CN101613704A - 一种丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT)基因的分析及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT)基因及其编码的蛋白酶与用途，该基因为首次利用cDNA芯片技术从丹参中克隆而得，填补了从我国传统名贵中药材丹参中分离克隆出乙酰CoA酰基转移酶基因的空白。本发明所提供的SmAACT基因具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。丹参乙酰CoA酰基转移酶基因催化MVA途径上第一个酶促反应，使2分子的乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA，是丹参二萜醌类化合物生物合成途径上的第一个关键酶，推测该基因的表达量与丹参酮类成分的含量密切相关。本发明提供的SmAACT基因可以通过生物技术提高丹参中二萜类活性成分丹参酮类的含量，可用于利用生物技术来提高丹参酮类物质含量的研究和产业化，有助于丹参药材的品质改良及选育，具有很好的应用前景。

Description

一种丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT)基因的分析及应用

技术领域

本发明属于药用植物基因工程领域，具体地说，涉及利用cDNA芯片技术克隆一种新的丹参乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA acyltryansferase，AACT)基因，转化该基因以提高丹参中二萜类次生代谢产物含量的方法。

背景技术

药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将破解药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。

二萜类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一，在药用植物中很多活性成分如紫杉醇、丹参酮IIA、雷公藤甲、乙素等均为二萜类化合物。药用植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.为一味常用中药，素有“一味丹参，功同四物”的美称，具有活血化瘀、理气止痛的功效，是众多复方、保健品的主要成分。丹参主要含有两类活性成分：脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物。

萜类生物合成由甲羟戊酸途径(MVA)和丙酮酸途径(DXP)组成。MVA途径长期以来都被认为是萜类化合物生物合成的惟一途径。它由Conrad Bloch和Feodor Lynen于1958年首先在动物和酵母中发现，主要存在于细胞质中，又可称为细胞质途径(cytosolic pathway)，通过该途径形成了植物中的倍半萜、三萜和甾醇等。乙酰CoA酰基转移酶(AACT)催化MVA途径上第一个酶促反应，使2个分子的乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA。迄今为止，已从拟南芥(Arabodipsisth aliana)、橡胶树(pararu bbertree)、水稻(rice)和胡萝卜(radish)中克隆并鉴定了AACT基因的全长cDNA。AACT在不同植物基因组中其拷贝数不同，在拟南芥中AACT有一个小的基因家族，而在胡萝卜中，AACT是一个单拷贝基因，其表达受到光的调节。本发明首次从鼠尾草属药用植物丹参中克隆得到编码SmAACT的基因，在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的丹参乙酰CoA酰基转移酶基因及其氨基酸序列。

植物基因克隆的方法有很多种，如功能克隆、表型克隆、定位克隆等。近年来，国外研究者采用经典的功能克隆法克隆到一些药用植物的关键酶基因，如紫杉醇合酶。然而在事先无目的蛋白或其相应基因定位的的情况下分离相关基因是相当困难的。因此，对于遗传背景不清，相关基因产物不明的情况下，表型克隆成为基因克隆的主要方法。基因芯片技术是20世纪80年代发展起来的一项高新技术，它可以对生物整个基因组的所有基因表达同时进行实时监测，作为一个全新的、强有力的技术平台，已广泛地应用于功能基因组的研究中，也成为挖掘新基因的强有力手段。cDNA芯片已在拟南芥、水稻、番茄、棉花等多个植物中得到了应用，但在药用植物功能基因研究中还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丹参cDNA芯片的制作、杂交、差异基因分析以及功能基因克隆的方法，并通过过表达AACT基因，预测SmAACT基因在丹参萜类成分积累过程中的重要作用。本发明涉及的丹参cDNA芯片克隆关键酶基因、载体构建、遗传转化、分子检测、丹参酮类成分提取及含量测定方法用于本发明，为利用转基因丹参大规模生产有效成分奠定了坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明应用cDNA基因芯片方法从丹参中克隆AACT基因；检测茉莉酸甲酯处理后SmAACT基因的表达情况及丹参酮IIA含量的变化情况；构建含所述DNA分子的植物过表达载体，用根癌农杆菌介导，将AACT基因导入丹参并再生出植株；PCR检测外源目的基因AACT的整合情况；HPLC测定丹参中四种萜类成分含量，筛选获得萜类成分含量显著提高的转基因丹参植株。

