CN116790531A - 一种p450酶突变体、编码基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种P450酶突变体、编码基因及其在制备皮质醇中的应用，属于生物工程技术领域。所述P450酶突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的智人来源CYP11B1通过氨基酸突变所得，氨基酸突变的位点为S146V、H331D、L440F中的至少一个。本发明提供的P450酶突变体相对野生型CYP11B1在大肠杆菌中具有更高的可溶性表达水平，构建的重组表达菌株的催化水平更高，可以以11‑脱氧皮质醇为底物制备皮质醇，产物的产率高，无副产物产生，具有很好的工业化应用前景。

Description

一种P450酶突变体、编码基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种针对智人来源CYP11B1改造的P450酶突变体、编码基因及其在制备皮质醇中的应用。
背景技术
皮质醇(Cortisol)是从肾上腺皮质中提取出的对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素，属于糖皮质激素的一种，在应激生理适应、能量动员和免疫反应的调节中起着至关重要的作用。除用作抗炎药物和免疫抑制剂，皮质醇也被用作合成其他糖皮质激素的中间体，如泼尼松、泼尼松龙等。
皮质醇是通过肾上腺皮质线粒体中的11β-羟化酶的作用，由11-脱氧皮质醇生成。皮质醇的全化学合成涉及约40个步骤且收率低(Woodward R,Sondheimer F,Taub D,etal.The total synthesis of steroids[J].Journal of the American ChemicalSociety,1952,74(17):4223-4251.)。在目前的工业生产中主要采用从天然存在的甾醇开始的半合成方法，包括前期多步骤化学过程和最后一步利用弯孢属(Curvularia)或犁头霉属(Absidia)真菌培养物进行微生物转化11-脱氧皮质醇或其21-醋酸酯生产皮质醇(杨顺楷.甾体微生物转化：糖皮质激素氢化可的松生物转化的鲁棒性及其研究应用[J].应用与环境生物学报,2022,28(01):230-238.)。但真菌催化过程的选择性较差，常伴随着11α-OH或14α-OH副产物的产生，这需要在下游分离步骤中耗费更多的成本，且真菌的培养和转化时间均较长。
哺乳动物中皮质醇主要在肾上腺中合成，最后一步11β-羟基化由线粒体P450酶CYP11B1执行。基于CYP11B1专一的羟化功能，已利用人CYP11B1构建重组酿酒酵母菌株从头合成皮质醇，但是实现的生产率和效价较低(分别为1.64mg·L-1·d-1和11.5mg·L-1)(Szczebara F M,Chandelier C,Villeret C,et al.Total biosynthesis ofhydrocortisone from a simple carbon source in yeast[J].Nature Biotechnology,2003,21(2):143-149.)。人CYP11B1与完整电子转移链人皮质铁氧还蛋白(adrenodoxin,Adx)和人皮质铁氧还蛋白还原酶(adrenodoxin reductase,AdR)在粟酒裂殖酵母中共表达后可在72小时内生产1mM的皮质醇(约120.8mg·L-1·d-1)(Hakki T,Zearo S,C-A,et al.Coexpression of redox partners increases the hydrocortisone(cortisol)production efficiency in CYP11B1 expressing fission yeast Schizosaccharomycespombe[J].Journal of Biotechnology,2008,133(3):351-359.)。这些皮质醇产率离工业化要求仍有较大的距离，因此，开发基于CYP11B1的高催化活力生物催化剂用于皮质醇的合成是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种催化活力高、立体选择性专一的细胞色素P450酶用于制备皮质醇，满足工业化生产的要求。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通过对智人来源的细胞色素P450酶CYP11B1进行酶分子工程改造，获得了催化活力显著提升的P450酶突变体，具体的，所述P450酶突变体是氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的智人来源CYP11B1通过氨基酸突变所得的突变体，其中，所述氨基酸突变的位点为第146位、第331位、第440位中的至少一个，且第146位的丝氨酸突变为缬氨酸，第331位的组氨酸突变为天冬氨酸，第440的亮氨酸突变为苯丙氨酸。
