰지마 폴리스포라(Vanderwaltomzyma polyspora) (서열 번호: 2), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 3), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 4), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 5), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii) (서열 번호: 6), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) (서열 번호: 7), 아시비아 고시피(Ashbya gossypii) (서열 번호: 8), 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri) (서열 번호: 9), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 10), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 11), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis) (서열 번호: 12), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii) (서열 번호: 13), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 14), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis) (서열 번호: 15), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (서열 번호: 16), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) (서열 번호: 17), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) (서열 번호: 18), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) (서열 번호: 19), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) (서열 번호: 20), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (서열 번호: 21), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 22), 그리고 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 23)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
한 구체예에서, 재조합 미생물은 3-케토산 환원효소를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이를 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 3-케토산 환원효소 활성의 감소를 유발한다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 3-케토산 환원효소를 인코딩하는 유전자의 부분 결실을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 3-케토산 환원효소 활성의 감소를 유발한다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 3-케토산 환원효소를 인코딩하는 유전자의 완전한 결실을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 3-케토산 환원효소 활성의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 3-케토산 환원효소를 인코딩하는 유전자와 연관된 조절 영역의 변형을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 발현의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 전사 조절자의 변형을 포함하고, 이것은 3-케토산 환원효소를 인코딩하는 유전자의 전사의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 3-케토산 환원효소를 인코딩하는 모든 유전자에서 돌연변이를 포함하고, 이것은 상기 유전자(들)에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 활성의 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 3-케토산 환원효소 활성 또는 발현은 적어도 대략 50% 감소된다. 다른 구체예에서, 3-케토산 환원효소 활성 또는 발현은 3-케토산 환원효소 활성 또는 발현의 감소를 포함하지 않는 재조합 미생물과 비교하여, 적어도 대략 60%, 적어도 대략 65%, 적어도 대략 70%, 적어도 대략 75%, 적어도 대략 80%, 적어도 대략 85%, 적어도 대략 90%, 적어도 대략 95%, 또는 적어도 대략 99% 감소된다. 한 구체예에서, 상기 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29 (YMR226C) 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 결실을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현은 적어도 대략 50% 감소된다. 다른 구체예에서, 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 결실을 포함하지 않는 재조합 미생물과 비교하여 적어도 대략 60%, 적어도 대략 65%, 적어도 대략 70%, 적어도 대략 75%, 적어도 대략 80%, 적어도 대략 85%, 적어도 대략 90%, 적어도 대략 95%, 또는 적어도 대략 99% 감소된다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 내생성 단백질은 알데히드 탈수소효소 (ALDH)이다. 한 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, ALD6, 그리고 HFD1, 그리고 이들의 동족체와 변이체로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 인코딩된다. 예시적인 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 (서열 번호: 25) 단백질이다. 일부 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 (서열 번호: 25) 단백질 또는 이의 동족체 또는 변이체이다. 한 구체예에서, 동족체는 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 26), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 27), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 28), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) (서열 번호: 29), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 30), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 31), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) YJ789 (서열 번호: 32), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) JAY291 (서열 번호: 33), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) EC1118 (서열 번호: 34), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) DBY939 (서열 번호: 35), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) AWRI1631 (서열 번호: 36), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) RM11-1a (서열 번호: 37), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 38), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 39), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 40), 그리고 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 41)로 구성된 군에서 선택된다.
한 구체예에서, 재조합 미생물은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이를 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 알데히드 탈수소효소 활성의 감소를 유발한다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 부분적인 결실을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 알데히드 탈수소효소 활성의 감소를 유발한다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 완전한 결실을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 알데히드 탈수소효소 활성의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 유전자와 연관된 조절 영역의 변형을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 발현의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 전사 조절자의 변형을 포함하고, 이것은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 전사의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 모든 유전자에서 돌연변이를 포함하고, 이것은 상기 유전자(들)에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 활성의 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 알데히드 탈수소효소 활성 또는 발현은 적어도 대략 50% 감소된다. 다른 구체예에서, 알데히드 탈수소효소 활성 또는 발현은 알데히드 탈수소효소 활성 또는 발현의 감소를 포함하지 않는 재조합 미생물과 비교하여, 적어도 대략 60%, 적어도 대략 65%, 적어도 대략 70%, 적어도 대략 75%, 적어도 대략 80%, 적어도 대략 85%, 적어도 대략 90%, 적어도 대략 95%, 또는 적어도 대략 99% 감소된다. 한 구체예에서, 상기 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 재조합 미생물은 3-케토산을 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이다. 아세토락테이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로는 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 그리고 조효소 A의 생합성을 위한 경로에서 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이다. 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로는 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생합성을 위한 경로에서 선택될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 재조합 미생물은 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함할 수 있다. 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로는 이소부탄올, 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-프로판올, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생합성을 위한 경로에서 선택될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 알데히드 중간물질은 이소부티르알데히드, 1-부타날, 2-메틸-1-부타날, 3-메틸-1-부타날, 1-프로파날, 1-펜타날, 1-헥사날, 3-메틸-1-펜타날, 4-메틸-1-펜타날, 4-메틸-1-헥사날, 그리고 5-메틸-1-헵타날에서 선택될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 재조합 미생물은 3-케토산과 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이다. 아세토락테이트와 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로는 이소부탄올, 1-부탄올, 그리고 3-메틸-1-부탄올의 생합성을 위한 경로에서 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이다. 2-아세토-2-히드록시부티레이트와 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로는 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생합성을 위한 경로에서 선택될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 이소부탄올을 생산하기 위한 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 그리고 여기서 상기 미생물은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 일부 구체예에서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 특정 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29 (YMR226C) 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 이소부탄올을 생산하기 위한 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 그리고 여기서 상기 미생물은 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 일부 구체예에서, 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소는 알데히드 탈수소효소이다. 특정 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 이소부탄올을 생산하기 위한 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 그리고 여기서 상기 미생물은 (i) 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고, 그리고 (ii) 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 일부 구체예에서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 특정 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29 (YMR226C) 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩되다. 일부 구체예에서, 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소는 알데히드 탈수소효소이다. 특정 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다.
한 구체예에서, 이소부탄올 생산 대사 경로는 피루베이트의 이소부탄올로의 전환에서 한 단계를 촉진하는 적어도 하나의 외생성 유전자를 포함한다. 다른 구체예에서, 이소부탄올 생산 대사 경로는 피루베이트의 이소부탄올로의 전환에서 단계들을 촉진하는 적어도 2개의 외생성 유전자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이소부탄올 생산 대사 경로는 피루베이트의 이소부탄올로의 전환에서 단계들을 촉진하는 적어도 3개의 외생성 유전자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이소부탄올 생산 대사 경로는 피루베이트의 이소부탄올로의 전환에서 단계들을 촉진하는 적어도 4개의 외생성 유전자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이소부탄올 생산 대사 경로는 피루베이트의 이소부탄올로의 전환에서 단계들을 촉진하는 5개의 외생성 유전자를 포함한다.
한 구체예에서, 이소부탄올 경로 유전자 중에서 하나 또는 그 이상은 시토졸에 국한되는 효소를 인코딩한다. 한 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 하나의 이소부탄올 경로 효소가 시토졸에 국한되는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함한다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 2개의 이소부탄올 경로 효소가 시토졸에 국한되는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 3개의 이소부탄올 경로 효소가 시토졸에 국한되는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 4개의 이소부탄올 경로 효소가 시토졸에 국한되는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함한다. 예시적인 구체예에서, 재조합 미생물은 5개의 이소부탄올 경로 효소가 시토졸에 국한되는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 이소부탄올 경로 유전자는 아세토락테이트 신타아제 (ALS), 케톨산 환원이성화효소 (KARI), 디히드록시산 탈수화효소 (DHAD), 2-케토산탈카르복실화효소 (KIVD), 그리고 알코올 탈수소효소 (ADH)로 구성된 군에서 선택되는 효소(들)를 인코딩한다.
다른 측면에서, 재조합 미생물은 하나 또는 그 이상의 알코올 탈수소효소의 발현을 감소시키고 및/또는 제거함으로써, 이소부탄올의 이소부티르알데히드로의 전환이 감소하도록 조작될 수 있다. 특정 구체예에서, 알코올 탈수소효소는 ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, 그리고 ADH7, 그리고 이들의 동족체와 변이체로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 인코딩된다.
다른 측면에서, 본 발명은 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는데 증강된 능력을 보이는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH)에 관계한다. 일반적으로, 이들 향상된 ADH 효소를 발현하는 세포는 발효 반응 동안 증가된 수준의 이소부탄올을 생산할 것이다. 본 발명의 변형된 ADH 효소가 이소부탄올-생산 발효 반응에서 유용성을 갖긴 하지만, 본 발명이 속하는 분야에서 평균적 기술자는 이들 변형된 ADH 효소가 다른 알코올, 예를 들면, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 1-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 그리고 3-메틸-1-부탄올을 생산하는 발효 반응에서도 유용하다는 것을 이해할 것이다.
일정한 측면에서, 본 발명은 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 능력을 증강시키기 위해 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH)에 관계한다. 이런 ADH의 실례에는 하기에서 선택되는 아미노산에 상응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 효소가 포함된다: (a) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 티로신 50; (b) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 글루타민 77; (c) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 발린 108; (d) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 티로신 113; (e) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 이소류신 212; 그리고 (f) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 류신 264, 여기서 AdhA (서열 번호: 185)는 락토코커스 락티스(L. lactis) 알코올 탈수소효소 (ADH) 유전자 adhA (서열 번호: 184) 또는 이의 코돈-최적화된 이형 (서열 번호: 206)에 의해 인코딩된다.
한 구체예에서, 변형된 ADH 효소는 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 위치 50에 상응하는 아미노산에서 돌연변이를 내포한다. 다른 구체예에서, 변형된 ADH 효소는 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 위치 77에 상응하는 아미노산에서 돌연변이를 내포한다. 또 다른 구체예에서, 변형된 ADH 효소는 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 위치 108에 상응하는 아미노산에서 돌연변이를 내포한다. 또 다른 구체예에서, 변형된 ADH 효소는 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 위치 113에 상응하는 아미노산에서 돌연변이를 내포한다. 또 다른 구체예에서, 변형된 ADH 효소는 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 위치 212에 상응하는 아미노산에서 돌연변이를 내포한다. 또 다른 구체예에서, 변형된 ADH 효소는 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 위치 264에 상응하는 아미노산에서 돌연변이를 내포한다.
한 구체예에서, ADH 효소는 앞서 기술된 위치에 상응하는 아미노산에서 2개 또는 그 이상의 돌연변이를 내포한다. 다른 구체예에서, ADH 효소는 앞서 기술된 위치에 상응하는 아미노산에서 3개 또는 그 이상의 돌연변이를 내포한다. 또 다른 구체예에서, ADH 효소는 앞서 기술된 위치에 상응하는 아미노산에서 4개 또는 그 이상의 돌연변이를 내포한다. 또 다른 구체예에서, ADH 효소는 앞서 기술된 위치에 상응하는 아미노산에서 5개 또는 그 이상의 돌연변이를 내포한다. 또 다른 구체예에서, ADH 효소는 앞서 기술된 위치에 상응하는 아미노산에서 6개의 돌연변이를 내포한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 위치 50에서 티로신이 페닐알라닌 또는 트립토판 잔기로 대체되는 ADH 효소에 관계한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 위치 77에서 글루타민이 아르기닌 또는 세린 잔기로 대체되는 ADH 효소에 관계한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 위치 108에서 발린이 세린 또는 알라닌 잔기로 대체되는 ADH 효소에 관계한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 위치 113에서 티로신이 페닐알라닌 또는 글리신 잔기로 대체되는 ADH 효소에 관계한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 위치 212에서 이소류신이 트레오닌 또는 발린 잔기로 대체되는 ADH 효소에 관계한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 위치 264에서 류신이 발린 잔기로 대체되는 ADH 효소에 관계한다. 한 구체예에서, ADH 효소는 이들 특정 구체예에서 기술된 위치에 상응하는 아미노산에서 2개 또는 그 이상의 돌연변이를 내포한다. 다른 구체예에서, ADH 효소는 이들 특정 구체예에서 기술된 위치에 상응하는 아미노산에서 3개 또는 그 이상의 돌연변이를 내포한다. 또 다른 구체예에서, ADH 효소는 이들 특정 구체예에서 기술된 위치에 상응하는 아미노산에서 4개 또는 그 이상의 돌연변이를 내포한다. 또 다른 구체예에서, ADH 효소는 이들 특정 구체예에서 기술된 위치에 상응하는 아미노산에서 5개 또는 그 이상의 돌연변이를 내포한다. 또 다른 구체예에서, ADH 효소는 이들 특정 구체예에서 기술된 위치에 상응하는 아미노산에서 6개의 돌연변이를 내포한다.
일정한 예시적인 구체예에서, ADH 효소는 서열 번호: 189, 서열 번호: 191, 서열 번호: 193, 서열 번호: 195, 서열 번호: 197, 서열 번호: 199, 서열 번호: 201, 서열 번호: 203, 서열 번호: 205, 서열 번호: 208, 서열 번호: 210, 서열 번호: 212, 서열 번호: 214, 서열 번호: 216, 서열 번호: 218, 서열 번호: 220, 서열 번호: 222, 서열 번호: 224, 그리고 야생형 또는 부모 효소와 비교하여 상응하는 돌연변이를 포함하는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 서열을 포함한다.
앞선 단락에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 범위 내에 앞서 설명된 것들에 상응하는 변형을 내포하는, 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185) 이외의 ADH 효소가 더욱 포함된다. 이런 ADH 효소에는 표 97에 열거된 ADH 효소가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일부 구체예에서, 변형되는 ADH 효소는 NADH-의존성 ADH 효소이다. 이런 NADH-의존성 ADH 효소의 실례는 공동 소유된 동시-계속 출원 U.S. Patent Publication No. 2010/0143997에서 기술되는데, 이것은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 일부 구체예에서, NADPH-이용 ADH 효소를 원래 인코딩하는 유전자는 상기 효소의 보조인자 선호 (co-factor preference)를 NADH로 전환하기 위해 변형된다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 이들 변형된 ADH는 일반적으로 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여, 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 증강된 능력을 보일 것이다. 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율 (kcat/KM)은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 5% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 15% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 25% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 50% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 75% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 100% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 200% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 500% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 1000% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 2000% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 3000% 증강된다. 가장 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 3500% 증강된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 일정한 바람직한 숙주 생명체, 예를 들면, 효모와 대장균(E. coli)에서 발현을 위해 코돈 최적화된 변형된 ADH 효소에 관계한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 변형된 ADH 효소를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관계한다. 이러한 측면에 따라, 본 발명은 또한, 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환이 요망되는 임의의 발효 과정에서 이들 변형된 ADH 효소를 이용하는 방법에 관계한다. 이러한 측면에 따른 한 구체예에서, 변형된 ADH 효소는 이소부탄올을 생산하는 숙주 세포의 능력을 증강시키는데 적합할 수 있다. 이러한 측면에 따른 다른 구체예에서, 변형된 ADH 효소는 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 1-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 그리고 3-메틸-1-부탄올을 생산하는 숙주 세포의 능력을 증강시키는데 적합할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 변형된 ADH를 포함하는 재조합 미생물은 이소부탄올 생산 대사 경로를 발현하도록 더욱 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 하나의 외생성 유전자를 포함하는 이소부탄올 생산 대사 경로를 발현하도록 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 2개의 외생성 유전자를 포함하는 이소부탄올 생산 대사 경로를 발현하도록 조작될 수 있다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 3개의 외생성 유전자를 포함하는 이소부탄올 생산 대사 경로를 발현하도록 조작될 수 있다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 4개의 외생성 유전자를 포함하는 이소부탄올 생산 대사 경로를 발현하도록 조작될 수 있다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 5개의 외생성 유전자를 포함하는 이소부탄올 생산 대사 경로를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서 본 발명에서는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하는 재조합 미생물, 그리고 상기 재조합 미생물을 이용하여 이소부탄올을 생산하는 방법을 더욱 제시한다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 이소부탄올 경로 효소(들)는 아세토락테이트 신타아제 (ALS), 케톨산 환원이성화효소 (KARI), 디히드록시산 탈수화효소 (DHAD), 2-케토산탈카르복실화효소 (KIVD), 그리고 알코올 탈수소효소 (ADH)에서 선택된다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 이소부탄올 경로 효소는 원핵 생명체로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 대안적 구체예에서, 이소부탄올 경로 효소는 진핵 생명체로부터 유래될 수 있다. 피루베이트를 이소부탄올로 전환시키는 예시적인 대사 경로는 예로써 바실루스 서브틸리스(B. subtilis)로부터 alsS에 의해 인코딩된 아세토히드록시산 신타아제 (ALS) 효소, 예로써 대장균(E. coli)으로부터 ilvC에 의해 인코딩된 케톨산 환원이성화효소 (KARI), 예로써 락토코커스 락티스(L. lactis)로부터 ilvD에 의해 인코딩된 디히드록시산 탈수화효소 (DHAD), 예로써 락토코커스 락티스(L. lactis)로부터 kivD에 의해 인코딩된 2-케토산탈카르복실화효소 (KIVD), 그리고 예로써 본 명세서에서 기술된 바와 같이 위치 Y50, Q77, V108, Y113, I212, 그리고 L264에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 락토코커스 락티스(L. lactis)로부터 adhA에 의해 인코딩된 알코올 탈수소효소 (ADH) (가령, 본 명세서에서 기술된 변형된 ADH)로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 재조합 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces) 계통분기의 미생물, 사카로미세스 센수 스트릭토(Saccharomyces sensu stricto) 미생물, 크랩트리-음성 효모 미생물, 크랩트리-양성 효모 미생물, WGD (전체 유전체 복제)-이후 효모 미생물, WGD (전체 유전체 복제)-이전 효모 미생물, 그리고 비-발효 효모 미생물일 수 있다.
일부 구체예에서, 재조합 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces) 계통분기의 효모 재조합 미생물일 수 있다.
일부 구체예에서, 재조합 미생물은 사카로미세스 센수 스트릭토(Saccharomyces sensu stricto) 미생물일 수 있다. 한 구체예에서, 사카로미세스 센수 스트릭토(Saccharomyces sensu stricto)는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), 사카로미세스 쿠드리아브제비(S. kudriavzevii), 사카로미세스 미카태(S. mikatae), 사카로미세스 바야누스(S. bayanus), 사카로미세스 우바룸(S. uvarum). 사카로미세스 카로카니스(S. carocanis) 및 이들의 하이브리드로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 재조합 미생물은 크랩트리-음성 재조합 효모 미생물일 수 있다. 한 구체예에서, 크랩트리-음성 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 아이사첸키아(Issatchenkia), 한세눌라(Hansenula), 또는 칸디다(Candida)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류된다. 추가의 구체예에서, 크랩트리-음성 효모 미생물은 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala), 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 및 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii)에서 선택된다.
일부 구체예에서, 재조합 미생물은 크랩트리-양성 재조합 효모 미생물일 수 있다. 한 구체예에서, 크랩트리-양성 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 데바리오미세스(Debaryomyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia) 및 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류된다. 추가의 구체예에서, 크랩트리-양성 효모 미생물은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 지고사카로미세스 바일리(Z. bailli), 지고사카로미세스 로욱시(Z. rouxii), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 그리고 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum)으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 재조합 미생물은 WGD (전체 유전체 복제)-이후 효모 재조합 미생물일 수 있다. 한 구체예에서, WGD-이후 효모 재조합 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 칸디다(Candida)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류된다. 추가의 구체예에서, WGD-이후 효모는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli), 그리고 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 재조합 미생물은 WGD (전체 유전체 복제)-이전 효모 재조합 미생물일 수 있다. 한 구체예에서, WGD-이전 효모 재조합 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia), 아이사첸키아(Issatchenkia), 데바리오미세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 파키솔렌(Pachysolen), 야로위아(Yarrowia) 및 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류된다. 추가의 구체예에서, WGD-이전 효모는 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis), 아이싸첸키아 옥시덴탈리스(Issatchenkia occidentalis), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala), 파키솔렌 탄노필리스(Pachysolen tannophilis), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 그리고 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 재조합 미생물은 트리코스포론(Tricosporon), 로도토룰라(Rhodotorula), 믹소지마(Myxozyma), 또는 칸디다(Candida)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 비-발효 효모 미생물인 미생물일 수 있다. 특정 구체예에서, 비-발효 효모는 칸디다 제스토비(C. xestobii)이다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 재조합 미생물을 이용하여 연료, 화학물질, 그리고 아미노산을 비롯한 유익한 대사산물을 생산하는 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 방법은 대사산물의 회수가능한 양이 생산될 때까지 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 재조합 미생물을 배양하는 단계, 그리고 선택적으로, 대사산물을 회수하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 미생물은 이론적으로 적어도 대략 5 퍼센트의 수율에서 탄소 공급원으로부터 대사산물을 생산한다. 다른 구체예에서, 미생물은 이론적으로 적어도 대략 10 퍼센트, 적어도 대략 15 퍼센트, 적어도 대략 20 퍼센트, 적어도 대략 25 퍼센트, 적어도 대략 30 퍼센트, 적어도 대략 35 퍼센트, 적어도 대략 40 퍼센트, 적어도 대략 45 퍼센트, 적어도 대략 50 퍼센트, 적어도 대략 55 퍼센트, 적어도 대략 60 퍼센트, 적어도 대략 65 퍼센트, 적어도 대략 70 퍼센트, 적어도 대략 75 퍼센트, 적어도 대략 80 퍼센트, 적어도 대략 85 퍼센트, 적어도 대략 90 퍼센트, 적어도 대략 95 퍼센트, 또는 적어도 대략 97.5 퍼센트의 수율에서 대사산물을 생산한다. 한 구체예에서, 대사산물은 3-케토산을 중간물질로서 이용하는 생합성 경로로부터 유래될 수 있다. 한 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이다. 따라서 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 그리고 조효소 A가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 대사산물은 아세토락테이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이다. 따라서 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 대사산물은 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 이소부탄올, 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-프로판올, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 대사산물은 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 대사산물은 이소부탄올, 1-부탄올, 그리고 3-메틸-1-부탄올 생합성 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 아세토락테이트와 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 대사산물은 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올 생합성 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 2-아세토-2-히드록시부티레이트와 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로로부터 유래될 수 있다.
한 구체예에서, 재조합 미생물은 호기성 조건 하에 성장된다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 미세호기성 조건 하에 성장된다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 혐기성 조건 하에 성장된다.
상세한 설명
본 명세서에서 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 문맥에서 명백하게 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다. 따라서 예로써, "폴리뉴클레오티드"에 대한 지시는 복수의 이런 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 "미생물"에 대한 지시는 하나 또는 그 이상의 미생물 등에 대한 지시를 포함한다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에서 기술된 것들에 유사하거나 동등한 방법과 물질이 이들 개시된 방법과 조성물의 실시에 이용될 수 있긴 하지만, 예시적인 방법, 장치와 물질은 본 명세서에서 기술된다.
상기에서 및 본 명세서 전반에서 논의된 임의의 간행물은 본 출원의 출원 일자에 앞서 그들의 개시 목적으로만 제공된다. 이들 중에서 어느 것도 본 발명자들이 앞선 발표에 의해 이런 공개에 앞서는 권리가 없음을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.
용어 "미생물"은 역 (domain) 고세균류 (Archaea), 세균류 (Bacteria)와 진핵생물계 (Eucarya) (후자는 효모 및 섬유성 진균 포함), 원충, 조류, 또는 고등 원생생물로부터 원핵과 진핵 세균 종을 포함한다. 용어 "세균 세포" 및 "세균"은 용어 미생물과 교체가능하게 이용된다.
용어 "속"은 Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea (Garrity, G.M., Lilburn, T.G., Cole, J.R., Harrison, S.H., Euzeby, J., 그리고 Tindall, B.J. (2007) The Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea. TOBA Release 7.7, March 2007. Michigan State University Board of Trustees. [http://www.taxonomicoutline.org/]])에 따른 관련된 종의 분류학적 그룹으로서 정의된다.
용어 "종"은 97% 이상의 16S 리보솜 RNA 서열 상동성 및 70% 이상의 유전체 혼성화 (genomic hybridization)를 갖고, 그리고 별개의 단위로서 인식될 만큼 모든 다른 생명체로부터 충분히 상이한 밀접하게 관련된 생명체의 집합으로서 정의된다.
용어 "재조합 미생물," "변형된 미생물," 및 "재조합 숙주 세포"은 본 명세서에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 내생성 폴리뉴클레오티드를 발현하거나 과다발현하고, 이종기원성 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 벡터 내에 포함된 것들, 통합 구조체 내에 포함된 것들, 또는 내인성 유전자의 발현에서 변경을 갖는 것들을 발현하도록 유전학적으로 변형된 미생물을 지칭한다. "변경"은 발현, 수준, 또는 활성이 변경의 부재에서 관찰되는 것보다 크거나 작도록 하기 위해, 유전자의 발현, 또는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 아단위를 인코딩하는 RNA 분자 또는 동등한 RNA 분자의 수준, 또는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 아단위의 활성이 상향 조절되거나 하향 조절된다는 것을 의미한다. 가령, 용어 "변경한다"는 "저해한다"를 의미할 수 있지만, 단어 "변경한다"의 이용은 이러한 정의에 한정되지 않는다.
유전자 서열에 관하여 용어 "발현"은 유전자의 전사, 그리고 적절한 경우에, 결과의 mRNA 전사체의 단백질로의 번역을 지칭한다. 따라서 문맥으로부터 명백하게 확인되는 바와 같이, 단백질의 발현은 개방 해독 틀 서열의 전사와 번역으로부터 결과이다. 숙주 세포에서 원하는 산물의 발현 수준은 세포 내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양, 또는 선별된 서열에 의해 인코딩된 원하는 산물의 양의 기초에서 결정될 수 있다. 가령, 선별된 서열로부터 전산된 mRNA는 qRT-PCR 또는 노던 혼성화 (Northern hybridization)에 의해 정량될 수 있다 (참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). 선별된 서열에 의해 인코딩된 단백질은 다양한 방법에 의해, 예를 들면, ELISA에 의해, 단백질의 생물학적 활성을 분석함에 의해, 또는 상기 단백질을 인식하고 여기에 결합하는 항체를 이용하는, 이런 활성과 무관한 검사법, 예를 들면, 웨스턴 블롯팅 (western blotting) 또는 방사면역검정 (radioimmunoassay)을 이용함에 의해 정량될 수 있다 (참조: Sambrook et al., 1989, supra). 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 원하는 대사산물을 생산하기 위한 대사 경로에 관련된 표적 효소를 인코딩한다. 용어 "재조합 미생물" 및 "재조합 숙주 세포"는 특정 재조합 미생물뿐만 아니라 이런 미생물의 자손 또는 잠재적 자손 역시 지칭하는 것으로 이해된다. 일정한 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 계속되는 세대에서 일어나기 때문에, 이런 자손은 실제로, 부모 세포와 일치하지 않을 수도 있지만, 본 명세서에서 상기 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.
용어 "과다발현"은 기초 수준의 mRNA (가령, Aft 단백질을 인코딩하는 것들)을 발현하거나 기초 수준의 단백질을 갖는 유사한 상응하는 변형되지 않은 세포와 비교하여, 세포 내에서 단백질(들) (가령, TMA29 단백질 또는 이의 동족체)을 인코딩하는 mRNA의 상승된 수준 (가령, 비정상적 수준) 및/또는 단백질(들) (가령, TMA29)의 상승된 수준을 지칭한다. 특정 구체예에서, TMA29, 또는 이들의 동족체는 증가된 TMA29 mRNA, 단백질, 및/또는 활성을 나타내도록 조작된 미생물에서 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 8-배, 10-배, 12-배, 15-배 또는 그 이상 과다발현될 수 있다.
본 명세서에서 및 당업자가 이해하는 바와 같이, 단백질, 예를 들면, 효소의 "감소된 활성 및/또는 발현"은 단백질의 감소된 특이적 촉매 활성 (가령, 감소된 활성) 및/또는 세포 내에서 단백질의 감소된 농도 (가령, 감소된 발현)을 의미할 수 있고, 반면 단백질, 예를 들면, 효소의 "결실된 활성 및/또는 발현" 또는 "제거된 활성 및/또는 발현"은 효소의 거의 또는 전혀 없는 특이적 촉매 활성 (가령. 결실된 활성) 및/또는 세포 내에서 효소의 거의 또는 전혀 없는 농도 (가령. 결실된 발현)을 의미할 수 있다.
용어 "야생형 미생물"은 자연에서 발생하는 세포, 다시 말하면, 유전학적으로 변형되지 않은 세포를 지칭한다. 야생형 미생물은 첫 번째 표적 효소를 발현하거나 과다발현하도록 유전학적으로 변형될 수 있다. 이러한 미생물은 두 번째 표적 효소를 발현하거나 과다발현하도록 변형된 미생물의 산출에서 부모 미생물로서 기능할 수 있다. 차례로, 첫 번째와 두 번째 표적 효소를 발현하거나 과다발현하도록 변형된 미생물은 세 번째 표적 효소를 발현하거나 과다발현하도록 변형될 수 있다.
따라서 "부모 미생물"은 연속하는 유전자 변형 사건에 대한 참고 세포로서 기능한다. 각 변형 사건은 참고 세포 내로 핵산 분자를 도입함으로써 달성될 수 있다. 이러한 도입은 표적 효소의 발현 또는 과다발현을 조장한다. 용어 "조장한다"는 부모 미생물에서 예로써, 프로모터 서열의 유전자 변형을 통한, 표적 효소를 인코딩하는 내생성 폴리뉴클레오티드의 활성화를 포함하는 것으로 이해된다. 게다가, 용어 "조장한다"는 표적 효소를 인코딩하는 이종기원성 폴리뉴클레오티드의 부모 미생물 내로의 도입을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "조작한다"는 미생물에서 검출가능한 변화를 유발하는 미생물의 임의의 조작을 지칭하는데, 여기서 조작은 미생물에 이종기원성인 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 삽입하고, 그리고 미생물에 선천성인 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 돌연변이시키는 것을 포함하지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "돌연변이"는 변경된 핵산 또는 폴리펩티드를 유발하는 핵산 및/또는 폴리펩티드의 임의의 변형을 지칭한다. 돌연변이에는 예로써, 폴리뉴클레오티드 내에서 점 돌연변이, 결실, 또는 단일 또는 복수 잔기의 삽입이 포함되고, 이것은 유전자의 단백질-인코딩 영역 내에서 발생하는 변경, 그리고 조절 또는 프로모터 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 단백질-인코딩 서열의 외부에서 영역의 변경이 포함한다. 유전자 변경은 임의의 유형의 돌연변이일 수 있다. 가령, 돌연변이는 점 돌연변이, 해독틀 이동 (frame-shift) 돌연변이, 난센스 돌연변이, 삽입, 또는 유전자의 일부 또는 전부의 결실을 구성할 수 있다. 이에 더하여, 변형된 미생물의 일부 구체예에서, 미생물 유전체의 일부가 이종기원성 폴리뉴클레오티드로 대체된다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 자연-발생한다. 다른 구체예에서, 돌연변이는 인위적 선택압 (artificial selection pressure)을 통해 확인되고 및/또는 농축된다. 또 다른 구체예에서, 미생물 유전체에서 돌연변이는 유전자 조작의 결과이다.
"대사 경로"로도 지칭되는 용어 "생합성 경로"는 한 가지 화학 종을 다른 화학 종으로 전환시키기 위한 일단의 동화 또는 이화 생화학적 반응을 지칭한다. 유전자 산물은 그들이 병렬로 또는 연속적으로, 동일한 기질에 작용하거나, 동일한 산물을 생산하거나, 또는 동일한 기질과 대사산물 최종 산물 사이의 물질대사 중간물질 (즉, 대사산물)에 작용하거나 이를 생산하는 동일한 "대사 경로"에 속한다.
본 명세서에서, 용어 "이소부탄올 생산 대사 경로"는 피루베이트로부터 이소부탄올을 생산하는 효소 경로를 지칭한다.
분자, 특히 효소와 폴리뉴클레오티드와 관련하여, 본 명세서에서 용어 "이종기원성"은 선천성 미생물에서 분자의 발현 수준과 비교하여 더욱 낮은, 동등한 또는 더욱 높을 수 있는 발현 수준과 상관없이, 그들이 기원하거나 자연적으로 발견되는 생명체 이외의 생명체에서 발현되는 분자를 지시한다.
다른 한편, 분자, 특히 효소와 폴리뉴클레오티드와 관련하여, 본 명세서에서 용어 "선천성" 또는 "내생성"은 선천성 미생물에서 분자의 발현 수준과 비교하여 더욱 낮은, 동등한 또는 더욱 높을 수 있는 발현 수준과 상관없이, 그들이 기원하거나 자연적으로 발견되는 생명체에서 발현되는 분자를 지시한다. 선천성 효소 또는 폴리뉴클레오티드의 발현은 재조합 미생물에서 변화될 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "공급원료 (feedstock)"은 다른 산물이 만들어질 수 있는 미생물 또는 발효 과정에 공급된 원료 또는 원료의 혼합물로서 정의된다. 가령, 탄소 공급원, 예를 들면, 바이오매스 (biomass) 또는 바이오매스로부터 유래된 탄소 화합물은 발효 과정에서 생물연료를 생산하는 미생물에 대한 공급원료이다. 하지만, 공급원료는 탄소 공급원 이외의 영양소를 내포할 수도 있다.
용어 "기질" 또는 "적절한 기질"은 효소의 작용에 의해 다른 화합물로 전환되거나, 또는 전환되도록 의도되는 임의의 물질 또는 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 단일 화합물뿐만 아니라 화합물의 조합, 예를 들면, 적어도 하나의 기질, 또는 이의 유도체를 내포하는 용액, 혼합물 및 기타 물질 역시 포함한다. 게다가, 용어 "기질"은 출발 물질로서 이용에 적합한 탄소 공급원, 예를 들면, 임의의 바이오매스 유래된 당을 제공하는 화합물뿐만 아니라, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 재조합 미생물과 연관된 경로에 이용되는 중간물질과 최종 산물 대사산물 역시 포함한다. 모든 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC) 유전자에서 돌연변이로 상기 유전자의 피루베이트 탈카르복실화효소 활성이 감소되는 조작된 효모 미생물에 대한 탄소 공급원으로서 이용되는 용어 "C2-화합물"은 에탄올과 아세테이트가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 2개의 탄소 원자로 구성되는 유기 화합물을 지칭한다.
용어 "발효" 또는 "발효 과정"은 미생물이 원료, 예를 들면, 공급원료와 영양소를 내포하는 배양 배지에서 배양되는 과정으로 정의되고, 여기서 상기 미생물은 원료, 예를 들면, 공급원료를 산물로 전환시킨다.
용어 "부피 생산성" 또는 "생산율"은 시간 단위당 형성된 산물의 양/배지의 부피로서 정의된다. 부피 생산성은 시간당 그램/리터 (g/ℓ/h)로 보고된다.
용어 "비생산성" 또는 "비생산율"은 세포의 양에 대해 시간 단위당 형성된 산물의 양/배지의 부피로서 정의된다. 비생산성은 OD에 대해 시간당 그램 또는 밀리그램/리터 (g/ℓ/h/OD)로 보고된다.
용어 "수율"은 원료의 단위 중량당 획득된 산물의 양으로서 정의되고, 그리고 산물 g/기질 g (g/g)으로서 표현될 수 있다. 수율은 이론적 수율의 백분율로서 표현될 수도 있다. "이론적 수율"은 산물을 만드는데 이용되는 대사 경로의 화학량론 (stoichiometry)에 의해 지시되는 바와 같이, 기질의 소정의 양에 대해 산출될 수 있는 산물의 최대량으로서 정의된다. 가령, 글루코오스의 이소부탄올로의 전형적인 전환에 대한 이론적 수율은 0.41 g/g이다. 따라서 0.39 g/g의 글루코오스로부터 이소부탄올의 수율은 이론적 수율의 95% 또는 95이론적 % 수율로서 표현될 것이다.
용어 "역가"는 용액의 세기 또는 용액 내에 물질의 농도로서 정의된다. 가령, 발효액 내에서 생물연료의 역가는 발효액 리터당 용액 내에 생물연료의 g (g/ℓ)으로 표현된다.
"호기성 조건"은 발효 배지 내에서 산소 농도가 호기성 또는 조건 혐기성 미생물에 의해 최종 전자 수용자 (terminal electron acceptor)로서 이용될 만큼 충분히 높은 조건으로서 정의된다.
대조적으로, "혐기성 조건"은 발효 배지 내에서 산소 농도가 미생물에 의해 최종 전자 수용자 (terminal electron acceptor)로서 이용되기에는 너무 낮은 조건으로서 정의된다. 혐기성 조건은 산소가 최종 전자 수용자로서 미생물에게 더 이상 가용하지 않을 때까지, 질소와 같은 비활성 가스를 발효 배지에 살포함으로써 달성될 수 있다. 대안으로, 혐기성 조건은 산소가 최종 전자 수용자로서 미생물에게 가용하지 않을 때까지, 발효의 가용 산소를 소모하는 미생물에 의해 달성될 수 있다. 혐기성 조건 하에 이소부탄올의 생산 방법은 공동 소유된 동시-계속 출원 US 2010/0143997에서 기술되고, 이의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
"호기성 물질대사"는 산소가 탄수화물로부터 전형적으로 ATP의 형태에서 에너지를 만들기 위해 최종 전자 수용자로서 이용되는 생화학적 과정을 지칭한다. 호기성 물질대사는 예로써, 해당 (glycolysis) 및 TCA 사이클을 거쳐 일어나는데, 여기서 단일 글루코오스 분자는 산소의 존재에서 이산화탄소로 완전하게 물질대사된다.
대조적으로, "혐기성 물질대사"는 산소가 NADH에 내포된 전자의 최종 수용자가 아닌 생화학적 과정을 지칭한다. 혐기성 물질대사는 혐기성 호흡 (여기서 산소 이외의 화합물이 최종 전자 수용자로서 기능한다), 그리고 기질 수준 인산화 (여기서 NADH로부터 전자가 "발효 경로"를 거쳐 환원된 산물을 산출하는데 이용된다)로 구분될 수 있다.
"발효 경로"에서, NAD(P)H는 NAD(P)H에서 운반된 전자를 생산하는 동일한 대사 경로에 의해 생산된 분자에 전자를 공여한다. 가령, 일정한 효모 균주의 발효 경로 중에서 하나에서, 해당을 통해 산출된 NAD(P)H는 피루베이트에 전자를 전달하여 에탄올을 산출한다. 발효 경로는 일반적으로 혐기성 조건 하에 활발하지만, 호기성 조건 하에, NADH가 호흡 연쇄 (respiratory chain)를 거쳐 완전하게 산화되지 않는 조건 하에서도 일어날 수 있다. 가령, 일정한 글루코오스 농도 이상에서, 크랩트리 양성 효모는 호기성 조건 하에 다량의 에탄올을 생산한다.
용어 "부산물"은 아미노산, 아미노산 전구물, 화학물질, 화학물질 전구물, 생물연료, 또는 생물연료 전구물의 생산에 관련된 바람직하지 않은 산물을 의미한다. 원하는 대사 경로 (가령, 이소부탄올-생산 대사 경로)와 경쟁하는 탄소 경로에서 효소적 활성 (3-KAR, ALDH, PDC, GPD 등)의 존재 또는 부재와 관련하여 이용될 때 용어 "실질적으로 없는"은 효소의 수준이 야생형 숙주 내에서 동일한 효소의 수준보다 훨씬 낮다는 것을 의미하고, 여기서 야생형 수준의 대략 50% 이하가 바람직하고 대략 30% 이하가 더욱 바람직하다. 활성은 야생형 활성의 대략 20% 이하, 대략 10% 이하, 대략 5% 이하, 또는 대략 1% 이하일 수 있다. 특정 효소적 활성 (3-KAR, ALDH, PDC, GPD 등)이 "실질적으로 없는" 미생물은 재조합 수단을 통해 산출되거나, 자연에서 확인될 수 있다.
용어 "비-발효 효모"는 NADH로부터 전자가 발효 경로, 예를 들면, 글루코오스로부터 에탄올과 CO2의 생산을 거쳐 환원된 산물을 산출하는데 이용되는 혐기성 물질대사를 실현하지 못하는 효모 종이다. 비-발효 효모는 "다람 발효관 (Durham Tube) 검사"에 의해 (J.A. Barnett, R.W. Payne, and D. Yarrow. 2000. Yeasts Characteristics and Identification. 3rd edition. p. 28-29. Cambridge University Press, Cambridge, UK) 또는 에탄올과 CO2와 같은 발효 산물의 생산을 모니터링함으로써 확인될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 본 명세서에서 용어 "핵산"과 교체가능하게 이용되고, 그리고 임의의 길이의 단일 가닥 또는 이중 가닥, 센스 또는 안티센스 데옥시리보핵산 (DNA) 및 적절한 경우에, siRNA를 비롯한 임의의 길이의 단일 가닥 또는 이중 가닥, 센스 또는 안티센스 리보핵산 (RNA)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 이들의 상사체를 포함하는 2개 또는 그 이상의 단위체로 구성되는 유기 중합체를 지칭한다. 용어 "뉴클레오티드"는 퓨린 또는 피리미딘 염기 및 포스페이트 기에 연결된 리보오스 또는 데옥시리보오스 당으로 구성되고, 그리고 핵산의 염기성 구조적 단위인 임의의 몇몇 화합물을 지칭한다. 용어 "뉴클레오시드"는 데옥시리보오스 또는 리보오스와 결합된 퓨린 또는 피리미딘 염기로 구성되고 특히 핵산에서 발견되는 화합물 (구아노신 또는 아데노신으로서)을 지칭한다. 용어 "뉴클레오티드 상사체" 또는 "뉴클레오시드 상사체"는 각각, 하나 또는 그 이상의 개별 원자가 상이한 원자 또는 상이한 기능기로 대체되는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 지칭한다. 따라서 용어 폴리뉴클레오티드는 임의의 길이의 핵산, DNA, RNA, 상사체 및 이들의 단편을 포함한다. 3개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드는 또한, 뉴클레오티드성 올리고머 (nucleotidic oligomer) 또는 올리고뉴클레오티드로 불린다.
본 명세서에서 기술된 폴리뉴클레오티드는 "유전자"를 포함하고, 그리고 본 명세서에서 기술된 핵산 분자는 "벡터" 또는 "플라스미드"를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서 용어 "유전자" (일명, "구조적 유전자")는 아미노산의 특정 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는데, 이것은 하나 또는 그 이상의 단백질 또는 효소의 전부 또는 일부를 포함하고, 그리고 예로써, 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 조절 (비-전사된) DNA 서열, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 유전자의 전사된 영역은 코딩 서열뿐만 아니라 인트론, 5'-비번역 영역 (UTR), 그리고 3'-UTR을 비롯한 비번역 영역을 포함할 수 있다.
용어 "오페론"은 공통 프로모터로부터 단일 전사 단위로서 전사되는 2개 또는 그 이상의 유전자를 지칭한다. 일부 구체예에서, 오페론을 포함하는 유전자는 연속된 유전자이다. 전체 오페론의 전사는 공통 프로모터를 변형함으로써 변화 (즉, 증가, 감소, 또는 제거)될 수 있는 것으로 이해된다. 대안으로, 오페론 내에 임의의 유전자 또는 유전자의 조합이 인코딩된 폴리펩티드의 기능 또는 활성을 변화시키기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 인코딩된 폴리펩티드의 활성에서 증가를 유발할 수 있다. 게다가, 이러한 변형은 인코딩된 폴리펩티드에 새로운 활성을 부여할 수 있다. 예시적인 새로운 활성에는 대안적 기질의 이용 및/또는 대안적 환경 조건에서 기능하는 능력이 포함된다.
"벡터"는 핵산이 증식하고 및/또는 생명체, 세포, 또는 세포 성분 사이에서 이전될 수 있는 임의의 수단이다. 벡터에는 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 플라스미드, 파지미드, 트랜스포손, 그리고 인공 염색체, 예를 들면, YAC (효모 인공 염색체), BAC (박테리아 인공 염색체), 그리고 PLAC (식물 인공 염색체) 등이 포함되는데, 이들은 자율적으로 복제하거나, 또는 숙주 세포의 염색체 내로 통합될 수 있는 "에피솜 (episome)"이다. 벡터는 또한, 나신 RNA 폴리뉴클레오티드, 나신 DNA 폴리뉴클레오티드, 동일한 가닥 내에서 DNA와 RNA 둘 모두로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 폴리-리신-접합된 DNA 또는 RNA, 펩티드-접합된 DNA 또는 RNA, 리포좀-접합된 DNA 등일 수 있는데, 이들은 자연 상태에서 에피솜이 아니고, 또는 이것은 상기 폴리뉴클레오티드 구조체 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하는 생명체, 예를 들면, 아그로박테륨 (agrobacterium) 또는 세균류일 수 있다.
"형질전환 (transformation)"은 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 과정을 지칭한다. 형질전환 (또는 형질도입 (transduction), 또는 형질감염 (transfection))은 화학적 형질전환 (가령. 리튬 아세테이트 형질전환), 전기천공 (electroporation), 미세주입 (microinjection), 바이오블리스틱 (biolistics) (또는 입자 폭발-매개된 전달 (particle bombardment-mediated delivery)), 또는 아그로박테륨 매개된 형질전환을 비롯한 다수의 수단 중에서 한 가지로 달성될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "효소"는 하나 또는 그 이상의 화학적 또는 생화학적 반응을 촉진하거나 증진하는 임의의 물질을 지칭하고, 여기에는 일반적으로, 폴리펩티드로 완전하게 또는 부분적으로 구성되는 효소가 포함되지만, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상이한 분자로 구성되는 효소가 포함될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "단백질," "펩티드," 또는 "폴리펩티드"는 2개 또는 그 이상의 아미노산 단위체 및/또는 이들의 상사체로 구성되는 유기 중합체를 지칭한다. 본 명세서에서, 용어 "아미노산" 또는 "아미노산 단위체"는 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 (optical isomer)를 포함하는 임의의 자연 및/또는 합성 아미노산을 지칭한다. 용어 "아미노산 상사체"는 하나 또는 그 이상의 개별 원자가 상이한 원자, 또는 상이한 기능기로 대체되는 아미노산을 지칭한다. 따라서 용어 폴리펩티드는 전장 단백질을 비롯한 임의 길이의 아미노산 중합체, 그리고 펩티드 및 이들의 상사체와 단편을 포함한다. 3개 또는 그 이상의 아미노산의 폴리펩티드는 또한, 단백질 올리고머 또는 올리고펩티드로 불린다.
첫 번째 과 (family) 또는 종 (species)의 본래 효소 또는 유전자와 관련하여 이용된 용어 "동족체 (homolog)"는 기능적, 구조적 또는 유전체적 분석에 의해, 첫 번째 과 또는 종의 본래 효소 또는 유전자에 상응하는 두 번째 과 (family) 또는 종 (species)의 효소 또는 유전자인 것으로 결정되는 두 번째 과 또는 종의 별개의 효소 또는 유전자를 지칭한다. 가장 빈번하게는, 동족체는 기능적, 구조적 또는 유전체적 유사성을 가질 것이다. 유전자 프로브 및 PCR을 이용하여 효소 또는 유전자의 동족체를 용이하게 클로닝할 수 있는 기술은 공지되어 있다. 클로닝된 서열의 동족체로서의 정체는 기능적 검사법을 이용하고 및/또는 유전자의 유전체 맵핑 (genomic mapping)에 의해 확인될 수 있다.
단백질은 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 두 번째 유전자의 아미노산 서열과 유사한 아미노산 서열을 가지면, 두 번째 단백질에 "상동성 (homology)"을 갖거나 또는 "상동하다". 대안으로, 단백질은 이들 두 단백질이 "유사한" 아미노산 서열을 가지면, 두 번째 단백질에 상동성을 갖는다 (따라서 용어 "상동한 단백질"은 이들 두 단백질이 유사한 아미노산 서열을 갖는다는 것을 의미하는 것으로 정의된다).
용어 "상사체 (analog)" 또는 "상사한"은 기능에서만 서로 관련되고, 그리고 공통 혈통으로부터 유래되지 않거나 공통 조상 서열을 공유하지 않는 핵산 또는 단백질 서열 또는 단백질 구조를 지칭한다. 상사체는 서열에서 상이하지만, 수렴 진화 (convergent evolution)로 인하여 유사한 구조를 공유할 수 있다. 가령, 두 효소는 이들 효소가 기질의 산물로의 전환의 동일한 반응을 촉진하고 서열에서 무관하면, 이들 두 효소가 구조에서 관련되는 지에 상관없이, 상사체이거나 상사하다.
감소된 부산물 축적을 갖는 재조합 미생물
효모 세포는 당을 전환시켜 피루베이트를 생산하고, 이것은 이후, 세포 물질대사의 다수의 경로에서 이용된다. 근년에, 효모 세포는 피루베이트-주동된 생합성 경로를 거쳐 다수의 바람직한 산물을 생산하기 위해 조작되고 있다. 이들 생합성 경로 중에서 다수에서, 최초 경로 단계는 내생성 피루베이트의 3-케토산으로의 전환이다.
본 명세서에서, "3-케토산"은 C1 탄소 상에서 카르복실산 모이어티 (moiety) 및 C3 탄소 상에서 케톤 모이어티를 내포하는 유기 화합물을 지칭한다. 가령, 아세토락테이트 및 2-히드록시-2-메틸-3-옥소부탄산은 C3 탄소에서 케톤 기를 갖는 3-케토산이다 (예로써, 도 2 참조).
많은 생합성 경로에 공통적인 3-케토산의 실례는 아세토락테이트인데, 이것은 효소 아세토락테이트 신타아제 (일명, 아세토히드록시산 신타아제)의 작용에 의해 피루베이트로부터 형성된다. 아세토락테이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로 중에는 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 그리고 조효소 A의 생산을 위한 경로가 포함된다. 이들 유익한 아세토락테이트-유래된 대사산물의 합성을 위한 조작된 생합성 경로는 표 1 및 도 18에서 제시된다.
아세토락테이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로
생합성 경로 참고문헌 a
이소부탄올 US 2009/0226991 (Feldman et al.), US 2011/0020889 (Feldman et al.), 그리고 US 2010/0143997 (Buelter et al.)
1-부탄올 WO/2010/017230 (Lynch), WO/2010/031772 (Wu et al.), 그리고 KR2011002130 (Lee et al.)
2-부탄올 WO/2007/130518 (Donaldson et al.), WO/2007/130521 (Donaldson et al.), 그리고 WO/2009/134276 (Donaldson et al.)
2-부타논 WO/2007/130518 (Donaldson et al.), WO/2007/130521 (Donaldson et al.), 그리고 WO/2009/134276 (Donaldson et al.)
2-3-부탄디올 WO/2007/130518 (Donaldson et al.), WO/2007/130521 (Donaldson et al.), 그리고 WO/2009/134276 (Donaldson et al.)
아세토인 WO/2007/130518 (Donaldson et al.), WO/2007/130521 (Donaldson et al.), 그리고 WO/2009/134276 (Donaldson et al.)
디아세틸 Gonzalez et al., 2000, J. Biol. Chem 275: 35876-85 및 Ehsani et al., 2009, App. Environ. Micro. 75: 3196-205
발린 WO/2001/021772 (Yocum et al.) 및 McCourt et al., 2006, Amino Acids 31: 173-210
류신 WO/2001/021772 (Yocum et al.) 및 McCourt et al., 2006, Amino Acids 31: 173-210
판토텐산 WO/2001/021772 (Yocum et al.)
3-메틸-1-부탄올 WO/2008/098227 (Liao et al.), Atsumi et al., 2008, Nature 451: 86-89, 그리고 Connor et al., 2008, Appl. Environ. Microbiol. 74: 5769-5775
4-메틸-1-펜탄올 WO/2010/045629 (Liao et al.), Zhang et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:20653-20658
조효소 A WO/2001/021772 (Yocum et al.)
a - 본 표에서 각 참고문헌의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
표 1에 열거된 각 생합성 경로는 공통의 3-케토산 중간물질, 아세토락테이트를 공유한다. 이런 이유로, 이들 생합성 경로로부터 산물 수율은 상기 생합성 경로의 하류 효소에 가용한 아세토락테이트의 양에 부분적으로 의존할 것이다.
많은 생합성 경로에 공통적인 3-케토산의 다른 실례는 2-아세토-2-히드록시부티레이트인데, 이것은 효소 아세토락테이트 신타아제 (일명, 아세토히드록시산 신타아제)의 작용에 의해 피루베이트 및 2-케토부티레이트로부터 형성된다. 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로 중에는 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생산을 위한 경로가 포함된다. 이들 유익한 2-아세토-2-히드록시부티레이트-유래된 대사산물의 합성을 위한 조작된 생합성 경로는 표 2 및 도 19에서 제시된다.
2-아세토-2-히드록시부티레이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로
생합성 경로 참고문헌 a
2-메틸-1-부탄올 WO/2008/098227 (Liao et al.), WO/2009/076480 (Picataggio et al.), 그리고 Atsumi et al., 2008, Nature 451: 86-89
이소류신 McCourt et al., 2006, Amino Acids 31: 173-210
3-메틸-1-펜탄올 WO/2010/045629 (Liao et al.), Zhang et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:20653-20658
4-메틸-1-헥산올 W WO/2010/045629 (Liao et al.), Zhang et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:20653-20658
5-메틸-1-헵탄올 WO/2010/045629 (Liao et al.), Zhang et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:20653-20658
a - 본 표에서 각 참고문헌의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
표 2에 열거된 각 생합성 경로는 공통의 3-케토산 중간물질, 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 공유한다. 이런 이유로 이들 생합성 경로로부터 산물 수율은 상기 생합성 경로의 하류 효소에 가용한 아세토락테이트의 양에 부분적으로 의존할 것이다.
유사하게, 효모 세포는 알데히드를 경로 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 거쳐 다수의 바람직한 산물을 생산하기 위해 조작될 수 있다. 알데히드 중간물질을 포함하는 조작된 생합성 경로에는 이소부탄올, 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-프로판올, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생산을 위한 생합성 경로가 포함된다 (표 3 및 도 18, 19, 그리고 20 참조).
알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로
생합성 경로 알데히드 중간물질 참고문헌 a
이소부탄올 이소부티르알데히드 US 2009/0226991 (Feldman et al.), US 2011/0020889 (Feldman et al.), 그리고 US 2010/0143997 (Buelter et al.)
1-부탄올 1-부타날 WO/2010/017230 (Lynch), WO/2010/031772 (Wu et al.), WO/2010/045629 (Liao et al.), WO/2007/041269 (Donaldson et al.), WO/2008/052991 (Raamsdonk et al.), WO/2008/143704 (Buelter et al.), 그리고 WO/2008/080124 (Gunawardena et al.)
2-메틸-1-부탄올 2-메틸-1-부타날 WO/2008/098227 (Liao et al.), WO/2009/076480 (Picataggio et al.), 그리고 Atsumi et al., 2008, Nature 451: 86-89
3-메틸-1-부탄올 3-메틸-1-부타날 WO/2008/098227 (Liao et al.), Atsumi et al., 2008, Nature 451: 86-89, 그리고 Connor et al., 2008, Appl. Environ. Microbiol. 74: 5769-5775
1-프로판올 1-프로파날 WO/2008/098227 (Liao et al.)
1-펜탄올 1-펜타날 WO/2010/045629 (Liao et al.), Zhang et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:20653-20658
1-헥산올 1-헥사날 WO/2010/045629 (Liao et al.), Zhang et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:20653-20658
3-메틸-1-펜탄올 3-메틸-1-펜타날 WO/2010/045629 (Liao et al.), Zhang et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:20653-20658
4-메틸-1-펜탄올 4-메틸-1-펜타날 WO/2010/045629 (Liao et al.), Zhang et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:20653-20658
4-메틸-1-헥산올 4-메틸-1-헥사날 WO/2010/045629 (Liao et al.), Zhang et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:20653-20658
5-메틸-1-헵탄올 5-메틸-1-헵타날 WO/2010/045629 (Liao et al.), Zhang et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:20653-20658
a - 본 표에서 각 참고문헌의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
표 3에 열거된 각 생합성 경로는 알데히드 중간물질을 갖는다. 가령, 이소부탄올 생산 대사 경로에서 알데히드 중간물질은 이소부티르알데히드이고 (도 1 참조), 반면 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-프로판올, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생산을 위한 경로는 각각, 1-부타날, 2-메틸-1-부타날, 3-메틸-1-부타날, 1-프로파날, 1-펜타날, 1-헥사날, 3-메틸-1-펜타날, 4-메틸-1-펜타날, 4-메틸-1-헥사날, 그리고 5-메틸-1-헵탄올을 알데히드 중간물질로서 이용한다. 이런 이유로, 이들 알데히드 중간물질을 이용하는 생합성 경로에서 산물 수율은 상기 생합성 경로의 하류 효소에 가용한 알데히드 중간물질의 양에 부분적으로 의존할 것이다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 3-케토산 및/또는 알데히드 중간물질로부터 유래된 원치 않는 부산물의 축적을 담당하는 효소적 활성을 발견하였다. 구체적으로, 이들은 3-케토산 환원효소 및 알데히드 탈수소효소가 각각, 3-케토산 및 알데히드의 원치 않는 부산물로의 전환을 책임진다는 것을 확정하였다. 이들 효소의 활성은 표 1-3에 열거된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 3-케토산- 및/또는 알데히드-유래된 산물의 최적 생산성과 수율을 방해하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 이들 새로 특징화된 효소적 활성을 억제하면, 원치 않는 부산물의 형성이 상당히 감소되거나 제거되고, 그리고 유익한 대사산물의 수율과 역가가 부수적으로 향상된다는 것을 발견하였다.
3-케토산으로부터 3-히드록시산의 감소된 축적
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 원치 않는 부산물, 3-히드록시산이 3-케토산 중간물질을 수반하는 경로를 포함하는 미생물로 발효 반응 동안 축적될 수 있다는 것을 발견하였다.
본 명세서에서, "3-히드록시산"은 C1 탄소 상에서 카르복실산 모이어티 및 C3 탄소 탄소 상에서 알코올 모이어티를 내포하는 유기 화합물이다. 3-히드록시산은 3-케토산 케톤 모이어티의 알코올 모이어티로의 화학적 환원에 의해 3-케토산으로부터 획득될 수 있다. 가령, 아세토락테이트 또는 2-히드록시-2-메틸-3-옥소부탄산에서 케톤 모이어티의 환원은 3-히드록시산 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)의 형성을 유발한다 (예로써, 도 2 참조).
본 발명자들은 3-히드록시산 부산물, 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (CAS # 14868-24-7) (DH2MB)이 3-케토산 중간물질, 아세토락테이트를 수반하는 생합성 경로를 포함하는 미생물로 발효 반응 동안 축적된다는 것을 발견하였다. 이러한 부산물의 축적은 생합성 경로의 표적 대사산물의 최적 생산성과 수율을 방해하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 DH2MB의 생산이 아세토락테이트의 환원에 의해 유발된다는 것을 발견하였다. DH2MB의 생산을 책임지는 활성을 감소시키거나 제거하기 위해, 이러한 반응을 촉진하는 상응하는 효소적 활성이 확인되고 감소되거나 제거되어야 했다. 본 발명자들은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)에서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 이와 같은 한 가지 효소가 YMR226C (일명, TMA29)라는 것을 발견하였다. 이것은 효모에서, 아세토락테이트를 DH2MB로 전환시키는 단백질을 최초로 보고한다.
본 발명자들은 또한, 3-히드록시산 부산물, 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트가 3-케토산 중간물질, 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 수반하는 생합성 경로를 포함하는 미생물로 발효 반응 동안 축적된다는 것을 발견하였다. 이러한 부산물의 축적은 생합성 경로의 표적 대사산물의 최적 생산성과 수율을 방해하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트의 생산이 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 감소에 의해 유발된다는 것을 발견하였다. 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트의 생산을 책임지는 활성을 감소시키거나 제거하기 위해, 이러한 반응을 촉진하는 상응하는 효소적 활성이 확인되고 감소되거나 제거되어야 했다. 본 발명자들은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)에서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소 YMR226C (일명, TMA29)가 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환 역시 촉진한다는 것을 발견하였다. 이것은 효모에서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로 전환시키는 단백질을 최초로 보고한다.
본 발명자들은 본 명세서에서, 바람직한 대사산물의 수율에서 증가를 동반하는 과정인, 3-케토산 중간물질의 상응하는 3-히드록시산 부산물로의 전환을 감소시키기 위한 복수 전략을 기술한다. 한 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이고, 그리고 상응하는 3-히드록시산은 DH2MB이다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 감소시키는 것은 아세토락테이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로로부터 유래되는 유익한 대사산물, 예를 들면, 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 그리고 조효소 A의 증가된 생산을 가능하게 한다. 다른 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이고, 그리고 상응하는 3-히드록시산은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트이다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환을 감소시키는 것은 유익한 대사산물, 예를 들면, 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 증가된 생산을 가능하게 한다.
따라서 본 발명의 한 측면은 3-케토산을 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없다. 한 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이고, 그리고 3-히드록시산 부산물은 DH2MB이다. 다른 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이고, 그리고 3-히드록시산 부산물은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트이다.
다른 측면에서, 본 발명은 3-케토산을 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 한 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이고, 그리고 3-히드록시산 부산물은 DH2MB이다. 다른 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이고, 그리고 3-히드록시산 부산물은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트이다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 단백질은 케토환원효소이다. 예시적인 구체예에서, 케토환원효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 본 명세서에서, 용어 "3-케토산 환원효소"는 3-케토산의 3-옥소 기를 향하여 활동성인 케토환원효소 (즉, 케톤 환원효소)를 지칭한다. 3-케토산 환원효소에 의해 촉진될 수 있는 예시적인 반응의 도해는 도 2에 도시된다. 적절한 3-케토산 환원효소는 일반적으로, 효소 분류 하위집단 1.1.1.X에서 확인되는데, 여기서 마지막 자리 숫자 X는 기질에 좌우된다. 예시적인 3-케토산 환원효소의 무제한적 목록 및 이들의 상응하는 효소 분류 번호는 도 3에 도시된다.
예시적인 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 본 명세서에서 "TMA29"와 교체가능하게 이용되는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226C (서열 번호: 1) 단백질이다. 일부 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226C (서열 번호: 1) 단백질 또는 이의 동족체 또는 변이체이다. 한 구체예에서, 동족체는 반더왈톰지마 폴리스포라(Vanderwaltomzyma polyspora) (서열 번호: 2), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 3), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 4), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 5), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii) (서열 번호: 6), 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) (서열 번호: 7), 아시비아 고시피(Ashbya gossypii) (서열 번호: 8), 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri) (서열 번호: 9), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 10), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 11), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis) (서열 번호: 12), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii) (서열 번호: 13), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 14), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis) (서열 번호: 15), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (서열 번호: 16), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) (서열 번호: 17), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) (서열 번호: 18), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) (서열 번호: 19), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) (서열 번호: 20), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (서열 번호: 21), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 22), 그리고 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 23)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 3-케토산 환원효소를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이를 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 3-케토산 환원효소 활성의 감소를 유발한다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 3-케토산 환원효소 유전자를 인코딩하는 유전자의 부분적인 결실을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 3-케토산 환원효소 활성의 감소를 유발한다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 3-케토산 환원효소를 인코딩하는 유전자의 완전한 결실을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 3-케토산 환원효소 활성의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 3-케토산 환원효소를 인코딩하는 유전자와 연관된 조절 영역의 변형을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 발현의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 전사 조절자의 변형을 포함하고, 이것은 3-케토산 환원효소를 인코딩하는 유전자의 전사의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 3-케토산 환원효소를 인코딩하는 모든 유전자에서 돌연변이를 포함하고, 이것은 상기 유전자(들)에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 활성의 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 상기 3-케토산 환원효소 유전자는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29 (YMR226C) 유전자 또는 이의 동족체이다. 당분야에서 이해되는 바와 같이, 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 이외의 효모에서 TMA29의 자연 발생 동족체는 본 발명의 방법을 이용하여 유사하게 비활성화될 수 있다. TMA29 동족체 및 이런 TMA29 동족체를 확인하는 방법은 본 명세서에서 기술된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조절된 프로모터의 이용, 약한 구조성 프로모터의 이용, 이배체 효모에서 유전자의 2개 사본 중에서 하나의 파괴, 이배체 효모에서 유전자의 2개 사본 모두의 파괴, 안티센스 핵산의 발현, siRNA의 발현, 내인성 프로모터의 부정적 조절자의 과다발현, 내인성 또는 이종기원성 유전자의 활성의 변경, 더욱 낮은 비활성을 갖는 이종기원성 유전자의 이용 등 또는 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 3-케토산 환원효소와 같은 단백질의 활성을 감소시키거나 파괴하는데 이용가능한 몇몇 추가의 기전이 존재한다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 재조합 미생물은 변형되지 않은 부모 미생물보다 더욱 적은 3-히드록시산 부산물을 생산하도록 조작된다. 한 구체예에서, 재조합 미생물은 대략 20 퍼센트 이하의 탄소 수율에서 탄소 공급원으로부터 3-히드록시산 부산물을 생산한다. 다른 구체예에서, 미생물은 대략 10 이하, 대략 5 이하, 대략 2 이하, 대략 1 이하, 대략 0.5 이하, 대략 0.1 이하, 또는 대략 0.01 퍼센트 이하의 탄소 수율에서 탄소 공급원으로부터 3-히드록시산 부산물을 생산한다. 한 구체예에서, 3-히드록시산 부산물은 3-케토산, 아세토락테이트로부터 유래된 DH2MB이다. 다른 구체예에서, 3-히드록시산 부산물은 3-케토산, 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 유래된 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트이다.
한 구체예에서, 3-케토산으로부터 유래된 3-히드록시산 부산물 탄소 수율은 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 결실을 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 재조합 미생물에서 적어도 대략 50% 감소된다. 다른 구체예에서, 3-케토산으로부터 유래된 3-히드록시산 부산물은 3-케토산의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 결실을 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 60%, 적어도 대략 65%, 적어도 대략 70%, 적어도 대략 75%, 적어도 대략 80%, 적어도 대략 85%, 적어도 대략 90%, 적어도 대략 95%, 적어도 대략 99%, 적어도 대략 99.9%, 또는 적어도 대략 100% 감소된다. 한 구체예에서, 3-히드록시산 부산물은 3-케토산, 아세토락테이트로부터 유래된 DH2MB이다. 다른 구체예에서, 3-히드록시산 부산물은 3-케토산, 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 유래된 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트이다.
추가의 구체예에서, 바람직한 발효 산물의 수율은 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 제거를 포함하는 재조합 미생물에서 증가된다. 한 구체예에서, 바람직한 발효 산물의 수율은 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 1% 증가된다. 다른 구체예에서, 바람직한 발효 산물의 수율은 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 5%, 적어도 대략 10%, 적어도 대략 25%, 또는 적어도 대략 50% 증가된다. 한 구체예에서, 3-히드록시산 부산물은 3-케토산, 아세토락테이트로부터 유래된 DH2MB이다. 따라서 한 구체예에서, 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 그리고 조효소 A가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 바람직한 발효 산물은 아세토락테이트가 중간물질로서 기능하는 임의의 생합성 경로로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 3-히드록시산 부산물은 3-케토산, 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 유래된 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트이다. 따라서 다른 구체예에서, 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 바람직한 발효 산물은 2-아세토-2-히드록시부티레이트가 중간물질로서 기능하는 임의의 생합성 경로로부터 유래된다.
진전된 구체예에서, 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 잠재적으로 촉진하는 추가의 효소는 3-케토산을 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물의 유전체로부터 결실된다. 3-케토산 중간물질을 3-히드록시산 부산물로 전환시키는 잠재력을 갖는 내생성 효모 유전자에는 케토환원효소, 짧은 사슬 알코올 탈수소효소, 중간 사슬 알코올 탈수소효소, 알도오스 환원효소 패밀리의 구성원, D-히드록시산 탈수소효소 패밀리의 구성원, 알코올 탈수소효소, 그리고 락테이트 탈수소효소가 포함된다. 한 구체예에서, 3-히드록시산 부산물은 3-케토산, 아세토락테이트로부터 유래된 DH2MB이다. 다른 구체예에서, 3-히드록시산 부산물은 3-케토산, 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 유래된 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트이다.
3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 추가의 효소를 확인하는 방법은 하기와 같이 개설된다:
케토환원효소, 짧은 사슬 알코올 탈수소효소, 중간 사슬 알코올 탈수소효소, 알도오스 환원효소 패밀리의 구성원, D-히드록시산 탈수소효소 패밀리의 구성원, 알코올 탈수소효소, 그리고 락테이트 탈수소효소를 코딩하는 내생성 효모 유전자는 3-케토산 (가령, 아세토락테이트 또는 2-아세토-2-히드록시부티레이트)이 중간물질인 생합성 경로를 포함하는 효모 균주의 유전체로부터 결실된다. 이들 결실 균주는 상응하는 3-히드록시산 부산물 (가령, 아세토락테이트 및 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 각각 유래된 DH2MB 또는 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트)의 존재와 농도에 대해 발효액의 발효와 분석에 의해 부모 균주와 비교된다. 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)에서, 3-히드록시산 부산물의 생산을 감소시키는 결실은 복수 결실을 보유하는 균주의 작제에 의해 합동된다. 후보 유전자에는 YAL060W, YJR159W, YGL157W, YBL114W, YOR120W, YKL055C, YBR159W, YBR149W, YDL168W, YDR368W, YLR426W, YCR107W, YILL24W, YML054C, YOL151W, YMR318c, YBR046C, YHR104W, YIR036C, YDL174C, YDR541C, YBR145W, YGL039W, YCR105W, YDL124W, YIR035C, YFL056C, YNL274c, YLR255C, YGL185C, YGL256W, YJR096W, YJR155W, YPL275W, YOR388C, YLR070C, YMR083W, YER081W, YJR139C, YDL243C, YPL113C, YOL165C, YML086C, YMR303C, YDL246C, YLR070C, YHR063C, YNL331C, YFL057C, YIL155C, YOL086C, YAL061W, YDR127W, YPR127W, YCL018W, YIL074C, YIL124W, 그리고 YEL071W가 포함될 수 있지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 결실 균주 중에서 다수는 상업적으로 구입가능하다 (가령, Open Biosystems YSC1054). 이들 결실 균주는 ALS 유전자 (가령, 바실루스 서브틸리스(B. subtilis) alsS)가 CUP1 프로모터의 제어 하에 발현되는 플라스미드 pGV2435로 형질전환된다. 형질전환체 (transformant)는 교반 배양기 내에서 48시간 동안 30℃, 75 rpm에서 교반 플라스크에서 150 g/ℓ 글루코오스를 내포하는 YPD 배지에서 배양된다. 48시간후, 교반 플라스크로부터 샘플은 3-히드록시산 부산물 (가령, 아세토락테이트 및 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 각각 유래된 DH2MB 및 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트)의 농도에 대해 HPLC에 의해 분석된다. 당분야에서 이해되는 바와 같이, 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 이외의 효모에서 3-케토산 환원효소 유전자 (가령, TMA29)의 자연 발생 동족체는 유사하게 비활성화될 수 있다. 3-케토산 환원효소 유전자 (가령, TMA29) 동족체 및 이런 3-케토산 환원효소 유전자 동족체를 확인하는 방법은 본 명세서에서 기술된다.
결실 라이브러리를 스크리닝하는 다른 방법은 효모 세포를 3-케토산 중간물질 (가령, 아세토락테이트 또는 2-아세토-2-히드록시부티레이트)과 함께 배양하고, 그리고 상응하는 3-히드록시산 부산물 (가령, 아세토락테이트 및 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 각각 유래된, DH2MB 또는 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트)의 생산에 대해 배양액을 분석하는 것이다.
열거된 유전자 중에서 일부는 탠덤 복제 또는 전체 유전체 복제 사건의 결과이고, 그리고 유사한 기질 특이성을 가질 것으로 예상된다. 실례는 YAL061W (BDH1), 그리고 YAL060W (BDH2), YDR368W (YPR1) 및 YOR120W (GCY1)이다. 복제된 유전자 중에서 단지 하나의 결실은 표현형을 유발하지 않을 것으로 생각된다. 이들 유전자 쌍은 양쪽 유전자에서 결실을 보유하는 균주에서 분석되어야 한다.