本发明包括如下具体步骤：

(1)采用cDNA芯片方法获得丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT)基因；

(2)茉莉酸甲酯处理后SmAACT基因的表达情况及丹参酮IIA含量的变化情况；

(3)构建含AACT基因的植物过表达载体，转化根癌农杆菌，获得用于转化丹参的含AACT基因的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化丹参，获得经PCR检测的转基因丹参植株；

(5)对获得的转基因丹参中萜类成分含量进行HPLC测定，筛选获得萜类成分含量显著提高的转基因丹参植株。

结果表明，在过表达SmAACT基因的转基因发根高产株系中二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量比非转基因对照组分别提高：1.1、1.8、1.6、2.6倍，初步证明SmAACT基因在丹参次生代谢产物生成过程中具有重要作用。这一结果对于培育高品质的药用植物品种特别是丹参具有重要的理论及实际意义。

本发明所提供的丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT)首次从丹参中克隆制备，填补了从我国药物植物丹参乙酰CoA酰基转移酶基因的空白。利用本发明可以通过基因工程技术来提高丹参等植物中萜类活性成分萜类物质的含量。转基因结果显示，丹参乙酰CoA酰基转移酶基因可通过转基因技术用于提高萜类成分含量的研究和产业化，尤其可用于中药材丹参的品质改良，能缓解丹参酮、隐丹参酮等萜类药源严重匾乏问题，对提高丹参酮等物质产量具有较好的促进作用，具有很好的应用前景。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、丹参cDNA芯片的制作

1、丹参总RNA的分离和检测

取陕西商洛丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge)根2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至65℃预热的10mL提取缓冲液中(CTAB(W/V)2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol·L^-1，EDTA 25m mol·L^-1，NaCl 2.0mol·L^-1，2％PVP40，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2％)，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10M LiCl，混匀后放置4℃沉淀过夜；7500g离心20分钟，沉淀用500μL SSTE(SDS 0.5％，NaCl 1mol·L^-1，Tris-HCl(pH8.0)10mmol·L^-1，EDTA 1mmol·L^-1，在65℃溶解5分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70℃放置2h；4℃13000g离心20分钟，沉淀室温干燥10分钟后溶于100μL DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。

2、cDNA文库的构建

采用mRNA纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA PurifiCation Kit，Pharmacia公司)分离mRNA后，通过在cDNA分子两端加上EcoR I/Not I接头，在T4多核苷酸激酶的作用下磷酸化，与表达载体λZAP Express Predigested Vector(ZAP Express Predigested VectorKit，stratagene公司)连接，然后采用stratagene公司的ZAP Express Pridigested Gigapack CloningKits(EcoRI/CIAP-Treated)将包装蛋白在体外包装连接产物，感染E.coli XL1-Blue MRF’构建成cDNA文库。

3、cDNA芯片的制备

3.1PCR扩增

挑取分离良好的噬菌斑溶于100μL SM缓冲液(Amresco公司)中混匀后作为PCR模板。PCR扩增引物为λZAP Express多克隆位点两侧的部分序列：M13-20引物：5′-GTAAAACGACGGCCAGTG-3′，BK反向引物：5′-GGAAACAGCTATGACCTTG-3′。96孔板PCR反应体系，准备如下混合物：dNTP(25mmol·L-1)，600μL；Mg2+600μL，10×缓冲液1000μL；Taq(Takara Ex Taq，5U·μL^-1)，40μL；M13-20引物(12.5μmol·L-1)，200μL；BK反向引物(12.5μmol·L-1)200μL；高纯水补足至10mL。混合均匀后，用排枪分装至96孔PCR板。然后各加入6μL DNA模板，混合均匀。在ABI9700型基因扩增仪上进行PCR反应，反应条件为94℃预变性3分钟，然后进行35个循环，为94℃30s，54℃30s，72℃2分钟，循环结束后72℃后延伸5分钟。取3μL反应产物在含EB的1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，在SYNGENE型凝胶成像系统下观察、拍照。

