CN117467651B

CN117467651B - 一种表达芳香族氨基酸降解酶重组多肽和重组细胞及其应用

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Publication number: CN117467651B
Application number: CN202311811167.1A
Authority: CN
Inventors: 王立; 孔繁智; 王文磊; 王斗
Original assignee: Suzhou Youxin Hesheng Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Youxin Hesheng Technology Co ltd
Priority date: 2023-12-27
Filing date: 2023-12-27
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2043-12-27
Also published as: CN117467651A

Abstract

本发明公开了一种表达芳香族氨基酸降解酶重组多肽和重组细胞及其应用，属于生物技术领域。本发明以来源于黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium的芳香族氨基酸降解酶XAL为出发序列，通过突变位点的筛选及验证，发现了一系列能够提高酶活力及稳定性的XAL突变体，将突变体引入基因工程菌中后进行降解活性验证，发现与转化未突变酶的对照菌株相比，本发明构建的重组菌的氨基酸降解活性显著提升。本发明还涉及包含重组XAL多肽或重组细胞及其组合物用于治疗和工业目的的用途。

Description

一种表达芳香族氨基酸降解酶重组多肽和重组细胞及其应用

技术领域

本发明涉及一种表达芳香族氨基酸降解酶重组多肽和重组细胞及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

苯丙氨酸降解酶(PAL)连同组氨酸降解酶(HAL)和酪氨酸降解酶(TAL)一起是芳香族氨基酸降解酶家族(EC 4 .3 .1 .23-1 .25和4 .3 .1 .3)的成员。芳香族氨基酸降解酶（XAL）同时具备苯丙氨酸降解酶(PAL)、组氨酸降解酶(HAL)、酪氨酸降解酶(TAL)的活性，对芳香族氨基酸均有降解活性。

苯丙酮尿症(Phenylketonuria)，简称PKU，是先天性氨基酸代谢障碍中最常见的疾病，也是一种常染色体隐性遗传病，因苯丙氨酸羟化酶基因突变，导致酶活性降低，苯丙氨酸及其代谢产物在体内蓄积导致的疾病。一般在出生后3-6个月开始出现症状，临床表现有智力、运动发育落后、皮肤毛发色素减少、鼠尿臭味等。如果未得到及时治疗，高量的苯丙氨酸累积会引起较为严重的医学问题，例如癫痫发作、智力障碍等。目前，常见治疗苯丙酮尿症的药物大多是化学药物，存在较高的毒副作用、容易产生耐药性等缺点，生物药物中，现阶段治疗PKU的特效药是注射PEG修饰后的重组PAL蛋白（PEG-PAL，聚乙二醇缀合的苯丙氨酸解氨酶），可以将人血浆中的苯丙氨酸浓度降低至较为安全的浓度水平，但PEG-PAL会引起较为严重的免疫反应；不同于PEG-PAL侵入性制剂及治疗方法，国内外也有口服PAL制剂的研究，口服递送的优势是无免疫排斥反应，但是缺点亦较为明显，口服的PAL会被肠胃内的胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等分解。

酪氨酸血症（tyrosinemia）是由于酪氨酸代谢途径中的酶缺陷，引起的血浆中酪氨酸浓度增高，不同步骤的酶的缺陷可导致多种临床表现不同的疾病，如导致脑、肝、肾、骨骼等多脏器损害，预后不良，致死及致残率很高。酪氨酸在人体的来源包括饮食摄入和内源性合成两部分，内源性生成的底物来源为食源性的必需氨基酸酪氨酸。目前针对酪氨酸血症存在唯一一款上市药物--尼替西农（NTBC）。NTBC是4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的竞争性抑制剂，可抑制HT-1患者体内酪氨酸的常规分解代谢，阻止毒性代谢产物在体内蓄积，从而避免肝肾功能损害，提高患者存活率。患者在尼替西农治疗期间必须限制饮食中酪氨酸和酪氨酸摄入量。研究中报告的常见不良反应为血小板减少、白细胞减少和视觉系统病症，包括结膜炎、角膜混浊、角膜炎和畏光。但由于NTBC为4-羟基苯丙酮酸双加氧酶抑制剂，抑制了酪氨酸向4-羟基苯丙酮酸的代谢，故血酪氨酸增高，若血酪氨酸水平超过 500 μmol /L，需要控制蛋白质摄入，给予不含酪氨酸、酪氨酸配方营养粉饮食治疗，否则会由于血酪氨酸水平过高导致角膜损伤。酪氨酸血症的治疗方法还包括肝移植及基因治疗。肝移植治疗已有20多年历史，可显著改善患者的肝脏、肾脏及神经系统症状。近几年随着NTBC的应用需要肝移植者逐渐减少。另外，肝移植术后仍需终生进行免疫抑制治疗，且此方法受手术条件及供体数量少的限制，临床上应用存在困难，故只有当患儿肝功能严重衰竭，且对尼替西农治疗无效或由于其他原因得不到尼替西农治疗及肝组织有发生恶变的依据时，选择肝移植治疗。至于基因治疗目前仍处于动物研究阶段。

基于苯丙酮尿症和酪氨酸血症治疗药物的缺乏，提出本发明。然而，苯丙酮尿症和酪氨酸血症作为基因缺陷病，目前没有特效药能够根治，现有的治疗方式都是通过限制饮食或特殊饮食的方式来减少苯丙氨酸或酪氨酸的摄入，从而减轻病症。但特殊饮食或限制饮食因为食物索然无味，会对患者的营养健康造成较大影响，因此如何找到能让患者在正常饮食的条件下摄入较低量的苯丙氨酸或酪氨酸的方式变得尤为重要。所以，若想从食源性代谢的角度对以上疾病进行治疗，首要解决的问题是如何在减少药物用量的前提下提高XAL蛋白的催化活性及稳定性等，因此天然PAL的定向改造尤为重要。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过对来源于黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的芳香族氨基酸降解酶进行突变，得到其突变体，从而提高了此酶的催化活力、酶稳定性、热稳定性、酸耐受性等，同时提高了其在成药方面的性能，具有重要的经济价值和社会意义。