具体的，第146位的丝氨酸突变为缬氨酸的突变体CYP11B1-S146V，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
第331位的组氨酸突变为天冬氨酸的突变体CYP11B1-H331D，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；
第440位的亮氨酸突变为苯丙氨酸的突变体CYP11B1-L440F，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；
第146位的丝氨酸突变为缬氨酸且第331位的组氨酸突变为天冬氨酸的突变体CYP11B1-S146V/H331D，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
第146位的丝氨酸突变为缬氨酸且第440位的亮氨酸突变为苯丙氨酸的突变体CYP11B1-S146V/L440F，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
第331位的组氨酸突变为天冬氨酸且第440位的亮氨酸突变为苯丙氨酸的突变体CYP11B1-H331D/L440F，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
第146位的丝氨酸突变为缬氨酸且第331位的组氨酸突变为天冬氨酸且第440位的亮氨酸突变为苯丙氨酸的突变体CYP11B1-S146V/H331D/L440F，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
研究表明，相较于野生型CYP11B1，上述P450酶突变体在大肠杆菌中的可溶性表达水平显著提升，基因工程菌的全细胞催化活力显著提升。
对所述P450酶突变体的其他氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
针对本发明P450酶突变体的获得，可以通过对智人来源CYP11B1的编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)进行定点突变，基因表达后得到所述P450酶突变体。
本发明还提供了用于编码所述P450酶突变体的编码基因，所述编码基因是在SEQID NO.9所示核苷酸序列的基础上对编码相应氨基酸的密码子进行突变获得。具体的，S146V为编码第146位丝氨酸的密码子TCT突变为编码缬氨酸的密码子GTG，H331D为编码第331位组氨酸的密码子CAT突变为编码天冬氨酸的密码子GAT，L440F为编码第440位亮氨酸的密码子TTA突变为编码苯丙氨酸的密码子TTT。
本发明还提供了包含编码所述的P450酶突变体氨基酸序列的编码基因的重组表达载体。优选的，所述重组表达载体以pET-17b为载体质粒。
进一步的，所述重组表达载体还包括皮质铁氧还蛋白还原酶(adrenodoxinreductase,AdR)编码基因与皮质铁氧还蛋白(adrenodoxin,Adx)编码基因。AdR和Adx负责将P450氧化过程中所需的氧化还原当量从NAD(P)H传递到P450酶。本发明通过在重组表达载体中克隆AdR编码基因与Adx编码基因，与所述P450酶突变体编码基因共表达，作为氧化还原伴侣向CYP11B1参与的羟化反应传递反应所需电子。
优选的，所述氧化还原伴侣采用牛来源AdR和牛来源Adx，AdR氨基酸序列和编码基因分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，Adx氨基酸序列和编码基因分别如SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13所示。
优选的，所述重组表达载体中皮质铁氧还蛋白还原酶编码基因的上游插入有核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的RBS序列，皮质铁氧还蛋白编码基因的上游插入有核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的RBS序列。
本发明还提供了包含所述重组表达载体的基因工程菌，所述基因工程菌用于生产所述的P450酶突变体。所述重组载体转化宿主细胞获得重组基因工程菌，所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞，优选的，基因工程菌的宿主菌采用大肠杆菌E.coli C43(DE3)。