3.2PCR产物纯化

使用96孔Multiscreen filter plates(Millipore公司)纯化板进行PCR产物的纯化。将3.1项下琼脂糖凝胶检测为单一条带的PCR产物(100μL)转入纯化板中；将纯化板放于Millipore的真空装置上，于15mmHg真空抽滤10分钟，直至抽干；加入100μL水，15mmHg真空抽滤10分钟，直至抽干；从真空抽滤装置上取下PCR纯化板，加入40μL(pH8.0左右)的水，将纯化板放至摇床上轻摇20～30分钟重悬DNA；将纯化产物吸出，置于酶标板上测定浓度和纯度；取1μL纯化产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测；将纯化产物真空干燥。

3.3cDNA芯片点制

根据上述测定的浓度差异加入适量50％DMSO作为点样液，调节浓度至约250ng·μL^-1后，将样品转移至384孔板中准备芯片点制。点样仪为GeneMachine公司OmniGrid 100。点样参数为：针：2×12，X：8000，Y：6000；点间距：300microns；点阵：13×14；点阵间距：500microns；矩阵模式：4×12。

实施例2：丹参乙酰CoA酰基转移酶基因的克隆

1、实验材料的准备

丹参毛状根为发根农杆菌15834直接感染的方式进行Ri-质粒转化诱导的毛状根。取6-7V固体培养基(不含激素)暗藏保存的丹参毛状根，在无菌条件下将2g湿根接种于装有200ml无激素的6-7V液体培养基的500mL三角瓶中进行继代培养，培养至18d后作为试验材料。培养条件为25℃，110～120r·min-1，黑暗条件下培养。

2、诱导子的制备和处理

酵母提取物(yeast extract，YE)生物诱导子的制备：取25g酵母提取物溶于125mL蒸馏水中，加入100mL无水乙醇，置于4℃冰箱静置4d，倾去上清液，胶状沉淀溶于125mL蒸馏水中，加入无水乙醇(乙醇含量达80％)二次沉淀，离心，沉淀溶于100mL蒸馏水中，120℃灭菌20min，冷却后置于4℃冰箱备用。

银离子(Ag⁺)的制备：取AgNO35.096g溶于100mL蒸馏水中，制备得3mmol·L-1的Ag⁺。

诱导子处理：向培养18d的丹参毛状根培养基中分别加入诱导子组合YE+Ag+(YE 2ml、Ag⁺66.7ul)进行诱导处理，每个处理3个重复，分别于YE+Ag⁺处理后不同时期收获，用吸水纸吸干，各样本称取约2g鲜重于液氮速冻后-70℃保存(提取总RNA)或40℃干燥至恒重，精密称量毛状根的干重用于测定毛状根中丹参酮IIA的含量。

3、诱导子处理后丹参酮IIA的含量变化

采用高效液相色谱法测定诱导子处理后丹参酮IIA的含量。取干燥至恒重的丹参毛状根适量，研碎过40目筛，混匀。取药材细粉约0.2g，精密称量，置20mL容量瓶中，加甲醇溶液4mL，精密称重，超声处理40min，取出放冷，加甲醇溶液补足至原重，摇匀，静置，过0.45μm微孔滤膜即得。色谱条件为：Waters 2695高效液相色谱仪，RP-Waters C18柱(150mm×3.9mm，5μm)，检测波长：270nm；柱温：30℃，流速1.0m·min^-1，流动相为0.5％醋酸甲醇(A)和0.5％醋酸水(B)线性梯度洗脱：0～25min，30％～60％A；25～30min，60％～65％A；30～50min，65％～70％A；50～60min，70％～80％A；60～61min，80％～30％A。经过诱导子处理后，丹参酮IIA含量迅速上升，处理后第48h，丹参酮IIA YE+Ag⁺处理组是对照组的1.7倍，处理后第6d处理组是对照组的4.6倍，处理后第9d，处理组是对照组的5.9倍。结果表明丹参毛状根经诱导子处理之后，丹参酮类成分在短时间内迅速积累。

4、芯片杂交分析

根据上述诱导子处理后丹参酮IIA的变化情况，选用YE+Ag⁺处理后48h的毛状根及对照组作为芯片杂交样品，以对照组(C)为参照，与YE+Ag⁺(YA)的材料进行杂交，重复两次，每组均采用正反标记以消除染料的误差。

