CN109628422A

CN109628422A - 一种苦皮藤酰基转移酶18466及其基因序列

Info

Publication number: CN109628422A
Application number: CN201910091385.XA
Authority: CN
Inventors: 乔建军; 秦小淯; 闫晓光; 张雷; 李伟国; 梁冬梅
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2019-04-16

Abstract

本发明公开了一种苦皮藤酰基转移酶18466及其基因序列，该基因全长1383bp，编码461个氨基酸，酶蛋白分子量大小为54KDa，以pET28a大肠杆菌蛋白表达质粒为载体，以大肠杆菌BL21为宿主，实现了苦皮藤酰基转移酶18466的异源表达，以香叶醇为底物酰基化生成单萜酯化合物。因此研究酰基转移酶的功能及其序列特征对萜类化合物的酯化物具有重要意义。

Description

一种苦皮藤酰基转移酶18466及其基因序列

技术领域

本发明属于酶基因工程及酶工程领域，具体涉及一种来源于苦皮藤(Celastrμsangμlatμs)的酰基转移酶18466以及基因序列C-18466。

背景技术

萜类化合物是化学结构和构象最为复杂的天然产物，目前发现的萜类化合物有80000种左右，占据天然产物的三分之一，广泛分布于植物和微生物中。萜类化合物的生物合成需要的最基本的结构单元是二甲基烯丙基焦磷酸Dimethylallyl diphosphate，DMAPP和异戊烯基焦磷酸Isopentenyl diphosphate，IPP来自于甲羟戊酸途径和脱氧木酮糖磷酸酯途径。不同数量的DMAPP和IPP首尾聚合再经过特殊的萜合酶的催化形成单萜(C₁₀)倍半萜(C₁₅)和二萜(C₂₀)等天然产物。单萜类化合物是萜类化合物中结构和种类最丰富的一种，已经被广泛应用于生物制药、天然绿色农药杀虫和杀菌剂、燃料替代品和食品级香料和调味剂等行业开发使用。香叶醇是一个非环单萜醇类化合物，它是玫瑰油、马丁香油和香茅油等香精油的主要成分之一。香叶醇及其酯广泛用作日用香精和食用香精，是玫瑰系香精的主剂，用于配制日用产品和食品。

在植物生长发育过程中存在着各种次生代谢产物的修饰过程，如氧化还原、糖基化、甲基化、羟基化和酰基化反应过程。其中酰基化是修饰植物次生代谢产物的一个至关重要的过程，能改变次级代谢物的挥发性、极性、化学稳定性和生物活性。该过程需要酰基转移的催化。酰基转移酶是一类具有多功能的蛋白质大家族，不同的酰基转移酶对生物体的遗传、基因的表达、物质代谢和信号传导等过程起重要的作用。因此研究酰基转移酶的功能及其序列特征对萜类化合物的酯化物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种苦皮藤酰基转移酶18466及其基因序列，还提供了包含本发明基因的质粒及包含该表达质粒的宿主细胞，并利用宿主细胞(重组菌)诱导表达该苦皮藤酰基转移酶18466，以香叶醇为底物酰基化生成单萜酯化合物。

本发明的技术方案是：

一种苦皮藤酰基转移酶，记为18466，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码上述苦皮藤酰基转移酶18466的基因，记为C-18466，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

一种重组质粒，记为pET28a-His6-18466，含有编码苦皮藤酰基转移酶18466的基因，诱导型启动子T7，6个组氨酸筛选标签。

一种重组菌，记为BL21/pET28a-His6-18466，含有上述重组质粒。

本发明的有益效果是：本发明一种苦皮藤酰基转移酶18466及其基因序列，该基因全长1383bp，编码461个氨基酸，酶蛋白分子量大小为54KDa，以pET28a大肠杆菌蛋白表达质粒为载体，以大肠杆菌BL21为宿主，实现了苦皮藤酰基转移酶18466的异源表达，以香叶醇为底物体外酰基化生成乙酸香叶酯和苯甲酸香叶酯，对单萜酯的生产及运用具有重要意义，同时该基因的获得对植物萜类酰基化修饰机制和生物胁迫机理研究奠定基础。

附图说明

图1为BL21/pET28a-His6-18466重组大肠菌株验证DNA琼脂糖凝胶图谱(目的条带大小为1383bp)；

M：标准DNA分子尺；泳道1为C-18466基因DNA样品；

图2为BL21/pET28a-His6-18466重组大肠菌株验证蛋白表达SDS-Page凝胶图谱(目的蛋白分子量大小为54kDa)；

图3为BL21/pET28a-His6-18466酰基转移酶体外酰基化产物GC-MS图谱；

A为酰基化产物的GC图谱；B为保留时间8.41min峰的质谱图和NIST14谱库中乙酸香叶酯质谱图比较；C为保留时间14.00min峰的质谱图和NIST14谱库中苯甲酸香叶酯质谱图比较。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明倍半萜合成酶基因来源于苦皮藤植株，植物在2017年5月11日采集于陕西省杨凌示范区西北农林大学博览园。