本发明提供了重组XAL多肽及其突变体、生物活性片段和类似物，以及表达所述重组XAL多肽及其突变体、生物活性片段和类似物重组细胞的药物组合。

本发明提供了编码所述重组芳香族氨基酸降解酶多肽的多核苷酸、重组多肽和/或其组合物、表达重组芳香族氨基酸降解酶多肽的重组细胞和/或其组合物。在一些实施方案中，将重组XAL多肽优化以提供增强的催化活性、以及减少的对蛋白水解的敏感性和增加的对在升高的温度储存的耐受性。本发明还提供了用于使用包含表达重组XAL重组细胞和/或其组合物用于治疗的用途。

现有降低血液中的苯丙氨酸的一种方法是注射重组PAL和通过聚乙二醇化修饰的PAL变体(PEG-PAL)。可用于PEG-PAL组合物的PAL变体包括野生型点状念珠藻(Nostoc punctiforme)(NpPAL)、多变鱼腥藻(AvPAL)和圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)(RtPAL)的变体。关于降低血液中酪氨酸的方法，无相关报道。

口服酶制剂的关键优势是酶对免疫系统的暴露减少，从而使注射后观察到的免疫应答最小化。但是，对于口服制剂的主要限制是酶活性在胃和肠腔中的损失。为了有效并起作用，这些酶必须耐受酸性pH和蛋白酶的降解。在一些先前的研究中，部分由于蛋白酶的酶降解，且部分酶在pH7 .0比活性相对较低。

尽管口服酶制剂的多种制剂取得了一些进展，对具有改进的特性的用于口服酶制剂仍存在需求。这些改进的特性包括但不限于较长的半衰期、增加的催化活性、改进的对消化道中的条件以及存储条件的稳定性和减少的聚集。此外，大量酶的使用不仅不利于制剂，而且提高了生产及患者购买成本，因此提高酶的活性及耐受性尤为重要。另外，主流观点认为利用益生菌细胞作为底盘构建重组细胞，相较异源表达重组蛋白的方法更有利于治疗。

芳香族氨基酸降解酶（XAL）还可以被用作酪氨酸代谢紊乱诸如I型酪氨酸血症、II型酪氨酸血症、III型酪氨酸血症和尿黑酸症的治疗，这些都是常染色体代谢遗传紊乱，其中参与酪氨酸降解的酶中的一种由于相应基因中的突变而部分起作用或不起作用。这种基因的缺失导致血液中酪氨酸和其他酪氨酸代谢物水平升高。因为酪氨酸衍生自苯丙氨酸，所以限制苯丙氨酸和酪氨酸摄入对具有酪氨酸代谢紊乱的患者是有益的。

①重组XAL多肽：

本发明的重组XAL多肽源自黄孢原毛平革菌。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.4具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.4具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并具有与SEQ ID NO.4相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：48、210、374、384、394、522、526、585、586、601。在一些实施方案中，氨基酸取代选自F48V、I210F、D374A、F384S、S394G、A522V、I526S、I585L、L586P、D601G中至少一个或其多个组合，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO.4来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.6具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.6具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并具有与SEQ ID NO.6相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：62、93、250、359、370、409、468、624、690、708。在一些实施方案中，氨基酸取代选自K62N、E93D、S250N、E370V、N409T、L468I、D624Y、G690S、I708F中至少一个或其多个组合，其中氨基酸位置相对于SEQID NO.6来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.8具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.8具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并具有与SEQ ID NO.8相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：147、382、383、433、582、678。在一些实施方案中，氨基酸取代选自G147D、A382T、Q383K、A433T、L582P、E678D中至少一个或其多个组合，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO.8来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.10具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.10具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并具有与SEQ ID NO.10相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：127、167、170、199、204、400、488。在一些实施方案中，氨基酸取代选自D127A、A167T、S170C、I199L、E204G、T400P、A488S中至少一个或其多个组合，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO.10来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.12具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并具有与SEQ ID NO.12相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：67、202、413、571、573、590。在一些实施方案中，氨基酸取代选自D67H、M202L、D413E、H571Y、P573S、I590F中至少一个或其多个组合，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO.12来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.14具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.14具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并具有与SEQ ID NO.14相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：5、141、170、183、417、482、500、524。在一些实施方案中，氨基酸取代选自I5M、L141M、S170Y、R183P、G417S、V482A、V500F、Y524H中至少一个或其多个组合，其中氨基酸位置相对于SEQ IDNO.14来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.16具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.16具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并具有与SEQ ID NO.16相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：476、180、213、322、341、356、722、727。在一些实施方案中，氨基酸取代选自N476T、I180S、L213R、G322S、V341L、V356E、G722A、V727F中至少一个或其多个组合，其中氨基酸位置相对于SEQID NO.16来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.18具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.18具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并具有与SEQ ID NO.18相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：91、122、207、225、476、537、677、684、731。在一些实施方案中，氨基酸取代选自N91S、F122I、R207S、D225H、N476K、A537V、Y677D、L684M、L731V中至少一个或其多个组合，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO.18来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.20具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.20具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并具有与SEQ ID NO.20相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：81、241、297、480、481、707、729。在一些实施方案中，氨基酸取代选自R81H、A241S、N297K、K480E、G481D、I707V、M729I中至少一个或其多个组合，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO.20来编号。

在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.22具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性。在一些实施方案中，氨基酸差异为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置。在一些实施方案中，表现出至少一种改进的特性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.22具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并具有与SEQ ID NO.22相比的至少一个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：61、184、203、331、388、585、629。在一些实施方案中，氨基酸取代选自G61R、M184I、G203C、T331P、Q388H、I585T、S629C中至少一个或其多个组合，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO.22来编号。

②降低对蛋白水解敏感性的突变体：

在一些实施方案中，本发明的重组XAL多肽具有相应的酶活性、表现出减少的对蛋白水解的敏感性、并且包含：a)与参考序列SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和b)与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22相比在一个或更多个氨基酸位置处的氨基酸残基差异。

在一些实施方案中，表现出减少的对蛋白水解的敏感性的重组XAL多肽与SEQ IDNO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22相比在一个或更多个氨基酸位置(与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。