3-히드록시산 부산물 (가령, 아세토락테이트 및 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 각각 유래된 DH2MB 또는 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트)의 생산을 책임지는 추가의 내인성 활성을 찾기 위한 대안적 접근법은 이러한 3-히드록시산 부산물의 생산을 책임지는 효소를 인코딩하는 것으로 의심되는 유전자를 과다발현하는 효모 균주를 분석하는 것이다. 이런 균주는 앞서 열거된 다수의 후보 유전자 (가령, Open Biosystems YSC3870)에 대해 상업적으로 구입가능하다. ORF 과다발현 균주는 결실 균주에서와 동일한 방식으로 처리된다. 이들은 ALS 발현을 위해 플라스미드로 형질전환되고 3-히드록시산 부산물 (가령, DH2MB 또는 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트) 생산 수준에 대해 스크리닝되었다. 3-히드록시산 부산물 (가령, DH2MB 또는 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트)의 생산을 유발하는 가능한 유전자의 목록을 좁히기 위해, 이들의 발현은 발효 샘플에서 분석될 수 있다. 3-히드록시산 부산물 (가령, DH2MB 또는 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트)을 생산하는 발효 동안 발현되지 않는 유전자는 가능한 표적의 목록으로부터 배제될 수 있다. 이러한 분석은 발효조 샘플로부터 RNA의 추출 및 이들 샘플을 예로써, Roche NimbleGen에 의한 전체 유전체 발현 분석에 종속시킴에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 낮은 수준의 하나 또는 그 이상의 3-히드록시산 부산물을 자연적으로 생산하는 균주는 3-케토산 중간물질을 포함하는 생합성 경로로부터 유래되는, 증가된 수준의 바람직한 발효 산물을 생산하는 데에도 적용가능성 (applicability)을 가질 수 있다. 본 발명이 속하는 분야의 평균적 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 낮은 수준의 하나 또는 그 이상의 3-히드록시산 부산물을 자연적으로 생산하는 균주는 본질적으로 낮거나 검출되지 않는 수준의 내생성 효소 활성을 나타내고 3-케토산의 3-히드록시산으로의 감소된 전환을 유발하는데, 이러한 속성은 바람직한 발효 산물, 예를 들면, 이소부탄올의 생산에 유리하다. 3-케토산 환원효소 활성이 실질적으로 없는 선천성 숙주 미생물을 확인하기 위한 몇몇 접근법이 본 명세서에서 기술된다. 가령, 3-히드록시산 부산물 (가령, DH2MB 또는 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트)의 생산을 책임지는, 본질적으로 낮거나 검출되지 않는 내생성 효소 활성을 나타내는 숙주 미생물을 찾는 한 가지 접근법은 효모 세포를 3-케토산 (가령, 아세토락테이트 또는 2-아세토-2-히드록시부티레이트)과 함께 배양함으로써 효모 균주를 분석하고, 그리고 상응하는 3-히드록시산 부산물 (가령, 아세토락테이트 및 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 각각 유래된 DH2MB 또는 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트)의 생산에 대해 배양액을 분석하는 것이다.
3-케토산을 중간물질로서 이용하는 생합성 경로로부터 유래된 유익한 대사산물을 생산하는 본 명세서에서 기술된 재조합 미생물은 피루베이트의 3-케토산 (가령, 아세토락테이트 및/또는 2-아세토-2-히드록시부티레이트) 이외의 산물로의 전환을 위한 효소적 활성이 감소되거나 제거되도록 더욱 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC), 락테이트 탈수소효소 (LDH), 피루베이트 산화효소, 피루베이트 탈수소효소, 및/또는 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD)의 효소적 활성이 감소되거나 제거된다.
특정 구체예에서, 유익한 대사산물은 아세토락테이트 신타아제 (ALS) 유전자를 과다발현하는 재조합 PDC-마이너스 GPD-마이너스 효모 미생물에서 생산된다. 다른 특정 구체예에서, ALS는 바실루스 서브틸리스(B. subtilis) alsS에 의해 인코딩된다.
알데히드 중간물질로부터 산성 부산물의 감소된 축적
실시예에서 더욱 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 또한, 원치 않는 산성 부산물 (가령, 이소부탄올의 경우에 이소부티레이트)이 알데히드 중간물질 (가령, 이소부탄올의 경우에 이소부티르알데히드)을 수반하는 경로를 포함하는 미생물로 발효 반응 동안 축적될 수 있다는 것을 발견하였다.
본 명세서에서, "산성 부산물"은 카르복실산 모이어티를 내포하는 유기 화합물을 지칭한다. 산성 부산물은 알데히드의 산화에 의해 획득될 수 있다. 가령, 이소부티르알데히드의 산화는 이소부티르산의 형성을 유발한다 (예로써, 도 4 참조).
본 발명자들은 이들 산성 부산물의 축적이 알데히드 중간물질을 이용하는 생합성 경로의 최적 생산성과 수율을 방해한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이들 산성 부산물의 생산이 상응하는 알데히드의 탈수소화에 의해 유발된다는 것을 발견하였다. 산성 부산물의 생산을 책임지는 활성을 감소시키거나 제거하기 위해, 이러한 반응을 촉진하는 상응하는 효소적 활성은 확인되고 감소되거나 제거되어야 했다. 본 발명자들은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)에서, 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 이와 같은 한 가지 효소가 알데히드 탈수소효소라는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 본 명세서에서, 바람직한 대사산물, 예를 들면, 이소부탄올, 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-프로판올, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 수율에서 증가를 동반하는 과정인, 산성 부산물 형성을 감소시키기 위한 복수 전략을 기술한다.
따라서 본 발명의 한 측면은 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없다.
다른 측면에서, 본 발명은 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다.
한 구체예에서, 알데히드 중간물질은 이소부티르알데히드이고, 그리고 산성 부산물은 이소부티레이트이다. 다른 구체예에서, 알데히드 중간물질은 1-부타날이고, 그리고 산성 부산물은 부티레이트이다. 또 다른 구체예에서, 알데히드 중간물질은 2-메틸-1-부타날이고, 그리고 산성 부산물은 2-메틸-1-부티레이트이다. 또 다른 구체예에서, 알데히드 중간물질은 3-메틸-1-부타날이고, 그리고 산성 부산물은 3-메틸-1-부티레이트이다. 또 다른 구체예에서, 알데히드 중간물질은 1-프로파날이고, 그리고 산성 부산물은 프로피오네이트이다. 또 다른 구체예에서, 알데히드 중간물질은 1-펜타날이고, 그리고 산성 부산물은 펜타노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 알데히드 중간물질은 1-헥사날이고, 그리고 산성 부산물은 헥사노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 알데히드 중간물질은 3-메틸-1-펜타날이고, 그리고 산성 부산물은 3-메틸-1-펜타노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 알데히드 중간물질은 4-메틸-1-펜타날이고, 그리고 산성 부산물은 4-메틸-1-펜타노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 알데히드 중간물질은 4-메틸-1-헥사날이고, 그리고 산성 부산물은 4-메틸-1-헥사노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 알데히드 중간물질은 5-메틸-1-헵타날이고, 그리고 산성 부산물은 5-메틸-1-헵타노에이트이다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 단백질은 알데히드 탈수소효소 (ALDH)이다.
본 명세서에서, 용어 "알데히드 탈수소효소"는 하기 반응을 촉진하는 효소를 지칭한다:
알데히드 + 산화된 보조인자 + H2O = 산 + 환원된 보조인자 + H+
알데히드 탈수소효소에 의해 촉진될 수 있는 예시적인 반응의 도해는 도 4에 도시된다. 적절한 알데히드 탈수소효소는 일반적으로, 효소 분류 하위집단 EC 1.2.1.X에서 확인되는데, 여기서 마지막 자리 숫자 X는 기질 또는 보조인자에 좌우된다. 가령, EC 1.2.1.3은 하기 반응을 촉진한다: 알데히드 + NAD+ + H2O = 산 + NADH + H+); EC 1.2.1.4는 하기 반응을 촉진한다: 알데히드 + NADP+ + H2O = 산 + NADPH + H+); 그리고 EC1.2.1.5는 하기 반응을 촉진한다: 알데히드 + NAD(P)+ + H2O = 산 + NAD(P)H + H+.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 단백질은 알데히드 탈수소효소 (ALDH)이다. 한 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, ALD6, 그리고 HFD1, 그리고 이들의 동족체와 변이체로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 인코딩된다. 예시적인 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 알데히드 탈수소효소 ALD6 (서열 번호: 25) 또는 이의 동족체 또는 변이체이다. 한 구체예에서, 동족체는 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 26), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 27), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 28), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) (서열 번호: 29), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 30), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 31), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) YJ789 (서열 번호: 32), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) JAY291 (서열 번호: 33), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) EC1118 (서열 번호: 34), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) DBY939 (서열 번호: 35), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) AWRI1631 (서열 번호: 36), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) RM11-1a (서열 번호: 37), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 38), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 39), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 40), 그리고 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 41)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
한 구체예에서, 재조합 미생물은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이를 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 알데히드 탈수소효소 활성의 감소를 유발한다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 부분적인 결실을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 알데히드 탈수소효소 활성의 감소를 유발한다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 완전한 결실을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 알데히드 탈수소효소 활성의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 유전자와 연관된 조절 영역의 변형을 포함하고, 이것은 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 발현의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 전사 조절자의 변형을 포함하고, 이것은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 전사의 감소를 유발한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 알데히드 탈수소효소를 인코딩하는 모든 유전자에서 돌연변이를 포함하고, 이것은 상기 유전자(들)에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 활성의 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 상기 알데히드 탈수소효소는 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, ALD6, 그리고 HFD1, 그리고 이들의 동족체와 변이체로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 인코딩된다. 당분야에서 이해되는 바와 같이, 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 이외의 효모에서 알데히드 탈수소효소의 자연 발생 동족체는 본 발명의 방법을 이용하여 유사하게 비활성화될 수 있다. 알데히드 탈수소효소 동족체 및 이런 알데히드 탈수소효소 동족체를 확인하는 방법은 본 명세서에서 기술된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조절된 프로모터의 이용, 약한 구조성 프로모터의 이용, 이배체 효모에서 유전자의 2개 사본 중에서 하나의 파괴, 이배체 효모에서 유전자의 2개 사본 모두의 파괴, 안티센스 핵산의 발현, siRNA의 발현, 내인성 프로모터의 부정적 조절자의 과다발현, 내인성 또는 이종기원성 유전자의 활성의 변경, 더욱 낮은 비활성을 갖는 이종기원성 유전자의 이용 등 또는 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 알데히드 탈수소효소와 같은 단백질의 활성을 감소시키거나 파괴하는데 이용가능한 몇몇 추가의 기전이 존재한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 하나 이상의 알데히드 탈수소효소의 활성 또는 발현이 감소되거나 제거될 수 있다. 특정 구체예에서, ALD4와 ALD6 또는 이들의 동족체 또는 변이체의 활성 또는 발현이 감소되거나 제거된다. 다른 특정 구체예에서, ALD5와 ALD6 또는 이들의 동족체 또는 변이체의 활성 또는 발현이 감소되거나 제거된다. 또 다른 특정 구체예에서, ALD4, ALD5, 그리고 ALD6 또는 이들의 동족체 또는 변이체의 활성 또는 발현이 감소되거나 제거된다. 또 다른 특정 구체예에서, 시토졸에 국한된 알데히드 탈수소효소 ALD2, ALD3, 그리고 ALD6 또는 이들의 동족체 또는 변이체의 활성 또는 발현이 감소되거나 제거된다. 또 다른 특정 구체예에서, 미토콘드리아에 국한된 알데히드 탈수소효소 ALD4와 ALD5 또는 이들의 동족체 또는 변이체의 활성 또는 발현이 감소되거나 제거된다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 재조합 미생물은 변형되지 않은 부모 미생물보다 더욱 적은 산성 부산물을 생산하도록 조작된다. 한 구체예에서, 재조합 미생물은 부모 미생물과 비교하여 대략 50 퍼센트 이하의 탄소 수율에서 탄소 공급원으로부터 산성 부산물을 생산한다. 다른 구체예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여 대략 25 퍼센트 이하, 대략 10 퍼센트 이하, 대략 5 퍼센트 이하, 대략 1 퍼센트 이하, 대략 0.5 퍼센트 이하, 대략 0.1 퍼센트 이하, 또는 대략 0.01 퍼센트 이하의 탄소 수율에서 탄소 공급원으로부터 산성 부산물을 생산한다. 한 구체예에서, 산성 부산물은 이소부탄올 생합성 경로의 중간물질인 이소부티르알데히드로부터 유래된 이소부티레이트이다. 다른 구체예에서, 산성 부산물은 1-부탄올 생합성 경로의 중간물질인 1-부타날로부터 유래된 부티레이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 2-메틸-1-부탄올 생합성 경로의 중간물질인 2-메틸-1-부타날로부터 유래된 2-메틸-1-부티레이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 3-메틸-1-부탄올 생합성 경로의 중간물질인 3-메틸-1-부타날로부터 유래된 3-메틸-1-부티레이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 1-프로판올 생합성 경로의 중간물질인 1-프로파날로부터 유래되는 프로피오네이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 1-펜탄올 생합성 경로의 중간물질인 1-펜타날로부터 유래된 펜타노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 1-헥산올 생합성 경로의 중간물질인 1-헥사날로부터 유래된 헥사노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 3-메틸-1-펜탄올 생합성 경로의 중간물질인 3-메틸-1-펜타날로부터 유래된 3-메틸-1-펜타노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 4-메틸-1-펜탄올 생합성 경로의 중간물질인 4-메틸-1-펜타날로부터 유래된 4-메틸-1-펜타노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 4-메틸-1-헥산올 생합성 경로의 중간물질인 4-메틸-1-헥사날로부터 유래된 4-메틸-1-헥사노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 5-메틸-1-헵탄올 생합성 경로의 중간물질인 5-메틸-1-헵타날로부터 유래된 5-메틸-1-헵타노에이트이다.
한 구체예에서, 상응하는 알데히드로부터 산성 부산물 탄소 수율은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 결실을 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 재조합 미생물에서 적어도 대략 50% 감소된다. 다른 구체예에서, 아세토락테이트로부터 산성 부산물 탄소 수율은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 결실을 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 60%, 적어도 대략 65%, 적어도 대략 70%, 적어도 대략 75%, 적어도 대략 80%, 적어도 대략 85%, 적어도 대략 90%, 적어도 대략 95%, 적어도 대략 99%, 적어도 대략 99.9%, 또는 적어도 대략 100% 감소된다. 한 구체예에서, 산성 부산물은 이소부탄올 생합성 경로의 중간물질인 이소부티르알데히드로부터 유래된 이소부티레이트이다. 다른 구체예에서, 산성 부산물은 1-부탄올 생합성 경로의 중간물질인 1-부타날로부터 유래된 부티레이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 2-메틸-1-부탄올 생합성 경로의 중간물질인 2-메틸-1-부타날로부터 유래된 2-메틸-1-부티레이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 3-메틸-1-부탄올 생합성 경로의 중간물질인 3-메틸-1-부타날로부터 유래된 3-메틸-1-부티레이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 1-프로판올 생합성 경로의 중간물질인 1-프로파날로부터 유래된 프로피오네이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 1-펜탄올 생합성 경로의 중간물질인 1-펜타날로부터 유래된 펜타노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 1-헥산올 생합성 경로의 중간물질인 1-헥사날로부터 유래된 헥사노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 3-메틸-1-펜탄올 생합성 경로의 중간물질인 3-메틸-1-펜타날로부터 유래된 3-메틸-1-펜타노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 4-메틸-1-펜탄올 생합성 경로의 중간물질인 4-메틸-1-펜타날로부터 유래된 4-메틸-1-펜타노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 4-메틸-1-헥산올 생합성 경로의 중간물질인 4-메틸-1-헥사날로부터 유래된 4-메틸-1-헥사노에이트이다. 또 다른 구체예에서, 산성 부산물은 5-메틸-1-헵탄올 생합성 경로의 중간물질인 5-메틸-1-헵타날로부터 유래된 5-메틸-1-헵타노에이트이다.
추가의 구체예에서, 바람직한 발효 산물의 수율은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 제거를 포함하는 재조합 미생물에서 증가된다. 한 구체예에서, 바람직한 발효 산물의 수율은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 1% 증가된다. 다른 구체예에서, 바람직한 발효 산물의 수율은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 5%, 적어도 대략 10%, 적어도 대략 25%, 또는 적어도 대략 50% 증가된다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 바람직한 발효 산물은 이소부탄올, 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-프로판올, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올 생합성 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 알데히드가 중간물질로서 기능하는 임의의 생합성 경로로부터 유래될 수 있다.
알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 추가의 효소를 확인하는 방법은 하기와 같이 개설된다:
추정 알데히드와 알코올 탈수소효소를 코딩하는 내생성 효모 유전자는 효모 균주의 유전체로부터 결실된다. 이들 결실 균주는 효소적 검사법에 의해 부모 균주와 비교된다. 이들 결실 균주 중에서 다수는 상업적으로 구입가능하다 (가령, Open Biosystems YSC1054).
결실 라이브러리를 스크리닝하는 다른 방법은 효모 세포를 알데히드 (가령, 이소부티르알데히드 또는 1-부타날)와 함께 배양하고, 그리고 상응하는 산성 부산물 (가령, 이소부티르알데히드 또는 1-부타날로부터 각각 유래된 이소부티레이트 또는 부티레이트)의 생산에 대해 배양액을 분석하는 것이다.
산성 부산물 (가령, 이소부티르알데히드 또는 1-부타날로부터 각각 유래된 이소부티레이트 또는 부티레이트)의 생산을 책임지는 추가의 내인성 활성을 찾는 대안적 접근법은 산성 부산물의 생산을 책임지는 효소를 인코딩하는 것으로 의심되는 유전자를 과다발현하는 효모 균주를 분석하는 것이다. 이런 균주는 앞서 열거된 다수의 후보 유전자에 대해 상업적으로 구입가능하다 (가령, Open Biosystems YSC3870). ORF 과다발현 균주는 증가된 산성 부산물 생산 수준에 대해 스크리닝된다. 대안으로, ORF 과다발현 균주의 세포 용해물은 증가된 알데히드 산화 활성에 대해 분석된다. 산성 부산물의 생산을 유발하는 가능한 유전자의 목록을 좁히기 위해, 이들의 발현은 발효 샘플에서 분석될 수 있다. 산성 부산물을 생산하는 발효 동안 발현되지 않는 유전자는 가능한 표적의 목록으로부터 배제될 수 있다. 이러한 분석은 발효조 샘플로부터 RNA의 추출 및 이들 샘플을 예로써, Roche NimbleGen에 의한 전체 유전체 발현 분석에 종속시킴에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 낮은 수준의 하나 또는 그 이상의 산성 부산물을 자연적으로 생산하는 균주는 알데히드 중간물질을 포함하는 생합성 경로로부터 유래되는, 증가된 수준의 바람직한 발효 산물을 생산하는 데에도 적용가능성 (applicability)을 가질 수 있다. 본 발명이 속하는 분야의 평균적 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 낮은 수준의 하나 또는 그 이상의 산성 부산물을 자연적으로 생산하는 균주는 본질적으로 낮거나 검출되지 않는 수준의 내생성 효소 활성을 나타내고 알데히드의 산성 부산물로의 감소된 전환을 유발하는데, 이러한 속성은 바람직한 발효 산물, 예를 들면, 이소부탄올의 생산에 유리하다. 알데히드 탈수소효소 활성이 실질적으로 없는 선천성 숙주 미생물을 확인하기 위한 몇몇 접근법이 본 명세서에서 기술된다. 가령, 산성 부산물 (가령, 이소부티레이트 또는 부티레이트)의 생산을 책임지는, 본질적으로 낮거나 검출되지 않는 내생성 효소 활성을 나타내는 숙주 미생물을 찾는 한 가지 접근법은 효모 세포를 알데히드 (가령, 이소부티르알데히드 또는 1-부타날)와 함께 배양함으로써 효모 균주를 분석하고, 그리고 상응하는 산성 부산물 (가령, 이소부티르알데히드 또는 1-부타날로부터 각각 유래된 이소부티레이트 또는 부티레이트)의 생산에 대해 배양액을 분석하는 것이다.
앞서 기술된 바와 같이, 산성 부산물, 이소부티레이트의 생산을 감소시키는 한 가지 전략은 이소부티르알데히드를 이소부티레이트로 전환시킬 수 있는 효모 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 내생성 알데히드 탈수소효소 단백질의 활성 또는 발현을 감소시키거나 제거하는 것이다.
이소부티레이트의 생산을 감소시키는 다른 전략은 하나 또는 그 이상의 내생성 효모 알코올 탈수소효소의 활성 또는 발현의 감소 또는 제거이다. 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, 그리고 SFA1, 그리고 이들의 동족체 또는 변이체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 하나 또는 그 이상의 알코올 탈수소효소의 발현을 감소시키거나, 또는 이들을 결실시키는 것은 일반적으로, 이소부티레이트의 감소된 생산 및 이소부탄올 수율에서 부수적 증가를 유발할 것이다. 추가의 탈수소효소의 감소 및/또는 결실이 본 발명에서 계획되고 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 이들 탈수소효소에는 아릴 알코올 탈수소효소, 예를 들면, AAD3, AAD4, AAD6, AAD10, AAD14, AAD15, AAD16, 그리고 YPL088W, 그리고 이들의 동족체 또는 변이체뿐만 아니라 추가의 알코올 탈수소효소, 예를 들면, 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) BDH1, BDH2, SOR1, SOR2, XYL1, 그리고 이들의 동족체 또는 변이체가 포함된다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 카르보닐/알데히드 환원효소를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 추가의 유전자가 감소되고 및/또는 결실되도록 조작된 재조합 미생물을 제시한다. 이들 카르보닐/알데히드 환원효소에는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ARI1, YPR1, TMA29, YGL039W, 그리고 UGA2, 그리고 이들의 동족체 또는 변이체가 포함된다.
부산물 이소부티레이트의 생산을 감소시키기 위한 본 명세서에서 기술된 추가의 전략은 이소부탄올 경로 중간물질 2-케토이소발레레이트로부터 이소부티레이트를 생산할 수 있는 효모 내에 존재하는 내생성 단백질의 활성 또는 발현을 감소시키거나 제거하는 것이다. 이런 효소는 일반적으로, 케토산 탈수소효소 (KDH)로 지칭된다. 이들 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 제거 또는 감소는 원치 않는 부산물, 이소부티레이트의 생산을 감소시키거나 제거할 수 있다. KDH 효소 활성은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)에서 확인되었다 (Dickinson, J. R., and I. W. Dawes, 1992, The catabolism of branched-chain amino acids occurs via a 2-oxoacid dehydeogenase in S. cerevisiae. J. Gen. Microbiol. 138: 2029-2033). 하나 또는 그 이상의 케토산 탈수소효소 및 이들의 동족체 또는 변이체의 발현을 감소시키거나, 또는 이들을 결실시키는 것은 일반적으로, 이소부티레이트의 감소된 생산 및 이소부탄올 수율에서 부수적인 증가를 유발할 것이다.
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 및 기타 효모에서 유전자의 발현 감소 또는 결실은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면, 대립형질 대체 또는 교체, 그리고 다른 유전자 또는 마커 카세트 (marker cassette)의 삽입에 의한 유전자 파괴에 의해 달성될 수 있다.
부산물 이소부티레이트의 생산을 감소시키기 위한 본 명세서에서 기술된 다른 전략은 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환을 책임지는 알코올 탈수소효소 (ADH)의 활성 및/또는 발현을 증가시키는 것이다. 이러한 전략은 이소부탄올 경로 중간물질, 이소부티르알데히드에 대한 내생성 효소에 의한 경쟁을 예방한다. 알코올 탈수소효소의 활성 및/또는 발현에서 증가는 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 가령, 알코올 탈수소효소 활성은 증가된 프로모터 세기를 갖는 프로모터를 이용함으로써, 알코올 탈수소효소 유전자의 사본 수를 증가시킴으로써, 또는 증가된 비활성을 갖는 대안적 또는 변형된 알코올 탈수소효소를 이용함으로써 증가될 수 있다.
부산물 이소부티레이트의 생산을 감소시키기 위한 본 명세서에서 기술된 대안적 전략은 미카엘리스-멘텐 상수 (Michaelis-Menten constant, KM)에서 감소를 나타내는, 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환을 책임지는 이소부탄올 경로에서 알코올 탈수소효소 (ADH)를 이용하는 것이다. 이러한 전략은 또한, 이소부탄올 경로 중간물질, 이소부티르알데히드에 대한 내생성 효소에 의한 경쟁을 예방한다.
부산물 이소부티레이트의 생산을 감소시키기 위한 본 명세서에서 기술된 다른 전략은 증가된 활성 및 미카엘리스-멘텐 상수 (KM)에서 감수를 나타내는, 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환을 책임지는 이소부탄올 경로에서 알코올 탈수소효소 (ADH)를 이용하는 것이다. 이러한 전략 역시 이소부탄올 경로 중간물질, 이소부티르알데히드에 대한 내생성 효소에 의한 경쟁을 예방한다.
게다가, 변형된 ADH 효소를 이용함으로써, 본 발명자들은 정반응 (forward reaction) (즉, 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환)이 역반응 (reverse reaction) (즉, 이소부탄올의 이소부티르알데히드로의 전환)에 비하여 선호되는 반응인 상황을 구축할 수 있다.
앞서 기술된 전략은 일반적으로, 이소부티레이트 수율에서 감소를 유발하고, 이것은 이소부탄올 수율에서 증가를 동반한다. 따라서 이들 전략은 이소부티레이트 수율 및/또는 역가를 감소시키고, 그리고 이소부티레이트 수율에 대한 이소부탄올 수율의 비율을 증가시키는데 유용하다.
한 구체예에서, 이소부티레이트 수율 (mol 이소부티레이트 / mol 글루코오스)은 대략 5% 이하이다. 다른 구체예에서, 이소부티레이트 수율 (mol 이소부티레이트 / mol 글루코오스)은 대략 1% 이하이다. 또 다른 구체예에서, 이소부티레이트 수율 (mol 이소부티레이트 / mol 글루코오스)은 대략 0.5% 이하, 대략 0.1% 이하, 대략 0.05% 이하, 또는 대략 0.01% 이하이다.
한 구체예에서, 이소부탄올 대(對) 이소부티레이트 수율 비율은 적어도 대략 2이다. 다른 구체예에서, 이소부탄올 대(對) 이소부티레이트 수율은 적어도 대략 5이다. 또 다른 구체예에서, 이소부탄올 대(對) 이소부티레이트 수율 비율은 적어도 대략 20, 적어도 대략 100, 적어도 대략 500, 또는 적어도 대략 1000이다.
알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로로부터 유래된 유익한 대사산물을 생산하는 본 명세서에서 기술된 재조합 미생물은 피루베이트의 3-케토산 (가령, 아세토락테이트 및/또는 2-아세토-2-히드록시부티레이트) 이외의 산물로의 전환을 위한 효소적 활성이 감소되거나 제거되도록 더욱 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC), 락테이트 탈수소효소 (LDH), 피루베이트 산화효소, 피루베이트 탈수소효소, 및/또는 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD)의 효소적 활성이 감소되거나 제거된다.
특정 구체예에서, 유익한 대사산물은 아세토락테이트 신타아제 (ALS) 유전자를 과다발현하는 재조합 PDC-마이너스 GPD-마이너스 효모 미생물에서 생산된다. 다른 특정 구체예에서, ALS는 바실루스 서브틸리스(B. subtilis) alsS에 의해 인코딩된다.
3-히드록시산 부산물과 산성 부산물의 감소된 축적
본 발명자들은 본 명세서에서, 바람직한 대사산물의 수율에서 증가를 동반하는 과정인 3-케토산 중간물질의 상응하는 3-히드록시산 부산물로의 전환을 감소시키기 위한 복수 전략을 기술한다. 또한, 본 발명자들은 본 명세서에서, 바람직한 대사산물의 수율에서 더욱 증가를 동반하는 과정인 알데히드 중간물질의 상응하는 산성 부산물로의 전환을 감소시키기 위한 복수 전략을 기술한다.
따라서 한 측면에서, 본 발명은 3-케토산을 중간물질로서 이용하고 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 (i) 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없고, 그리고 (ii) 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없다. 한 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이다. 아세토락테이트와 알데히드 중간물질로서 이용하는 생합성 경로는 이소부탄올, 1-부탄올, 그리고 3-메틸-1-부탄올의 생합성을 위한 경로에서 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이다. 2-아세토-2-히드록시부티레이트와 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로는 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생합성을 위한 경로에서 선택될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 3-케토산을 중간물질로서 이용하고 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 (i) 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고, 그리고 (ii) 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 한 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이다. 아세토락테이트와 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로는 이소부탄올, 1-부탄올, 그리고 3-메틸-1-부탄올의 생합성을 위한 경로에서 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이다. 2-아세토-2-히드록시부티레이트와 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로는 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생합성을 위한 경로에서 선택될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 3-케토산 중간물질의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 단백질은 케토환원효소이다. 예시적인 구체예에서, 케토환원효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 다른 예시적인 구체예, 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226C (서열 번호: 1) 단백질 또는 이의 동족체 또는 변이체이다. 한 구체예에서, 동족체는 반더왈톰지마 폴리스포라(Vanderwaltomzyma polyspora) (서열 번호: 2), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 3), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 4), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 5), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii) (서열 번호: 6), 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) (서열 번호: 7), 아시비아 고시피(Ashbya gossypii) (서열 번호: 8), 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri) (서열 번호: 9), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 10), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 11), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis) (서열 번호: 12), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii) (서열 번호: 13), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 14), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis) (서열 번호: 15), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (서열 번호: 16), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) (서열 번호: 17), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) (서열 번호: 18), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) (서열 번호: 19), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) (서열 번호: 20), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (서열 번호: 21), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 22), 그리고 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 23)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 구체예에서, 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 단백질은 알데히드 탈수소효소 (ALDH)이다. 한 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, ALD6, 그리고 HFD1, 그리고 이들의 동족체와 변이체로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 인코딩된다. 예시적인 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 알데히드 탈수소효소 ALD6 (서열 번호: 25) 또는 이의 동족체 또는 변이체이다. 한 구체예에서, 동족체는 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 26), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 27), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 28), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) (서열 번호: 29), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 30), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 31), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) YJ789 (서열 번호: 32), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) JAY291 (서열 번호: 33), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) EC1118 (서열 번호: 34), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) DBY939 (서열 번호: 35), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) AWRI1631 (서열 번호: 36), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) RM11-1a (서열 번호: 37), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 38), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 39), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 40), 그리고 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 41)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
3-케토산과 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로로부터 유래된 유익한 대사산물을 생산하는 본 명세서에서 기술된 재조합 미생물은 피루베이트의 3-케토산 (가령, 아세토락테이트 및/또는 2-아세토-2-히드록시부티레이트) 이외의 산물로의 전환을 위한 효소적 활성이 감소되거나 제거되도록 더욱 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC), 락테이트 탈수소효소 (LDH), 피루베이트 산화효소, 피루베이트 탈수소효소, 및/또는 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD)의 효소적 활성이 감소되거나 제거된다.
특정 구체예에서, 유익한 대사산물은 아세토락테이트 신타아제 (ALS) 유전자를 과다발현하는 재조합 PDC-마이너스 GPD-마이너스 효모 미생물에서 생산된다. 다른 특정 구체예에서, ALS는 바실루스 서브틸리스(B. subtilis) alsS에 의해 인코딩된다.
3-히드록시산 부산물 및/또는 산성 부산물의 축적을 감소시키기 위한 전략의 예시적인 구체예
특정한 예시적인 구체예에서, 재조합 미생물은 아세토락테이트와 이소부티르알데히드가 중간물질인 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세토락테이트 중간물질의 DH2MB로의 전환 및 이소부티르알데히드 중간물질의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없다. 다른 특정 구체예에서, 재조합 미생물은 아세토락테이트와 이소부티르알데히드가 중간물질인 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 (i) 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고, 그리고 (ii) 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 한 구체예에서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 다른 구체예에서, 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소는 알데히드 탈수소효소 (ALDH)이다. 3-케토산 환원효소 (3-KAR)와 알데히드 탈수소효소 (ALDH)가 제거되는 이런 경로의 무제한적 실례는 도 5에 도시된다.
더욱 특정한 예시적인 구체예에서, 재조합 미생물은 아세토락테이트와 3-메틸-1-부타날이 중간물질인 3-메틸-1-부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세토락테이트 중간물질의 DH2MB로의 전환 및 3-메틸-1-부타날 중간물질의 3-메틸-1-부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없다. 다른 특정 구체예에서, 재조합 미생물은 아세토락테이트와 3-메틸-1-부타날이 중간물질인 3-메틸-1-부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 (i) 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고, 그리고 (ii) 3-메틸-1-부타날의 3-메틸-1-부티레이트로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 한 구체예에서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 다른 구체예에서, 3-메틸-1-부타날의 3-메틸-1-부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소는 알데히드 탈수소효소 (ALDH)이다. 3-케토산 환원효소 (3-KAR)와 알데히드 탈수소효소 (ALDH)가 제거되는 이런 경로의 무제한적 실례는 도 6에 도시된다.
더욱 특정한 예시적인 구체예에서, 재조합 미생물은 아세토락테이트와 2-메틸-1-부타날이 중간물질인 2-메틸-1-부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 2-아세토-2-히드록시부티레이트 중간물질의 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트로의 전환 및 2-메틸-1-부타날 중간물질의 2-메틸-1-부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없다. 다른 특정 구체예에서, 재조합 미생물은 2-아세토-2-히드록시부티레이트와 2-메틸-1-부타날이 중간물질인 2-메틸-1-부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 (i) 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고, 그리고 (ii) 2-메틸-1-부타날의 2-메틸-1-부티레이트로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 한 구체예에서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 다른 구체예에서, 2-메틸-1-부타날의 2-메틸-1-부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소는 알데히드 탈수소효소 (ALDH)이다. 3-케토산 환원효소 (3-KAR)와 알데히드 탈수소효소 (ALDH)가 제거되는 이런 경로의 무제한적 실례는 도 7에 도시된다.
DH2MB를 이소부탄올 경로 중간물질로 전환시키는 효소의 과다발현
이소부탄올 생산 효모에서 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (CAS# 14868-24-7)의 생산을 감소시키거나 제거하는 상이한 접근법은 DH2MB를 이소부탄올 경로 중간물질로 전환시키는 효소를 과다발현하는 것이다. 이를 달성하는 한 가지 방법은 DH2MB와 아세토락테이트의 상호 전환을 촉진하지만, DH2MB의 산화에 호의적인 효소를 이용하는 것이다. 이런 이유로, 한 구체예에서, 본 발명에서는 이소부탄올을 생산하기 위한 재조합 미생물을 제공하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 DH2MB를 아세토락테이트로 전환시킬 수 있는 내생성 또는 이종기원성 단백질을 과다발현한다.
한 구체예에서, 내생성 또는 이종기원성 단백질은 산화 반응에 동역학적으로 호의적이다. 다른 구체예에서, 내생성 또는 이종기원성 단백질은 DH2MB에 대한 낮은 KM 및 아세토락테이트에 대한 높은 KM을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 내생성 또는 이종기원성 단백질은 이의 보조인자의 산화된 형태에 대한 낮은 KM 및 이의 보조인자의 상응하는 환원된 형태에 대한 높은 KM을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 내생성 또는 이종기원성 단백질은 환원 방향보다는 산화 반응에 대한 더욱 높은 kcat를 갖는다. 이러한 내생성 또는 이종기원성 단백질은 바람직하게는, 이의 환원된 형태에 비하여 이의 산화된 형태의 높은 농도를 갖는 산화환원 보조인자를 이용하는 능력을 가질 것이다.
한 구체예에서, 내생성 또는 이종기원성 단백질은 YAL060W, YJR159W, YGL157W, YBL114W, YOR120W, YKL055C, YBR159W, YBR149W, YDL168W, YDR368W, YLR426W, YCR107W, YILL24W, YML054C, YOL151W, YMR318c, YBR046C, YHR104W, YIR036C, YDL174C, YDR541C, YBR145W, YGL039W, YCR105W, YDL124W, YIR035C, YFL056C, YNL274c, YLR255C, YGL185C, YGL256W, YJR096W, YJR155W, YPL275W, YOR388C, YLR070C, YMR083W, YER081W, YJR139C, YDL243C, YPL113C, YOL165C, YML086C, YMR303C, YDL246C, YLR070C, YHR063C, YNL331C, YFL057C, YIL155C, YOL086C, YAL061W, YDR127W, YPR127W, YCL018W, YIL074C, YIL124W, 그리고 YEL071W로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 인코딩된다. 이에 더하여, 이종기원성 유전자는 이소부탄올 생산 효모에서 과다발현될 수 있다. 가령, 베타-히드록시산 탈수소효소 (EC1.1.1.45 및 EC1.1.1.60)는 과다발현을 위한 후보일 것이다.
다른 구체예에서, 환원 반응에 동역학적으로 호의적인 내생성 또는 이종기원성 단백질은 산화 반응에 호의적이도록 조작된다. 다른 구체예에서, 단백질은 DH2MB에 대한 낮은 KM 및 아세토락테이트에 대한 높은 KM을 갖도록 조작된다. 또 다른 구체예에서, 단백질은 이의 보조인자의 산화된 형태에 대한 낮은 KM 및 이의 보조인자의 상응하는 환원된 형태에 대한 높은 KM을 갖도록 조작된다. 또 다른 구체예에서, 단백질은 환원 방향보다 산화 반응에 대한 더욱 높은 kcat를 갖도록 조작된다. 이러한 조작된 단백질은 바람직하게는, 이의 환원된 형태에 비하여 이의 산화된 형태의 높은 농도를 갖는 산화환원 보조인자를 이용하는 능력을 가질 것이다.
대안으로, DH2MB를 DHIV로 이성화시키는 효소가 과다발현될 수 있다. 이러한 접근법은 피루베이트로부터 이소부탄올의 생산을 위한 신규한 경로를 대표한다. 따라서 한 구체예에서, 본 발명에서는 이소부탄올을 생산하기 위한 재조합 미생물을 제공하는데, 여기서 상기 재조합 미생물은 DH2MB를 2,3-디히드록시이소발레레이트로 전환시킬 수 있는 내생성 또는 이종기원성 단백질을 과다발현한다.
2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트를 생합성 경로 중간물질로 전환시키는 효소의 과다발현
효모에서 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트의 생산을 감소시키거나 제거하는 상이한 접근법은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트를 생합성 경로 중간물질로 전환시키는 효소를 과다발현하는 것이다. 이러한 접근법은 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 중간물질로서 이용하는 임의의 생합성 경로에 유용하다. 이를 달성하는 한 가지 방법은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트와 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 상호 전환을 촉진하지만, 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트의 산화에 호의적인 효소를 이용하는 것이다. 이런 이유로, 한 구체예에서, 본 발명에서는 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올에서 선택되는 산물을 생산하기 위한 재조합 미생물을 제공하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트를 2-아세토-2-히드록시부티레이트로 전환시킬 수 있는 내생성 또는 이종기원성 단백질을 과다발현한다.
한 구체예에서, 내생성 또는 이종기원성 단백질은 산화 반응에 동역학적으로 호의적이다. 다른 구체예에서, 내생성 또는 이종기원성 단백질은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트에 대한 낮은 KM 및 2-아세토-2-히드록시부티레이트에 대한 높은 KM을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 내생성 또는 이종기원성 단백질은 이의 보조인자의 산화된 형태에 대한 낮은 KM 및 이의 보조인자의 상응하는 환원된 형태에 대한 높은 KM을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 내생성 또는 이종기원성 단백질은 환원 방향보다 산화 반응에 대한 더욱 높은 kcat를 갖는다. 이러한 내생성 또는 이종기원성 단백질은 바람직하게는, 이의 환원된 형태에 비하여 이의 산화된 형태의 높은 농도를 갖는 산화환원 보조인자를 이용하는 능력을 가질 것이다.
한 구체예에서, 내생성 또는 이종기원성 단백질은 YAL060W, YJR159W, YGL157W, YBL114W, YOR120W, YKL055C, YBR159W, YBR149W, YDL168W, YDR368W, YLR426W, YCR107W, YILL24W, YML054C, YOL151W, YMR318c, YBR046C, YHR104W, YIR036C, YDL174C, YDR541C, YBR145W, YGL039W, YCR105W, YDL124W, YIR035C, YFL056C, YNL274c, YLR255C, YGL185C, YGL256W, YJR096W, YJR155W, YPL275W, YOR388C, YLR070C, YMR083W, YER081W, YJR139C, YDL243C, YPL113C, YOL165C, YML086C, YMR303C, YDL246C, YLR070C, YHR063C, YNL331C, YFL057C, YIL155C, YOL086C, YAL061W, YDR127W, YPR127W, YCL018W, YIL074C, YIL124W, 그리고 YEL071W로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 인코딩된다. 이에 더하여, 이종기원성 유전자는 이소류신 생산 효모에서 과다발현될 수 있다. 가령, 베타-히드록시산 탈수소효소 (EC1.1.1.45 및 EC1.1.1.60)는 과다발현을 위한 후보일 것이다.
대안적으로, 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트 2,3-디히드록시-3-메틸발레레이트로 이성화시키는 효소는 과다발현될 수 있다. 이러한 접근법은 피루베이트로부터 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생산을 위한 신규한 경로를 대표한다. 따라서 한 구체예에서, 본 발명에서는 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올에서 선택되는 산물을 생산하기 위한 재조합 미생물을 제공하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트를 α,β-디히드록시-β-메틸발레레이트로 전환시킬 수 있는 내생성 또는 이종기원성 단백질을 과다발현한다.
DH2MB의 생산을 감소시키기 위한, 과다발현된 케톨산 환원이성화효소 (KARI) 및/또는 변형된 케톨산 환원이성화효소 (KARI)의 이용
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환은 중간물질 아세토락테이트에 대해 이소부탄올 경로와 경쟁한다. 현재의 효모 이소부탄올 생산 균주에서, 케톨산 환원이성화효소 (KARI)는 아세토락테이트의 DHIV로의 전환을 촉진한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 아세토락테이트의 2,3-디히드록시이소발레레이트 (DHIV)로의 전환을 촉진하는 과다발현된 케톨산 환원이성화효소 (KARI)를 갖는 재조합 미생물을 제공한다. KARI의 과다발현은 DH2MB 생산을 감소시키는 효과를 갖는다. 한 구체예에서, KARI는 용해물에서 적어도 0.01 U/mg의 활성을 갖는다. 다른 구체예에서, KARI는 용해물에서 적어도 0.03 U/mg의 활성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, KARI는 용해물에서 적어도 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 또는 10 U/mg의 활성을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 과다발현된 KARI는 야생형 또는 부모 KARI와 비교하여 아세토락테이트에 대한 감소된 KM을 나타내도록 조작된다. 아세토락테이트에 대한 더욱 낮은 KM을 갖는 변형된 KARI의 이용은 부산물 DH2MB의 생산을 감소시킬 것으로 예상된다. 더욱 낮은 기질 KM을 갖는 KARI는 동족체를 스크리닝함으로써 확인된다. 대안적으로, KARI는 당분야에 공지된 기술을 이용한 방향적 진화 (directed evolution)에 의해 감소된 KM을 나타내도록 조작될 수 있다.
이들 구체예 각각에서, KARI는 NADH (NADPH보다는)를 보조인자로서 이용하는 변이체 효소일 수 있다. 이런 효소는 공동 소유된 동시-계속 출원 U.S. Patent Publication No. 2010/0143997에서 기술되는데, 이것은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
DH2MB의 생산을 감소시키기 위한 과다발현된 디히드록시산 탈수화효소 (DHAD)의 이용
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 이소부탄올 경로 효소, 디히드록시산 탈수화효소 (DHAD)의 과다발현이 부산물, DH2MB의 생산을 감소시킨다는 것을 발견하였다.
따라서 한 구체예에서, 본 발명에서는 2,3-디히드록시이소발레레이트 (DHIV)의 2-케토이소발레레이트 (KIV)로의 전환을 촉진하는 디히드록시산 탈수화효소 (DHAD)를 갖는 재조합 미생물을 제공한다. DHAD의 과다발현은 DH2MB 생산을 감소시키는 효과를 갖는다. 한 구체예에서, DHAD는 용해물에서 적어도 0.01 U/mg의 활성을 갖는다. 다른 구체예에서, DHAD는 용해물에서 적어도 0.03 U/mg의 활성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, DHAD는 용해물에서 적어도 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 또는 10 U/mg의 활성을 갖는다.
3-히드록시산의 생산을 위한 재조합 미생물
본 발명에서는 추가의 측면에서, 산물 또는 물질대사 중간물질로서 3-히드록시산의 생산을 위한 재조합 미생물을 제공한다. 한 구체예에서, 이들 3-히드록시산-생산 재조합 미생물은 2-아세토락테이트의 DH2MB로의 환원을 촉진하는 아세토락테이트 신타아제 (ALS)와 3-케토산 환원효소를 발현한다. 다른 구체예에서, 이들 3-히드록시산-생산 재조합 미생물은 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트로의 환원을 촉진하는 아세토락테이트 신타아제 (ALS)와 3-케토산 환원효소를 발현한다.
이들 3-히드록시산-생산 재조합 미생물은 피루베이트의 아세토락테이트 이외의 산물로의 전환을 위한 효소적 활성이 감소되거나 제거되도록 더욱 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC), 락테이트 탈수소효소 (LDH), 피루베이트 산화효소, 피루베이트 탈수소효소, 및/또는 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD)의 효소적 활성이 감소되거나 제거된다.
특정 구체예에서, DH2MB는 ALS 유전자를 과다발현하고 3-케토산 환원효소를 발현하는 재조합 PDC-마이너스 GPD-마이너스 효모 미생물에서 생산된다. 한 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 선천성으로 발현된다. 다른 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 이종기원성으로 발현된다. 또 다른 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 과다발현된다. 특정 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다. 다른 특정 구체예에서, ALS는 바실루스 서브틸리스(B. subtilis) alsS에 의해 인코딩된다.
다른 특정 구체예에서, 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트는 ALS 유전자를 과다발현하고 3-케토산 환원효소를 발현하는 재조합 PDC-마이너스 GPD-마이너스 효모 미생물에서 생산된다. 한 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 선천성으로 발현된다. 다른 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 이종기원성으로 발현된다. 또 다른 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 과다발현된다. 특정 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다. 다른 특정 구체예에서, ALS는 바실루스 서브틸리스(B. subtilis) alsS에 의해 인코딩된다.
이들 추가의 측면에 따라서, 본 발명에서는 또한, 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 2-아세토락테이트의 DH2MB로의 환원을 촉진하는 아세토락테이트 신타아제 (ALS)와 3-케토산 환원효소를 발현하는 DH2MB-생산 재조합 미생물을 제공하는 단계, 그리고 (b) DH2MB의 회수가능한 양이 생산될 때까지, 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계.
이들 추가의 측면에 따라서, 본 발명에서는 또한, 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트로의 환원을 촉진하는 아세토락테이트 신타아제 (ALS)와 3-케토산 환원효소를 발현하는 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트-생산 재조합 미생물을 제공하는 단계, 그리고 (b) 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트의 회수가능한 양이 생산될 때까지, 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계.
산성 산물의 생산을 위한 재조합 미생물
본 발명에서는 추가의 측면에서, 알데히드로부터 유래된 산성 산물의 생산을 위한 재조합 미생물을 제공한다. 한 구체예에서, 이들 산성 산물 생산 재조합 미생물은 알데히드의 상응하는 산성 산물로의 전환을 촉진하는 알데히드 탈수소효소를 발현한다. 이들 산성 산물 생산 재조합 미생물은 원하는 산성 산물의 상류의 대사산물의 바람직하지 않은 전환에 대한 경쟁하는 효소적 활성이 감소되거나 제거되도록 더욱 조작될 수 있다.
특정 구체예에서, 산성 산물은 알데히드 탈수소효소를 과다발현하는 재조합 효모 미생물에서 생산된다. 한 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 선천성으로 발현된다. 다른 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 이종기원성으로 발현된다. 또 다른 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 과다발현된다. 특정 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다.
이러한 추가의 측면에 따라서, 본 발명에서는 또한, 산성 산물을 생산하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 알데히드의 산성 산물로의 전환을 촉진하는 알데히드 탈수소효소를 발현하는 산성 산물-생산 재조합 미생물을 제공하는 단계, 그리고 (b) 바람직한 산성 산물의 회수가능한 양이 생산될 때까지, 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계.
전반적인 미생물
본 발명에서 제공된 재조합 미생물은 적절한 탄소 공급원으로부터 유익한 대사산물, 예를 들면, 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 조효소 A, 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 5-메틸-1-헵탄올, 그리고 1-프로판올의 생산을 위한 경로에 관여하는 복수의 이종기원성 및/또는 선천성 효소를 발현할 수 있다. 조작된 생합성 경로에서 생산된 유익한 대사산물의 무제한적 목록은 본 명세서의 표 1-3에서 확인된다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, "조작된" 또는 "변형된" 미생물은 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 유전자 물질의 도입을 거쳐 및/또는 선천성 유전자의 발현의 변화, 따라서 미생물의 세포 생리와 생화학의 변화 또는 변경에 의해 생산된다. 유전자 물질의 도입 및/또는 선천성 유전자의 발현의 변형을 통해, 부모 미생물은 새로운 성질, 예를 들면, 새로운 또는 더욱 많은 양의 세포내 및/또는 세포외 대사산물을 생산하는 능력을 획득한다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 부모 미생물 내로 유전자 물질의 도입 및/또는 부모 미생물 내에서 선천성 유전자의 발현의 변화는 적절한 탄소 공급원으로부터 유익한 대사산물, 예를 들면, 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 조효소 A, 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 5-메틸-1-헵탄올, 그리고 1-프로판올을 생산하는 새로운 또는 변화된 능력을 유발한다. 부모 미생물 내로 도입된 유전자 물질 및/또는 부모 미생물에서 발현을 위해 변형된 유전자는 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 조효소 A, 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 5-메틸-1-헵탄올, 그리고 1-프로판올에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 대사산물의 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 효소 중에서 하나 또는 그 이상을 코딩하는 유전자(들), 또는 유전자의 일부를 내포하고, 또한 이들 유전자의 발현 및/또는 발현 조절을 위한 추가의 요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.
숙주 또는 부모 미생물 내로 유전자 물질의 도입에 추가하여, 조작된 또는 변형된 미생물은 또한, 미생물의 세포 생리와 생화학을 변화시키기 위해 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 변경, 파괴, 결실 또는 적중 (knocking-out)을 포함할 수 있다. 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 이러한 변경, 파괴, 결실 또는 적중을 통해, 미생물은 새로운 또는 향상된 성질 (가령, 새로운 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포내 대사산물을 생산하고, 원하는 경로 방향으로 대사산물의 흐름을 향상시키고, 및/또는 부산물의 생산을 감소시키는 능력) 성질을 획득한다.
본 발명에서 제공된 재조합 미생물은 또한, 부모 미생물에서 가능하지 않은 양으로 대사산물을 생산할 수 있다. "대사산물"은 물질대사에 의해 생산된 임의의 물질, 또는 특정 물질대사 과정에 필요하거나 참여하는 물질을 지칭한다. 대사산물은 물질대사의 출발 물질 (가령, 글루코오스 또는 피루베이트), 중간물질 (가령, 2-케토이소발레레이트), 또는 최종 산물 (가령, 이소부탄올)인 유기 화합물일 수 있다. 대사산물은 더욱 복잡한 분자를 구축하는데 이용되거나, 또는 이들은 더욱 단순한 분자로 부셔질 수 있다. 중간물질 대사산물은 종종 화학적 에너지의 방출과 함께 아마도, 더욱 복잡한 물질을 만드는데 이용되거나, 또는 더욱 단순한 화합물로 부셔지는 다른 대사산물로부터 합성될 수 있다.
본 발명에서는 본 발명의 방법, 조성물과 생명체에서 유용한 특정 유전자를 확인한다; 하지만 이런 유전자에 대한 절대 동일성 (absolute identity)이 필요하지는 않을 것으로 인지될 것이다. 가령, 폴리펩티드 또는 효소를 인코딩하는 서열을 포함하는 특정 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에서 변화가 수행되고 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 전형적으로, 이런 변화는 보존성 돌연변이 및 침묵 돌연변이를 포함한다. 이런 변형된 또는 돌연변이된 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드는 당분야에 공지된 방법을 이용한 기능적 효소의 발현에 대해 스크리닝될 수 있다.
유전자 코드의 본질적 축퇴 (degeneracy)로 인하여, 실질적으로 동일하거나 또는 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드 역시 이런 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현하는데 이용될 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 숙주에서 이의 발현을 증강시키기 위해 코딩 서열을 변경하는 것이 유리할 수 있다. 유전자 코드는 64개의 가능한 코돈으로 중복되지만, 대부분의 생명체는 전형적으로, 이들 코돈의 부분집합을 이용한다. 종 내에서 가장 빈번하게 이용되는 코돈은 최적 코돈 (optimal codon)으로 불리고, 그리고 매우 빈번하게 이용되지 않는 것들은 드문 또는 낮은-사용빈도 코돈으로 분류된다. 코돈은 때때로, "코돈 최적화" 또는 "종 코돈 바이어스 (codon bias)에 대한 제어"라고 불리는 과정 동안, 숙주의 선호되는 코돈 사용빈도를 반영하기 위해 치환될 수 있다.
특정 원핵 또는 진핵 숙주에 의해 선호되는 코돈을 내포하는 최적화된 코딩 서열 (Murray et al., 1989, Nucl Acids Res. 17: 477-508)은 예로써, 비-최적화된 서열로부터 생산된 전사체와 비교하여, 예로써 번역 속도를 증가시키거나, 또는 바람직한 성질, 예를 들면, 더욱 긴 반감기 (half-life)를 갖는 재조합 RNA 전사체를 생산하기 위해 제조될 수 있다. 번역 종결 코돈은 또한, 숙주 선호도 (host preference)를 반영하기 변형될 수 있다. 가령, 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)와 포유동물에 대한 전형적인 종결 코돈은 각각, UAA와 UGA이다. 외떡잎 식물 (monocotyledonous plant)에 대한 전형적인 종결 코돈은 UGA이고, 반면 곤충과 대장균(E. coli)은 통상적으로, UAA를 종결 코돈으로서 이용한다 (Dalphin et al., 1996, Nucl Acids Res. 24: 216-8). 식물에서 발현을 위한 뉴클레오티드 서열을 최적화하는 방법은 예로써, U.S. Pat. No. 6,015,891, 그리고 여기에서 인용된 참고문헌에서 제공된다.
당업자는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 그들의 뉴클레오티드 서열에서 상이한 다양한 DNA 화합물이 본 발명의 소정의 효소를 인코딩하는데 이용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 앞서 기술된 생합성 효소를 인코딩하는 선천성 DNA 서열은 본 발명의 구체예를 단순히 예시하기 위해 본 명세서에서 언급되고, 그리고 본 발명은 본 발명의 방법에 이용되는 효소의 폴리펩티드와 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 임의의 서열의 DNA 화합물을 포함한다. 유사한 방식으로, 폴리펩티드는 원하는 활성의 상실 또는 현저한 상실 없이 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실, 그리고 삽입을 전형적으로 견뎌낼 수 있다. 본 발명은 변형된 또는 변이체 폴리펩티드가 참고 폴리펩티드의 효소적 동화 또는 이화 활성을 갖기만 하면, 본 명세서에서 기술된 특정 단백질과 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 게다가, 본 발명에서 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열은 본 발명의 구체예를 단순히 예시한다.
이에 더하여, 대사산물을 산출하는데 유용한 효소의 동족체는 본 발명에서 제시된 미생물과 방법에 의해 포함된다.
본 명세서에서, 2개의 단백질 (또는 이들 단백질의 영역)은 아미노산 서열이 적어도 대략 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 가질 때, 실질적으로 상동하다. 2개의 아미노산 서열, 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 이들 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다 (가령, 최적 배열을 위해 첫 번째와 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열 중에서 한쪽 또는 양쪽에 갭이 도입될 수 있고, 그리고 비-상동한 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 한 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참고 서열의 길이는 참고 서열의 길이의 적어도 30%, 전형적으로 적어도 40%, 더욱 전형적으로 적어도 50%, 이보다 더욱 전형적으로 적어도 60%, 그리고 이보다 더욱 전형적으로 적어도 70%, 80%, 90%, 100%이다. 이후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 첫 번째 서열에서 위치가 두 번째 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 이후 이들 분자는 상기 위치에서 동일하다 (본 명세서에서, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"에 동등하다). 이들 두 서열 간에 동일성 퍼센트는 이들 두 서열의 최적 배열을 위해 도입되어야 하는 갭의 숫자, 그리고 각 갭의 길이를 고려한, 이들 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 숫자의 함수이다.
"상동한"이 단백질 또는 펩티드를 참고하여 이용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종, 보존성 아미노산 치환에 의해 달라지는 것으로 인지된다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질 (가령, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R 기)를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다.
2개 또는 그 이상의 아미노산 서열이 보존성 치환에 의해 서로 달라지는 경우에, 서열 동일성 퍼센트 또는 상동성 정도는 치환의 보존성 성격을 보정하기 위하여 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 달성하는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (참조: Pearson W.R., 1994, Methods in Mol Biol 25: 365-89).
하기 6가지 군은 각각, 서로에 대해 보존성 치환인 아미노산을 내포한다: 1) 세린 (S), 트레오닌 (T); 2) 아스파르트산 (D), 글루타민산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 알라닌 (A), 발린 (V), 그리고 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).
서열 동일성 퍼센트로 지칭되는 폴리펩티드에 대한 서열 상동성은 전형적으로, 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정된다. 공동 소유된 동시-계속 출원 US 2009/0226991을 참조한다. 상이한 생명체로부터 다수의 서열을 내포하는 데이터베이스에 분자 서열을 비교하는데 이용되는 전형적인 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 BLAST이다. 다수의 상이한 생명체로부터 서열을 내포하는 데이터베이스를 검색할 때, 아미노산 서열을 비교하는 것은 전형적이다. 아미노산 서열을 이용한 데이터베이스 검색은 공동 소유된 동시-계속 출원 US 2009/0226991에서 기술된 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 폭넓은 미생물이 아세토락테이트- 및/또는 알데히드 중간물질-요구 생합성 경로로부터 유익한 대사산물의 생산에 적합한 재조합 대사 경로를 포함하도록 변형될 수 있는 것으로 이해된다. 다양한 구체예에서, 미생물은 효모 미생물에서 선택될 수 있다. 대사산물, 예를 들면, 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 조효소 A, 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 5-메틸-1-헵탄올, 그리고 1-프로판올의 생산을 위한 효모 미생물은 일정한 특징에 기초하여 선택될 수 있다:
한 가지 특징은 미생물이 다양한 탄소 공급원을 유익한 대사산물, 예를 들면, 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 조효소 A, 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 5-메틸-1-헵탄올, 그리고 1-프로판올로 전환시키기 위해 선택되는 성질을 포함할 수 있다. 용어 "탄소 공급원"은 일반적으로, 원핵 또는 진핵 세포 성장을 위한 탄소 공급원으로서 이용하기 적합한 물질을 지칭한다. 적절한 탄소 공급원의 실례는 공동 소유된 동시-계속 출원 US 2009/0226991에서 기술된다. 따라서 한 구체예에서, 본 발명에서 개시된 재조합 미생물은 다양한 탄소 공급원을 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 자일로오스, 아라비노오스, 락토오스, 수크로오스, 그리고 이들의 혼합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 산물로 전환시킬 수 있다.
따라서 재조합 미생물은 자일로오스를 비롯한 5-탄소 (펜토오스) 당으로부터 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 조효소 A, 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 5-메틸-1-헵탄올, 그리고 1-프로판올의 생산을 위한 경로를 더욱 포함할 수 있다. 대부분의 효모 종은 복잡한 루트를 거쳐 자일로오스를 물질대사시키는데, 여기서 자일로오스는 먼저, 자일로오스 환원효소 (XR) 효소에 의해 자일리톨로 환원된다. 자일리톨은 이후, 자일리톨 탈수소효소 (XDH) 효소에 의해 자일룰로스 (xylulose)로 산화된다. 자일룰로스는 이후, 자일룰로키나아제 (xylulokinase) (XK) 효소에 의해 인산화된다. 이러한 경로는 효모 종에서 비효율적으로 작동하는데, 그 이유는 이것이 세포 내에서 산화환원 불균형 (redox imbalance)을 유발하기 때문이다. 자일로오스→자일리톨 단계는 NADH를 보조인자로서 이용하는 반면, 자일리톨→자일룰로스 단계는 NADPH를 보조인자로서 이용한다. 세포 내에서 산화환원 불균형을 회복하는 다른 과정이 작동하여야 한다. 이것은 종종, 생명체가 자일로오스 또는 다른 펜토오스 당 상에서 혐기성으로 성장할 수 없다는 것을 의미한다. 따라서 자일로오스 및 기타 펜토오스 당을 원하는 발효 산물로 효율적으로 발효시킬 수 있는 효모 종이 매우 바람직하다.
따라서 한 측면에서, 재조합 미생물은 기능적 외생성 자일로오스 이성화효소를 발현하도록 조작된다. 효모에서 기능적인 외생성 자일로오스 이성화효소는 당분야에 공지되어 있다. 예로써, Rajgarhia et al., US2006/0234364를 참조하고, 이것은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 이러한 측면에 따른 한 구체예에서, 외생성 자일로오스 이성화효소 유전자는 효모 세포에서 기능적인 프로모터와 종결자 서열에 작동가능하게 연결된다. 바람직한 구체예에서, 재조합 미생물은 자일로오스의 자일리톨로의 전환을 촉진하는 효소 (가령, XR 및/또는 XDH)를 인코딩하는 선천성 유전자의 결실 또는 파괴를 더욱 갖는다. 더욱 바람직한 구체예에서, 재조합 미생물은 또한, 효모 세포에서 기능적인 프로모터와 종결자 서열에 작동가능하게 연결된 기능적, 외생성 자일룰로키나아제 (XK) 유전자를 내포한다. 한 구체예에서, 자일룰로키나아제 (XK) 유전자는 과다발현된다.
한 구체예에서, 미생물은 감소된 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC) 활성을 갖거나 갖지 않는다. PDC는 피루베이트의 아세트알데히드로의 탈카르복실화 (decarboxylation)를 촉진하고, 이것은 이후, NADH의 NAD+로의 산화를 거쳐 ADH에 의해 에탄올로 환원된다. 에탄올 생산은 해당으로부터 NADH를 산화시키는 주요 경로이다. 이러한 경로의 결실은 생합성 경로에 기용한 피루베이트 및 환원 등가물 (NADH)을 증가시킨다. 따라서 PDC 유전자의 결실은 원하는 대사산물의 수율을 더욱 증가시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 미생물은 감소된 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD) 활성을 갖거나 갖지 않는다. GPD는 NADH의 NAD+로의 산화를 거쳐, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)의 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)로의 환원을 촉진한다. 글리세롤은 이후, 글리세롤-3-포스파타아제 (GPP)에 의해 G3P로부터 생산된다. 글리세롤 생산은 해당으로부터 과잉의 NADH를 산화시키는 이차적인 경로이다. 이러한 경로의 감소 또는 제거는 생합성 경로에 가용한 피루베이트 및 환원 등가물 (NADH)을 증가시킬 것이다. 따라서 GPD 유전자의 결실은 원하는 대사산물의 수율을 더욱 증가시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 미생물은 감소된 PDC 활성을 갖거나 갖지 않고, 그리고 감소된 GPD 활성을 갖거나 갖지 않는다. PDC-마이너스/GPD-마이너스 효모 생산 균주는 공동 소유된 동시-계속 출원, US 2009/0226991 및 US 2011/0020889에서 기술되고, 이들 둘 모두 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
한 구체예에서, 효모 미생물은 공동 소유된 동시-계속 출원 US 2009/0226991에서 기술된 바와 같이, "사카로미세스 (Saccharomyces) 효모 계통분기"에서 선택될 수 있다.
용어 "사카로미세스 센수 스트릭토(Saccharomyces sensu stricto)" 분류학 군은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)에 고도로 관련되는 효모 종의 클러스터이다 (Rainieri et al., 2003, J. Biosci Bioengin 96: 1-9). 사카로미세스 센수 스트릭토(Saccharomyces sensu stricto) 효모 종에는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), 사카로미세스 쿠드리아브제비(S. kudriavzevii), 사카로미세스 미카태(S. mikatae), 사카로미세스 바야누스(S. bayanus), 사카로미세스 우바룸(S. uvarum), 사카로미세스 카로카니스(S. carocanis), 그리고 이들 종으로부터 유래된 하이브리드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다 (Masneuf et al., 1998, Yeast 7: 61-72).
고대의 전체 유전체 복제 (whole genome duplication, WGD) 사건은 반자낭 균류 (hemiascomycete) 효모의 진화 동안 발생하고, 그리고 비교 유전체 도구 (comparative genomic tool)를 이용하여 발견되었다 (Kellis et al., 2004, Nature 428: 617-24; Dujon et al., 2004, Nature 430:35-44; Langkjaer et al., 2003, Nature 428: 848-52; Wolfe et al., 1997, Nature 387: 708-13). 이러한 주요 진화적 사건을 이용하여, 효모는 WGD 사건 이후에 공통 조상으로부터 분기하는 종 (본 명세서에서 "WGD-이후 효모") 및 WGD 사건 이전에 효모 계통으로부터 분기하는 종 (본 명세서에서, "WGD-이전 효모")으로 구분될 수 있다.
따라서 한 구체예에서, 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces)와 캔디다(Candida)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 WGD-이후 효모 속에서 선택될 수 있다. 선호되는 WGD-이후 효모 종에는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), 사카로미세스 우바룸(S. uvarum), 사카로미세스 바야누스(S. bayanus), 사카로미세스 파라독수스(S. paradoxus), 사카로미세스 카스텔리(S. castelli), 그리고 칸디다 글라브라타(C. glabrata)가 포함된다.
다른 구체예에서, 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia), 아이사첸키아(Issatchenkia), 데바리오미세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 야로위아(Yarrowia) 및 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 전체 유전체 복제-이전 (WGD-이전) 효모 속에서 선택될 수 있다. 대표적인 WGD-이전 효모 종에는 사카로미세스 클루이베리(S. kluyveri), 클루이베로미세스 써모톨레란스(K. thermotolerans), 클루이베로미세스 막시아누스(K. marxianus), 클루이베로미세스 왈티(K. waltii), 클루이베로미세스 락티스(K. lactis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 피치아 패스토리스(P. pastoris), 피치아 아노말라(P. anomala), 피치아 스티피티스(P. stipitis), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(I. orientalis), 아이싸첸키아 옥시덴탈리스(I. occidentalis), 아이싸첸키아 스쿠툴라타(I. scutulata), 데바리오미세스 한세니(D. hansenii), 한세눌라 아노말라(H. anomala), 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica), 그리고 시조사카로미세스 폼베(S. pombe)가 포함된다.
효모 미생물은 공동 소유된 동시-계속 출원 US 2009/0226991에서 기술된 바와 같이 크랩트리-음성 또는 크랩트리-양성일 수 있다. 한 구체예에서, 효모 미생물은 하기 속 (genera): 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 아이사첸키아(Issatchenkia), 한세눌라(Hansenula), 그리고 칸디다(Candida)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 크랩트리-음성 표현형을 갖는 효모에서 선택될 수 있다. 크랩트리-음성 종에는 사카로미세스 클루이베리(S. kluyveri), 클루이베로미세스 락티스(K. lactis), 클루이베로미세스 막시아누스(K. marxianus), 피치아 아노말라(P. anomala), 피치아 스티피티스(P. stipitis), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(I. orientalis), 아이싸첸키아 옥시덴탈리스(I. occidentalis), 아이싸첸키아 스쿠툴라타(I. scutulata), 한세눌라 아노말라(H. anomala), 그리고 칸디다 유틸리스(C. utilis)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다른 구체예에서, 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 데바리오미세스(Debaryomyces), 피치아(Pichia) 및 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 크랩트리-양성 표현형을 갖는 효모에서 선택될 수 있다. 크랩트리-양성 효모 종에는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), 사카로미세스 우바룸(S. uvarum), 사카로미세스 바야누스(S. bayanus), 사카로미세스 파라독수스(S. paradoxus), 사카로미세스 카스텔리(S. castelli), 클루이베로미세스 써모톨레란스(K. thermotolerans), 칸디다 글라브라타(C. glabrata), 지고사카로미세스 바일리(Z. bailli), 지고사카로미세스 로욱시(Z. rouxii), 데바리오미세스 한세니(D. hansenii), 피치아 패스토리스(P. pastoris), 그리고 시조사카로미세스 폼베(S. pombe)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
다른 특징은 미생물이 비-발효성인 성질을 포함할 수 있다. 다시 말하면, 이것은 탄소 공급원을 혐기성으로 물질대사시킬 수 있지만, 상기 효모는 산소의 존재에서 탄소 공급원을 물질대사시킬 수 있다. 비-발효 효모는 자연 발생 효모와 유전학적으로 변형된 효모 둘 모두를 지칭한다. 발효 효모로 혐기성 발효 동안, 해당으로부터 NADH를 산화시키는 주요 경로는 에탄올의 생산을 통하는 것이다. 에탄올은 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC)에 의해 피루베이트로부터 산출되는, 아세트알데히드의 환원을 거쳐 알코올 탈수소효소 (ADH)에 의해 생산된다. 한 구체예에서, 발효 효모는 선천성 PDC 활성의 감소 또는 제거에 의해 비-발효성이 되도록 조작될 수 있다. 따라서 해당에 의해 생산된 대부분의 피루베이트는 PDC에 의해 소비되지 않고 이소부탄올 경로에 이용가능하다. 이러한 경로의 결실은 생합성 경로에 이용가능한 피루베이트 및 환원 등가물을 증가시킨다. 발효 경로는 원하는 대사산물, 예를 들면, 이소부탄올의 낮은 수율과 낮은 생산성의 원인이 된다. 따라서 PDC 유전자의 결실은 원하는 대사산물, 예를 들면, 이소부탄올의 수율과 생산성을 증가시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 재조합 미생물은 트리코스포론(Tricosporon), 로도토룰라(Rhodotorula), 믹소지마(Myxozyma), 또는 칸디다(Candida)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류되는 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 비-발효 효모 미생물인 미생물일 수 있다. 특정 구체예에서, 비-발효 효모는 칸디다 제스토비(C. xestobii)이다.
이소부탄올-생산 효모 미생물
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 한 구체예에서, 효모 미생물은 해당에 의해 탄소 공급원, 예를 들면, 글루코오스가 피루베이트로 전환되도록 조작되고, 그리고 피루베이트는 이소부탄올 생산 대사 경로를 거쳐 이소부탄올로 전환된다 (참조: WO/2007/050671, WO/2008/098227, 그리고 Atsumi et al., 2008, Nature 45: 86-9). 이소부탄올의 대안적 생산을 위한 경로는 WO/2007/050671 및 Dickinson et al., 1998, J Biol Chem 273:25751-6에서 기술된다.
따라서 한 구체예에서, 피루베이트를 이소부탄올로 전환시키는 이소부탄올 생산 대사 경로는 하기 반응을 포함할 수 있다:
1. 2 피루베이트 → 아세토락테이트 + CO2
2. 아세토락테이트 + NAD(P)H → 2,3-디히드록시이소발레레이트 + NAD(P)+
3. 2,3-디히드록시이소발레레이트 → 알파-케토이소발레레이트
4. 알파-케토이소발레레이트 → 이소부티르알데히드 + CO2
5. 이소부티르알데히드 +NAD(P)H → 이소부탄올 + NAD(P)+
이들 반응은 효소 1) 아세토락테이트 신타아제 (ALS), 2) 케톨산 환원이성화효소 (KARI), 3) 디히드록시산 탈수화효소 (DHAD), 4) 케토-이소발레레이트 탈카르복실화효소 (KIVD), 그리고 5) 알코올 탈수소효소 (ADH)에 의해 수행된다 (도 1). 다른 구체예에서, 효모 미생물은 이들 효소가 과다발현되도록 조작된다. 가령, 이들 효소는 선천성 유전자에 의해 인코딩될 수 있다. 대안으로, 이들 효소는 이종기원성 유전자에 의해 인코딩될 수 있다. 가령, ALS는 바실루스 서브틸리스(B. subtilis)의 alsS 유전자, 락토코커스 락티스(L. lactis)의 alsS, 또는 클렙시엘라 유모니아(K. pneumonia)의 ilvK 유전자에 의해 인코딩될 수 있다. 가령, KARI는 대장균(E. coli), 코리네박테륨 글루타미쿰(C. glutamicum), 메타노코커스 마리팔루디스(M. maripaludis), 또는 피로미세스(Piromyces) 종 E2의 ilvC 유전자에 의해 인코딩될 수 있다. 가령, DHAD는 대장균(E. coli), 코리네박테륨 글루타미쿰(C. glutamicum), 또는 락토코커스 락티스(L. lactis)의 ilvD 유전자에 의해 인코딩될 수 있다. 가령, KIVD는 락토코커스 락티스(L. lactis)의 kivD 유전자에 의해 인코딩될 수 있다. ADH는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)의 ADH2, ADH6, 또는 ADH7, 또는 락토코커스 락티스(L. lactis)의 adhA에 의해 인코딩될 수 있다.