采用间接标记法进行探针标记，包括双链cDNA合成、T7介导的RNA体外转录合成cRNA、随机引物反转录、cDNA用KLENOW酶标记等步骤。

(1)双链cDNA合成：取5μg总RNA，以T7-Oligo(dT)15，5′-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3′，V可以是G、C和A，上海博亚生物技术有限公司)为引物，用cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)合成双链cDNA；双链合成以后用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化。

(2)体外转录合成cRNA：用T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(Promega公司)将双链cDNA进行体外转录合成cRNA；然后用RNeasy试剂盒(Qiagen公司)纯化。

(3)随机引物反转录：取2μg cRNA，用Superscript II反转录酶，200U·μL^-1(Invitrogen公司)，9 Random Primer进行反转录，反转录产物用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化。

(4)cDNA用KLENOW酶标记：取1μg cRNA反转录产物，用随机引物进行KLENOW标记，标记产物用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化，纯化后抽干。标记过程中dATP，dGTP，dTTP使用浓度为120μM，dCTP使用浓度为60μM，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP使用浓度为40μM。

将不同样品分别用cy3、cy5(Amersham公司)进行标记，然后溶于30μL杂交液中(3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5分钟，而后在0.2×SSC中室温洗5分钟，玻片甩干后进行扫描。将不同样品分别用cy3、cy5(Amersham公司)进行标记，然后溶于30μL杂交液中(3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5分钟，而后在0.2×SSC中室温洗5分钟，玻片甩干后进行扫描。芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行扫描。采用GenePix Pro 4.0图像分析软件(Axon Instruments公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化；最后用Ttest方法结合两倍差异的标准来确定差异表达基因。

5、差异基因的获得和分析

将每组芯片两次重复的共同差异基因进行5’单向测序，获得的EST序列采用Windows系统下的Staden Pachage(gap4)(http://staden.sourceforge.net)软件进行序列前处理以及拼接聚类。去掉载体、接头以及低质量序列和较短的序列。使用BLASTX(6 December 2005：BLAST2.2.13 released；http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)将处理后的EST序列在蛋白质水平上与NCBI非冗余蛋白质数据库(non-redundant protein database)进行同源性比较，结果克隆号为chip30h04的基因在YA/C杂交结果中均表现为上调基因，BlASTX注释为硫解酶thiolase基因，命名为丹参乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA acyltryansferase，SmAACT)基因。

6、cDNA末端快速扩增(5′-RACE和3′-RACE)

采用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)试剂盒进行扩增SmAACT的5′末端和3′末端的扩增，按照说明书进行操作。总RNA用Trizol(Invitrogene公司)试剂盒提取，步骤详见试剂盒操作手册。以设计的GSP1(5′-CATCGCCGCTTGCATACAAATAACA-CCC-3′)为5′RACE特异引物，进行cDNA 5′末端的扩增。PCR条件为94℃5min，94℃30s、68℃30s、72℃2min(35个循环)，72℃7min。扩增得到长约1800bp的特异性cDNA片段。根据SmAACT基因片段设计的3′RACE特异引物为：GSP2(5′-GGATGATTACTTGTCTGCCTCCTGGG-3′)，以GSP2为扩增引物，进行SmAACT cDNA3′末端的扩增。PCR条件为94℃5min，94℃30s、68℃30s、72℃1.5min(35个循环)，72℃7min。扩增出约600bp的DNA片段。琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara公司)回收目的片段，按pMD19T载体(Takara公司)试剂盒操作手册将上述片段克隆至pMD19-T载体中，鉴定阳性克隆并测序(北京三博远志生物有限公司)。

通过cDNA杂交所得EST序列和5’-RACE获得的部分片段测序结果，可得到序列表SEQID NO：1所示的丹参乙酰CoA酰基转移酶基因SmAACT全长cDNA序列，其所推导的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

7、全长cDNA的克隆和测序

根据5`RACE和3`RACE所得到的结果和芯片杂交获得的Unigene序列，从两端设计得到钩取SmAACT全长cDNA的引物，正向引物为：5`-GGGGGCAGCAGCATATTTCAGTCA-3`，反向引物为：5`-TACATGATCTGCCCTAAATAGTTG-3`；再以5`-RACE-Ready cDNA为模板，进行LA-PCR。琼脂糖凝胶电泳表明约在1600bp处出现特异片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收目的片段，按上述方法克隆至pMD19-T载体中(Takara)，鉴定阳性克隆并进行双向测序(北京三博远志生物有限公司)，用于原核表达载体的构建。