优选的，所述基因工程菌还包含表达分子伴侣GroEL/ES的pGro7质粒。分子伴侣蛋白可帮助原核宿主中真核来源膜蛋白的翻译后正确折叠，保证CYP11B1和AdR的活性表达。
本发明还提供了一种构建所述P450酶突变体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)设计定点突变引物，以含有核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示基因片段的质粒为模板，进行反向PCR，获得CYP11B1中第146位S突变为V或第331位H突变为D或第440位L突变为F的单位点突变产物；
(2)以单位点突变产物为模板，利用所述定点突变引物进行反向PCR获得双位点突变产物；以双位点突变产物为模板，利用所述定点突变引物进行反向PCR获得三位点突变产物；
(3)将所述单位点突变产物、双位点突变产物或三位点突变产物化至宿主菌，筛选获得P450酶突变体表达菌株，诱导表达，获得所述的P450酶突变体。
其中第146位S突变为V所需的引物：
S146V-F：5’-TTGCTCGCGATTTTGTGCAGGCACTGAAAAAAAAAGTGC-3’；
S146V-R：5’-TTTTTTTTCAGTGCCTGCACAAAATCGCGAGCAACGGC-3’；
第331位H突变为D所需的引物：
H331D-F：5’-GTATTAGCGAAGATCCACAGAAAGCTACGAC-3’；
H331D-R：5’-GTCGTAGCTTTCTGTGGATCTTCGCTAATAC-3’；
第440位L突变为F所需的引物：
L440F-F：5’-AGAAATGCTGTTATTTTTACATCATGTGCTG-3’；
L440F-R：5’-CAGCACATGATGTAAAAATAACAGCATTTCT-3’。
优选的，所述含有核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示基因片段的质粒中还克隆有核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13所示的基因片段。
优选的，重组质粒的原始载体为pET-17b；宿主菌采用大肠杆菌E.coli C43(DE3)。
本发明的另一个目的是提供所述的P450酶突变体在制备皮质醇中的应用，所述应用包括：所述P450酶突变体在皮质铁氧还蛋白还原酶和皮质铁氧还蛋白的共同作用下催化11-脱氧皮质醇11β-羟基化生成皮质醇。
本发明提供的P450酶突变体在氧化还原伴侣AdR/Adx的共同作用下可以催化11-脱氧皮质醇11β-羟基化，生成高光学纯度皮质醇，ee＞99％，具有良好的工业化应用前景。
进一步的，所述应用包括：以含有包含P450酶突变体编码基因、AdR和Adx编码基因的重组表达质粒的基因工程菌经发酵培养后离心获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞为催化剂，以11-脱氧皮质醇为底物，以含助溶剂的pH值≤8的缓冲液为反应介质，在25-37℃、150-300rpm条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得皮质醇。
优选的，所述基因工程菌宿主菌为大肠杆菌，宿主菌内含有表达分子伴侣GroEL/ES的pGro7质粒和包含P450酶突变体编码基因、AdR和Adx编码基因的重组表达质粒。
优选的，反应体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为25-100g/L，其中湿菌体含水质量为70-90％。更优选为25g/L。
优选的，反应体系中，底物的浓度为3-10mM，更优选为10mM。
优选的，pH缓冲溶液为磷酸钾缓冲液，即KH2PO4-K2HPO4缓冲液，浓度为50mM，pH为7.4，其中添加0.1-1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，1-5mg/mL阿拉伯糖(L-ara)，0.1-1.5mMδ-氨基乙酰丙酸(δ-ALA)，0-200μg/mL氨苄青霉素和1-5％甘油。更优选为1mM IPTG，4mg/mL L-ara，1mMδ-ALA，50μg/mL氨苄青霉素和2％甘油。
优选的，所述助溶剂为甲基-β-环糊精或(2-羟丙基)-γ-环糊精，环糊精在pH缓冲溶液中与底物的摩尔比为3～5:1，更优选为甲基-β-环糊精且与底物摩尔比为3:1。
上述各原料的添加浓度，如湿菌体、底物、环糊精等均以1L pH缓冲液终体积计算。
优选的，反应温度为27.5℃。
反应时间为12-32h，优选为24h。
优选的，振荡速率为170rpm。