在一些实施方案中，在基本相同的条件下，重组XAL多肽的蛋白水解敏感性与野生型XAL(例如，具有SEQ ID NO.2的PcXAL)或参考XAL多肽的蛋白水解敏感性相比减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、或至少90％。蛋白水解活性可以使用本领域已知的任何合适的方法、包括但不限于实施例中描述的方法来测量。

在一些实施方案中，当将参考XAL和具有减少的敏感性的重组XAL两者进行比较、并在基本相同的条件下暴露于基本相同的量的蛋白酶时，重组XAL多肽对一种或多种蛋白酶的组合物具有减少的敏感性，所述蛋白酶包括但不限于胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A/B、肽酶等。

③提高蛋白热稳定性的突变体：

在一些实施方案中，本发明的重组XAL多肽具有相应的酶活性、表现出提高蛋白热稳定性、并且包含：a)与参考序列SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和b)与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22相比在一个或更多个氨基酸位置处的氨基酸残基差异。

在一些实施方案中，表现出提高蛋白热稳定性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22相比在一个或更多个氨基酸位置(与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。

一些实施方案中，在基本相同的条件下，重组XAL多肽的提高蛋白热稳定性与野生型XAL(例如，具有SEQ ID NO.2的PcXAL)或参考XAL多肽的蛋白热稳定性在27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃温度下耐受性增加。提高蛋白热稳定性可以使用本领域已知的任何合适的方法、包括但不限于实施例中描述的方法来测量。在一些实施方案中，任何合适的测定可用于本发明，包括但不限于本文提供的。

④提高酸耐受性的突变体：

在一些实施方案中，本发明的重组XAL多肽具有相应的酶活性、表现出提高酸耐受性、并且包含：a)与参考序列SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和b)与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22相比在一个或更多个氨基酸位置处的氨基酸残基差异。

在一些实施方案中，表现表现出提高酸耐受性的重组XAL多肽与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，并具有与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22相比在一个或更多个氨基酸位置(与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同源性，并在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。

一些实施方案中，在基本相同的条件下，重组XAL多肽的提高酸耐受性与野生型XAL(例如，具有SEQ ID NO.2的PcXAL)或参考XAL多肽的酸耐受性在pH1.5、pH2、pH2.5、pH3、pH3.5、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8下耐受性增加。提高耐受性下可以使用本领域已知的任何合适的方法、包括但不限于实施例中描述的方法来测量。在一些实施方案中，任何合适的测定可用于本发明，包括但不限于本文提供的。

⑤编码重组多肽的多核苷酸、表达载体、宿主细胞：

在一些实施方案中，多核苷酸被连接至一个或更多个异源调控序列，以创建能够表达重组多肽的重组多核苷酸。在一些实施方案中，将包含编码重组XAL多肽的至少一种异源表达构建体引入到相应的宿主细胞中，来表达对应的XAL多肽。

在一些实施方案中，根据宿主细胞对编码XAL多肽的多聚核苷酸序列进行相应的密码子优化。细菌中使用的优选的密码子通常用于在细菌中表达。因此，编码重组XAL多肽的密码子优化的多核苷酸在全长编码区中的约45％、55％、65％、75％、85％或大于95％的密码子位置处包含优选的密码子。

在一些实施方案中，编码重组XAL多肽的多核苷酸包含选自SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21的多核苷酸序列。在一些实施方案中，编码重组XAL多肽的多核苷酸与SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21具有至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％核苷酸残基同源性。

在一些实施方案中，将编码本文的任何重组XAL多核苷酸以多种方式操作，以促进XAL多肽的表达。在一些实施方案中，编码XAL多肽的多核苷酸包括表达载体，其中存在一种或更多种控制序列来调控XAL多核苷酸和/或多肽的表达。取决于利用的表达载体，在将分离的多核苷酸插入载体前对分离的多核苷酸的操作可以是期望的或必要的。用于利用重组DNA方法修改多核苷酸和核酸序列的技术是本领域熟知的。

在一些实施方案中，控制序列包括启动子、多腺苷酸化序列、前导肽序列、信号肽序列和转录终止子，以及其他。

在一些实施方案中，基于宿主细胞来选择合适的启动子及前导肽序列。对于细菌宿主细胞，用于指导本公开内容合适的启动子包括但不限于从以下获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因 (amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM) 、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、及原核生物β-内酰胺酶基因、以及tac启动子。用于丝状真菌宿主细胞的示例性启动子包括但不限于从以下的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定型α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶启动子、及其突变启动子、截短启动子和杂合启动子。

在一些实施方案中，终止子序列被可操作地连接至编码XAL多肽的核酸序列的3 '末端，在所选择的宿主细胞中有功能的任何合适的终止子可用于本发明。

在一些实施方案中，前导序列可操作地连接至编码XAL多肽的核酸序列

的5 '末端，在所选择的宿主细胞中有功能的任何合适的前导序列可用于本发明。

在一些实施方案中，核酸序列的编码序列的5 '末端固有地包含信号肽编码区，所述信号肽编码区与编码分泌多肽的编码区的区段在翻译阅读框中天然连接。

在一些实施方案中，控制序列还是编码定位于多肽的氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。产生的多肽被称为“前多肽(propolypeptide)”。前导肽可以通过催化或自体催化前肽从前多肽的裂解被转化为成熟活性多肽。前肽编码区可以从任何合适的来源获得，包括但不限于以下的基因：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子。

在一些实施方案中，还利用了调控序列，这些序列促进相对于宿主细胞的生长调控多肽的表达。调控系统能引起基因表达响应于化学或物理刺激而开启或关闭的调控系统。在原核宿主细胞中，合适的调控序列包括但不限于lac、tac和trp操纵子系统。

在一些实施方案中，本发明涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含诸如启动子、终止子、复制起始位点、前导肽、编码重组XAL多肽的多核苷酸，以及取决于它们将被引入的宿主的类型，一个或更多个表达调控区。在一些实施方案中，将各种核酸和控制序列连接在一起组成重组表达载体，所述重组表达载体包括一个或更多个限制性酶切位点，以便这些位点插入或取代编码XAL多肽的核酸序列。

在一些实施方案中，重组表达载体可以是任何合适的载体，如质粒或病毒（载体可以是线性质粒或闭合的环状质粒），重组载体的选择通常取决于载体与待转入该载体的宿主细胞的相容性。