한 구체예에서, 경로 단계 2와 5는 NADH (NADPH보다는)를 보조인자로서 이용하는 KARI와 ADH 효소에 의해 수행될 수 있다. 이들 효소는 공동 소유된 동시-계속 출원, US 2010/0143997에서 기술되고, 이것은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 본 발명자들은 경로 단계 2와 5를 각각 촉진하는 NADH-의존성 KARI와 ADH 효소의 이용이 놀랍게도, 혐기성 조건 하에 이소부탄올의 생산을 가능하게 한다는 것을 발견하였다. 따라서 한 구체예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 아세토락테이트 (+NADH)의 전환을 촉진하여 2,3-디히드록시이소발레레이트를 생산하는 NADH-의존성 KARI를 이용할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 이소부티르알데히드 (+NADH)의 전환을 촉진하여 이소부탄올을 생산하는 NADH-의존성 ADH를 이용할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 아세토락테이트 (+NADH)의 전환을 촉진하여 2,3-디히드록시이소발레레이트를 생산하는 NADH-의존성 KARI, 그리고 이소부티르알데히드 (+NADH)의 전환을 촉진하여 이소부탄올을 생산하는 NADH-의존성 ADH 둘 모두를 이용할 수도 있다.
다른 구체예에서, 효모 미생물은 피루베이트를 이소부탄올로 전환시키는 증가된 능력을 갖도록 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 효모 미생물은 피루베이트를 이소부티르알데히드로 전환시키는 증가된 능력을 갖도록 조작될 수 있다. 다른 구체예에서, 효모 미생물은 피루베이트를 케토-이소발레레이트를 전환시키는 증가된 능력을 갖도록 조작될 수 있다. 다른 구체예에서, 효모 미생물은 피루베이트를 2,3-디히드록시이소발레레이트로 전환시키는 증가된 능력을 갖도록 조작될 수 있다. 다른 구체예에서, 효모 미생물은 피루베이트를 아세토락테이트로 전환시키는 증가된 능력을 갖도록 조작될 수 있다.
게다가, 전술한 효소 (또는 본 명세서에서 언급된 임의의 다른 것들 (또는 이들의 발현을 제어하거나 조정하는 임의의 조절 요소))를 인코딩하는 임의의 유전자는 당업자에게 공지된 유전자/단백질 조작 기술, 예를 들면, 방향적 진화 (directed evolution) 또는 논리적 돌연변이유발 (rational mutagenesis)에 의해 최적화될 수 있다. 이런 작용은 당업자가 효모에서 발현과 활성에 대해 이들 효소를 최적화할 수 있도록 한다.
이에 더하여, 이들 효소를 인코딩하는 유전자는 다른 진균과 세균 종으로부터 확인될 수 있고, 그리고 이러한 경로의 조정을 위해 발현될 수 있다. 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)와 사카로미세스 우바룸(S. uvarum)을 비롯한 사카로미세스(Saccharomyces) 종, 클루이베로미세스 써모톨레란스(K. thermotolerans), 클루이베로미세스 락티스(K. lactis), 그리고 클루이베로미세스 막시아누스(K. marxianus)를 비롯한 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 종, 피치아(Pichia) 종, 한세눌라 폴리모파(H. polymorpha)를 비롯한 한세눌라(Hansenula) 종, 칸디다(Candida) 종, 트리코스포론(Trichosporon) 종, 야마다지마 스티피티스(Y. stipitis)를 비롯한 야마다지마(Yamadazyma) 종, 토룰라스포라 프레토리엔시스(Torulaspora pretoriensis), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis), 시조사카로미세스 폼베(S. pombe)를 비롯한 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 종, 크립토코커스(Cryptococcus) 종, 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 뉴로스포라(Neurospora) 종, 또는 우스틸라고(Ustilago) 종이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 생명체가 이들 효소에 대한 출처로서 기능할 수 있다. 혐기성 진균으로부터 유전자의 출처에는 피로미세스(Piromyces) 종, 오르피노미세스(Orpinomyces) 종, 또는 네오칼리마스트릭스(Neocallimastix) 종이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 유용한 원핵 효소의 출처에는 대장균(Escherichia. coli), 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실루스(Bacillus) 종, 클로스트리듐(Clostridium) 종, 코리네박테륨(Corynebacterium) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 락토코커스(Lactococcus) 종, 엔테로박터(Enterobacter) 종, 그리고 살모넬라(Salmonella) 종이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명은 이소부탄올을 생산하기 위한 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 그리고 여기서 상기 미생물은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 일부 구체예에서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 특정 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29 (YMR226C) 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다. 한 구체예에서, 동족체는 반더왈톰지마 폴리스포라(Vanderwaltomzyma polyspora) (서열 번호: 2), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 3), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 4), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 5), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii) (서열 번호: 6), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) (서열 번호: 7), 아시비아 고시피(Ashbya gossypii) (서열 번호: 8), 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri) (서열 번호: 9), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 10), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 11), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis) (서열 번호: 12), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii) (서열 번호: 13), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 14), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis) (서열 번호: 15), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (서열 번호: 16), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) (서열 번호: 17), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) (서열 번호: 18), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) (서열 번호: 19), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) (서열 번호: 20), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (서열 번호: 21), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 22), 그리고 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 23)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 이소부탄올을 생산하기 위한 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 그리고 여기서 상기 미생물은 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 일부 구체예에서, 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소는 알데히드 탈수소효소이다. 예시적인 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 알데히드 탈수소효소 ALD6 (서열 번호: 25) 또는 이의 동족체 또는 변이체이다. 한 구체예에서, 동족체는 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 26), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 27), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 28), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) (서열 번호: 29), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 30), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 31), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) YJ789 (서열 번호: 32), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) JAY291 (서열 번호: 33), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) EC1118 (서열 번호: 34), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) DBY939 (서열 번호: 35), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) AWRI1631 (서열 번호: 36), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) RM11-1a (서열 번호: 37), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 38), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 39), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 40), 그리고 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 41)로 구성된 군에서 선택된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 이소부탄올을 생산하기 위한 재조합 미생물에 관계하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하고, 그리고 여기서 상기 미생물은 (i) 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고, 그리고 (ii) 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 일부 구체예에서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소는 3-케토산 환원효소 (3-KAR)이다. 특정 구체예에서, 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29 (YMR226C) 유전자 또는 이의 동족체 또는 변이체에 의해 인코딩된다.
한 구체예에서, 동족체는 반더왈톰지마 폴리스포라(Vanderwaltomzyma polyspora) (서열 번호: 2), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 3), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 4), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 5), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii) (서열 번호: 6), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) (서열 번호: 7), 아시비아 고시피(Ashbya gossypii) (서열 번호: 8), 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri) (서열 번호: 9), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 10), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 11), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis) (서열 번호: 12), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii) (서열 번호: 13), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 14), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis) (서열 번호: 15), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (서열 번호: 16), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) (서열 번호: 17), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) (서열 번호: 18), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) (서열 번호: 19), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) (서열 번호: 20), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (서열 번호: 21), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 22), 그리고 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 23)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소는 알데히드 탈수소효소이다. 특정 구체예에서, 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 알데히드 탈수소효소 ALD6 (서열 번호: 25) 또는 이의 동족체 또는 변이체이다. 한 구체예에서, 동족체는 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 26), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 27), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 28), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) (서열 번호: 29), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 30), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 31), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) YJ789 (서열 번호: 32), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) JAY291 (서열 번호: 33), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) EC1118 (서열 번호: 34), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) DBY939 (서열 번호: 35), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) AWRI1631 (서열 번호: 36), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) RM11-1a (서열 번호: 37), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 38), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 39), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 40), 그리고 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 41)로 구성된 군에서 선택된다.
한 구체예에서, 이소부탄올 생산 대사 경로는 피루베이트의 이소부탄올로의 전환에서 한 단계를 촉진하는 적어도 하나의 외생성 유전자를 포함한다. 다른 구체예에서, 이소부탄올 생산 대사 경로는 피루베이트의 이소부탄올로의 전환에서 단계들을 촉진하는 적어도 2개의 외생성 유전자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이소부탄올 생산 대사 경로는 피루베이트의 이소부탄올로의 전환에서 단계들을 촉진하는 적어도 3개의 외생성 유전자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이소부탄올 생산 대사 경로는 피루베이트의 이소부탄올로의 전환에서 단계들을 촉진하는 적어도 4개의 외생성 유전자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이소부탄올 생산 대사 경로는 피루베이트의 이소부탄올로의 전환에서 단계들을 촉진하는 5개의 외생성 유전자를 포함한다.
한 구체예에서, 이소부탄올 경로 유전자 중에서 하나 또는 그 이상은 시토졸에 국한되는 효소를 인코딩한다. 한 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 하나의 이소부탄올 경로 효소가 시토졸에 국한되는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함한다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 2개의 이소부탄올 경로 효소가 시토졸에 국한되는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 3개의 이소부탄올 경로 효소가 시토졸에 국한되는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 적어도 4개의 이소부탄올 경로 효소가 시토졸에 국한되는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함한다. 예시적인 구체예에서, 재조합 미생물은 5개의 이소부탄올 경로 효소가 시토졸에 국한되는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함한다. 하나 또는 그 이상의 유전자가 시토졸에 국한되는 이소부탄올 생산 대사 경로는 공동 소유된 동시-계속 출원 U.S. Application Serial No. 12/855,276에서 기술되고, 이것은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
이소부탄올의 생산에서 변형된 알코올 탈수소효소의 발현
부산물 이소부티레이트의 생산을 감소시키기 위한, 본 명세서에서 기술된 다른 전략은 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환을 책임지는 알코올 탈수소효소 (ADH)의 활성 및/또는 발현을 증가시키는 것이다. 이러한 전략은 이소부탄올 경로 중간물질, 이소부티르알데히드에 대한 내생성 효소에 의한 경쟁을 예방한다. ADH의 활성 및/또는 발현에서 증가는 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 가령, ADH 활성은 증가된 프로모터 세기를 갖는 프로모터를 이용함으로써 또는 알코올 탈수소효소 유전자의 사본 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
대안적 구체예에서, 부산물 이소부티레이트의 생산은 이소부티르알데히드에 대한 증가된 비활성을 갖는 ADH를 이용함으로써 감소될 수 있다. 이소부티르알데히드에 대한 증가된 비활성을 갖는 이런 ADH 효소는 자연에서 확인되거나, 또는 ADH 효소에 대한 변형, 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 변형으로부터 생길 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 변형은 이소부티르알데히드에 대한 미카엘리스-멘텐 상수 (Michaelis-Menten constant, KM)에서 감소를 유발할 것이다. 이런 변형된 ADH 효소의 이용을 통해, 이소부티르알데히드에 대한 내생성 효소에 의한 경쟁이 더욱 제한된다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 변형된 ADH를 포함하는 재조합 미생물에서 이소부티레이트 수율 (mol 이소부티레이트 / mol 글루코오스)은 대략 5% 이하이다. 다른 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 변형된 ADH를 포함하는 재조합 미생물에서 이소부티레이트 수율 (mol 이소부티레이트 / mol 글루코오스)은 대략 1% 이하이다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 변형된 ADH를 포함하는 재조합 미생물에서 이소부티레이트 수율 (mol 이소부티레이트 / mol 글루코오스)은 대략 0.5% 이하, 대략 0.1% 이하, 대략 0.05% 이하, 또는 대략 0.01% 이하이다.
게다가, 변형된 ADH 효소를 이용함으로써, 본 발명자들은 정반응 (forward reaction) (즉, 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환)이 역반응 (reverse reaction) (즉, 이소부탄올의 이소부티르알데히드로의 전환)에 비하여 선호되는 반응인 상황을 구축할 수 있다.
앞서 기술된 전략은 일반적으로, 이소부티레이트 수율에서 감소를 유발하고, 이것은 이소부탄올 수율에서 증가를 동반한다. 따라서 이들 전략은 이소부티레이트 수율 및/또는 역가를 감소시키고, 그리고 이소부티레이트 수율에 대한 이소부탄올 수율의 비율을 증가시키는데 유용하다.
따라서 한 측면에서, 본 출원에서는 나머지 4개의 이소부탄올 경로 효소와 공동-발현될 때, 향상된 이소부탄올 생산을 조장할 수 있는 증강된 활성을 갖는 변형된 ADH의 산출을 기술한다. 이러한 측면에 따른 한 구체예에서, 본 출원은 하나 또는 그 이상의 변형된 ADH를 포함하는 재조합 미생물에 관계한다. 한 구체예에서, 재조합 미생물은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 더욱 조작된다. 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 더욱 조작된다.
이소부탄올 생합성 경로 이외에, 다른 생합성 경로는 알데히드의 알코올로의 전환을 위해 ADH 효소를 이용한다. 가령, ADH 효소는 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 1-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 그리고 3-메틸-1-부탄올의 생산을 위한 생합성 경로의 일부로서 다양한 알데히드를 알코올로 전환시킨다.
본 명세서에서, 용어 "ADH" 또는 "ADH 효소" 또는 "알코올 탈수소효소"는 본 명세서에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환을 촉진하는 효소를 지칭한다. ADH 서열은 락토코커스 락티스(L. lactis) (서열 번호: 175), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 그리고 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 광범위한 미생물로부터 가용하다. 본 발명의 방법에 의해 변형가능한 ADH 효소에는 공동 소유된 동시-계속 출원 U.S. Patent Publication No. 2010/0143997에서 개시된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 변형가능한 ADH 효소의 대표적인 목록은 표 97에서 찾아볼 수 있다.
변형된 ADH 효소
본 발명에 따라서, 임의의 숫자의 돌연변이가 ADH 효소에 만들어질 수 있고, 그리고 한 구체예에서, 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 증가된 능력을 유발하기 위해 복합 돌연변이가 만들어질 수 있다. 이런 돌연변이에는 점 돌연변이, 해독틀 이동 돌연변이, 결실, 그리고 삽입이 포함되고, 하나 또는 그 이상 (가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 등)의 점 돌연변이가 선호된다. 예시적인 구체예에서, 변형된 ADH 효소는 (a) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 티로신 50; (b) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 글루타민 77; (c) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 발린 108; (d) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 티로신 113; (e) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 이소류신 212; 그리고 (f) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 류신 264에서 선택되는 아미노산에 상응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 AdhA (서열 번호: 185)는 락토코커스 락티스(L. lactis) 알코올 탈수소효소 (ADH) 유전자 adhA (서열 번호: 184) 또는 이의 코돈-최적화된 이형 (서열 번호: 206)에 의해 인코딩된다.
돌연변이는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 본 발명의 ADH 효소 내로 도입될 수 있다. 돌연변이는 예로써, 이가 금속 이온 보조인자로서 망간의 존재에서 PCR 반응을 수행함으로써 무작위로 도입될 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드 지향된 돌연변이유발은 인코딩 DNA 분자를 따라서 임의의 결정된 부위에서 모든 가능한 부류의 염기쌍 변화 (base pair change)를 가능하게 하는 변형된 ADH 효소를 산출하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 목적되는 ADH 효소를 코딩하는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열에 상보적인 (하나 또는 그 이상의 미스매치 제외) 올리고뉴클레오티드의 어닐링을 수반한다. 미스매치된 올리고뉴클레오티드는 이후, DNA 중합효소에 의해 신장되어, 한쪽 가닥에서 서열 내에 원하는 변화를 내포하는 이중-가닥 이중-가닥 DNA 분자가 산출된다. 서열에서 이들 변화는 예로써, 아미노산의 결실, 치환, 또는 삽입을 유발한다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드는 이후, 적절한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있고, 따라서 돌연변이체 또는 변형된 폴리펩티드가 생산될 수 있다. 앞서 기술된 올리고뉴클레오티드 지향된 돌연변이유발은 예로써, PCR에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 조성물과 방법에서 이용을 위한 효소에는 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 능력을 갖는 임의의 효소가 포함된다. 이런 효소에는 특히, 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA, 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) AdhA, 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) AdhA, 그리고 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) AdhA가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 방법에 의해 변경가능한 추가의 ADH 효소에는 공동 소유된 동시-계속 출원 U.S. Patent Publication No. 2010/0143997에서 개시된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 변경가능한 ADH 효소의 대표적인 목록은 표 16에서 찾아볼 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 변형된 ADH 효소는 일과적이고 당분야에 널리 공지된 재조합 또는 유전자 조작 기술에 의해 획득될 수 있다. 변형된 ADH 효소는 예로써, 특정 부위 돌연변이유발 또는 무작위 돌연변이유발에 의해, 목적되는 ADH 효소를 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 돌연변이시킴으로써 획득될 수 있다. 이런 돌연변이에는 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 그리고 삽입 돌연변이가 포함된다. 가령, 하나 또는 그 이상의 점 돌연변이 (가령, 하나 또는 그 이상의 상이한 아미노산으로 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환)가 본 발명의 변형된 ADH 효소를 작제하는데 이용될 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 아미노산 수준에서 야생형 ADH 효소 (가령, 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA 또는 대장균(E. coli) AdhA)에 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하고 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 증가된 능력을 나타내는 상동한 ADH 효소를 포함한다.
아미노산 수준에서, 서열 번호: 185에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 ADH 효소에 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하고, 그리고 변형되지 않은 야생형 효소와 비교하여 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 증가된 능력을 나타내는 ADH 효소 역시 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한, 앞서 기술된 ADH 효소를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 또한, 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600개 아미노산 잔기를 포함하고 ADH 효소와 연관된 하나 또는 그 이상의 활성을 유지하는 ADH 효소의 단편을 포함한다. 이런 단편은 결실 돌연변이에 의해, 일과적이고 당분야에 널리 공지된 재조합 기술에 의해, 또는 다수의 널리 공지된 단백분해 효소 중에서 한 가지를 이용한 목적되는 ADH 효소(들)의 효소적 절단에 의해 획득될 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 앞서 기술된 변형된 ADH 효소 및 ADH 효소 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
예로써, 참고 아미노산 서열에 적어도 50% "동일한" 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 단백질 단편에 의해, 단백질의 아미노산 서열은 단백질 서열이 참고 단백질의 아미노산 서열의 각 100개 아미노산마다 50개까지의 아미노산 변경을 포함할 수 있는 점을 제외하고, 참고 서열과 동일한 것으로 의도된다. 다시 말하면, 참고 아미노산 서열에 적어도 50% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 획득하기 위해, 참고 서열 내에 아미노산 잔기 중에서 50%까지 결실되거나, 또는 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 참고 서열 내에 전체 아미노산 잔기 중에서 50%까지 다수의 아미노산이 참고 서열 내로 삽입될 수 있다. 참고 서열의 이들 변경은 참고 아미노산 서열의 아미노 (N-) 및/또는 카르복시 (C-) 말단 위치에서 및/또는 이들 말단 위치 사이에 임의의 위치에서, 참고 서열에서 잔기 간에 및/또는 참고 서열 내에 하나 또는 그 이상의 인접한 그룹에서 개별적으로 산재되게 일어날 수 있다. 실제로, 소정의 아미노산 서열이 예로써, 참고 단백질의 아미노산 서열에 적어도 50% 동일한 지는 핵산 서열 동일성 결정을 위해 앞서 기술된 것들과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 또는 CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다 (Thompson, J. D., et al., Nucleic Acids Res. 22:4673 4680 (1994)).
한 측면에서, 아미노산 치환은 앞서 확인된 위치 (즉, 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 Y50, Q77, V108, Y113, I212, 또는 L264에 동등하거나 상응하는 아미노산 위치) 중에서 하나 또는 그 이상에서 만들어진다. 따라서 이들 위치에서 아미노산은 Ala, Asn, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 그리고 Val을 비롯한 임의의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 증가된 능력을 나타내는 ADH 효소의 특정 실례는 (1) 위치 50에서 티로신이 페닐알라닌 또는 트립토판 잔기로 대체되고, (2) 위치 77에서 글루타민이 아르기닌 또는 세린 잔기로 대체되고, (3) 위치 108에서 발린이 세린 또는 알라닌 잔기로 대체되고, (4) 위치 113에서 티로신이 페닐알라닌 또는 글리신 잔기로 대체되고, (5) 위치 212에서 이소류신이 트레오닌 또는 발린 잔기로 대체되고, 및/또는 (6) 위치 264에서 류신이 발린 잔기로 대체되는 ADH이다.
본 발명에서 이용을 위한, 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 능력을 갖는 폴리펩티드는 당업자에게 널리 공지된, 자연 단백질을 단리하고 정제하기 위한 표준 절차에 따라 그들의 자연 원핵 또는 진핵 출처로부터 단리될 수 있다 (참조: Houts, G. E., et al., J. Virol. 29:517 (1979)). 이에 더하여, 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 능력을 갖는 폴리펩티드는 당업자에게 익숙한 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다 (참조: Kotewicz, M. L., et al., Nucl. Acids Res. 16:265 (1988); Soltis, D. A., 그리고 Skalka, A. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3372 3376 (1988)).
본 발명의 한 측면에서, 변형된 ADH 효소는 재조합 기술에 의해 만들어진다. 본 발명에 따라서 변형되는 ADH 효소를 인코딩하는 유전자 또는 기타 핵산 분자를 클로닝하기 위해, ADH 효소 유전자 또는 개방 해독 틀을 내포하는 단리된 DNA는 재조합 DNA 라이브러리를 작제하는데 이용될 수 있다. 당분야에 널리 공지된 임의의 벡터가 목적되는 ADH 효소를 클로닝하는데 이용될 수 있다. 하지만, 이용된 벡터는 재조합 벡터가 형질전환될 숙주와 양립해야 한다.
플라스미드 라이브러리를 작제하기 위한 원핵 벡터에는 대장균(E. coli)에서 복제할 수 있는 것들과 같은 플라스미드, 예를 들면, pBR322, ColE1, pSC101, pUC-벡터 (pUC18, pUC19 등: In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); 그리고 Sambrook et al., In: Molecular Cloning A Laboratory Manual (2d ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))가 포함된다. 바실루스(Bacillus) 플라스미드에는 pC194, pUB110, pE194, pC221, pC217 등이 포함된다. 이런 플라스미드는 Glyczan, T. In: The Molecular Biology Bacilli, Academic Press, York (1982), 307 329에 의해 개시된다. 적절한 스트렙토미세스(Streptomyces) 플라스미드에는 pIJ101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177 4183 (1987))이 포함된다. 슈도모나스(Pseudomonas) 플라스미드는 John et al., (Rad. Insec. Dis. 8:693 704 (1986)), 그리고 Igaki, (Jpn. J. Bacteriol. 33:729 742 (1978))에서 재검토된다. 넓은-숙주 범위 플라스미드 또는 코스미드, 예를 들면, pCP13 (Darzins and Chakrabarty, J. Bacteriol. 159:9 18 (1984)) 역시 본 발명에 이용될 수 있다.
목적되는 ADH 핵산 분자를 클로닝하는데 적합한 숙주는 원핵 숙주이다. 원핵 숙주의 한 가지 실례는 대장균(E. coli)이다. 하지만, 본 발명의 원하는 ADH 핵산 분자는 에스체르키아(Escherichia), 바실루스(Bacillus), 스트렙토미세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 그리고 프로테우스(Proteus) 속의 숙주가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 원핵 숙주에서 클로닝될 수도 있다.
목적되는 ADH 효소의 클로닝과 발현을 위한 진핵 숙주에는 효모와 진균 세포가 포함된다. 특히 바람직한 진핵 숙주는 효모이다. 이런 진핵 세포에서 원하는 ADH 효소의 발현은 진핵 프로모터를 포함하는 진핵 조절 영역의 이용을 요구할 지도 모른다. 진핵 세포에서 ADH 핵산 분자의 클로닝과 발현은 널리 공지된 진핵 벡터 시스템을 이용한 널리 공지된 기술에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따라서 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 효소의 능력을 증가시키거나, 또는 본 발명에 따라서 효소에 본 명세서에서 기술된 다른 성질을 공여하기 위해, 하나 또는 그 이상의 돌연변이가 목적되는 임의의 ADH 효소에서 만들어질 수 있다. 이런 돌연변이에는 점 돌연변이, 해독틀 이동 돌연변이, 결실, 그리고 삽입이 포함된다. 바람직하게는, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 유발하는 하나 또는 그 이상의 점 돌연변이가 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 증강된 능력을 갖는 ADH 효소를 생산하는데 이용된다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185) 효소의 위치 Y50 (가령, Y50W 또는 Y50F), Q77 (가령, Q77S 또는 Q77R), V108 (가령. V108S 또는 V108A), Y113 (가령, Y113F 또는 Y113G), I212 (가령, I212T 또는 I212V), 및/또는 L264 (가령. L264V)에 동등하거나 상응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이가 목적되는 다른 ADH 효소에서 원하는 결과를 산출하기 위해 만들어질 수 있다.
본 발명에서 확인된 ADH 효소의 상응하는 위치 (가령, 서열 번호: 185의 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA)는 당업자에 의해 다른 ADH 효소에 대해 쉽게 확인될 수 있다. 따라서 정의된 영역 및 본 출원에서 기술된 검사법을 고려하면, 당업자는 하나 또는 다수의 변형을 만들 수 있고, 이것은 목적되는 임의의 ADH 효소에서 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 증가된 능력을 유발할 것이다.
바람직한 구체예에서, 변형된 ADH 효소는 야생형 ADH 효소와 비교하여 Y50, Q77, V108, Y113, I212, 또는 L264에 상응하는 위치에서 선택되는 1 내지 6개 아미노산 치환을 갖는다. 다른 구체예에서, 이들 변형된 ADH 효소는 개별 야생형 ADH 효소와 비교하여 다른 위치에서 추가의 아미노산 치환을 갖는다. 따라서 변형된 ADH 효소는 개별 야생형 ADH 효소와 비교하여 다른 위치에서 적어도 대략 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개의 상이한 잔기를 가질 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 아미노산 치환을 갖는 추가의 위치의 숫자는 변이체를 산출하는데 이용되는 야생형 ADH 효소에 좌우될 것이다. 따라서 일부 경우에, 50개까지의 상이한 위치가 아미노산 치환을 가질 수 있다.
다양한 미생물은 본 발명에서 제시된 재조합 미생물에서 이용하기 적합한 ADH 효소를 인코딩하는 유전자 물질에 대한 "출처"로서 기능할 수 있는 것으로 이해된다. 가령, 이에 더하여, 이들 효소를 인코딩하는 유전자는 다른 진균과 세균 종으로부터 확인될 수 있고, 그리고 이러한 경로의 조정을 위해 발현될 수 있다. 락토코커스 락티스(L. lactis)를 비롯한 락토코커스(Lactococcus) 종, 락토바실루스 브레비스(L. brevis), 락토바실루스 부츠네리(L. buchneri), 락토바실루스 힐가르디(L. hilgardii), 락토바실루스 퍼멘툼(L. fermentum), 락토바실루스 루테리(L. reuteri), 락토바실루스 바기날리스(L. vaginalis), 락토바실루스 안트리(L. antri), 락토바실루스 오리스(L. oris), 그리고 락토바실루스 콜레오호미니스(L. coleohominis)를 비롯한 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 페디오코커스 아시딜락티시(P. acidilactici)를 비롯한 페디오코커스(Pediococcus) 종, 바실루스 세레우스(B. cereus), 바실루스 투린기엔시스(B. thuringiensis), 바실루스 코아굴란스(B. coagulans), 바실루스 안트라시스(B. anthracis), 바실루스 웨이헨스테파넨시스(B. weihenstephanensis), 바실루스 미코이데스(B. mycoides), 그리고 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens)를 비롯한 바실루스(Bacillus) 종, 렙토트리키아 굿펠로위(L. goodfellowii), 렙토트리키아 부칼리스(L. buccalis), 그리고 렙토트리키아 호프스타디(L. hofstadii)를 비롯한 렙토트리키아(Leptotrichia) 종, 액티노바실루스 플로로뉴모니애 (A. pleuropneumoniae)를 비롯한 액티노바실루스(Actinobacillus) 종, 스트렙토코커스 상귀니스(S. sanguinis), 스트렙토코커스 파라상귀니스(S. parasanguinis), 스트렙토코커스 고르도니(S. gordonii), 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae), 그리고 스트렙토코커스 미티스(S. mitis)를 비롯한 스트렙토코커스(Streptococcus) 종, 스트렙토바실루스 모닐리포르미스(S. moniliformis)를 비롯한 스트렙토바실루스(Streptobacillus) 종, 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)를 비롯한 스타필로코커스(Staphylococcus) 종, 아이케넬라 코로덴스(E. corrodens)를 비롯한 아이케넬라(Eikenella) 종, 바이셀라 파라메센테로이데스(W. paramesenteroides)를 비롯한 바이셀라(Weissella) 종, 킹겔라 오랄리스(K. oralis)를 비롯한 킹겔라(Kingella) 종, 그리고 로티아 덴토카리오사(R. dentocariosa)를 비롯한 로티아(Rothia) 종, 그리고 엑시구오박테륨(Exiguobacterium) 종이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 생명체가 이들 효소에 대한 출처로서 기능할 수 있다.
몇몇 ADH 효소에 대한 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다. 가령, ADH 효소의 서열은 락토코커스 락티스(L. lactis) (서열 번호: 185), 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 그리고 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 미생물로부터 획득가능하다. 본 발명의 방법에 의해 변형가능한 ADH 효소에는 공동 소유된 동시-계속 출원 U.S. Patent Publication No. 2010/0143997에서 개시된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 변형가능한 ADH 효소의 대표적인 목록은 표 97에서 찾아볼 수 있다.
이에 더하여, 비활성을 갖는 ADH 효소를 인코딩하는 유전자를 확인하기 위해 임의의 방법이 이용될 수 있다. 일반적으로, 유사한 활성을 갖는 상동한 또는 상사한 유전자는 기능적, 구조적, 및/또는 유전적 분석에 의해 확인될 수 있다. 대부분의 경우에, 유사한 활성을 갖는 상동한 또는 상사한 유전자는 기능적, 구조적, 또는 유전적 유사성을 가질 것이다. 상동한 유전자 및 상동한 효소를 확인하기 위해 당업자에게 공지된 기술이 적합할 수 있다. 일반적으로, 상사한 유전자 및/또는 상사한 효소는 기능적 분석에 의해 확인될 수 있고 기능적 유사성을 가질 것이다. 상사한 유전자 및 상사한 효소를 확인하기 위해 당업자에게 공지된 기술이 적합할 수 있다. 가령, 상동한 또는 상사한 유전자, 단백질, 또는 효소를 확인하기 위한 기술에는 유전자/효소의 공개된 서열에 기초된 프라이머를 이용한 PCR에 의한, 또는 유전자 간에 보존된 영역을 증폭하도록 설계된 축퇴 프라이머를 이용한 축퇴 PCR에 의한 유전자의 클로닝이 포함될 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 게다가, 당업자는 기능적 상동성 또는 유사성을 갖는 상동한 또는 상사한 유전자, 단백질, 또는 효소를 확인하는 기술을 이용할 수 있다. 기술에는 활성에 대한 시험관내 효소 검사법을 통한 효소의 촉매 효율 또는 비활성에 대한 세포 또는 세포 배양액 조사, 그 다음 정제를 통한 상기 활성을 갖는 효소의 단리, 에드만 분해 (Edman degradation)와 같은 기술을 통한 효소의 단백질 서열 결정, 개연적 핵산 서열에 대한 PCR 프라이머의 설계, PCR을 통한 상기 DNA 서열의 증폭, 그리고 상기 핵산 서열의 클로닝이 포함된다. 유사한 활성을 갖는 상동한 또는 상사한 유전자를 확인하는 기술에는 또한, 후보 유전자 또는 효소와 관련된 데이터의 BRENDA, KEGG, 또는 MetaCYC와의 같은 데이터베이스와의 비교가 포함된다. 후보 유전자 또는 효소는 본 발명의 교시에 따라, 전술한 데이터베이스 내에서 확인될 수 있다. 게다가, 효소적 활성은 표현형적으로 결정될 수 있다.
증강된 촉매 효율을 갖는 ADH 효소를 만드는 방법
본 발명에서는 또한, 촉매 효율을 증강시키기 위해 ADH 효소를 조작하는 방법을 제시한다.
ADH 효소의 촉매 효율을 증가시키는 한 가지 접근법은 NNK 라이브러리로 포화 돌연변이유발 (saturation mutagenesis)이다. 이들 라이브러리는 어떤 단일 돌연변이가 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 증가된 능력에 기여하는 지를 확인하기 위해, 촉매 효율에서 증가에 대해 스크리닝될수 있다. 전술한 잔기에서 돌연변이의 조합은 임의의 방법에 의해 조사될 수 있다. 가령, 돌연변이체의 조합 라이브러리가 포화 돌연변이유발 연구의 결과에 기초하여 설계될 수 있다.
다른 접근법은 합성 올리고뉴클레오티드 상에서 인코딩된 무작위 돌연변이를 효소 내로 함입 (incorporation)함으로써 다양성 (diversity)을 산출하는 무작위 올리고뉴클레오티드 돌연변이유발을 이용하는 것이다. 집단 내에서 개별 효소에서 돌연변이의 숫자는 올리고뉴클레오티드의 합성 동안 표적 서열의 길이 및 무작위화의 정도를 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 이러한 더욱 정의된 접근법의 이점은 모든 가능한 아미노산 돌연변이 및 결부된 돌연변이가 발견될 수 있다는 점이다.
앞서 기술된 실험으로부터 최고 변이체들이 충분한 활성을 나타내지 않으면, 오류-유발 (error-prone) PCR에 의한 방향적 진화가 진전된 향상을 획득하는데 이용될 수 있다. ADH 효소의 오류-유발 PCR 돌연변이유발 이후에, ADH 활성에 대한 스크리닝이 수행될 수 있다.
증강된 ADH 촉매 효율
한 측면에서, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 증강된다. 본 명세서에서, 구(句) "촉매 효율"은 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환을 가능하게 하는 ADH 효소의 성질을 지칭한다.
한 구체예에서, 변형된 ADH의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 증강된다. 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 5% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 15% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 25% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 50% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 75% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 100% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 200% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 500% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 1000% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 2000% 증강된다. 더욱 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 3000% 증강된다. 가장 바람직하게는, 변형된 ADH 효소의 촉매 효율은 야생형 또는 부모 ADH와 비교하여 적어도 대략 3500% 증강된다.
변형된 ADH 효소의 유전자 발현
본 발명에서는 유익한 대사산물의 생산에 관여하는 하나 또는 그 이상의 변형된 ADH 효소 유전자의 발현을 위한 방법, 그리고 이러한 방법에 유용한 재조합 DNA 발현 벡터가 제시된다. 따라서 이런 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 용어 발현 벡터는 숙주 미생물 또는 세포-없는 전사와 번역 시스템 내로 도입될 수 있는 핵산을 지칭한다. 발현 벡터는 미생물 또는 임의의 세포 구획 내에 염색체 또는 다른 DNA, 예를 들면, 세포질 내에 복제 벡터의 일부로서 인지에 상관없이, 미생물 내에 영구적으로 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 발현 벡터는 또한, RNA의 발현을 주동하는 프로모터를 포함하고, RNA는 전형적으로 미생물 또는 세포 추출물 내에서 폴리펩티드로 번역된다. RNA의 단백질로의 효율적인 번역을 위해, 발현 벡터는 전형적으로 발현되는 유전자의 코딩 서열의 출발 코돈의 상류에 위치된 리보솜-결합 부위 서열 역시 내포한다. 다른 요소, 예를 들면, 인핸서, 분비 신호 서열, 전사 종결 서열, 그리고 벡터를 내포하는 숙주 미생물이 확인되고 및/또는 선별될 수 있는 하나 또는 그 이상의 마커 유전자 역시 발현 벡터 내에 존재할 수 있다. 선별가능 마커, 다시 말하면, 항생제 내성 또는 감수성을 공여하는 유전자가 이용되고, 그리고 형질전환된 세포가 적절한 선택성 배지에서 성장될 때 이들 세포에 선별가능 표현형을 공여한다.
발현 벡터의 다양한 성분은 벡터의 의도된 용도 및 벡터가 복제하거나 발현을 주동하도록 의도되는 숙주 세포(들)에 따라 광범위하게 변할 수 있다. 대장균(E. coli), 효모, 스트렙토미세스(Streptomyces), 그리고 기타 통상적으로 이용되는 세포에서 유전자의 발현과 벡터의 유지에 적합한 발현 벡터 성분은 폭넓게 공지되어 있고 상업적으로 구입가능하다. 가령, 본 발명의 발현 벡터 내에 포함을 위한 적절한 프로모터에는 진핵 또는 원핵 숙주 미생물에서 기능하는 것들이 포함된다. 프로모터는 숙주 미생물의 성장에 비하여 발현의 조절이 가능하거나, 또는 화학적 또는 물리적 자극에 응하여 유전자의 발현이 켜지거나 꺼지도록 하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 대장균(E. coli) 및 일정한 다른 세균 숙주 세포의 경우에, 생합성 효소, 항생제-내성 공여 효소, 그리고 파지 단백질에 대한 유전자로부터 유래된 프로모터가 이용될 수 있고, 여기에는 예로써, 갈락토오스, 락토오스 (lac), 말토오스, 트립토판 (trp), 베타-락타마아제 (bla), 박테리오파지 람다 PL, 그리고 T5 프로모터가 포함된다. 이에 더하여, 합성 프로모터, 예를 들면, tac 프로모터 (U.S. Pat. No. 4,551,433) 역시 이용될 수 있다. 대장균(E. coli) 발현 벡터의 경우에, 예로써 pUC, p1P, p1, 그리고 pBR로부터 대장균(E. coli) 복제 기원을 포함하는 것이 유용하다.
따라서 재조합 발현 벡터는 적어도 하나의 발현 시스템을 내포하고, 이것은 차례로, 프로모터에 작동가능하게 연결된 생합성 유전자 코딩 서열의 적어도 일부분 및 선택적으로, 양립성 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 실행하도록 작동하는 종결 서열로 구성된다. 숙주 세포는 염색체외 요소 (extrachromosomal element)로서 또는 염색체 내로 통합된 발현 시스템 서열을 내포하는 본 발명의 재조합 DNA 발현 벡터로 형질전환에 의해 변형된다.
게다가, 특정 미생물 (즉, 효모 미생물)에 특이적인 핵산 분자로부터 폴리펩티드를 발현하는 방법은 널리 공지되어 있다. 가령, 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 및 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 내에서 이종기원성 폴리펩티드의 발현에 이용되는 핵산 구조체는 널리 공지되어 있다 (참조: U.S. Pat. Nos. 4,859,596과 4,943,529, 이들 각각은 클루이베로미세스(Kluyveromyces)에 대해 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다; 그리고 사카로미세스(Saccharomyces)에 대해 예로써 Gellissen et al., Gene 190(1):87-97 (1997)). 효모 플라스미드는 선별가능 마커 및 복제 기원 (일명, 자율 복제 서열, Autonomously Replicating Sequence (ARS))을 갖는다. 이에 더하여, 일정한 플라스미드는 또한, 동원체 서열 (centromeric sequence)을 내포한다. 이들 동원체 플라스미드는 일반적으로, 단일 또는 낮은 사본 플라스미드이다. 동원체 서열이 없고, 그리고 2 마이크론 (사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)) 또는 1.6 마이크론 (클루이베로미세스 락티스(K. lactis)) 복제 기원을 이용하는 플라스미드는 높은 사본 플라스미드이다. 선별가능 마커는 자가영양성 마커, 예를 들면, HIS3, TRP1, LEU2, URA3 또는 ADE2, 또는 항생제 내성 마커, 예를 들면, bar, ble, hph, 또는 kan일 수 있다.
본 발명의 핵산은 표준 PCR 증폭 기술 및 하기 실시예 섹션에서 기술된 절차에 따라, 주형 (template)으로서 cDNA, mRNA 합성 DNA, 또는 대안으로, 유전체 DNA, 그리고 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다. 이렇게 증폭된 핵산은 적절한 벡터 내로 클로닝되고 DNA 서열 분석에 의해 특성화될 수 있다. 게다가, 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 예로써, 자동화된 DNA 합성장치를 이용한 표준 합성 기술에 의해 만들어질 수 있다.
또한, 본 명세서에서 기술된 효소에 상동한 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 인코딩된 단백질 내로 도입되도록 특정 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입함으로써 산출될 수 있는 것으로 이해된다. 돌연변이는 표준 기술, 예를 들면, 특정 부위 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다. 비-보존성 아미노산 치환 (상기 참조)을 만드는 것이 바람직한 이들 위치에 대조적으로, 일부 위치에서는 보존성 아미노산 치환을 만드는 것이 바람직하다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당분야에서 확인되었다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 아스파르트산, 글루타민산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다.
비록 아미노산 변경의 효과가 인산화, 당화, 사슬내 연쇄, 삼차 구조, 그리고 활성 부위 또는 가능한 알로스테릭 부위 (allosteric site)에서 아미노산의 역할과 같은 인자에 따라 달라지긴 하지만, 치환된 아미노산은 대체되는 아미노산과 동일한 그룹으로부터 나오는 것이 일반적으로 바람직하다. 어느 정도, 하기 그룹은 교체가능한 아미노산을 내포한다: 염기성 아미노산 리신, 아르기닌, 그리고 히스티딘; 산성 아미노산 아스파르트산과 글루타민산; 중성 극성 아미노산 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아스파라긴 및 정도가 덜하지만, 메티오닌; 비극성 지방족 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 그리고 류신 (하지만, 크기로 인하여, 글리신과 알라닌이 더욱 밀접하게 관련되고, 그리고 발린, 이소류신과 류신이 더욱 밀접하게 관련된다); 그리고 방향족 아미노산 페닐알라닌, 트립토판, 그리고 티로신. 이에 더하여, 비록 상이한 부류로 분류되긴 하지만, 알라닌, 글리신, 그리고 세린은 어느 정도 교체가능한 것으로 보이고, 그리고 시스테인은 이러한 그룹에 추가로 적합하거나, 또는 이들 극성 중성 아미노산과 함께 분류될 수 있다.
일반적인 방법
3-케토산 환원효소 동족체의 확인
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29가 포함되지만 이에 국한되지 않는, 3-케토산 환원효소 활성을 갖는 효소를 인코딩하는 유전자를 확인하기 위해 임의의 방법이 이용될 수 있다. 일반적으로, 3-케토산 환원효소에 상동한 또는 유사한 유전자, 예를 들면, TMA29는 기능적, 구조적, 및/또는 유전적 분석에 의해 확인될 수 있다. 많은 경우에, 상동한 또는 유사한 유전자 및/또는 상동한 또는 유사한 효소는 기능적, 구조적, 또는 유전적 유사성을 가질 것이다.
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 유전자 TMA29는 또한, YMR226C로 알려져 있다. 개방 해독 틀 (ORF) YMR226C는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 염색체 XIII 상에서 위치 722395…721592에서 발견된다. YMR226C의 염색체 위치는 많은 관련된 효모에서 염색체에 고도로 신터닉(syntenic)한 영역이다 [Byrne, K.P. and K. H. Wolfe (2005) "The Yeast Gene Order Browser: combining curated homology and syntenic context reveals gene fate in polyploid species." Genome Res. 15(10):1456-61. Scannell, D. R., K. P. Byrne, J. L. Gordon, S. Wong, and K. H. Wolfe (2006) "Multiple rounds of speciation associated with reciprocal gene loss in polyploidy yeasts." Nature 440: 341-5. Scannell, D. R., A. C. Frank, G. C. Conant, K. P. Byrne, M. Woolfit, and K. H. Wolfe (2007)" Independent sorting-out of thousands of duplicated gene pairs in two yeast species descended from a whole-genome duplication." Proc Natl Acad Sci U S A 104: 8397-402.]
가령, 다른 효모 종으로부터 YMR226C의 신터닉 이형의 위치는 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)에서 염색체 13, 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii)에서 염색체 1, 클루이베로미세스 락티스(K. lactis)에서 염색체 2, 아시비아 고시피(Ashbya gossypii)에서 염색체 6, 사카로미세스 클루이베리(S. kluyveri)에서 염색체 8, 클루이베로미세스 써모톨레란스(K. thermotolerans)에서 염색체 4, 그리고 추론된 조상 효모 종으로부터 염색체 8 상에서 발견될 수 있다 [Gordon, J. L., K. P. Byrne, and K. H. Wolfe (2009) "Additions, losses, and rearrangements on the evolutionary route from a reconstructed ancestor to the modern Saccharomyces cerevisiae genome." PLoS Genet. 5: e1000485.]
이러한 신터닉 상관관계를 이용하여, 상기 유전자의 종-특이적 이형은 쉽게 확인되고, 그리고 실례는 표 4에서 찾아볼 수 있다.
YMR226C 및 이들의 동족체.
종 유전자 명칭 서열 번호:
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226C 1
카바티엘라 폴리스포라(K. polyspora) Kpol_1043p53 2
사카로미세스 카스텔리(S. castelli) Scas_594.12d 3
칸디다 글라브라타(C. glabrata) CAGL0M11242g 4
사카로미세스 바야누스(S. bayanus) Sbay_651.2 5
지고사카로미세스 로욱시(Z. rouxii) ZYRO0A05742p 6
클루이베로미세스 락티스(K. lactis) KLLA0B08371g 7
아시비아 고시피(A. gossypii) AFR561Wp 8
사카로미세스 클루이베리(S. kluyveri) SAKL0H04730g 9
클루이베로미세스 써모톨레란스(K. thermotolerans) KLTH0D13002p 10
클루이베로미세스 왈티(K. waltii) Kwal_26.9160 11
신터니에 더하여, 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29 유전자에 대한 진균 동족체가 BLAST와 같은 도구 및 서열 배열을 통해 당업자에 의해 확인될 수 있다. 이들 다른 동족체는 3-히드록시산 부산물의 축적을 제거하기 위해 개별 효모 종으로부터 유사한 방식으로 결실될 수 있다. 상동한 단백질의 실례는 반더왈톰지마 폴리스포라(Vanderwaltomzyma polyspora) (서열 번호: 2), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 3), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 4), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 5), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii) (서열 번호: 6), 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) (서열 번호: 7), 아시비아 고시피(Ashbya gossypii) (서열 번호: 8), 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri) (서열 번호: 9), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 10), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 11), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis) (서열 번호: 12), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii) (서열 번호: 13), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 14), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis) (서열 번호: 15), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (서열 번호: 16), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) (서열 번호: 17), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) (서열 번호: 18), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) (서열 번호: 19), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) (서열 번호: 20), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (서열 번호: 21), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 22), 그리고 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 23)에서 발견될 수 있다.
당업자에게 공지된 기술이 추가의 상동한 유전자 및 상동한 효소를 확인하는데 적합할 수 있다. 일반적으로, 상사한 유전자 및/또는 상사한 효소는 기능적 분석에 의해 확인되고 기능적 유사성을 가질 것이다. 당업자에게 공지된 기술이 상사한 유전자 및 상사한 효소를 확인하는데 적합할 수 있다. 가령, 상동한 또는 상사한 유전자, 단백질, 또는 효소를 확인하기 위한 기술에는 유전자/효소의 공개된 서열에 기초된 프라이머를 이용한 PCR에 의한, 또는 탈수화효소 유전자 사이에 보존된 영역을 증폭하도록 설계된 축퇴 프라이머를 이용한 축퇴 PCR에 의한 탈수화효소 유전자 클로닝이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 게다가, 당업자는 기능적 상동성 또는 유사성을 갖는 상동한 또는 상사한 유전자, 단백질, 또는 효소를 확인하는 기술을 이용할 수 있다. 기술에는 상기 활성에 대한 시험관내 효소 검사법을 통한 효소의 촉매 활성에 대한 세포 또는 세포 배양액 조사(가령, 본 명세서에서 또는 Kiritani, K. Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970에서 기술된 바와 같이), 그 다음 정제를 통한 상기 활성을 갖는 효소의 단리, 에드만 분해 (Edman degradation)와 같은 기술을 통한 효소의 단백질 서열 결정, 개연적 핵산 서열에 대한 PCR 프라이머의 설계, PCR을 통한 상기 DNA 서열의 증폭, 그리고 상기 핵산 서열의 클로닝이 포함된다. 상동한 또는 유사한 유전자 및/또는 상동한 또는 유사한 효소, 상사한 유전자 및/또는 상사한 효소 또는 단백질을 확인하기 위한 기술에는 또한, 후보 유전자 또는 효소와 관련된 데이터의 BRENDA, KEGG, 또는 MetaCYC와 같은 데이터베이스와의 비교가 포함된다. 후보 유전자 또는 효소는 본 발명의 교시에 따라서, 앞서 언급된 데이터베이스 내에서 확인될 수 있다.
알데히드 탈수소효소 동족체의 확인
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6이 포함되지만 이에 국한되지 않는, 알데히드 탈수소효소 활성을 갖는 효소를 인코딩하는 유전자를 확인하기 위해 임의의 방법이 이용될 수 있다. 일반적으로, 알데히드 탈수소효소에 상동한 또는 유사한 유전자, 예를 들면, ALD6은 기능적, 구조적, 및/또는 유전적 분석에 의해 확인될 수 있다. 많은 경우에, 상동한 또는 유사한 유전자 및/또는 상동한 또는 유사한 효소는 기능적, 구조적, 또는 유전적 유사성을 가질 것이다.
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 유전자 ALD6은 또한, 분류명 YPL061W로 알려져 있다. 개방 해독 틀 (ORF) YPL061W는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 염색체 XVI 상에서 위치 432585…434087에서 발견된다. YPL061W의 염색체 위치는 많은 관련된 효모에서 염색체에 고도로 신터닉(syntenic)한 영역이다 [Byrne, K.P. and K. H. Wolfe (2005) "The Yeast Gene Order Browser: combining curated homology and syntenic context reveals gene fate in polyploid species." Genome Res. 15(10):1456-61. Scannell, D. R., K. P. Byrne, J. L. Gordon, S. Wong, and K. H. Wolfe (2006) "Multiple rounds of speciation associated with reciprocal gene loss in polyploidy yeasts." Nature 440: 341-5. Scannell, D. R., A. C. Frank, G. C. Conant, K. P. Byrne, M. Woolfit, and K. H. Wolfe (2007)" Independent sorting-out of thousands of duplicated gene pairs in two yeast species descended from a whole-genome duplication." Proc Natl Acad Sci U S A 104: 8397-402.]
가령, 다른 효모 종으로부터 YPL061W의 신터닉 이형의 위치는 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)에서 염색체 8, 클루이베로미세스 락티스(K. lactis)에서 염색체 5, 클루이베로미세스 써모톨레란스(K. thermotolerans)에서 염색체 5, 그리고 추론된 조상 효모 종으로부터 염색체 8 상에서 발견될 수 있다 [Gordon, J. L., K. P. Byrne, and K. H. Wolfe (2009) "Additions, losses, and rearrangements on the evolutionary route from a reconstructed ancestor to the modern Saccharomyces cerevisiae genome." PLoS Genet. 5: e1000485.]
이러한 신터닉 상관관계를 이용하여, 상기 유전자의 종-특이적 이형은 쉽게 확인되고, 그리고 실례는 표 5에서 찾아볼 수 있다.
ALD6 및 이들의 동족체.
종 유전자 명칭 서열 번호:
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YPL061W 25
사카로미세스 카스텔리(S. castelli) Scas_664.24 26
칸디다 글라브라타(C. glabrata) CAGL0H05137g 27
사카로미세스 바야누스(S. bayanus) Sbay_623.4 28
클루이베로미세스 락티스(K. lactis) KLLA0E23057 29
클루이베로미세스 써모톨레란스(K. thermotolerans) KLTH0E12210g 30
클루이베로미세스 왈티(K. waltii) Kwal_27.119760 31
신터니에 더하여, 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 유전자에 대한 진균 동족체가 BLAST와 같은 도구 및 서열 배열을 통해 당업자에 의해 확인될 수 있다. 이들 다른 동족체는 알데히드 부산물의 축적을 제거하기 위해 개별 효모 종으로부터 유사한 방식으로 결실될 수 있다. 상동한 단백질의 실례는 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli) (서열 번호: 26), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (서열 번호: 27), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) (서열 번호: 28), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) (서열 번호: 29), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) (서열 번호: 30), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii) (서열 번호: 31), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) YJ789 (서열 번호: 32), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) JAY291 (서열 번호: 33), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) EC1118 (서열 번호: 34), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) DBY939 (서열 번호: 35), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) AWRI1631 (서열 번호: 36), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) RM11-1a (서열 번호: 37), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (서열 번호: 38), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) (서열 번호: 39), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 40), 그리고 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (서열 번호: 41)에서 찾아볼 수 있다.
미생물에서 ADH 또는 KDH의 확인
알코올 탈수소효소 (ADH) 또는 케토산 탈수소효소 (KDH) 활성을 갖는 효소를 인코딩하는 유전자를 확인하기 위해 임의의 방법이 이용될 수 있다. 알코올 탈수소효소 (ADH)는 이소부탄올의 이소부티르알데히드로의 가역적 전환을 촉진할 수 있다. 케토산 탈수소효소 (KDH)는 2-케토이소발레레이트의 이소부티릴-CoA로의 전환을 촉진할 수 있고, 이것은 아세틸전달효소 및 카르복실산 키나아제 효소의 작용에 의해 이소부티레이트로 더욱 전환될 수 있다. 일반적으로, 공지된 알코올 탈수소효소 및 케토산 탈수소효소에 상동한 또는 유사한 유전자는 기능적, 구조적, 및/또는 유전적 분석에 의해 확인될 수 있다. 많은 경우에, 상동한 또는 유사한 알코올 탈수소효소 유전자 및/또는 상동한 또는 유사한 알코올 탈수소효소 효소는 기능적, 구조적, 또는 유전적 유사성을 가질 것이다. 유사하게, 상동한 또는 유사한 케토산 탈수소효소 유전자 및/또는 상동한 또는 유사한 케토산 탈수소효소 효소는 기능적, 구조적, 또는 유전적 유사성을 가질 것이다.
효모 미생물에서 PDC와 GPD의 확인
피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC) 활성 또는 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD) 활성을 갖는 효소를 인코딩하는 유전자를 확인하기 위해 임의의 방법이 이용될 수 있다. PDC와 GPD의 확인을 위한 적절한 방법은 공동 소유된 동시-계속 출원, US 2009/0226991과 US 2011/0020889에서 기술되고, 이들 둘 모두 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
유전자 삽입과 결실
핵산 분자를 효모 내로 도입하기 위해 임의의 방법이 이용될 수 있고, 그리고 이와 같은 많은 방법이 널리 공지되어 있다. 가령, 형질전환과 전기천공 (electroporation)은 핵산을 효모 세포 내로 도입하기 위한 통상의 방법이다 (참조: Gietz et al., 1992, Nuc Acids Res. 27: 69-74; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163-8; 그리고 Becker et al., 1991, Methods in Enzymology 194: 182-7).
한 구체예에서, 목적되는 유전자의 효모 미생물의 DNA 단편 또는 표적 유전자로의 통합은 상동성 재조합 (homologous recombination)의 원리에 따라 일어난다. 이러한 구체예에 따라서, 적어도 하나의 효모 마커 유전자 및/또는 통합되는 유전자를 포함하는 모듈 (module) (내부 모듈)을 내포하는 통합 카세트 (integration cassette)는 표적화된 통합 부위의 단부에 상동한 DNA 단편 (재조합원성 (recombinogenic) 서열)에 의해 한쪽 측면 상에서 접한다. 효모를 적절한 방법에 의해 카세트로 형질전환시킨 이후, 재조합원성 서열 사이에 상동성 재조합은 통합 카세트의 재조합원성 서열에 상응하는 유전제의 두 부위 간에서 염색체 영역을 대체하는 내부 모듈을 유발할 수 있다 (Orr-Weaver et al., 1981, PNAS USA 78: 6354-58).
한 구체예에서, 효모 미생물 내로 목적되는 유전자의 통합을 위한 통합 카세트는 효모 염색체 내로 이종기원성 유전자의 통합을 위한 재조합원성 서열에 의해 접하는 선별가능 마커와 함께, 적절한 프로모터와 종결자의 제어하에 이종기원성 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 이종기원성 유전자는 선천성 유전자(들)의 사본 수를 증가시키기 위해 요망되는 적절한 선천성 유전자를 포함한다. 선별가능 마커 유전자는 HIS3, TRP1, LEU2, URA3, bar, ble, hph, 그리고 kan이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 효모에 이용되는 임의의 마커 유전자일 수 있다. 재조합원성 서열은 원하는 적용에 적합한 원하는 통합 부위에 따라, 자유롭게 선택될 수 있다.
다른 구체예에서, 효모 미생물의 염색체 내로 유전자의 통합은 무작위 통합에 의해 일어날 수 있다 (Kooistra et al., 2004, Yeast 21: 781-792).
추가적으로, 한 구체예에서, 일정한 도입된 마커 유전자는 당업자에게 널리 공지된 기술을 이용하여 유전체로부터 제거된다. 가령, URA3 마커 상실은 URA3 내포 세포를 FOA (5-플루오르-오르트산) 내포 배지에 도말하고 FOA 내성 집락을 선별함으로써 획득될 수 있다 (Boeke et al., 1984, Mol. Gen. Genet 197: 345-47).
본 발명의 효모 세포 내에 포함된 외생성 핵산 분자는 상기 세포 내에서 임의의 형태로 유지될 수 있다. 가령, 외생성 핵산 분자는 세포의 유전체 내로 통합되거나, 또는 딸 세포에 안정적으로 전달 ("유전")될 수 있는 에피솜 상태 (episomal state)로 유지될 수 있다. 이런 염색체외 유전자 요소 (가령, 플라스미드, 미토콘드리아 유전체 등)은 딸 세포에서 이런 유전자 요소의 존재를 담보하는 선별 마커를 추가적으로 내포할 수 있다. 게다가, 효모 세포는 안정적으로 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다. 이에 더하여, 본 명세서에서 기술된 효모 세포는 앞서 기술된 바와 같은 특정 외생성 핵산 분자의 단일 사본 또는 복수 사본을 내포할 수 있다.
효소적 활성의 감소
본 발명의 범위 내에 효모 미생물은 감소된 효소적 활성, 예를 들면, 감소된 3-케토산 환원효소, PDC, ALDH, 또는 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD) 활성을 가질 수 있다. 특정 효소적 활성과 관련하여 본 명세서에서 용어 "감소된"은 동일한 종의 동등한 효소 세포에서 측정된 것보다 더욱 낮은 수준의 효소적 활성을 지칭한다. 용어 "감소된"은 또한, 동일한 종의 동등한 효모 세포와 비교하여 효소적 활성의 제거를 지칭한다. 따라서 3-케토산 환원효소, PDC, ALDH 또는 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD) 활성이 없는 효모 세포는 감소된 3-케토산 환원효소, PDC, ALDH 또는 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD) 활성을 갖는 것으로 간주되는데, 그 이유는 비록 전부는 아니지만 대부분의 동등한 효모 균주가 적어도 어느 정도의 3-케토산 환원효소, PDC, ALDH, 또는 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD) 활성을 갖기 때문이다. 이런 감소된 효소적 활성은 더욱 낮은 효소 농도, 효소의 더욱 낮은 비활성, 또는 이들의 조합의 결과일 수 있다. 많은 상이한 방법이 감소된 효소적 활성을 갖는 효모를 만드는데 이용될 수 있다. 가령, 효모 세포는 통상의 돌연변이유발 또는 적중 (knock-out) 기술을 이용하여 파괴된 효소-인코딩 좌위 (locus)를 갖도록 조작될 수 있다 (참조: Methods in Yeast Genetics (1997 edition), Adams, Gottschling, Kaiser, and Stems, Cold Spring Harbor Press (1998). 이에 더하여, 감소된 활성을 갖는 효소를 발생시키는 일정한 점-돌연변이(들)가 도입될 수 있다. 또한, 자연에서 발견될 때 3-케토산 환원효소, PDC, ALDH, 또는 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD) 활성에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 활성이 실질적으로 없는 효모 균주는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
대안으로, 안티센스 기술이 효소적 활성을 감소시키는데 이용될 수 있다. 가령, 효모는 효소가 만들어지는 것을 예방하는 안티센스 분자를 인코딩하는 cDNA를 내포하도록 조작될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "안티센스 분자"는 내생성 폴리펩티드의 코딩 가닥에 상응하는 서열을 내포하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 안티센스 분자는 또한, 측면 서열 (가령, 조절 서열)을 가질 수 있다. 따라서 안티센스 분자는 리보자임 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 리보자임은 상기 분자가 RNA를 절단한다면, 헤어핀 (hairpin), 해머머리 (hammerhead), 또는 도끼머리 (axhead) 구조가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 포괄적 구조를 가질 수 있다.
감소된 효소적 활성을 갖는 효모는 많은 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 가령, 감소된 3-케토산 환원효소, PDC, ALDH, 또는 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD) 활성을 갖는 효모는 통상의 방법을 이용하여 쉽게 확인될 수 있는데, 이들 방법은 예로써, 액체 크로마토그래피 (liquid chromatography)를 거쳐 글리세롤 형성을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
이종기원성 유전자의 과다발현
선천성 또는 이종기원성 핵산 분자로부터 폴리펩티드를 과다발현하는 방법은 널리 공지되어 있다. 이런 방법은 제한 없이, 조절 요소가 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 증진하도록 핵산 서열을 작제하는 것을 포함한다. 전형적으로, 조절 요소는 전사 수준에서 다른 DNA 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열이다. 따라서 조절 요소에는 제한 없이, 프로모터, 인핸서 등이 포함된다. 가령, 외생성 유전자는 유도성 프로모터 또는 구조성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 게다가, 효모에서 외생성 핵산 분자로부터 폴리펩티드를 발현하는 방법은 널리 공지되어 있다. 가령, 클루이베로미세스(Kluyveromyces)와 사카로미세스(Saccharomyces) 내에서 외생성 폴리펩티드의 발현에 이용되는 핵산 구조체는 널리 공지되어 있다 (참조: 클루이베로미세스(Kluyveromyces)의 경우에 U.S. Pat. No. 4,859,596와 4,943,529, 그리고 사카로미세스(Saccharomyces)의 경우에 예로써, Gellissen et al., Gene 190(1):87-97 (1997)). 효모 플라스미드는 선별가능 마커 및 복제 기원을 갖는다. 게다가, 일정한 플라스미드는 동원체 서열 (centromeric sequence) 역시 내포할 수 있다. 이들 동원체 플라스미드는 일반적으로, 단일 또는 낮은 사본 플라스미드이다. 동원체 서열이 없고 2 마이크론 (사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)) 또는 1.6 마이크론 (클루이베로미세스 락티스(K. lactis)) 복제 기원을 이용하는 플라스미드는 높은 사본 플라스미드이다. 선별가능 마커는 자가영양성 마커, 예를 들면, HIS3, TRP1, LEU2, URA3 또는 ADE2, 또는 항생제 내성 마커, 예를 들면, bar, ble, hph, 또는 kan일 수 있다.
다른 구체예에서, 이종기원성 제어 요소는 내생성 유전자의 발현을 활성화시키거나 억제하는데 이용될 수 있다. 추가적으로, 발현이 억제되거나 제거될 때, 관련된 효소, 단백질 또는 RNA에 대한 유전자는 공지된 결실 기술에 의해 제거될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 범위 내에 임의의 효모는 발현되거나, 과다발현되거나, 또는 억제되는 특정 효소에 특이적인 선별 기술에 의해 확인될 수 있다. 원하는 표현형을 갖는 균주를 확인하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이런 방법에는 제한 없이, PCR, RT-PCR, 그리고 핵산 혼성화 기술, 예를 들면, 노던과 서던 분석, 특정 기질 상에서 또는 특정 기질, 화학적 화합물, 선별 작용제 등의 존재에서 변경된 성장 능력이 포함된다. 일부 경우에, 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 검출함으로써 세포가 특정 핵산을 내포하는 지를 결정하는데 면역조직화학 및 생화학적 기술이 이용될 수 있다. 가령, 인코딩된 효소에 대한 특이성 (specificity)을 갖는 항체가 특정 효모 세포가 상기 인코딩된 효소를 내포하는 지의 여부를 결정하는데 이용될 수 있다. 더 나아가, 효소적 폴리펩티드의 발현의 결과로써 생산된 산물을 검출함으로써 세포가 효소적 폴리펩티드를 인코딩하는 특정 핵산 분자를 내포하는 지를 결정하는데 생화학적 기술이 이용될 수 있다. 가령, 아세토락테이트 신타아제를 인코딩하는 벡터로 세포를 형질전환시키고, 그리고 벡터가 없는 세포와 비교하여 증가된 아세토락테이트 농도를 검출하는 것은 상기 벡터가 존재할 뿐만 아니라 유전자 산물이 활동성이라는 것을 지시한다. 특정한 효소적 활성 또는 특정 산물의 존재를 검출하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 가령, 아세토락테이트의 존재는 Hugenholtz and Starrenburg, 1992, Appl. Micro. Biot . 38:17-22에서 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
효소적 활성의 증가
본 발명의 효모 미생물은 효소의 증가된 활성 (가령, 이소부탄올 생산 대사 경로에 관여하는 효소의 증가된 활성)을 갖도록 더욱 조작될 수 있다. 특정 효소적 활성과 관련하여 본 명세서에서 용어 "증가된"은 동일한 종의 동등한 효모 세포에서 측정된 것보다 더욱 높은 수준의 효소적 활성을 지칭한다. 가령, 특정 효소의 과다발현은 상기 효소에 대한 세포 내에서 활성의 증가된 수준을 유발할 수 있다. 해당 또는 이소부탄올 경로에 관련된 효소에 대한 증가된 활성은 이소부탄올의 증가된 생산성과 수율을 유발할 것이다.
효소적 활성을 증가시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이런 기술에는 증가된 사본 수 및/또는 강한 프로모터의 이용, 효소의 음성 조절을 경감시키는 돌연변이의 도입, 기질에 대한 비활성을 증가시키고 및/또는 Km을 감소시키는 특정한 돌연변이의 도입에 의한, 또는 방향적 진화에 의한 효소의 발현 증가가 포함될 수 있다 (참조: Methods in Molecular Biology (vol. 231), ed. Arnold and Georgiou, Humana Press (2003)).
고수율 발효를 위해 재조합 미생물을 이용하는 방법
유익한 대사산물을 가장 경제적으로 생산하기 위한 생체촉매 (biocatalyst)의 경우에, 상기 대사산물을 높은 수율에서 생산하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 생산된 유일한 산물은 원하는 대사산물인데, 그 이유는 여분의 산물 (즉, 부산물)이 특히 이들 여분의 산물이 거의 또는 전혀 가치가 없는 경우에, 원하는 대사산물의 수율 감소 및 자본과 경상비 (operating cost)의 증가를 유발하기 때문이다. 이들 여분의 산물은 또한, 이들 산물을 원하는 대사산물로부터 분리하기 위해, 추가의 자본과 경상비를 필요로 한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물로부터 유래된 유익한 대사산물을 생산하는 방법을 제시한다.
한 구체예에서, 상기 방법은 유익한 대사산물의 회수가능한 양이 생산될 때까지 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 3-케토산을 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계, 그리고 선택적으로, 대사산물을 회수하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이다. 예시적인 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 유익한 대사산물은 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 그리고 조효소 A의 생산을 위한 생합성 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 아세토락테이트를 중간물질로서 이용하는 임의의 생합성 경로로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 유익한 대사산물은 이소부탄올이다. 다른 구체예에서, 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이다. 예시적인 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 유익한 대사산물은 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생산을 위한 생합성 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 중간물질로서 이용하는 임의의 생합성 경로로부터 유래될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 유익한 대사산물의 회수가능한 양이 생산될 때까지 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계, 그리고 선택적으로, 대사산물을 회수하는 단계를 포함한다. 예시적인 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 유익한 대사산물은 이소부탄올, 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-프로판올, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생산을 위한 생합성 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 알데히드를 중간물질로서 이용하는 임의의 생합성 경로로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 유익한 대사산물은 이소부탄올이다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 유익한 대사산물의 회수가능한 양이 생산될 때까지 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 아세토락테이트와 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계, 그리고 선택적으로, 대사산물을 회수하는 단계를 포함한다. 예시적인 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 (i) 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되고, 그리고 (ii) 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 유익한 대사산물은 이소부탄올, 1-부탄올, 그리고 3-메틸-1-부탄올의 생산을 위한 생합성 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 아세토락테이트와 알데히드를 중간물질로서 이용하는 임의의 생합성 경로로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 유익한 대사산물은 이소부탄올이다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 유익한 대사산물의 회수가능한 양이 생산될 때까지 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 2-아세토-2-히드록시부티레이트와 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계, 그리고 선택적으로, 대사산물을 회수하는 단계를 포함한다. 예시적인 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 (i) 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되고, 그리고 (ii) 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작된다. 유익한 대사산물은 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생산을 위한 생합성 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 2-아세토-2-히드록시부티레이트와 알데히드를 중간물질로서 이용하는 임의의 생합성 경로로부터 유래될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 알코올 탈수소효소 (ADH)-요구 생합성 경로로부터 유래된 유익한 대사산물을 생산하는 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 유익한 대사산물의 회수가능한 양이 생산될 때까지 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 본 명세서에서 기술된 변형된 ADH를 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계, 그리고 선택적으로, 대사산물을 회수하는 단계를 포함한다. 유익한 대사산물은 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 1-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 그리고 3-메틸-1-부탄올의 생산을 위한 생합성 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 임의의 ADH-요구 생합성 경로로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 유익한 대사산물은 이소부탄올이다.
탄소 공급원으로부터 유익한 대사산물을 생산하는 방법에서, 효모 미생물은 탄소 공급원을 내포하는 적절한 배양 배지에서 배양된다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 배양 배지로부터 유익한 대사산물을 단리하는 단계를 더욱 포함한다. 가령, 이소부탄올은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 증류 (distillation), 투석증발 (pervaporation), 또는 액체-액체 추출에 의해 배양 배지로부터 단리될 수 있다.
한 구체예에서, 재조합 미생물은 탄소 공급원으로부터 유익한 대사산물을 적어도 5 퍼센트의 이론적 수율로 생산할 수 있다. 다른 구체예에서, 미생물은 탄소 공급원으로부터 유익한 대사산물을 적어도 대략 10 퍼센트, 적어도 대략 15 퍼센트, 적어도 대략 20 퍼센트, 적어도 대략 25 퍼센트, 적어도 대략 30 퍼센트, 적어도 대략 35 퍼센트, 적어도 대략 40 퍼센트, 적어도 대략 45 퍼센트, 적어도 대략 50 퍼센트, 적어도 대략 55 퍼센트, 적어도 대략 60 퍼센트, 적어도 대략 65 퍼센트, 적어도 대략 70 퍼센트, 적어도 대략 75 퍼센트, 적어도 대략 80 퍼센트, 적어도 대략 85 퍼센트, 적어도 대략 90 퍼센트, 적어도 대략 95 퍼센트, 또는 적어도 대략 97.5%의 이론적 수율로 생산할 수 있다. 특정 구체예에서, 유익한 대사산물은 이소부탄올이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 예시되고, 이들 실시예는 한정으로서 간주되지 않는다. 도면과 서열 목록뿐만 아니라 본 출원 전반에서 인용된 모든 참고문헌, 특허, 그리고 공개된 특허 출원의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명의 예시적인 구체예가 하기 도면에서 도시된다:
도 1에서는 이소부탄올 경로의 예시적인 구체예를 도시한다.
도 2에서는 3-케토산 환원효소에 의해 촉진될 수 있는 예시적인 반응을 도시한다.
도 3에서는 예시적인 3-케토산 환원효소의 무제한적 목록 및 이들의 상응하는 효소 분류 번호를 도시한다.