优选的，所述的湿菌体为E.coli C43(DE3)/pET-17b-CYP11B1-S146V/H331D/L440F。该突变体生产皮质醇的产率可以达到2756.3mg·L-1·d-1，是同等催化条件下野生型CYP11B1的1.87倍，光学纯度ee为99％。
发酵培养方法为：重组工程菌接种至含氨苄青霉素(终浓度为100μg/mL)和氯霉素(终浓度为20μg/mL)的TB培养基中(其中磷酸钾盐浓度为0.017M KH2PO4+0.072M K2HPO4)，37℃、220rpm培养至菌体浓度OD600至1.0左右，加入终浓度为1mM的IPTG，4mg/mL的L-ara，1mM的δ-ALA，50μg/mL的氨苄青霉素，30℃、200rpm诱导培养21h，于4℃、3500rpm离心10min收集菌体细胞。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供的P450酶突变体相对野生型CYP11B1在大肠杆菌中具有更高的可溶性表达水平，构建的重组表达菌株的催化水平更高，且保持了专一的立体选择性，可以以11-脱氧皮质醇为底物制备皮质醇，产物的收率高，无副产物产生。
(2)本发明利用表达P450酶突变体的全细胞作为甾体药物中间体羟基化生物催化剂，使得高光学纯度手性产物的获得更加经济简便，生产方法具有操作简单、成本低廉等优点，大大降低了生产成本，具有很好的工业化应用前景。
附图说明
图1为重组突变体的质粒图谱。
图2为利用不同强度的RBS序列构建的重组菌株的相对活力比较。
图3为野生型CYP11B1工程菌在不同诱导表达温度条件下的相对活力比较。
图4为野生型CYP11B1工程菌在培养至不同OD600条件下的相对活力比较。
图5为部分重组突变体菌株培养结束后收获的菌体颜色对比图。
图6为反应体系应用不同助溶剂对野生型CYP11B1工程菌催化活性的影响。
图7为反应体系中底物浓度对野生型CYP11B1工程菌催化活性的影响。
图8为标准品皮质醇和底物11-脱氧皮质醇的混合物(Standard)以及E.coli C43(DE3)空白对照(Blank)、CYP11B1及其突变体(S146V)和底物11-脱氧皮质醇反应所得产物的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的。如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
实施例1：构建可表达各突变体的工程菌
1、根据UniProt数据库中P15538(智人来源CYP11B1，www.uniprot.org/uniprotkb/P15538/entry)蛋白氨基酸序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成相应编码基因，其中P15538氨基酸序列的N端前27aa替换为MATK，即N端序列由MALRAKAEVCMAVPWLSLQRAQALGTR改为MATK。即智人来源CYP11B1野生型的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
牛来源AdR(P00257，https://www.uniprot.org/uniprotkb/P00257/entry)和Adx(P08165，https://www.uniprot.org/uniprotkb/P08165/entry)的相应编码基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成。AdR的氨基酸序列和编码基因的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示，Adx的氨基酸序列和编码基因的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13所示。
利用RBS设计软件(https://www.denovodna.com/)预测各基因的初始RBS，其中CYP11B1的RBS序列固定为表达质粒上的自带序列，CYP11B1、AdR、Adx的初始RBS强度分别为8400au、5000au、20000au。为AdR与Adx设计不同强度的RBS序列，AdR的RBS强度分别设计为10000au、50000au和100000au，Adx的RBS强度分别设计为20000au、80000au、150000au和430000au，并根据具体RBS序列设计引物，如表1所示。
表1.AdR和Adx编码基因的不同强度RBS序列
注：RBS碱基序列部分用下划线表示。
分别以合成的AdR基因片段、Adx基因片段为模板，采用相应的引物对进行PCR扩增，获得带有不同RBS序列的基因片段。