在一些实施方案中，表达载体是自主复制载体，其复制独立于染色体复制，诸如质粒、微型染色体、人工染色体。在一些实施方案中，利用了单个或更多个载体或质粒。

在一些实施方案中，具有本文公开的重组XAL多肽可以通过使编码天然存在的或重组的XAL多肽的多核苷酸经受任何合适的诱变和/或本领域中已知的和/或如本文描述的定向进化的方法来获得。在一些实施方案中，定向进化过程包括诱变PCR、盒式诱变、交错延伸过程、体外重组以及其他方式，以产生可以被表达、筛选和测定的变体文库，任何合适的诱变和定向演化方法可用于本发明，并且是本领域熟知的。

诱变和定向进化方法可以容易地应用于编码XAL的多核苷酸，用于产生可以被表达、筛选和测定的变体文库，任何合适的诱变和定向演化方法可用于本发明，并且是本领域熟知的。

在一些实施方案中，诱变处理后获得的突变体，通过经受指定测定条件，测定热处理、酸处理、其他合适的测定条件之后剩余的酶活性的量进行筛选。然后将包含编码XAL多肽的多核苷酸的克隆进行测序，并用于重组多肽表达。测定突变文库酶可以使用本领域已知的任何合适的方法，例如HPLC进行分析。

在一些实施方案中，使用的蛋白纯化方法是熟知技术中的任何一种或更多种，将宿主细胞中表达的重组XAL多肽从任一种从细胞和/或培养基回收，所述用于蛋白纯化的熟知技术包括超声处理、过滤、盐析、超离心和色谱法以及其他方法。

在一些实施方案中，重组XAL多肽通过包括以下的方法在宿主细胞中产生：将包含编码本文描述的重组XAL多肽的多核苷酸序列的宿主细胞在有利于重组XAL多肽产生的培养基及培养环境下进行培养，并从细胞和/或培养基回收重组XAL多肽。

在一些实施方案中，本发明提供了产生重组XAL多肽的方法，所述方法包括在适宜的培养条件下培养包含编码重组XAL多肽的多核苷酸序列的重组细胞，以产生重组XAL多肽，并任选地从培养物和/或培养的细菌细胞回收重组XAL多肽，所述重组XAL多肽具有与参考序列SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，以及与如本文提供的SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22相比的一个或更多个氨基酸残基差异。在一些实施方案中，宿主细胞产生多于一种重组XAL多肽。

在一些实施方案中，将重组XAL多肽从重组宿主细胞和/或培养基回收后，将它们通过本领域已知的任何合适的方法进一步纯化。在一些另外的实施方案中，将纯化的XAL多肽与其他成分组合，来提供适当时用于不同应用和用途的包含重组XAL多肽的组合物和制剂，例如药物组合物。

在一些实施方案中，包含本发明的重组XAL多肽的组合物包括一种或更多种常用的载体化合物，包括但不限于糖、淀粉、纤维素、树胶和/或蛋白。口服制剂中的另外的组分可以包括着色剂和或甜味剂及润滑剂，以及肠溶包衣。在一些实施方案中，包括了崩解剂或增溶剂。在一些实施方案中，特别是在液体制剂中，将重组XAL多肽与多种另外的组分配比，所述另外的组分包括但不限于防腐剂、增稠剂、湿润剂、醇类、悬浮剂、脂肪酸和/或乳化剂。

在一些实施方案中，XAL重组蛋白可用作用于治疗苯丙酮尿症、I型酪氨酸血症、II型酪氨酸血症、III型酪氨酸血症和尿黑酸症的治疗蛋白。如果苯丙氨酸、酪氨酸代谢紊乱的患者未被及早治疗，高水平的苯丙氨酸、酪氨酸及其分解产物中的一些可以导致显著的医学问题，所述医学问题包括肝衰竭和肾衰竭、肝癌、智力障碍以及甚至死亡。

在一些实施方案中，本发明提供了重组XAL多肽，所述重组XAL多肽适于在降低苯丙酮尿症、酪氨酸血症和尿黑酸症患者的血液、脑脊液等中的苯丙氨酸和酪氨酸浓度。向具有高血液苯丙氨酸、酪氨酸水平的患者施用的重组XAL多肽的剂量取决于患者的基因型、患者情况，及本领域技术人员已知的其他因素。在一些实施方案中，意图将组合物向苯丙酮尿症、酪氨酸血症、尿黑酸症患者单次或重复施用。

在一些实施方案中，重组XAL多肽在向患者施用的组合物中的浓度足以有效治疗、改善和/或预防疾病的症状(例如，I型、II型或III型酪氨酸血症或尿黑酸症、疾病和/或症状)。在一些实施方案中，将重组XAL多肽与尼替西农或其他药物组合物和/或膳食组合物组合向苯丙酮尿症、酪氨酸血症、尿黑酸症患者施用。

具体地：

一种具有芳香族氨基酸降解酶（XAL）活性的重组多肽，所述重组多肽包含：a) 氨基酸序列，所述氨基酸序列具有与参考序列 SEQ ID NO.2 或其功能片段至少85％的序列同源性；b) 多肽序列，所述多肽序列包含与 SEQ ID NO.2 或其功能片段相比在一个或更多个氨基酸位置处的至少一个氨基酸残基差异；并且 c) 所述重组多肽与所述参考序列SEQ ID NO.2相比表现出选自以下的改进的特性：i) 增强的催化活性、ii) 降低的对蛋白水解的敏感性、iii) 增加的对酸性 pH 的耐受性、或 i)、ii)、iii) 的任何组合。

进一步地，其中所述一个或更多个氨基酸位置选自5、48、61、62、67、81、91、93、122、127、141、147、167、170、180、183、184、199、202、203、204、207、210、213、225、241、250、297、322、331、341、356、359、370、374、382、383、384、388、394、400、409、413、417、433、468、476、480、481、482、488、500、522、524、526、537、571、573、582、585、586、590、601、624、629、677、678、684、690、707、708、722、727、729、731和/或其任何组合，其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO.2 来编号。