实施例3、SmAACT基因的生物信息学分析

本发明涉及的丹参乙酰CoA酰基转移酶基因全长cDNA的长度为1623bp，详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于126-1325bp。将丹参全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索，结果表明SmAACT与其他植物的乙酰CoA酰基转移酶同源性介于70.6％(水稻，NP-001041797.1)至84.0％(胡黄连，ABC74567)之间，具有高度的同源性，丹参SmAACT与烟草(AAU95618)、苏木(AAL18924)等的同源性也较高。根据蛋白质氨基酸序列多重比对结果可以看出，不同物种间氨基酸序列具有多处保守序列区域(motif)，所有的AACT都具有通用的一致氨基酸识别模式：N-x(2)-G-G-x-(LIVM)-(SA)-x-G-H-P-x-(GA)-x-(ST)-G，这是乙酰CoA酰基转移酶的重要功能域。根据植物乙酰CoA酰基转移酶蛋白进化树分析来看，新克隆的丹参SmAACT与拟南芥罗卡属(CAA55006)植物的亲缘关系较近，与胡黄连(ABC74567)、烟草(AAU95618)等的植物亲缘关系较远。

实施例4、茉莉酸甲酯处理后SmAACT基因表达与丹参酮IIA含量的分析

利用茉莉酸甲酯(100mM)处理丹参毛状根，收集不同时间点的材料用于丹参AACT基因表达量和丹参酮IIA的含量。AACT基因表达量采用荧光实时定量PCR。总RNA用Trizol(Invitrogene公司)试剂盒提取，步骤详见试剂盒操作手册。取1μg RNA模板按RT试剂盒(Takara公司)说明书反转录得到cDNA。Real-time定量PCR采用ABI Prism 7000SequenceDetection System(Applied Biosystems，USA)和SYBGREEN PCR Master Mix(AppliedBiosystems，UK)试剂盒，以丹参actin基因(GenBank登录号DQ243702)(引物序列actin-222：5’-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3’，actin-488：5’-AGGAACCACCGATCCAGACA-3’)作为对照，确证不同时间都符合要求而且cDNA的量都相差不多。AACT基因引物为：SmAACTF5’GCCCTTGTCTTGAACTCGTGTAATCCTA 3’，SmAACT R5’AATCTAATTCGCTCTGCTTCTCCATCTC 3’。按94℃ for 5min，(94℃ for 30sec，55℃ for30sec and 72℃ for 1min)40cycles，72℃7min的PCR条件进行扩增。结果表明：经过MJ处理后，SmAACT基因表达水平于24h内迅速升高，之后逐渐降低到对照组水平。经actin内参基因均一化之后，与对照组比较，处理后24h，MJ处理组是同时期对照组的2.3倍，说明丹参毛状根经茉莉酸甲酯处理后，SmAACT基因表达水平内迅速升高，从而有利于其编码的蛋白AACT催化2分子乙酰CoA发生缩合反应，推动代谢流向目的产物丹参酮类成分流动。

采用HPLC测定丹参酮IIA含量，色谱条件为：Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器，Millennium 32工作站，色谱甲醇(天津)；水为三重蒸馏水，氯仿(分析纯)，无水乙醇(分析纯)，丹参酮IIA(购自北京市药品检定所)。RP-Waters C18(150mm×3.9mm，5μm)柱，检测波长：270nm；柱温：30℃，其流动相条件为：流速1.0mL.min^-1，流动相为0.5％醋酸甲醇(A)和0.5％醋酸水(B)线性梯度洗脱：0～25min，30％～60％A；25～30min，60％～65％A；30～50min，65％～70％A；50～60min，70％～80％A；60～61min，80％～30％A。结果显示：经过MJ处理后5d，丹参酮类成分含量迅速上升，处理后第5d，丹参酮IIA成分是对照组的1.3倍，处理后第10d，丹参酮IIA成分含量是对照组的5.4倍；处理后第15d，丹参酮IIA成分含量是对照组的6.1倍。结果表明：丹参毛状根经茉莉酸甲酯处理后，丹参AACT基因表达量能被显著的诱导表达，且伴随丹参酮IIA的迅速积累。由上推测所得到的丹参AACT基因为丹参酮类成分生物合成途径的关键酶基因。