然后以质粒pET-17b为载体，通过PCR、双酶切和体外连接，构建得到包含上述CYP11B1编码基因、AdR编码基因和Adx编码基因的重组质粒pET-17b(图1)，将该重组质粒转入大肠杆菌E.coli C43(DE3)中获得野生型CYP11B1的工程重组菌株，将该重组菌株在含100μg/mL的氨苄青霉素抗性的LB平板上活化，37℃培养12h，挑取单菌落于同样含100μg/mL的氨苄青霉素抗性的5mL LB试管中，37℃、220rpm培养12h左右，按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒。
将测序正确的重组质粒pET-17b与表达分子伴侣GroEL/ES的pGro7质粒共同转入大肠杆菌E.coli C43(DE3)中获得工程重组菌株，将该重组菌株在含100μg/mL的氨苄青霉素抗性和20μg/mL的氯霉素抗性的LB平板上活化，37℃培养12h，挑取单菌落于同样含100μg/mL氨苄青霉素抗性和20μg/mL氯霉素抗性的5mL LB试管中，37℃、220rpm培养12h左右，再以1％接种量(v/v)接种到含100μg/mL氨苄青霉素和20μg/mL氯霉素的50mL TB培养基中(其中磷酸钾盐浓度为0.034M KH2PO4+0.144M K2HPO4)，37℃、220rpm培养至菌体浓度OD600至0.5左右，加入终浓度为1mM的IPTG，4mg/mL的L-ara，1mM的δ-ALA，50μg/mL的氨苄青霉素，27.5℃、200rpm诱导培养21h，于4℃、3500rpm离心10min收集菌体细胞，得到表达野生酶的工程菌的湿菌体。
结果如图2所示，AdR和Adx的RBS强度分别为50000au和80000au时，即RBS序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，全细胞催化活性达到了最高水平，较原始菌株(Ori)提高了18.6％，用于皮质醇生产时空产率提升至407.0mg·L-1·d-1。以该条件下构建的质粒用于后续实验。
2、CYP11B1单位点146、331、440突变体的构建
以步骤1构建的质粒作为模板，使用QuikChange Lightning Site-DirectedMutagenesis Kit点突变试剂盒(Agilent,United States)完成突变质粒的构建。将野生型氨基酸序列中的第146位的丝氨酸(S)、第331位的组氨酸(H)和第440位的亮氨酸(L)进行单位点突变，设计相应的引物，如表2所示。
表2.突变引物
将上述构建好的突变质粒转入大肠杆菌E.coli C43(DE3)感受态细胞，混匀后置于冰上15min，结束后将大肠杆菌E.coli C43(DE3)感受态放入温度42℃下热激90s后置于冰上缓和5min，再加入1mL LB培养基，于37℃下培养50min，结束后于12000rpm离心1min，取100μL上清重悬菌体，涂布于含100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板上，于37℃恒温培养箱培养12h。
挑取平板上的单菌落于含有200μL LB培养基的试管中，培养8h后取其中100μL用于测序，测序结果正确的将剩余菌液添加等体积的40％甘油溶液，置于-80℃冰箱中保存备用。
分别获得CYP11B1突变体工程菌E.coli C43(DE3)/pET-17b-CYP11B1-S146V、E.coli C43(DE3)/pET-17b-CYP11B1-H331D、E.coli C43(DE3)/pET-17b-CYP11B1-L440F。测序结果显示编码第146位丝氨酸(S)的密码子TCT突变为编码缬氨酸(V)的密码子GTG；编码第331位组氨酸(H)的密码子CAT突变为编码天冬氨酸(D)的密码子GAT；编码第440位亮氨酸(L)的密码子TTA突变为编码苯丙氨酸(F)的密码子TTT。突变体S146V、H331D、L440F的氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。
3、CYP11B1组合突变体的构建
以步骤2构建的pET-17b-CYP11B1-S146V、pET-17b-CYP11B1-H331D作为模板，使用点突变试剂盒完成突变质粒的构建，方法同上。测序结果正确获得CYP11B1突变体工程菌E.coli C43(DE3)/pET-17b-CYP11B1-S146V/H331D、E.coli C43(DE3)/pET-17b-CYP11B1-S146V/L440F、E.coli C43(DE3)/pET-17b-CYP11B1-H331D/L440F，对应突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7。
进一步以上述质粒为模板，使用点突变试剂盒完成突变质粒的构建，方法同上。测序结果正确获得CYP11B1突变体工程菌E.coli C43(DE3)/pET-17b-CYP11B1-S146V/H331D/L440F，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。