进一步地，当与 SEQ ID NO.2的多肽最佳比对时，与 SEQ ID NO.2相比的所述氨基酸残基差异选自以下置换中的一个或更多个：I5M、F48V、G61R、K62N、D67H、R81H、N91S、E93D、F122I、D127A、L141M、G147D、A167T、S170C、S170Y、I180S、R183P、M184I、I199L、M202L、G203C、E204G、R207S、I210F、L213R、D225H、A241S、S250N、N297K、G322S、T331P、V341L、V356E、E359V、E370V、D374A、A382T、Q383K、F384S、Q388H、S394G、T400P、N409T、D413E、G417S、A433T、L468I、N476T、N476K、K480E、G481D、V482A、A488S、V500F、A522V、Y524H、I526S、A537V、H571Y、P573S、L582P、I585L、I585T、L586P、I590F、D601G、D624Y、S629C、Y677D、E678D、L684M、G690S、I707V、I708F、G722A、V727F、M729I、L731V。

进一步地，所述重组多肽具有与 SEQ ID NO.2至少85％的序列同一性；和在位置I5或F48、G61、K62、D67、R81、N91、E93、F122、D127、L141、G147、A167、S170、I180、R183、M184、I199、M202、G203、E204、R207、I210、L213、D225、A241、S250、N297、G322、T331、V341、V356、E359、E370、D374、A382、Q383、F384、Q388、S394、T400、N409、D413、G417、A433、L468、N476、K480、G481、V482、A488、V500、A522、Y524、I526、A537、H571、P573、L582、I585、L586、I590、D601、D624、S629、Y677、E678、L684、G690、I707、I708、G722、V727、M729、L731处的氨基酸残基差异。

进一步地，所述氨基酸残基差异为I5M或F48V、G61R、K62N、D67H、R81H、N91S、E93D、F122I、D127A、L141M、G147D、A167T、S170C、S170Y、I180S、R183P、M184I、I199L、M202L、G203C、E204G、R207S、I210F、L213R、D225H、A241S、S250N、N297K、G322S、T331P、V341L、V356E、E359V、E370V、D374A、A382T、Q383K、F384S、Q388H、S394G、T400P、N409T、D413E、G417S、A433T、L468I、N476T、N476K、K480E、G481D、V482A、A488S、V500F、A522V、Y524H、I526S、A537V、H571Y、P573S、L582P、I585L、I585T、L586P、I590F、D601G、D624Y、S629C、Y677D、E678D、L684M、G690S、I707V、I708F、G722A、V727F、M729I、L731V。

进一步地，所述改进的特性选自提升对苯丙氨酸和/或酪氨酸的降解能力。

进一步地，所述参考序列是源自黄孢原毛平革菌（Phanerochaetechrysosporium）的野生型PcXAL。

进一步地，所述重组多肽包含具有与SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或其功能片段至少约 90％的序列同一性的氨基酸序列。

进一步地，所述重组多肽其氨基酸序列的N端融合表达了蛋白标签。

进一步地，所述蛋白标签选自6*His标签、HA标签、MBP标签、SUMO标签、Myc标签、GST标签、Flag标签或GroE标签等。优选地，其核苷酸序列经过序列优化。

一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码至少一种如前所述的重组多肽。

进一步地，所述序列被可操作地连接到控制序列。

进一步地，所述多核苷酸是密码子优化的。

一种表达载体，所述表达载体包含至少一种上述的多核苷酸序列，优选地，和至少一种控制序列。

进一步地，所述控制序列是启动子、终止子、前导肽等。

进一步地，所述启动子是异源启动子。

一种重组细胞，所述重组细胞载有至少一种上述的多核苷酸序列，和/或上述载体。

进一步地，重组细胞的宿主细胞包括但不限于真菌细胞、藻类细胞、昆虫细胞和植物细胞。合适的真菌宿主细胞包括但不限于子囊菌门、担子菌门、半知菌亚门、接合菌门、不完全菌。

进一步地，重组细胞是酵母细胞，包括但不限于假丝酵母属、酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属物种的细胞。在本发明的一些实施方案中，酵母细胞是多形汉逊酵母、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母、糖化酵母、克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、树干毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、白念珠菌、解脂耶氏酵母。

进一步地，重组细胞为原核细胞。合适的原核细胞包括但不限于革兰氏阳性、革兰氏阴性、革兰氏可变细菌。任何合适的细菌生物体可用于本发明，包括但不限于土壤杆菌属、脂环酸芽胞杆菌属、鱼腥藻属、组囊藻属、不动杆菌属、嗜酸栖热菌属、节杆菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌属、短杆菌属、丁酸弧菌属、布赫纳氏菌属、弯曲杆菌属、梭菌属、棒状杆菌属、着色菌属、粪球菌属、埃希氏菌属、肠球菌属、肠杆菌属、梭形杆菌属、粪杆菌属、弗朗西丝菌属、黄杆菌属、地芽孢杆菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属、泥杆菌属、微球菌属、微杆菌属、中生根瘤菌、甲基杆菌属、甲基杆菌属、分枝杆菌属、奈瑟菌属、泛菌属、假单胞菌属、原绿球藻属、红细菌属、红假单胞菌属、红假单胞菌属、罗氏菌属、红球菌属、栅列藻属、链霉菌属、链球菌属、糖单孢菌属、葡萄球菌属、沙雷菌属、沙门菌属、志贺菌属、嗜热厌氧杆菌属、嗜热聚球藻、热球菌属、黄单胞菌属、耶尔森菌属、发酵单胞菌属。

进一步地，重组细胞是：土壤杆菌属、不动杆菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌属、布赫纳氏菌属、地芽孢杆菌属、弯曲杆菌属、梭菌属、棒状杆菌属、埃希氏菌属、肠球菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、泛菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、沙门菌属、链球菌属、链霉菌属或发酵单胞菌属。

进一步地，重组细胞对人类是非致病性或工业生产菌株，并且适用于本发明。在本发明的一些实施方案中，细菌宿主细胞是土壤杆菌属物种，如：放射形土壤杆菌、发根土壤杆菌、悬钩子土壤杆菌。

进一步地，重组细胞是芽孢杆菌属物种，如：苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌)、灿烂芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌。

进一步地，重组细胞是梭菌属物种，如：破伤风梭菌、象牙海岸梭菌、产气荚膜梭菌、拜氏梭菌。

进一步地，重组细胞是链霉菌属物种，如：生二素链霉菌、不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、生金色链霉菌、金色链霉菌、杀真菌素链霉菌、灰色链霉菌、变铅青链霉菌。