도 4에서는 알데히드 탈수소효소에 의해 촉진될 수 있는 예시적인 반응을 도시한다.
도 5에서는 이소부탄올-생산 재조합 미생물에서 DH2MB와 이소부티레이트의 생산을 감소시키기 위한 전략을 도시한다.
도 6에서는 3-메틸-1-부탄올-생산 재조합 미생물에서 DH2MB와 3-메틸-1-부티레이트의 생산을 감소시키기 위한 전략을 도시한다.
도 7에서는 2-메틸-1-부탄올 생산 재조합 미생물에서 2-에틸-2,3-디히드록시부티레이트와 2-메틸-1-부티레이트의 생산을 감소시키기 위한 전략을 도시한다.
도 8에서는 DH2MB와 아세테이트를 내포하는 샘플 (위쪽) 및 아세테이트와 DHIV를 내포하는 샘플 (아래쪽)을 보여주는 LC4 크로마토그램의 중첩 오버레이 (stacked overlay)를 도시한다. 용출 순서: DH2MB, 그 이후에 아세테이트 (위쪽); 락테이트, 아세테이트, DHIV, 이소부티레이트, 피루베이트 (아래쪽).
도 9에서는 LC1 상에서 수집된 DHIV에 상응하는 체류 시간에서 수집되고, 그리고 전도도 검출 (Conductivity Detection)과 함께 AS-11 칼럼 상에서 LC4에 의해 분석된 샘플 분획에 대한 크로마토그램을 도시한다.
도 10에서는 LC1로부터 분리된 피크의 1H-COSY 스펙트럼을 도시한다. 상기 스펙트럼은 0.95 ppm에서 DH2MB 메틸 양성자 (이중항)가 3.7 ppm에서 메틴 양성자 (사중항)에 결합된다는 것을 지시한다.
도 11에서는 LC1로부터 분리된 피크의 1H-NMR 스펙트럼을 도시한다. 상기 스펙트럼은 DH2MB의 존재를 지시한다: 적분 값 3을 갖는 1.2 ppm에서 메틸 양성자 (a)의 단일항, 적분 값 3을 갖는 0.95 ppm에서 메틸 양성자 (b)의 이중항, 그리고 적분 값 1.84를 갖는 3.7 ppm에서 메틴 양성자 (c)의 사중항. 메틴 양성자 (c)의 적분 값은 동일한 영역 내에서 글루코오스 공명과의 겹침으로 인하여 1보다 크다.
도 12에서는 LC1로부터 분리된 피크의 LC-MS 분석을 도시한다. 여러 분자 이온이 상기 도면의 위쪽 부분에서 지시된 바와 같이, 샘플 내에서 확인되었다. 134 분자 이온의 더욱 단편화 (MS2)는 분리된 LC1 분획이 CO2 (*) 및 H2O + CO2 (**)의 특징적인 상실에 의해 히드록실 카르복실산을 내포한다는 것을 지시하였다.
도 13에서는 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (2R,3S)-1a, (2S,3R)-1b, (2R,3R)-2a, (2S,3S)-2b의 부분입체이성질성 및 거울상이성질성 구조를 도시한다.
도 14에서는 D2O에서 결정화된 DH2MB의 1H 스펙트럼을 도시한다. 1H NMR (TSP) 1.1 (d, 6.5 Hz, 3H), 1.3 (s, 3H), 3.9 (q, 6.5 Hz, 3H)
도 15에서는 D2O에서 결정화된 DH2MB의 13C 스펙트럼을 도시한다. 상기 스펙트럼은 5가지 상이한 탄소 공명을 지시하는데, 이들 중에서 하나는 181 ppm에서 특징적인 카르복실산 공명이다.
도 16에서는 GEVO3160으로 단일 발효로부터 이소부탄올과 부산물의 발효 프로필을 도시한다. 생산 통기 (production aeration)는 접종후 93시간 시점에 0.8 mM/h의 OTR에서 0.3 mM/h로 감소하였다. 열린 다이아몬드 = iBuOH, 정사각형 = DH2MB로서 정량된 미지의 것, 별표 = 세포 건조 중량 (cdw), 그리고 닫힌 삼각형 = 총부산물.
도 17에서는 지오바실루스 스테아로써모필루스(G. stearothermophilus) (Pymol)의 구조를 갖는 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA 아미노산 서열의 구조적 배열을 도시한다. 활성 부위 돌연변이가 도시된다 (Y50F와 L264V). 보조인자 결합 도메인에서 돌연변이 역시 도시된다 (I212T와 N219Y).
도 18에서는 아세토락테이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 도시한다. 1-부탄올, 이소부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 그리고 4-메틸-1-펜탄올의 생산을 위한 생합성 경로는 아세토락테이트와 알데히드 둘 모두를 중간물질로서 이용한다.
도 19에서는 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 도시한다. 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생산을 위한 생합성 경로는 2-아세토-2-히드록시부티레이트와 알데히드 둘 모두를 중간물질로서 이용한다.
도 20에서는 알데히드를 중간물질로서 이용하는 추가의 생합성 경로를 도시한다.
실시예
실시예 1-26에 대한 일반적인 방법
서열: 본 명세서에서 개시된 아미노산과 뉴클레오티드 서열은 표 6에서 제시된다.
Figure pct00001
배지: 이용된 배지는 표준 효모 배지 (참조: Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3rd ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 그리고 Guthrie, C. and Fink, G.R. eds. Methods in Enzymology Part B: Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology 350:3-623 (2002)). YP 배지는 1% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 펩톤을 내포한다. YPD는 달리 명시되지 않으면 2% 글루코오스를 내포하는 YP이다. YPE는 25 ㎖/ℓ 에탄올을 내포하는 YP이다. SC 배지는 6.7 g/ℓ Difco™ 효모 질소 염기, 14g/ℓ Sigma™ 합성 드롭아웃 배지 보충물 (히스티딘, 트립토판, 우라실, 그리고 류신을 제외한 아미노산과 영양소 포함), 0.076 g/ℓ 히스티딘, 0.076 g/ℓ 트립토판, 0.380 g/ℓ 류신, 그리고 0.076 g/ℓ 우라실이다. SCD는 달리 명시되지 않으면, 2% (w/v) 글루코오스를 내포하는 SC이다. SC와 SCD 배지의 드롭아웃 이형은 히스티딘 (-H), 트립토판 (-W), 류신 (-L), 또는 우라실 (-U) 중에서 하나 또는 그 이상을 생략함으로써 만들어진다. 앞서 기술된 배지의 고형 이형은 2% (w/v) 아가를 내포한다.
클로닝 기술: 달리 명시되지 않으면, 클로닝 및 플라스미드 작제를 위한 표준 분자 생물학 방법이 일반적으로 이용되었다 (Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). 클로닝 기술에는 제한 효소로 절단, DNA 단편을 산출하기 위한 PCR (KOD Hot Start 중합효소, Cat# 71086, Merck, Darmstadt, Germany), DNA 결찰 키트 (Mighty Mix Cat# TAK 6023, Clontech Laboratories, Madison, WI)를 이용한 2개 DNA 단편의 결찰, 그리고 적격성 대장균(E. coli) 세포 내로 세균 형질전환 (Xtreme Efficiency DH5a 적격 세포, Cat# ABP-CE-CC02096P, Allele Biotechnology, San Diego, CA)이 포함되었다. 플라스미드 DNA는 Qiagen QIAprep Spin Miniprep 키트 (Cat# 27106, Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 대장균(E. coli) 세포로부터 정제되었다. DNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Zymoclean Gel DNA Recovery 키트 (Zymo Research, Orange, CA; Catalog #D4002)를 이용하여 아가로오스 겔로부터 정제되었다.
집락 PCR: 효모 집락 PCR은 제조업체의 프로토콜에 따라, FailSafe™ PCR System (EPICENTRE? Biotechnologies, Madison, WI; Catalog #FS99250)을 이용하였다. 15 ㎕의 Master Mix E 완충액, 10.5 ㎕ 물, 10 μM 농도에서 2 ㎕의 각 프라이머, 키트로부터 0.5 ㎕ 중합효소 효소 혼합물을 내포하는 PCR 칵테일이 각 샘플 (각각 30 ㎕)에 대한 0.2 ㎖ PCR 튜브에 첨가되었다. 각 후보에서, 소량의 세포가 무균 피펫 팁 (sterile pipette tip)을 이용하여 반응 튜브에 첨가되었다. 양성 PCR 산물의 존재는 아가로오스 겔 전기영동을 이용하여 평가되었다.
SOE PCR: PCR 반응물은 하기 PCR 조건을 이용하여 유전자증폭기에서 배양되었다: 94℃ x 2 min의 1회 사이클, 94℃ x 30 s, 53℃ x 30 s, 72℃ x 2 min의 35회 사이클, 그리고 72℃ x 10 min의 1회 사이클. 각 반응물이 하기를 내포하도록 마스터 혼합물 (master mix)이 만들어졌다: 3 ㎕ MgSO4 (25 mM), 5 ㎕ 10X KOD 완충액, 5 ㎕ 50% DMSO, 5 ㎕ dNTP 혼합물 (각각 2 mM), 1 ㎕ KOD, 28 ㎕ dH2O, 1.5 ㎕ 전방 프라이머 (10 μM), 1.5 ㎕ 후방 프라이머 (10 μM), 0.5 ㎕ 주형 (플라스미드 또는 유전체 DNA).
유전체 DNA 단리: Zymo Research ZR 진균/세균 DNA 키트 (Zymo Research Orange, CA; Catalog #D6005)가 하기와 같이 변형된 제조업체의 프로토콜에 따라, 유전체 DNA 단리에 이용되었다. 펠릿의 재현탁후, 200 ㎕가 2개의 분리된 ZR BashingBead™ 용해 튜브 (수율을 극대화시키기 위해)로 이전되었다. 비드 비팅 (bead beating)에 의한 용해 (lysis)후, 각각의 ZR BashingBead™ 용해 튜브로부터 400 ㎕의 상층액이 2개의 분리된 Zymo-Spin™ IV 스핀 필터로 이전되고 7,000 rpm에서 1분 동안 원심분리되었다. 회전후, 1.2 ㎖의 진균/세균 DNA 결합 완충액이 각 여과액에 첨가되었다. 800 ㎕ 분취량에서, 양쪽 필터로부터 여과액은 수집 튜브 내에 단일 Zymo-Spin™ IIC 칼럼으로 이전되고 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리되었다. 용출 단계의 경우에, 100 ㎕의 EB (용출 완충액, Qiagen)에서 용리하는 대신에, 50 ㎕의 EB가 첨가되고, 1분 동안 배양되고, 그 이후 이들 칼럼은 1분 동안 원심분리되었다. 이러한 용출 단계는 100 ㎕의 최종 용출 부피를 위해 반복되었다.
사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae ) 형질전환. 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주는 1% 에탄올을 내포하는 YPD에서 성장되었다. 형질전환-적격 세포는 100 mM 리튬 아세테이트에서 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 세포의 재현탁에 의해 제조되었다. 일단 세포가 준비되면, DNA (무균수로 15 ㎕의 최종 부피), 72 ㎕ 50% PEG, 10 ㎕ 1M 리튬 아세테이트, 그리고 3 ㎕의 변성된 연어 정액 DNA (10 mg/㎖)의 혼합물이 각 형질전환을 위해 만들어졌다. 1.5 ㎖ 튜브에서, 15 ㎕의 세포 현탁액이 DNA 혼합물 (100 ㎕)에 첨가되고, 그리고 형질전환 현탁액이 5회 짧은 펄스 (short pulse) 동안 와동되었다. 형질전환체는 30℃에서 30분 동안 배양되고, 그 이후에 42℃에서 22분 동안 배양되었다. 세포는 원심분리 (18,000 x g, 10 s, 25℃)에 의해 수집되었다. 세포는 350 ㎕ YPD에서 재현탁되고, 그리고 30℃에서 250 rpm으로 하룻밤 회복 교반 (recovery shaking)후, 세포는 0.2 g/ℓ G418 선택성 평판을 내포하는 YPD 평판 위에 전개되었다. 이후, 형질전환체는 G418 선택성 평판 상에 단일 집락 정제되었다.
클루이베로미세스 막시아누스( K. marxianus ) 형질전환: 클루이베로미세스 막시아누스(K. marxianus) 균주는 3 ㎖의 적절한 배양 배지에서 250 rpm과 30℃에서 하룻밤동안 성장되었다. 익일에, 배양액은 50 ㎖의 동일한 배지에서 희석되고 1 내지 4의 OD600으로 성장되었다. 세포는 원심분리 (실온에서 1600 x g, 5분)에 의해 무균 50 ㎖ 코니칼 튜브에서 수집되었다. 세포는 10 ㎖의 전기천공 완충액 (10 mM Tris-C1, 270 mM 수크로오스, 1 mM MgCl2, pH 7.5)에서 재현탁되고, 그리고 1600 x g에서 실온에서 5분 동안 수집되었다. 세포는 10 ㎖ IB (YPE, 25 mM DTT, 20 mM HEPES, pH 8.0; 100 ㎕의 2.5 M DTT 및 200 ㎕의 1 M HEPES, pH 8.0을 10 ㎖의 YPD로 희석함으로써 새로 만들어짐)에서 재현탁되었다. 세포는 250 rpm, 30℃에서 30분 동안 배양되었다 (튜브는 수직으로 놓임). 세포는 실온에서 5분 동안 1600 x g으로 수집되고 10 ㎖의 차가운 전기천공 완충액에 재현탁되었다. 세포는 4℃에서 5분 동안 1600 x g로 펠릿화 (pelleting)되었다. 세포는 1 ㎖의 차가운 전기천공 완충액에 재현탁되고 마이크로퓨지 튜브 (microfuge tube)로 이전되었다. 세포는 4℃에서 20 sec동안 >10,000 x g로 원심분리에 의해 수집되었다. 세포는 30-38 OD600/㎖의 최종 바이오매스 농도를 위해 적절한 양의 차가운 전기천공 완충액에서 재현탁되었다. 400 ㎕의 세포가 차가운 전기천공 큐벳 (0.4 cm 갭)에 첨가되고, 50 ㎕의 SOE PCR 산물 (또는 물 대조)이 첨가되고 위아래로 피펫팅 (pipetting)에 의해 혼합되고, 그리고 큐벳은 얼음 위에서 30분 동안 배양되었다. 샘플은 1.8 kV, 1000 Ohm, 25 μF에서 전기천공되었다. 샘플은 이후, 1 ㎖의 적절한 배양 배지를 포함하는 50 ㎖ 튜브로 이전되고, 그리고 이들 샘플은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 배양후, 세포는 적절한 아가 평판 상에 도말되었다.
클루이베로미세스 락티스( K. lactis ) 형질전환: 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) 균주는 3 ㎖ YPD에서 250 rpm과 30℃에서 하룻밤동안 성장되었다. 익일에, 배양액은 50 ㎖ YPD에서 희석되고, 그리고 ~0.8의 OD600에 도달할 때까지 성장되었다. 50 ㎖ YPD 배양액으로부터 세포는 원심분리 (2700 rcf, 2분, 25℃)에 의해 수집되었다. 세포는 50 ㎖ 무균수로 세척되고 RT에서 2분 동안 2700 rcf로 원심분리에 의해 수집되었다. 세포는 25 ㎖ 무균수로 다시 한 번 세척되고 RT에서 2분 동안 2700 rcf로 원심분리에 의해 수집되었다. 세포는 1 ㎖ 100 mM 리튬 아세테이트에서 재현탁되고 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브 (Eppendorf tube)로 이전되었다. 세포는 RT에서 10 sec동안 18,000 rcf로 원심분리에 의해 수집되었다. 세포는 세포 펠릿의 부피의 대략 4x인 부피의 100 mM 리튬 아세테이트에서 재현탁되었다. 10-15 ㎕ 부피의 DNA, 72 ㎕ 50% PEG (3350), 10 ㎕ 1 M 리튬 아세테이트, 3 ㎕ 변성된 연어 정액 DNA, 그리고 무균수가 각 형질전환을 위한 100 ㎕의 최종 부피로 합동되었다. 1.5 ㎖ 튜브에서, 15 ㎕의 세포 현탁액이 DNA 혼합물에 첨가되고, 그리고 형질전환 현탁액은 5회 짧은 펄스로 와동되었다. 형질전환체는 30℃에서 30분 동안 배양되고, 그 이후에 42℃에서 22분 동안 배양되었다. 세포는 RT에서 10 sec동안 18,000 rcf로 원심분리에 의해 수집되었다. 세포는 400 ㎕의 적절한 배지에서 재현탁되고 형질전환된 세포를 선별하기 위해 적절한 배지를 내포하는 아가 평판 위에 전개되었다.
분석 화학:
가스 크로마토그래피 (방법 GC1). 에탄올과 이소부탄올을 비롯한 휘발성 유기 화합물의 분석은 불꽃 이온화 검출기 (flame ionization detector, FID)에 연결된 Agilent 7673 오토샘플러, ZB-FFAP 칼럼 (J&W; 30 m 길이, 0.32 mm ID, 0.25 μM 필름 두께) 또는 등가물이 구비된 Agilent 5890/6890/7890 가스 크로마토그래프 상에서 수행되었다. 온도 프로그램은 아래와 같았다: 주입기의 경우 200℃, 검출기의 경우 300℃, 1분 동안 100℃ 오븐, 230℃까지 70℃/분 구배, 이후 2.5분 동안 유지. 분석은 인증된 표준 (>99%, Sigma-Aldrich로부터 획득됨), 그리고 1-펜탄올을 내부 표준으로 하는 5-포인트 보정 곡선 (calibration curve)을 이용하여 수행되었다.
고성능 액체 크로마토그래피 (방법 LC1): 2,3-디히드록시이소발레레이트 (DHIV), 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB), 이소부티레이트와 글루코오스를 비롯한 유기 산 대사산물의 분석은 Bio-Rad Micro-guard Cation H 카트리지와 2개의 Phenomenex Rezex RFQ-Fast Fruit H+ (8%), 연속적으로 100 x 7.8-mm 칼럼, 또는 등가물이 구비된 Agilent 1200 또는 등가의 고성능 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 수행되었다. 유기 산 대사산물은 Agilent 1100 또는 동등한 UV 검출기 (210 nm) 및 굴절률 검출기 (refractive index detector)를 이용하여 검출되었다. 칼럼 온도는 60℃이었다. 이러한 방법은 이동상 (mobile phase)으로서 Milli-Q 물에서 0.0180 N H2SO4와 등용매성이었다. 유속은 1.1 ㎖/min으로 설정되었다. 주입 부피는 20 ㎕이고, 그리고 작업 시간 (run time)은 16분이었다. 유기 산 대사산물의 정량은 Cioffi et al. (Cioffi, E. et al. Anal Biochem 1980, 104, pp.485)에 따라 합성된 DHIV (2,3-디히드록시-3-메틸-부타노에이트, CAS 1756-18-9), 그리고 DHIV와 DH2MB가 동일한 반응률 (response factor)을 나타낸다는 가정에 기초하여 정량된 DH2MB를 제외하고, 인증된 표준 (>99% 또는 가능한 최대 순도)으로 5-포인트 보정 곡선을 이용하여 수행되었다. 이러한 방법에서, DHIV와 DH2MB는 공동-용리하는데, 그 이유는 그들의 농도가 이들 두 농도의 합인 것으로 보고되기 때문이다.
고성능 액체 크로마토그래피 (방법 LC4): 2,3-디히드록시이소발레레이트 (DHIV, CAS 1756-18-9), 2,3-디히드록시-2-메틸부티르산 (DH2MB), 락테이트, 아세테이트, 아세토락테이트, 이소부티레이트, 그리고 피루베이트)를 비롯한 옥소 산 (oxo acid)의 분석은 IonPac AG11-HC 가드 칼럼 (Dionex: 13 μm, 4.6 x 50 mm) 및 IonPac ATC-3 음이온 트랩 칼럼 (Dionex: 9 x 24 mm)과 결합된 IonPac AS11-HC 분석 칼럼 (Dionex: 9 μm, 4.6 x 250 mm)이 구비된 Agilent-1100 고성능 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 수행되었다. 아세토락테이트는 225nm에서 UV 검출기를 이용하여 검출되고, 반면 모든 다른 분석물은 전도도 검출기 (AutoSuppression 리사이클 양식에서 ASRS 4 mm를 갖는 ED50-억제 전도도, 200 mA 억제자 전류 (suppressor current))를 이용하여 검출되었다. 칼럼 온도는 35℃이었다. 주입 크기는 10 ㎕이었다. 상기 방법은 하기 용출 프로필을 이용하였다: 3분 동안 0.25 mM NaOH, 그 이후에 22분 동안 0.25에서 5 mM NaOH로 선형 구배 (linear gradient) 및 0.1분 동안 5 mM에서 38.25 mM로 2차 선형 구배, 그 이후에 4.9분 동안 38.25 mM NaOH 및 7분 동안 0.25 mM NaOH에서 재-평형화 (re-equilibrating)에 앞서 0.1분 동안 38.25 mM에서 0.25 mM로 최종 선형 구배. 유속은 2 ㎖/min으로 설정되었다. 분석은 하기를 제외하고, 인증된 표준 (>99%, 또는 가능한 최대 순도)으로 4-포인트 보정 곡선을 이용하여 수행되었다: DHIV는 Cioffi et al. (Cioffi, E. et al. Anal Biochem 1980, 104, pp.485)에 따라 합성되었다. DH2MB는 실시예 8에 기술된 바와 같이 합성되고 DHIV와 DH2MB가 동일한 반응률을 나타낸다는 가정에 기초하여 정량되었다. 라세미 아세토락테이트는 NaOH로 에틸-2-아세톡시-2-메틸아세토아세테이트 (EAMMA)의 가수분해에 의해 만들어졌다 (Krampitz, L.O. Methods in Enzymology 1957 , 3, 277-283.). 이러한 방법에서, DHIV와 DH2MB는 분리된다 (도 8).
효소 검사법
단백질 농도의 결정: 단백질 농도 (효모 용해물 또는 정제된 단백질의)는 BioRad Bradford 단백질 검사 시약 키트 (Cat# 500-0006, BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하고, 그리고 표준 곡선 (standard curve)의 경우에 BSA를 이용하여 결정되었다. 이러한 검사법에 대한 표준 곡선은 500 ㎍/㎖ BSA의 표준 단백질 스톡 (stock)의 연속 희석도를 이용하여 작성되었다. BioRad 단백질 표준 곡선의 선형 범위 (linear range) 내에 속하는 각 용해물의 OD595 치수를 획득하기 위해 세포 용해물의 적절한 희석액이 물에서 만들어졌다. 10 ㎕의 용해물 희석액이 500 ㎕의 희석된 BioRad 단백질 검사 염료에 첨가되고, 샘플은 와동에 의해 혼합되고, 그리고 실온에서 6분 동안 배양되었다. 샘플은 큐벳으로 이전되고 분광광도계에서 595 nm에서 판독되었다. 이들 표준의 선형 회귀 (linear regression)는 각 샘플의 단백질 농도를 계산하는데 이용되었다.
알코올 탈수소효소 (ADH) 검사법. 세포는 얼음 위에서 해동되고 용해 완충액 (100 mM Tris-HCl pH 7.5)에서 재현탁되었다. 1000 ㎕의 유리 비드 (glass bead) (0.5 mm 직경)가 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 첨가되고 875 ㎕의 세포 현탁액이 첨가되었다. 효모 세포는 Retsch MM301 믹서 밀 (mixer mill) (Retsch Inc. Newtown, PA)을 이용하여 용해되고, 각각 전속에서 6 X 1분 혼합되고, 각 비드-비팅 단계 간에 얼음 위에서 1분 배양되었다. 이들 튜브는 4℃에서 10분 동안 23,500xg로 원심분리되고, 그리고 상층액은 이용을 위해 이동되었다. 이들 용해물은 검사 때까지 얼음 위에 유지되었다. 효모 용해물 단백질 농도는 앞서 기술된 바와 같이 결정되었다.
샘플의 희석액은 활성 판독 (activity reading)이 달성될 수 있도록 만들어졌다. 일반적으로, 낮은 ADH 활성을 갖는 것으로 예상되는 균주로부터 샘플은 용해 완충액 (100 mM Tris-HCl pH 7.5)에서 1:5 희석되고, 그리고 높은 ADH 활성을 갖는 것으로 예상되는 균주, 예를 들면, ADH 유전자가 높은 사본 수 플라스미드로부터 발현되는 균주로부터 샘플은 1:40 내지 1:100 희석되었다. 반응은 SpectraMax? 340PC 멀티-평판 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 내에 96-웰 평판에서 90 ㎕의 반응 완충액 (100 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 μM NADH; 11 mM 이소부티르알데히드)로 10 ㎕의 적절하게 희석된 세포 추출물을 이용하여 삼중으로 수행되었다. 반응은 340nm에서 5분 동안 추적되고, 흡광도가 10초마다 판독되었다. 반응은 30℃에서 수행되었다. 반응은 완전한 완충액 및 기질이 없는 완충액에서 수행되었다.
이소부티르알데히드 산화 검사법 (ALD6 검사법): 세포 펠릿은 얼음 위에서 해동되고 용해 완충액 (10 mM 인산나트륨 pH7.0, 1 mM 디티오트레이톨, 5% w/v 글리세롤)에서 재현탁되었다. 1 ㎖의 유리 비드 (0.5 mm 직경)가 각 샘플에 대한 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 첨가되고 850 ㎕의 세포 현탁액이 첨가되었다. 효모 세포는 Retsch MM301 믹서 밀 (mixer mill) (Retsch Inc. Newtown, PA)을 이용하여 용해되고, 각각 전속에서 6 X 1분 혼합되고, 그 사이에 얼음 위에서 1분 배양되었다. 이들 튜브는 4℃에서 10분 동안 21,500xg로 원심분리되고, 그리고 상층액은 새로운 튜브로 이전되었다. 추출물은 검사 때까지 얼음 위에 유지되었다. 효모 용해물 단백질 농도는 앞서 기술된 바와 같이 결정되었다.
세포 용해물에서 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 산화를 촉진하는 효소의 효소 활성을 측정하는데 이용되는 방법은 Meaden et al. 1997, Yeast 13: 1319-1327 및 Postma et al. 1988, Appl. Environ. Microbiol. 55: 468-477로부터 변경되었다. 간단히 말하면, 각 샘플에서, 10 ㎕의 희석되지 않은 세포 용해물이 UV 마이크로역가 평판의 6개 웰에 첨가되었다. 3개 웰은 50 mM HEPES-NaOH (pH 7.5), 0.4 mM NADP+, 3.75 mM MgCl2, 그리고 0.1 mM, 1 mM, 또는 10 mM 이소부티르알데히드를 내포하는 90 ㎕ 검사 완충액이 제공되었다. 나머지 3개 웰은 90 ㎕의 기질 없음 완충액 (이소부티르알데히드가 없는 점을 제외하고 검사 완충액과 동일)이 제공되었다. 이들 완충액은 위아래로 피펫팅에 의해 웰 내에서 용해물과 혼합되었다. 이후, 반응이 340 nm에서 5분 동안 모니터링되고, 흡광도가 SpectraMax? 340PC 평판 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 10초마다 판독되었다. 반응은 30℃에서 수행되었다. 각 샘플에 대한 Vmax는 기질 없음 대조의 배경 시도 (background reading)를 뺄셈함으로써 측정되었다. 용해물 없음 대조 역시 각 기질 농도에 대해 삼중으로 수행되었다.
ALS 검사법: 실시예 1-18에서 기술된 ALS 검사법의 경우에, 세포는 얼음 위에서 해동되고 용해 완충액 (50 mM 인산칼륨 완충액 pH 6.0 및 1 mM MgSO4)에서 재현탁되었다. 1000 ㎕의 유리 비드 (glass bead) (0.5 mm 직경)가 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 첨가되고 875 ㎕의 세포 현탁액이 첨가되었다. 효모 세포는 Retsch MM301 믹서 밀 (mixer mill) (Retsch Inc. Newtown, PA)을 이용하여 용해되고, 각각 전속에서 6 X 1분 혼합되고, 각 비드-비팅 단계 간에 얼음 위에서 1분 배양되었다. 이들 튜브는 4℃에서 10분 동안 23,500xg로 원심분리되고, 그리고 상층액은 이용을 위해 이동되었다. 이들 용해물은 검사 때까지 얼음 위에 유지되었다. 용해물의 단백질 함량은 앞서 기술된 바와 같이 결정되었다. 모든 ALS 검사는 기질과 함께 및 기질 없이, 각 용해물에 대해 삼중으로 수행되었다. 각 용해물을 검사하기 위해, 15 ㎕의 용해물이 135 ㎕의 완충액 (50 mM 인산칼륨 완충액 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM 티아민-피로포스페이트, 110 mM 피루베이트)과 혼합되고, 그리고 30℃에서 15분 동안 배양되었다. 완충액은 실온에서 제조되었다. 기질 없음 대조 (피루베이트가 없는 완충액) 및 용해물 없음 대조 (용해물 대신에 용해 완충액) 역시 포함되었다. 배양후, 21.5 ㎕의 35% H2SO4가 각 반응물에 첨가되고 37℃에서 1시간 동안 배양되었다.
실시예 19-25에서 기술된 ALS 검사의 경우에, 세포는 얼음 위에서 해동되고 용해 완충액 (100 mM NaPO4 pH 7.0, 5 mM MgCl2 및 1 mM DTT)에서 재현탁되었다. 1 ㎖의 유리 비드 (0.5 mm 직경)가 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 첨가되고 800 ㎕의 세포 현탁액이 유리 비드를 내포하는 튜브에 첨가되었다. 효모 세포는 각각 30회 사이클/초(second)에서 1분 동안 6회 혼합 및 혼합 간에 1분 결빙 (icing)에 의해, Retsch MM301 믹서 밀 (mixer mill) (Retsch Inc. Newtown, PA) 및 냉각 블록 (cooling block)을 이용하여 용해되었다. 이들 튜브는 4℃에서 10분 동안 21,500xg로 원심분리되고, 그리고 상층액이 이동되었다. 추출물은 검사 때까지 얼음 위에 유지되었다. 효모 용해물 단백질 농도는 앞서 기술된 바와 같이, BioRad Bradford 단백질 검사 시약 키트 (Cat# 500-0006, BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하고, 그리고 표준 곡선의 경우에 BSA를 이용하여 측정되었다. 모든 ALS 검사는 각 용해물에 대해 삼중으로 수행되었다. 모든 완충액, 용해물 및 반응 튜브는 얼음 위에서 미리 냉각되었다. 각 용해물을 검사하기 위해, 15 ㎕의 용해물 (필요에 따라 용해 완충액으로 희석됨)이 135 ㎕의 검사 완충액 (50 mM KPi, pH 7.0, 1 mM MgSO4, 1 mM 티아민-피로포스페이트, 110 mM 피루베이트)과 혼합되고, 그리고 30℃에서 15분 동안 배양되었다. 기질 없음 대조 (피루베이트가 없는 완충액) 및 용해물 없음 대조 (용해물 대신에 용해 완충액) 역시 포함되었다. 배양후, 각 반응물은 21.5 ㎕의 35% H2SO4와 혼합되고, 37℃에서 1시간 동안 배양되고, 그리고 임의의 불용성 침전물을 제거하기 위해 5분 동안 5,000 x g로 원심분리되었다.
모든 검사 샘플은 2개의 Restek RFQ 150 x 4.6 mm 칼럼이 일련으로 구비된 HP-1200 고성능 액체 크로마토그래피 시스템인 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 검사 기질 (피루베이트)과 산물 (아세토인)에 대해 분석되었다. 유기 산 대사산물은 HP-1100 UV 검출기 (210 nm) 및 굴절률을 이용하여 검출되었다. 칼럼 온도는 60℃이었다. 이러한 방법은 이동상으로서 0.0180 N H2SO4 (Milli-Q 물에서)와 등용매성이었다. 유속은 1.1 ㎖/min으로 설정되었다. 주입 부피는 20 ㎕이고, 그리고 작업 시간은 8분이었다. 분석은 인증된 표준 (>99%, Sigma-Aldrich로부터 획득됨) 및 5-포인트 보정 곡선을 이용하여 수행되었다.
TMA29 효소 검사법: 세포 펠릿은 얼음 위에서 해동되고 용해 완충액 (10 mM 인산나트륨 pH7.0, 1 mM 디티오트레이톨, 5% w/v 글리세롤)에서 재현탁되었다. 1 ㎖의 유리 비드 (0.5 mm 직경)가 각 샘플에 대한 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 첨가되고 850 ㎕의 세포 현탁액이 첨가되었다. 효모 세포는 Retsch MM301 믹서 밀 (mixer mill) (Retsch Inc. Newtown, PA)을 이용하여 용해되고, 각각 전속에서 6 X 1분 혼합되고, 그 사이에 얼음 위에서 1분 배양되었다. 이들 튜브는 4℃에서 10분 동안 21,500xg로 원심분리되고, 그리고 상층액은 새로운 튜브로 이전되었다. 추출물은 검사 때까지 얼음 위에 유지되었다. 효모 용해물 단백질 농도는 앞서 기술된 바와 같이, BioRad Bradford 단백질 검사 시약 키트 (Cat# 500-0006, BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하고, 그리고 표준 곡선의 경우에 BSA를 이용하여 측정되었다.
(S)-2-아세토락테이트 ((S)-AL)의 효소적 합성은 혐기성 플라스크에서 수행되었다. 반응은 20 mM 인산칼륨 pH 7.0, 1 mM MgCl2, 0.05 mM 티아민 피로포스페이트 (TPP), 그리고 200 mM 나트륨 피루베이트를 내포하는 55 ㎖의 총 부피에서 수행되었다. 합성은 65 단위 (unit)의 정제된 바실루스 서브틸리스(B. subtilis) AlsS의 부가에 의해 시작되고, 그리고 반응물은 고정 배양기에서 30℃에서 7.5시간 동안 배양되었다.
라세미 2-아세토락테이트 ((R/S)-2-AL)의 화학적 합성은 50 ㎕의 에틸-2-아세톡시-2-메틸아세토아세테이트 (EAMMA)를 990 ㎕의 물과 혼합함으로써 수행되었다. 이후, 260 ㎕의 2 N NaOH가 각 첨가후 15초의 와동과 함께 10 ㎕ 증분 (increment)으로 첨가되었다. 그 다음, 용액은 오비탈 교반기 상에서 20분 동안 혼합되었다.
라세미 AHB ((R/S)-AHB)의 화학적 합성은 50 ㎕의 에틸-2-아세톡시-2-에틸-3-옥소부타노에이트를 990 ㎕의 물과 혼합함으로써 수행되었다. 이후, 2 N NaOH가 각 첨가후 15초의 와동과 함께 10 ㎕ 증분 (increment)으로 첨가되었다. NaOH는 용액의 pH가 12가 될 때까지 첨가되었다 (~180 ㎕의 2 N NaOH). 그 다음, 용액은 오비탈 교반기 상에서 20분 동안 혼합되었다.
(S)-AL, (R/S)-AL 또는 (R/S)-AHB 감소 활성의 결정을 위해, 10 ㎕의 희석되지 않은 세포 용해물이 UV 마이크로역가 평판의 6개 웰에 첨가되었다. 3개 웰은 100 mM KPO4 (pH 7.0), 150 μM NADPH, 그리고 5 mM (S)-AL 또는 10 mM (R/S)-AL 또는 10 mM (R/S)-AHB를 기질로서 내포하는 90 ㎕ 검사 완충액이 제공되었다. 나머지 3개 웰은 90 ㎕의 기질 없는 검사 완충액이 제공되었다. 이들 완충액은 위아래로 피펫팅에 의해 웰 내에서 용해물과 혼합되었다. 이후, 반응이 340 nm에서 모니터링되고, 흡광도가 SpectraMax? 340PC 평판 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 10초마다 판독되었다. 반응은 30℃에서 수행되었다. 각 샘플에 대한 (S)-AL, (R/S)-AL 또는 (R/S)-AHB 감소 활성은 기질 없음 대조의 배경 시도 (background reading)를 뺄셈함으로써 측정되었다. 용해물 없음 대조 역시 삼중으로 수행되었다.
DHAD 효소 검사법: 세포 펠릿은 얼음 위에서 해동되고 용해 완충액 (50 mM Tris pH 8.0, 5 mM MgSO4, 그리고 G Biosciences 효모/ 진균 ProteaseArrest™ (St. Louis, MO, USA, Catalog #788-333))에서 재현탁되었다. 1 ㎖의 유리 비드 (0.5 mm 직경)가 각 샘플에 대한 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 첨가되고 850 ㎕의 세포 현탁액이 첨가되었다. 효모 세포는 Retsch MM301 믹서 밀 (mixer mill) (Retsch Inc. Newtown, PA)을 이용하여 용해되고, 각각 전속에서 6 X 1분 혼합되고, 그 사이에 얼음 위에서 1분 배양되었다. 이들 튜브는 4℃에서 10분 동안 21,500xg로 원심분리되고, 그리고 상층액은 새로운 튜브로 이전되었다. 추출물은 검사 때까지 얼음 위에 유지되었다. 효모 용해물 단백질 농도는 앞서 기술된 바와 같이 결정되었다. 각 샘플로부터 단백질은 DHAD 검사 완충액 (50 mM Tris pH8, 5 mM MgSO4)에서 0.5 ㎍/㎕의 최종 농도로 희석되었다. 각 용해물의 3개 샘플이 용해물 없음 대조와 함께 조사되었다. 10 ㎕의 각 샘플 (또는 DHAD 검사 완충액)이 0.2 ㎖ PCR 튜브에 첨가되었다. 다중-채널 피펫을 이용하여, 90 ㎕의 기질이 각 튜브에 첨가되었다 (기질 혼합물은 4 ㎖ DHAD 검사 완충액을 0.5 ㎖ 100 mM DHIV에 첨가함으로써 제조되었다). 샘플은 35℃에서 30분 동안 유전자증폭기 (Eppendorf Mastercycler)에 넣어지고, 그 이후에 95℃에서 5분 배양되었다. 샘플은 유전자증폭기 상에서 4℃로 냉각되고, 이후 5분 동안 3000xg로 원심분리되었다. 최종적으로, 75 ㎕의 상층액이 새로운 PCR 튜브로 이전되고 아래와 같이 HPLC에 의해 분석되었다: 100 ㎕ DNPH 시약 (12 mM 2,4 - 디니트로페닐 히드라진 10 mM 구연산 pH 3.0 80% 아세토니트릴 20% MilliQ H20)이 100 ㎕의 각 샘플에 첨가되었다. 샘플은 유전자증폭기 (Eppendorf, Mastercycler)에서 70℃에서 30분 동안 배양되었다. 케토-이소발레레이트와 이소부티르알데히드의 분석은 Eclipse XDB C-18 역상 칼럼 (Agilent) 및 C-18 역상 칼럼 가드 (Phenomenex)가 구비된 HP-1200 고성능 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 수행되었다. 케토이소발레레이트와 이소부티르알데히드는 HP-1100 UV 검출기 (210 nm)를 이용하여 검출되었다. 칼럼 온도는 50℃이었다. 이러한 방법은 2.5% 희석된 인산 (4%)을 갖는 이동상으로서 물에서 70% 아세토니트릴과 등용매성이었다. 유속은 3 ㎖/min으로 설정되었다. 주입 크기는 10 ㎕이고, 그리고 작업 시간은 2분이었다.
실시예 1: 사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )에서 ADH 활성을 증가시킴으로써 증가된 이소부탄올/이소부티레이트 비율
본 실시예의 목적은 증가된 알코올 탈수소효소 활성이 증가된 이소부탄올 수율, 감소된 이소부티레이트 수율, 그리고 이소부탄올 수율 대(對) 이소부티레이트 수율의 비율에서 증가를 유발한다는 것을 증명하는 것이다.
본 실시예에서 개시된 균주와 플라스미드는 각각, 표 7과 8에서 제시된다.
실시예 1에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO 번호 유전형
GEVO2843 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), MATa ura3 leu2 his3 trp1
pdc1△::P CUP1 :[Bs_alsS1_coSc:T CYC1 : P PGK1 : Ll_kivD2: P ENO2 : Sp_HIS5]
pdc5△::[LEU2: bla: P TEF1 : ILV3△N: P TDH3 : Ec_ilvC_coSc Q110V ]
pdc6△::[URA3: bla: P TEF1 : Ll_kivD2: P TDH3 : Dm_ADH ]
{C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
실시예 1에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 명칭 관련된 유전자/용법 유전형
pGV2011 KARI, 그리고 DHAD를 발현하는 2μ 플라스미드 P TDH3 :Ec_ilvC_coSc Q110V , P TEF1 :Ll_ilvD_coSc,
2μ ori, bla, G418R
pGV2485 KARI, DHAD, 그리고 ADH를 발현하는 2μ 플라스미드 P TDH3 :Ec_ilvC_coSc Q110V , P TEF1 :Ll_ilvD_coSc, P ENO2 :Ll_adhA,
2μ ori, bla, G418R
염색체 DNA로부터 단일 알코올 탈수소효소 (노랑초파리(D. melanogaster) ADH, Dm_ADH)를 발현하는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO2843은 앞서 기술된 바와 같이, KARI와 DHAD만을 보유하는 2μ 플라스미드 pGV2011 (각각, Ec_ilvC_Q110V와 Ll_ilvD_coSc), 또는 KARI, DHAD와 ADH를 보유하는 pGV2485 (각각, Ec _ ilvC _ Q110V, Ll _ ilvD _ coSc, 그리고 Ll _ adhA)로 형질전환되었다.
발효 배양을 시작하기 위하여, 형질전환된 균주의 소규모 하룻밤 배양이 1% 에탄올과 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 YPD 배지에서 시작되고 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 각 균주의 3가지 생물학적 복제물이 조사되었다. 다음날 아침, 이들 배양액의 OD600이 측정되고, 그리고 적절한 양이 50 ㎖ 차단된 (baffled) 플라스크에서 50 ㎖의 동일한 배지를 대략 0.1의 OD600까지 접종하는데 이용되었다. 이들 전배양액 (preculture)은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 배양액이 대략 5-6의 OD600에 도달했을 때, 이들은 50 ㎖ Falcon 튜브에서 25℃에서 5분 동안 2700 rpm으로 원심분리되었다. 한 가지 50 ㎖ 배양액 (한 가지 클론)으로부터 세포는 8% 글루코오스, 0.2 g/ℓ G418, 1% (v/v) 에탄올 (3 g/ℓ 에르고스테롤 및 132 g/ℓ Tween-80을 내포)을 내포하는 YPD에서 재현탁되고, 그리고 pH 6.5에서 200 mM MES로 완충되었다. 배양액은 이후, 250 ㎖ 차단되지 않은 (unbaffled) 플라스크로 이전되고 30℃와 75 rpm에서 배양되었다.
72시간 시점에, 각 발효 플라스크로부터 샘플이 OD600, ADH 활성을 측정하기 위해, 그리고 GC1과 LC1에 의한 분석을 위해 채취되었다. GC1과 LC1 분석을 위한 샘플을 준비하기 위해, 적절한 부피의 세포 배양액이 마이크로원심분리기에서 10분 동안 최대 속도로 회전되고, 그리고 상층액이 GC1과 LC1 분석을 위해 이동되었다. 4℃에서 5분 동안 3000 x g로 14 ㎖의 배양 배지를 원심분리함으로써 ADH 검사를 위한 세포 펠릿이 만들어졌다. 상층액은 제거되고, 그리고 세포는 3 ㎖ 차가운 무균수에서 세척되었다. 튜브는 이후, 2분 동안 앞서 기술된 바와 같이 원심분리되고, 상층액이 제거되고, 그리고 이들 튜브는 총 세포 중량 (total cell weight)을 결정하기 위해 다시 칭량되었다. 이들 Falcon 튜브는 -80℃에서 보관되었다. ADH 검사는 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다.
표 9에서는 발효 과정 동안 각 균주에 대한 OD600을 보여준다. 72시간의 이러한 발효 동안, 이들 균주의 OD600은 유사하였다: 이들은 대략 7의 OD600에서 시작되고 대략의 9의 OD600에서 종결되었다. 상기 두 플라스미드로 형질전환된 GEVO2843으로부터 용해물의 시험관내 ADH 효소적 활성은 72시간 시점에서 측정되었다. 표 9에서는 시험관내에서 측정된, 용해물에서 ADH 활성을 보여준다. ADH가 없는 플라스미드 (pGV2011)를 보유하는 균주는 대략 0.04 U/mg의 활성을 보였다. Ll_adhA 유전자를 갖는 플라스미드 (pGV2485)를 보유하는 균주는 대략 7-배 높은 ADH 활성을 보였다.
72시간 발효후, 플라스미드 pGV2011 또는 pGV2485로 형질전환된 균주 GEVO2843의 OD600 및 알코올 탈수소효소 활성.
GEVO2843 형질전환 OD 600 ADH 활성
[U/mg]
pGV2011 8.5 0.04
pGV2485 9.1 0.29
72시간 발효후 이소부탄올과 이소부티레이트 역가는 표 10에서 제시된다. 0.04 U/mg의 낮은 ADH 활성을 갖는 균주에서 이소부탄올 역가는 0.29 U/mg의 높은 ADH 활성을 갖는 균주에 비하여 훨씬 낮았다. 0.04 U/mg의 낮은 ADH 활성을 갖는 균주에서 이소부티레이트 역가는 0.29 U/mg의 높은 ADH 활성을 갖는 균주에 비하여 훨씬 높았다. 표 10에서는 또한, 72시간 발효후 이소부티레이트와 이소부탄올에 대한 수율을 보여준다. 0.04 U/mg의 낮은 ADH 활성을 갖는 균주에서 이소부탄올 수율은 0.29 U/mg의 높은 ADH 활성을 갖는 균주에 비하여 훨씬 낮았다. 0.04 U/mg의 낮은 ADH 활성을 갖는 균주에서 이소부티레이트 수율은 0.29 U/mg의 높은 ADH 활성을 갖는 균주에 비하여 훨씬 높았다.
72시간 발효후, 플라스미드 pGV2011 또는 pGV2485로 형질전환된 균주 GEVO2843에서 이소부탄올과 이소부티레이트에 대한 역가와 수율.
이소부탄올 역가
[g/ℓ] 		이소부티레이트 역가
[g/ℓ] 		이소부탄올 수율
[mol/mol
글루코오스] 		이소부티레이트
수율
[mol/mol
글루코오스] 		수율 비율
(이소부탄올/
이소부티레이트)
pGV2011 3.2 3.8 0.22 0.22 1.0
pGV2485 4.7 1.9 0.33 0.11 3.0
실시예 2: 사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )에서 변이체 ADH Ll_AdhA RE1 의 이용에 의한 더욱 증가된 이소부탄올 / 이소부티레이트 비율
본 실시예의 목적은 증가된 kcat와 감소된 KM을 갖는 알코올 탈수소효소의 발현이 이소부탄올 수율에서 더욱 증가, 이소부티레이트 수율에서 감소, 그리고 이소부탄올 수율 대(對) 이소부티레이트 수율의 비율에서 증가를 유발한다는 것을 증명하는 것이다.
실시예 2에서 개시된 균주의 유전형 .
GEVO 번호 유전형
GEVO2843 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), MATa ura3 leu2 his3 trp1
pdc1△::P CUP1 :[Bs_alsS1_coSc:T CYC1 : P PGK1 : Ll_kivD2: P ENO2 : Sp_HIS5]
pdc5△::[LEU2: bla: P TEF1 : ILV3△N: P TDH3 : Ec_ilvC_coSc Q110V ]
pdc6△::[URA3: bla: P TEF1 : Ll_kivD2: P TDH3 : Dm_ADH ]
{C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
실시예 2에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 명칭 관련된 유전자/용법 유전형
pGV2543 KARI, DHAD, KIVD, 그리고 ADH (Ll_AdhAhis6)를 발현하는 2μ 플라스미드 P TDH3 :Ec_ilvC_coSc Q110V , P TEF1 :Ll_ilvD_coSc,
P PGK1 :Ll_kivD_coEc,
P ENO2 : Ll_AdhA his6 ,
2μ ori, bla, G418R
pGV2545 KARI, DHAD, KIVD, 그리고 ADH (Ll_AdhARE1-his6)를 발현하는 2μ 플라스미드 P TDH3 :Ec_ilvC_coSc Q110V , P TEF1 :Ll_ilvD_coSc,
P PGK1 :Ll_kivD_coEc,
P ENO2 : Ll_AdhA RE1-his6 ,
2μ ori, bla, G418R
염색체 DNA로부터 단일 알코올 탈수소효소 (노랑초파리(D. melanogaster) ADH, Dm _ ADH)를 발현하는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO2843는 KARI, DHAD, KIVD 및 his-표식되고 코돈-최적화된 야생형 ADH를 보유하는 2μ 플라스미드 pGV2543 (각각, Ec_ilvC Q110V , Ll_ilvD_coSc, 그리고 Ll_adhA_coSc his6 ) 또는 KARI, DHAD, KIVD 및 his-표식되고 코돈-최적화된 돌연변이체 ADH를 보유하는 pGV2545 (각각, Ec_ilvC Q110V , Ll_ilvD_coSc, 그리고 Ll_adhA RE1 _coSc his6 )로 형질전환되었다. 이들 균주는 배양되고, 그리고 앞서 기술된 바와 같이 GC1과 LC1에 의해 ADH 효소 활성 및 세포외 대사산물의 생산에 대해 평가되었다.
Ll_adhA_coSc his6 Ll_adhA RE1 _coSc his6 의 유전자 산물 (각각, Ll_adhAhis6 및 Ll_adhARE1-his6)의 동역학적 파라미터는 표 13에서 제시된다.
NADH를 보조인자로 하여 이소부티르알데히드에 대해 측정된, 야생형 Ll_adhAhis6 및 변형된 Ll_adhARE1의 동역학적 파라미터 비교.
변이체 K M
[mM 이소부티르알데히드] 		k cat
[s -1 ] 		k cat / K M
[M -1 *s -1 ]
Ll_adhAhis6 11.7 51 4400
Ll_adhARE1-his6 1.6 84 49700
표 14에서는 발효 과정 동안 각 균주에 대한 OD600을 보여준다. 72시간의 이러한 발효 동안, 이들 균주의 OD600은 유사하였다: 이들은 대략 6의 OD600에서 시작되고 대략의 9의 OD600에서 종결되었다. 상기 두 플라스미드로 형질전환된 GEVO2843으로부터 용해물의 시험관내 ADH 효소적 활성은 72시간 시점에서 측정되었다. 표 14에서는 앞서 기술된 바와 같이 시험관내에서 측정된, 용해물에서 ADH 활성을 보여준다. Ll_adhA_coSc his6 을 갖는 플라스미드 (pGV2543)를 보유하는 균주는 대략 0.38 U/mg의 활성을 보였다. Ll_adhA RE1 _coSc his6 유전자를 갖는 플라스미드 (pGV2545)를 보유하는 균주는 대략 7-배 높은 ADH 활성을 보였다.
72시간 발효후, 플라스미드 pGV2543 또는 pGV2545로 형질전환된 균주 GEVO2843의 OD600 및 알코올 탈수소효소 활성.
GEVO2843 형질전환 OD 600 ADH 활성
[U/mg]
pGV2543 8.5 0.38
pGV2545 8.8 2.46
72시간 발효후 이소부탄올과 이소부티레이트 역가와 수율은 표 15에 도시된다. pGV2543을 보유하는 균주에서 이소부탄올 역가와 수율은 pGV2545를 보유하는 균주에 비하여 낮았다. pGV2543을 보유하는 균주에서 이소부티레이트 역가와 수율은 pGV2545를 보유하는 균주에 비하여 훨씬 높았다.
72시간 발효후, 플라스미드 pGV2453 또는 pGV2485로 형질전환된 균주 GEVO2843에서 이소부탄올과 이소부티레이트에 대한 역가와 수율.
GEVO2843
형질전환		 이소부탄올
[g/ℓ] 		이소부티레이트
[g/ℓ] 		이소부탄올 수율
[mol/mol
글루코오스] 		이소부티레이트
수율
[mol/mol
글루코오스] 		수율 비율
(이소부탄올/
이소부티레이트)
pGV2543 4.6 1.3 0.28 0.06 4
pGV2545 4.9 0.3 0.29 0.01 20
실시예 3: RE1 의 발현에 의한 사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )에서 더욱 증가된 이소부탄올 / 이소부티레이트 비율
본 실시예의 목적은 증가된 kcat와 감소된 KM을 갖는 알코올 탈수소효소의 발현이 발효조 용기에서 수행된 발효 동안 이소부탄올 수율에서 증가 및 이소부티레이트 수율에서 감소를 유발한다는 것을 증명하는 것이다.
발효는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO3519와 GEVO3523의 성과를 비교하기 위해 수행되었다. 이소부탄올과 이소부티레이트 역가와 수율은 발효 동안 측정되었다. GEVO3519는 하기 효소를 인코딩하는 유전자를 내포하는 2μ 플라스미드 pGV2524를 보유한다: KARI, DHAD, KIVD 및 his-표식된, 코돈-최적화된 야생형 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) ADH. GEVO3523은 하기 효소를 인코딩하는 유전자를 내포하는 2μ 플라스미드 pGV2524를 보유한다: KARI, DHAD, KIVD 및 감소된 KM과 증가된 kcat를 갖는 his-표식된, 코돈-최적화된 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) ADH의 향상된 변이체. 이들 균주는 LC1과 GC1에 의한 이소부탄올, 이소부티르알데히드, 글루코오스 소비, 그리고 DasGip 발효조 용기에서 발효 동안 OD600에 대해 평가되었다.
실시예 3에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO 번호 유전형
GEVO3128 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) , MATa ura3 leu2 his3 trp1
gpd2△::[T Kl_URA3_short :P FBA1 :Kl_URA3:T Kl_URA3 ]
gpd1△::P ccw12 :hph
pdc1△ ::[P CUP1 :Bs_alsS1_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivDkivD2:P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5△::[LEU2:bla:P TEF1 ;ILV3△N:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc Q110V ]
pdc6△::[P TEF1 :Ll_ilvD:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 :P ENO2 :Ll_adhA:P FBA1 :Sc_TRP1] {C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
GEVO3519 플라스미드 pGV2524로 형질전환된 GEVO3128
GEVO3523 플라스미드 pGV2546로 형질전환된 GEVO3128
실시예 3에서 개시된 플라스미드.
플라스미드
명칭 		관련된 유전자/용법 유전형
pGV2524 2μ 플라스미드 P TDH3 : Ec _ ilvC _ coSc P2D1 -A1 , P TEF1 : Ll _ ilvD _ coSc,
P PGK1 :Ll_kivD2_coEc P ENO2 :Ll_adhA_coSc his6 ,
2μ ori, bla, G418R
pGV2546 2μ 플라스미드 P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 , P TEF1 :Ll_ilvD_coSc,
P PGK1 :Ll_kivD2_coEc P ENO2 :Ll_adhA_coSc RE1-his6 ,
2μ ori, bla, G418R
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO3128은 앞서 기술된 바와 같이 균주 GEVO3519와 GEVO3523을 산출하기 위해 각각, 2μ 플라스미드 pGV2524 또는 pGV2546로 형질전환되었다. GEVO3519와 GEVO3523의 접종물 배양은 80 ㎖의 YPD 배지 0.2g/ℓ G418 항생제, 1% v/v 에탄올, 그리고 0.019 g/ℓ 트립토판을 내포하는 500 ㎖ 차단된 플라스크를 접종함으로써 시작되었다. 배양액은 대략 34시간 동안 배양되었다. 오비탈 교반기는 양쪽 실험에서 250 rpm과 30℃로 설정되었다. GEVO3519와 GEVO3523 균주에 대해 유사한 세포 덩어리가 획득되었다. 배양후 획득된 세포 밀도 (cell density)는 8.0 OD600이었다. 배치 발효 (batch fermentation)는 용기당 0.9 ℓ의 작업 부피를 갖는 2 ℓ 탑 드라이브 모터 DasGip 용기를 이용하여, 80 g/ℓ 글루코오스, 0.2 g/ℓ G418, 1% v/v 에탄올, 그리고 0.019 g/ℓ 트립토판을 내포하는 YPD 배지에서 수행되었다. 용기는 적절한 용존 산소 및 pH 프로브 (probe)와 함께, 121℃에서 60분 동안 살균되었다. 용존 산소 프로브는 편극 (polarization)을 가능하게 하기 위해 살균후 보정되지만, pH 프로브는 살균전 보정되었다. pH는 6N KOH와 2N H2SO4를 이용하여 pH 6.0에서 조절되었다. 배양의 성장 기 (growth phase) 동안, 산소 전달 속도 (oxygen transfer rate, OTR)는 10 mM/h이고, 그리고 배양의 생산 기 동안 OTR은 0.2 mM/h이었다.
표 18에서는 배양의 생산 기 동안 계산된 이소부탄올 역가와 수율 (이론적 %로서)을 보여준다. 이소부탄올 역가와 수율 둘 모두 감소된 KM과 증가된 kcat를 갖는 알코올 탈수소효소를 보유하는 균주 GEVO3523에서 증가된다. 표 18에서는 또한, 도달된 최대 역가로서 보고되는 이소부티레이트 역가, 그리고 탄소 수율로서 수율 (%)을 보여준다. 이소부티레이트 역가와 수율 둘 모두 감소된 KM과 증가된 kcat를 갖는 알코올 탈수소효소를 보유하는 균주 GEVO3523에서 감소된다.
이소부탄올과 이소부티레이트 역가와 수율.
균주 이소부탄올 역가 [g/ℓ] 이소부탄올 수율
[이론적 %] 		이소부티레이트
역가 [g/ℓ] 		이소부티레이트 수율
[C-수율 %]
GEVO3519 3.9 ± 0.4 50.5 ± 2.1 0.82 ± 0.04 4.0 ± 0.0
GEVO3523 5.0 ± 0.3 59.5 ± 2.1 0.40 ± 0.01 2.0 ± 0.0
실시예 4: 사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )에서 ALD6 유전자의 결실에 의한 발효 동안 감소된 이소부티레이트와 아세테이트 생산
하기 실시예는 ALD6 유전자의 결실이 발효 동안 이소부티레이트와 아세테이트 생산의 감소를 유발한다는 것을 예증한다.
ALD6 결실 균주의 작제: 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)로부터 ALD6의 결실을 위한 ALD6의 결실 대립형질을 내포하는 DNA 단편을 산출하기 위해 PCR이 이용되었다. 한 가지 PCR 반응은 프라이머 oGV2834와 oGV2835를 이용하여 DNA 단편 (A)를 증폭하고, 이러한 단편은 ALD6의 상류 측면 영역 및 상기 DNA 단편의 3' 단부에서 pGV1954로부터 P Sc_CCW12 프로모터 영역의 5' 단부와의 겹침 영역을 포함한다. 다른 PCR 반응은 프라이머 oGV2836과 oGV2837을 이용하여 DNA 단편 (D)를 증폭하고, 이러한 단편은 ALD6의 하류 측면 영역 및 상기 DNA 단편의 5' 단부에서 pGV2074로부터 hph 히그로마이신 내성 ORF의 3' 단부와의 겹침 영역을 포함한다. 또 다른 PCR 반응은 프라이머 oGV2631과 oGV2632를 이용하여 DNA 단편 (B)를 증폭하고, 이러한 단편은 상기 DNA 단편의 5' 단부에서 ALD6의 상류 측면 영역의 3' 단부와의 겹침 영역 (단편 A) 및 상기 DNA 단편의 3' 단부에서 pGV2074로부터 hph 히그로마이신 내성 ORF의 5' 단부와의 겹침 영역을 갖는 pGV1954로부터 P Sc_CCW12 프로모터 영역을 포함한다. 또 다른 PCR 반응은 프라이머 oGV2633과 oGV2634를 이용하여 DNA 단편 (C)를 증폭하고, 이러한 단편은 상기 DNA 단편의 5' 단부에서 pGV1954로부터 P Sc_CCW12 프로모터 영역의 3' 단부와의 겹침 영역 (단편 B) 및 상기 DNA 단편의 3' 단부에서 ALD6의 하류 측면 영역의 5' 단부와의 겹침 영역 (단편 D)을 갖는 pGV2074로부터 hph 히그로마이신 내성 ORF를 포함한다. DNA 단편 A와 B는 프라이머 oGV2834와 oGV2632를 이용한 PCR에 의해 결합되어 DNA 단편 AB가 산출되고, 그리고 DNA 단편 C와 D는 프라이머 oGV2633과 oGV2837을 이용한 PCR에 의해 결합되어 DNA 단편 CD가 산출되었다. DNA 단편 AB와 CD는 프라이머 oGV2834와 oGV2837를 이용한 PCR에 의해 결합되어, ALD6의 결실 대립형질을 내포하는 최종 DNA 단편 ABCD가 산출되었다.
Figure pct00002
Figure pct00003
ALD6의 결실에 의해 감소된 이소부티레이트와 아세테이트 생산을 나타내는 균주는 ALD6의 결실 대립형질을 내포하는 ABCD DNA 단편으로 GEVO3198의 형질전환에 의해 작제되었다. 형질전환체는 0.1 g/ℓ 히그로마이신에 대한 내성에 대해 선별되고, 그리고 형질전환체 집락은 프라이머 쌍 oGV2840/oGV2680, oGV968/oGV2841, 그리고 oGV2838/oGV2839를 이용한 ABCD DNA 단편의 정확한 통합을 위해 집락 PCR에 의해 스크리닝되었다. 균주 GEVO3711, GEVO3712와 GEVO3713은 이러한 집락 PCR에 의해, ABCD DNA 단편의 정확한 통합에 의해 ALD6이 결실되는 것으로 확인되었다.
ALD6의 결실에 의해 감소된 이소부티레이트와 아세테이트 생산을 나타내는 이소부탄올 생산 경로를 내포하는 균주는 KARI, DHAD, KIVD와 ADH를 발현하는 유전자를 보유하는 2μ 복제 기원 플라스미드, pGV2247 (각각, Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 , Ll_ilvD_coSc, Ll_kivD2_coEc, 그리고 Ll_adhA)로 GEVO3711, GEVO3712와 GEVO3713의 형질전환에 의해 작제되었다. 형질전환체는 0.2 g/ℓ G418 및 0.1 g/ℓ 히그로마이신에 대한 내성에 대해 선별되고, 그리고 0.1 g/ℓ 히그로마이신 및 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 배지 상에 재-스트리킹 (re-streaking)에 의해 정제되어, 균주 GEVO3714, GEVO3715와 GEVO3716이 산출되었다. 이소부탄올 생산 경로를 내포하는 ALD6 대조 균주, GEVO3466은 플라스미드 pGV2247로 GEVO3198의 형질전환에 의해 산출되었다. 형질전환체는 0.2 g/ℓ G418에 대한 내성에 대해 선별되고, 그리고 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 배지 상에 재-스트리킹 (re-streaking)에 의해 정제되었다
ald2 △, ald3 △, ald4 △, ald5 △와 hfd1 △ 결실 균주의 작제 : 별개의 균주에서 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)로부터 개별적으로 ALD2 , ALD3 , ALD4 , ALD5와 HFD1의 결실을 위한 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5와 HFD1의 개별 결실 대립형질을 내포하는 별개의 DNA 단편을 산출하기 위해 PCR이 이용되었다. 추가적으로, 개별 균주에서 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)로부터 ALD2와 ALD3 둘 모두의 결실 (ald2△ ald3△)을 위한, 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 유전체에서 인접하는 유전자인 ALD2와 ALD3 둘 모두를 커버하는 결실 대립형질을 내포하는 DNA 단편을 산출하기 위해 PCR이 이용되었다. 각 개별 유전자에 대해, 상류 측면 영역, pGV1954로부터 P Sc_CCW12 프로모터 영역, pGV2074로부터 hph 히그로마이신 내성 ORF 및 하류 측면 영역을 내포하는 4-성분 단편은 표 20에 열거된 프라이머 쌍을 이용하는 점을 제외하고, ALD6의 결실을 위한 ABCD 단편의 산출에서와 같이 PCR에 의해 산출되었다. ALD2와 ALD3 둘 모두의 결실을 위한 이러한 4-성분 단편은 ALD2로부터 상류 측면 영역 및 ALD3으로부터 하류 측면 영역을 내포하고, 그리고 표 20에 열거된 프라이머 쌍을 이용한 PCR에 의해 유사하게 작제되었다. pGV1954로부터 P Sc_CCW12 프로모터 영역은 프라이머 쌍 oGV2631/oGV2632로 항상 증폭되었고, 그리고 pGV2074로부터 hph 히그로마이신 내성 ORF는 프라이머 쌍 oGV2633/oGV2634로 항상 증폭되었다.
유전자 결실을 위해 상류와 하류 영역을 증폭하는데 이용되는 프라이머.
유전자 결실 상류 영역을 위한 프라이머 쌍 하류 영역을 위한 프라이머 쌍
ald2△ oGV2796/oGV2797, oGV2796/oGV2798 oGV2800/oGV2801
ald3△ oGV2806/oGV2808 oGV2810/oGV2811
ald2△ ald3 △ oGV2796/oGV2798 oGV2810/oGV2811
ald4△ oGV2816/oGV2818 oGV2820/oGV2821
ald5△ oGV2826/oGV2827 oGV2828/oGV2829
ald6△ oGV2834/oGV2835 oGV2836/oGV2837
hfd1△ oGV2842/oGV2843 oGV2844/oGV2845
개별적으로 ALD2 , ALD3 , ALD4 , ALD5 와 HFD1의 결실을 갖는 균주 및 ALD2와 ALD3 둘 모두의 결실을 갖는 균주는 ALD2 , ALD3 , ALD4 , ALD5 또는 HFD1의 개별 결실 대립형질을 내포하는 개별 4-성분 DNA 단편, 또는 ALD2와 ALD3 둘 모두의 결실 대립형질을 내포하는 4-성분 DNA 단편으로 GEVO3198 또는 GEVO3466의 형질전환에 의해 작제되었다. 형질전환체는 0.1 g/ℓ 히그로마이신에 대한 내성에 대해 선별되고, 그리고 형질전환체 집락은 표 21에 열거된 프라이머 쌍을 이용한 4-성분 DNA 단편의 정확한 통합을 위해 집락 PCR에 의해 스크리닝되었다. 균주 GEVO3567은 이러한 집락 PCR에 의해, ALD2가 정확하게 결실되는 것으로 확인되었다; 균주 GEVO3568은 이러한 집락 PCR에 의해, ALD3이 정확하게 결실되는 것으로 확인되었다; 균주 GEVO3569는 이러한 집락 PCR에 의해, ALD2와 ALD3 둘 모두 정확하게 결실되는 것으로 확인되었다; 균주 GEVO3579는 이러한 집락 PCR에 의해, ALD4가 정확하게 결실되는 것으로 확인되었다; 균주 GEVO3705, GEVO3706과 GEVO3707은 이러한 집락 PCR에 의해, ALD5가 정확하게 결실되는 것으로 확인되었다; 그리고 균주 GEVO3720, GEVO3721과 GEVO3722는 이러한 집락 PCR에 의해, HFD1이 정확하게 결실되는 것으로 확인되었다.
이소부탄올 생산 경로를 내포하고 개별적으로 ALD2, ALD3과 ALD5의 결실 또는 ALD2와 ALD3 둘 모두의 결실을 갖는 균주는 플라스미드 pGV2247로 균주 GEVO3567, GEVO3568, GEVO3569, GEVO3705, GEVO3706과 GEVO3707의 형질전환에 의해 작제되었다. 형질전환체는 0.2 g/ℓ G418 및 0.1 g/ℓ 히그로마이신에 대한 내성에 대해 선별되고, 그리고 0.1 g/ℓ 히그로마이신 및 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 배지 상에 재-스트리킹 (re-streaking)에 의해 정제되어, 균주 GEVO3586, GEVO3587, GEVO3588, GEVO3590, GEVO3591, GEVO3592, GEVO3593, GEVO3594, GEVO3595, GEVO3708, GEVO3709와 GEVO3710이 산출되었다. 균주 GEVO3579, GEVO3720, GEVO3721과 GEVO3722는 GEVO3466로부터 산출되고, 따라서 플라스미드 pGV2247을 내포하였다.
유전자 결실의 확인을 위해 집락을 스크리닝하는데 이용되는 프라이머.
유전자 결실 프라이머 쌍
ald2△ oGV2802/oGV2632, oGV968/oGV2803, oGV2804/oGV2805
ald3△ oGV2812/oGV2632, oGV968/oGV2813, oGV2814/oGV2815
ald2△ ald3 △ oGV2802/oGV2632, oGV968/oGV2813, oGV2804/oGV2805, oGV2814/oGV2815
ald4△ oGV2822/oGV2632, oGV968/oGV2896, oGV2824/oGV2825
ald5△ oGV2832/oGV2680, oGV1965/oGV2833, oGV2830/oGV2831
ald6△ oGV2840/oGV2680, oGV968/oGV2841, oGV2838/oGV2839
hfd1△ oGV2848/oGV2680, oGV968/oGV2849, oGV2846/oGV2847
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 4에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 명칭 유전형
pGV2247 P TEF1 :Ll_ilvD_coSc P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 P PGK1 :Ll_kivD2_coEc P ENO2 : Ll_adhA 2μ-ori, pUC-ori, bla, G418R.
교반 플라스크 발효: GEVO3466의 성과를 ald2 △, ald3 △, ald2 △ ald3 △, ald4△, ald5 △, hfd1 △와 ald6 △ 결실 돌연변이를 내포하는 균주와 비교하기 위해 발효가 수행되었다. 효모 균주는 14 ㎖ 둥근-바닥 스냅-캡 튜브에서, 세포 패치로부터, 또는 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 YPD 아가 평판으로부터 정제된 단일 집락으로부터 0.2 g/ℓ G418 및 1% v/v 에탄올 배지를 내포하는 3 ㎖의 YPD 내로 접종되었다. 배양액은 250 rpm과 30℃에서 비스듬히 최대 24시간 교반하면서 하룻밤동안 배양되었다. 각 균주에 대해 별개로, 이들 하룻밤 배양액은 슬리브 클로저 (sleeve closure)를 갖는 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 0.2 g/ℓ G418 및 1% v/v 에탄올 배지를 내포하는 50 ㎖의 YPD를 0.1의 OD600까지 접종하는데 이용되었다. 이들 플라스크 배양액은 250 rpm과 30℃에서 최대 24시간 교반하면서 하룻밤동안 배양되었다. 이들 플라스크 배양액으로부터 세포는 5분 동안 3000xg로 원심분리에 의해 각 균주에 대해 별개로 수확되고, 그리고 각 세포 펠릿은 80 g/ℓ 글루코오스, 에탄올에 용해된 3 g/ℓ 에르고스테롤과 132 g/ℓ Tween 80의 1% v/v 저장 용액, 200 mM MES 완충액, pH 6.5, 그리고 0.2 g/ℓ G418 배지를 내포하는 5 ㎖의 YPD에서 별개로 재현탁되었다. 각 세포 현탁액은 벤트 스크루-캡 (vented screw-cap)을 갖는 250 ㎖ 비-차단된 플라스크에서 80 g/ℓ 글루코오스, 에탄올에 용해된 3 g/ℓ 에르고스테롤과 132 g/ℓ Tween 80의 1% v/v 저장 용액, 200 mM MES 완충액, pH 6.5, 그리고 0.2 g/ℓ G418 배지를 내포하는 50 ㎖의 YPD를 대략 5의 OD600까지 접종하는데 이용되었다. 이들 발효액은 250 rpm과 30℃에서 교반 배양되었다. 주기적으로, 각 교반 플라스크 발효액으로부터 샘플은 OD600을 측정하고, 그리고 이소부탄올과 기타 대사산물에 대한 가스 크로마토그래피 (GC1) 분석, 그리고 유기 산과 글루코오스에 대한 고성능 액체 크로마토그래피 (LC1) 분석에 대비하기 위해 이동되었다. 2 ㎖의 샘플은 마이크로원심분리기 튜브로 이동되고 10분 동안 최대 rpm으로 마이크로원심분리기에서 원심분리되었다. 1 ㎖의 상층액은 앞서 기술된 바와 같이 GC1과 LC1에 의해 세포외 대사산물이 분석되었다.