实施例5、根癌农杆菌介导AACT基因遗传转化丹参获得转基因丹参植株

1.Gateway过表达载体的构件：

设计扩SmAACT基因全长的引物(SmAACT-B1：TTCTAATACGACTCACTATAGGGCA；SmAACT-B2：CAATAACTCTACCTAAGGACCAAAG)。应用高保真酶进行PCR，将产物切胶回收。

BP反应

PCR产物	50-100ng(3.5uL)
		PDONR221	50-100ng(0.5uL)
BP Clonase酶	1.0uL(用前轻轻混合下)

A.反应体系置25度温育12小时(PCR仪)，

B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应。

C.将BP反应产物经过DH5α克隆

D.含40ug/ml kan(卡那霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证，提质粒。

LR反应

BP反应质粒	50-150ng(3.5uL)
		PH7WG2D载体	150ng(0.5uL)
LR Clonase酶	1.0uL(用前轻轻混合下)

A.反应体系置25度温育12小时(PCR仪)，

B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应。

C.将BP反应产物经过DH5α克隆

D.含50ug/ml Spe(壮观霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证。

提质粒并通过电击转化的方法转入农杆菌中。

2、根癌农杆菌介导AACT基因转化丹参

2.1外植体预培养

选取10d的丹参无菌苗，将叶片剪成0.5×0.5cm²的小块，用刀将叶表面划伤，以背面向上方式将叶片置于MS固体培养基上，于25℃光照16h，黑暗8h条件下预培养2d。

2.2农杆菌活化扩增

4℃保存的平板上挑取单菌落于新的含50mg/L Rif和80mg/L Spe的YEB培养基上，划线，挑取单菌落接种于15ml含50mg/L Rif和80mg/L Spe的YEB液体培养基中，于28振荡培养至OD2600.5左右(250rpm，23h)，保菌，将菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10min，弃上清，用等体积的MS液体培养基重悬沉淀菌体，用于侵染。

2.3侵染及共培养

将预培养材料放入MS重悬液中，侵染10min，取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放入新的MS固体培养基上，暗培养48-72h。

2.4选择培养

将共培养的外植体用无菌水清洗3次，400mg/L cef水浸泡5min左右，无菌水清洗1次，吸干水分后移入含2mg/L Hyg和400mg/L cef的MS固体培养基上，与黑暗中进行筛选培养。每7天更换一次培养基，选择生长迅速至2-3cm的抗性毛状根，将其切下，单独标号转入2mg/LHyg和400mg/L cef的MS培养基上，将除菌后的阳性根转入2mg/L Hyg的MS培养基继代。

2.5进一步筛选确定

毛状根经过绿色荧光显微镜检测(GFP)，再经过特异引物PCR检测目的基因是否插入植物基因组，选择阳性株系进行放大培养(6，7-V培养基)。

实施例6、转基因丹参植株的PCR检测

根据SEQ ID No.1基因的ORF序列设计SmAACT基因的双向引物对目的基因进行检测。结果表明，转AACT丹参株系在1200bp处扩增出特异DNA片段，而以非转化丹参基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化丹参的含AACT基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化丹参，获得经PCR检测的转基因丹参植株。

实施例7、转基因丹参中丹参酮类成分含量测定

生长45d的丹参毛状根37℃干燥，研磨成粉，100mg加4ml甲醇，4℃浸泡过夜，超声30min，离心(3000rpm，3min)，上清取出液氮吹干，加入1ml甲醇复溶，过0.22um滤膜。采用HPLC测定二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量，色谱条件为：Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器，Millennium 32工作站，色谱甲醇(天津)；水为三重蒸馏水，氯仿(分析纯)，无水乙醇(分析纯)，二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA(购自北京市药品检定所)。RP-Waters C18(150mm×3.9mm，5μm)柱，检测波长：270nm；柱温：30℃，其流动相条件为：流速1.0mL.min^-1，流动相为0.5％醋酸甲醇(A)和0.5％醋酸水(B)线性梯度洗脱：0～25min，30％～60％A；25～30min，60％～65％A；30～50min，65％～70％A；50～60min，70％～80％A；60～61min，80％～30％A。在该色谱条件下对丹参毛状根丹参酮类成分进行含量测定。