进一步地，重组细胞为埃希氏菌属物种，例如大肠杆菌等。

优选地，所述宿主细胞可以为任何益生菌。

生产上述突变体的一种方法，包括以下步骤：以含有野生型编码基因的质粒为模版，通过定点突变将野生型的基因进行突变，获得含有突变体编码基因的质粒，将该质粒转入宿主细胞中，培养重组细胞得到突变体。

当然，本领域技术人员可以想到，本发明也提供了一种提高芳香族氨基酸降解酶活性或稳定性的方法，以SEQ ID NO.2或其对应的核苷酸序列为出发序列，对5、48、61、62、67、81、91、93、122、127、141、147、167、170、180、183、184、199、202、203、204、207、210、213、225、241、250、297、322、331、341、356、359、370、374、382、383、384、388、394、400、409、413、417、433、468、476、480、481、482、488、500、522、524、526、537、571、573、582、585、586、590、601、624、629、677、678、684、690、707、708、722、727、729、731中任一位点或其组合进行突变。

进一步地，所述活性为氨基酸降解活性，优选地，氨基酸为苯丙氨酸和/或酪氨酸。

进一步地，所述稳定性为以下一种或其组合：酶稳定性（尤其是对肠胃中含有的酶）、热稳定性、耐酸稳定性。

上述重组多肽和/或其组合物，重组多肽编码基因和/或其组合物，含有重组多肽的重组载体和/或其组合物，重组细胞和/或其组合物用于治疗苯丙酮尿症和/或酪氨酸血症。

进一步地，适用于治疗血液升高的苯丙氨酸和/或酪氨酸。

进一步地，以上述物质制备而成的药物适于口服施用。

进一步地，所述药物可呈片剂、胶囊剂、口服液体制剂、颗粒剂和微丸的形式。

进一步地，所述片剂、胶囊剂还应包含肠溶包衣。

进一步地，上述药物可单独使用或与另外具有治疗效果的化合物共施用。

一种药物组合物，所述组合物包含至少一种上述具有治疗效果的成分。

进一步地，在向受试者提供所述组合物后，所述受试者的血液中的苯丙氨酸和/或酪氨酸浓度减少。

进一步地，施用药物组合物后，苯丙酮尿症和/或高酪氨酸血症的症状改善。

进一步地，所述受试者能够食用比未被提供至少一种药物和/或其组合物的受试者需要的膳食更少限制其苯丙氨酸、酪氨酸含量的膳食，所述药物组合物包含至少一种重组多肽成分，和/或重组细胞成分。

本发明的有益效果：

本发明提供了重组芳香族氨基酸降解酶多肽，该重组多肽相对于改造前具有酶活提升、热稳定性提升、酶稳定性提升、酸耐受性提高等多重效果，不仅显著提高氨基酸降解效果，且增加了储存和应用的稳定性，基于该特性，该重组多肽或其组合物在苯丙酮尿症或酪氨酸血症治疗中效果得以提升。

附图说明

图1为不同细胞灌胃后模型小鼠血液苯丙氨酸水平检测结果；其中，A为单次给药结果，B为连续给药结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明涉及的方案如下：

本发明提供了包含至少一种取代或取代集合的重组多肽，所述取代或取代集合位于选自以下的一个或更多个氨基酸位置：5、48、61、62、67、81、91、93、122、127、141、147、167、170、180、183、184、199、202、203、204、207、210、213、225、241、250、297、322、331、341、356、359、370、374、382、383、384、388、394、400、409、413、417、433、468、476、480、481、482、488、500、522、524、526、537、571、573、582、585、586、590、601、624、629、677、678、684、690、707、708、722、727、729、731，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO.2。

一些实施方案中，重组多肽是来源于黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的芳香族氨基酸降解酶突变体。在一些另外的实施方案中，本发明的重组多肽比野生型多肽PcXAL具有更强的芳香族氨基酸降解活性。在一些另外的实施方案中，本发明的重组多肽比野生型多肽PcXAL更具有热稳定性。在一些另外的实施方案中，重组多肽比野生型多肽PcXAL更耐受蛋白水解。在又一些另外的实施方案中，重组多肽比野生型多肽PcXAL通过至少一种消化道酶的蛋白水解具有耐受性。在外的一些实施方案中，重组多肽比野生型多肽PcXAL更具有酸稳定性。

本发明还提供了编码本文提供的至少一种重组多肽的重组多核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸编码本文提供的至少一种重组多肽。在一些另外的实施方案中，重组多核苷酸编码本文提供的至少一种重组苯丙氨酸氨裂合酶多肽。在一些另外的实施方案中，重组多核苷酸序列是密码子优化的。

本发明提供了至少一种蛋白标签。在一些实施例方案中，重组芳香族氨基酸裂解酶携带任一种蛋白标签。在一些实施例方案中，重组芳香族氨基酸裂解酶的N端融合表达了蛋白标签。在一些实施例方案中，蛋白标签是SUMO、GST、GroE。在另一些实施例方案中，蛋白标签的添加可以提高蛋白的表达量及活性。

本发明还提供了包含本文提供的至少一种重组多核苷酸序列的表达载体。在一些实施方案中，表达载体携带本文提供的重组多核苷酸序列。在一些另外的实施方案中，表达载体还包含至少一种控制序列。在一些另外的实施方案中，控制序列包含启动子。在一些实施方案中，启动子是异源性启动子。

本发明还提供了用本文提供的至少一种多核苷酸序列转化的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是用本文提供的多核苷酸序列转化的。

在一些实施方案中，药剂形式可以是丸剂、片剂、胶囊、囊形片、液体或乳剂。在一些实施方案中，丸剂、片剂、胶囊或囊形片还包含肠溶包衣。在一些实施方案中，组合物适于口服和/或注射施用。在又一些另外的实施方案中，组合物可单独施用，和/或与其他治疗有效的化合物共施用。

本发明还提供了本文提供的组合物中的任一种的用途，组合物包含至少一种重组多肽和/或重组细胞。在一些实施方案中，本文提供了单独或以任何组合的任何组合物。不意图将本发明受限于任何特定用途。