교반 플라스크 발효액에서 ALD6의 결실은 이소부티레이트와 아세테이트 생산을 감소시켰다: GEVO3466 및 ald6△ 균주 GEVO3714, GEVO3715와 GEVO3716에 대한 52시간 교반 플라스크 발효 결과는 표 24에 요약된다. ald6△ 균주 GEVO3714, GEVO3715와 GEVO3716은 ALD6 균주 GEVO3466보다 71% 적은 이소부티레이트를 생산하였다. ald6△ 균주 GEVO3714, GEVO3715와 GEVO3716 역시 ALD6 균주 GEVO3466보다 86% 적은 아세테이트를 생산하였다. ald6△ 균주 GEVO3714, GEVO3715와 GEVO3716에서 이소부탄올 수율은 ALD6 균주 GEVO3466과 별다른 차이가 없었다. ald6△ 균주 GEVO3714, GEVO3715와 GEVO3716에서 이소부탄올 역가는 ALD6 균주 GEVO3466보다 23% 높았다.
ALD6의 결실에 의한 감소된 이소부티레이트와 아세테이트 생산을 증명하는 교반 플라스크 발효 결과
균주 이소부탄올
역가
[g/ℓ] 		이소부탄올 수율
[이론적 %] 		생산된
이소부티레이트
[g/ℓ] 		생산된
아세테이트 [g/ℓ]
GEVO3466
(ALD6)		 2.6 ± 0.1 44 ± 2 0.48 ± 0.06 0.59 ± 0.04
GEVO3714, GEVO3715 및 GEVO3716 (ald6△) 3.2 ± 0.2 42 ± 2 0.14 ± 0.06 0.08 ± 0.01
GEVO3466 및 ald2 △, ald3 △, ald2 △, ald3 △, ald4 △, ald5 △와 hfd1 △ 균주에 대한 72시간 교반 플라스크 발효 결과는 표 25와 표 26에서 요약된다. ALD3, ALD2와 ALD3 둘 모두, 또는 ALD4에서 결실을 갖는 균주는 야생형 ALDH 균주 GEVO3466과 비교하여 이소부티레이트 생산에서 감소가 없었다. ALD2, ALD5 또는 HFD1에서 결실을 갖는 균주는 야생형 ALDH 균주 GEVO3466과 비교하여 이소부티레이트 생산에서 현저한 감소가 없었다. ALD2와 ALD3 둘 모두의 결실을 갖는 균주는 야생형 ALDH 균주 GEVO3466보다 19% 적은 아세테이트를 생산하지만, ALD2, ALD3, ALD4, ALD5 또는 HFD1의 개별 결실을 갖는 균주는 야생형 ALD 균주 GEVO3466과 비교하여 아세테이트 생산에서 현저한 감소가 없었다.
ALD2, ALD3, ALD4, 또는 ALD2와 ALD3 둘 모두의 결실에 의한 이소부티레이트와 아세테이트 생산에서 감소 없음을 증명하는 교반 플라스크 발효 결과.
균주 이소부탄올 역가
[g/ℓ] 		이소부탄올 수율
[이론적 %] 		생산된
이소부티레이트
[g/ℓ] 		생산된
아세테이트
[g/ℓ]
GEVO3466
(야생형)		 5.1 ± 0.1 42 ± 2 1.24 ± 0.15 0.95 ± 0.07
GEVO3590, GEVO3591 및 GEVO3592 (ald2△) 5.2 ± 0.2 45 ± 2 1.21 ± 0.06 0.85 ± 0.07
GEVO3593, GEVO3594 및 GEVO3595 (ald3△) 5.5 ± 0.6 45 ± 6 1.34 ± 0.16 0.91 ± 0.07
GEVO3596, GEVO3597 및 GEVO3598 (ald2△ ald3△) 6.8 ± 0.1 51 ± 1 1.41 ± 0.09 0.77 ± 0.08
GEVO3579 (ald4△) 5.6 ± 0.7 46 ± 6 1.34 ± 0.13 0.89 ± 0.15
ALD5 또는 HFD1의 결실에 의한 이소부티레이트와 아세테이트 생산에서 감소 없음을 증명하는 교반 플라스크 발효 결과.
균주 이소부탄올 역가
[g/ℓ] 		이소부탄올 수율
[이론적 %] 		생산된
이소부티레이트
[g/ℓ] 		생산된
아세테이트
[g/ℓ]
GEVO3466
(야생형)		 4.0 ± 0.4 44 ± 7 0.47 ± 0.04 0.75 ± 0.05
GEVO3708, GEVO3709 및 GEVO3710 (ald5△) 3.8 ± 0.8 46 ± 15 0.41 ± 0.04 0.64 ± 0.08
GEVO3720, GEVO3721 및 GEVO3722 (hfd1△) 4.4 ± 1.0 54 ± 14 0.40 ± 0.07 0.56 ± 0.18
벤치탑 발효조에서 발효: 벤치탑 발효조에서 발효는 GEVO3466 (ALD6)의 성과를 GEVO3714과 GEVO3715 (ald6 △)와 비교하기 위해 수행되었다. 글루코오스 소비, 이소부탄올 생산, 이소부티레이트 생산, 그리고 OD600이 발효 동안 측정되었다. 이들 발효에서, 도말 평판으로부터 정제된 균주는 1% v/v 에탄올, 100 μM CuSO4ㆍ5H20 및 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 80 ㎖의 YPD 배지를 포함하는 500 ㎖ 차단된 플라스크로 이전되고 250 rpm으로 오비탈 교반기에서 30℃에서 32시간 동안 배양되었다. 플라스크 배양액은 0.5의 출발 OD600을 위해 용기당 80 g/ℓ 글루코오스, 1% v/v 에탄올, 100 μM CuSO4ㆍ5H20 및 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 0.9 ℓ의 작업 부피의 YPD 배지를 갖는 개별 2 ℓ 탑 드라이브 모터 발효조 용기로 이전되었다. 발효조는 30℃와 pH 6.0에서 가동되고, 그리고 산소 전달 속도 (OTR)에 기초된 2-기 (phase) 호기성 조건하에 6N KOH와 2N H2SO4로 제어되었다. 초기에, 발효조는 700 rpm의 고정된 휘저음 및 5 sL/h의 공기 오버레이 (air overlay)에 의해 10 mM/h의 성장기 OTR에서 가동되었다. 배양액은 대략 9-10 OD600까지 24시간 동안 성장되고, 그 직후에 24시간 내지 86.5시간의 기간 동안 휘저음을 700 rpm에서 450 rpm으로 감소시킴으로써 생산 통기 OTR = 2.0 mM/h로 전환되었다. 주기적으로, 각 발효조로부터 샘플은 OD600을 측정하고, 그리고 이소부탄올과 기타 대사산물에 대한 가스 크로마토그래피 (GC1) 분석, 그리고 유기 산과 글루코오스에 대한 고성능 액체 크로마토그래피 (LC1) 분석에 대비하기 위해 이동되었다. 2 ㎖의 샘플은 마이크로원심분리기 튜브로 이동되고 10분 동안 최대 rpm으로 마이크로원심분리기에서 원심분리되었다. 1 ㎖의 상층액은 앞서 기술된 바와 같이 GC1과 LC1에 의해 분석되었다.
벤치탑 발효조 발효에서 ALD6의 결실은 이소부티레이트와 아세테이트 생산을 감소시키고 이소부탄올 수율을 증가시켰다: 86.5시간 벤치탑 발효조 발효 결과는 표 27에 요약된다. ald6△ 균주 GEVO3714와 GEVO3715는 ALD6 균주 GEVO3466보다 38% 적은 이소부티레이트를 생산하였다. ald6△ 균주 GEVO3714와 GEVO3715는 또한, ALD6 균주 GEVO3466보다 61% 적은 아세테이트를 생산하였다. ald6△ 균주 GEVO3714와 GEVO3715에서 이소부탄올 수율은 ALD6 균주 GEVO3466보다 25% 높았다. ald6△ 균주 GEVO3714와 GEVO3715에서 이소부탄올 역가 역시 ALD6 균주 GEVO3466보다 35% 높았다.
ALD6의 결실에 의한 감소된 이소부티레이트와 아세테이트 생산 및 증가된 이소부탄올 수율을 증명하는 벤치탑 발효조 발효 결과.
균주 이소부탄올 역가
[g/ℓ] 		이소부탄올 수율
[이론적 %] 		생산된 이소부티레이트
[g/ℓ] 		생산된 아세테이트
[g/ℓ]
GEVO3466
(ALD6)		 8.2 ± 0.1 32 ± 1 2.1 ± 0.1 2.3 ± 0.3
GEVO3714 및 GEVO3715 (ald6△) 11.1 ± 0.1 40 ± 0 1.3 ± 0.1 0.9 ± 0.1
실시예 5: 사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )에서 ALD6 활성의 결정
하기 실시예는 이소부티르알데히드 산화 활성이 ald6△ 균주에서 훨씬 감소된다는 것을 예증한다.
실시예 5에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO # 유전형 출처
GEVO3527 MATα his3△-1 leu2△ lys2△ ura3△ ATCC# 201389 (BY4742)
GEVO3940 MATα his3△-1 leu2△lys2△ ura3△ ald6△ ::kan R OpenBiosystems cat# YSC1054 (Yeast MATalpha collection)
ALD6 (YPL061W) 유전자가 결실되는 효모 균주 GEVO3940 및 이의 부모 GEVO3527은 각 균주에 대해 삼중으로 3 ㎖의 YPD 배지를 14 ㎖ 배양액 튜브에 접종함으로써 각각 삼중으로 배양되었다. 배양은 GEVO3527의 경우에 YPD 아가 평판 상에서, 그리고 GEVO3940의 경우에 0.2 g/ℓ G418 평판을 내포하는 YPD 아가 평판 상에서 패치 (patch)로부터 시작되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 익일에, 하룻밤 배양액의 OD600이 측정되고, 그리고 50 ㎖ 배양액을 0.1의 OD600까지 접종하기 위한 각 배양액의 부피가 계산되었다. 계산된 부피의 각 배양액은 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 50 ㎖의 YPD를 접종하는데 이용되었고, 그리고 이들 배양액은 30℃와 250 rpm에서 배양되었다. 이들 세포는 7시간의 성장후 1.6-2.1의 OD에서 중간-로그 기 (mid-log phase) 동안 수확되었다. 배양액은 미리 칭량된 50 ㎖ Falcon 튜브로 이전되고, 그리고 세포가 5분 동안 3000 x g로 원심분리에 의해 수집되었다. 배지의 제거후, 세포는 10 ㎖ MilliQ H20로 세척되었다. 물의 제거후, 세포는 5분 동안 3000 x g로 다시 한 번 원심분리되고, 그리고 남아있는 물은 1 ㎖ 피펫 팁 (pipette tip)을 이용하여 조심스럽게 제거되었다. 세포 펠릿은 칭량되고, 이후 그들이 용해되고 앞서 기술된 바와 같이 이소부티르알데히드 산화 활성에 대해 조사될 때까지 -80℃에서 보관되었다.
표 29에서 제시된 바와 같이, 10 mM 이소부티르알데히드의 산화에 대한 GEVO3527 용해물에서 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6의 비활성은 13.9 mU/mg이었다. ALD6 결실을 갖는 동일한 균주는 22-배 적은 0.6 mU/mg의 비활성을 가졌다. 1.0 mM 이소부티르알데히드의 산화에 대한 GEVO3527 용해물에서 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6의 비활성은 17.6 mU/mg이었다. ALD6 결실을 갖는 동일한 균주는 8-배 적은 2.1 mU/mg의 비활성을 가졌다. 0.1 mM 이소부티르알데히드의 산화에 대한 GEVO3527 용해물에서 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6의 비활성은 6.7 mU/mg이었다. ALD6 결실을 갖는 동일한 균주는 5-배 적은 1.3 mU/mg의 비활성을 가졌다. 이들 데이터는 내생성 ALD6 효소가 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)에서 이소부탄올 경로의 이소부티레이트 부산물을 책임진다는 것을 증명한다.
Figure pct00006
실시예 6: 사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )에서 ALD6 유전자의 결실 및 향상된 알코올 탈수소효소의 과다발현으로 더욱 감소된 이소부티레이트 생산
하기 실시예는 ALD6 결실 및 향상된 동역학적 성질을 갖는 ADH 과다발현의 합동이 이소부티레이트 생산에서 더욱 감소 및 이소부탄올 생산에서 더욱 증가를 유발한다는 것을 예증한다.
이소부티레이트는 효모에서 이소부티르알데히드 물질대사의 부산물이고, 그리고 탄소 수율의 유의미한 분획을 포함할 수 있다. 하기 효모 균주가 작제되었다: GEVO3466은 균주 GEVO3198을 하기 효소: KARI, DHAD, KIVD 및 야생형 ADH를 인코딩하는 유전자를 보유하는 2μ 플라스미드, pGV2247 (각각, Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 , Ll_ilvD_coSc, Ll_kivD2_coEc, 그리고 Ll_adhA)로 형질전환시킴으로써 작제되었다. GEVO3198은 염색체 DNA로부터 단일 사본의 알코올 탈수소효소 (락토코커스 락티스(L. lactis) ADH, Ll_adhA)를 발현한다. 생물학적 복제물이 GEVO3714와 GEVO3715로 명명되는 두 번째 균주는 2가지 독립된 균주, GEVO3711과 GEVO3712를 하기 효소: KARI, DHAD, KIVD 및 야생형 ADH를 인코딩하는 유전자를 보유하는 2μ 플라스미드 pGV2247 (각각, Ec_ilvC_coSc P2D1-A1, , Ll_ilvD_coSc, Ll_kivD2_coEc, 그리고 Ll_adhA)로 형질전환시킴으로써 작제되었다. GEVO3711과 3712는 단일 알코올 탈수소효소 (락토코커스 락티스(L. lactis) ADH, LI_adhA)를 발현하고 염색체 DNA로부터 ALD6 유전자가 결실된다. 생물학적 복제물이 GEVO3855와 GEVO3856으로 명명되는 세 번째 균주는 균주, GEVO3711을 하기 효소: KARI, DHAD, KIVD 및 돌연변이체 ADH를 인코딩하는 유전자를 보유하는 2μ 플라스미드 pGV2602 (각각, Ec_ilvC_coSc P2D1-A1-his6, , Ll _ ilvD _ coSc , Ll _ kivD2 _ coEc , 그리고 Ll _ adhA RE1 )를 형질전환시킴으로써 작제되었다.
실시예 6에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO No. 유전형
GEVO3198 MATa ura3 leu2 his3 trp1
gpd1△::T Kl_URA3
gpd2△::[T Kl_URA3_short :P FBA1 :Kl_URA3:T Kl_URA3 ]
pdc1△::[P CUP1 :Bs_alsS_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivDkivD:P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5△::[LEU2:bla:P TEF1 :ILV3△N:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc Q110V ]
pdc6△::[P TEF :Ll_ilvD:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 :P ENO2 :Ll_adhA:P FBA1 :Sc_TRP1] {C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
GEVO3466 MATa ura3 leu2 his3 trp1 gpd1△::T Kl_URA3
gpd2△::[T Kl_URA3_short :P FBA1 :Kl_URA3:T Kl_URA3 ]
pdc1△::[P CUP1 :Bs_alsS_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivDkivD:P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5△::[LEU2:bla:P TEF1 :ILV3△N:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc Q110V ]
pdc6△::[P TEF :Ll_ilvD:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 :P ENO2 :Ll_adhA:P FBA1 :Sc_TRP1] pGV2247로 형질전환됨 {C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
GEVO3711,
GEVO3712 		MATa ura3 leu2 his3 trp1 gpd1△::T Kl_URA3
gpd2△::[T Kl_URA3_short :P FBA1 :Kl_URA3:T Kl_URA3 ]
pdc1△::[P CUP1 :Bs_alsS_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivD:P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5 △::[ LEU2 : bla : P TEF1 : ILV3 △N: P TDH3 : Ec _ ilvC _ coSc Q110V ]
pdc6△::[P TEF :Ll_ilvD:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 :P ENO2 :Ll_adhA:P FBA1 :Sc_TRP1]
ald6△::P CCW12 : hph {C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
GEVO3714, GEVO3715 MATa ura3 leu2 his3 trp1 gpd1△::T Kl_URA3
gpd2△::[T Kl_URA3_short :P FBA1 :Kl_URA3:T Kl_URA3 ]
pdc1△::[P CUP1 :Bs_alsS_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivD:P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5△::[LEU2:bla:P TEF1 :ILV3△N:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc Q110V ]
pdc6△::[P TEF :Ll_ilvD:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 :P ENO2 :Ll_adhA:P FBA1 :Sc_TRP1]
ald6△::P CCW12 : hph pGV2247로 형질전환됨 {C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
GEVO3855, GEVO3856 MATa ura3 leu2 his3 trp1 gpd1△::T Kl_URA3
gpd2△::[T Kl_URA3_short :P FBA1 :Kl_URA3:T Kl_URA3 ]
pdc1△::[P CUP1 :Bs_alsS_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivD:P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5△::[LEU2:bla:P TEF1 :ILV3△N:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc Q110V ]
pdc6△::[P TEF :Ll_ilvD:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 :P ENO2 :Ll_adhA:P FBA1 :Sc_TRP1]
ald6△::P CCW12 : hph pGV2602로 형질전환됨 {C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
실시예 6에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 명칭 유전형
pGV2247 P TEF1 :Ll_ilvD_coSc, P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 , P PGK1 :Ll_kivD2_coEc, P ENO2 : Ll_adhA. 2μ-ori, pUC-ori, bla, G418R.
pGV2602 P TEF1 :Ll_ilvD_coSc, P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1-his6 , P PGK1 :Ll_kivD2_coEc, P ENO2 : Ll_adhA RE1 . 2μ-ori, pUC-ori, bla, G418R.
2가지 상이한 세트의 발효가 수행되었다. 발효 세트 A는 GEVO3466 (LI _ adhA)의 성과를 GEVO3714-GEVO3715 (LI - adhA, ald6△)와 비교하기 위해 수행되었다. 발효 세트 B는 GEVO3714 (LI_adhA, ald6△)의 성과를 GEVO3855-GEVO3856 (LI_adhA RE1 , ald6△)과 각각 비교하기 위해 수행되었다. 글루코오스 소비, 이소부탄올 생산, 이소부티레이트 생산, 그리고 OD600이 발효 동안 측정되었다. 이들 발효에서, YPD 아가 평판 상에서 성장된 단일 격리된 세포 집락이 1% v/v 에탄올, 100 μM CuSO4ㆍ5H20 및 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 80 ㎖의 YPD 배지를 포함하는 500 ㎖ 차단된 플라스크로 이전되고 250 rpm으로 오비탈 교반기에서 30℃에서 32시간 동안 배양되었다. 플라스크 배양액은 0.5의 출발 OD600을 위해 용기당 80 g/ℓ 글루코오스, 1% v/v 에탄올, 100 μM CuSO4ㆍ5H20 및 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 0.9 ℓ의 작업 부피의 YPD 배지를 갖는 개별 2 ℓ 탑 드라이브 모터 발효조 용기로 이전되었다. 발효조는 30℃와 pH 6.0에서 가동되고, 그리고 산소 전달 속도 (OTR)에 기초된 2-기 (phase) 호기성 조건하에 6N KOH로 제어되었다. 초기에, 발효조는 양쪽 실험에서 700 rpm의 고정된 휘저음 및 5 sL/h의 공기 오버레이 (air overlay)에 의해 10 mM/h의 성장기 OTR에서 가동되었다. 배양액은 대략 9-10 OD600까지 24시간 동안 성장되고, 그 직후에 48.5시간 동안 생산 통기 조건으로 전환되었다. 첫 번째 실험에서, 2.5 - 3.0 mM/h의 OTR은 휘저음을 700 rpm에서 425 rpm으로 감소시킴으로써 지속되고, 반면 두 번째 실험에서, 2.0 - 2.5 mM/h의 OTR은 휘저음을 700 rpm에서 400 rpm으로 감소시킴으로써 지속되었다. 주기적으로, 각 발효조로부터 샘플은 OD600을 측정하고, 그리고 가스 크로마토그래피 (GC1) 분석 및 액체 크로마토그래피 (LC1) 분석에 대비하기 위해 이동되었다. GC1과 LC1을 위해, 2 ㎖의 샘플이 에펜도르프 튜브로 이동되고 10분 동안 최대 rpm으로 마이크로원심분리기에서 원심분리되었다. 1 ㎖의 상층액은 GC1 (이소부탄올, 기타 대사산물)에 의해 분석되고, 그리고 1 ㎖는 고성능 액체 크로마토그래피 (LC1)에 의해 유기 산과 글루코오스에 대해 분석되었다.
2가지 별개의 발효 세트 A와 B로부터 72.5시간 데이터는 표 32와 33에 요약된다. 발효 세트 A는 GEVO3466 (WT ADH)을 GEVO3714와 3715 (WT ADH, ald6△)와 비교하고, 반면 발효 세트 B는 GEVO3714 (WT ADH, ald6△)를 GEVO3855와 3856 (Ll_adhA RE1 , ald6△)과 비교하였다.
발효 세트 A를 지시하는 데이터 (표 32)는 ALD6 유전자 결실을 갖는 Ll_adhA를 보유하는 균주에서 이소부탄올 역가와 이론적 수율이 ALD6 유전자 결실을 갖지 않는 LI_adhA를 보유하는 균주와 비교하여, 각각 1.4-배와 1.3-배 높다는 것을 증명한다. ALD6 유전자 결실을 갖지 않는 LI_adhA를 보유하는 균주 (GEVO3466)는 0.040 g/g의 이소부티레이트 수율 (생산된 이소부티레이트 그램/소비된 글루코오스 그램)을 갖는 반면, ALD6 유전자 결실을 갖는 LI_adhA를 보유하는 균주 (GEVO3714, GEVO3715)는 0.017 g/g의 더욱 낮은 이소부티레이트 수율을 가졌다. ALD6 유전자 결실을 갖지 않는 락토코커스 락티스(L. lactis) adhA를 보유하는 균주는 2.3 g/ℓ 아세테이트를 생산하는 반면, ALD6 유전자 결실을 갖는 락토코커스 락티스(L. lactis) adhA를 보유하는 균주는 0.6 g/ℓ 아세테이트를 생산하였다.
발효 세트 A로부터 데이터.
균주 OD 600 생산된 이소부탄올 [g/ℓ] 생산된 이소부티레이트 [g/ℓ] 이소부탄올 수율
[이론적 %] 		이소부티레이트 수율
[g/g] 		생산된 아세테이트
[g/ℓ]
GEVO3466
(WT ADH)		 9.7 ± 0.1 7.4 ± 0.6 1.7 ± 0.0 48.1 ± 2.6 0.040 ± 0.004 2.3 ± 0.1
GEVO3714, GEVO3715 (WT ADH, ALD6△ ) 10.0 ± 0.7 10.4 ± 0.1 0.8 ± 0.1 55.3 ± 0.6 0.017 ± 0.003 6.1 ± 0.1
발효 세트 B를 지시하는 데이터 (표 33)은 ALD6 유전자 결실을 갖는 락토코커스 락티스(L. lactis) adhA RE1 을 보유하는 균주에서 이소부탄올 역가와 이론적 수율이 ALD6 유전자 결실을 갖는 락토코커스 락티스(L. lactis) adhA를 보유하는 균주와 비교하여 각각, 1.2배와 1.1-배 높다는 것을 증명한다. ALD6 유전자 결실을 갖는 락토코커스 락티스(L. lactis) adhA RE1 을 보유하는 균주 (GEVO3855, GEVO3856)는 0.014 g/g의 더욱 높은 이소부티레이트 수율 및 0.0 g/ℓ의 유사한 아세테이트 역가를 갖는 ALD6 유전자 결실을 갖는 락토코커스 락티스(L. lactis) adhA를 보유하는 균주 (GEVO3714)와 비교하여, 가장 낮은 이소부티레이트 수율 (생산된 이소부티레이트 그램/소비된 글루코오스 그램), 0.005 g/g을 갖고, 그리고 0.0 g/ℓ 아세테이트를 생산하였다 (표 33)
발효 세트 B로부터 데이터.
균주 OD 600 생산된 이소부탄올 [g/ℓ] 생산된 이소부티레이트 [g/ℓ] 이소부탄올 수율
[이론적 %] 		이소부티레이트 수율
[g/g] 		생산된 아세테이트
[g/ℓ]
GEVO3714, (WT ADH, ALD6△ ) 9.7 ± 0.2 10.3 ± 0.1 0.8 ± 0.0 46.5 ± 1.6 0.014 ± 0.000 0.0 ± 0.0
GEVO3855, GEVO3856 (Ll_adhA RE1 , ALD6△) 9.9 ± 0.3 12.0 ± 0.0 0.3 ± 0.0 51.5 ± 0.8 0.005 ± 0.000 0.0 ± 0.0
실시예 7: 이소부탄올 발효의 부산물로서 DH2MB 의 확인
이소부탄올-생산 효모 균주의 발효 동안, 방법 LC1에서 2,3-디히드록시 이소발레레이트 (DHIV)와 공동-용리하고, 그리고 이러한 기초에서 정량된 미지의 피크는 이용된 탄소 중에서 실질적인 부분에 대한 싱크 (sink)로서 기능하는 것으로 밝혀졌다.
초기에, 이러한 피크는 오로지 2,3-디히드록시이소발레레이트 (DHIV)인 것으로 생각되었지만, 차후 연구는 KARI 산물 저해가 이들 수준의 DHIV에서 발생하고, 따라서 이런 농도를 불가능하게 만든다는 것을 지시하였다. 추가의 실험은 이러한 만회된 피크가 효소 검사법에서 DHAD와 반응하지 않고, 따라서 유의미한 양의 DHIV가 존재할 가능성이 배제된다는 것을 증명하였다.
고성능 액체 크로마토그래피 LC1: 2개의 Rezex RFQ-Fast Fruit H+ (8%)150 x 4.6 mm 칼럼 (Phenomenex)이 일련으로 구비된 Agilent-1200 고성능 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 유기 산 대사산물의 분석이 수행되었다. 유기 산 대사산물은 Agilent-1100 UV 검출기 (210 nm) 및 굴절률 (RI) 검출기를 이용하여 검출되었다. 칼럼 온도는 60℃이었다. 이러한 방법은 이동상으로서 0.0128 N H2SO4 (Milli-Q 물에서 25% 0.0512 N H2SO4)와 등용매성이었다. 유속은 1.1 ㎖/min으로 설정되었다. 주입 부피는 20 ㎕이고 작업 시간은 16분이었다.
고성능 액체 크로마토그래피 LC3: 최대 10 mM 알데히드, 케톤과 케토산 중간물질 (합동된)을 내포하는 샘플의 경우에, DNPH 시약이 각 샘플에 1:1 비율로 첨가되었다. 100 ㎕ DNPH 시약 (12 mM 2,4 - 디니트로페닐 히드라진 20 mM 구연산 pH 3.0 80% 아세토니트릴 20% MilliQ H2O)이 100 ㎕의 각 샘플에 첨가되었다. 샘플은 유전자증폭기 (Eppendorf, Mastercycler)에서 70℃에서 30분 동안 배양되었다. 아세토인, 디아세틸, 케토이소발레레이트 및 이소부티르알데히드의 분석은 Eclipse XDB C-18 150 x 4 mm; 5 μm 입자 크기 역상 칼럼 (Agilent) 및 C-18 역상 가드 칼럼 (Phenomenex)이 구비된 Agilent-1200 고성능 액체 크로마토그래피 시스템에서 수행되었다. 모든 분석물은 Agilent-1100 UV 검출기 (360 nm)를 이용하여 검출되었다. 칼럼 온도는 50℃이었다. 이러한 방법은 이동상으로서 60% 아세토니트릴 2.5% 인산 (0.4%), 37.5% 물과 등용매성이었다. 유속은 2 ㎖/min으로 설정되었다. 주입 크기는 10 ㎕이고 작업 시간은 10분이었다.
고성능 액체 크로마토그래피 LC4: IonPac AS11-HC Analytical, IonPac AG11-HC 가드 칼럼 (IonPac ATC 칼럼, Dionex의 경우에 3-4 mm) 또는 등가물 및 IonPac ATC-1 음이온 트랩 칼럼 또는 등가물이 구비된 Agilent-1100 고성능 액체 크로마토그래피 시스템에서 옥소산의 분석이 수행되었다. 옥소산은 전도도 검출기 (ED50-억제 전도도, 억제자 유형: AutoSuppression 리사이클 양식에서 ASRS 4 mm, 억제자 전류: 300 mA)를 이용하여 검출되었다. 칼럼 온도는 35℃이었다. 이러한 방법은 하기 용출 프로필을 이용하였다: 0.25 mM에서 3분 동안 유지; 25분 시점에 5 mM로 선형 구배 (linear gradient); 25.1분 시점에 38.5 mM로 선형 구배, 38.5 mM에서 4.9분 동안 유지; 30.1분 시점에 0.25 mM로 선형 구배; 7분 동안 평형으로 유지. 유속은 2 ㎖/min로 설정되었다. 주입 크기는 5 ㎕이고 작업 시간은 37.1분이었다.
GC-MS: 단일 쿼드 (quad) 320MS가 구비된 Varian 3800CP GC 시스템; DB-5ms 칼럼; 250℃에서 1079 주입 포트; 100 분할비 (split ration)에서 일정한 유속 1.0㎖/min; 오븐 프로필: 최초 온도, 40℃, 5분 동안 유지, 235℃까지 20℃/min의 램프 (ramp)와 2분 동안 유지; 0.5 ㎕의 샘플을 전달하는 combiPAL 오토샘플러; 35 내지 100의 수집된 덩어리. BSTFA 도출: (1) 샘플을 GC 바이알에서 질소 하에 증발 건조시킨다; (2) 0.5 ㎖의 아세토니트릴과 0.5 ㎖의 BSTFA 시약을 첨가한다; (3) 50℃에서 30분 동안 항온처리한다; (4) GC-MS 상에 주입한다.
LC-MS: LC1 피크 분획의 LC-MS 분석을 위해, 샘플은 복수 파장 검출기 및 LC/MSD 트랩 질량 분석계 (이온 트랩)가 구비된 Agilent 1100 Series 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템 내로 주입되었다. 이들 분리는 샘플 내에 성분의 확인을 제공하기 위해, 질량 분석 (mass spectrometry)에 의해 모니터링되었다. 질량 분석계는 샘플 주입을 위한 대기압 화학적 이온화 (APCI) 양식으로 가동되었다. 이들 분석은 양성과 음성 APCI 양식을 이용하여 수행되었다. "미지의 것"의 검출은 음성 이온화 양식에서만 관찰되었다. 분석은 샘플 분석물에 관한 단편화 데이터를 획득하기 위해 MSn을 이용하여 수행되었다. 분리는 5 ㎛ 입자를 갖는 4.6 x 150 mm Agilent Zorbax SB C-18 칼럼을 이용하여 달성되었다. 샘플은 90% HPLC 물과 10% 메탄올의 용리액 (eluent)을 이용하는 등용매성 방법을 이용하여 이동되었다. 10 ㎕ 주입이 샘플 용액의 분석에 이용되었다. 샘플은 또한, 크로마토그래피 칼럼을 우회함으로써 분석되었다.
DHIV와 이의 이성절체, DH2MB는 LC1에서 동일한 체류 시간에서 용리한다. 이들 화합물에 관련된 피크는 발효 샘플 내에 다른 화합물로부터 분리된다. 피크는 HPLC로부터 수집되고 추가 분석에 이용되었다. DHIV (및 DH2MB)에 대한 LC1에서 관찰된 RI 검출기 신호 대(對) UV 검출기 신호의 신호 비율은 통상의 유기 산 (가령, 락테이트, 아세테이트 등)에 특징적이다; 접합된 산 (가령, 피루베이트)은 극히 상이한 RI/UV 신호 비율을 갖는다. 만회된 "피크 DHIV"는 비-접합된 산에 특징적이었다:
비율 (RI/UV): 만회된 DHIV/DH2MB 피크 (130); DHIV Std (150); 피루베이트 (14).
"미스터리 피크"에서 카르보닐 모이어티의 결여는 LC1로부터 만회된 피크 분획 및 DNPH 사이에 반응의 완전한 결여에 의해 확증되었다: LC3 크로마토그래피 시스템에서 부가 피크 없음이 분명하였다.
LC1로부터 만회된 피크 분획은 이후, 알칼리성 조건 하에 작업되는 방법 LC4에 의해 분석되고, 그리고 DHIV와 아세토락테이트를 분리할 수 있다. 이의 결과는 표준 혼합물의 오버레이와 함께, 도 9에서 도시된다. 이것은 DH2MB (이것이 차후에 확인되기 때문에), 그리고 DHIV 사이에 분리를 분명하게 증명한다. 일부 피루베이트 역시 DH2MB 피크의 컬렉션에 들어갔다.
NMR 분석: 방법 LC1로부터 만회된 샘플 피크는 중화되고 냉동 건조되고 NMR 분석을 위해 발송되었다. 1H-COSY NMR (도 10) 및 양성자 NMR 스펙트럼 (도 11)에 의한 2-D 연결도 분석은 우수한 결과를 산출하였다.
DHIV와 함께 용리하는 "미스터리 피크"의 2-D 분석 (도 10): 다운필드 전위된 하나의 메틸 기는 임의의 인접하는 양성자에 의해 분할되지 않고, 여기서 0.95 ppm에서 메틸 기는 히드록실에 인접하는 하나의 양성자에 의해 이중항으로 분할된다. 양성자는 차례로, 인접하는 메틸 기에 의해 사중항으로 분할된다. 3.1과 3.7 ppm 사이에 복잡한 패턴은 "DHIV"의 피크 컬렉션 동안 운반된 글루코오스의 상이한 아노머 (anomer)를 지시한다.
NMR 피크의 지정은 하기 스펙트럼 (도 11)에서 도시되고, "미스터리 피크"의 실체가 2,3-디히드록시-2-부티레이트 (DH2MB)라는 것을 분명하게 지시한다.
1H NMR과 COSY 스펙트럼은 디히드록시이소발레르산의 구조적 이성질체인 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산의 존재를 뒷받침한다. 이들 스펙트럼에서 다른 신호는 아노머 단백질, 따라서 당 성분의 존재를 뒷받침한다. 게다가, 3.1-3.8 ppm 사이에 신호의 복잡한 집단화 (grouping)는 종종, 올리고사카라이드에서 관찰된다. 13C NMR 스펙트럼은 매우 약하고, 그리고 기준선 (base line)에 미치지 못하는 45 ppm에서 신호에 기초된 첨부된 양성자 검사 (Attached Proton Test, APT) 실험인 것으로 보인다.
LC-MS 역시 LC1 피크 분획에서 수행되었다. LC-MS는 상기 화합물이 134의 질량 (DHIV와 DH2MB 둘 모두)을 갖는다는 것을 증명하는데 충분하였다 (도 12).
이러한 분석은 미지의 부산물을 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (CAS # 14868-24-7)으로 최종적으로 확인하였다. 상기 화합물은 4가지 상이한 입체이성질체 형태 (stereoisomeric form)로 존재한다. 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산은 일단의 시스 (cis)와 트랜스 (trans) 부분입체이성질체 (diastereomer)로서 존재하고, 이들 각각은 일단의 거울상이성질체 (enantiomer)로서 존재한다. 이들 4가지 화합물은 도 13에 도시된다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, DH2MB는 (2S)-2-히드록시-2-메틸-3-옥소부티레이트 (아세토락테이트)로부터 유래된다. 이러한 반응의 산물은 (2S,3R)-2,3-디히드록시-2-메틸부탄산, (2S,3S)-2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 또는 이들 두 부분입체이성질체의 혼합물일 수 있는데, 이것은 이러한 전환을 촉진하는 내생성 효소(들)의 입체선택성 (stereoselectivity)에 좌우된다.
실시예 8: DH2MB의 생산과 정제
본 실시예의 목적은 DH2MB가 어떻게 생산되고 정제되는 지를 예시하는 것이다.
플라스미드 pGV2247 (Ec_ilvC_P2D1-A1, Ll_ilvD, Ll_kivD2, 그리고 Ll_adhA의 발현을 위한 2-마이크론, G418 내성 플라스미드)을 발현하는, ALS 활성을 포함하는 조작된 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2 균주 (GEVO3160, 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2: MATa ura3 leu2 his3 trp1 gpd1△::P CCW12 : Hph gpd2△::T Kl_URA3 _ short : P FBA1 : Kl_URA3: T Kl_URA3 pdc1△::P CUP1 : Bs_alsS_coSc: T CYC1 : P PGK1 : Ll_kivD: P ENO2 _ Sp _HIS5 pdc5△::LEU2: bla: P TEF1 : ILV3△N: P TDH3 : ilvC_coSc_Q110V pdc6△::P TEF1 : Ll_ilvD_P TDH3 : Ec_ilvC_coSc_P2D1-A1: P ENO2 : Ll_adhA: P FBA1 : Sc_TRP1 {C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨})는 30℃, pH6.0, 그리고 대략 10 mmol/h의 OTR에서 1L 배양 배지 배지 (10 g/ℓ 효모 추출물, 20 g/ℓ 펩톤, 80 g/ℓ 글루코오스, 1% v/v 에탄올, 100 μM CuSO4ㆍ5H20, 0.2 g/ℓ G418)로 채워진 2 ℓ 탑 드라이브 모터 DasGip 용기를 이용한 배치 발효 (batch fermentation)에서 대략 10 g/ℓ DH2MB를 생산하는데 이용되었다.
세포-없는 발효액은 농축된 H2SO4를 이용하여 pH 2로 산성화되었다. 산성화된 배양액은 Buchi Rotovapor R-215를 이용하여 감압 (0-100 mbar) 하에 350 ㎖로 농축되었다. 배양액을 내포하는 플라스크는 증발 동안 물 전해조에서 20-30℃로 가열되었다. 70 ㎖ 부피의 MeOH가 농축된 배양액에 첨가되고, 그리고 혼합물은 500 ㎖ 액체-액체 추출기 (Sigma-Aldrich cat. # Z562432)로 이전되고, 상기 추출기는 에틸 아세테이트 (EtOAc)로 연속 추출을 위해 제조업체의 명세에 따라 설치되었다. 연속 추출은 3일 동안, EtOAc 추출물을 매일 새로운 EtOAc로 교체하면서 수행되었다.
추출후, EtOAc 내에서 DH2MB 추출물의 첫 2개의 배치 (batch)는 합동되고 무수성 MgSO4로 건조되고, 그 이후에 여과되었다. 건성 추출물은 진공 하에 500 ㎖까지 농축되고 실온에서 교반에 의해 30분 동안 3 g의 활성화된 목탄 (Fluka cat# 05105)으로 처리되었다. 탈색된 용액은 여과되고 진공 (Buchi Rotovapor R-215를 이용하여 0-100 mbar) 하에 대략 50 ㎖로 농축되었다. 용액은 4℃에서 2일 동안 배양되었다. 획득된 결정은 여과되고 얼음같이 차가운 디에틸에테르와 아세톤으로 세척되었다. 결정은 감압 (0.05 mbar) 하에 하루 동안 냉동 건조기를 이용하여 건조되었다.
단리된 DH2MB는 1H (도 14)와 13C (도 15) NMR에 의해 분석되었다. 1H NMR (TSP) 1.1 (d, 6.5 Hz, 3H), 1.3 (s, 3H), 3.9 (q, 6.5 Hz, 3H). 13C 스펙트럼은 샘플 내에 존재하는 5가지 상이한 탄소 원자를 지시하였다. 181 ppm에서 공명은 샘플 내에 존재하는 카르복실산 탄소를 지시하였다. 결론적으로, NMR 스펙트럼에 기초하여 단리된 DH2MB의 99% 순도를 추정할 수 있었다.
실시예 9: 발효 동안 이소부탄올 수율에 대한 DH2MB 생산의 영향
본 실시예의 목적은 DH2MB가 ALS와 TMA29 활성을 포함하는 효모 균주에서 실질적인 수준으로 축적된다는 것을 증명하는 것이다.
본 실시예에서 개시된 균주와 플라스미드는 각각, 표 34와 35에서 제시된다.
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO3160의 유전형.
균주 유전형
GEVO3160 MATa ura3 leu2 his3 trp1 gpd1△::[P CCW12 : hph] gpd2△::[T Kl_URA3_short : P FBA1 : Kl_URA3:T Kl_URA3 ] pdc1△:: [P CUP1 : Bs_alsS_coSc: T CYC1 : P PGK1 : Ll_kivD: P ENO2 : Sp_HIS5] pdc5△::[LEU2: bla: P TEF: -ILV3△N: P TDH3 : Ec_ilvC_coSc Q110V ] pdc6△:: [P TEF1 : Ll_ilvD_P TDH3 : Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 : P ENO2 : Ll_adhA: P FBA1 : Sc_TRP1]{C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨} pGV2247
플라스미드 pGV2247의 유전형.
플라스미드 유전형
pGV2247 P Sc_TEF1 : Ll_ilvD_coSc, P Sc_TDH3 : Ec_ilvC_coSc P2D1A1 , P Sc_TPI1 : G418R,
P Sc_PGK1 : Ll_kivD_coEc, P Sc_ENO2 : Ll_adhA, 2μ, APr, PMB1
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO3160은 앞서 기술된 바와 같이 pGV2247로 형질전환되었다. 형질전환된 균주를 특징짓기 위해 발효가 수행되었다. 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 YPD 아가 평판 상에서 성장된 단일 격리된 세포 집락이 80 g/ℓ 글루코오스, 1% v/v 에탄올, 100 μM CuSO4ㆍ5H20, 그리고 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 5 ㎖의 YPD 배지를 포함하는 500 ㎖ 차단된 플라스크로 이전되고 30℃와 250 rpm에서 24시간 동안 배양되었다. 그 다음, 상기 배양액은 80 ㎖의 동일한 배지를 내포하는 500 ㎖ 차단된 플라스크로 이전되고 250 rpm으로 오비탈 교반기에서 30℃에서 24시간 동안 배양되었다. 플라스크 배양액은 0.5의 출발 OD600을 위해 0.9 ℓ의 작업 부피의 동일한 배지를 갖는 2 ℓ 탑 드라이브 모터 발효조 용기로 이전되었다. 발효조는 30℃와 pH 6.0에서 가동되고, 그리고 산소 전달 속도 (OTR)에 기초된 2-기 (phase) 호기성 조건하에 6N KOH로 제어되었다. 초기에, 발효조는 양쪽 실험에서 700 rpm의 고정된 휘저음 및 5 sL/h의 공기 오버레이 (air overlay)에 의해 10 mM/h의 성장기 OTR에서 가동되었다. 배양액은 대략 8의 OD600까지 대략 20시간 동안 성장되고, 그 직후에 생산 통기 조건으로 전환되었다. 1 mM/h의 OTR은 휘저음을 700 rpm에서 350 rpm으로 감소시킴으로써 지속되었다. 접종후 93시간 시점에, 각 균주로부터 하나의 복제물 용기는 휘저음을 350 rpm에서 180 rpm으로 감소시킴으로써 OTR = 0.3 mM/h로 더욱 감소되었다. 주기적으로, 각 발효조로부터 샘플은 OD600을 측정하고, 그리고 가스 크로마토그래피 (GC1) 분석 및 액체 크로마토그래피 (LC1) 분석에 대비하기 위해 이동되었다. GC1과 LC1을 위해, 2 ㎖의 샘플이 에펜도르프 튜브로 이동되고 10분 동안 최대 rpm으로 마이크로원심분리기에서 원심분리되었다. 1 ㎖의 상층액은 GC1 (이소부탄올, 기타 대사산물)에 의해 분석되고, 그리고 1 ㎖는 고성능 액체 크로마토그래피 (LC1)에 의해 유기 산과 글루코오스에 대해 분석되었다.
도 16에서는 pGV2247로 형질전환된 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) GEVO3160의 산물과 부산물 프로필을 도시한다. 이들 프로필은 이소부탄올 생산 Pdc-마이너스, Gpd-마이너스 효모 균주를 표시한다. Pdc-마이너스/Gpd-마이너스 효모 생산 균주는 공동 소유된 동시-계속 출원, US 2009/0226991과 US 2011/0020889에서 기술되는데, 이들 모두 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 도 16에서는 이소부탄올 (13.9 g/ℓ) 및 "DHIV"로서 정량되고 DH2MB (8.4 g/ℓ)로서 확인된 미지의 화합물이 미세호기성 생산 OTR 동안 생산된 일차 산물이라는 것을 보여준다. DHIV의 반응률 (response factor)을 이용한 정량이 DH2MB의 정확한 정량을 유발한다고 가정하면, 소비된 탄소 중에서 대략 12-13%는 DH2MB의 생산으로 전환된다. DH2MB로 전환되는 아세토락테이트가 그 대신에 이소부탄올로 전환되면, 도 16에서 도시된 발효의 전체 기간 동안 이소부탄올 수율이 훨씬 높을 것이다.
실시예 10: ALS 발현은 DH2MB 생산에 필수적이다
본 실시예의 목적은 외생성으로 발현된 ALS 활성이 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)에서 DH2MB 축적에 필수적이라는 것을 증명하는 것이다.
본 실험은 ALS가 DH2MB의 생산에 필수적인 지를 결정하기 위해 실행되었다. 본 실험에 이용된 균주는 GEVO1187 (사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2; MATa ura3 -52 leu2 -3_112 his3 △1 trp1 -289 ADE2) 및 GEVO2280 (사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2; MATa ura3 leu2 his3 trp1 ADE2 pdc1 △::P CUP11 :Bs_alsS2:TRP1)이었다. 발효에 앞서, 양쪽 균주는 앞서 기술된 바와 같이 2 마이크론 플라스미드 pGV2082 (P TDH3 :Ec_ilvC_coSc Q110V , P TEF1 :Ll_ilvD_coSc, P PGK1 :Ll_kivD_coEc, and P ENO2 :Dm_ADH, 2μ ori, bla, G418R)로 형질전환되었다.
ALS 활성을 측정하기 위해, GEVO1187과 GEVO2280으로부터 효모 세포 추출물이 준비되었다. 세포는 대략 1의 OD600까지 성장되고, 1 mM CuSO4로 2시간 동안 유도되고, 이후 수확되었다. 검사를 위한 세포를 준비하기 위해, 50 ㎖의 세포가 2700 x g로 원심분리에 의해 수집되었다. 배지의 제거후, 세포는 무균 dH2O에서 재현탁되고, 2700 X g로 원심분리되고, 그리고 남아있는 배지가 1 ㎖ 피펫 팁 (pipette tip)을 이용하여 조심스럽게 제거되었다. 세포 펠릿은 칭량되고 (빈 튜브가 미리 칭량되었다), 이후 이용될 때까지 -80℃에서 동결되었다. 세포 용해물은 아래에 기술된 바와 같이 하기 SOP를 이용하여 준비되었다. 세포는 얼음 위에서 해동되고, 그리고 결과물이 질량으로 20% 세포 현탁액이 되도록 용해 완충액 (250 mM KPO4 pH 7.5, 10 mM MgCl2 및 1 mM DTT)에서 재현탁되었다. 1000 ㎕ 부피의 유리 비드 (glass bead) (0.5 mm 직경)가 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 첨가되고 875 ㎕의 세포 현탁액이 첨가되었다. 효모 세포는 각각 전속에서 6 X 1분 혼합 및 그 사이에 1분 결빙 단계에 의해, Retsch MM301 믹서 밀 (mixer mill) (Retsch Inc. Newtown, PA)을 이용하여 용해되었다. 이들 튜브는 4℃에서 10분 동안 23,500xg로 원심분리되고, 그리고 상층액이 이동되었다. 추출물은 검사 때까지 얼음 위에 유지되었다. 용해물 단백질 농도는 앞서 기술된 바와 같이, BioRad Bradford 단백질 검사 시약 키트 (Cat# 500-0006, BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하고, 그리고 표준 곡선의 경우에 BSA를 이용하여 측정되었다. 간단히 말하면, 모든 ALS 검사는 기질과 함께 및 기질 없이, 각 용해물에 대해 삼중으로 수행되었다. 각 용해물을 검사하기 위해, 용해 완충액으로 1:2 희석된 100 ㎕의 용해물은 900 ㎕의 완충액 (50 mM 인산칼륨 완충액 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM 티아민-피로포스페이트, 110 mM 피루베이트)과 혼합되고, 그리고 30℃에서 15분 동안 배양되었다. 완충액은 실온에서 제조되었다. 기질 없음 대조 (피루베이트가 없는 완충액) 및 용해물 없음 대조 (용해물 대신에 용해 완충액) 역시 포함되었다. 배양후, 각 반응물로부터 175 ㎕가 25 ㎕의 35% H2SO4와 혼합되고 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 샘플은 LC1에 의해 분석되었다. 이러한 방법을 이용하여, 야생형 균주 GEVO1187은 검출가능한 ALS 활성을 갖지 않는 반면, ALS-발현 균주 GEVO2280은 0.65 단위/mg 용해물 ALS 활성을 갖는 것으로 결정되었다.
이들 두 균주 (이종기원성 ALS 통합된 발현 구조체와 함께 또는 이러한 구조체 없이)의 성과는 하기 교반 플라스크 발효 조건을 이용하여 비교되었다. 균주는 0.2 mg/㎖ G418을 내포하는 YPD 평판 상에 패칭 (patching)되었다. 하룻밤 성장후, 세포는 무균 이쑤시개로 평판으로부터 이동되고 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 4 ㎖의 YPD에서 재현탁되었다. 각 배양액에 대한 OD600이 측정되었다. 0.1의 최종 OD600이 획득되도록, 세포가 50 g/ℓ 덱스트로스와 0.2 mg/㎖ G418을 내포하는 50 ㎖ YP에 첨가되었다. ALS 발현을 주동하는 CUP1 프로모터를 유도하기 위해, 1mM 황산구리가 24시간 시점에서 첨가되었다. 이용되지 않는 배지는 GC와 LC를 위한 배지 블랭크 (medium blank)로서 기능하고, 그리고 발효의 경우에 t=0 샘플로서 기능하기 위해 4℃에서 보관되었다. t=24, 48과 72시간 시점에서 샘플이 GC1에 의한 분석을 위해 준비되고, 그리고 72시간 시점에서 샘플이 LC1에 의해 추가적으로 분석되었다. 24와 48시간 시점에서, 각 배양액의 상층액의 1:10 희석액이 YSI에 의해 분석되었다. 필요한 경우에, 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 50% 글루코오스가 100 g/ℓ 글루코오스의 최종 농도로 첨가되었다. 발효는 250 RPM으로 교반하면서 30℃에서 수행되었다.
72시간의 교반 플라스크 발효에서 도달된 DH2MB 역가는 ALS가 없는 WT 균주 (BUD1187) 및 PDC1에서 P CUP1 :Bs_alsS2를 발현하는 균주 (BUD2280) 둘 모두에 대해 LC1 방법을 이용하여 측정되었다. 각 균주는 4-성분 플라스미드 pGV2082로 형질전환되었다. 발효는 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다. 외생성 ALS 발현이 없는 균주는 DH2MB를 생산하지 못하는 반면, ALS 발현을 갖는 균주는 최대 1.4 g/ℓ DH2MB + DHIV를 생산하였다.
실시예 11: 단지 ALS 발현만 DH2MB 생산에 필수적이다
본 실시예의 목적은 ALS 활성 단독이 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)에서 DH2MB 축적을 책임진다는 것을 증명하는 것이다.
본 실험은 단독으로 또는 KARI, DHAD, KIVD, ADH 발현 플라스미드와 공동으로 ALS가 DH2MB의 생산을 책임지는 지를 결정하기 위해 실행되었다. 본 실험에서 이용된 균주는 GEVO2618 (MATa ura3 leu2 his3 trp1 pdc1△::[P CUP1 : Bs_alsS1_coSc: TRP1)이었다. 본 실험에서 조사된 플라스미드는 나머지 4가지 경로 유전자 (- P TEF1 :Ll_ilvD_coSc: P TDH3 :Ec_ilvC_coScQ110V:P Sc_TPI1 : G418: P PGK1 : Ll_kivD2_coEc:PDC1-3'영역: P ENO2 : Ll _ adhA 2μ bla, pUC-ori)를 내포하는 pGV2227, 그리고 pGV2020, 빈 벡터 대조 (P Sc _ TEF1 , P Sc _ TPI1 , G418R, APr, 2μ)이었다.
pGV2020로 형질전환된 GEVO2618 및 pGV2227로 형질전환된 GEVO2618의 교반 플라스크 배양은 OD600 ~0.1에서 200 mM MES pH6.5 및 0.4 g/ℓ G418을 내포하는 YPD (15% 글루코오스)에서 시작되고, 그리고 교반 배양기에서 30℃와 75 rpm에서 진행되었다. 샘플은 24시간과 48시간 시점에 채취되고, 그리고 이들 샘플은 HPLC (LC1)와 GC (GC1)에 의해 대사산물 수준에 대해 분석되었다. 48시간후, 모든 글루코오스가 양쪽 균주에 의해 배지로부터 소비되었다. 빈 벡터를 내포하는 균주 (GEVO2618 + pGV2020)는 3.8% 수율을 의미하는 4.6 g/ℓ의 DHIV + DH2MB를 생산하였다. 추가의 4가지 경로 유전자를 발현하는 벡터를 내포하는 균주 (GEVO2618 + pGV2227)는 3.1% 수율을 의미하는 5.6 g/ℓ의 유사한 역가의 DHIV + DH2MB를 생산하였다.
실시예 12: DH2MB 생산에 대한 증가된 KARI 활성의 효과
본 실시예의 목적은 증가된 KARI 활성이 ALS 활성을 포함하는 효모에서 감소된 DH2MB 생산을 유발하는 지를 증명하는 것이다.
본 실시예에서 개시된 균주와 플라스미드는 각각, 표 36과 37에서 제시된다.
실시예 12에서 개시된 균주의 유전형.
균주 유전형
GEVO2843 S. cerevisiae, MATa ura3 leu2 his3 trp1
pdc1△::P CUP1 :[Bs_alsS1_coSc:T CYC1 : P PGK1 : Ll_kivD2: P ENO2 : Sp_HIS5]
pdc5△::[LEU2: bla: P TEF1 : ILV3△N: P TDH3 : Ec_ilvC_coSc Q110V ]
pdc6△::[URA3: bla: P TEF1 : Ll_kivD2: P TDH3 : Dm_ADH ]
{C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
실시예 12에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 유전형
pGV2196 CEN, ARS, hph, bla, pUC-ori.
pGV2377 P TEF1 : Ll_ilvD_coSc, P ScPGK1 : Ll_kivD_coEc, P ScENO2 : Ll_adhA, 2μ ori, pUC ori, bla, G418R
pGV2466 P TEF1 : Ll_ilvD_coSc, P SCTDH3 : Ec_ilvC_coSc his6 , P ScPGK1 : Ll_kivD_coEc, P ScENO2 : Ll_adhA, 2μ ori, pUC ori, bla, G418R
pGV2398 P TEF1 : Ll_ilvD_coSc, P SCTDH3 : Ec_ilvC_coSc Q110V-his6 , P ScPGK1 : Ll_kivD_coEc, P ScENO2 :Ll_adhA, 2μ ori, pUC ori, bla, G418R
pGV2400 P TEF1 : Ll_ilvD_coSc, P SCTDH3 : Ec_ilvC_coSc P2D1-A1-his6 , P ScPGK1 : Ll_kivD_coEc, P ScENO2 : Ll_adhA, 2μ ori, pUC ori, bla, G418R
pGV2406 P Sc_TEF1: Ec_ilvC_coSc Q110V-his6 , CEN, ARS, hph, bla, pUC ori.
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO2843은 야생형 또는 조작된 KARI의 발현이 DH2MB의 더욱 큰 축적을 유발하는 지를 결정하기 위해, 앞서 기술된 바와 같이 2μ 플라스미드 pGV2377, pGV2466, pGV2398, 그리고 pGV2400로 형질전환되었다.
2μ 플라스미드 (pGV2377, 2466, 2398, 2400)로 형질전환된 GEVO2843의 전배양은 1% 에탄올 및 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 YPD에서 시작되고 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 이들 전배양액은 차단된 플라스크에서 50 ㎖의 동일한 배지를 접종하는데 이용되고 ~5의 OD600에 도달할 때까지 30℃와 250 rpm에서 배양되었다. 이들은 25℃에서 5분 동안 2700 rcf로 50 ㎖ Falcon 튜브에서 펠릿화되었다. 그 다음, 각 50 ㎖ 배양액으로부터 세포는 8% 글루코오스, 1% (v/v) 에탄올, 에르고스테롤, Tween-80, 0.2 g/ℓ G418, 그리고 200 mM MES, pH6.5를 내포하는 50 ㎖ YPD에서 재현탁되었다. 배양액은 250 ㎖ 차단되지 않은 플라스크에 첨가되고 30℃와 75 rpm에서 배양기에 배치되었다. 샘플은 OD600을 측정하고, 그리고 발효액을 GC1과 LC1 분석으로 세포외 대사산물에 대해 분석하기 위해 72시간후 채취되었다.
표 38에서는 pGV2377로 형질전환된 균주 (플라스미드로부터 임의의 KARI 유전자를 과다발현하지 않음)가 합동된 DH2MB + DHIV에 대한 15%의 가장 높은 탄소 수율을 생산하는 반면, pGV2466 (Ec_ilvC_coSchis6을 내포함), pGV2398 (Ec_ilvC_coScQ110V-his6을 내포함), 그리고 pGV2400 (Ec_ilvC_coScP2D1-A1-his6을 내포함)을 갖는 균주가 8-10%의 유사한 합동된 DH2MB + DHIV 탄소 수율을 갖는다는 것을 보여준다. 유사하게, pGV2377로 형질전환된 균주는 6%의 가장 낮은 탄소 수율에서 이소부탄올을 생산하였다. 플라스미드 상에서 KARI 유전자를 포함하는 나머지 균주는 더욱 높은 탄소 수율에서 이소부탄올을 생산하였다.
감소된 DH2MB 생산이 증가된 이소부탄올 생산과 상관한다는 관찰 결과는 DH2MB가 KARI를 필요로 하지 않는 반응을 거쳐 아세토락테이트로부터 생산된다는 조사 결과와 일치한다.
이소부탄올 및 합동된 DH2MB + DHIV 탄소 수율
균주 플라스미드 KARI 이소부탄올 탄소
수율 [%] 		DH2MB + DHIV 탄소
수율 [%]
GEVO2843 pGV2377 n/a 6 15
GEVO2843 pGV2466 Ec_ilvC_coSchis6 18 8
GEVO2843 pGV2398 Ec_ilvC_coScQ110V-his6 15 8
GEVO2843 pGV2400 Ec_ilvC_coScP2D1-A1-his6 18 10
두 번째 실험이 실행되었는데, 여기서 균주는 플라스미드로부터 KARI를 발현하지 않거나, 낮은 수준의 KARI를 발현하거나, 또는 높은 수준의 KARI를 발현하였다. 본 실험에서, 세포 용해물의 KARI 활성이 측정되었다.
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO2843은 표 37에서 기술된 바와 같은 플라스미드의 조합에서 기술된 바와 같이 형질전환되었다; KARI 없음 균주는 pGV2377 + pGV2196을 내포하고 플라스미드-유래 KARI을 갖지 않았고, 낮은 KARI 균주는 pGV2377 + pGV2406을 내포하고 낮은 사본 플라스미드로부터 KARI를 발현하고, 그리고 높은 KARI 균주는 pGV2398 + pGV2196을 내포하고 높은 사본 플라스미드로부터 KARI를 발현하였다. 발효 및 샘플링 (sampling)은 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다. GC1과 LC1 방법은 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다. KARI 검사를 위한 세포는 용해 완충액이 250 mM KPO4 pH 7.5, 10 mM MgCl2 및 1 mM DTT인 점을 제외하고, 앞서 기술된 바와 같이 용해되었다. 용해물의 단백질 농도는 앞서 기술된 바와 같이 측정되었다.
시험관내 KARI 활성을 측정하기 위해, 아세토락테이트 기질이 50 ㎕의 에틸-2 아세톡시-2-메틸-아세토아세테이트를 990 ㎕의 물과 혼합함으로서 만들어졌다. 그 다음, 260 ㎕의 NaOH가 첨가될 때까지 10 ㎕의 2 N NaOH가 순차적으로 첨가되고, 첨가 간에 15초 동안 와동 혼합되었다. 아세토락테이트는 실온에서 20분 휘저어지고 얼음 위에 유지되었다. NADPH는 0.01N NaOH에서 50 mM의 농도로 준비되었다. 상기 농도는 분광광도계에서 340 nm에서 희석된 샘플의 OD를 판독하고, 그리고 정확한 농도를 계산하기 위해 6.22 M-1cm-1의 몰 흡광 계수 (molar extinction coefficient)를 이용함으로써 결정되었다. 3가지 완충액이 준비되고 얼음 위에 유지되었다. 반응 완충액은 250 mM KPO4 pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 10 mM 아세토락테이트, 그리고 0.2 mM NADPH를 내포하였다. 기질 없음 완충액은 아세토락테이트가 제외되었다. NADPH 없음 완충액은 NADPH가 제외되었다. 반응은 SpectraMax 340PC 다중-평판 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 내에 96-웰 평판에서 90 ㎕의 반응 완충액과 함께 10 ㎕의 세포 추출물을 이용하여 삼중으로 수행되었다. 반응은 5분 동안 동역학적 곡선을 측정함으로써 340 nm에서 추적되고, OD가 30℃에서 10초마다 판독되었다. 각 추출물에 대한 Vmax는 완전한 완충액에서 시도로부터 기질 없음 대조의 배경 시도 (background reading)를 뺄셈한 이후 측정되었다.
표 39에서는 이소부탄올 및 합동된 DH2MB + DHIV에 대한 탄소 수율 (%)뿐만 아니라 KARI 활성에 대한 데이터를 보여준다. KARI 활성이 증가함에 따라서, 이소부탄올 탄소 수율이 증가하고 합동된 DH2MB + DHIV 탄소 수율이 감소하였다.
KARI 활성, 이소부탄올 및 합동된 DH2MB + DHIV 탄소 수율.
균주 플라스미드 KARI 활성 μmol/min/mg 이소부탄올 탄소 수율 [%] DH2MB + DHIV 탄소 수율 [%]
GEVO2843 pGV2377 + pGV2196 0.011 ± .002 5 19
GEVO2843 pGV2377 + pGV2406 0.030* 11* 16*
GEVO2843 pGV2398 + pGV2196 0.151 ± .005 19 11
*이 데이터는 한 가지 샘플만을 포함한다
실시예 13: 증가된 DHAD 활성의 효과
본 실시예의 목적은 증가된 DHAD 활성이 ALS 활성을 포함하는 효모에서 감소된 DH2MB 생산을 유발한다는 것을 증명하는 것이다.
본 실시예에서 개시된 균주와 플라스미드는 각각, 표 40과 41에서 제시된다.
GEVO2843은 상이한 쌍의 플라스미드로 형질전환되었다. 균주 A는 pGV2227 + pGV2196을 내포한다. 균주 B는 pGV2284 + pGV2196을 내포한다. 균주 C는 pGV2284 + pGV2336을 내포한다. 이들 3가지 2-플라스미드 조합 중에서 한 가지로 BUD2843의 단일 형질전환체는 히그로마이신을 내포하는 YPD 평판 상에서 단일 집락 정제되고, 그리고 패칭된 세포는 1% 에탄올 (v/v), 0.2 g/ℓ G418 및 0.1 g/ℓ 히그로마이신을 내포하는 3 ㎖ YPD를 접종하는데 이용되었다. 배양액은 1% 에탄올 (v/v), 0.2 g/ℓ G418 및 0.1 g/ℓ 히그로마이신을 내포하는 3 ㎖ YPD를 접종하는데 이용되기에 앞서, 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 이들 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 익일에, 배양액은 8% 글루코오스, 200 mM MES pH6.5, 에르고스테롤 및 Tween80을 내포하는 50 ㎖ YPD를 대략 0.1의 OD600까지 접종하는데 이용되었다. 이들 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 익일에, 배양액은 50 ㎖의 동일한 배지에서 ~0.1의 OD600까지 희석되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 배양되고, 그리고 0, 24, 47, 70, 그리고 92시간의 배양후 1.5 ㎖ 샘플이 이동되었다. 이들 샘플은 앞서 기술된 바와 같이 GC와 LC 분석에 대비되었다. 92시간후, 나머지 모든 샘플은 원심분리되고, 그리고 펠릿은 칭량되고 -80℃에서 보관되었다. DHAD 검사는 앞서 기술된 바와 같이, 동결된 펠릿으로부터 준비된 용해물로 수행되었다. LC1과 GC1 분석은 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다.
실시예 13에서 개시된 균주의 유전형.
균주 유전형
GEVO2843 MATa ura3 leu2 his3 trp1 pdc1△::[P CUP1 :Bs_alsS_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivD:P ENO2 :Sp_HIS5] pdc5 △::[LEU2:bla:P TEF1 :Sc_ILV3△N:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc Q110V ] pdc6△::[URA3:bla:P TEF1 :Ll_kivD:P TDH3 :DmADH]
{C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
실시예 13에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 유전형
pGV2227 P Sc_TEF1 : Ll_ilvD_coSc, P Sc_TDH3 : Ec_ilvC_coSc Q110V , P Sc_TPI1 : G418, P Sc_PGK1 : Ll_kivD_coEc, P Sc_ENO2 : Ll_adhA, 2μ, APr, PMB1
pGV2284 P Sc_TEF1 , P Sc_TDH3 : Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 , P Sc_TPI1 : G418, P Sc_PGK1 : Ll_kivD_coEc, P Sc_ENO2 : Ll_adhA, 2μ, APr, PMB1
pGV2196 P Sc_PGK1 P Sc_TEF1 , P Sc_TPI1 : hph, CEN, APr, pUC ORI
pGV2336 P Sc_ENO , T ScPDC6 P Sc_PGK , P Sc_TEF1 : Ll_ilvD_coSc P Sc_TDH3 , P Sc_TPI1 : hph, CEN, APr, pUC ORI
표 42에서는 DHAD 활성, 이소부탄올 수율 및 합동된 DHIV + DH2MB 수율을 보여준다. pGV2284 + pGV2196으로 형질전환된 균주 (플라스미드로부터 발현된 DHAD 없음)는 합동된 DH2MB + DHIV에 대한 19%의 가장 높은 탄소 수율 및 이소부탄올에 대한 9%의 가장 낮은 탄소 수율을 산출하였다. pGV2227 + pGV2196으로 형질전환된 균주 (플라스미드로부터 최대 DHAD 발현)는 합동된 DH2MB + DHIV에 대한 9%의 가장 낮은 탄소 수율 및 이소부탄올에 대한 18%의 가장 높은 탄소 수율을 산출하였다. pGV2284 + pGV2336으로 형질전환된 균주 (플라스미드로부터 낮은 사본 DHAD 발현)는 합동된 DH2MB + DHIV에 대한 16% 및 이소부탄올에 대한 12%의 중간 탄소 수율을 산출하였다.
92시간 발효에서 DHAD 활성, 이소부탄올 및 합동된 DH2MB + DHIV 탄소 수율.
균주 플라스미드 DHAD 활성 이소부탄올 탄소 수율 [%] DH2MB + DHIV 탄소 수율 [%]
A pGV2227 + pGV2196 0.29 ± 0.05 18 9
B pGV2284 + pGV2196 0.05 ± 0.00 9 19
C pGV2284 + pGV2336 0.08 ± 0.01 12 16
두 번째 실험에서, GEVO2843은 상이한 쌍의 플라스미드 (표 43)로 형질전환되고 앞서 기술된 바와 같은 교반 플라스크 발효액에서 평가되었다. 균주 D는 pGV2196 + pGV2589를 내포한다. 균주 E는 pGV2529 + pGV2589를 내포한다. 균주 F는 pGV2196 + pGV2485를 내포한다. pGV2196 + pGV2589로 형질전환된 균주 (플라스미드-유래 DHAD 없음)는 1.25 g/ℓ 이소부탄올 및 5.67 g/ℓ DH2MB + DHIV를 생산하였다. 높은-사본 플라스미드로부터 발현된 DHAD를 갖는 균주 (pGV2196 + pGV2485)는 2.74 g/ℓ 이소부탄올 및 3.71 g/ℓ DH2MB + DHIV를 생산하였는데, 이것은 DHAD 발현에서 증가가 DH2MB + DHIV 축적에서 감소를 유발한다는 것을 지시하였다. 낮은-사본 플라스미드로부터 발현된 DHAD를 갖는 균주 (pGV2529 + pGV2485)는 중간 수준의 양쪽 대사산물을 생산하였는데, 이것은 중간 수준의 DHAD 활성과 일치하였다.
실시예 13에서 개시된 추가의 플라스미드.
플라스미드 유전형
2196 P Sc_PGK1 , P Sc_TEF1 , P Sc_TPI1 hph, CEN, AP r , pUC ORI
2529 P Sc_PGK1 , P Sc_TEF1 Ll_ilvD_coSc4, P Sc_TPI1 hph, CEN, AP r , pUC ORI
2589 P Sc_TDH3 Ec_ilvC_coSc_Q110V, P Sc_TPI1 G418R, P Sc_ENO2 Ll_ adhA, 2μ, AP r , PMB1
72시간 발효에서 DHAD 활성, 이소부탄올 역가와 수율, 그리고 합동된 DH2MB + DHIV 역가.
균주 플라스미드(들) 플라스미드-유래 DHAD 이소부탄올 역가 (g/ℓ) 이소부탄올 수율 (%) DH2MB + DHIV (g/ℓ)
D pGV2196 + pGV2589 없음 1.25 ± 0.27 16.1 5.67 ± 0.29
E pGV2529 + pGV2589 낮은 사본 2.15 ± 0.05 24.8 5.00 ± 0.20
F pGV2196 + pGV2485 높은 사본 2.74 ± 0.22 31.0 3.71 ± 0.11
실시예 14: 표적화된 결실에 의한 사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )에서 TMA29 의 결실
하기 실시예에서는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 유전체로부터 TMA29 유전자의 결실이 아세토락테이트 신타아제가 과다발현될 때 DH2MB의 생산을 제거한다는 것을 예증한다.
TMA29 유전자 산물을 비롯하여, DH2MB의 생산을 촉진할 수 있는 몇몇 환원효소 후보가 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 유전체에서 확인되었다. 이들 환원효소를 인코딩하는 유전자는 URA3 마커의 통합을 이용하여, g/ℓ 양의 DH2MB를 생산하는 것으로 알려져 있는 균주인 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO2618에서 결실되었다. TMA29를 비롯한 임의의 후보 유전자의 결실이 DH2MB의 생산을 감소시키거나 제거하는 지를 결정하기 위해, 이들 균주로 발효가 수행되었다.
균주, 플라스미드, 그리고 프라이머 서열은 각각, 표 45, 46, 그리고 47에 열거된다.
실시예 14에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO No. 유전형
GEVO1187 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2 MATa ura3-52 leu2-3_112 his3△1 trp1-289 ADE2
GEVO2618 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), MATa ura3 leu2 his3 trp1 pdc1△::[P CUP1-1 : Bs_alsS1_coSc: TRP1].
GEVO3638 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), MATa ura3 leu2 his3 trp1 pdc1△::[P CUP1-1 : Bs_alsS1_coSc: TRP1] tma29△::[T Kl_URA3_short : P FBA1 : Kl_URA3: T Kl_URA3]
GEVO3639 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), MATa ura3 leu2 his3 trp1 pdc1△::[P CUP1-1 : Bs_alsS1_coSc: TRP1] tma29△::[T Kl_URA3_short :P FBA1 : Kl_URA3: T Kl_URA3 ]
GEVO3640 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), MATa ura3 leu2 his3 trp1 pdc1△::[P CUP1-1 : Bs_alsS1_coSc: TRP1] tma29△::[T Kl_URA3_short : P FBA1 : Kl_URA3:T Kl_URA3 ]
실시예 14에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 명칭 유전형
pGV1299 Kl_URA3, bla, pUC-ori.
pGV2129 Kl_URA3-5', bla.