实施例2：各突变体的诱导表达
1、培养条件的优化
(1)按照实施例1的菌体培养条件，比较野生型CYP11B1工程菌在不同诱导温度30℃、27.5℃、24℃、20℃、17℃的影响，结果如图3所示，30℃时培养的菌株催化效果最好，相对活性为118.4％。
(2)培养基组成，将实施例1中TB培养基中磷酸钾盐浓度调整为0.017M KH2PO4+0.072M K2HPO4时培养的菌株催化效果变好，相对活性为167.1％。
(3)比较不同诱导OD(OD600＝0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2)，结果如图4所示，其中在OD600＝1.0时进行诱导后培养的菌株催化效果最好，相对活性为132.7％。
将以上优化后的最佳单因素水平进行组合(30℃+TB培养基(0.017M KH2PO4+0.072MK2HPO4)+OD600＝1.0)，培养的菌株全细胞催化活性由407.0mg·L-1·d-1提升至584.2mg·L-1·d-1。
2、将实施例1构建的携带各突变体基因表达质粒的工程菌分别接种至含100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB液体培养基试管中，37℃培养12h，按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒。
将携带各突变体编码基因的pET-17b质粒与表达分子伴侣GroEL/ES的pGro7质粒共同转入大肠杆菌E.coli C43(DE3)中获得工程重组菌株，将该重组菌株在含100μg/mL的氨苄青霉素抗性和20μg/mL的氯霉素抗性的LB平板上活化，37℃培养12h，挑取单菌落于同样含100μg/mL氨苄青霉素抗性和20μg/mL氯霉素抗性的5mL LB试管中，37℃、220rpm培养12h左右，再以1％接种量(v/v)接种到含100μg/mL氨苄青霉素素和20μg/mL氯霉素的50mLTB培养基(0.017M KH2PO4+0.072M K2HPO4)中，37℃、220rpm培养至菌体浓度OD600至1.0左右，加入终浓度为1mM的IPTG，4mg/mL的L-ara，1mM的δ-ALA，50μg/mL的氨苄青霉素，30℃、200rpm诱导培养21h，于4℃、3500rpm离心10min收集菌体细胞，分别得到表达突变体的工程菌的湿菌体。
实验结果分析：与野生型(WT)相比较，表达突变体的工程菌株颜色更红(如图5)，这是活性P450表达量提升的明显特征，说明本发明所提供的智人来源CYP11B1突变体具有更高的可溶性表达水平。
实施例3：各突变体制备皮质醇
1、全细胞反应条件的优化
(1)助溶剂
配置含有50mM 11-脱氧皮质醇的二甲基亚砜(DMSO)溶液作为底物母液。将实施例1构建的野生型湿菌体利用磷酸钾缓冲液进行重悬，并加入底物母液和IPTG、L-ara、δ-ALA和氨苄青霉素母液，使其中的湿菌体终含量为25g/L，底物终浓度为3mM，配置成为反应体系溶液，置于27.5℃，170rpm恒温摇床条件下反应24h。反应结束后，用乙酸乙酯萃取并离心，35℃真空旋蒸1h，随后用液相流动相(乙腈)复溶。
将甲基-β-环糊精(M-β-CD)和(2-羟丙基)-γ-环糊精[(2-OH)-γ-CD]分别以与底物摩尔比为3:1、4:1和5:1的比例配置成母液形式。以10％的体积比加入到反应体系，底物终浓度均为3mM。
如图6所示，两种不同类型CDs的应用均实现了对催化活性的显著提升，其中M-β-CD以低摩尔比(3:1)加入时效果最佳，相对活性提升了51.0％，时空产率达到881.9mg·L-1·d-1，而(2-OH)-γ-CD在以4:1的摩尔比加入时，相对活性提升了71.8％，时空产率达到1003.4mg·L-1·d-1。鉴于M-β-CD的成本相比(2-OH)-γ-CD明显更低，所以选择M-β-CD(3:1摩尔比)用作后续实验中全细胞反应体系的助溶剂。
(2)底物浓度
底物的供应量分别采用3mM、5mM、7mM、10mM，如图7所示，发现随着底物浓度的提升，皮质醇产率也随之明显提升，在10mM底物浓度下时空产率进一步达到1470.0mg·L-1·d-1，固定该浓度应用于后续的实验。
2、配置含有100mM 11-脱氧皮质醇和300mM M-β-CD的水溶液作为底物母液。
将实施例2获得的各突变体湿菌体利用磷酸钾缓冲液进行重悬，并加入底物母液和IPTG、L-ara、δ-ALA和氨苄青霉素母液，使其中的湿菌体终含量为25g/L，底物终浓度为10mM，配置成为反应体系溶液，置于27.5℃，170rpm恒温摇床条件下反应24h。反应结束后，用乙酸乙酯萃取并离心，35℃真空旋蒸1h，随后用液相流动相(乙腈)复溶。