下述实施例所使用的方法：

（1）重组芳香族氨基酸降解酶突变体构建

具有本文公开的特性的重组XAL多肽可以通过使编码天然存在的或重组的XAL多肽的多核苷酸经受任何合适的诱变和/或本领域中已知的和/或如本文描述的定向进化的方法来获得。示例性定向演化技术为诱变和/或DNA改组。亦可以使用的其他定向演化程序包括诱变PCR、盒式诱变、交错延伸过程、体外重组以及其他方式。诱变和定向演化方法可以容易地应用于编码XAL的多核苷酸，以产生可以被表达、筛选和测定的变体文库，任何合适的诱变和定向演化方法可用于本发明，并且是本领域熟知的。

（2）氨基酸检测方法

酪氨酸检测方法：酪氨酸作为反应底物，通过检测酪氨酸在反应体系中的降低情况，建立并优化了液相色谱检测方法，检测采用岛津高效液相色谱LC-2050C，检测条件参数如下：

色谱柱：SHIMADZU C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；

流动相：1%乙酸和乙腈；

柱温：40 ℃；

流速：0.8 mL/分钟

梯度洗脱：

0-8分钟，1.5%乙酸—乙腈(95: 5)渐变至1.5%乙酸—乙腈(0: 100)；

8-13分钟，保持1.5%乙酸—乙腈(0: 100)

13-14分钟， 1.5%乙酸—乙腈(0: 100)渐变至1.5%乙酸—乙腈(95: 5)；

14-23分钟，保持1.5%乙酸—乙腈(95: 5)

检测：紫外，波长280 nm

进样量：10µL

苯丙氨酸检测方法：苯丙氨酸作为反应的底物，通过检测苯丙氨酸在反应体系中的降低情况，建立并优化了液相色谱检测方法，该法能实现对苯丙氨酸和肉桂酸的同步检测，检测采用岛津高效液相色谱LC-2050C，检测条件参数如下：

色谱柱：Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；

流动相：1%乙酸和乙腈；

柱温：40 ℃；

流速：0.8 mL/分钟；

梯度洗脱：

0-8分钟，1%乙酸—乙腈(95: 5)渐变至1.5%乙酸—乙腈(0: 100)；

8-13分钟，保持1%乙酸—乙腈(0: 100)；

13-14分钟， 1%乙酸—乙腈(0: 100)渐变至1.5%乙酸—乙腈(95: 5)；

14-23分钟，保持1%乙酸—乙腈(95: 5)。

检测：紫外，波长260 nm；

进样量：10µL。

（3）下述实施例所涉及的材料如下：

SOC培养基：2% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、0.05% NaCl 、2.5 mM KCl、10 mMMgCl₂、10mM MgSO₄、20 mM D-葡萄糖，调节至pH7.5。

人工肠液、人工胃液均购自南京源之信生物技术有限公司。

实施例1 PcXAL基因的获得及突变文库的构建

全基因合成用于肠杆菌表达密码子优化后的黄孢原毛平革菌芳香族氨基酸降解酶（PcXAL）基因序列（SEQ ID NO.1），并克隆到大肠杆菌表达载体pGEX4T中以提供pGEX4T-PcXAL，并将质粒转化到的大肠杆菌EcN1917菌株中。使用本领域技术人员通常已知的定向进化技术从这个质粒构建体产生基因变体文库。

实施例2 重组多肽高通量培养

将转化后的大肠杆菌细胞涂布在SOC筛选平板上来进行培养。在37℃过夜培养后，挑去菌落于96孔深孔板中培养，所述深孔板孔洞中装有500μl SOC液体筛选培养基。于200rpm、30℃ 摇床中培养2-3小时，然后将细胞用40μL无菌水中的10mM IPTG诱导，并在200rpm、30℃ 摇床中过夜培养（12-15小时）。次日，4000rpm、20min收集菌体，将上清液弃去，并在分析之前将细胞在-80℃冷冻。

实施例3 全细胞的破碎及重组多肽的纯化

将一定体积的裂解缓冲液添加到细胞沉淀物中，颠倒混匀后室温孵育1-2小时后，4000rpm、20min离心取上清，并通过SDS-PAGE的分析显示条带大小是否正确，并使用FPLC进行蛋白纯化。在一些实施方案中，较大量的菌体使用超声破碎等破碎手段，在此不做一一列举。

实施例4 表达重组多肽的重组细胞全菌体活性检测

工程化多肽活性通过测量反式肉桂酸（苯丙氨酸产物）、对香豆酸（酪氨酸产物）的形成来确定，将表达重组多肽的重组细胞（1*10¹⁰CFU）与含有50mM苯丙氨酸/酪氨酸PBS（PH7.0）溶液震荡混匀（反应体积为2mL），孵育一段时间后，用HPLC进行检测，结果见表1。在一些实施方案中，使用了不同浓度的苯丙氨酸/酪氨酸做底物检测了多种表达重组多肽的重组细胞全菌体活性，在此不做一一列举（高通量筛选中产生的负向突变在本文未体现，下同）。

在表1中，与表达原始PcXAL多肽的重组细胞全菌体活性的比较，并定义如下：“*”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于0 .95倍、但少于1倍、；“**”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于1倍、但少于1.25倍；“***”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于1.25倍。

实施例5 重组多肽活性检测

重组多肽活性通过测量反式肉桂酸（苯丙氨酸产物）、对香豆酸（酪氨酸产物）的形成来确定，将0.5 mg 重组多肽与含有50mM苯丙氨酸/酪氨酸PBS（PH 7.0）溶液震荡混匀（反应体积为2mL），孵育一段时间后，用HPLC 进行检测，结果见表2。在一些实施方案中，使用了不同浓度的苯丙氨酸/酪氨酸做底物检测了多种重组多肽降解活性，在此不做一一列举。

在表2中，与原始PcXAL多肽的活性的比较，并定义如下：“*”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于0 .95倍、但少于1倍、；“**”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于1倍、但少于1.25倍；“***”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于1.25倍。