结果表明，在过表达SmAACT基因的转基因发根高产株系中二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量比非转基因对照组分别提高：1.1、1.8、1.6、2.6倍。检测结果证明，丹参SmAACT基因对促进丹参酮类含量的提高有明显作用，SmAACT基因可用于利用转基因技术来提高丹参酮含量的研究和产业化中，具有很好的应用前景。

序列表

<110>中国中医科学院中药研究所

<120>一种丹参乙酰CoA酰基转移酶(Sm AACT)基因的分析及应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1623

<212>DNA

<213>丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)

<220>

<221>CDS

<222>(126)..(1325)

<400>1

ttctaatacg actcactata gggcaagcag tggtatcaac gcagagtacg cgggattctc    60

gcttaatata ttctttattg gctgctccat ttttatcagg ctttaatttt gctcaaaagt    120

tgatcatggc accagaagct gcttcaatca acccaaaaga tgtttgcatc gtgggtgttg    180

ctcggacacc tatgggtggt tttctcggtt cactctcatc agtaccggca accaagcttg    240

gatccgtagc tattcagagt gctttgaaga gagcaaatat cgatccatca cttgtacaag    300

aagttttctt cgggaatgta ctcagcgcaa acttaggaca ggctcctgcc cgtcaggcag    360

cgttgggtgc cgggatcccg aattcagtag tctgtacaac catcaacaaa gtctgtgcct    420

ctggaatgaa agcaactatg ctagcagcgc aaagtatcca gttgggtctc aatgatgttg    480

tagtggccgg tggcatggag agcatgtcta atgtcccaaa atacatcgca gaggcgagga    540

aaggatctcg acttggacac gactctcttg ttgatggaat gctgaaggac ggactctggg    600

atgtttacaa cgatgttggc atgggtgtct gtgctgaatt atgcgctgag caccatagca    660

ttacgagaga gcagcaggac gattttgctg tccaaagttt cgagcgtgga attgctgctc    720

aagatgtcgg tgcctttgcg tgggagatta ctccagtcga agtatccggt gggagaggac    780

gaccatccac cattgttgac aaggatgaag gtcttggaaa gtttgatgct gcaaagttga    840

ggaagctaag accgagtttc aaggaaaccg gtggaactgt cacagccggc aacgcttcta    900

gcataagcga tggtgccgct gctcttgttt tagtaagcgg acagaaagct ctggagctcg    960

ggcttacggt cattggaaag atctccggat atgctgatgc cgctcatgcc ccggaactgt    1020

ttacgactgc cccggctctt gcaattccca aggcactcaa gaatgctggt ttggaagcat    1080

ctaaagtgga ctattacgaa atcaatgaag cttttgcggt cgtggctctt gctaatcaga    1140

agctattgga tcttagtccg gaaagagtta acgtacacgg tggagctgtg tctctagggc    1200

atcctctcgg ttgcagtggc gctcgtatct tggtcactct cttgggggtt ttgaggcaaa    1260

agaacgcaag tatggcgttg gtggcgtttg caacggagga ggaggcgcct cggcccttgt    1320

cttgaactcg tgtaatccta ccttgtttgt gatttcgttg ggacgacgcg actggcagcg    1380

gagcagcctt tgaagagatg gagaagcaga gcgaattaga ttaatctgta catcttcagt    1440

cttagatgag ttttactgtg ttattttctt ttcttcagca taatttgact tagatagata    1500

gtagagaaga tggtgtttct gatcatatgc tggtgtactt tatctccata atgtaccggc    1560

gcgaatcctg aatccttagt cactgcaggc gcgatcagct ttggtcctta ggtagagtta    1620

ttg                                                                  1623

<210>2

<211>399

<212>PRT

<213>丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)