실시예 14에서 개시된 올리고뉴클레오티드 서열.
oGV # 서열
893 GGATGTGAAGTCGTTGACACAG (서열 번호: 118)
2231 TTGAAACGTTGGGTCCATAC (서열 번호: 119)
2232 TTCACCGTGTGCTAGAGAAC (서열 번호: 120)
2862 TTATACAGGAAACTTAATAGAACAAATC (서열 번호: 121)
2867 TGAAACAGCATGGCGCATAG (서열 번호: 122)
2869 CTGTGTCAACGACTTCACATCCGAGGTAACGAGGAACAAGCC (서열 번호: 123)
2870 TTTCGCCGGTATATTCCGTAG (서열 번호: 124)
2891 GTTCTATTAAGTTTCCTGTATAACGGCATTGTTCACCAGAATGTC (서열 번호: 125)
2902 TCCCGACGGCTGCTAGAATG (서열 번호: 126)
2904 CGCTCCCCATTAATTATACA (서열 번호: 127)
2913 GAAAGGCTCTTGGCAGTGAC (서열 번호: 128)
2914 GCCCTGGTGCAATTAGAATG (서열 번호: 129)
2915 TGCAGAGGGTGATGAGTAAG (서열 번호: 130)
2916 GGCCAAAGGTAAGGAGAACG (서열 번호: 131)
균주 작제 : 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO3638, GEVO3639, 그리고 GEVO3640은 TMA29를 URA3 마커로 대체하기 위해 GEVO2618을 2부 통합 SOE PCR 산물로 형질전환시킴으로써 작제되었다. 환원효소 유전자에 대한 5'와 3' 표적화 서열을 증폭하기 위한 프라이머는 URA3 단편에 상동한 20 bp 서열로 설계되었다. 이것은 SOE PCR이 URA3 마커 및 목적되는 환원효소 유전자에 접하는 상동한 영역을 내포하는 단편을 산출하는데 이용될 수 있도록 하기 위해 수행되었다. PCR은 Eppendorf Mastercycler? (Cat# 71086, Novagen, Madison WI) 상에서 수행되었다. SOE PCR 단편을 산출하는데 이용된 프라이머 세트에 대해 하기 PCR 프로그램이 추종되었다: 2분 동안 94℃, 이후 (94℃ 30초, 53℃ 30초, 72℃ 1.5분)의 30회 사이클, 이후 10분 동안 72℃. 하기 프라이머 쌍과 주형이 SOE 반응의 첫 번째 단계에 이용되었다.
5' URA3 단편을 산출하기 위해, oGV2232와 oGV2862가 pGV2129를 주형으로 이용하여 5' URA3 단편을 증폭하는데 이용되었다. 상기 1364 bp 단편은 겔 전기영동에 의해 정제되었다. 3' URA3 단편을 산출하기 위해, oGV2231과 oGV893이 pGV1299를 주형으로 이용하여 3' URA3 단편을 증폭하는데 이용되었다. 상기 1115 bp 단편은 겔 전기영동에 의해 정제되었다.
5' TMA29 단편을 산출하기 위해, oGV2867과 oGV2891이 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) S288c 유전체 DNA를 주형으로서 이용하여 5' TMA29 단편을 증폭하는데 이용되었다. 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) S288c 균주는 ATCC (ATCC#204508)로부터 구입되었다. 상기 412 bp 단편은 겔 전기영동에 의해 정제되었다. 3' TMA29 단편을 산출하기 위해, oGV2869와 oGV2870이 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) S288c 유전체 DNA를 주형으로서 이용하여 3' TMA29 단편을 증폭하는데 이용되었다. 상기 305 bp 단편은 겔 전기영동에 의해 정제되었다.
하기 프라이머 쌍과 주형이 SOE PCR 산물을 산출하는데 이용되었다. 5' TMA29 SOE PCR 산물을 산출하기 위해, oGV2232와 oGV2867이 이용되었다. 5' URA3 단편 및 5' TMA29 단편이 주형으로서 이용되었다. 3' TMA29 SOE PCR 산물을 산출하기 위해, oGV2231과 oGV2870이 이용되었다. 3' URA3 단편 및 3' TMA29 단편이 주형으로서 이용되었다.
2부 통합 SOE PCR 산물로 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO2618의 형질전환은 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다. 형질전환 이후에, 세포는 원심분리 (18,000 x g, 10초, 25℃)에 의해 수집되고 400 ㎕ SCD-HLWU 배지에서 재현탁되었다. 통합성 형질전환체는 형질전환된 세포를 SCD-Ura 아가 배지 상에 도말함으로써 선별되었다. 일단 형질전환체가 단일 집락 정제되면, 이들은 SCD-Ura 평판 상에 유지되었다.
집락 PCR은 정확한 통합을 확증하는데 이용되었다. 정확한 5'-단부를 스크리닝하기 위해, URA3: TMA29 5' 연접 프라이머 oGV2915와 oGV2902가 991 bp에서 예측된 밴드를 제공하는데 이용되었다. 정확한 3'-단부를 스크리닝하기 위해, URA3: TMA29 3' 연접 프라이머 oGV2904와 oGV2916이 933 bp에서 예측된 밴드를 제공하는데 이용되었다. TMA29 유전자의 결실을 스크리닝하기 위해, 프라이머 oGV2913과 oGV2914가 이용되었는데, 상기 CDS가 결실되면 288 bp의 결여가 예측되었다.
발효: 발효는 tma29△ 균주 GEVO3638, GEVO3639와 GEVO3640, 그리고 부모 TMA29 균주 GEVO2618로 수행되었다. 배양은 30℃와 250 rpm에서 교반하면서 YPD에서 시작되었다. 4회 계대 (doubling)후, 각 배양액에 대한 OD600이 측정되었다. 0.05의 최종 OD600이 획득되도록, 15% 글루코오스를 내포하는 50 ㎖ YPD에 세포가 첨가되었다. t=24시간에서, 2 ㎖의 배지가 이동되고 25 ㎕가 OD600을 측정하기 위해 1:40 희석도에서 이용되었다. 남아있는 배양액은 10분 동안 최대 속도로 마이크로원심분리기에서 원심분리되고, 그리고 1 ㎖의 상층액이 이동되고 LC1과 LC4 분석이 수행되었다. t=48시간에서, 2 ㎖의 배지가 이동되고 25 ㎕가 OD600을 측정하기 위해 1:40 희석도에서 이용되었다. 1 ㎖의 상층액은 LC1에 의해 분석되었다. 이에 더하여, 14 ㎖가 2700 x g로 원심분리에 의해 수집되었다. 배지의 제거후, 세포는 무균 dH20에서 재현탁되고, 2700 X g로 원심분리되고, 그리고 남아있는 배지가 1 ㎖ 피펫 팁 (pipette tip)을 이용하여 조심스럽게 제거되었다. 세포 펠릿은 칭량되고 (빈 튜브가 미리 칭량되었다), 이후 앞서 기술된 바와 같이 ALS 검사를 위해 해동될 때까지 -80℃에서 동결되었다
DH2MB의 생산은 이종기원성 ALS 발현, 예를 들면, Bs_alsS1_coSc 유전자에 의존한다. 세포 용해물의 ALS 활성은 TMA29 결실이 ALS 발현 및/또는 활성에 어떤 영향도 주지 않는다는 것을 증명하기 위해 앞서 기술된 바와 같이 측정되었다. TMA29 결실을 보유하는 균주로부터 추출물의 ALS 활성은 부모 균주로부터 추출물의 활성보다 못하지 않고, 그리고 약간 높다. 24시간 (ALS 활성의 경우에 48시간) 시점에서 결과는 표 48에 요약되고, 그리고 TMA29 결실을 갖는 균주에서 DH2MB 생산의 결여를 분명하게 증명한다. LC4 분석은 GEVO3527이 DHIV를 생산하지 않는다는 것을 확증하였다.
TMA29 결실을 갖는 균주에서 DH2MB의 생산.
균주 OD 600 LC1 에 의해
소비된
글루코오스
[g/ℓ] 		LC1에 의한
DH2MB
[g/ℓ] 		ALS 활성 [U/mg]
GEVO2618 9.2 ± 0.9 61.56 ± 12.0 1.51 ± 0.1 0.44 ± 0.06
GEVO3638, GEVO3639,
GEVO3640 (tma29△) 		12.5 ± 5.0 68.44 ± 12.5 0.00 ± 0.0 0.57 ± 0.04
실시예 15: 결실 라이브러리에 의한 사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )에서 TMA29 의 결실
하기 실시예에서는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 유전체로부터 TMA29 유전자의 결실이 아세토락테이트 신타아제가 과다발현될 때 DH2MB의 생산을 제거한다는 것을 예증한다.
균주, ORF 결실, 그리고 플라스미드는 각각, 표 49, 50, 그리고 51에 열거된다.
실시예 15에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO # 유전형/출처
GEVO3527 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) BY4742: MATa his3△1 leu2△0 lys2△0 ura3△0 /ATCC #201389, ATCC 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110-2209로부터 구입됨
실시예 15에서 개시된 ORF 결실.
ORF 결실 유전자 명칭 출처
YMR226C TMA29 결실 라이브러리는 Open Biosystems, cat # YSC 1054로부터 획득되었다
실시예 15에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 관련된 유전자
pGV2435 P ScCUP1 : Bs_alsS1_coSc:P ScTPI1 :hph:T ScCYC1 , CEN/ARS, bla, pUC-ori
균주마다 하나의 유전자/ORF가 결실된 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주의 상업적 라이브러리가 DH2MB의 생산을 촉진할 지도 모르는 결실을 스크리닝하는데 이용되었다. TMA29 (즉, YMR226C) ORF의 결실을 내포하는 후보 균주가 선별되었다. 외생성 ALS 발현이 DH2MB의 생산에 요구되기 때문에, CUP1 프로모터에 의해 주동된 Bs _ alsS1 _ coSc 유전자를 내포하는 CEN 플라스미드 (pGV2435)가 앞서 기술된 바와 같이 균주 내로 형질전환되었다. 형질전환체는 0.2 g/ℓ 히그로마이신을 내포하는 YPD 평판 상에 도말하기에 앞서, 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 회수되었다. 형질전환체는 이후, 0.2 g/ℓ 히그로마이신을 내포하는 YPD 평판 상에 패칭되고 30℃에서 배양되었다. TMA29 (YMR226C)의 결실이 DH2MB의 생산을 감소시키거나 제거하는 지를 결정하기 위해, 이들 균주로 발효가 수행되었다. 각 균주의 3가지 독립된 형질전환체가 하룻밤동안 성장된 발효 전배양액을 30℃와 250 rpm에서, 0.2 g/ℓ 히그로마이신을 내포하는 YPD에서 포화까지 접종하는데 이용되었다. 익일에, 전배양액의 OD600이 측정되고, 그리고 50 ㎖ 배양액을 0.1의 OD600까지 접종하는데 필요한 하룻밤 배양액의 부피가 각 배양액에 대해 계산되었다. 250 ㎖ 비-차단된 플라스크에서 150 g/ℓ 글루코오스, 200 mM MES, pH 6.5 및 0.2 g/ℓ 히그로마이신을 내포하는 50 ㎖의 YPD가 계산된 양의 하룻밤 배양액으로 접종되었다. 세포는 오비탈 교반기에서 30℃와 75 rpm에서 배양되었다. 24시간 시점에, 모든 배양액은 각 플라스크에 8.8 ㎖의 50% 글루코오스 용액의 첨가에 의해 추가의 75 g/ℓ 글루코오스가 공급되고, 이후 30℃와 75 rpm에서 배양으로 복귀되었다. 72시간 시점에, 1.5 ㎖가 각 플라스크로부터 샘플링되었다 (2개의 에펜도르프 튜브 간에 750 ㎕ 분할됨). 각 배양액 (H2O에서 1:40 희석도)에 대해 OD600이 측정되었다. 세포는 마이크로원심분리기에서 10분 동안 ≥14000 x g로 원심분리에 의해 샘플로부터 이동되었다. 이들 샘플로부터 상층액이 수집되고 LC1에 의한 분석 때까지 4℃에서 보관되었고, 그리고 세포 펠릿은 앞서 기술된 바와 같이 ALS 검사를 위해 해동될 때까지 -80℃에서 보관되었다.
72시간 시점에서 GEVO3527의 경우에 13.7 및 TMA29 결실 균주의 경우에 15.7의 OD600 값으로, 이들 두 균주 간에 성장에서 일부 편차가 있었다 (표 52). 이들 균주는 72시간까지 대략 223 g/ℓ의 동일한 양의 글루코오스를 소비하였다 (표 52). GEVO3527은 72시간까지 2.8 g/ℓ의 DH2MB를 생산하였다. YMR226C 결실 균주 (tma29△)는 검출가능한 수준의 DH2MB를 생산하지 못하였다. GEVO3527에 대한 특정한 DH2MB 역가는 0.2 g/ℓ/OD이었다; YMR226C 결실 균주 (tma29△)는 검출가능한 수준의 DH2MB를 생산하지 못하였다. LC4 분석은 GEVO3527이 DHIV를 생산하지 못한다는 것을 확증하였다.
72시간 시점에 세포 성장, 소비된 글루코오스, 그리고 DH2MB 생산.
균주 OD 600 LC1에 의해
소비된
글루코오스 [g/ℓ] 		LC1에 의한
DH2MB 역가
[g/ℓ] 		특정한
DH2MB 역가
[g/ℓ/OD]
GEVO3527 13.7 ± 0.3 223.3 ± 0.6 2.8 ± 0.1 0.2 ± 0.01
TMA29 △ 15.7 ± 5.5 223.9 ± 0.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0
실시예 16: 사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )에서 TMA29 유전자의 결실로 향상된 이소부탄올 비율, 수율, 그리고 역가
하기 실시예에서는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 유전체로부터 TMA29 유전자의 결실이 원하는 산물, 이소부탄올의 생산성, 수율, 그리고 역가에서 증가를 유발한다는 것을 예증한다. 이에 더하여, 이것은 DH2MB 생산성, 수율과 역가에서 감소를 유발한다.
DH2MB는 효모에서 아세토락테이트 물질대사의 부산물이다. 이소부탄올 발효에서, DH2MB는 탄소 수율 중에서 10% 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 야생형 TMA29를 갖는 균주는 Bs_alsS1_coSc (서열 번호: 23)에 의해 인코딩된 발현된 아세토락테이트 신타아제 (ALS)의 존재에서 DH2MB를 생산한다. TMA29가 결실된 균주는 발현된 Bs_alsS1_coSc의 존재에서 DH2MB를 생산하지 못한다. 염색체로부터 ALS를 발현하는 모든 PDC와 GPD 유전자 (Bs_alsS1_coSc)가 결실된 효모 균주는 TMA29가 결실되고, 그리고 DHAD (Ll_ilvD_coSc), KARI (Ec_ilvC_coSc P2D1-A1-his6 ), KIVD (Ll_kivD2_coEc) 및 ADH (Ll_adhA_coSc RE1-his6 )에 대한 유전자를 갖는 높은 사본 4-성분 이소부탄올 경로 플라스미드, pGV2550으로 형질전환되었다. 상기 균주의 이소부탄올 역가, 수율과 생산성은 교반 플라스크 발효액 및 발효조 둘 모두에서, TMA29 유전자가 결실되지 않은 부모 균주의 이소부탄올 역가, 수율과 생산성과 비교되었다. 균주와 플라스미드는 각각, 표 53과 54에 열거된다.
실시예 16에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO No. 유전형
GEVO1187 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2 MATa ura3 leu2 his3 trp1 ADE2
GEVO3351 MATa ura3 leu2 his3 trp1 gpd1△::[TKl_URA3] gpd2 △::TKl_URA3
pdc1 △::[P CUP1 :Bs_alsS1_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivD-P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5 △::[LEU2;bla;P TEF1 :ILV3△N;P TDH3 ;ilvC_coSc Q110V ]
pdc6 △::[P TEF -Ll_ilvD:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 :P ENO2 :Ll_adhA:P FBA1 :Sc_TRP1] {C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
GEVO3663 MATa ura3 leu2 his3 trp1 gpd1::T Kl_URA3 gpd1△::[T Kl_URA3 ] gpd2 △::T Kl_URA3
pdc1 △::[P CUP1 :Bs_alsS1_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivD-P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5 △::[LEU2;bla;P TEF1 :ILV3△N;P TDH3 ;ilvC_coSc Q110V ]
pdc6 △::[P TEF -Ll_ilvD:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 :P ENO2 :Ll_adhA:P FBA1 :Sc_TRP1]
tma29△::[T Kl_URA3_short : P FBA1 :Kl_URA3: T Kl_URA3 ] {C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
GEVO3690, GEVO3691, GEVO 3692 MATa ura3 leu2 his3 trp1 gpd1△::[T Kl_URA3 ] gpd2 △::T Kl_URA3
pdc1 △::[P CUP1 :Bs_alsS1_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivD-P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5 △::[LEU2;bla;P TEF1 :ILV3△N;P TDH3 ;ilvC_coSc Q110V ]
pdc6 △::[P TEF -Ll_ilvD:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 :P ENO2 :Ll_adhA:P FBA1 :Sc_TRP1] 형질전환된 with pGV2550 {C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
GEVO3694, GEVO3695, GEVO3696 GEVO3697 MATa ura3 leu2 his3 trp1 gpd1△::[T Kl_URA3 ] gpd2 △::T Kl_URA3
pdc1 △::[P CUP1 :Bs_alsS1_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivD-P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5 △::[LEU2;bla;P TEF1 :ILV3△N;P TDH3 ;ilvC_coSc Q110V ]
pdc6 △::[P TEF -Ll_ilvD:P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1 :P ENO2 :Ll_adhA:P FBA1 :Sc_TRP1]
tma29△::[T Kl_URA3_short : P FBA1 :Kl_URA3: T Kl_URA3 ]형질전환된 with pGV2550 {C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
실시예 16에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 명칭 유전형
pGV1299 Kl_URA3, bla, pUC-ori.
pGV2129 Kl_URA3-5', bla, pUC ori
pGV2550 P ScTEF1 :Ll_ilvD_coS, P ScTDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1-his6 :P ScPGK1 :Ll_kivD2_coEc: P ScENO2 :Ll_adhA_coSc RE1-his6 , 2μ-ori, pUC-ori, bla, G418R.
효모 균주 작제 : GEVO3663은 형질전환후 세포가 SCD-Ura 평판 위에 전개되기에 앞서 350 ㎕ SCD-Ura 배지에서 재현탁되는 점을 제외하고, 앞서 기술된 바와 같이 TMA29를 URA3 마커로 대체하기 위해 GEVO3351을 실시예 14에서 기술된 2부 통합 SOE PCR 산물로 형질전환시킴으로써 작제되었다.
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO3690, GEVO3691, 그리고 GEVO3692는 GEVO3351을 플라스미드 pGV2550로 형질전환시킴으로써 작제되었다. 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 GEVO3694, GEVO3695, 그리고 GEVO3697은 GEVO3663을 플라스미드 pGV2250로 형질전환시킴으로써 작제되었다. 간단히 말하면, 적격 세포는 새로운 평판으로부터 세포를 100 ㎕ 100 mM 리튬 아세테이트로 이동시킴으로써 준비되었다. 세포 현탁액은 30분 동안 실온에서 배양되었다. 플라스미드 DNA는 앞서 기술된 바와 같이 형질전환되었다. 형질전환후, 세포는 1% 에탄올을 내포하는 400 ㎕ YPD에서 재현탁되고 250 rpm으로 교반하면서 30℃에서 6시간 동안 배양되었다. 세포는 이후, 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 YPD 평판 위에 전개되었다. 형질전환체는 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 YPD 평판 상에 단일 집락 정제되었다. 일단 형질전환체가 단일 집락 정제되면, 이들은 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 YPD 평판 상에 유지되었다.
발효: 교반 플라스크 발효는 GEVO3690-GEVO3692 (TMA29)의 성과를 GEVO3694-GEVO3695 및 GEVO3697 (tma29△)과 비교하기 위해 수행되었다. 배양 (3 ㎖)은 1% 에탄올 및 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 YPD에서 시작되고 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 대략 20시간후 이들 배양액의 OD600이 측정되었다. 적절한 양의 각 배양액이 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 1% 에탄올 및 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 50 ㎖의 YPD를 대략 0.1의 OD600까지 접종하는데 이용되었다. 이들 전배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 배양액이 대략 5의 OD600에 도달했을 때, 이들은 50 ㎖ Falcon 튜브에서 25℃에서 5분 동안 2700 rcf로 원심분리되었다. 각 50 ㎖ 배양액으로부터 세포는 앞서 기술된 바와 같이 50 ㎖의 발효 배지에서 재현탁되었다. 배양액은 이후, 250 ㎖ 차단되지 않은 벤트 스크루-캡 플라스크로 이전되고 30℃와 75 rpm에서 배양되었다. 24시간과 48시간 시점에, 각 플라스크로부터 샘플은 OD600을 측정하고 GC1 분석에 대비하기 위해 이동되었다. GC1 분석을 위해, 2 ㎖ 샘플이 에펜도르프 튜브로 이동되고 10분 동안 최대로 마이크로원심분리기에서 원심분리되었다. 1 ㎖의 상층액은 GC1에 의해 분석되었다. 72시간 시점에, OD600과 GC 분석을 위한 세포를 수집하기 위해 동일한 절차가 이용되었고, 그리고 게다가, 이들 샘플은 고성능 액체 크로마토그래피 (LC1)에 의해 DH2MB와 DHIV를 비롯한 유기 산, 그리고 글루코오스에 대해 분석되었다.
72시간 시점에 결과는 표 55에 요약된다. 이소부탄올 역가, 수율과 비율은 TMA29 유전자의 결실로 증가하는 반면, DH2MB 생산은 감소한다.
72시간 시점에 이소부탄올 역가, 수율과 비율 증가.
균주 OD 600 소비된 글루코오스 [g/ℓ] 생산된 이소부탄올 [g/ℓ] 이소부탄올 수율
[이론적 %] 		이소부탄올 비율 [g/ℓ/h] 생산된 DH2MB [g/ℓ]
GEVO3690, GEVO3691, GEVO3692 8.3 ± 0.3 29.8 ± 1.3 5.5 ± 0.4 45.1 ± 4 0.08 3.1
GEVO3694, GEVO3695, GEVO3697 (TMA29△ ) 8.3 ± 0.7 33.4 ± 1.0 7.6 ± 0.2 55.1 ± 2 0.11 0.03
이에 더하여, GEVO3690-GEVO3691 (TMA29) 대(對) GEVO3694-GEVO3696 (tma29 △)의 성과는 또한, 발효조 용기에서 수행된 발효 동안 비교되었다. 도말된 배양액은 20 g/ℓ 글루코오스, 1% v/v 에탄올, 100 μM CuSO4ㆍ5H20, 그리고 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 80 ㎖의 YP 배지를 포함하는 500 ㎖ 차단된 플라스크로 이전되고 250 rpm으로 오비탈 교반기에서 30℃에서 34.5시간 동안 배양되었다. 플라스크 배양액은 0.2의 시작 OD600을 위해 20 g/ℓ 글루코오스, 1% v/v 에탄올, 100 μM CuSO4.5H20, 그리고 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 80 ㎖의 YP 배지를 포함하는 1.2 ℓ의 작업 부피를 갖는 개별 2 ℓ 탑 드라이브 모터 발효조 용기로 이전되었다. 발효조는 30℃와 pH 6에서 가동되고, 2-기 호기성 발효 하에 6N KOH로 제어되었다. 초기에, 발효조는 850 rpm의 고정된 휘저음 및 5 sL/h의 공기 오버레이 (air overlay)에 의해 10 mM/h의 성장기 산소 전달 속도 (OTR)에서 가동되었다. 배양액은 31시간 동안 대략 6-7 OD600까지 성장되고, 그 직후에 111시간의 나머지 발효 동안 휘저음을 850 rpm에서 300 rpm으로 감소시킴으로써 0.5 mM/h의 생산 통기 OTR로 전환되었다. 주기적으로, 각 발효조로부터 샘플은 OD600을 측정하고 가스 크로마토그래피 (GC1) 분석에 대비하기 위해 이동되었다. GC를 위해, 2 ㎖의 샘플이 에펜도르프 튜브로 이동되고 10분 동안 최대로 마이크로원심분리기에서 원심분리되었다. 1 ㎖의 상층액은 GC1 (이소부탄올, 기타 대사산물)에 의해 분석되었다. 72시간 시점에, OD600과 GC 분석을 위한 세포를 수집하기 위해 동일한 절차가 이용되었고, 그리고 게다가, 이들 샘플은 고성능 액체 크로마토그래피 (LC1)에 의해 유기 산과 글루코오스에 대해 분석되었다.
111시간 시점에 결과는 표 56에 요약된다. 이소부탄올 역가, 수율과 비율은 TMA29 유전자의 결실로 증가하는 반면, DH2MB 생산은 검출되지 않는 수준까지 감소한다.
111시간 시점에서 이소부탄올 역가, 수율과 비율 증가.
균주 OD 600 소비된 글루코오스 a
[g/ℓ] 		생산된 이소부탄올 a
[g/ℓ] 		생산된 DH2MB a
[g/ℓ] 		이소부탄올 수율 b
[이론적 %] 		이소부탄올 비율 b
[g/ℓ/h]
GEVO3690, GEVO3691
(TMA29+) 		7.2 ± 0.7 29.7 ± 1.1 8.6 ± 0.1 2.9 62.4 ± 3 0.09
GEVO3694, GEVO3695, GEVO3696 (TMA29△ ) 7.4 ± 1.3 35.7 ± 3.9 12.3 ± 1.2 0 75.0 ± 0.01 0.14
a 글루코오스, 이소부탄올, 그리고 DH2MB 역가는 최종 역가, 다시 말하면, 111시간 발효 시점에서 역가이다.
b 이소부탄올 수율과 비율은 생산 단계, 다시 말하면, 31 내지 111시간의 발효에만 기초하여 계산된다.
실시예 17: 사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )에서 TMA29 활성의 결정
하기 실시예에서는 (S)-2-아세토락테이트 감소 활성이 tma29△ 균주에서 유의미하게 감소한다는 것을 예증한다.
실시예 17에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO # 유전형 출처
GEVO3527 MATα his3△-1 leu2△ lys2△ ura3△ ATCC# 201389 (BY4742)
GEVO3939 MATα his3△-1 leu2△ lys2△ ura3△ tma29::kan R OpenBiosystems cat# YSC1054 (Yeast MATalpha collection)
TMA29 (YMR226C) 유전자가 결실된 효모 균주 GEVO3939 및 이의 부모 GEVO3527은 각 균주에 대해 삼중으로 14 ㎖ 배양액 튜브에서 3 ㎖의 YPD를 접종함으로써 각각 삼중으로 배양되었다. 배양은 GEVO3527의 경우에 YPD 아가 평판 상에서, 그리고 GEVO3939와 GEVO3940의 경우에 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 YPD 평판 상에서 패치 (patch)로부터 시작되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 익일에, 하룻밤 배양액의 OD600이 측정되고, 그리고 50 ㎖ 배양액을 0.1의 OD600까지 접종하기 위한 각 배양액의 부피가 계산되었다. 계산된 부피의 각 배양액이 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 50 ㎖의 YPD를 접종하는데 이용되고, 그리고 이들 배양액은 30℃와 250 rpm에서 배양되었다.
세포는 7시간 성장후, 1.6-2.1의 OD에서 중간-로그 기 동안 수확되었다. 배양액은 미리 칭량된 50 ㎖ Falcon 튜브로 이전되고, 그리고 세포가 5분 동안 3000 x g로 원심분리에 의해 수집되었다. 배지의 제거후, 세포는 10 ㎖ MilliQ H20로 세척되었다. 물의 제거후, 세포는 5분 동안 3000 x g로 다시 한 번 원심분리되고, 그리고 남아있는 물은 1 ㎖ 피펫 팁을 이용하여 조심스럽게 제거되었다. 세포 펠릿은 칭량되고, 이후 추가 이용 때까지 -80℃에서 보관되었다.
세포 펠릿은 얼음 위에서 해동되고, 그리고 결과물이 질량으로 20% 세포 현탁액이 되도록 용해 완충액 (10 mM 인산나트륨 pH7.0, 1 mM 디티오트레이톨, 5% w/v 글리세롤)에서 재현탁되었다. 각 샘플에 대해 1 ㎖의 유리 비드 (glass bead) (0.5 mm 직경)가 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 첨가되고 850 ㎕의 세포 현탁액이 첨가되었다. 효모 세포는 각각 전속에서 6 X 1분 혼합 및 그 사이에 얼음 위에서 1분 배양에 의해, Retsch MM301 믹서 밀 (mixer mill) (Retsch Inc. Newtown, PA)을 이용하여 용해되었다. 이들 튜브는 4℃에서 10분 동안 21,500xg로 원심분리되고, 그리고 상층액이 새로운 튜브로 이전되었다. 추출물은 앞서 기술된 바와 같이 TMA29 검사를 이용하여 조사될 때까지 얼음 위에 유지되었다.
(S)-2-아세토락테이트의 환원에 대한, 야생형 MATα 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주인 GEVO3527 용해물에서 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29의 비활성은 6.9 ± 0.2 mU/mg이었다. tma29△ 균주 GEVO3939는 0.7 ± 0.3 mU/mg의 비활성을 가졌다. 야생형 GEVO3527 균주는 결실 균주보다 대략 10-배 높은 TMA29 비활성을 가졌다.
실시예 18. 클루이베로미세스 락티스( Kluyveromyces lactis )에서 TMA29 활성의 결정
하기 실시예에서는 (S)-2-아세토락테이트 감소 활성이 tma29△ 균주에서 유의미하게 감소한다는 것을 예증한다.
실시예 18에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO # 유전형
GEVO1287 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), MATα uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1]
GEVO1742 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), MATalpha uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1△::kan
GEVO4458 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), MATalpha uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1△::kan tma29△::hph
실시예 18에서 개시된 올리고뉴클레오티드 서열.
oGV # 서열
821 CGGGTAATTAACGACACCCTAGAGG (서열 번호: 132)
2320 GGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAG (서열 번호: 133)
3065 AAAAAGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGCGTTGATAAGGGCAACAACGTTAGTATC (서열 번호: 134)
3066 ATACTAACGTTGTTGCCCTTATCAACGCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTAC (서열 번호: 135)
3067 TCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGTTACCCAAGCTGTTTTGCCTATTTTCAAAGC (서열 번호: 136)
3068 GCTTTGAAAATAGGCAAAACAGCTTGGGTAACTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTG (서열 번호: 137)
3069 AGTTCAAATCAGTTCGAGGATAATTTAAG (서열 번호: 138)
3070 TTAATAAATGCTCAAAAGAAAAAAGGCTGGCG (서열 번호: 139)
3103 ACCGGTGCTTCTGCAGGTATTG (서열 번호: 140)
3106 ATGCTTGGTTGGAAGCAAATAC (서열 번호: 141)
클루이베로미세스 락티스(K. lactis) 균주 GEVO4458은 하기와 같이 GEVO1742로부터 작제되었다. SOE PCR을 이용하여 클루이베로미세스 락티스(K. lactis)의 TMA29 좌위가 결실된 DNA 구조체가 만들어졌다. 5' 표적화 서열은 프라이머 oGV3103과 oGV3065와 함께, GEVO1287 유전체 DNA를 주형으로서 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. 376 bp 단편은 겔 전기영동에 의해 정제되었다. 3' 표적화 서열은 프라이머 oGV3106과 oGV3067과 함께, GEVO1287 유전체 DNA를 주형으로서 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. 405 bp 단편은 겔 정제되었다. Hph 마커는 프라이머 oGV3066과 oGV3068과 함께, pGV2701 (P TEF1 -Hph, CEN/ARS, pUC-ori, bla)을 주형으로서 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. 1,165 bp 단편은 겔 정제되었다. 그 다음, 5' 표적화 서열 및 hph 마커는 주형으로서 기술된 PCR 산물을 이용하여 서로 결합되었다. 반응은 프라이머 oGV3068과 oGV3103을 이용하여 증폭되었다. 1,984 bp 단편은 겔 정제되었다. 그 다음, 5' 표적화 서열 + Hph 마커 PCR 단편은 프라이머 oGV3103과 oGV3106과 함께, PCR을 이용하여 3' 표적화 서열과 결합되었다. 2,331 bp는 겔 정제되고 형질전환에 이용되었다. 효모 DNA는 Zymo Research ZR 진균/세균 DNA 키트 (Zymo Research Orange, CA; Catalog #D6005)를 이용하여 단리되었다. GEVO1287은 차단된 125 ㎖ 플라스크에서 12.5 ㎖의 YPD에서 포화까지 성장되었다. 전체 배양액은 15 ㎖ Falcon 튜브에서 수집되고, 그리고 세포가 2700 rcf에서 5분 동안 수집되었다. 유전체 DNA는 제조업체의 지시에 따라 단리되었다. DNA 농도가 측정되고, 그리고 모든 유전체 DNA 준비물이 25 ng/㎕의 최종 농도로 희석되었다.
GEVO1742는 하기와 같이 형질전환되었다. 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 50 ㎖ YPD 배지는 새로운 평판으로부터 GEVO1742 세포로 접종되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 다음날 아침, 배양액은 YPD 배지에서 1:50 희석되고 6시간 동안 성장되었다. 세포는 30℃에서 2분 동안 2700 rcf로 원심분리에 의해 수집되었다. 세포는 세포를 50 ㎖ 무균 MilliQ 물로 완전하게 재현탁함으로써 세척되었다. 세포는 30℃에서 2분 동안 2700 rcf로 원심분리에 의해 수집되었다. 세포는 25 ㎖ 무균 MilliQ 물로 재현탁함으로써 세척되었다. 세포는 30℃에서 2분 동안 2700 rcf로 원심분리에 의해 수집되었다. 세포는 1 ㎖ 100mM 리튬 아세테이트에서 재현탁되고, 에펜도르프 튜브로 이전되고, 그리고 10초 동안 14,000 rcf로 원심분리에 의해 수집되었다. 상층액은 이동되고, 그리고 세포가 100mM LiOAc에서 4X 펠릿 부피로 재현탁되었다. DNA (15 ㎕의 PCR 산물), 72 ㎕ 50% PEG, 10 ㎕ 1 M 리튬 아세테이트, 그리고 3 ㎕의 변성된 연어 정액 DNA (10 mg/㎖)의 혼합물이 각 형질전환을 위해 준비되었다. 1.5 ㎖ 튜브에서, 15 ㎕의 세포 현탁액이 DNA 혼합물 (170 ㎕)에 첨가되고, 그리고 형질전환 현탁액은 5회 짧은 펄스 동안 와동되었다. 형질전환체는 30℃에서 30분 동안 배양되고, 그 이후에 42℃에서 22분 동안 배양되었다. 세포는 원심분리 (18,000 x g, 10초, 25℃)에 의해 수집되었다. 세포는 400 ㎕ YPD 배지에서 재현탁되고 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 회수되었다. 다음날 아침, 세포는 0.1 g/ℓ 히그로마이신으로 보충된 YPE 평판 (1% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 펩톤, 25 ㎖/ℓ 에탄올) 위에 전개되었다. 형질전환체는 0.1 g/ℓ 히그로마이신으로 보충된 YPE 평판 상에 단일 집락 정제되었다.
단일 집락 단리물은 0.1 g/ℓ 히그로마이신으로 보충된 YPE 평판 상에 패칭되고, 그리고 이들 패치는 집락 PCR에 의해 정확한 통합에 대해 스크리닝되었다. 정확한 PCR 산물의 존재는 아가로오스 겔 전기영동을 이용하여 확증되었다. 내부 TMA29 코딩 영역을 스크리닝하기 위해, 프라이머 oGV3103과 oGV3106이 이용되었다. 5' 통합 연접을 스크리닝하기 위해, 프라이머 oGV3069과 oGV821이 이용되었다. 3' 통합 연접을 스크리닝하기 위해, 프라이머 oGV2320과 oGV3070이 이용되었다.
효모 세포는 각 균주에 대해 삼중으로 14 ㎖ 배양액 튜브에 3 ㎖의 YPD 배지 (1% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 펩톤, 2% (w/v) 글루코오스)를 접종함으로써 배양되었다. 배양은 YPD 평판 (1% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 펩톤, 2% (w/v) 글루코오스, 2% 아가) 상에서 패치 (patch)로부터 시작되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 익일에, 하룻밤 배양액의 OD600이 측정되고, 그리고 50 ㎖ 배양액을 0.1의 OD600까지 접종하기 위한 각 배양액의 부피가 계산되었다. 계산된 부피의 각 배양액이 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 50 ㎖의 YPD를 접종하는데 이용되었고, 그리고 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 세포는 1.8 - 2.2의 OD에서 중간-로그 기 동안 수확되었다. 배양액은 미리 칭량된 50 ㎖ Falcon 튜브로 이전되고, 그리고 세포가 5분 동안 3000 x g로 원심분리에 의해 수집되었다. 배지의 제거후, 세포는 10 ㎖ MilliQ H20로 세척되었다. 물의 제거후, 세포는 5분 동안 3000 x g로 다시 한 번 원심분리되고, 그리고 남아있는 물은 1 ㎖ 피펫 팁으로 조심스럽게 제거되었다. 세포 펠릿은 칭량되고, 이후 -80℃에서 보관되었다.
세포 펠릿은 얼음 위에서 해동되고, 그리고 결과물이 질량으로 20% 세포 현탁액이 되도록 용해 완충액 (10 mM 인산나트륨 pH7.0, 1 mM 디티오트레이톨, 5% w/v 글리세롤)에서 재현탁되었다. 각 샘플에 대해 1 ㎖의 유리 비드 (glass bead) (0.5 mm 직경)가 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 첨가되고 850 ㎕의 세포 현탁액이 첨가되었다. 효모 세포는 각각 전속에서 6 X 1분 혼합 및 그 사이에 얼음 위에서 1분 배양에 의해, Retsch MM301 믹서 밀 (mixer mill) (Retsch Inc. Newtown, PA)을 이용하여 용해되었다. 이들 튜브는 4℃에서 10분 동안 21,500xg로 원심분리되고, 그리고 상층액이 새로운 튜브로 이전되었다. 추출물은 앞서 기술된 바와 같이 TMA29 검사를 이용하여 조사될 때까지 얼음 위에 유지되었다.
(S)-2-아세토락테이트의 환원에 대한, TMA29 유전자를 갖는 Gevo1742의 비활성은 0.0043 ± 0.0005 μmol/min/mg 용해물이었다. TMA29 유전자가 결실된 Gevo4459의 비활성은 0.0019 ± 0.0003 μmol/min/mg 용해물이었다.
실시예 19: 사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )에서 ALD6 결실, TMA29 결실, 그리고 증가된 k cat 와 감소된 K M 을 갖는 알코올 탈수소효소를 포함하는 균주에서 증가된 이소부탄올 수율
하기 실시예에서는 ALD6 결실, TMA29 결실, 그리고 향상된 동역학적 성질을 갖는 ADH를 인코딩하는 유전자의 과다발현의 합동이 증가된 이소부탄올 생산과 이론적 수율을 유발한다는 것을 예증한다.
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2 균주, GEVO3991은 염색체 DNA로부터 향상된 알코올 탈수소효소 (락토코커스 락티스(L. lactis) ADH*, LI_ADH*) 및 탈카르복실화효소 (락토코커스 락티스(L. lactis) KIVD, LI_kivD2)를 발현하는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2 균주, GEVO3956을 효소: KARI, DHAD, 그리고 향상된 ADH를 인코딩하는 유전자 (각각, Ec_ilvC_coSc P2D1-A1-his6 , Ll_ilvD_coSc, 그리고 Ll_adhA RE1 )를 발현하는 2μ 플라스미드, pGV2603 (P TDH3 :Ec_ilvC_coSc P2D1-A1-his6, P TEF1 :Ll_ilvD_coSc, P ENO2 :Ll_adhA RE1 , 2μ-ori, pUC-ori, bla, G418R)으로 형질전환시킴으로써 작제되었다.
실시예 19에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO No. 유전형
GEVO3991 MATa ura3 leu2 his3 trp1
ald6△::[P ENO2 :Ll_adhA RE1 :P FBA1 :Sc_TRP1
gpd1△::T Kl_URA3
gpd2△::T Kl_URA3
tma29△::T Kl_URA3
pdc1△::[P PDC1 :Ll_kivD2_coSc5:P FBA1 :LEU2:T LEU2 :P ADH1 :Bs_alsS1_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivD2_coEc:P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5△::T Kl_URA3
pdc6△::P TDH3 :Sc_AFT1:P ENO2 :Ll_adhA RE1 :T- Kl_URA3_short :P FBA1 :Kl_URA3:T Kl_URA3 ]{C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨},
[pGV2603]
GEVO3956 MATa ura3 leu2 his3 trp1 ald6△::[P ENO2 :Ll_adhA RE1 :P FBA1 :Sc_TRP1
gpd1△::T Kl_URA3
gpd2△::T Kl_URA3
tma29△::T Kl_URA3
pdc1△::[P PDC1 :Ll_kivD2_coSc5:P FBA1 :LEU2:T LEU2 :P ADH1 :Bs_alsS1_coSc:T CYC1 :P PGK1 :Ll_kivD2_coEc:P ENO2 :Sp_HIS5]
pdc5△::T Kl_URA3
pdc6△::P TDH3 :Sc_AFT1:P ENO2 :Ll_adhA RE1 :T- Kl_URA3_short :P FBA1 :Kl_URA3:T Kl_URA3 ]{C2 보충-독립성, 글루코오스 내성 및 더욱 빠른 성장을 위해 진화됨}
발효는 4가지 복제물 발효조에서 GEVO3991 (LI _ adhA RE1 , ALD6 △, TMA29 △)의 성과를 결정하기 위해 수행되었다. 글루코오스 소비, 이소부탄올 생산, 이소부티레이트 생산, 아세테이트 생산 및 OD600이 발효 동안 측정되었다. 이들 발효에서, YPD 아가 평판 상에 성장된 단일 격리된 세포 집락은 80 g/ℓ 글루코오스, 5 g/ℓ 에탄올, 0.5 g/ℓ MgSO4, 그리고 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 80 ㎖의 YPD를 포함하는 500 ㎖ 차단된 플라스크로 이전되고 250 rpm으로 오비탈 교반기에서 30℃에서 30시간 동안 배양되었다. 플라스크 배양액은 0.3의 시작 OD600을 위해 용기당 80 g/ℓ 글루코오스, 5 g/ℓ 에탄올, 0.5 g/ℓ MgSO4, 그리고 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 YPD를 포함하는 0.9 ℓ의 작업 부피를 갖는 4개의 개별 2 ℓ 탑 드라이브 모터 발효조 용기로 이전되었다. 발효조는 30℃와 pH 6.0에서 가동되고, 그리고 산소 전달 속도 (OTR)에 기초된 2-기 (phase) 호기성 조건하에 6N KOH로 제어되었다. 초기에, 발효조는 700 rpm의 고정된 휘저음 및 5 sL/h의 공기 오버레이 (air overlay)에 의해 10 mM/h의 성장기 OTR에서 가동되었다. 배양액은 대략 10-11의 OD600까지 22.5시간 동안 성장되고, 그 직후에 40.7시간 동안 생산 통기 조건으로 전환되었다. 생산 기 동안 세포 밀도는 13 - 14 OD600에 접근하였다. 생산 기는 300 rpm의 고정된 휘저음에 의해 0.5 mM/h의 OTR에서 가동되었다. 주기적으로, 각 발효조로부터 샘플은 OD600을 측정하고, 그리고 가스 크로마토그래피 (GC) 분석 및 액체 크로마토그래피 (LC) 분석에 대비하기 위해 이동되었다. GC와 LC를 위해, 2 ㎖의 샘플이 에펜도르프 튜브로 이동되고 10분 동안 최대로 마이크로원심분리기에서 원심분리되었다. 1 ㎖의 상층액은 GC1 (이소부탄올, 기타 대사산물)에 의해 분석되고, 그리고 1 ㎖는 고성능 액체 크로마토그래피 (LC1)에 의해 유기 산과 글루코오스에 대해 분석되었다.
GEVO3991은 22.5시간 성장기 동안 13.8의 세포 밀도를 달성하였다. 실험의 전체 지속 기간 (63.2시간) 동안 생산된 이소부탄올은 18.6 ± 0.9 g/ℓ, 생산된 이소부티레이트는 0.84 ± 0.10 g/ℓ, 그리고 생산된 아세테이트는 0.15 ± 0.02 g/ℓ이었다. 실험의 생산 기 (22.5 - 63.5시간) 동안 달성된 이론적 이소부탄올 수율은 80.3 ± 1.1%인 반면, 이소부티레이트 수율은 단지 0.013 ± 0.001 g/g 글루코오스이었다. DH2MB의 생산은 검출되지 않았다.
이에 더하여, GEVO3991의 3가지 독립된 형질전환체 역시 교반 플라스크에서 특성화되었다. 이들 균주는 1% 에탄올 및 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 3 ㎖의 YPD에서 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 성장되었다. 이들 배양액은 차단된 250 ㎖ 플라스크에서 50 ㎖의 동일한 배지에서 0.1의 OD600으로 희석되고 하룻밤동안 성장되었다. OD600이 측정되고, 그리고 250 OD600에 대략 동등한 부피의 세포가 2분 동안 2700 rcf로 원심분리에 의해 각 배양액에 대해 수집되고, 그리고 이들 세포는 50 ㎖의 발효 배지 (80 g/ℓ 글루코오스, 0.03 g/ℓ 에르고스테롤, 1.32 g/ℓ Tween80, 1% v/v 에탄올, 200 mM MES, pH6.5을 내포하는 YPD)에서 재현탁되고, 그리고 차단되지 않은 벤트 스크루 캡 250㎖ 플라스크로 이전되었다. OD600이 체크되고, 그리고 배양액이 미세호기성 발효를 개시하기 위해 30℃와 75 rpm에 배치되었다. 액체 크로마토그래피 (LC), 가스 크로마토그래피 (GC) 분석 및 OD600을 위한 샘플이 거의 24시간 간격으로 채취되었다. 이들 샘플 (2 ㎖)은 10분 동안 18,000 x g으로 원심분리되고, 그리고 1.5 ㎖의 정화된 상층액이 GC1과 LC1에 의한 분석에 이용되었다.
발효는 대략 4의 OD600에서 시작되었다. 세포는 72시간의 미세호기성 발효에 의해 대략 8의 OD600까지 성장하였다. 72시간후, 이소부탄올 역가는 12.3 g/ℓ이고, 그리고 이소부탄올 수율은 이론값의 67.2%이었다. 이소부티레이트 역가와 수율은 낮았다: 0.6 g/ℓ 이소부티레이트가 0.013 g/g 글루코오스의 수율에서 생산되었다. DH2MB의 생산은 검출되지 않았다.
실시예 20: 클루이베로미세스 막시아누스( K. marxianus )에서 TMA29 결실의 효과
본 실시예의 목적은 ALS 활성을 포함하는 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) 균주에서 TMA29의 결실이 감소된 DH2MB 생산을 유발한다는 것을 증명하는 것이다.
본 실시예에서 개시된 균주, 플라스미드, 그리고 올리고뉴클레오티드 서열은 각각, 표 61, 62, 그리고 63에서 열거된다.
실시예 20에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO No. 유전형
1947 ura3 - delta2 , 균주 NRRL-Y-7571 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)로부터 유래됨 (E.C. Hansen) van der Walt (1971)
2348 ura3-delta2 pdc1△::G418R, P Sc_PDC1 :31COX4 MTS:Bs_alsS:P Sc_FBA1 :URA3 ura3-delta2
6403, 6404 ura3-delta2 pdc1△::G418R, P Sc_PDC1 :31COX4 MTS:alsS: P Sc_FBA1 :URA3 ura3-delta2 tma29△::P Sc_TEF1 -hph
실시예 20에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 명칭 관련된 유전자/용법 유전형
pGV2701 hph 단편을 제공하기 위한 SOE PCR을 위해 P TEF1 :hph, CEN, pUC ori, bla
실시예 20에서 개시된 올리고뉴클레오티드 서열.
프라이머 서열
3498 ATGTCTCAAGGTAGAAGAGCTG (서열 번호: 142)
3137 GGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGTATATCTTCTGAATCAATTGCACCGAC (서열 번호: 143)
3140 CAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGAGAGGTATGATTAATACCAATGTCTTGGG (서열 번호: 144)
3499 TCATTCACCACGGTAAATGTGG (서열 번호: 145)
3138 GTCGGTGCAATTGATTCAGAAGATATACATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCC (서열 번호: 146)
3139 GTATTAATCATACCTCTCTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTGAAATATAAATAACG (서열 번호: 147)
3501 GAAGGAAATTCCAGTCTCCTAGTTCCTTTGAACAC (서열 번호: 148)
2320 GGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAG (서열 번호: 149)
3500 CAGAACAATCAATCAACGAACGAACGACCCACCC (서열 번호: 150)
821 CGGGTAATTAACGACACCCTAGAGG (서열 번호: 151)
3141 AAGGAGATGCTTGGTTTGTAGCAAACACC (서열 번호: 152)
균주 작제 : 클루이베로미세스 막시아누스(K. marxianus) TMA29 단백질 (서열 번호: 23)을 인코딩하는 클루이베로미세스 막시아누스(K. marxianus) TMA29 유전자 동족체는 하기와 같이 부모 클루이베로미세스 막시아누스(K. marxianus) 균주 GEVO2348로부터 결실되어 균주 GEVO6403과 GEVO6404가 산출되었다.
유전체 DNA는 앞서 기술된 바와 같이 GEVO1947로부터 단리되었다. 앞서 기술된 바와 같이 SOE PCR에 의해 GEVO2348의 TMA29 좌위 내로 대장균(E. coli) hph (히그로마이신 내성) 카세트를 통합하는 구조체가 만들어졌다. PCR 단계 #1은 5' TMA29 표적화 서열, 3' TMA29 표적화 서열, 그리고 hph 마커를 산출하는 3가지 반응으로 구성되었다. 5' 표적화 서열은 준비된 GEVO1947 유전체 DNA로부터, 프라이머 oGV3498과 oGV3137로 증폭되었다. 상기 385 bp 단편은 겔 전기영동에 의해 정제되었다. 3' 표적화 서열은 준비된 GEVO1947 유전체 DNA로부터, 프라이머 oGV3140과 oGV3499로 증폭되었다. 상기 473 bp 단편은 겔 정제되었다. P TEF1 :hph:T CYC1(부분) 카세트는 pGV2701로부터, 프라이머 oGV3138과 oGV3139로 증폭되었다. 1,651 bp 단편은 겔 정제되었다. 최종 SOE PCR 단계는 단계 #1 (5' 표적화 서열/hph 마커/3' 표적화 서열)로부터 이들 3가지 산물을 연결하였다. 반응물은 프라이머 oGV3498과 oGV3499를 이용하여 증폭되었다. 2,414 bp 단편은 겔 정제되고 앞서 기술된 바와 같이 GEVO2348의 형질전환에 이용되었다. 형질전환을 위한 세포를 성장시키는데 이용되는 배지는 YPE이었다. 형질전환 이후에, 150 ㎕의 형질전환 배양액이 0.1 g/ℓ 히그로마이신을 내포하는 YPE 평판 위에 전개되었다. 이들 평판은 30℃에서 배양되고, 그리고 형질전환된 집락은 단일 집락 단리되고, 이후 0.1 g/ℓ 히그로마이신을 내포하는 YPE 평판 상에서 집락 PCR을 위해 패칭되었다.
효모 집락 PCR은 앞서 기술된 바와 같이 적절한 3' 통합 연접, 5' 통합 연접, 그리고 TMA29 코딩 영역의 결여를 스크리닝하는데 이용되었다. 적절한 3' 통합 연접은 프라이머 oGV3501과 2320을 이용하여 확증되었다. 적절한 5' 통합 연접은 프라이머 oGV3500과 oGV0821을 이용하여 확증되었다. 최종적으로, TMA29 내부 코딩 영역의 결실을 스크리닝하기 위해, 프라이머 oGV3500과 oGV3141이 이용되었다.
발효: 교반 플라스크 발효는 Bs_alsS를 발현하는 균주에서 TMA29의 결실이 감소된 DH2MB의 생산을 유발하는 지를 결정하기 위해, 앞서 기술된 바와 같이 균주 GEVO2348 (TMA29), GEVO6403 (tma29△), 그리고 GEVO6404 (tma29△) 각각에 대해 삼중으로 수행되었다. tma29△ 균주의 단일 집락 격리된 형질전환체는 0.1 g/ℓ 히그로마이신을 내포하는 YPE 평판에 패칭되는 반면, 부모 균주는 YPE 평판에 패칭되었다. 이들 패치로부터 세포는 YPE의 3 ㎖ 배양액을 접종하는데 이용되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 하룻밤 배양후, 이들 배양액의 OD600은 물에서 1:40 희석함으로써 측정되었다. 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 0.1의 OD600을 획득하기 위해 적절한 양의 배양액이 50 ㎖의 YPE에 첨가되고 30℃와 250 rpm에서 배양되었다. 24시간 배양후, 이들 배양액의 OD600이 물에서 1:40 희석함으로써 측정되었다. 5의 OD600을 획득하기 위해 8% 글루코오스 및 200 mM MES, pH 6.5를 내포하는 50 ㎖의 YPD에 적절한 양의 배양액이 첨가되었다. 발효 배양액은 차단되지 않은 250 ㎖ 플라스크에서 30℃와 75 rpm에서 배양되었다. 배지의 하나의 15 ㎖ 분취량 역시 LC4 분석을 위한 블랭크로서 이용을 위해 수집되고 샘플 제출 때까지 4℃에 유지되었다. 72시간후, 1.5 ㎖의 배양액이 이동되고, 그리고 OD600과 LC4 분석을 위해 샘플이 앞서 기술된 바와 같이 준비되었다. 이에 더하여, 효소 검사를 위한 샘플이 4℃에서 5분 동안 3000 x g로 원심분리된 2개의 15 ㎖ Falcon 튜브에 80 OD의 적절한 샘플을 이전함으로써 72시간 시점에 수확되었다. 펠릿은 3 ㎖ 차가운, 무균수에서 재현탁되고, 그리고 테이블탑 원심분리기 (tabletop centrifuge) 내에 스윙 버킷 로터 (swinging bucket rotor)에서 4℃에서 2분 동안 5000 x g로 원심분리되었다. 물은 진공 흡입기 (vacuum aspirator)에 의해 제거되었다. 코니칼 튜브는 -80℃에서 보관되었다.
용해물의 시험관내 ALS 효소적 활성은 앞서 기술된 바와 같이 측정되었다. 표 64에서는 72시간후 균주로부터 용해물의 평균 시험관내 ALS 효소적 활성을 제시한다. ALS 활성은 GEVO2348 (3.14 단위/mg 용해물의 평균)에서뿐만 아니라 tma29△ 균주 GEVO6403와 GEVO6404 (각각, 1.63과 1.58 단위/mg 용해물의 평균) 둘 모두에서 측정가능하다.
표 64에서는 또한, 이들 균주에 대한 LC4에 의한 DH2MB와 DHIV 역가를 제시한다. GEVO2348 (TMA29) 균주는 0.89 g/ℓ의 평균 DH2MB 역가를 산출하는 반면, DHIV는 검출되지 않았다. DH2MB 역가는 tma29△ 균주 GEVO6403과 GEVO6404에서 유의미하게 감소하였는데, 각각 0.16과 0.15 g/ℓ로 측정되었다. ALS 활성이 tma29△ 균주에서 감소하긴 하지만, 이것은 결실 균주에서 DH2MB 역가의 >80% 감소를 설명하지 못한다. 가령, GEVO2348의 한 가지 기술적 복제물은 2.5 단위/mg 용해물의 ALS 활성을 나타내고 0.83 g/ℓ DH2MB를 생산하는 반면, tma29△ 균주 GEVO6404의 기술적 복제물 중에서 한 가지는 1.9 단위/mg 용해물의 유사한 활성을 갖고 단지 0.16 g/ℓ DH2MB만을 생산하였다.
72시간 발효후, tma29△ 균주에서 ALS 활성, DH2MB와 DHIV 역가, 그리고 DH2MB 퍼센트 감소.
균주 TMA29 ALS 활성
(U/mg 용해물) 		LC4에 의한
DH2MB (g/ℓ) 		LC4에 의한
DHIV
(g/ℓ) 		DH2MB 감소
(%)
GEVO2348 + 3.1 ± 0.5 0.89 ± 0.07 n.d.
GEVO6403 △ 1.6 ± 0.2 0.16 ± 0.02 n.d. 82%
GEVO6404 △ 1.6 ± 0.3 0.15 ± 0.01 n.d. 83%
n.d. = 검출되지 않음
실시예 21: 클루이베로미세스 락티스( Kluyveromyces lactis )에서 TMA29 결실의 효과
본 실시예의 목적은 ALS 활성을 포함하는 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 균주에서 TMA29 의 결실이 감소된 DH2MB 생산을 유발한다는 것을 증명하는 것이다.
본 실시예에 개시된 균주, 플라스미드, 그리고 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각각, 표 65, 66, 그리고 67에서 열거된다.
실시예 21에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO 번호 유전형
1742 MATalpha uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1::kan, 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) 균주 ATCC 200826로부터 유래됨 (Kluyveromyces lactis (Dombrowski) van der Walt, teleomorph)
4458 MATalpha uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1::kan tma29::hph
6310, 6311, 6312 MATalpha uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1::kan [pGV1429]
6313, 6314, 6315 MATalpha uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1::kan [pGV1645]
6316, 6317 MATalpha uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1::kan + Bs_alsS:TRP1의 무작위 통합
6318, 6319, 6320 MATalpha uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1::kan tma29::hph [pGV1429]
6321, 6322,6323 MATalpha uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1::kan tma29::hph [pGV1645]
6324, 6325 MATalpha uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1::kan tma29::hph + Bs_alsS:TRP1의 무작위 통합
실시예 21에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 명칭 관련된 유전자/용법 유전형
pGV1429 TRP1을 내포하는 높은 사본 1.6 μ 빈 벡터 1.6 μ-ori, PMB1 ori, bla, TRP1
pGV1645 TRP1과 Bs_alsS를 내포하는 높은 사본 1.6 μ 벡터 1.6 μ-ori, PMB1 ori, bla, TRP1, Bs_alsS
pGV1726
( Ahd I로 선형화됨) 		TRP1과 Bs_alsS를 내포하는 벡터 PMB1 ori, bla, TRP1, Bs_alsS
실시예 21에서 개시된 올리고뉴클레오티드 서열.
프라이머 서열
oGV3065 AAAAAGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGCGTTGATAAGGGCAACAACGTTAGTATC (서열 번호: 153)
oGV3066 ATACTAACGTTGTTGCCCTTATCAACGCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTAC (서열 번호: 154)
oGV3067 TCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGTTACCCAAGCTGTTTTGCCTATTTTCAAAGC (서열 번호: 155)
oGV3068 GCTTTGAAAATAGGCAAAACAGCTTGGGTAACTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTG (서열 번호: 156)
oGV3103 ACCGGTGCTTCTGCAGGTATTG (서열 번호: 157)
oGV3106 ATGCTTGGTTGGAAGCAAATAC (서열 번호: 158)
oGV1321 AATCATATCGAACACGATGC (서열 번호: 159)
oGV1324 AGCTGGTCTGGTGATTCTAC (서열 번호: 160)
균주 작제 : 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) TMA29 단백질 (서열 번호: 7)을 인코딩하는 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) TMA29 유전자 동족체는 하기와 같이 부모 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) 균주 GEVO1742로부터 결실되어 실시예 18에서 기술된 바와 같이 균주 GEVO4458가 산출되었다.
클루이베로미세스 락티스(K. lactis) 균주 GEVO1742 (부모, TMA29) 및 GEVO4458 (tma29△)은 앞서 기술된 바와 같이 플라스미드 pGV1429 (빈 대조 벡터), pGV1645 (Bs_alsS를 발현), 또는 AhdI 선형화된 플라스미드 pGV1726 (Bs_alsS의 무작위 통합을 유발)으로 형질전환되고, 400 ㎕의 1.25x SC-HWLU에서 재현탁되고, 그리고 형질전환된 세포를 선별하기 위해 SCD-W 평판 위에 전개되었다. GEVO1742와 tma29△ 균주 GEVO4458 둘 모두에서 AhdI 선형화된 pGV1726의 무작위 통합은 앞서 기술된 바와 같이 내부 Bs_alsS 코딩 영역에 특이적인 프라이머 oGV1321과 oGV1324를 이용한 집락 PCR에 의해 확증되었다. 균주 GEVO6316, GEVO6317, GEVO6324, 그리고 GEVO6325는 유전자 통합에 양성이었다.
발효: 교반 플라스크 발효는 Bs_alsS를 발현하는 균주에서 TMA29의 결실이 감소된 DH2MB의 생산을 유발하는 지를 결정하기 위해 앞서 기술된 바와 같이 다양한 GEVO 균주 (표 65)에서 수행되었다. 단일 집락 단리된 형질전환체는 SCD-W 평판에 패칭되고, 비-형질전환된 부모는 YPD 상에 패칭되었다. 이들 패치로부터 세포는 YPD (부모 균주 및 통합된 균주) 또는 3 ㎖ SCD-W에서 3 ㎖ 배양액을 접종하는데 이용되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 하룻밤동안 배양후, 이들 배양액의 OD600이 물에서 1:40 희석함으로써 측정되었다. 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 0.1의 OD600을 획득하기 위해 적절한 양의 배양액이 5% 글루코오스를 내포하는 50 ㎖의 YPD 또는 5% 글루코오스를 내포하는 SCD-W에 첨가되고 30℃와 250 rpm에서 배양되었다. 24시간 배양후, 이들 배양액의 OD600이 물에서 1:40 희석함으로써 측정되었다. 5의 OD600을 획득하기 위해 적절한 양의 배양액이 8% 글루코오스, 200 mM MES pH 6.5를 내포하는 50 ㎖의 YPD 또는 8% 글루코오스를 내포하는 SCD-W에 첨가되었다. 250 OD가 발효를 시작하는데 유효하지 않으면, 전체 50 ㎖ 배양액이 이용되었다. 발효 배양액은 차단되지 않은 250 ㎖ 플라스크에서 30℃와 75 rpm에서 배양되었다. 15 ㎖ 코니칼 튜브 역시 앞서 기술된 바와 같이 LC1과 LC4 분석을 위한 배지 블랭크 (media blank)로서 수집되고 샘플 제출 때까지 4℃에 유지되었다. 72시간 시점에, 1.5 ㎖의 배양액이 계산되었다. OD600 값이 측정되고, 그리고 10분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하고 분석되는 1 ㎖의 상층액을 이동함으로써 LC1과 LC4 분석을 위한 샘플이 준비되었다. 이에 더하여, 효소 검사를 위한 샘플이 72시간 시점에서 수확되었다. 60 OD의 적절한 샘플이 15 ㎖ Falcon 튜브 내로 이전되고 4℃에서 5분 동안 3000 X로 원심분리되었다. 펠릿은 3 ㎖ 차가운, 무균수에서 재현탁되고, 그리고 3 x 20 OD 복제물을 만들기 위해 3개의 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브 (각각 1 ㎖)로 이전되었다. 이들 튜브는 테이블탑 원심분리기 (tabletop centrifuge) 내에 스윙 버킷 로터 (swinging bucket rotor)에서 4℃에서 2분 동안 5000 x g로 원심분리되었다. 물은 진공 흡입기 (vacuum aspirator)에 의해 제거되었다. 에펜도르프 튜브는 -80℃에서 보관되었다.
용해물의 시험관내 ALS 효소적 활성은 앞서 기술된 바와 같이 측정되었다. 표 68에서는 72시간후 균주로부터 용해물의 평균 시험관내 ALS 효소적 활성을 제시한다. ALS 활성은 Bs_alsS가 무작위로 통합된 균주 (GEVO6316, GEVO6317, GEVO6324, 6325) 또는 Bs_alsS가 플라스미드로부터 발현된 균주 (GEVO6313-6315, GEVO6321-6323)에서만 측정가능하였다. Bs_alsS가 통합된 균주에서 ALS 활성은 플라스미드로부터 Bs_alsS를 발현하는 균주에서보다 낮았다. 하지만, Bs_alsS가 통합된 TMA29 균주 (GEVO6316, GEVO6317)에서 0.25 단위/mg 용해물의 활성은 합동된 DHIV + DH2MB의 역가 1.06 g/ℓ를 산출하는데 여전히 충분하였다.
표 68에서는 72시간 발효후 다양한 균주에 대한, LC1 분석에 기초된 합동된 DHIV + DH2MB 역가를 제시한다. 균주 GEVO1742 (부모, TMA29) 균주는 Bs_alsS가 무작위로 통합 (1.06 g/ℓ)되거나, 또는 플라스미드 pGV1645로부터 발현 (0.45 g/ℓ)될 때에만 측정가능한 합동된 DHIV + DH2MB 역가를 산출하였다. 이들 DHIV + DH2MB 역가는 무작위 통합 (GEVO6324, GEVO6325) 또는 플라스미드 (GEVO6321-6323)에 의해 Bs_alsS를 발현할 때 tma29△ 균주 GEVO4458에서 소멸되었다. LC4 분석은 합동된 DHIV + DH2MB 역가 중에서 대부분이 실제로는 DH2MB라는 것을 지시하였다.
ALS 활성, 합동된 DHIV + DH2MB 역가, 그리고 합동된 DHIV + DH2MB 역가 중에서 DH2MB의 백분율.
균주 부모
균주 		통합된
플라스미드 (I),
플라스미드 (P),
또는 대조l (C) 		TMA29 ALS ALS 활성
(U/mg 용해물) 		LC1에 의한
DHIV + DH2MB
(g/ℓ) 		LC4에 의한
DH2MB + DHIV에서
DH2MB %
GEVO1742 없음 + - 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 n/a
GEVO6316, 6317 GEVO1742 pGV1726 (I) + + 0.25 ± 0.06 1.06 ± 0.23 80.0 ± 3.7
GEVO4458 GEVO1742 없음 △ - 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 n/a
GEVO6324, 6325 GEVO4458 pGV1726 (I) △ + 0.86 ± 0.28 0.00 ± 0.00 n/a
GEVO6310-6312 GEVO1742 pGV1429 (C) + - 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 n/a
GEVO6313-6315 GEVO1742 pGV1645 (P) + + 6.12 ± 1.09 0.45 ± 0.02 87.2 ± 2.3
GEVO6318-6320 GEVO4458 pGV1429 (C) △ - 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 n/a
GEVO6321-6323 GEVO4458 pGV1645 (P) △ + 1.23 ± 0.45 0.00 ± 0.00 n/a
n/a= 적용할 수 없음, 샘플이 LC1에 의한 검출가능한 피크를 갖지 않고, 따라서 LC4에 의해 분석되지 않았다.
실시예 22: 아이싸첸키아 오리엔탈리스( I. orientalis )에서 TMA29 결실의 효과
하기 실시예에서는 아이싸첸키아 오리엔탈리스(I. orientalis) TMA29 유전자의 결실이 감소된 TMA29 활성을 유발하고, 또한 ALS 활성을 포함하는 균주에서 DH2MB 생산의 감소를 유발한다는 것을 예증한다.
실시예 22에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO # 관련 유전형
GEVO4450 ura3△/ura3△
pdc1-1△::Ll_kivD: T ScCYC1 : loxP: P ENO1 : Bs_alsS /
pdc1-2△::Ll_kivD: T ScCYC1 : loxP: P ENO1 : Bs_alsS
TMA29/TMA29
GEVO12425 ura3△/ura3△
pdc1-1△:: Ll_kivD: T ScCYC1 : loxP: P ENO1 : Bs_alsS pdc1-2△:: Ll_kivD: loxP
TMA29 / TMA29
GEVO6155 ura3△/ura3△
pdc1-1△::Ll_kivD: T ScCYC1 : loxP: P ENO1 : Bs_alsS
pdc1-2△::Ll_kivD: loxP
TMA29/
tma29△::P PDC :Ll_adhA RE1 : P TDH3 : Ec_ilvC P2D1-A1 : loxP: URA3: loxP: P ENO1 : Ll_ilvD
GEVO6158 ura3△/ ura3△
pdc1-1△:: Ll_kivD: T ScCYC1 : loxP: P ENO1 : Bs_alsS
pdc1-2△:: Ll_kivD: loxP
tma29△:: P PDC : Ll_adhA RE1 : P TDH3 : Ec_ilvC P2D1-A1 _coCB: loxP: URA3: loxP: P ENO1 : Ll_ilvD /
tma29△:: P PDC : Ll_adhA RE1 : P TDH3 :Ec_ilvC P2D1-A1 : loxP: URA3: loxP: P ENO1 : Ll_ilvD
GEVO12473 ura3△/ ura3△
pdc1-1△:: Ll_kivD: T ScCYC1 : loxP: P ENO1 : Bs_alsS
pdc1-2△:: Ll_kivD: loxP
tma29△:: loxP: URA3: loxP/
tma29△::loxP: MEL5: loxP
GEVO12474 ura3△/ura3△
pdc1-1△:: Ll_kivD: T ScCYC1 : loxP: P ENO1 : Bs_alsS
pdc1-2△:: Ll_kivD: loxP
tma29△:: loxP: URA3: loxP/
tma29△:: loxP: MEL5: loxP
균주 작제 : TMA29 유전자에 대해 야생형 (GEVO4450, GEVO12425)이거나, TMA29 유전자의 1개 사본의 결실에 대해 이형접합체 (GEVO6155)이거나, 또는 TMA29 유전자가 완전하게 결실된 (GEVO6158, GEVO12473, GEVO12474), PTA-6658로부터 유래된 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) 균주가 표준 효모 유전학과 분자 생물학 방법을 이용하여 작제되었다. 이들 균주는 또한, 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) alsS 유전자의 1개 사본을 보유한다.
TMA29 효소 검사: TMA29 시험관내 검사를 위해, 아이싸첸키아 오리엔탈리스(I. orientalis) 균주 GEVO4450 (TMA29/TMA29), GEVO6155 (tma29△/TMA29), 그리고 GEVO6158 (완전한 tma29△/tma29△)는 새로운 YPD 평판으로부터 세포로, 125 ㎖ 차단된 플라스크에서 25 ㎖ YPD를 접종함으로써 성장되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 성장되었다. 이들 배양액은 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 50 ㎖의 YPD를 0.05의 OD600까지 접종하는데 이용되었다. 배양액은 대략 5-8의 OD600에 도달할 때 (후기 로그 기)까지 30℃와 250 rpm에서 성장되었다. 세포는 50 ㎖ Falcon 튜브에서 80 OD의 세포를 수집하고 3분 동안 2,700 x g로 원심분리함으로써 수확되었다. 상층액의 제거후, 세포는 얼음 위에 배치되고 5 ㎖ 차가운 물로 세척되었다. 세포는 3분 동안 2,700 x g로 원심분리되고, 그리고 물이 제거되었다. 세포 펠릿은 이용 때까지 -80℃에 보관되었다. 추가적으로, 동일한 균주가 새로운 평판으로부터 3 ㎖의 YPD를 접종하고 30℃와 250 rpm에서 8시간 동안 성장시킴으로써 성장되었다. 배양액은 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 50 ㎖의 YPD를 0.01의 OD600까지 접종하는데 이용되고, 그리고 이들 배양액은 대략 4-8의 OD600에 도달할 때까지 30℃와 250 rpm에서 성장되었다. 상기 배양액은 적절한 양의 배양액을 50 ㎖ Falcon 튜브에서 3분 동안 2,700 x g로 원심분리하고, 이후 세포 펠릿을 50 ㎖의 지정된 배지에서 재현탁함으로써, 8% 글루코오스, 200 mM MES pH 6.5를 내포하는 50 ㎖의 YPD를 4-5의 최종 OD600까지 접종하는데 이용되었다. 세포는 250 ㎖ 비-차단된 플라스크에서 30℃와 75 rpm에서 48시간 동안 배양되었다 (발효 기). 80개의 OD 세포 펠릿이 앞서 기술된 바와 같이 수확되었다. 세포는 재현탁되고, 용해되고, 그리고 앞서 기술된 바와 같이 TMA29 활성에 대해 조사되었다.
표 70에서는 U/mg 총 단백질에서 아이싸첸키아 오리엔탈리스(I. orientalis) 균주 GEVO4450, 6155, 그리고 6158의 용해물의 특정한 TMA29 활성을 제시한다. 특정한 TMA29 활성은 GEVO4450 (TMA29/TMA29)와 비교하여 GEVO6155 (tma29/TMA29) 및 GEVO6158 (완전한 tma29 결실)에서 감소한다.
아이싸첸키아 오리엔탈리스(I. orientalis) 균주에서 TMA29 활성.