实施例6 重组多肽对蛋白酶敏感性的检测

人工肠液中含有胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、磷酸钠、牛黄胆酸钠、氯化钙可以模拟肠道环境，将重组多肽与人工肠液混合后（外50mM苯丙氨酸/酪氨酸，反应体积为2mL），孵育一段时间后，使用HPLC对其活性进行检测，结果见表3。在一些实施方案中，使用了其他蛋白酶进行了多种重组多肽蛋白酶敏感性的检测，在此不做一一列举。

在表3中，人工肠液分别处理0.5小时和1小时后，与原始PcXAL多肽的活性的比较，并定义如下：“*”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于0 .95倍、但少于1倍、；“**”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于1倍、但少于1 .25倍；“***”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于1.25倍。

实施例7 重组多肽热稳定的检测

将高通量生长的重组多肽裂解物在55℃条件下孵育0.5-1小时，离心取上清，并将上清液转移至96孔微量滴定板，冷冻并冻干成干粉，将冻干的酶粉在50℃的振荡器中孵育多达7天。之后，将冻干的酶在含有50mM苯丙氨酸/酪氨酸2mL PBS（PH 7.0）溶液中震荡混匀，孵育一段时间后，使用HPLC对其活性进行检测，结果见表4。在一些实施方案中，检测了多种重组多肽及其在不同温度下的重组多肽的热稳定性，在此不做一一列举。

在表4中，55℃分别处理0.5小时和1小时、并制备成冻干酶粉在50℃孵育7天后，与原始PcXAL多肽的活性的比较，并定义如下：“*”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于0.95倍、但少于1倍、；“**”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于1倍、但少于1 .25倍；“***”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于1 .25倍。

实施例8 重组多肽对酸耐受性的检测

人工胃液PH为2.5，将含有重组多肽的PBS溶液与人工肠液混合1：1混匀，模拟进食环境（外50mM苯丙氨酸/酪氨酸，反应体积为2mL），孵育一段时间后，使用HPLC对其活性进行检测，结果见表5。在一些实施方案中，检测了多种重组多肽及其在不同PH下重组多肽的耐受性，在此不做一一列举。

在表5中，重组多肽的PBS溶液与人工肠液混合1：1混匀，分别孵育0.5小时和1小时后，与原始PcXAL多肽的活性的比较，并定义如下：“*”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于0 .95倍、但少于1倍、；“**”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于1倍、但少于1 .25倍；“***”=苯丙氨酸及酪氨酸降解活性提升大于1 .25倍。

实施例9 模型小鼠血液苯丙氨酸水平检测

将宿主细胞、表达原始PcXAL多肽的重组细胞、表达重组多肽的重组细胞，对灌胃苯丙氨酸代谢功能障碍小鼠进行分别灌胃，一段时间后检测各点模型小鼠血液中的苯丙氨酸水平，表达上述最优突变体14的重组大肠杆菌的降解活性结果见图1。在一些实施方案中，检测了多种表达重组多肽重组细胞进行小鼠灌胃后血液苯丙氨酸水平检测，在此不做一一列举。

图1中A表示单次给药、B表示连续给药，在苯丙酮尿症小鼠模型中（PKU小鼠），表达原始PcXAL多肽的重组细胞及表达重组多肽的重组细胞，单次及连续给药均可抑制PKU小鼠单次口服苯丙氨酸后的吸收，降低血液中苯丙氨酸水平。与空白对照组相比，在口服苯丙氨酸后2小时的抑制率可达30%以上，且作用至少可持续4小时，其中表达重组多肽的重组细胞效果要优于表达原始PcXAL多肽的重组细胞。该结果证明，在 PKU 小鼠模型中，通过口服表达重组多肽重组细胞的方式，可更好地抑制苯丙氨酸经消化道吸收入血的作用，从而降低口服苯丙氨酸后血液中苯丙氨酸水平的升高，达到治疗苯丙酮尿症的目的。

我们同样对具有酪氨酸代谢功能障碍的PKU小鼠模型进行重组细胞和酪氨酸灌胃，一段时间后检测模型小鼠血液中的酪氨酸水平，发现表达突变体14的重组大肠杆菌对血液中酪氨酸的降解程度也远高于表达原始PcXAL多肽的重组细胞，具有统计学差异。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种芳香族氨基酸降解酶，其特征在于，所述芳香族氨基酸降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

2.根据权利要求1所述的芳香族氨基酸降解酶，其特征在于，所述芳香族氨基酸降解酶通过SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列突变得到，突变体酶相对于野生型酶至少表现出以下一种特性：

（1）氨基酸降解活性提高；

（2）酶稳定性提高；

（3）热稳定性提高；

（4）酸耐受性提高。

3.根据权利要求1所述的芳香族氨基酸降解酶，其特征在于，所述芳香族氨基酸降解酶的氨基酸序列N端融合表达蛋白标签。

4.编码权利要求1-3任一项所述芳香族氨基酸降解酶的多核苷酸。

5.携带权利要求4所述多核苷酸的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体上含有至少一种控制序列。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述控制序列包括启动子、终止子、信号肽或前导肽中的至少一种。

8.含有权利要求1-3任一项所述芳香族氨基酸降解酶、权利要求4所述多核苷酸或权利要求5-7任一项所述表达载体的重组细胞。

9.权利要求1-3任一项所述芳香族氨基酸降解酶、权利要求4所述多核苷酸、权利要求5-7任一项所述表达载体或权利要求8所述重组细胞在制备用于酪氨酸和/或苯丙氨酸降解的产品中的应用。

10.权利要求1-3任一项所述芳香族氨基酸降解酶、权利要求4所述多核苷酸、权利要求5-7任一项所述表达载体或权利要求8所述重组细胞在制备苯丙酮尿症和/或酪氨酸血症预防或治疗药物中的应用。

11.一种用于预防或治疗苯丙酮尿症和/或酪氨酸血症的药物组合物，其特征在于，含有权利要求1-3任一项所述芳香族氨基酸降解酶、权利要求4所述多核苷酸、权利要求5-7任一项所述表达载体或权利要求8所述重组细胞。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有药学上可接受的载体。

13.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，口服施用所述药物组合物。

14.一种提高芳香族氨基酸降解酶活性或稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：对SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列进行突变，所述突变为进行I5M、L141M、S170Y、R183P、G417S、V482A、V500F、Y524H的组合突变。