<400>2

Met Ala Pro Glu Ala Ala Ser Ile Asn Pro Lys Asp Val Cys Ile Val

1               5                   10                  15

Gly Val Ala Arg Thr Pro Met Gly Gly Phe Leu Gly Ser Leu Ser Ser

            20                  25                  30

Val Pro Ala Thr Lys Leu Gly Ser Val Ala Ile Gln Ser Ala Leu Lys

        35                  40                  45

Arg Ala Asn Ile Asp Pro Ser Leu Val Gln Glu Val Phe Phe Gly Asn

    50                  55                  60

Val Leu Ser Ala Asn Leu Gly Gln Ala Pro Ala Arg Gln Ala Ala Leu

65                  70                  75                  80

Gly Ala Gly Ile Pro Asn Ser Val Val Cys Thr Thr Ile Asn Lys Val

                85                  90                  95

Cys Ala Ser Gly Met Lys Ala Thr Met Leu Ala Ala Gln Ser Ile Gln

            100                 105                 110

Leu Gly Leu Asn Asp Val Val Val Ala Gly Gly Met Glu Ser Met Ser

        115                 120                 125

Asn Val Pro Lys Tyr Ile Ala Glu Ala Arg Lys Gly Ser Arg Leu Gly

    130                 135                 140

His Asp Ser Leu Val Asp Gly Met Leu Lys Asp Gly Leu Trp Asp Val

145                 150                 155                 160

Tyr Asn Asp Val Gly Met Gly Val Cys Ala Glu Leu Cys Ala Glu His

                165                 170                 175

His Ser Ile Thr Arg Glu Gln Gln Asp Asp Phe Ala Val Gln Ser Phe

            180                 185                 190

Glu Arg Gly Ile Ala Ala Gln Asp Val Gly Ala Phe Ala Trp Glu Ile

        195                 200                 205

Thr Pro Val Glu Val Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Ser Thr Ile Val

    210                 215                 220

Asp Lys Asp Glu Gly Leu Gly Lys Phe Asp Ala Ala Lys Leu Arg Lys

225                 230                 235                 240

Leu Arg Pro Ser Phe Lys Glu Thr Gly Gly Thr Val Thr Ala Gly Asn

                245                 250                 255

Ala Ser Ser Ile Ser Asp Gly Ala Ala Ala Leu Val Leu Val Ser Gly

            260                 265                 270

Gln Lys Ala Leu Glu Leu Gly Leu Thr Val Ile Gly Lys Ile Ser Gly

        275                 280                 285

Tyr Ala Asp Ala Ala His Ala Pro Glu Leu Phe Thr Thr Ala Pro Ala

    290                 295                 300

Leu Ala Ile Pro Lys Ala Leu Lys Asn Ala Gly Leu Glu Ala Ser Lys

305                 310                 315                 320

Val Asp Tyr Tyr Glu Ile Asn Glu Ala Phe Ala Val Val Ala Leu Ala

                325                 330                 335

Asn Gln Lys Leu Leu Asp Leu Ser Pro Glu Arg Val Asn Val His Gly

            340                 345                 350

Gly Ala Val Ser Leu Gly His Pro Leu Gly Cys Ser Gly Ala Arg Ile

        355                 360                 365

Leu Val Thr Leu Leu Gly Val Leu Arg Gln Lys Asn Ala Ser Met Ala

    370                 375                 380

Leu Val Ala Phe Ala Thr Glu Glu Glu Ala Pro Arg Pro Leu Ser

385                 390                 395

Claims (9)

1、一种与丹参二萜醌类化合物合成有关的基因SmAACT(Salvia Miltiorrhiza Bge.Acetoacetyl-CoA Thiolase)，它是下列核苷酸序列之一：

1)SEQ ID No.1的DNA序列；

2)由SEQ ID No.1通过一个或几个核苷酸的添加、删除、取代而得到的序列，其编码与SEQ ID No.2相同功能的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：所述丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT)基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：该基因的读码框位于126-1325位核苷酸。

4、一种由权利要求1所述的基因SmAACT编码的蛋白质。

5、根据权利要求4所述蛋白质，其特征在于：它的氨基酸残基序列为SEQ ID No.2。

6、含有权利要求1所述基因全序列或部分片段的重组载体。

7、含有权利要求1所述基因全序列或部分片段的宿主细胞。

8、含有权利要求1所述基因的转基因细胞系。

9、权利要求1所述基因在丹参药材鉴定及育种中的应用。