균주 TMA29 활성
후기 로그 기
[U/mg 총 단백질] 		TMA29 활성
48시간 발효 기
[U/mg 총 단백질]
GEVO4450 0.0048 ± .0010 .0027 ± .0003
GEVO6155 0.0025 ± .0008 .0010 ± .0001
GEVO6158 0.0023 ± .0003 .0010 ± .0003
발효: 발효를 위해, 아이싸첸키아 오리엔탈리스(I. orientalis) 균주 GEVO12425 (TMA29 / TMA29), GEVO12473 (tma29 / tma29), 그리고 GEVO12474 (tma29/tma29)는 새로운 YPD 평판으로부터 세포로, 125 ㎖ 차단된 플라스크에서 12 ㎖ YPD를 접종함으로써 성장되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 성장되었다. 12 ㎖ 하룻밤 배양액의 OD600이 측정되고, 그리고 적절한 양이 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 5% 글루코오스를 내포하는 50 ㎖ YPD를 0.1의 OD600까지 접종하는데 이용되었다. 플라스크는 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 50 ㎖ 배양액의 OD600이 측정되었다. 적절한 양의 배양액은 50 ㎖ Falcon 튜브에서 25℃에서 5분 동안 2700 rcf로 원심분리되고, 그리고 상층액이 제거되었다. 각각 50 ㎖ 배양액으로부터 세포는 8% 글루코오스, 200 mM MES, pH 6.5를 내포하는 50 ㎖ YPD에서 재현탁되었다. 배양액은 이후, 250 ㎖ 차단되지 않은 스크루-캡 플라스크로 이전되고 30℃와 75 rpm에서 배양되었다. 72시간 시점에, 각 플라스크로부터 샘플이 이동되고, OD600이 측정되고, 그리고 1 ㎖ 샘플을 에펜도르프 튜브로 이전하고 25℃에서 10초 동안 18,000 x g로 원심분리함으로써 LC4 분석을 위한 샘플이 준비되었다. 원심분리후, 0.75 ㎖의 상층액이 마이크로역가 평판으로 이전되고 LC4에 의해 분석되었다. 또한, 72시간 시점에 효소 검사를 위한 세포는 앞서 기술된 바와 같이 80 OD를 15 ㎖ Falcon 튜브로 이전함으로써 수집되었다. ALS 검사를 위한 세포는 재현탁되고, 용해되고, 그리고 앞서 기술된 바와 같이 조사되었다.
표 71에서는 72시간 시점에 GEVO12425, 12473, 그리고 12474에 대한 DH2MB 생산 및 ALS 활성을 제시한다. DH2MB 역가는 LC4에 의해 측정되었다. ALS 활성은 모든 균주에서 유사하였다.
72시간 발효에서 아이싸첸키아 오리엔탈리스(I. orientalis) 균주에서 DH2MB 생산 및 ALS 활성.
균주 LC4에 의한 DH2MB
[g/ℓ] 		ALS 활성
[U/mg]
GEVO12425 1.87 ± 0.60 4.6 ± 1.1
GEVO12473 0.08 ± 0.01 4.0 ± 0.1
GEVO12474 0.07 ± 0.00 3.1 ± 1.1
실시예 23: 시조사카로미세스 폼베( S. pombe )에서 TMA29 결실의 효과
하기 실시예에서는 (S)-2-아세토락테이트 감소 활성이 시조사카로미세스 폼베(S. pombe) TMA29 균주와 비교하여 시조사카로미세스 폼베(S. pombe) tma29△ 균주에서 유의미하게 감소한다는 것을 예증한다.
실시예 23에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO # 유전형 출처
GEVO6444 h+ ade6-M216, ura4-D18, leu1-32 Bioneer 균주 BG_0000H8
GEVO6445 h+ SPAC521.03△::kanMX4, ade6-M216, ura4-D18, leu1-32
TMA29 동족체 (서열 번호: 22) 결실됨		 Bioneer 균주 BG_1772H
본래의 TMA29 유전자 (서열 번호: 161)를 갖는 효모 균주 GEVO6444 및 TMA29 유전자가 결실된 GEVO6445는 125 ㎖ 차단된 플라스크 내에 12 ㎖ YPD에서 하룻밤동안 250 rpm과 30℃에서 성장되었다. 익일에, OD600 값이 측정되고, 그리고 대략 0.3의 OD600에서 5% 글루코오스를 내포하는 50 ㎖ YPD에서 기술적 삼중 배양이 시작되었다. 배양액은 하루 내내 250 rpm과 30℃에서 성장되었다. 하루의 종결 시점에서, 배양액은 5% 글루코오스를 내포하는 YPD에서 대략 0.15의 OD600까지 희석되고 250 rpm과 30℃에서 하룻밤동안 배양되었다. 세포는 4 내지 6의 OD600에 도달 시에 수확되었다. 효소 검사를 위한 펠릿을 수확하기 위해, 80 OD의 적절한 샘플이 2개의 15 ㎖ Falcon 튜브 (삼중 샘플을 위해)로 이전되고 4℃에서 5분 동안 3000 x g로 원심분리되었다. 펠릿은 3 ㎖ 차가운 무균수에서 재현탁되고 테이블탑 원심분리기 내에 스윙 버킷 로터에서 4℃에서 2분 동안 5000 X g로 원심분리되었다. 물은 진공 흡입기에 의해 제거되었다. 펠릿은 -80℃에서 보관되었다. 용해물이 준비되고, 그리고 TMA29 효소 검사가 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다.
(S)-2-아세토락테이트의 환원에 대한 시조사카로미세스 폼베(S. pombe) GEVO6444 용해물의 비활성은 0.018 ± 0.002 U/mg 총 단백질이었다. tma29△ 균주 GEVO6445의 용해물은 0.001 ± 0.002 U/mg 총 단백질의 비활성을 가졌다.
실시예 24: 클루이베로미세스 막시아누스( K. marxianus )에서 ALD6 결실의 효과
본 실시예의 목적은 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) 균주에서 ALD6의 결실이 감소된 이소부티르알데히드 산화 활성과 이소부티레이트 생산을 유발한다는 것을 증명하는 것이다.
본 실시예에서 개시된 균주, 플라스미드, 그리고 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각각, 표 73, 74, 그리고 75에서 열거된다.
실시예 24에서 개시된 클루이베로미세스 막시아누스(K. marxianus) 균주의 유전형.
GEVO 번호 유전형
GEVO1947 ura3-delta2
GEVO6264,
GEVO6265 		ura3-delta2 ald6△::P TEF1 -hph
GEVO2087 ura3-delta2, PDC1, P Sc_PDC1 :31COX4 MTS:alsS:P Sc_TDH3 :kivD co HMI1 MTS:P Sc_ADH1 :ADH7:P Sc_FBA1 :URA3
GEVO6270
GEVO6271 		ura3-delta2, PDC1, P Sc_PDC1 :31COX4 MTS:alsS:P Sc_TDH3 :kivD co HMI1 MTS:P Sc_ADH1 :ADH7:P Sc_FBA1 :URA3 ald6△::P TEF1 -hph
실시예 24에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 명칭 관련된 유전자/용법 유전형
pGV2701 hph 단편을 제공하기 위한 SOE PCR을 위해 P TEF1 :hph, CEN, pUC ori, bla
실시예 24에서 개시된 올리고뉴클레오티드 서열.
프라이머 서열
oGV3490 GTCAAGATTGTTGAACAAAAGCC (서열 번호: 162)
oGV3492 GAGTAAAAAAGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGGTTTAGTGGGGTTGGGGAAGCTGGC (서열 번호: 163)
oGV3493 CAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGGCCAACATCAAGAAGACTATTCCAAACTTGGTC (서열 번호: 164)
oGV3495 TGTATGATTCGAAAGCTTCTTCACC (서열 번호: 165)
oGV3491 GCCAGCTTCCCCAACCCCACTAAACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTC (서열 번호: 166)
oGV3494 GACCAAGTTTGGAATAGTCTTCTTGATGTTGGCCTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTG (서열 번호: 167)
oGV3497 TTACTCGAGCTTGATTCTGAC (서열 번호: 168)
oGV2320 GGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAG (서열 번호: 169)
oGV3496 ATGTCTTCATCACTAGCAGAG (서열 번호: 170)
oGV0821 CGGGTAATTAACGACACCCTAGAGG (서열 번호: 171)
oGV0706 GGTTGGTATTCCAGCTGGTGTCG (서열 번호: 172)
균주 작제 : 클루이베로미세스 막시아누스(K. marxianus) ALD6 단백질 (서열 번호: 39)을 인코딩하는 클루이베로미세스 막시아누스(K. marxianus) ALD6 유전자 동족체는 하기와 같이 부모 클루이베로미세스 막시아누스(K. marxianus) 균주 GEVO1947과 GEVO2087로부터 결실되어 각각, 균주 GEVO6264/GEVO6265, 그리고 GEVO6270/GEVO6271이 산출되었다.
유전체 DNA는 앞서 기술된 바와 같이 GEVO1947로부터 단리되었다. 앞서 기술된 바와 같이 SOE PCR에 의해, 대장균(E. coli) hph (히그로마이신 내성) 카세트를 GEVO1947과 GEVO2087의 ALD6 좌위 내로 통합하기 위한 구조체가 만들어졌다. PCR 단계 #1은 3가지 반응물: 5' ALD6 표적화 서열, 3' ALD6 표적화 서열, 그리고 hph 마커로 구성되었다. 5' 표적화 서열은 준비된 GEVO1947 유전체 DNA로부터, 프라이머 oGV3490과 oGV3492로 증폭되었다. 상기 635 bp 단편은 겔 전기영동에 의해 정제되었다. 3' 표적화 서열은 준비된 GEVO1947 유전체 DNA로부터, 프라이머 oGV3493과 oGV3495로 증폭되었다. 상기 645 bp 단편은 겔 정제되었다. P TEF1 :hph:T CYC1(부분) 카세트는 pGV2701로부터, 프라이머 oGV3491과 oGV3494로 증폭되었다. 1,665 bp 단편은 겔 정제되었다. 최종 SOE PCR 단계는 단계 #1 (5' ALD6 표적화 서열/hph 마커/3' ALD6 표적화 서열)로부터 이들 3가지 산물을 연결하였다. 반응물은 프라이머 oGV3490과 oGV3495를 이용하여 증폭되었다. 2,826 bp 단편은 겔 정제되고 앞서 기술된 바와 같이 GEVO1947과 GEVO2087의 형질전환에 이용되었다. 형질전환을 위한 세포를 성장시키는데 이용되는 배지는 YPD이었다. 형질전환 이후에, 150 ㎕의 각 형질전환 배양액이 0.2 g/ℓ 히그로마이신으로 보충된 YPD 평판 위에 전개되었다. 이들 평판은 30℃에서 배양되었다. 형질전환된 집락은 최초 집락 PCR 스크리닝을 위해 패칭되고, 이후 단일 집락 단리되고 0.2 g/ℓ 히그로마이신으로 보충된 YPD 평판 상에 재패칭되었다.
효모 집락 PCR은 앞서 기술된 바와 같이 적절한 3' 통합 연접, 5' 통합 연접, 그리고 ALD6 코딩 영역의 결여를 스크리닝하는데 이용되었다. 적절한 3' 통합 연접은 프라이머 oGV3497과 oGV2320을 이용하여 확증되었다. 적절한 5' 통합 연접은 프라이머 oGV3496과 oGV0821을 이용하여 확증되었다. 최종적으로, ALD6 내부 코딩 영역의 결실은 프라이머 oGV3495와 oGV0706을 이용하여 확증되었다.
발효: 2 g/ℓ 이소부티르알데히드로 교반 플라스크 발효는 앞서 기술된 바와 같이, ALD6 균주 GEVO6264/GEVO6265 및 GEVO6270/GEVO6271, 그리고 그들의 상응하는 ALD6 부모 균주 GEVO1947과 GEVO2087의 기술적 삼중을 이용하여 수행되었다.
확증된 ALD6△ 균주의 단일 집락 격리된 형질전환체는 0.2 g/ℓ 히그로마이신으로 보충된 YPD 평판에 패칭되고, 그리고 부모 균주는 YPD 평판에 패칭되었다. 이들 패치로부터 세포는 YPD의 기술적 삼중 3 ㎖ 배양액을 접종하는데 이용되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 하룻밤 배양후, 이들 배양액의 OD600은 물에서 1:40 희석함으로써 측정되었다. 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 0.1의 OD600을 획득하기 위해 적절한 양의 배양액이 5% 글루코오스를 내포하는 50 ㎖의 YPD에 첨가되고 30℃와 250 rpm에서 배양되었다. 24시간 배양후, 이들 배양액의 OD600이 물에서 1:40 희석함으로써 측정되었다. 5의 OD600을 획득하기 위해 8% 글루코오스, 200 mM MES, pH 6.5 및 2 g/ℓ 이소부티르알데히드를 내포하는 50 ㎖의 YPD에 적절한 양의 배양액이 첨가되었다. 발효 배양액은 차단되지 않은 250 ㎖ 플라스크에서 30℃와 75 rpm에서 배양되었다. 이용되지 않는 배지는 LC 분석을 위한 배지 블랭크 (medium blank)로서 수집되고 샘플 제출 때까지 4℃에서 유지되었다. 48시간 시점에, 각 플라스크로부터 샘플이 하기와 같이 채취되었다. 1.5 ㎖의 배양액이 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브로 이동되었다. OD600 값이 측정되고, 그리고 샘플이 LC1 분석에 대비되었다. 각 튜브는 10분 동안 14,000 rpm으로 원심분리되고, 그리고 상층액이 LC1에 의해 분석되었다. 이에 더하여, 효소 검사를 위한 샘플이 48시간후 수확되었다. 80 OD의 적절한 샘플이 2개의 15 ㎖ Falcon 튜브 (중복 샘플을 위해)로 이전되고 4℃에서 5분 동안 3000 x g로 원심분리되었다. 펠릿은 3 ㎖ 차가운 무균수에서 재현탁되고 스윙 버킷 로터에서 4℃에서 2분 동안 5000 X g로 원심분리되었다. 물은 진공 흡입기 (vacuum aspirator)에 의해 제거되었다. 코니칼 튜브는 -80℃에서 보관되었다.
표 76에서는 48시간 발효후 이소부티레이트 역가를 제시한다. ALD6 부모 균주 GEVO1947은 각각, 0.19 g/ℓ와 0.013 g/ℓ/OD의 평균 총 이소부티레이트 역가 및 평균 특정 이소부티레이트 역가를 산출하였다. 이들 총 이소부티레이트 역가와 특정 이소부티레이트 역가는 ald6△ 균주 GEVO6264 (각각, 0.06 g/ℓ와 0.004 g/ℓ/OD), 그리고 또한, ald6△ 균주 GEVO6265 (각각, 0.05 g/ℓ와 0.003 g/ℓ/OD)에서 유의미하게 감소하였다. ALD6 부모 균주 GEVO2087은 각각, 0.15 g/ℓ와 0.008 g/ℓ/OD의 총 이소부티레이트 역가 및 특정 이소부티레이트 역가를 산출하였다. 총 이소부티레이트 역가 및 특정 이소부티레이트 역가는 ald6△ 균주 GEVO6270 (0.05 g/ℓ와 0.003 g/ℓ/OD), 그리고 또한, ald6△ 균주 GEVO6271 (각각, 0.08 g/ℓ와 0.005 g/ℓ/OD)에서 유미하게 감소하였다.
Figure pct00007
실시예 25: 클루이베로미세스 락티스( K. lactis )에서 ALD6 결실의 효과
본 실시예의 목적은 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) 균주에서 ALD6의 결실이 감소된 이소부티르알데히드 산화 활성과 이소부티레이트 생산을 유발한다는 것을 증명하는 것이다.
본 실시예에서 개시된 균주, 플라스미드, 그리고 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각각, 표 77, 78과 79에 열거된다.
실시예 25에서 개시된 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) 균주의 유전형.
GEVO 번호 유전형
GEVO1287 MATα uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1], 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) (Dombrowski) van der Walt, teleomorph, ATCC 200826
GEVO6242 MATα uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] ald6△::P TEF1 -hph
GEVO1830 MATα uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1::kan:Ec_ilvC_△N:Ec_ilvD△N_coKl::Sc_LEU2 통합됨} {Ll_kivD;Sc_Adh7:Km_URA3 무작위로 통합됨} {P Sc_CUP1-1 :Bs_alsS:TRP1 무작위 통합됨}
GEVO6244,
GEVO6245 		MATα uraA1 trp1 leu2 lysA1 ade1 lac4-8 [pKD1] pdc1::kan:Ec_ilvC_△N:Ec_ilvD△N_coKl::Sc_LEU2 통합됨} {Ll_kivD;Sc_Adh7:Km_URA3 통합됨} {PSc_CUP1-1:Bs_alsS:TRP1 무작위 통합됨} ald6△::P TEF1 -hph
실시예 25에서 개시된 플라스미드.
플라스미드 명칭 유전형
pGV2701 P TEF1 :hph, CEN, pUC ori, bla
실시예 25에서 개시된 올리고뉴클레오티드 서열.
프라이머 서열
oGV3502 GAAACACAGTGGATTAGTGCTGTC (서열 번호: 173)
oGV3504 GAAGAGTAAAAAAGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGCTCTTTGTAATTGTTGTTGGTG (서열 번호: 174)
oGV3505 CAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAAACAGAGTCCATCCGTTTGAAACTGATTGCATGTC (서열 번호: 175)
oGV3507 TCAAATTCTATTATCGCGCGGG (서열 번호: 176)
oGV3503 CACCAACAACAATTACAAAGAGCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTC (서열 번호: 177)
oGV3506 GACATGCAATCAGTTTCAAACGGATGGACTCTGTTTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTG (서열 번호: 178)
oGV3509 CTCCTCCGTTGCAGAACAAGGCTTTG (서열 번호: 179)
oGV2320 GGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAG (서열 번호: 180)
oGV3508 CGGTGTTAAGTGCCAGAAATTGGTTG (서열 번호: 181)
oGV0821 CGGGTAATTAACGACACCCTAGAGG (서열 번호: 182)
oGV3510 CGGCGTACTCGACGTCTTGAGAAGTAG (서열 번호: 183)
균주 작제 : 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) ALD6 단백질 (서열 번호: 29)을 인코딩하는 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) ALD6 유전자 동족체는 하기와 같이 부모 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) 균주 GEVO1287과 GEVO1830으로부터 결실되어 각각, 균주 GEVO6242와 GEVO6244/GEVO6245가 산출되었다.
유전체 DNA는 앞서 기술된 바와 같이 GEVO1287로부터 단리되었다. 앞서 기술된 바와 같이 SOE PCR에 의해, 대장균(E. coli) hph (히그로마이신 내성) 카세트를 GEVO1287과 GEVO1830의 ALD6 좌위 내로 통합하기 위한 구조체가 만들어졌다. PCR 단계 #1은 3가지 반응물: 5' ALD6 표적화 서열, 3' ALD6 표적화 서열, 그리고 hph 마커로 구성되었다. 5' 표적화 서열은 준비된 GEVO1987 유전체 DNA로부터, 프라이머 oGV3502와 oGV3504로 증폭되었다. 상기 639 bp 단편은 겔 전기영동에 의해 정제되었다. 3' 표적화 서열은 준비된 GEVO1287 유전체 DNA로부터, 프라이머 oGV3505와 oGV3507로 증폭되었다. 상기 628 bp 단편은 겔 정제되었다. P TEF1 :hph:T CYC1(부분) 카세트는 pGV2701로부터, 프라이머 oGV3503과 oGV3506으로 증폭되었다. 1,663 bp 단편은 겔 정제되었다. 최종 SOE PCR 단계는 단계 #1 (5' 표적화 서열/hph 마커/3' 표적화 서열)로부터 이들 3가지 산물을 연결하였다. 반응물은 프라이머 oGV3502와 oGV3507을 이용하여 증폭되었다. 2,810 bp 단편은 겔 정제되고 앞서 기술된 바와 같이 GEVO1287과 GEVO1830의 형질전환에 이용되었다. 집락은 0.1 g/ℓ 히그로마이신으로 보충된 YPD 평판 상에서 히그로마이신 내성에 대해 선별되었다. 효모 집락 PCR은 앞서 기술된 바와 같이 적절한 3' 통합 연접, 5' 통합 연접, 그리고 ALD6 코딩 영역의 결여를 스크리닝하는데 이용되었다. 적절한 3' 통합 연접은 프라이머 oGV3509와 oGV2320을 이용하여 확증되었다. 적절한 5' 통합 연접은 프라이머 oGV3508과 oGV0821을 이용하여 확증되었다. 최종적으로, ALD6 내부 코딩 영역의 결실은 프라이머 oGV3508과 oGV3510을 이용하여 확증되었다.
발효: 배지에서 2 g/ℓ 이소부티르알데히드로 첫 번째 교반 플라스크 발효는 ALD6 균주 GEVO6242 및 ALD6 야생형 부모 균주 GEVO1287의 기술적 삼중을 이용하여 수행되었다. 확증된 ALD6△ 결실 균주의 단일 집락 격리된 형질전환체는 0.1 g/ℓ 히그로마이신으로 보충된 YPD 평판에 패칭되고, 그리고 부모 균주는 YPD 평판에 패칭되었다. 이들 패치로부터 세포는 YPD의 기술적 삼중 3 ㎖ 배양액을 접종하는데 이용되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 하룻밤 배양후, 이들 배양액의 OD600은 물에서 1:40 희석함으로써 측정되었다. 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 0.1의 OD600을 획득하기 위해 적절한 양의 배양액이 5% 글루코오스를 내포하는 50 ㎖의 YPD에 첨가되고 30℃와 250 rpm에서 배양되었다. 24시간 배양후, 이들 배양액의 OD600이 물에서 1:40 희석함으로써 측정되었다. 5의 OD600을 획득하기 위해 8% 글루코오스, 200 mM MES, pH 6.5 및 2 g/ℓ 이소부티르알데히드를 내포하는 50 ㎖의 YPD에 적절한 양의 배양액이 첨가되었다. 발효 배양액은 차단되지 않은 250 ㎖ 플라스크에서 30℃와 75 rpm에서 배양되었다. 이용되지 않는 배지는 LC1 분석을 위한 배지 블랭크 (medium blank)로서 수집되고 샘플 제출 때까지 4℃에서 유지되었다. 24시간 시점에, 각 플라스크로부터 샘플이 하기와 같이 채취되었다. 1.5 ㎖의 배양액이 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브로 이동되었다. OD600 값이 측정되고, 그리고 샘플이 LC1 분석에 대비되었다. 각 튜브는 10분 동안 14,000 rpm으로 원심분리되고, 그리고 상층액이 앞서 기술된 바와 같은 LC1 분석을 위해 수집되었다.
2 g/ℓ 이소부티르알데히드로 두 번째 교반 플라스크 발효는 ALD6 결실 균주 GEVO6244/GEVO6245 및 이들의 상응하는 ALD6 부모 균주 GEVO1830의 기술적 삼중을 이용하여 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다. 이러한 발효는 앞서 기술된 바와 같이 24와 48시간 시점에서 샘플링되었다. 표 80에서는 이들 양쪽 발효에 대한 이소부티레이트 역가를 제시한다. 이소부티레이트 역가는 ALD6 부모 균주와 비교하여 ald6△ 균주에서 유의미하게 감소한다.
Figure pct00008
실시예 26: 2- 아세토 -2- 히드록시부티레이트를 향한 TMA29 활성
하기 실시예에서는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29 단백질이 (S)-2-아세토락테이트 ((S)-AL)와 2-아세토-2-히드록시부티레이트 (AHB)를 향해 활동성이라는 것을 예증한다.
실시예 26에서 개시된 균주의 유전형.
GEVO # 유전형 출처
GEVO3527 MATα his3△-1 leu2△ lys2△ ura3△ ATCC# 201389 (BY4742)
GEVO3939 MATα his3△-1 leu2△ lys2△ ura3△ tma29::kan R OpenBiosystems cat# YSC1054 (Yeast MATalpha collection)
TMA29 (YMR226C) 유전자가 결실된 효모 균주 GEVO3939 및 이의 부모 GEVO3527은 각 균주에 대해 삼중으로 14 ㎖ 배양액 튜브에서 3 ㎖의 YPD를 접종함으로써 각각 삼중으로 배양되었다. 배양은 GEVO3527의 경우에 YPD 아가 평판 상에서, 그리고 GEVO3939의 경우에 0.2 g/ℓ G418을 내포하는 YPD 평판 상에서 패치 (patch)로부터 시작되었다. 배양액은 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 익일에, 하룻밤 배양액의 OD600이 측정되고, 그리고 50 ㎖ 배양액을 0.1의 OD600까지 접종하기 위한 각 배양액의 부피가 계산되었다. 계산된 부피의 각 배양액이 250 ㎖ 차단된 플라스크에서 50 ㎖의 YPD를 접종하는데 이용되고, 그리고 이들 배양액은 30℃와 250 rpm에서 배양되었다.
세포는 8시간 성장후, 2.2-2.7의 OD에서 중간-로그 기 동안 수확되었다. 배양액은 미리 칭량된 50 ㎖ Falcon 튜브로 이전되고, 그리고 세포가 5분 동안 3000 x g로 원심분리에 의해 수집되었다. 배지의 제거후, 세포는 10 ㎖ MilliQ H20로 세척되었다. 물의 제거후, 세포는 5분 동안 3000 x g로 다시 한 번 원심분리되고, 그리고 남아있는 물은 1 ㎖ 피펫 팁을 이용하여 조심스럽게 제거되었다. 세포 펠릿은 칭량되고, 이후 추가 이용 때까지 -80℃에서 보관되었다.
세포 펠릿은 얼음 위에서 해동되고, 그리고 결과물이 질량으로 20% 세포 현탁액이 되도록 용해 완충액 (10 mM 인산나트륨 pH7.0, 1 mM 디티오트레이톨, 5% w/v 글리세롤)에서 재현탁되었다. 각 샘플에 대해 1 ㎖의 유리 비드 (glass bead) (0.5 mm 직경)가 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 첨가되고 850 ㎕의 세포 현탁액이 첨가되었다. 효모 세포는 각각 전속에서 6 X 1분 혼합 및 그 사이에 얼음 위에서 1분 배양에 의해, Retsch MM301 믹서 밀 (mixer mill) (Retsch Inc. Newtown, PA)을 이용하여 용해되었다. 이들 튜브는 4℃에서 10분 동안 21,500xg로 원심분리되고, 그리고 상층액이 새로운 튜브로 이전되었다. 추출물은 (R/S)-AHB와 (R/S)-AL을 향한 TMA29 활성을 결정하기 위한 앞서 기술된 바와 같은 TMA29 검사를 이용하여 조사될 때까지 얼음 위에 유지되었다.
(R/S)-AHB의 환원에 대한, 야생형 MATα 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주인 GEVO3527 용해물에서 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29의 비활성은 10.5 ± 0.6 mU/mg이었다. tma29△ 균주 GEVO3939는 4.8 ± 0.1 mU/mg의 비활성을 가졌다. 야생형 GEVO3527 균주는 결실 균주보다 대략 2-배 높은 TMA29 비활성을 가졌다.
(R/S)-AL의 환원에 대한, 야생형 MATα 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주인 GEVO3527 용해물에서 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) TMA29의 비활성은 12.3 ± 0.2 mU/mg이었다. tma29△ 균주 GEVO3939는 2.9 ± 0.3 mU/mg의 비활성을 가졌다. 야생형 GEVO3527 균주는 결실 균주보다 대략 4-배 높은 TMA29 비활성을 가졌다.
실시예 27-30에 대한 일반적인 방법
실시예 27-30에서 기술된 균주, 플라스미드, 유전자/아미노산 서열, 그리고 프라이머 서열은 각각, 표 82, 83, 84와 85에서 열거된다.
실시예 27-30에서 개시된 균주의 유전형.
유전형 또는 참고
대장균(E. coli) BL21(DE3) (Lucigen Corporation, Middleton, WI)
대장균(E. coli) DH5α (Novagen, Gibbstown, NJ)
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2 (Euroscarf, Frankfurt, Germany)
실시예 27-30에서 개시된 플라스미드.
Gevo No . 유전형 또는 참고
pET22(b)+ Novagen, Gibbstown, NJ
pGV1102 P Sc_TEF1 -HA-tag-MCS-T CYC1 ,URA3, 2-마이크론, bla, pUC-ori
pGV1662 PSc_ TEF1 -락토코커스 락티스(L. lactis) kivD-T Sc_CYC1 , bla, ColE1 ori, URA3, 2μ ori.
pGV1947 P Sc_TEF1 -Ll_adhA-T Sc_CYC1 bla URA3 pMB1 ori 2μ ori
pGV1947his P Sc_TEF1 -Ll_adhA his6 -T Sc_CYC1 bla URA3 pMB1 ori 2μ ori
pET1947 P T7 ::Ll_adhA his6 , bla, oripBR322, lacI
pGV2274 Ll_adhA_coSc 서열을 내포하는 클로닝 벡터 (DNA2.0, Menlo Park, CA에 의해 합성됨)
pGV2475 P Sc_TEF1 -Ll_adhA_coSc 28E7-his6 -T Sc_CYC1 , bla, URA3, pMB1 ori, 2μ ori
pGV2476 P Sc_TEF1 -Ll_adhA_coSc his6 -T Sc_CYC1 , bla, URA3, pMB1 ori, 2μ ori
pGV2477 P Sc_TEF1 -Ll_adhA_coSc RE1-his6 -T Sc_CYC1 , bla, URA3, pMB1 ori, 2μ ori
pGV30C11 P Sc_TEF1 -Ll_adhA_coSc 30C11-his6 -T Sc_CYC1 , bla, URA3, pMB1 ori, 2μ ori
실시예 27-30에서 개시된 핵산과 단백질 서열.
출처 유전자 (서열 번호) 단백질 (서열 번호)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA (서열 번호: 184) Ll_AdhA (서열 번호: 185)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA_coSc his6 (서열 번호: 186) Ll_AdhAhis6 (서열 번호: 187)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA_coSc 28E7-his6 (서열 번호: 188) Ll_AdhA28E7-his6 (서열 번호: 189)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA_coSc 30C11-his6 (서열 번호: 190) Ll_AdhA30C11-his6 (서열 번호: 191)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA_coSc RE1-his6 (서열 번호: 192) Ll_AdhARE1-his6 (서열 번호: 193)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA_coSc 7A4-his6 (서열 번호: 194) Ll_AdhA7A4-his6 (서열 번호: 195)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA_coSc 4A3-his6 (서열 번호: 196) Ll_AdhA4A3-his6 (서열 번호: 197)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA 1H7-his6 (서열 번호: 198) Ll_AdhA1H7-his6 (서열 번호: 199)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA 10F10-his6 (서열 번호: 200) Ll_AdhA10F10-his6 (서열 번호: 201)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA 8F11-his6 (서열 번호: 202) Ll_AdhA8F11-his6 (서열 번호: 203)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA 8D10-his6 (서열 번호: 204) Ll_AdhA8D10-his6 (서열 번호: 205)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA_coSc (서열 번호: 206) Ll_AdhA (서열 번호: 185)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA_coSc 28E7 (서열 번호: 207) Ll_AdhA28E7 (서열 번호: 208)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA_coSc 30C11 (서열 번호: 209) Ll_AdhA30C11 (서열 번호: 210)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA_coSc RE1 (서열 번호: 211) Ll_AdhARE1 (서열 번호: 212)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll _ adhA _ coSc 7A4 (서열 번호: 213) Ll_AdhA7A4 (서열 번호: 214)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA_coSc 4A3 (서열 번호: 215) Ll_AdhA4A3 (서열 번호: 216)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA 1H7 (서열 번호: 217) Ll_AdhA1H7 (서열 번호: 218)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA 10F10 (서열 번호: 219) Ll_AdhA10F10 (서열 번호: 220)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA 8F11 (서열 번호: 221) Ll_AdhA8F11 (서열 번호: 222)
락토코커스 락티스(L. lactis) Ll_adhA 8D10 (서열 번호: 223) Ll_AdhA8D10 (서열 번호: 224)
실시예 27-30에서 개시된 프라이머 서열 (5'→ 3').
프라이머 명칭 서열*
XX7 GGAGAAAACCCATATGTCGTTTAC (서열 번호: 225)
XX9 GCAGCCGAACGCTCGAGGGCGGCCG (서열 번호: 226)
His_Not1_1947_rev CTCGAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTAGTAAAATCAA (서열 번호: 227)
Sal1_for GAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGTT (서열 번호: 228)
adhAcoSc_SalIin_for GTTTGTCGACATGAAGGCTGCAGTTGTCCGT (서열 번호: 229)
adhAcoSC_NotIin_his_rev TCGAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTCGTGAAGTCTATAACCATTCTACC (서열 번호: 230)
pGV1994ep_for CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAAC (서열 번호: 231)
pGV1994ep_rev CTAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGTGGG (서열 번호: 232)
RecombADHY50_for TGCTGCCGGAGATTWCGGCAACAAGGCAGG (서열 번호: 233)
RecombADHY50_rev CCTGCCTTGTTGCCGWAATCTCCGGCAGCA (서열 번호: 234)
RecombADHL264_for ATGGTAGCCGTTGCTKTACCAAACACAGAA (서열 번호: 235)
RecombADHL264_rev TTCTGTGTTTGGTAMAGCAACGGCTACCAT (서열 번호: 236)
RecombADHI212_Y219_for GCTGATGTCAYAATTAACTCTGGTGACGTTWACCCTGTAG (서열 번호: 237)
RecombADHI212_Y219_rev CTACAGGGTWAACGTCACCAGAGTTAATTRTGACATCAGC (서열 번호: 238)
NNKADHF50_for TGCTGCCGGAGATNNKGGCAACAAG (서열 번호: 239)
NNKADHF50_rev GCCTTGTTGCCMNNATCTCCGGCAG (서열 번호: 240)
NNKADHR77_for GTTAGTTCTCTCNNKGTAGGTGATAG (서열 번호: 241)
NNKADHR77_rev CACTCTATCACCTACMNNGAGAGAAC (서열 번호: 242)
NNKADHA108_for ACATTTTGCCGAGAANNKAAAAACGC (서열 번호: 243)
NNKADHA108_rev ACCAGCGTTTTTMNNTTCTCGGCAAA (서열 번호: 244)
NNKADHF113_for GTCAAAAACGCTGGTNNKAGCGTTGA (서열 번호: 245)
NNKADHF113_rev ACCATCAACGCTMNNACCAGCGTTTT (서열 번호: 246)
NNKADHT212_for AGATAGGTGCTGATGTCNNKATTAAC (서열 번호: 247)
NNKADHT212_rev CAGAGTTAATMNNGACATCAGCACCT (서열 번호: 248)
NNKADHV264_for GGTAGCCGTTGCTNNKCCAAACACAG (서열 번호: 249)
NNKADHV264_rev ATTTCTGTGTTTGGMNNAGCAACGGC (서열 번호: 250)
Recomb2F50Minilib_for GTTGCAGCAGGTGATTDKGGCAACAAAGCA (서열 번호: 251)
Recomb2F50Minilib_rev TGCTTTGTTGCCMHAATCACCTGCTGCAAC (서열 번호: 252)
Recomb2Q77Gen5_for3 TGATGTAAGCTCGCTTCAAGTTGGTGATCG (서열 번호: 253)
Recomb2Q77Gen5_rev4 CGATCACCAACTTGAAGCGAGCTTACATCA (서열 번호: 254)
Recomb2R77Gen5_for5 TGATGTAAGCTCGCTTCGAGTTGGTGATCG (서열 번호: 255)
Recomb2R77Gen5_rev6 CGATCACCAACTCGAAGCGAGCTTACATCA (서열 번호: 256)
Recomb2S77Gen5_for7 TGATGTAAGCTCGCTTTCTGTTGGTGATCG (서열 번호: 257)
Recomb2S77Gen5_rev8 CGATCACCAACAGAAAGCGAGCTTACATCA (서열 번호: 258)
Recomb2Y113 Gen5_for9 TTAAAAATGCAGGATATTCAGTTGATGGCG (서열 번호: 259)
Recomb2Y113 Gen5_rev10 CGCCATCAACTGAATATCCTGCATTTTTAA (서열 번호: 260)
Recomb2F113 Gen5_for11 TTAAAAATGCAGGATTTTCAGTTGATGGCG (서열 번호: 261)
Recomb2F113 Gen5_rev12 CGCCATCAACTGAAAATCCTGCATTTTTAA (서열 번호: 262)
Recomb2G113 Gen5_for13 TTAAAAATGCAGGAGGGTCAGTTGATGGCG (서열 번호: 263)
Recomb2G113 Gen5_rev14 CGCCATCAACTGACCCTCCTGCATTTTTAA (서열 번호: 264)
Recomb2T212 Mini_for15 GAGCTGATGTGRYAATCAATTCTGGTGATG (서열 번호: 265)
Recomb2T212 Mini_rev16 CATCACCAGAATTGATTRYCACATCAGCTC (서열 번호: 266)
Recomb2V264 Mini_for17 TGGTTGCTGTGGCAKTACCCAATACTGAGA (서열 번호: 267)
Recomb2V264 Mini_rev18 TCTCAGTATTGGGTAMTGCCACAGCAACCA (서열 번호: 268)
* A (아데닌), G (구아닌), C (시토신), T (티민), U (우라실), R (퓨린 - A 또는 G), Y (피리미딘 - C 또는 T), N (임의의 뉴클레오티드), W (약함 - A 또는 T), S (강함 - G 또는 C), M (아미노 - A 또는 C), K (케토 - G 또는 T), B (A 아님 - G 또는 C 또는 T),시간 (G 아님 - A 또는 C 또는 T), D (C 아님 - A 또는 G 또는 T), 그리고 V (T 아님 - A 또는 G 또는 C)
배지와 완충액:
SC-URA: 6.7 g/ℓ Difco™ 효모 질소 염기, 14 g/ℓ Sigma™ 합성 드롭아웃 배지 보충물 (히스티딘, 트립토판, 그리고 류신을 제외한 아미노산과 영양소 포함), 10 g/ℓ 카사미노산, 20 g/ℓ 글루코오스, 0.018 g/ℓ 아데닌 헤미황산염, 그리고 0.076 g/ℓ 트립토판.
SD-URA: MP Biomedicals (Irvine, CA)에서 상업적으로 구입가능. 조성: 1.7 g/ℓ 효모 질소 염기 (YNB), 5 g/ℓ 황산암모늄, 20 g/ℓ 글루코오스, 우라실 CSM-URA가 없는 카사미노산.
YPD (효모 펩톤 덱스트로스) 배지: 10 g/ℓ 효모 추출물, 20 g/ℓ 펩톤, 20 g/ℓ 글루코오스.
Tris-DTT: 1 ㎖의 1 M TrisHCl, pH 8.0당 0.39 g 1,4-디티오트레이톨, 필터 멸균됨.
완충액 A: 20 mM Tris, 20 mM 이미다졸, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, pH 7.4로 조정됨, 필터 멸균됨.
완충액 B: 20 mM Tris, 300 mM 이미다졸, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, pH 7.4로 조정됨, 필터 멸균됨
완충액 E: 1.2 g Tris 염기, 92.4 g 글루코오스, 그리고 1 ℓ의 탈염수당 0.2 g MgCl2, pH 7.5로 조정됨, 필터 멸균됨
pET1947의 작제 : 락토코커스 락티스(L. lactis) adhA (Ll_adhA) 유전자는 프라이머 His_Not1_1947_fwd와 Sal1_rev를 이용하여 pGV1947의 외부에 클로닝되고 pET22b(+) 내로 결찰되어, 플라스미드 pET1947이 산출되었다.
pGV2476의 작제: 플라스미드 pGV2274는 전방 프라이머 adhAcoSc_SalIin_for 및 후방 프라이머 adhAcoSC_NotIin_his_rev를 이용한 PCR을 위한 주형으로서 기능하였다. PCR 산물은 정제되고, NotI과 SalI로 제한 절단되고, 그리고 pGV1662 내로 결찰되고, 이것은 NotI과 SalI로 절단되고 정제되었다.
사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae )의 형질전환: 예정된 형질전환의 전일 밤에, YPD 배양액은 단일 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2 집락으로 접종되고 30℃와 250 rpm에서 하룻밤동안 배양되었다. 다음날 아침에, 20 ㎖ YPD 배양이 0.1의 OD600에서 하룻밤 배양액으로 차단되지 않은 250 ㎖ 에를렌마이어 플라스크에서 시작되었다. 상기 배양액은 1.3 - 1.5의 OD600에 도달할 때까지 30℃와 250 rpm에서 배양되었다. 배양액이 원하는 OD600에 도달할 때, 200 ㎕의 Tris-DTT가 첨가되고, 그리고 배양액은 30℃와 250 rpm에서 추가로 15분 동안 배양되었다. 세포는 이후, 4℃와 2,500xg에서 3분 동안 펠릿화되었다. 상층액을 제거한 이후, 펠릿은 10 ㎖의 얼음같이 차가운 완충액 E에서 재현탁되고 앞서 기술된 바와 같이 다시 한 번 스핀다운 (spin down)되었다. 이후, 세포 펠릿은 1 ㎖의 얼음같이 차가운 완충액 E에 재현탁되고 앞에서와 같이 한 번 더 스핀다운되었다. 피펫으로 상층액의 제거후, 200 ㎕의 얼음같이 차가운 완충액 E가 첨가되고, 그리고 펠릿이 부드럽게 재현탁되었다. 6 ㎕의 삽입물/골격 혼합물은 반으로 분할되고 50 ㎕의 세포 현탁액에 첨가되었다. DNA/세포 혼합물은 0.2 cm 전기천공 큐벳 (BIORAD) 내로 이전되고 0.54 kV와 25 μF에서 펄스 컨트롤러 (pulse controller) 없이 전기천공되었다. 그 직후에, 1 ㎖의 미리 가온된 YPD가 첨가되고, 그리고 형질전환된 세포는 15 ㎖ 원형 바닥 배양 튜브 (Falcon)에서 30℃와 250 rpm에서 재생되었다. 1시간후, 세포는 4℃와 2,500xg에서 3분 동안 스핀다운되고, 그리고 펠릿은 1 ㎖ 미리 데워진 SD-URA 배지에서 재현탁되었다. 상이한 양의 형질전환된 세포가 SD-URA 평판 상에 도말되고 30℃에서 1.5일 동안 또는 집락이 무균 이쑤시개로 골라 뽑힐 수 있을 만큼 충분히 클 때까지 배양되었다.
효모 세포의 플라스미드 미니-제조: ZymoprepTM II - 효모 플라스미드 Miniprep 키트 (Zymo Research, Orange, CA)는 약간 변경된 액체 배양을 위한 제조업체의 프로토콜에 따라 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 세포로부터 플라스미드 DNA를 준비하는데 이용되었다. 200 ㎕ 분취량의 효모 세포는 600xg에서 2분 동안 스핀다운되었다. 상층액을 따라버린 후, 200 ㎕의 용액 1이 펠릿을 재현탁하기 위해 첨가되었다. 이들 샘플에, 3 ㎕의 ZymolyaseTM가 첨가되고, 그리고 세포/효소 현탁액은 손가락으로 가볍게 침으로써 부드럽게 혼합되었다. 이들 샘플을 37℃에서 1시간 동안 배양한 이후, 용액 2와 3이 첨가되고 각 첨가후 충분하게 혼합되었다. 이들 샘플은 이후, 4℃와 최대 속도에서 10분 동안 스핀다운되었다. 그 이후에, Zymo 칼럼 위에서 정화 (clean-up)가 제조업체의 지시에 따라 수행되었다. 플라스미드 DNA는 10 ㎕의 PCR 등급 물로 용리되었다. 이러한 부피의 절반은 대장균(E. coli) DH5α를 형질전환시키는데 이용되었다.
대장균( E. coli )에서 이종기원성 ADH 발현: 암피실린 (최종 농도 0.1 mg/㎖)을 내포하는 50 ㎖의 Luria-Bertani (LB) 배지 (리터당 10 g 트립톤, 10 g NaCl, 5 g 효모 추출물)를 내포하는 플라스크 (500 ㎖ Erlenmeyer)는 플라스미드 pET1947을 보유하는 단일 집락의 0.5 ㎖ 하룻밤 LBamp 배양액을 이용하여 0.1의 최초 OD600으로 접종되었다. 50 ㎖ LB 발현 배양액은 250 rpm과 37℃에서 3-4시간 동안 성장되었다. 단백질 발현은 0.5 mM의 최종 농도로 IPTG의 첨가로 대략 1의 OD600에서 유도되었다. 단백질 발현은 225 rpm과 25℃에서 24시간 동안 지속되었다. 세포는 5300xg와 4℃에서 10분 동안 수확되고, 이후 세포 펠릿은 추가 이용 때까지 -20℃에서 동결되었다.
사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae ) CEN.PK2에서 이종기원성 발현: 100 ㎖의 SC-URA로 채워진 플라스크 (1000 ㎖ 에를렌마이어)는 1 ㎖ 하룻밤 배양액 (단일 CEN.PK2 집락으로 접종된 5 ㎖ SC-URA, 30℃와 250 rpm에서 성장됨)으로 접종되었다. 발현 배양액은 30℃와 250 rpm에서 24시간 동안 성장되었다. 세포는 5분 동안 5300xg에서 펠릿화되었다. 상층액은 버려지고, 그리고 펠릿은 다시 한 번 회전되었다. 이후, 잔류 상층액이 피펫으로 제거되었다. 펠릿은 추가 이용 때까지 -20℃에서 동결되었다.
고처리량 검사을 위한 96-웰 평판 내에 CEN.PK2에서 이종기원성 발현: 300 ㎕의 SC-URA로 채워진, 웰당 1 ㎖ 수용량 (capacity)의 얕은 96-웰 평판은 Ll_adhAhis6 또는 이의 변이체를 코딩하는 플라스미드를 보유하는 단일 CEN.PK2 집락으로 접종되었다. 600 ㎕의 SC-URA로 채워진, 웰당 2 ㎖ 수용량 (capacity)의 깊은 96-웰 평판은 50 ㎕의 이들 하룻밤 배양액으로 접종되었다. 이들 평판은 30℃와 250 rpm에서 24시간 동안 성장되고, 이후 4℃와 5300xg에서 5분 동안 수확되고 -20℃에서 보관되었다.
대장균( E. coli )으로부터 ADH-포함 추출물의 제조: 발현된 ADH를 내포하는 대장균(E. coli) 세포 펠릿은 해동되고 완충액 A에서 재현탁되었다 (0.25 g 습식 중량/㎖ 완충액). 재현탁된 세포는 50% 듀티 사이클 (duty cycle)로 1분 동안 초음파처리에 의해 용해되고 11000xg와 4℃에서 10분 동안 펠릿화되었다. 추출물은 4℃에서 보관되었다.
사카로미세스 세레비지에( S. cerevisiae ) CEN.PK2로부터 ADH-포함 추출물의 제조: 발현된 ADH를 내포하는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2 세포 펠릿은 해동되고 펠릿의 습식 중량을 획득하기 위해 칭량되었다. 세포는 이후, 결과물이 질량으로 20% 세포 현탁액이 되도록 완충액 A에서 재현탁되었다. 0.5 mm 직경의 유리 비드가 1000 ㎕-마크의 (0.5 mm 직경) 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 첨가되고, 그 이후 875 ㎕의 세포 현탁액이 첨가되었다. 효모 세포는 각각 전속에서 6 x 1분 혼합 및 그 사이에 1-분 결빙 단계에 의해, Retsch MM301 믹서 밀 (mixer mill) (Retsch Inc. Newtown, PA)을 이용한 비드 비팅에 의해 용해되었다. 이들 튜브는 4℃에서 10분 동안 23,500xg로 원심분리되고, 그리고 상층액이 제거되었다. 추출물은 4℃에서 보관되었다.
ADH의 정제: ADH는 Akta 정제장치 FPLC 시스템 (GE Healthcare)을 이용하여 니켈로 미리 충전된 1 ㎖ Histrap 고성능 (histrap HP) 칼럼 (GE Healthcare) 위에서 IMAC (Immobilized metal affinity chromatography)에 의해 정제되었다. 칼럼은 4 칼럼 부피 (cv)의 완충액 A로 평형화되었다. 조추출물을 칼럼 상에 주입한 이후, 상기 칼럼은 2 cv 동안 완충액 A로 세척되고, 그 이후에 15 cv 동안 100% 용출 완충액 B로 선형 구배되고 96-웰 평판에서 수집되었다. 단백질을 내포하는 분획물은 모아지고 4℃에서 보관되었다.
ADH 큐벳 검사: ADH 활성은 340 nm에서 흡광도를 측정함에 의해 NADH 농도에서 감소를 모니터링함으로써 동역학적으로 조사되었다. 100 mM Tris/HCl pH 7.0, 1 mM DTT, 11 mM 이소부티르알데히드, 그리고 200 μM NADH를 내포하는 반응 완충액이 준비되었다. 반응은 900 ㎕의 반응 완충액에 적절한 희석도에서 100 ㎕의 조추출물 또는 정제된 단백질의 첨가에 의해 개시되었다.
ADH 마이크로역가 평판 활성 검사: 마이크로역가 평판에서 활성 측정은 규모축소 큐벳 검사이다. 총 부피는 100 ㎕이었다. 적절하게 희석된 10 ㎕의 조용해물 또는 정제된 효소가 검사 평판에 배치되었다. 반응 완충액은 앞서 기술된 바와 같이 준비되고 (이소부티르알데히드 기질 단독) 이 중에서 90 ㎕가 평판 내에 효소 용액에 첨가되었다. NADH의 소비는 무한 M200 평판 판독기 (TECAN Trading AG, Switzerland)에서 340 nm에서 기록되었다.
ADH 고처리량 활성 검사: 96-웰 평판에서 동결된 효모 세포 펠릿은 실온에서 20분 동안 해동되고, 이후 100 ㎕의 Y-Per (Pierce, Cat# 78990)이 첨가되었다. 평판은 세포 펠릿을 재현탁하기 위해 간단히 와동되었다. 실온과 130 rpm에서 60-분 배양 기간후, 조추출물을 희석하기 위해 300 ㎕의 100 mM Tris-HCl (pH 7.0)이 평판에 첨가되었다. 5,300xg와 4℃에서 10분 동안 원심분리 단계 이후에, 40 ㎕의 결과의 조추출물이 액체 처리 로봇 (liquid handling robot)을 이용하여 검사 평판 (편평 바닥, Rainin)으로 이전되었다. 이들 검사 평판은 4,000 rpm과 실온에서 짧게 스핀다운되었다. 평판당 12 ㎖ 검사 완충액 (100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1 mM, 0.5 mM, 0.25 mM 또는 0.125 mM 이소부티르알데히드, 1 mM DTT, 200 μM NADH)이 준비되고 이 중에서 100 ㎕가 반응을 개시하기 위해 각 웰에 첨가되었다. NADH의 고갈은 무한 M200 평판 판독기 (TECAN Trading AG, Switzerland)에서 340 nm에서 2분 모니터링되었다.
활성 검사로부터 획득된 데이터에 기초된 비활성의 측정: 이종기원성으로 발현된 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA를 내포하는 샘플, 예를 들면, 조추출물과 정제된 단백질의 단백질 농도는 제조업체의 지시에 따라, Quick Start™ Bradford 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 측정되었다. 1 단위의 효소 활성 (1 U)은 검사 방법의 명시된 조건 하에 분당 1 마이크로몰 (micromole) 기질의 전환을 촉진하는 효소의 양으로서 정의된다.
열안정도 측정: 부모 Ll_adhA 및 이의 변이체의 T50 값 (15분의 배양 시간후 효소 활성의 50%가 유지되는 온도)이 열안정도 데이터를 획득하기 위해 측정되었다. 30 ㎕ 분취량의 정제된 효소가 PCR 튜브 내로 이전되었다. 각 튜브는 특정한 배양 온도에 지정되었고, 상기 온도는 20℃-온도 범위를 커버하는 구배로 프로그래밍된 Mastercycler?ep PCR 기계 (Eppendorf, Hamburg, Germany)의 블록 상에서 슬롯 (slot)에 상응하였다. 이들 튜브는 그들의 슬롯에서 15분 동안 배양되었다. 이후, 반응은 얼음 위에서 진정되었다. 잔여 활성은 앞서 기술된 바와 같이 ADH 마이크로역가 평판 활성 검사로 측정되었다.
정제를 위한 His-태그의 이용: 하기에 기술된 각 실시예에서, his-태그를 포함하는 ADH 효소가 언급된다. 당분야에서 이해되는 바와 같이, 이런 his-태그는 단백질 정제를 용이하게 한다. 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 his-태그가 결여된 ADH 효소는 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환에 동등하게 또는 더욱 우수하게 적합하다. 정제-가능화 his-태그가 결여되는 본 명세서에서 기술된 변형된 ADH 효소의 실례는 서열 번호: 206-224에서 발견된다.
실시예 27: 무작위 돌연변이유발에 의한 방향적 진화
하기 실시예에서는 ADH의 동역학적 성질을 향상시키는 방법을 예증하고, 또한 이런 향상된 ADH 효소의 동역학적 성질을 기술한다. Ll_adhA_coSc his6 유전자를 보유하고 플라스미드 pGV1662의 유도체인 플라스미드 pGV2476은 전방 프라이머 pGV1994ep_for 및 후방 프라이머 pGV1994_rev를 이용한 오류 유발 PCR을 위한 주형으로서 기능하였다. 이들 프라이머는 골격 pGV1662에 특이적이고, 그리고 ADH 삽입물의 50 bp 상류와 하류에 결합하여 효모에서 상동성 재조합을 위한 겹침을 발생시킨다. 3가지 오류 유발 PCR 반응의 조성은 표 86에 요약된다. 온도 프로필은 하기와 같았다: 95℃ 3분 최초 변성, 95℃ 30s 변성, 55℃ 30s 어닐링, 72℃ 2분 신장, 25회 사이클, 72℃에서 5분 최종 신장.
오류 유발 라이브러리에 대한 PCR 조건.
최종 MnCl 2 농도 [μM] 100 200 300
주형 [ng] 2 2 2
전방 프라이머 [μM] 0.2 0.2 0.2
후방 프라이머 [μM] 0.2 0.2 0.2
dNTP [μM] 400 400 400
Taq 완충액 (10x 스톡) [㎕] 10 10 10
MgCl2 [μM] 7 7 7
Taq 중합효소 [U] 8 8 8
MnCl2 (1 mM 스톡) [μM] 100 200 300
PCR 등급 물 [㎕] 41.4 31.4 21.4
PCR 산물은 1% 분석적 TAE 아가로오스 겔 상에서 체크되고, 미량의 주형 DNA를 제거하기 위해 37℃에서 1시간 동안 DpnI 절단되고, 이후 1% 예비 TAE 아가로오스 겔을 이용하여 정화되었다. PCR 산물을 내포하는 아가로오스 조각은 제조업체의 프로토콜에 따라, Freeze 'n' Squeeze 튜브 (BIORAD, Hercules, CA; catalog #732-6166)를 이용하여 청소되고, 그 이후에 펠릿 착색 절차 (Novagen, catalog # 69049-3)가 수행되었다. 한편, 플라스미드 pGV1662는 NotI과 SalI로 제한 절단되고, 그 이후 절단 혼합물이 아가로오스 겔 상에서 이동되고 펠릿 착색되었다. 각각 500 ng의 플라스미드와 삽입물은 서로 혼합되고, 펠릿 페인트로 침전되고, 6 ㎕의 PCR 등급 물에서 재현탁되고, 그리고 일반적 방법에서 앞서 기술된 바와 같이 전기적격 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 세포를 형질전환시키는데 이용되었다.
100, 200, 그리고 300 μM MnCl2 라이브러리 각각으로부터 총 88개 클론은 비-ADH 대조로서 부모 플라스미드 pGV2476을 내포하는 4개의 클론 및 pGV1102를 내포하는 3개의 클론과 함께, 96-웰 평판 내로 채집되었다. 1개 웰은 빈 상태로 남겨졌고 무균 대조로서 기능하였다. 일반적 방법 (고처리량 검사, ADH 고처리량 활성 검사를 위한 96-웰 평판에서 CEN.PK2에서 이종기원성 발현) 하에 앞서 기술된 바와 같이 이들 라이브러리를 스크리닝한 이후, 300 μM 라이브러리가 선택되고 추가의 4,000개 클론이 동일한 방식으로 스크리닝되었다. 총 24개 변이체가 야생형과 비교하여 1.5-배 이상 향상되었고 삼중으로 재-스크리닝을 위해 선택되었다. 이들 중에서 상위 10개의 변이체는 성장되고 일반적 방법 (사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2에서 이종기원성 발현) 하에 앞서 기술된 바와 같이 100 ㎖ 배양액에서 발현되고, 그리고 효모 조추출물에서 그들의 비활성이 일반적 방법 (ADH 마이크로역가 평판 검사) 하에 앞서 기술된 바와 같이 측정되었다. 2가지 변이체, Ll_AdhA28E7-his6과 Ll_AdhA30C11-his6은 야생형 효소 Ll_AdhAhis6 (0.1 U/mg 총 용해물 단백질)과 비교하여 활성에서 2-배 이상의 향상 (각각, 0.3과 0.25 U/mg 총 용해물 단백질)을 나타내고 더욱 상세하게 특성화되었다.
이들 2가지 변이체로부터 플라스미드 DNA는 일반적 방법 (효모 세포의 플라스미드 미니-제조) 하에 앞서 기술된 바와 같이 추출되고 DNA 염기서열분석 (Laragen, Los Angeles, CA)에 종속되었는데, 이것은 표 87에서 열거된 바와 같이 변이체당 2개의 돌연변이를 노출시켰다. 이들 돌연변이 중에서 2가지 (Y50F와 L264V)는 기질 결합 도메인 (청록색)과 보조인자 결합 도메인 (녹색) 사이에 갭인 활성 부위에 매우 가깝게 위치한다. 돌연변이 I212T와 N219Y는 보조인자 결합 도메인의 표면 상에 위치한다 (도 17에 도시됨). 보조인자 결합 부위 돌연변이의 위치를 강조하기 위해, 도 17은 구조 배열에 관한 2가지 도면을 수반한다.
첫 번째 오류 유발 라이브러리 (1 세대)의 2가지 향상된 변이체에서 발견된 돌연변이의 목록.
변이체 돌연변이
Ll_adhA28E7-his6 N219Y, L264V
Ll_adhA30C11-his6 Y50F, I212T
2가지 효소 변이체, Ll_AdhA28E7 - his6과 Ll_AdhA30C11 - his6은 더욱 큰 규모 (각각, 100 ㎖ 배양액)에서 각각, 플라스미드 pGV2475와 pGV30C11로부터 발현되고, 정제되고, 그리고 일반적 방법 (사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2에서 이종기원성 발현, 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2로부터 ADH-포함 추출물의 제조, ADH의 정제) 하에 앞서 기술된 바와 같이 더욱 상세하게 특성화되었다. 야생형 Ll_AdhAhis6 효소는 플라스미드 pGV2476으로부터 발현되고 동일한 방식으로 정제되었다. 이들 효소는 일반적 방법 (ADH 큐벳 검사) 하에 앞서 기술된 바와 같이 동역학적 성질에 대해 특성화되었다. 표 88에서는 이소부티르알데히드와 NADH로 측정된 동역학적 파라미터를 제시한다. 감소된 KM-값은 양쪽 변이체에 대해 관찰되는 반면, kcat는 단지 Ll_AdhA28E7에 대해서만 향상되었다.
Figure pct00009
야생형 효소와 이들 2가지 변이체의 열안정도는 일반적 방법 (열안정도 측정) 하에 앞서 기술된 바와 같이 측정되었다. 발견된 돌연변이는 촉매 효율에 대한 유익한 효과뿐만 아니라 변이체의 안정성에도 긍정적인 영향을 주었다. 표 89에서는 부모와 변이체에 대해 측정된 T50을 요약한다.
부모 효소 및 변이체의 T50의 요약.
변이체 T 50 [℃], 15분
Ll_AdhAhis6 54.4 ± 0.5
Ll_AdhA28E7 - his6 62.3 ± 0.3
Ll_AdhA30C11-his6 57.6 ± 0.6
실시예 28: 재조합에 의한 방향적 진화
하기 실시예에서는 ADH의 동역학적 성질을 향상시키는 방법을 예증하고, 또한 이런 향상된 ADH 효소의 동역학적 성질을 예증한다. 첫 번째 오류 유발 라이브러리에서 발견된 유익한 돌연변이 및 이들 각 부위에서 야생형 잔기를 재조합하는 두 번째 유전자 라이브러리 (2 세대)가 작제되었다 (표 90).
재조합 라이브러리 내에 포함된 아미노산 돌연변이.
아미노산 위치 야생형 돌연변이 총 #
(야생형 포함)
50 Y F 2
212 I T 2
219 Y N 2
264 L V 2
프라이머 RecombADHY50_rev와 pGV1994ep_for (단편 1), RecombADHY50_for과 RecombADHI212_Y219_rev (단편 2), RecombADHI212_Y219_와 RecombADHL264_rev (단편 3), 그리고 RecombADHL264_rev와 pGV1994ep_rev (단편 4)를 이용하여 4개의 PCR 단편이 산출되었다. 이들 단편은 분석적 1% TAE 겔에서 분석되고, DpnI 절단되고, 1% 예비 TAE 아가로오스 겔 상에서 분리되고, Freeze'n'Squeeze (BIORAD) 처리되고, 그리고 최종적으로 펠릿 착색 (Novagen)되었다. 깨끗한 단편은 집합 PCR을 위한 주형으로서 기능하였다. 성공적인 집합 PCR후, PCR 산물은 실시예 27에서 앞서 기술된 바와 같이 처리되고, 실시예 27에서 앞서 기술된 바와 같이 pGV1662 골격과 혼합되고, 그리고 혼합물은 일반적 방법에서 실시예 27-30에 대해 앞서 기술된 바와 같이 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)를 형질전환시키는데 이용되었다. 재조합 라이브러리의 80개 단일 클론이 채취되고 고처리량 스크린에서, 야생형 및 오류 유발 라이브러리에서 발견된 2가지 변이체와 비교되었다.
총 80개의 단일 클론이 최초 부모 및 2가지 향상된 변이체와 함께, 96-웰 평판 내로 채집되었다. 일반적 방법 (고처리량 검사, ADH 고처리량 활성 검사를 위한 96-웰 평판에서 CEN.PK2에서 이종기원성 발현) 하에 앞서 기술된 바와 같이 재조합 평판을 스크리닝한 이후, 부모 Ll_AdhA28E7-his6 또는 Ll_AdhA30C11-his6과 비교하여 적어도 2-배 높은 활성을 나타내는 12개 변이체는 일반적 방법 (사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2에서 이종기원성 발현) 하에 앞서 기술된 바와 같이 100 ㎖ 배양액에서 성장되고 발현되며, 그리고 효모 조추출물에서 그들의 활성은 일반적 방법 (ADH 마이크로역가 평판 검사) 하에 앞서 기술된 바와 같이 측정되었다. 2가지 변이체는 조추출물에서 매우 유사한 비활성을 가졌다. Ll_AdhARE1이 추가 변형을 위해 선택되었는데, 그 이유는 이의 활성이 Ll_AdhA28E7-his6보다 40% 및 Ll_AdhA30C11-his6보다 64% 높았기 때문이다.
이러한 변이체로부터 플라스미드 DNA는 일반적 방법 (효모 세포의 플라스미드 미니-제조) 하에 앞서 기술된 바와 같이 추출되고 DNA 염기서열분석 (Laragen, Los Angeles, CA)에 종속되었는데, 이것은 돌연변이 Y50F, I212T, 그리고 L264V (Ll_AdhARE1에서 발견됨)가 관찰된 향상에 기여하는 반면, 위치 219에서 돌연변이가 이들 변이체의 활성에 유해하고 재조합 라이브러리의 임의의 향상된 변이체에서 발견되지 않는다는 것을 노출시켰다.
변이체 Ll_AdhARE1-his6은 더욱 큰 규모 (각각, 100 ㎖ 배양액)에서 플라스미드 pGV2477로부터 발현되고, 정제되고, 그리고 일반적 방법 (사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2에서 이종기원성 발현, 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) CEN.PK2로부터 ADH-포함 추출물의 제조, ADH의 정제) 하에 앞서 기술된 바와 같이 더욱 상세하게 특성화되었다. 야생형 Ll_AdhAhis6 효소는 플라스미드 pGV2476으로부터 발현되고 동일한 방식으로 정제되었다. 이들 효소는 일반적 방법 (ADH 큐벳 검사) 하에 앞서 기술된 바와 같이 동역학적 성질에 대해 특성화되었다. 표 91에서는 이소부티르알데히드와 NADH로 측정된 동역학적 파라미터를 제시한다. Ll_AdhAhis6, Ll_AdhA28E7-his6, Ll_AdhA30C11-his6과 비교하여, Ll_AdhARE1-his6에 대해 감소된 KM 및 증가된 kcat가 관찰되었다.
Figure pct00010
변이체 Ll_adhARE1 - his6은 wt의 T50보다 5도 높고 재조합 라운드의 가장 안정된 부모, Ll_AdhA28E7 - his6보다 거의 1도 낮은 61.6 ± 0.1℃의 T50 값을 보였다.
실시예 29: 무작위 돌연변이유발, 부위 포화 돌연변이유발, 그리고 재조합에 의한 락토코커스 락티스 ( L. lactis ) AdhA 의 방향적 진화
하기 실시예에서는 ADH의 동역학적 성질을 향상시키는 방법을 예증하고, 또한 이런 향상된 ADH 효소의 동역학적 성질을 기술한다.
Ll_adhA RE1-his6 유전자는 두 번째 라운드의 오류 유발 PCR과 스크리닝을 위한 주형으로서 기능하였다 (3 세대). 이러한 스크리닝 검사는 0.125 mM 이소부티르알데히드를 이용하였다. 상기 실시예 1에 따라 200 μM MnCl2로 오류 유발 PCR을 이용하여 산출된 라이브러리 중에서 대략 3,000개 클론이 발현되고 고처리량 방식으로 스크리닝되었다. 몇몇 히트 (hit)가 삼중으로 재스크리닝을 위해 선택되고, 그리고 2가지 변이체, Ll_AdhA7A4-his6과 Ll_AdhA4A3-his6이 향상된 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 이들 변이체의 돌연변이는 표 92에 제시된다.
3 세대 변이체 Ll_AdhA7A4-his6과 Ll_AdhA4A3-his6에서 축적된 돌연변이의 목록.
변이체 돌연변이
Ll_AdhA7A4-his6 Y50F, I212T, L264V, Q77R, V108A
Ll_AdhA4A3-his6 Y50F, I212T, L264V, Y113F
부모뿐만 아니라 Ll_AdhA7A4 - his6과 Ll_AdhA4A3 - his6의 용해물에서 비활성 (U/mg)이 pH 7.0에서 생물학적 삼중으로 측정되었다 (표 93).
Ll_AdhA7A4 - his6 (59.4 ℃) 및 Ll_AdhA4A3 - his6 (57.6 ℃)의 T50 값은 둘 모두 Ll_AdhAhis6보다 높고 Ll_AdhARE1 - his6보다 낮았다.
2 라운드의 오류 유발 PCR 및 1 라운드의 재조합 이후, 부위-포화 돌연변이유발이 6개 부위 각각에서 수행되어 6개 라이브러리 (라이브러리 50, 77, 108, 113, 212, 그리고 264)가 산출되었다. 최초 부모, Ll_AdhAhis6은 각 NNK 단편에 대한 주형으로서 이용되었다. 각 라이브러리에 대한 2개 단편이 표 4에 열거된 프라이머를 이용하여 증폭되고 (라이브러리 50의 단편 1의 경우에 pGV1994ep_for과 NNKADHF50_rev, 라이브러리 50의 단편 2의 경우에 NNKADHF50_for과 pGV1994ep_rev; 라이브러리 77의 단편 1의 경우에 pGV1994ep_for과 NNKADHR77_rev, 라이브러리 77의 단편 2의 경우에 NNKADHR77_for과 pGV1994ep_rev; 라이브러리 108의 단편 1의 경우에 pGV1994ep_for과 NNKADHA108_rev, 라이브러리 108의 단편 2의 경우에 NNKADHA108_for과 pGV1994ep_rev; 라이브러리 113의 단편 1의 경우에 pGV1994ep_for과 NNKADHF113_rev, 라이브러리 113의 단편 2의 경우에 NNKADHF113_for과 pGV1994ep_rev; 라이브러리 212의 단편 1의 경우에 pGV1994ep_for과 NNKADHT212_rev, 라이브러리 212의 단편 2의 경우에 NNKADHT212_for과 pGV1994ep_rev; 라이브러리 264의 단편 1의 경우에 pGV1994ep_for과 NNKADHV264_rev, 라이브러리 264의 단편 2의 경우에 NNKADHV264_for과 pGV1994ep_rev), 이후 집합 PCR을 위한 주형으로서 이용되었다. 집합 PCR 산물은 효모에서 NNK 라이브러리를 산출하기 위해 앞서 기술된 바와 같이 처리되었다. 90개 클론이 각 NNK 라이브러리를 위해 채집되고, 그리고 별개로 스크리닝되었다. 재스크리닝후, 6개 라이브러리로부터 9개 클론이 효모로부터 미니-제조되고, 이들 플라스미드는 대장균(E. coli)을 형질전환시키는데 이용되고, 그리고 결과의 플라스미드는 염기서열분석되었다. 이들의 용해물 활성 및 염기서열분석 결과는 표 94에 요약된다.
부위 포화 돌연변이유발의 요약 (4 세대).
NNK 라이브러리의 위치 변이체 용해물에서
U/mg 		NNK 라이브러리에서 발견된 돌연변이 NNK 라이브러리에서 발견된
예시적인 돌연변이 		재조합에 대한 돌연변이
- Ll_adhAhis6 0.28 ± 0.08
- Ll_AdhARE1 1.15 ± 0.20
50 1G4 0.78 ± 0.02 Y50W F, W C, L, F, W, Y, X
77 2G3 0.42 ±0.00 Q77S R, S Q, R, S
77 2H2 0.43 ± 0.00 - - -
108 3D10 0.61 ± 0.01 V108A - -
108 3D12 0.53 ± 0.07 V108S - -
113 4A3b 0.38 ± 0.05 Y113G F, G Y, F, G
113 4E6 0.30 ± 0.04 Y113G - -
212 5D2 0.92 ± 0.02 I212V T, V A, I, T, V
264 6E12 0.38 ± 0.07 L264V V I, V
부위 포화 돌연변이유발 라이브러리에서 발견된 다양한 돌연변이는 SOE PCR을 이용한 조합 방식 (combinatorial fashion)으로 재조합되고, 그리고 라이브러리는 비-코돈 최적화된 부모, pGV1947his를 이용하여 작제되었다. 표 85에서 기술된 프라이머는 6개 표적화된 부위에서 야생형 서열 역시 허용하였다. 6개 단편은 Recomb2F50Minilib_rev 및 pGV1994ep_for (단편 1), Recomb2F50Minilib_for 및 Recomb2Q77Gen5_rev4, Recomb2R77Gen5_rev6과 Recomb2S77Gen5_rev8의 혼합 (단편 2), Recomb2Q77Gen5_for3, Recomb2R77Gen5_for5와 Recomb2S77Gen5_for7의 혼합 및 Recomb2Y113 Gen5_rev10, Recomb2F113 Gen5_rev12와 Recomb2G113 Gen5_rev14의 혼합 (단편 3), Recomb2Y113 Gen5_for9, Recomb2F113 Gen5_for11과 Recomb2G113 Gen5_for13의 혼합 및 Recomb2T212 Mini_rev16 (단편 4), Recomb2T212 Mini_for15 및 Recomb2V264 Mini_rev18 (단편 5), 그리고 Recomb2V264 Mini_for17 및 pGV1994ep_rev (단편 6)를 이용하여 산출되었다. 단편 PCR은 분석 1% TAE 겔에서 분석되고, 이후 산물은 37℃에서 1시간 동안 DpnI 절단되고, 1% 예비 TAE 아가로오스 겔 상에서 분리되고, Freeze'n'Squeeze (BIORAD) 처리되고, 그리고 최종적으로 펠릿 착색 (Novagen)되었다. 깨끗한 단편은 집합 PCR을 위한 주형으로서 기능하였다. 성공적인 집합 PCR후, 상동성 재조합 (앞서 기술된 바와 같음)이 라이브러리를 산출하는데 이용되었다. 1000개 이상의 개별 클론이 0.125 mM의 이소부티르알데히드 농도를 이용하여 스크리닝되었다. 상위 60개 변이체로 구성되는 재스크리닝 평판이 수집되고 0.125 mM 이소부티르알데히드로 조사되었다.