选用新鲜采集的苦皮藤植株进行RNA提取，并通过反转录PCR获得其cDNA序列，构建cDNA文库。使用PacBio ISO-Seq平台进行测序，通过在Interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro)中进行BLAST比对获得具有BAHD family结构域的目的基因。以cDNA序列为模板，设计引物扩增C-18466基因序列，并通过酶切连接到pET28a-His6-18466质粒上，转化获得BL21/pET28a-His6-18466大肠宿主(E.coli BL21)表达质粒，实现苦皮藤酰基转移酶18466的高效表达。

实施例1.所述的BL21/pET28a-His6-18466菌株苦皮藤酰基转移酶18466的克隆及表达。

采用RNAprep pure Plant Kit提取苦皮藤总RNA。采用Clontech SMARTer PCRcDNA Synthesis Kit合成第一链cDNA，第一链cDNA经过PCR扩增合成第二链cDNA，然后双链DNA经过二次PCR扩增后，用于SMRTbell建库，并采用PacBio ISO-Seq平台进行测序。

根据测序获得的C-18466基因序列SEQ ID NO.2，设计引物扩增目的基因，引物序列如下：

引物C-18466-F:5'CGCGGATCCCATGGGCGGATCCGCCAG 3'(SEQ ID NO.3)

引物C-18466-R：5'CCGCTCCTCGAGTAAAGCGCTGATGATCAGAC 3'(SEQ ID NO.4)

以反转录获得的cDNA序列为模板，采用上述引物，PCR扩增C-18466基因序列。反应体系为50μl，包括ddH₂O 18μl，dNTP mixtμre 1μl,C-18466-F引物1μl，C-18466-R引物1μl，DNA模板1μl，2×Phanta Max 25μl，Fidelity DNA polymerase 1μl。扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃终延伸5min。

PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶检测条带大小，用Μniversal DNA PurificationKit回收目的片段。

用NcoI和XhoI酶切纯化的DNA片段和pET28a质粒，酶切后的产物经过ΜniversalDNA Purification Kit回收得到酶切片段，经过T4DNA ligase连接酶进行连接，得到重组质粒。酶切体系为：NcoI 1.5μL，XhoI 1.5μL，DNA片段或质粒42μL，cut smart buffer 5μL。37℃水浴2h。连接体系为：目的酶切基因片段7μL与酶切质粒1μL，T4连接酶1μL，10×T4ligase bμffer1μL。16℃过夜连接。

采用大肠杆菌电转化法，进行BL21转化，操作步骤如下：

(1)大肠BL21的感受态标准规格每管含有100μL感受态细胞(取出置于冰上)。

(2)1.5mL EP管中加入2μL连接产物和80μL感受态细胞，轻轻混合均匀，置于冰中预冷5min，再转入预冷的电击杯中2.5kV电击，电击参数一般在3.5ms左右。

(3)取1mL LB培养基加入电转杯，轻轻吸打，并转至1.5mL离心管中，37℃下复苏培养45-60min。

(4)复苏后，5000rpm，离心1min，弃上清，留100μl，用涂布棒将菌液涂布于含100μg/mL kana抗性LB固体培养基上。37℃培养箱倒置培养10-14h。

(5)从恒温培养箱中将已出现菌落的平板取出，随机挑选10个单菌落(直径≥1mm)分别混匀于10μL ddH₂O中。取7μL混于100μL kana LB培养基中，剩余3μL作为PCR模板，将对应菌液标号。配12管上、下引物与taq mix酶的混合体系，每个模板中加入7μL混合液，进行PCR。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选含有目标转化子的单菌落。

结果表明(如图1所示)：挑选的转化子在1200bp和2000bp之间有单一条带，证明转化子为阳性克隆子。

实施例2.重组蛋白的大量表达及纯化

由于载体His标签和目的蛋白的融合表达，可利用Ni-NTA层析柱，纯化蛋白。

粗提蛋白

(1)活化菌种：取50μL甘油菌接种于含50μg/mL kana的50mL LB培养基中，37℃，180rpm过夜培养12h。

(2)发酵：将过夜培养物按1:100转接于含50μg/mL kana的200mL LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8(3h左右)。

(3)诱导：IPTG加至最适浓度，在一定温度下150rpm诱导一定时间。

(4)收集菌体：50mL离心管中加入发酵液，6000rpm离心5-10分钟，弃上清，加入8mLPBS(pH 7.4)重悬菌体。

(5)破碎前，加入0.1M PMSF蛋白酶抑制剂至终浓度1mM，同时加入100mg/mL溶菌酶至终浓度1mg/mL，混合摇匀。

(6)将菌体置于冰上，超声破碎仪破碎细菌，超声功率20W，超5s，停5s，持续30min，至样品变得清亮透明。

(7)向破碎的细胞中分别加入RNase A至终浓度10μg/mL并加入DNase I至终浓度5μg/mL，充分混匀，冰浴15min。

(8)离心：4℃，12000rpm离心15min，将上清转管，置于冰上备用，(离心前取总蛋白样，离心后取上清液和沉淀样)。

纯化蛋白

(1)层析柱处理：填料4mL；用平衡液清洗，多次混匀，12000rpm离心10min至无酒精味；用完后用10-15mL的平衡液洗，最后加20％乙醇保存。

(2)将平衡好的层析柱填料倒入破碎蛋白上清中(50mL离心管)，再加入30mLbinding buffer，颠倒混匀，置水平摇床冰浴结合1小时。(离心管横放，平置冰盒底)