利用高效液相色谱(HPLC)分析确定其产率和ee值，皮质醇和11-脱氧皮质醇标准品的液相色谱图如图8所示。最终测得产物ee值和产率如表3所示。
表3.各突变体制备皮质醇的ee值和产率
产物ee值 产率
野生型CYP11B1 >99％ 1470.0±21.2mg·L-1·d-1
突变体CYP11B1-S146V >96％ 2560.1±116.8mg·L-1·d-1(**)
突变体CYP11B1-H331D ＞99％ 2338.6±81.3mg·L-1·d-1(**)
突变体CYP11B1-L440F ＞99％ 2111.0±42.1mg·L-1·d-1(**)
突变体CYP11B1-S146V/H331D ＞99％ 2523.2±170.3mg·L-1·d-1(**)
突变体CYP11B1-S146V/L440F ＞99％ 1561.0±116.8mg·L-1·d-1(ns)
突变体CYP11B1-H331D/L440F ＞99％ 2297.0±54.3mg·L-1·d-1(**)
突变体CYP11B1-S146V/H331D/L440F ＞99％ 2756.3±104.2mg·L-1·d-1(**)
注释：与野生型比较，ns表示P>0.05，**表示P≤0.01。±代表标准差。
实验结果分析：重组表达的基因工程菌具有更优良的催化活性，CYP11B1突变体催化合成皮质醇的最高时空产率可达到2756.3mg·L-1·d-1，ee值达99％，光学纯度高。且催化剂易于制备、反应条件温和、环境友好，能高效催化甾体化合物的高度选择性11β-羟基化反应，具有很好的工业化应用开发前景。

Claims (10)

1.一种P450酶突变体，其特征在于，所述P450酶突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的智人来源CYP11B1通过氨基酸突变所得的突变体，其中，所述氨基酸突变的位点为第146位、第331位、第440位中的至少一个，且第146位的丝氨酸突变为缬氨酸，第331位的组氨酸突变为天冬氨酸，第440的亮氨酸突变为苯丙氨酸。
2.如权利要求1所述的P450酶突变体，其特征在于，所述P450酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.8中任一所示。
3.一种用于编码如权利要求1或2所述的P450酶突变体的编码基因。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求3所述的编码基因。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包括皮质铁氧还蛋白还原酶编码基因与皮质铁氧还蛋白编码基因，所述皮质铁氧还蛋白还原酶编码基因的上游插入有核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的RBS序列，所述皮质铁氧还蛋白编码基因的上游插入有核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的RBS序列。
6.一种用于生产如权利要求1或2所述的P450酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求4或5所述的重组表达载体。
7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还包含表达分子伴侣GroEL/ES的pGro7质粒。
8.如权利要求1或2所述的P450酶突变体在制备皮质醇中的应用，其特征在于，所述应用包括：所述P450酶突变体在皮质铁氧还蛋白还原酶和皮质铁氧还蛋白的共同作用下催化11-脱氧皮质醇11β-羟基化生成皮质醇。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括：以含有包含P450酶突变体编码基因、皮质铁氧还蛋白还原酶编码基因和皮质铁氧还蛋白编码基因的重组表达质粒的基因工程菌经发酵培养后离心获得的湿菌体或湿菌体固定化细胞为催化剂，以11-脱氧皮质醇为底物，以含助溶剂的pH值≤8的缓冲液为反应介质，在25-37℃、150-300rpm条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得皮质醇。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，反应体系中，底物的浓度为3-10mM，所述助溶剂为甲基-β-环糊精或(2-羟丙基)-γ-环糊精，与底物的摩尔比为3～5:1，催化剂的用量以湿菌体重量计为25-100g/L，其中湿菌体含水质量为70-90％。
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