100 ㎖ SC-URA 배지에서 발현을 위해 10개의 변이체가 선택되고 용해물에서 그들의 비활성이 측정되었다. 이들 중에서 4개는 염기서열분석되고 (돌연변이에 대해 표 95를 참조한다), 정제되고, 그리고 더욱 상세하게 특성화되었다 (표 96). 이들 새로운 변이체는 Ll_AdhARE1과 같은 용해물에서 유사한 비활성을 보였다. 흥미롭게도, 변이체 4A3은 높은 비활성을 갖는 효소로서 두드러졌다.
5 세대로부터 변이체에서 돌연변이의 목록.
변이체 돌연변이
Ll_AdhA1H7-his6 Y50F, I212A, L264V, Y113F
Ll_AdhA10F10-his6 Y50F, I212T, L264V, Q77S, Y113F
Ll_AdhA8F11-his6 Y50F, I212A, L264V, Q77R, Y113F
Ll_AdhA8D10-his6 Y50F, I212V, L264V, Q77S, Y113F
5 세대로부터 변이체의 생화학적 성질.
조용해물 정제된 단백질
변이체 U/mg K M [mM] U/mg k cat [s -1 ] k cat / K M [M -1 *s -1 ]
Ll_AdhA1H7-his6 1.12 ± 0.11 39.9 ± 1.7
Ll_AdhA10F10-his6 1.15 ± 0.17 75.4 ± 12.3
Ll_AdhA8F11-his6 1.09 ± 0.13 0.8 ± 0.2 41.7 ± 0.2 55 68233
Ll_AdhA8D10-his6 1.05 ± 0.08 58.8 ± 4.5
실시예 30: 상동한 ADH 효소의 조작
하기 실시예에서는 추가의 ADH 효소가 추가의 ADH 효소의 동역학적 성질을 향상시키기 위해 어떻게 확인되고 조작되는 지를 예시한다.
락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA에 상동한 효소는 하기 검색 파라미터: 기대 역치 (Expect threshold)=10, 단어 크기 (word size)=3, 매트릭스 (matrix)=Blosum62, 갭 오프닝 (gap opening)=11, 갭 연장 (gap extension)= 1을 갖는 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 아미노산 서열을 이용한 공개적으로 가용한 데이터베이스의 BlastP 검색을 통해 확인되었다. 대략 60% 이상의 서열 동일성을 갖는 동족체를 나타내는 상위 100개 히트가 선별되고 표 97에 열거된다. 이들 서열은 하기 파라미터를 갖는 벡터 NTI Advance 10.3.1의 구성요소인 복수 서열 배열 도구 AlignX를 이용하여 배열되었다: 갭 오프닝 페널티 (Gap opening penalty) = 10, 갭 연장 페널티 (gap extension penalty) = 0.05, 갭 분리 페널티 범위 (gap separation penalty range) = 8. 이들 복수 서열 배열은 (a) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 티로신 50; (b) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 글루타민 77; (c) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 발린 108; (d) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 티로신 113; (e) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 이소류신 212; 그리고 (f) 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 185)의 류신 264에 상응하는 잔기 사이에 매우 높은 수준의 보존을 보였는데, 여기서 AdhA (서열 번호: 185)는 락토코커스 락티스(L. lactis) 알코올 탈수소효소 (ADH) 유전자 adhA (서열 번호: 184) 또는 이의 코돈-최적화된 이형 (서열 번호: 206)에 의해 인코딩된다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
상기 상세한 설명은 명료한 이해를 위해 제공되고 부당한 제한으로서 해석되지 않아야 하는데, 그 이유는 변형이 당업자에게 명백할 것이기 때문이다.
본 발명이 특정 구체예와 관련하여 기술되긴 했지만, 추가의 변형이 가능하고, 그리고 일반적으로, 본 발명의 원리에 따라, 그리고 본 발명이 속하는 분야에서 공지되거나 관례적 실행 내에 있고, 앞서 진술된 본질적 특징 (essential feature)에 적용될 수 있고, 첨부된 특허청구범위의 범위에서 추종되는 바와 같은 본 발명의 개시로부터 벗어남을 비롯하여, 본 발명의 임의의 변화, 용도, 또는 적응을 본 출원이 커버하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 그리고 간행물의 특허청구범위, 도면 및/또는 그림을 비롯한 개시는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> GEVO, INC. Buelter, Thomas Hawkins, Andrew Porter-Scheinman, Stephanie Meinhold, Peter Dundon, Catherine Asleson Aristidou, Aristos Urano, Jun Lies, Doug Peters, Matthew Dey, Melissa Jancauskas, Justas Evans, Kent Kelly, Julie Berry, Ruth Bastian, Sabine Arnold, Frances <120> Yeast Microorganisms with Reduced By-Product Accumulation for Improved Production of Fuels, Chemicals, and Amino Acids <130> GEVO-045/03WO <150> US 61/304,069 <151> 2010-02-12 <150> US 61/308,568 <151> 2010-02-26 <150> US 61/282,641 <151> 2010-03-10 <150> US 61/352,133 <151> 2010-06-07 <150> US 61/411,885 <151> 2010-11-09 <150> US 61/430,801 <151> 2010-01-07 <160> 268 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 267 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ser Gln Gly Arg Lys Ala Ala Glu Arg Leu Ala Lys Lys Thr Val 1 5 10 15 Leu Ile Thr Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Leu Glu 20 25 30 Tyr Leu Glu Ala Ser Asn Gly Asp Met Lys Leu Ile Leu Ala Ala Arg 35 40 45 Arg Leu Glu Lys Leu Glu Glu Leu Lys Lys Thr Ile 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2 <211> 267 <212> PRT <213> Kabatiella polyspora <400> 2 Met Ser Gln Gly Arg Lys Ala Ser Glu Arg Leu Ala Gly Lys Thr Val 1 5 10 15 Leu Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Leu Glu 20 25 30 Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gly His Met Lys Leu Ile Leu Val Ala Arg 35 40 45 Arg Leu Glu Lys Leu Gln Glu Leu Lys Glu Thr Ile Cys Lys Glu Tyr 50 55 60 Pro Glu Ser Lys Val His Val Glu Glu Leu Asp Ile Ser Asp Ile Asn 65 70 75 80 Arg Ile Pro Glu Phe Ile Ala Lys Leu Pro Glu Glu Phe Lys Asp Ile 85 90 95 Asp Ile Leu Ile Asn Asn Ala Gly Lys Ala Leu Gly Ser Asp Thr Ile 100 105 110 Gly Asn Ile Glu Asn Glu Asp Ile Lys Gly Met Phe Glu Thr Asn Val 115 120 125 Phe Gly Leu Ile Cys Leu Thr Gln Ala Val Leu Pro Ile Phe Lys Ala 130 135 140 Lys Asn Gly Gly Asp Ile Val Asn Leu Gly Ser Ile Ala Gly Ile Glu 145 150 155 160 Ala Tyr Pro Thr Gly Ser Ile Tyr Cys Ala Thr Lys Phe Ala Val Lys 165 170 175 Ala Phe Thr Glu Ser Leu Arg Lys Glu Leu Ile Asn Thr Lys Ile Arg 180 185 190 Val Ile Glu Ile Ala Pro Gly Met Val Asn 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Val Thr Gln Ala Val Leu His Ile Phe Gln Lys 130 135 140 Lys Asn Ser Gly Asp Ile Val Asn Leu Gly Ser Val Ala Gly Arg Asp 145 150 155 160 Ala Tyr Pro Thr Gly Ser Ile Tyr Cys Ala Ser Lys Phe Ala Val Arg 165 170 175 Ala Phe Thr Glu Ser Leu Arg Arg Glu Leu Ile Asn Thr Lys Ile Arg 180 185 190 Val Ile Leu Ile Ala Pro Gly Ile Val Glu Thr Glu Phe Ser Val Val 195 200 205 Arg Tyr Lys Gly Asp Asn Glu Arg Ala Lys Ser Val Tyr Asp Gly Val 210 215 220 His Pro Leu Glu Ala Asp Asp Val Ala Asp Leu Ile Val Tyr Thr Thr 225 230 235 240 Ser Arg Lys Gln Asn Thr Val Ile Ala Asp Thr Leu Ile Phe Pro Thr 245 250 255 Ser Gln Gly Ser Ala Phe His Val His Arg Asp 260 265 <210> 4 <211> 268 <212> PRT <213> Candida glabrata <400> 4 Met Ser Gln Gly Arg Lys Ala Ala Glu Arg Leu Gln Gly Lys Ile Ala 1 5 10 15 Phe Ile Thr Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Ile Glu 20 25 30 Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gly Ser Val Lys Leu Val Leu Gly Ala Arg 35 40 45 Arg Met Glu Lys Leu Glu Glu Leu Lys Lys Glu Leu Leu Ala Gln Tyr 50 55 60 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<213> Saccharomyces bayanus <400> 5 Met Ser Gln Gly Arg Lys Ala Ala Glu Arg Leu Ala Asn Lys Thr Val 1 5 10 15 Leu Ile Thr Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Leu Glu 20 25 30 Tyr Leu Glu Ala Ser Asn Gly Asn Met Lys Leu Ile Leu Ala Ala Arg 35 40 45 Arg Leu Glu Lys Leu Glu Glu Leu Lys Lys Thr Ile Asp Glu Glu Phe 50 55 60 Pro Asn Ala Lys Val His Val Gly Gln Leu Asp Ile Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Lys Ile Lys Pro Phe Ile Glu Asn Leu Pro Glu Ala Phe Lys Asp Ile 85 90 95 Asp Ile Leu Ile Asn Asn Ala Gly Lys Ala Leu Gly Ser Glu Arg Val 100 105 110 Gly Glu Ile Ala Thr Gln Asp Ile Gln Asp Val Phe Asp Thr Asn Val 115 120 125 Thr Ala Leu Ile Asn Val Thr Gln Ala Val Leu Pro Ile Phe Gln Ala 130 135 140 Lys Asn Ser Gly Asp Ile Val Asn Leu Gly Ser Val Ala Gly Arg Asp 145 150 155 160 Ala Tyr Pro Thr Gly Ser Ile Tyr Cys Ala Ser Lys Phe Ala Val Gly 165 170 175 Ala Phe Thr Asp Ser Leu Arg Lys Glu Leu Ile Asn Thr Lys Ile Arg 180 185 190 Val Ile Leu Ile Ala Pro Gly Leu Val Glu Thr Glu Phe Ser Leu 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267 <212> PRT <213> Ashbya gossypii <400> 8 Met Ser Leu Gly Arg Lys Ala Ala Glu Arg Leu Ala Asn Lys Ile Val 1 5 10 15 Leu Val Thr Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Arg Ala Thr Ala Ile Asn 20 25 30 Tyr Ala Asp Ala Thr Asp Gly Ala Ile Lys Leu Ile Leu Val Ala Arg 35 40 45 Arg Ala Glu Lys Leu Thr Ser Leu Lys Gln Glu Ile Glu Ser Lys Tyr 50 55 60 Pro Asn Ala Lys Ile His Val Gly Gln Leu Asp Val Thr Gln Leu Asp 65 70 75 80 Gln Ile Arg Pro Phe Leu Glu Gly Leu Pro Glu Glu Phe Arg Asp Ile 85 90 95 Asp Ile Leu Ile Asn Asn Ala Gly Lys Ala Leu Gly Thr Glu Arg Val 100 105 110 Gly Glu Ile Ser Met Asp Asp Ile Gln Glu Val Phe Asn Thr Asn Val 115 120 125 Ile Gly Leu Val His Leu Thr Gln Glu Val Leu Pro Ile Met Lys Ala 130 135 140 Lys Asn Ser Gly Asp Ile Val Asn Val Gly Ser Ile Ala Gly Arg Glu 145 150 155 160 Ala Tyr Pro Gly Gly Ser Ile Tyr Cys Ala Thr Lys His Ala Val Lys 165 170 175 Ala Phe Thr Arg Ala Met Arg Lys Glu Leu Ile Ser Thr Lys Ile Arg 180 185 190 Val Phe Glu Ile Ala Pro Gly Ser Val Glu Thr Glu Phe 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PRT <213> Kluyveromyces waltii <400> 11 Met Ser Gln Gly Arg Lys Ala Ser Glu Arg Leu Ala Gly Lys Thr Val 1 5 10 15 Leu Ile Thr Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Gln Ala Thr Ala Leu Glu 20 25 30 Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gly Asn Ile Lys Leu Ile Leu Ala Ala Arg 35 40 45 Arg Leu Glu Lys Leu Lys Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Lys Asp Phe 50 55 60 Pro Glu Ala Lys Val Tyr Ile Gly Gln Leu Asp Val Thr His Thr Asp 65 70 75 80 Glu Ile Lys Pro Phe Ile Asp Asn Leu Pro Glu Glu Phe Lys Asp Ile 85 90 95 Asp Ile Leu Ile Asn Asn Ala Gly Lys Ala Leu Gly Ser Asp Pro Val 100 105 110 Gly Thr Ile Asp Ala Ser Asp Ile Glu Gly Met Ile Gln Thr Asn Val 115 120 125 Val Ala Leu Ile Asn Met Thr Gln Ala Val Leu Pro Ile Phe Lys Ala 130 135 140 Lys Asn Ala Gly Asp Ile Val Asn Leu Gly Ser Val Ala Gly Arg Glu 145 150 155 160 Ala Tyr Pro Thr Gly Ser Ile Tyr Cys Ala Thr Lys His Ala Val Arg 165 170 175 Ala Phe Thr Gln Ser Leu Arg Lys Glu Leu Ile Asn Thr Asn Ile Arg 180 185 190 Val Ile Glu Ile Ala Pro Gly Asn Val Glu Thr Glu Phe Ser 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<212> PRT <213> Pichia pastoris <400> 14 Met Ser Tyr Gly Leu Ala Ala Ala Ser Arg Leu Ala Gly Lys Val Ile 1 5 10 15 Leu Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Glu Ala Thr Ala Leu Glu 20 25 30 Tyr Ala Asn Ala Ala Lys Gly Glu Ile Lys Leu Ala Leu Ser Ala Arg 35 40 45 Arg Phe Glu Lys Leu Glu Gly Leu Lys Glu Lys Leu Thr Thr Gln Trp 50 55 60 Pro Asn Ile Lys Val His Ile Ala Leu Leu Asp Val Ser Asn Ile Ala 65 70 75 80 Lys Leu Thr Glu Tyr Val Glu Ser Leu Pro Glu Glu Phe Lys Ala Val 85 90 95 Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Lys Ala Leu Gly Ile Asp Arg Val 100 105 110 Gly Gln Ile Leu Gln Glu Asp Ile Asp Gly Met Phe Gln Thr Asn Val 115 120 125 Ile Gly Leu Ile Ser Leu Thr Gln Leu Ile Leu Pro Gly Met Lys Ala 130 135 140 Arg Asn Arg Gly Asp Ile Ile Gln Leu Gly Ser Ile Ala Gly Arg Asp 145 150 155 160 Pro Tyr Pro Gly Gly Gly Ile Tyr Cys Ala Thr Lys Ala Ala Val Arg 165 170 175 Ser Phe Ser His Ser Leu Arg Lys Glu Leu Ile Asp Thr Lys Ile Arg 180 185 190 Val Ile Glu Ile Asp Pro Gly Ala Val Gln Thr Glu Phe Ser 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PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 17 Met Ser Phe Gly Asp Lys Ala Ala Ala Arg Leu Ala Gly Lys Thr Val 1 5 10 15 Phe Val Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Gln Ala Thr Val Leu Ala 20 25 30 Leu Ala Glu Ala Ala Lys Gly Asp Leu Lys Phe Val Leu Ala Ala Arg 35 40 45 Arg Thr Asp Arg Leu Asp Glu Leu Lys Lys Lys Leu Glu Thr Asp Tyr 50 55 60 Lys Gly Ile Gln Val Leu Pro Phe Lys Leu Asp Val Ser Lys Val Glu 65 70 75 80 Glu Thr Glu Asn Ile Val Ser Lys Leu Pro Lys Glu Phe Ser Glu Val 85 90 95 Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly Met Val His Gly Thr Glu Lys Val 100 105 110 Gly Ser Ile Asn Gln Asn Asp Ile Glu Ile Met Phe His Thr Asn Val 115 120 125 Leu Gly Leu Ile Ser Val Thr Gln Gln Phe Val Gly Glu Met Arg Lys 130 135 140 Arg Asn Lys Gly Asp Ile Val Asn Ile Gly Ser Ile Ala Gly Arg Glu 145 150 155 160 Pro Tyr Val Gly Gly Gly Ile Tyr Cys Ala Thr Lys Ala Ala Val Arg 165 170 175 Ser Phe Thr Glu Thr Leu Arg Lys Glu Asn Ile Asp Thr Arg Ile Arg 180 185 190 Val Ile Glu Val Asp Pro Gly Ala Val Glu Thr Glu Phe Ser Val 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acgttagagc ggttgcagcc cctaaactag gtccagccgc agacgacgca 600 attagcgctg caattgctaa aattcagacg gcgaaactac cagtagtcct tgtcggtatg 660 aagggcggaa gaccagaagc aataaaagct gttcgtaagt tattgaagaa agtccaatta 720 cctttcgttg agacttacca agcagcaggt actttatcta gagatttaga ggatcagtat 780 tttggaagga taggtctatt tagaaaccaa ccaggagatt tactattaga acaagctgat 840 gttgtactta ctatcggtta tgatcctata gagtatgacc caaagttttg gaacataaat 900 ggggatagaa caattataca tctagacgag ataatcgccg acatcgatca cgcttatcaa 960 ccagatttag aactaatcgg agatatcccg tcaacaatca atcatattga acatgatgct 1020 gtaaaggttg agttcgctga acgtgagcag aaaatcttat ctgatctaaa gcaatatatg 1080 catgagggtg aacaagttcc agcagactgg aaatctgacc gtgcacatcc tttggaaatc 1140 gttaaggaac taagaaatgc ggtcgatgat catgtgactg ttacatgtga tatcggttca 1200 catgcaattt ggatgtcacg ttattttagg agctacgaac cattaacttt aatgatatct 1260 aacgggatgc aaactctggg ggttgcactt ccttgggcta ttggcgctag tttagttaag 1320 cccggtgaga aggtggtatc ggtatcaggt gatggtggct ttctgttttc ggctatggaa 1380 ttagaaactg cagtccgttt aaaagctccc attgtgcata ttgtctggaa tgattctact 1440 tacgacatgg ttgcttttca acagttgaag aaatacaata gaacttcggc tgtagacttt 1500 ggtaacatcg atattgtgaa atatgctgag tcttttggcg caacaggcct gagggtggaa 1560 agtccagatc agttagctga tgtgttgaga caagggatga atgccgaggg accggtaatc 1620 atagatgtgc cagttgacta ctcagacaat attaatttgg cttctgataa acttcctaaa 1680 gagtttggcg agctaatgaa gaccaaagcc ttataa 1716 <210> 43 <211> 571 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 43 Met Leu Thr Lys Ala Thr Lys Glu Gln Lys Ser Leu Val Lys Asn Arg 1 5 10 15 Gly Ala Glu Leu Val Val Asp Cys Leu Val Glu Gln Gly Val Thr His 20 25 30 Val Phe Gly Ile Pro Gly Ala Lys Ile Asp Ala Val Phe Asp Ala Leu 35 40 45 Gln Asp Lys Gly Pro Glu Ile Ile Val Ala Arg His Glu Gln Asn Ala 50 55 60 Ala Phe Met Ala Gln Ala Val Gly Arg Leu Thr Gly Lys Pro Gly Val 65 70 75 80 Val Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly Leu 85 90 95 Leu Thr Ala Asn Thr Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Ala Gly Asn 100 105 110 Val Ile Arg Ala Asp Arg Leu Lys Arg Thr 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ttcagaacga aggtaaattc gtccaccaca ctctggctga cggcgatttc 360 aaacacttca tgaaaatgca tgaacctgtg actgcggcac gtacgctgct gactgcagag 420 aacgctactg tggaaatcga ccgcgttctg tctgcgctgc tgaaagaacg caaaccagtt 480 tacatcaacc tgcctgtgga tgttgcggca gctaaagcgg aaaaaccgag cctgccgctg 540 aagaaagaaa actccacttc taacactagc gaccaggaaa tcctgaacaa aatccaggag 600 tctctgaaaa acgcaaagaa accaatcgtg atcaccggcc acgaaatcat ttcttttggt 660 ctggagaaga ccgtgaccca attcatcagc aaaaccaaac tgccgattac caccctgaac 720 ttcggcaagt cctctgttga cgaggctctg ccgtctttcc tgggcatcta caacggtact 780 ctgagcgaac cgaacctgaa agaatttgtt gaatctgcgg acttcatcct gatgctgggc 840 gttaaactga ccgactcttc taccggtgca ttcactcacc atctgaacga aaacaaaatg 900 attagcctga acatcgacga gggtaaaatc ttcaacgagc gtatccagaa cttcgacttc 960 gaaagcctga tcagctctct gctggacctg tccgaaatcg agtataaagg caaatacatt 1020 gacaaaaagc aagaagattt cgtaccatct aacgcactgc tgtcccagga tcgcctgtgg 1080 caggccgtgg agaacctgac ccagagcaat gaaaccatcg tggcggaaca aggtacgagc 1140 tttttcggcg cgtcttctat ctttctgaaa tccaaaagcc attttatcgg tcagccgctg 1200 tggggtagca ttggctatac tttcccggca gcgctgggct ctcagatcgc tgataaagaa 1260 tctcgtcatc tgctgttcat cggtgacggt tccctgcagc tgaccgtaca ggaactgggt 1320 ctggcaattc gtgaaaagat caacccgatt tgcttcatta ttaacaatga cggctacacc 1380 gttgagcgtg agatccacgg tccgaaccag tcttacaacg atatccctat gtggaactac 1440 tctaaactgc cggagtcctt cggcgcaact gaggaccgtg ttgtgtctaa aattgtgcgt 1500 accgaaaacg aatttgtgag cgtgatgaaa gaggcccagg ccgatccgaa ccgtatgtac 1560 tggatcgaac tgatcctggc gaaagaaggc gcaccgaagg tactgaagaa aatgggcaag 1620 ctgtttgctg aacagaataa atcctaa 1647 <210> 49 <211> 548 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 49 Met Tyr Thr Val Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu His Glu Leu Gly 1 5 10 15 Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu 20 25 30 Asp Gln Ile Ile Ser His Lys Asp Met Lys Trp Val Gly Asn Ala Asn 35 40 45 Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Thr Lys Lys 50 55 60 Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Val 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1440 gatggtagat tctccggtgg cactcacggt tttgttgtcg gccatattgt gcctgaagcc 1500 gttgagggtg gactaatcgg cttagttgaa gatgacgata taatagagat agatgcagtc 1560 aacaactcta tatccctgaa agtttccgat gaagaaatcg caaagagaag agctaattat 1620 cagaagccaa ctccgaaagc caccagggga gttttggcaa aattcgctaa attaacccgt 1680 cctgcatcgg aagggtgtgt tactgatctg taa 1713 <210> 51 <211> 570 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 51 Met Glu Phe Lys Tyr Asn Gly Lys Val Glu Ser Val Glu Leu Asn Lys 1 5 10 15 Tyr Ser Lys Thr Leu Thr Gln Asp Pro Thr Gln Pro Ala Thr Gln Ala 20 25 30 Met Tyr Tyr Gly Ile Gly Phe Lys Asp Glu Asp Phe Lys Lys Ala Gln 35 40 45 Val Gly Ile Val Ser Met Asp Trp Asp Gly Asn Pro Cys Asn Met His 50 55 60 Leu Gly Thr Leu Gly Ser Lys Ile Lys Ser Ser Val Asn Gln Thr Asp 65 70 75 80 Gly Leu Ile Gly Leu Gln Phe His Thr Ile Gly Val Ser Asp Gly Ile 85 90 95 Ala Asn Gly Lys Leu Gly Met Arg Tyr Ser Leu Val Ser Arg Glu Val 100 105 110 Ile Ala Asp Ser Ile Glu Thr Asn Ala Gly Ala Glu Tyr Tyr Asp Ala 115 120 125 Ile Val Ala 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agaagttagc tgagtgtgac 720 aacattggtg aatacatcaa gaagacaatg gaattgggta ttttacctcg tgatatcctc 780 acaaaagagg cttttgaaaa cgccattact tatgtcgttg caaccggtgg gtccactaat 840 gctgttttgc atttggtggc tgttgctcac tctgcgggtg tcaagttgtc accagatgat 900 ttccaaagaa tcagtgatac tacaccattg atcggtgact tcaaaccttc tggtaaatac 960 gtcatggccg atttgattaa cgttggtggt acccaatctg tgattaagta tctatatgaa 1020 aacaacatgt tgcacggtaa cacaatgact gttaccggtg acactttggc agaacgtgca 1080 aagaaagcac caagcctacc tgaaggacaa gagattatta agccactctc ccacccaatc 1140 aaggccaacg gtcacttgca aattctgtac ggttcattgg caccaggtgg agctgtgggt 1200 aaaattaccg gtaaggaagg tacttacttc aagggtagag cacgtgtgtt cgaagaggaa 1260 ggtgccttta ttgaagcctt ggaaagaggt gaaatcaaga agggtgaaaa aaccgttgtt 1320 gttatcagat atgaaggtcc aagaggtgca ccaggtatgc ctgaaatgct aaagccttcc 1380 tctgctctga tgggttacgg tttgggtaaa gatgttgcat tgttgactga tggtagattc 1440 tctggtggtt ctcacgggtt cttaatcggc cacattgttc ccgaagccgc tgaaggtggt 1500 cctatcgggt tggtcagaga cggcgatgag attatcattg atgctgataa taacaagatt 1560 gacctattag tctctgataa ggaaatggct caacgtaaac aaagttgggt tgcacctcca 1620 cctcgttaca caagaggtac tctatccaag tatgctaagt tggtttccaa cgcttccaac 1680 ggttgtgttt tagatgcttg a 1701 <210> 53 <211> 566 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 53 Met Lys Lys Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Ile Ile Thr Glu Pro Lys Gly 1 5 10 15 Gln Gly Ala Ser Gln Ala Met Leu Tyr Ala Thr Gly Phe Lys Lys Glu 20 25 30 Asp Phe Lys Lys Pro Gln Val Gly Val Gly Ser Cys Trp Trp Ser Gly 35 40 45 Asn Pro Cys Asn Met His Leu Leu Asp Leu Asn Asn Arg Cys Ser Gln 50 55 60 Ser Ile Glu Lys Ala Gly Leu Lys Ala Met Gln Phe Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Ser Asp Gly Ile Ser Met Gly Thr Lys Gly Met Arg Tyr Ser Leu 85 90 95 Gln Ser Arg Glu Ile Ile Ala Asp Ser Phe Glu Thr Ile Met Met Ala 100 105 110 Gln His Tyr Asp Ala Asn Ile Ala Ile Pro Ser Cys Asp Lys Asn Met 115 120 125 Pro Gly Val Met Met Ala Met Gly Arg His Asn Arg Pro Ser Ile Met 130 135 140 Val Tyr Gly Gly Thr Ile Leu Pro Gly His Pro Thr Cys Gly Ser Ser 145 150 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Drosophila melanogaster <400> 54 atgtcgttta ctttgaccaa caagaacgtg attttcgttg ccggtctggg aggcattggt 60 ctggacacca gcaaggagct gctcaagcgc gatctgaaga acctggtgat cctcgaccgc 120 attgagaacc cggctgccat tgccgagctg aaggcaatca atccaaaggt gaccgtcacc 180 ttctacccct atgatgtgac cgtgcccatt gccgagacca ccaagctgct gaagaccatc 240 ttcgcccagc tgaagaccgt cgatgtcctg atcaacggag ctggtatcct ggacgatcac 300 cagatcgagc gcaccattgc cgtcaactac actggcctgg tcaacaccac gacggccatt 360 ctggacttct gggacaagcg caagggcggt cccggtggta tcatctgcaa cattggatcc 420 gtcactggat tcaatgccat ctaccaggtg cccgtctact ccggcaccaa ggccgccgtg 480 gtcaacttca ccagctccct ggcgaaactg gcccccatta ccggcgtgac ggcttacact 540 gtgaaccccg gcatcacccg caccaccctg gtgcacacgt tcaactcctg gttggatgtt 600 gagcctcagg ttgccgagaa gctcctggct catcccaccc agccctcgtt ggcctgcgcc 660 gagaacttcg tcaaggctat cgagctgaac cagaacggag ccatctggaa actggacttg 720 ggcaccctgg aggccatcca gtggaccaag cactgggact ccggcatcta a 771 <210> 55 <211> 256 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 55 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tggagctgat gtgattatca attctggtga tgtaaatcca 660 gttgatgaaa ttaaaaaaat aactggcggc ttaggggtgc aaagtgcaat agtttgtgct 720 gttgcaagga ttgcttttga acaagcggtt gcttctttga aacctatggg caaaatggtt 780 gctgtggcac ttcccaatac tgagatgact ttatcagttc caacagttgt ttttgacgga 840 gtggaggttg caggttcact tgtcggaaca agacttgact tggcagaagc ttttcaattt 900 ggagcagaag gtaaggtaaa accaattgtt gcgacacgca aactggaaga aatcaatgat 960 attattgatg aaatgaaggc aggaaaaatt gaaggccgaa tggtcattga ttttactaaa 1020 taa 1023 <210> 57 <211> 340 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 57 Met Lys Ala Ala Val Val Arg His Asn Pro Asp Gly Tyr Ala Asp Leu 1 5 10 15 Val Glu Lys Glu Leu Arg Ala Ile Lys Pro Asn Glu Ala Leu Leu Asp 20 25 30 Met Glu Tyr Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Val Ala Ala Gly 35 40 45 Asp Tyr Gly Asn Lys Ala Gly Thr Val Leu Gly His Glu Gly Ile Gly 50 55 60 Ile Val Lys Glu Ile Gly Ala Asp Val Ser Ser Leu Gln Val Gly Asp 65 70 75 80 Arg Val Ser Val Ala Trp Phe Phe Glu Gly Cys Gly His Cys Glu Tyr 85 90 95 Cys Val Ser Gly 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cactggcggt ttaggtgttc aatccgcgat tgtatgtgcc 720 gttgcgagaa ttgcattcga gcaggctgta gcctcactaa agcctatggg caaaatggta 780 gccgttgctg taccaaacac agaaatgaca ttatctgtgc caacagtcgt gtttgatgga 840 gttgaagtag caggtagtct tgttggaaca agactcgatt tggccgaagc tttccaattc 900 ggtgcagaag ggaaggttaa gcctattgtc gctaccagaa agttggagga aatcaatgac 960 atcattgatg agatgaaggc ggggaagatt gaaggtagaa tggttataga cttcacgaag 1020 caccaccacc accaccacta a 1041 <210> 61 <211> 346 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 61 Met Lys Ala Ala Val Val Arg His Asn Pro Asp Gly Tyr Ala Asp Leu 1 5 10 15 Val Glu Lys Glu Leu Arg Ala Ile Lys Pro Asn Glu Ala Leu Leu Asp 20 25 30 Met Glu Tyr Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Val Ala Ala Gly 35 40 45 Asp Phe Gly Asn Lys Ala Gly Thr Val Leu Gly His Glu Gly Ile Gly 50 55 60 Ile Val Lys Glu Ile Gly Ala Asp Val Ser Ser Leu Gln Val Gly Asp 65 70 75 80 Arg Val Ser Val Ala Trp Phe Phe Glu Gly Cys Gly His Cys Glu Tyr 85 90 95 Cys Val Ser Gly Asn Glu Thr Phe Cys Arg Glu Val Lys Asn Ala Gly 100 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ctgatatcga tgtcttgatt aataatgctg gacttgctct aggtaccgat 300 aaagtcattg atcttaatat tgatgacgcc gttaccatga ttactaccaa tgttcttggt 360 atgatggcta tgactcgtgc ggttcttcct atattctaca gcaaaaacaa gggtgatatt 420 ttgaacgttg gcagtattgc cggcagagaa tcatacgtag gcggctccgt ttactgctct 480 accaagtctg cccttgctca attcacttcc gctttgcgta aggagactat tgacactcgc 540 attcgtatta tggaggttga tcctggcttg gtcgaaaccg aattcagcgt tgtgagattc 600 cacggagaca aacaaaaggc tgataatgtt tacaaaaata gtgagccttt gacacccgaa 660 gacattgctg aggtgattct ttttgccctc actcgcagag aaaacgtcgt tattgccgat 720 acacttgttt tcccatccca tcaaggtggt gccaatcatg tgtacagaaa gcaagcgtag 780 <210> 162 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV3490 <400> 162 gtcaagattg ttgaacaaaa gcc 23 <210> 163 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV3492 <400> 163 gagtaaaaaa ggagtagaaa cattttgaag ctatggttta gtggggttgg ggaagctggc 60 <210> 164 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV3493 <400> 164 caaatttttc ttttttttct gtacaggcca acatcaagaa gactattcca aacttggtc 59 <210> 165 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV3495 <400> 165 tgtatgattc gaaagcttct tcacc 25 <210> 166 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV3491 <400> 166 gccagcttcc ccaaccccac taaaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc 60 <210> 167 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV3494 <400> 167 gaccaagttt ggaatagtct tcttgatgtt ggcctgtaca gaaaaaaaag aaaaatttg 59 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV3497 <400> 168 ttactcgagc ttgattctga c 21 <210> 169 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV2320 <400> 169 ggctgtgtag aagtactcgc cgatag 26 <210> 170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV3496 <400> 170 atgtcttcat cactagcaga g 21 <210> 171 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV0821 <400> 171 cgggtaatta acgacaccct agagg 25 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gaaaaatttg 60 <210> 179 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV3509 <400> 179 ctcctccgtt gcagaacaag gctttg 26 <210> 180 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV2320 <400> 180 ggctgtgtag aagtactcgc cgatag 26 <210> 181 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV3508 <400> 181 cggtgttaag tgccagaaat tggttg 26 <210> 182 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV0821 <400> 182 cgggtaatta acgacaccct agagg 25 <210> 183 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oGV3510 <400> 183 cggcgtactc gacgtcttga gaagtag 27 <210> 184 <211> 1023 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 184 atgaaagcag cagtagtaag acacaatcca gatggttatg cggaccttgt tgaaaaggaa 60 cttcgagcaa tcaaacctaa tgaagctttg cttgacatgg agtattgtgg agtctgtcat 120 accgatttgc acgttgcagc aggtgattat ggcaacaaag cagggactgt tcttggtcat 180 gaaggaattg gaattgtcaa agaaattgga gctgatgtaa gctcgcttca agttggtgat 240 cgggtttcag tggcttggtt ctttgaagga tgtggtcact gtgaatactg tgtatctggt 300 aatgaaactt tttgtcgaga agttaaaaat gcaggatatt cagttgatgg cggaatggct 360 gaagaagcaa ttgttgttgc cgattatgct gtcaaagttc ctgacggact tgacccaatt 420 gaagctagct caattacttg tgctggagta acaacttaca aagcaatcaa agtatcagga 480 gtaaaacctg gtgattggca agtaattttt ggtgctggag gacttggaaa tttagcaatt 540 caatatgcta aaaatgtttt tggagcaaaa gtaattgctg ttgatattaa tcaagataaa 600 ttaaatttag ctaaaaaaat tggagctgat gtgattatca attctggtga tgtaaatcca 660 gttgatgaaa ttaaaaaaat aactggcggc ttaggggtgc aaagtgcaat agtttgtgct 720 gttgcaagga ttgcttttga acaagcggtt gcttctttga aacctatggg caaaatggtt 780 gctgtggcac ttcccaatac tgagatgact ttatcagttc caacagttgt ttttgacgga 840 gtggaggttg caggttcact tgtcggaaca agacttgact tggcagaagc ttttcaattt 900 ggagcagaag gtaaggtaaa accaattgtt gcgacacgca aactggaaga aatcaatgat 960 attattgatg aaatgaaggc aggaaaaatt gaaggccgaa tggtcattga ttttactaaa 1020 taa 1023 <210> 185 <211> 340 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 185 Met Lys Ala Ala Val Val Arg His Asn 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aacgagacat tttgccgaga agtcaaaaac gctggttata gcgttgatgg tggaatggca 360 gaggaagcaa tcgtggttgc agattatgcc gtcaaagtcc cagatggcct agatccaata 420 gaagcatcat ctataacttg tgcaggcgtc accacttaca aagctatcaa ggtgtctggc 480 gttaagccag gagactggca agttatcttc ggagctggtg gcctgggcaa cttagctatc 540 cagtacgcca aaaacgtatt tggtgcgaag gtgatcgctg tagatatcaa tcaagataag 600 ctcaatcttg ccaaaaagat aggtgctgat gtcatcatta actctggtga cgttaaccct 660 gtagacgaaa tcaaaaagat cactggcggt ttaggtgttc aatccgcgat tgtatgtgcc 720 gttgcgagaa ttgcattcga gcaggctgta gcctcactaa agcctatggg caaaatggta 780 gccgttgctt tgccaaacac agaaatgaca ttatctgtgc caacagtcgt gtttgatgga 840 gttgaagtag caggtagtct tgttggaaca agactcgatt tggccgaagc tttccaattc 900 ggtgcagaag ggaaggttaa gcctattgtc gctaccagaa agttggagga aatcaatgac 960 atcattgatg agatgaaggc ggggaagatt gaaggtagaa tggttataga cttcacgaag 1020 caccaccacc accaccacta a 1041 <210> 187 <211> 346 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 187 Met Lys Ala Ala Val Val Arg His Asn Pro Asp Gly Tyr Ala Asp Leu 1 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aacgagacat tttgccgaga agtcaaaaac gctggttata gcgttgatgg tggaatggca 360 gaggaagcga tcgtggttgc agattatgcc gttaaagtcc cagatggcct agatccaata 420 gaagcatcat ctataacttg tgcaggcgtc accacttaca aagctatcaa ggtgtctggc 480 gttaagccag gagactggca agttatcttc ggagctggtg gcctgggcaa cttagctatc 540 cagtacgcca aaaacgtatt tggtgcgaag gtgatcgctg tagatatcaa tcaagataag 600 ctcaatcttg ccaaaaagat aggtgctgat gtcacaatta actctggtga cgttaaccct 660 gtagacgaaa tcaaaaagat cactggcggt ttaggtgttc aatccgcgat tgtatgtgcc 720 gttgcgagaa ttgcattcga gcaggctgta gcctcactaa agcctatggg caaaatggta 780 gccgttgctc tgccaaacac agaaatgaca ttatctgtgc caacagtcgt gtttgatgga 840 gttgaagtag caggtagtct tgttggaaca agactcgatt tggccgaagc tttccaattc 900 ggtgcagaag ggaaggttaa gcctattgtc gctaccagaa agttggagga aatcaatgac 960 atcattgatg agatgaaggc ggggaagatt gaaggtagaa tggttataga cttcacgaag 1020 caccaccacc accaccacta a 1041 <210> 191 <211> 346 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 191 Met Lys Ala Ala Val Val Arg His Asn Pro Asp Gly Tyr Ala Asp Leu 1 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aacgagacat tttgccgaga agtcaaaaac gctggttata gcgttgatgg tggaatggca 360 gaggaagcga tcgtggttgc agattatgcc gttaaagtcc cagatggcct agatccaata 420 gaagcatcat ctataacttg tgcaggcgtc accacttaca aagctatcaa ggtgtctggc 480 gttaagccag gagactggca agttatcttc ggagctggtg gcctgggcaa cttagctatc 540 cagtacgcca aaaacgtatt tggtgcgaag gtgatcgctg tagatatcaa tcaagataag 600 ctcaatcttg ccaaaaagat aggtgctgat gtcacaatta actctggtga cgttaaccct 660 gtagacgaaa tcaaaaagat cactggcggt ttaggtgttc aatccgcgat tgtatgtgcc 720 gttgcgagaa ttgcattcga gcaggctgta gcctcactaa agcctatggg caaaatggta 780 gccgttgctg taccaaacac agaaatgaca ttatctgtgc caacagtcgt gtttgatgga 840 gttgaagtag caggtagtct tgttggaaca agactcgatt tggccgaagc tttccaattc 900 ggtgcagaag ggaaggttaa gcctattgtc gctaccagaa agttggagga aatcaatgac 960 atcattgatg agatgaaggc ggggaagatt gaaggtagaa tggttataga cttcacgaag 1020 caccaccacc accaccacta a 1041 <210> 193 <211> 346 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 193 Met Lys Ala Ala Val Val Arg His Asn Pro Asp Gly Tyr Ala Asp Leu 1 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aacgagacat tttgccgaga attcaaaaac gctggtttta gcgttgatgg tggaatggca 360 gaggaagcga tcgtggttgc agattatgcc gttaaagtcc cagatggcct agatccaata 420 gaagcatcat ctataacttg tgcaggcgtc accacttaca aagctatcaa ggtgtctggc 480 gttaagccag gagactggca agttatcttc ggagctggtg gcctgggcaa cttagctatc 540 cagtacgcca aaaacgtatt tggtgcgaag gtgatcgctg tagatatcaa tcaagataag 600 ctcaatcttg ccaaaaagat aggtgctgat gtcacaatta actctggtga cgttaaccct 660 gtagacgaaa tcaaaaagat cactggcggt ttaggtgttc aatccgcgat tgtatgtgcc 720 gttgcgagaa ttgcattcga gcaggctgta gcctcactaa agcctatggg caaaatggta 780 gccgttgctg taccaaacac agaaatgaca ttatctgtgc caacagtcgt gtttgatgga 840 gttgaagtag caggtagtct tgttggaaca agactcgatt tggccgaagc tttccaattc 900 ggtgcagaag ggaaggttaa gcctattgtc gctaccagaa agttggagga aatcaatgac 960 atcattgatg agatgaaggc ggggaagatt gaaggtagaa tggttataga cttcacgaag 1020 caccaccacc accaccacta a 1041 <210> 197 <211> 346 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 197 Met Lys Ala Ala Val Val Arg His Asn Pro Asp Gly Tyr Ala Asp Leu 1 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tttgtcgaga agttaaaaat gcaggatttt cagttgatgg cggaatggct 360 gaagaagcaa ttgttgttgc cgattatgct gtcaaagttc ctgacggact tgacccaatt 420 gaagctagct caattacttg tgctggagta acaacttaca aagcaatcaa agtatcagga 480 gtaaaacctg gtgattggca agtaattttt ggtgctggag gacttggaaa tttagcaatt 540 caatatgcta aaaatgtttt tggagcaaaa gtaattgctg ttgatattaa tcaagataaa 600 ttaaatttag ctaaaaaaat tggagctgat gtgacaatca attctggtga tgtaaatcca 660 gttgatgaaa ttaaaaaaat aactggcggc ttaggggtgc aaagtgcaat agtttgtgct 720 gttgcaagga ttgcttttga acaagcggtt gcttctttga aacctatggg caaaatggtt 780 gctgtggcag tacccaatac tgagatgact ttatcagttc caacagttgt ttttgacgga 840 gtggaggttg caggttcact tgtcggaaca agacttgact tggcagaagc ttttcaattt 900 ggagcagaag gtaaggtaaa accaattgtt gcgacacgca aactggaaga aatcaatgat 960 attattgatg aaatgaaggc aggaaaaatt gaaggccgaa tggtcattga ttttactaaa 1020 caccaccacc accaccacta a 1041 <210> 220 <211> 340 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 220 Met Lys Ala Ala Val Val Arg His Asn Pro Asp Gly Tyr Ala Asp Leu 1 5 10 15 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Ala Ser Leu Lys Pro Met 245 250 255 Gly Lys Met Val Ala Val Ala Val Pro Asn Thr Glu Met Thr Leu Ser 260 265 270 Val Pro Thr Val Val Phe Asp Gly Val Glu Val Ala Gly Ser Leu Val 275 280 285 Gly Thr Arg Leu Asp Leu Ala Glu Ala Phe Gln Phe Gly Ala Glu Gly 290 295 300 Lys Val Lys Pro Ile Val Ala Thr Arg Lys Leu Glu Glu Ile Asn Asp 305 310 315 320 Ile Ile Asp Glu Met Lys Ala Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Val Ile 325 330 335 Asp Phe Thr Lys 340 <210> 225 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer XX7 <400> 225 ggagaaaacc catatgtcgt ttac 24 <210> 226 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer XX9 <400> 226 gcagccgaac gctcgagggc ggccg 25 <210> 227 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer His_Not1_1947_rev <400> 227 ctcgagcggc cgcttagtgg tggtggtggt ggtgtttagt aaaatcaa 48 <210> 228 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sal1_for <400> 228 gaaagcatag caatctaatc taagtt 26 <210> 229 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer adhAcoSc_SalIin_for <400> 229 gtttgtcgac atgaaggctg cagttgtccg t 31 <210> 230 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer adhAcoSC_NotIin_his_rev <400> 230 tcgagcggcc gcttagtggt ggtggtggtg gtgcttcgtg aagtctataa ccattctacc 60 <210> 231 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer pGV1994ep_for <400> 231 cggtcttcaa tttctcaagt ttcagtttca tttttcttgt tctattacaa c 51 <210> 232 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer pGV1994ep_rev <400> 232 ctaactcctt ccttttcggt tagagcggat gtggg 35 <210> 233 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RecombADHY50_for <400> 233 tgctgccgga gattwcggca acaaggcagg 30 <210> 234 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RecombADHY50_rev <400> 234 cctgccttgt tgccgwaatc tccggcagca 30 <210> 235 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RecombADHL264_for <400> 235 atggtagccg ttgctktacc aaacacagaa 30 <210> 236 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RecombADHL264_rev <400> 236 ttctgtgttt ggtamagcaa cggctaccat 30 <210> 237 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RecombADHI212_Y219_for <400> 237 gctgatgtca yaattaactc tggtgacgtt waccctgtag 40 <210> 238 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RecombADHI212_Y219_rev <400> 238 ctacagggtw aacgtcacca gagttaattr tgacatcagc 40 <210> 239 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHF50_for <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 239 tgctgccgga gatnnkggca acaag 25 <210> 240 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHF50_rev <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 240 gccttgttgc cmnnatctcc ggcag 25 <210> 241 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHR77_for <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 241 gttagttctc tcnnkgtagg tgatag 26 <210> 242 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHR77_rev <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 242 cactctatca cctacmnnga gagaac 26 <210> 243 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHA108_for <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 243 acattttgcc gagaannkaa aaacgc 26 <210> 244 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHA108_rev <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 244 accagcgttt ttmnnttctc ggcaaa 26 <210> 245 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHF113_for <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 245 gtcaaaaacg ctggtnnkag cgttga 26 <210> 246 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHF113_rev <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 246 accatcaacg ctmnnaccag cgtttt 26 <210> 247 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHT212_for <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 247 agataggtgc tgatgtcnnk attaac 26 <210> 248 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHT212_rev <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 248 cagagttaat mnngacatca gcacct 26 <210> 249 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHV264_for <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 249 ggtagccgtt gctnnkccaa acacag 26 <210> 250 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NNKADHV264_rev <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 250 atttctgtgt ttggmnnagc aacggc 26 <210> 251 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2F50Minilib_for <400> 251 gttgcagcag gtgattdkgg caacaaagca 30 <210> 252 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2F50Minilib_rev <400> 252 tgctttgttg ccmhaatcac ctgctgcaac 30 <210> 253 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2Q77Gen5_for3 <400> 253 tgatgtaagc tcgcttcaag ttggtgatcg 30 <210> 254 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2Q77Gen5_rev4 <400> 254 cgatcaccaa cttgaagcga gcttacatca 30 <210> 255 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2R77Gen5_for5 <400> 255 tgatgtaagc tcgcttcgag ttggtgatcg 30 <210> 256 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2R77Gen5_rev6 <400> 256 cgatcaccaa ctcgaagcga gcttacatca 30 <210> 257 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2S77Gen5_for7 <400> 257 tgatgtaagc tcgctttctg ttggtgatcg 30 <210> 258 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2S77Gen5_rev8 <400> 258 cgatcaccaa cagaaagcga gcttacatca 30 <210> 259 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2Y113 Gen5_for9 <400> 259 ttaaaaatgc aggatattca gttgatggcg 30 <210> 260 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2Y113 Gen5_rev10 <400> 260 cgccatcaac tgaatatcct gcatttttaa 30 <210> 261 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2F113 Gen5_for11 <400> 261 ttaaaaatgc aggattttca gttgatggcg 30 <210> 262 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2F113 Gen5_rev12 <400> 262 cgccatcaac tgaaaatcct gcatttttaa 30 <210> 263 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2G113 Gen5_for13 <400> 263 ttaaaaatgc aggagggtca gttgatggcg 30 <210> 264 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2G113 Gen5_rev14 <400> 264 cgccatcaac tgaccctcct gcatttttaa 30 <210> 265 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2T212 Mini_for15 <400> 265 gagctgatgt gryaatcaat tctggtgatg 30 <210> 266 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2T212 Mini_rev16 <400> 266 catcaccaga attgattryc acatcagctc 30 <210> 267 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2V264 Mini_for17 <400> 267 tggttgctgt ggcaktaccc aatactgaga 30 <210> 268 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Recomb2V264 Mini_rev18 <400> 268 tctcagtatt gggtamtgcc acagcaacca 30

Claims (165)

  1. 3-케토산을 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은 상기 3-케토산의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이고, 그리고 상기 3-히드록시산 부산물은 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  3. 청구항 2에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 50% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 청구항 2에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 75% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 청구항 2에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 95% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 재조합 미생물은 아세토락테이트-유래된 산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 아세토락테이트-유래된 산물은 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 그리고 조효소 A에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이고, 그리고 상기 3-히드록시산 부산물은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 청구항 8에 있어서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트 탄소 수율은 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 50% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 청구항 8에 있어서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트 탄소 수율은 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 75% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 청구항 8에 있어서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트 탄소 수율은 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 95% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 재조합 미생물은 2-아세토-2-히드록시부티레이트-유래된 산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 2-아세토-2-히드록시부티레이트-유래된 산물은 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  14. 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 3-케토산의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 상기 효소는 3-케토산 환원효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226 (서열 번호: 1) 또는 이의 동족체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 그리고 서열 번호: 23, 또는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  17. 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은 상기 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  18. 청구항 17에 있어서, 알데히드 중간물질로부터 산성 부산물 탄소 수율은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 35% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  19. 청구항 17에 있어서, 알데히드 중간물질로부터 산성 부산물 탄소 수율은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 75% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  20. 청구항 17에 있어서, 알데히드 중간물질로부터 산성 부산물 탄소 수율은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 95% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  21. 청구항 17에 있어서, 알데히드를 중간물질로서 이용하는 상기 생합성 경로는 이소부탄올, 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-프로판올, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올의 생합성을 위한 경로에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  22. 청구항 17 내지 21중 어느 한 항에 있어서, 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 상기 효소는 알데히드 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 (서열 번호: 25) 또는 이의 동족체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  24. 청구항 22에 있어서, 상기 알데히드 탈수소효소는 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 그리고 서열 번호: 41, 또는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  25. 3-케토산과 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은
    (i) 상기 3-케토산의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 그리고
    (ii) 상기 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이고, 그리고 상기 3-히드록시산 부산물은 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  27. 청구항 26에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 50% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  28. 청구항 26에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 75% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  29. 청구항 26에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 95% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  30. 청구항 26에 있어서, 상기 재조합 미생물은 아세토락테이트-유래된 산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 아세토락테이트 유래된 산물은 이소부탄올, 1-부탄올, 그리고 3-메틸-1-부탄올에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  32. 청구항 25에 있어서, 상기 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이고, 그리고 상기 3-히드록시산 부산물은 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  33. 청구항 32에 있어서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트 탄소 수율은 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 50% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  34. 청구항 32에 있어서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트 탄소 수율은 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 75% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  35. 청구항 32에 있어서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트로부터 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트 탄소 수율은 2-아세토-2-히드록시부티레이트의 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 95% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  36. 청구항 32에 있어서, 상기 재조합 미생물은 2-아세토-2-히드록시부티레이트-유래된 산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 2-아세토-2-히드록시부티레이트-유래된 산물은 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  38. 청구항 25 내지 37중 어느 한 항에 있어서, 3-케토산의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 상기 효소는 3-케토산 환원효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226 (서열 번호: 1) 또는 이의 동족체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  40. 청구항 38에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 그리고 서열 번호: 23, 또는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  41. 청구항 25 내지 40에 있어서, 알데히드 중간물질로부터 산성 부산물 탄소 수율은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 35% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  42. 청구항 25 내지 40중 어느 한 항에 있어서, 알데히드 중간물질로부터 산성 부산물 탄소 수율은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 75% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  43. 청구항 25 내지 40중 어느 한 항에 있어서, 알데히드 중간물질로부터 산성 부산물 탄소 수율은 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 95% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  44. 청구항 25 내지 43중 어느 한 항에 있어서, 알데히드의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 상기 효소는 알데히드 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 (서열 번호: 25) 또는 이의 동족체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  46. 청구항 44에 있어서, 상기 알데히드 탈수소효소는 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 그리고 서열 번호: 41, 또는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  47. 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC) 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  48. 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD) 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  49. 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 재조합 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces) 계통분기의 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  51. 청구항 49에 있어서, 상기 재조합 미생물은 사카로미세스 센수 스트릭토(Saccharomyces sensu stricto) 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 사카로미세스 센수 스트릭토(Saccharomyces sensu stricto) 미생물은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), 사카로미세스 쿠드리아브제비(S. kudriavzevii), 사카로미세스 미카태(S. mikatae), 사카로미세스 바야누스(S. bayanus), 사카로미세스 우바룸(S. uvarum), 사카로미세스 카로카니스(S. carocanis) 및 이들의 하이브리드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  53. 청구항 49에 있어서, 상기 재조합 미생물은 크랩트리 (Crabtree)-음성 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  54. 청구항 53에 있어서, 상기 크랩트리-음성 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 아이사첸키아(Issatchenkia) 및 칸디다(Candida)로 구성된 군에서 선택되는 속 (genus)으로 분류되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 크랩트리-음성 효모 미생물은 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 피치아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis), 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala), 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 및 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  56. 청구항 49에 있어서, 상기 재조합 미생물은 크랩트리-양성 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 크랩트리-양성 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 데바리오미세스(Debaryomyces), 피치아(Pichia), 칸디다(Candida), 그리고 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  58. 청구항 57에 있어서, 상기 크랩트리-양성 효모 미생물은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 지고사카로미세스 바일리(Zygosaccharomyces bailli), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 그리고 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  59. 청구항 49에 있어서, 상기 재조합 미생물은 WGD (전체 유전체 복제)-이후 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  60. 청구항 59에 있어서, 상기 WGD-이후 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 칸디다(Candida)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 WGD-이후 효모 미생물은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli), 그리고 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  62. 청구항 49에 있어서, 상기 재조합 미생물은 WGD (전체 유전체 복제)-이전 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  63. 청구항 62에 있어서, 상기 WGD-이전 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia), 데바리오미세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 아이사첸키아(Issatchenkia), 파키솔렌(Pachysolen), 야로위아(Yarrowia) 및 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 WGD-이전 효모 미생물은 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 피치아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala), 파키솔렌 탄노필리스(Pachysolen tannophilis), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 그리고 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  65. 하기 단계를 포함하는, 3-케토산 중간물질로부터 유래된 유익한 대사산물을 생산하는 방법:
    (a) 청구항 1 내지 16 및 25 내지 64중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 제공하는 단계;
    (b) 유익한 대사산물의 회수가능한 양이 생산될 때까지, 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 재조합 미생물을 배양하는 단계; 그리고
    (c) 유익한 대사산물을 회수하는 단계.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이고, 그리고 유익한 대사산물은 이소부탄올, 2-부탄올, 1-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세토인, 디아세틸, 발린, 류신, 판토텐산, 이소부틸렌, 3-메틸-1-부탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 그리고 조효소 A에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 청구항 65에 있어서, 상기 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이고, 그리고 유익한 대사산물은 2-메틸-1-부탄올, 이소류신, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 하기 단계를 포함하는, 알데히드 중간물질로부터 유래된 유익한 대사산물을 생산하는 방법:
    (a) 청구항 17 내지 64중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 제공하는 단계;
    (b) 유익한 대사산물의 회수가능한 양이 생산될 때까지, 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 재조합 미생물을 배양하는 단계; 그리고
    (c) 유익한 대사산물을 회수하는 단계.
  69. 청구항 68에 있어서, 상기 알데히드 중간물질은 이소부티르알데히드, 1-부타날, 2-메틸-1-부타날, 3-메틸-1-부타날, 1-프로파날, 1-펜타날, 1-헥사날, 3-메틸-1-펜타날, 4-메틸-1-펜타날, 4-메틸-1-헥사날, 그리고 5-메틸-1-헵타날에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 상기 유익한 대사산물은 이소부탄올, 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-프로판올, 1-펜탄올, 1-헥산올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 하기 단계를 포함하는, 3-케토산과 알데히드 중간물질로부터 유래된 유익한 대사산물을 생산하는 방법:
    (a) 청구항 25 내지 64중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 제공하는 단계;
    (b) 유익한 대사산물의 회수가능한 양이 생산될 때까지, 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 재조합 미생물을 배양하는 단계; 그리고
    (c) 유익한 대사산물을 회수하는 단계.
  72. 청구항 71에 있어서, 상기 3-케토산 중간물질은 아세토락테이트이고, 그리고 유익한 대사산물은 이소부탄올, 1-부탄올, 그리고 3-메틸-1-부탄올에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 청구항 71에 있어서, 상기 3-케토산 중간물질은 2-아세토-2-히드록시부티레이트이고, 그리고 유익한 대사산물은 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 그리고 5-메틸-1-헵탄올에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은 아세토락테이트의 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)으로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  75. 청구항 74에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 50% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  76. 청구항 74에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 75% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  77. 청구항 74에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 95% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  78. 청구항 74 내지 77중 어느 한 항에 있어서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 상기 효소는 3-케토산 환원효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  79. 청구항 78에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226 (서열 번호: 1) 또는 이의 동족체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  80. 청구항 78에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 그리고 서열 번호: 23, 또는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  81. 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  82. 청구항 81에 있어서, 이소부티르알데히드로부터 이소부티레이트 탄소 수율은 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 35% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  83. 청구항 81에 있어서, 이소부티르알데히드로부터 이소부티레이트 탄소 수율은 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 75% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  84. 청구항 81에 있어서, 이소부티르알데히드로부터 이소부티레이트 탄소 수율은 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 95% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  85. 청구항 81 내지 84중 어느 한 항에 있어서, 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 상기 효소는 알데히드 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  86. 청구항 85에 있어서, 상기 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 (서열 번호: 25) 또는 이의 동족체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  87. 청구항 86에 있어서, 상기 알데히드 탈수소효소는 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 그리고 서열 번호: 41, 또는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  88. 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은
    (i) 아세토락테이트의 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 그리고
    (ii) 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  89. 청구항 88에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 50% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  90. 청구항 88에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 75% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  91. 청구항 88에 있어서, 아세토락테이트로부터 DH2MB 탄소 수율은 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 대략 95% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  92. 청구항 88 내지 91중 어느 한 항에 있어서, 아세토락테이트의 DH2MB로의 전환을 촉진하는 상기 효소는 3-케토산 환원효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  93. 청구항 92에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226 (서열 번호: 1) 또는 이의 동족체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  94. 청구항 92에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 그리고 서열 번호: 23, 또는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  95. 청구항 88에 있어서, 이소부티르알데히드로부터 이소부티레이트 탄소 수율은 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 35% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  96. 청구항 88에 있어서, 이소부티르알데히드로부터 이소부티레이트 탄소 수율은 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 75% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  97. 청구항 88에 있어서, 이소부티르알데히드로부터 이소부티레이트 탄소 수율은 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 적어도 95% 감소하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  98. 청구항 88 내지 97중 어느 한 항에 있어서, 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 상기 효소는 알데히드 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  99. 청구항 98에 있어서, 상기 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 (서열 번호: 25) 또는 이의 동족체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  100. 청구항 98에 있어서, 상기 알데히드 탈수소효소는 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 그리고 서열 번호: 41, 또는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  101. 청구항 88 내지 100중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC) 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  102. 청구항 88 내지 101중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 (GPD) 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  103. 청구항 88 내지 102중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  104. 청구항 103에 있어서, 상기 재조합 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces) 계통분기의 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  105. 청구항 103에 있어서, 상기 재조합 미생물은 사카로미세스 센수 스트릭토(Saccharomyces sensu stricto) 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  106. 청구항 105에 있어서, 상기 사카로미세스 센수 스트릭토(Saccharomyces sensu stricto) 미생물은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae), 사카로미세스 쿠드리아브제비(S. kudriavzevii), 사카로미세스 미카태(S. mikatae), 사카로미세스 바야누스(S. bayanus), 사카로미세스 우바룸(S. uvarum), 사카로미세스 카로카니스(S. carocanis) 및 이들의 하이브리드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  107. 청구항 103에 있어서, 상기 재조합 미생물은 크랩트리-음성 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  108. 청구항 107에 있어서, 상기 크랩트리-음성 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 아이사첸키아(Issatchenkia) 및 칸디다(Candida)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  109. 청구항 108에 있어서, 상기 크랩트리-음성 효모 미생물은
    사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 피치아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis), 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala), 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 및 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  110. 청구항 103에 있어서, 상기 재조합 미생물은 크랩트리-양성 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  111. 청구항 110에 있어서, 상기 크랩트리-양성 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 데바리오미세스(Debaryomyces), 피치아(Pichia), 칸디다(Candida), 그리고 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  112. 청구항 111에 있어서, 상기 크랩트리-양성 효모 미생물은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 지고사카로미세스 바일리(Zygosaccharomyces bailli), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 그리고 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  113. 청구항 103에 있어서, 상기 재조합 미생물은 WGD (전체 유전체 복제)-이후 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  114. 청구항 113에 있어서, 상기 WGD-이후 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 칸디다(Candida)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  115. 청구항 114에 있어서, 상기 WGD-이후 효모 미생물은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로미세스 카스텔리(Saccharomyces castelli), 그리고 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  116. 청구항 103에 있어서, 상기 재조합 미생물은 WGD (전체 유전체 복제)-이전 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  117. 청구항 116에 있어서, 상기 WGD-이전 효모 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia), 데바리오미세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 아이사첸키아(Issatchenkia), 파키솔렌(Pachysolen), 야로위아(Yarrowia), 그리고 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)로 구성된 군에서 선택되는 속으로 분류되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  118. 청구항 117에 있어서, 상기 WGD-이전 효모 미생물은 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로미세스 왈티(Kluyveromyces waltii), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 피치아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii), 아이싸첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala), 파키솔렌 탄노필리스(Pachysolen tannophilis), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 그리고 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  119. 하기 단계를 포함하는, 이소부탄올을 생산하는 방법:
    (a) 청구항 74 내지 118중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 제공하는 단계;
    (b) 이소부탄올의 회수가능한 양이 생산될 때까지, 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 재조합 미생물을 배양하는 단계; 그리고
    (c) 이소부탄올을 회수하는 단계.
  120. 3-케토산을 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은:
    (a) 상기 3-케토산의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 및/또는
    (b) 3-케토산의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  121. 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은:
    (a) 상기 알데히드 중간물질의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 및/또는
    (b) 알데히드 중간물질의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  122. 3-케토산과 알데히드를 중간물질로서 이용하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은:
    (a) 상기 3-케토산의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 및/또는
    (b) 3-케토산의 3-히드록시산 부산물로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없고; 그리고
    (c) 상기 알데히드 중간물질의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 및/또는
    (d) 알데히드 중간물질의 산성 부산물로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  123. 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은:
    (a) 아세토락테이트의 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)으로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 및/또는
    (b) 아세토락테이트의 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)으로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  124. 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은:
    (a) 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 및/또는
    (b) 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  125. 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은:
    (a) 아세토락테이트의 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)으로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 및/또는
    (b) 아세토락테이트의 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)으로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없고; 그리고
    (c) 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 제거되도록 조작되고; 및/또는
    (d) 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉진하는 효소가 실질적으로 없는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  126. 하기를 포함하는 재조합 미생물:
    (a) 아세토락테이트 신타아제 활성을 갖는 시토졸에 국한된 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자, 그리고 여기서 세포는 피루베이트를 아세토락테이트로 전환시키고; 그리고
    (b) 과다발현된 케톨산 환원이성화효소, 여기서 상기 KARI는 야생형 또는 부모 KARI와 비교하여, 아세토락테이트에 대한 감소된 KM 및/또는 아세토락테이트에 대한 증가된 kcat를 나타내도록 조작된다.
  127. 하기를 포함하는 재조합 미생물:
    (a) 적어도 0.5U/mg 용해물 아세토락테이트 신타아제 활성을 갖는 시토졸에 국한된 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자, 그리고 여기서 세포는 피루베이트를 아세토락테이트로 전환시키고; 그리고
    (b) 과다발현된 케톨산 환원이성화효소 (KARI), 여기서 상기 KARI는 적어도 0.03U/mg 용해물 KARI 활성을 갖는다.
  128. 하기를 포함하는 재조합 미생물:
    (a) 적어도 0.5U/mg 용해물 아세토락테이트 신타아제 활성을 갖는 시토졸에 국한된 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자, 그리고 여기서 세포는 피루베이트를 아세토락테이트로 전환시키고; 그리고
    (b) 과다발현된 디히드록시산 탈수화효소 (DHAD), 여기서 상기 DHAD는 적어도 0.03U/mg 용해물 DHAD 활성을 갖는다.
  129. 하기를 포함하는 재조합 미생물:
    (a) 아세토락테이트 신타아제 활성을 갖는 시토졸에 국한된 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자, 그리고 여기서 세포는 피루베이트를 아세토락테이트로 전환시키고;
    (b) 아세토락테이트의 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)으로의 전환을 촉진하는데 관여하는 하나 또는 그 이상의 내생성 단백질의 활성 또는 발현의 감소 또는 결실; 그리고
    (c) 과다발현된 케톨산 환원이성화효소.
  130. 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)을 아세토락테이트로 전환시킬 수 있는 내생성 또는 이종기원성 단백질을 과다발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  131. 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)을 2,3-디히드록시이소발레레이트 (DHIV)로 전환시킬 수 있는 내생성 또는 이종기원성 단백질을 과다발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  132. 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)의 생산을 위한 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은 아세토락테이트를 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)으로 전환시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 효소를 과다발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  133. 청구항 132에 있어서, 아세토락테이트를 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)으로 전환시킬 수 있는 상기 효소는 3-케토산 환원효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  134. 청구항 133에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226 (서열 번호: 1) 또는 이의 동족체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  135. 청구항 133에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 그리고 서열 번호: 23, 또는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  136. 하기 단계를 포함하는, 2,3-디히드록시-2-메틸부탄산 (DH2MB)의 생산 방법:
    (a) 청구항 132 내지 135중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 제공하는 단계;
    (b) DH2MB의 회수가능한 양이 생산될 때까지, 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 재조합 미생물을 배양하는 단계; 그리고
    (c) DH2MB을 회수하는 단계.
  137. 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트의 생산을 위한 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로 전환시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 효소를 과다발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  138. 청구항 137에 있어서, 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트로 전환시킬 수 있는 상기 효소는 3-케토산 환원효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  139. 청구항 138에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) YMR226 (서열 번호: 1) 또는 이의 동족체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  140. 청구항 138에 있어서, 상기 3-케토산 환원효소는 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 그리고 서열 번호: 23, 또는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  141. 하기 단계를 포함하는, 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트의 생산 방법:
    (a) 청구항 137 내지 140중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 제공하는 단계;
    (b) 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트의 회수가능한 양이 생산될 때까지, 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 재조합 미생물을 배양하는 단계; 그리고
    (c) 2-에틸-2,3-디히드록시부타노에이트를 회수하는 단계.
  142. 산성 산물의 생산을 위한 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은 알데히드를 산성 부산물로 전환시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 효소를 과다발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  143. 청구항 142에 있어서, 알데히드의 산성 산물로의 전환을 촉진하는 상기 효소는 알데히드 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  144. 청구항 143에 있어서, 상기 알데히드 탈수소효소는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) ALD6 (서열 번호: 25) 또는 이의 동족체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  145. 청구항 143에 있어서, 상기 알데히드 탈수소효소는 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 그리고 서열 번호: 41, 또는 이들의 동족체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  146. 하기 단계를 포함하는, 산성 산물의 생산 방법:
    (a) 청구항 142 내지 145중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 제공하는 단계;
    (b) 산성 산물의 회수가능한 양이 생산될 때까지, 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 재조합 미생물을 배양하는 단계; 그리고
    (c) 산성 산물을 회수하는 단계.
  147. 청구항 146에 있어서, 상기 산성 부산물은 이소부티레이트, 부티레이트, 2-메틸-1-부티레이트, 3-메틸-1-부티레이트, 프로피오네이트, 펜타노에이트, 헥사노에이트, 3-메틸-1-펜타노에이트, 4-메틸-1-펜타노에이트, 4-메틸-1-헥사노에이트, 그리고 5-메틸-1-헵타노에이트에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  148. (a) 야생형 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA (서열 번호: 2)의 티로신 50; (b) 야생형 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA의 글루타민 77; (c) 야생형 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA의 발린 108; (d) 야생형 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA의 티로신 113; (e) 야생형 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA의 이소류신 212; 그리고 (f) 야생형 락토코커스 락티스(L. lactis) AdhA의 류신 264로 구성된 군에서 선택되는 아미노산에 상응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 변형을 포함하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  149. 청구항 148에 있어서, 상기 티로신 50 잔기는 페닐알라닌 또는 트립토판 잔기로 대체되는 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  150. 청구항 148에 있어서, 상기 글루타민 77 잔기는 아르기닌 또는 세린 잔기로 대체되는 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  151. 청구항 148에 있어서, 상기 발린 108 잔기는 세린 또는 알라닌 잔기로 대체되는 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  152. 청구항 148에 있어서, 상기 티로신 113 잔기는 페닐알라닌 또는 글리신 잔기로 대체되는 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  153. 청구항 148에 있어서, 상기 이소류신 212 잔기는 트레오닌, 알라닌, 또는 발린 잔기로 대체되는 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  154. 청구항 148에 있어서, 상기 류신 264 잔기는 발린 잔기로 대체되는 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  155. 청구항 148에 있어서, 변형된 ADH의 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환에 대한 촉매 효율은 야생형 ADH와 비교하여 적어도 대략 50% 증강되는 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  156. 청구항 148에 있어서, 변형된 ADH의 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환에 대한 촉매 효율은 야생형 ADH와 비교하여 적어도 대략 100% 증강되는 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  157. 청구항 148에 있어서, 변형된 ADH의 이소부티르알데히드의 이소부탄올로의 전환에 대한 촉매 효율은 야생형 ADH와 비교하여 적어도 대략 200% 증강되는 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  158. 청구항 148에 있어서, ADH는 락토코커스(Lactococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 바실루스(Bacillus), 렙토트리키아(Leptotrichia), 액티노바실루스(Actinobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스트렙토바실루스(Streptobacillus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 아이케넬라(Eikenella), 바이셀라(Weissella), 킹겔라(Kingella), 로티아(Rothia), 그리고 엑시구오박테륨(Exiguobacterium)에서 선택되는 속 (genus)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  159. 청구항 158에 있어서, ADH는 숙주 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화되는 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  160. 청구항 159에 있어서, 상기 숙주 세포는 효모인 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  161. 청구항 159에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH).
  162. 청구항 148 내지 161중 어느 한 항에 따른 변형된 알코올 탈수소효소 (ADH)를 인코딩하는 핵산 구조체로 형질전환된 재조합 미생물.
  163. 청구항 15에 있어서, 상기 재조합 미생물은 아세토락테이트 신타아제 (ALS), 케톨산 환원이성화효소 (KARI), 디히드록시산 탈수화효소 (DHAD), 그리고 2-케토산탈카르복실화효소 (KIVD)에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 이소부탄올 대사 경로 효소를 포함하는 이소부탄올 생산 대사 경로를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  164. 청구항 163에 있어서, 상기 재조합 미생물은 효모 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  165. 하기 단계를 포함하는, 이소부탄올을 생산하는 방법:
    (a) 청구항 148 내지 164중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 제공하는 단계; 그리고
    (b) 이소부탄올의 회수가능한 양이 생산될 때까지, 탄소 공급원을 제공하는 공급원료를 내포하는 배양 배지에서 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계.
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