(3)洗涤：将binding后的混合物转移到柱子中(4℃冰箱)，待柱子中液体快滴完时，用200mL wash buffer滴洗，1.5h左右。用考马斯亮蓝(EP管中装50μl)检测滴下的液体是否含有杂蛋白，当没有杂蛋白时即停止洗柱子。

(4)加入10mL Elution Buffer，4℃冰箱静置15min，收集15管(1.5mL EP管，每管收集500μl左右)洗脱液，同时用考马斯亮蓝检测蛋白浓度，EP管中装50μl考马斯亮蓝，加入5μl洗脱液。最后选取浓度大的7管，总体积3mL。(从中选取20μl跑胶)

PD脱盐柱

用PD-10脱盐柱对蛋白进行脱盐，PD-10脱盐柱预装Sephadex G-25填料可用于除去小分子化合物，主要借助于填料的孔径，分子量小的渗透在孔内，分子量大的先被洗脱下来。

PD-10脱盐柱预处理：用25mL平衡液洗柱，弃流出液。

将含蛋白浓度较高的洗脱液合并加入柱子内，静置15min，弃流出液。

取3ml平衡buffer加入脱盐柱，分6管收集洗脱液。测蛋白浓度，以100μL分装到PCR管中,-80℃备用。

蛋白洗脱后继续用平衡buffer洗脱盐柱，后用20％乙醇洗，4℃保存于20％乙醇。

SDS-PAGE结果表明(如图2所示)：纯化的蛋白在50KDa附近有单一条带，证明以表达出目的蛋白。

实施例3.体外酶促反应及GC-MS检测发酵产物

体外酶促反应

反应体系进行酰基转移酶的酶催化反应，加入100ng纯化后的可溶性蛋白，80μM苯甲酰-CoA/乙酰-CoA和100μM香叶醇于500μL磷酸缓冲液(pH7.8)31℃反应1.5h。然后将反应混合物用正己烷(500μL)萃取，得的酶催化反应产物通过GC-MS分析。

(1)GC-MS检测方法

色谱柱：TG-5MS；离子源；EI，70eV；进样量：1μL；进样温度：200℃；检测器温度：280℃；柱温：240℃；程序升温：初始温度70℃，10℃/min升温到280℃，维持5min。

结果表明(如图3所示)：GC-MS谱图中的目标峰，经过与NIST14数据库中的参考质谱数据比较发现，BL21/pET28a-His6-18466菌株发酵表达蛋白酶催化产物8.41min的色谱峰为乙酸香叶酯。在保留时间14.00min的色谱峰为苯甲酸香叶酯。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的若干改进或变形，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，也应视为在本发明的专利保护范围内。

<110> 天津大学

<120> 一种苦皮藤酰基转移酶18466及其基因序列

<130>

<160> 4

<170>

<210> 1

<211> 461

<212> PRT

<213> 苦皮藤

<400> 1

Met Gly Gly Ser Ala Ser Pro Pro Thr Ser Leu Val Phe Lys Val His

1 5 10 15

Arg Asn Glu Pro Glu Leu Ile Ser Pro Ala Lys Pro Val Pro Arg Glu

20 25 30

Leu Lys Leu Leu Ser Asp Ile Asp Asp Gln Glu Gly Leu Arg Phe His

35 40 45

Ile Pro Val Ile Gln Leu Tyr Arg Tyr Asn Pro Ser Met Lys Gly Lys

50 55 60

Asp Pro Ala Lys Val Val Lys Glu Ala Leu Ala Lys Ala Leu Val Phe

65 70 75 80

Tyr Tyr Pro Phe Ala Gly Arg Leu Arg Glu Gly Pro Gly Arg Lys Leu

85 90 95

Thr Val Asp Cys Asn Gly Glu Gly Ile Leu Phe Val Glu Gly Asp Ala

100 105 110

Asp Val Ser Ile Glu Glu Phe Gly Glu Ala Leu His Pro Pro Phe Pro

115 120 125

Cys Leu Glu Glu Leu Ile Phe Asp Val Pro Gly Ser Ser Ala Val Leu

130 135 140

Asn Ser Pro Leu Ile Leu Val Gln Val Thr Arg Leu Arg Cys Gly Gly

145 150 155 160

Phe Ile Leu Ala Leu Arg Leu Asn His Thr Met Ala Asp Ala Pro Gly

165 170 175

Leu Val Gln Phe Met Ser Ala Val Gly Glu Met Ala Arg Gly Ala Thr

180 185 190

Val Pro Ser Leu Gln Pro Val Trp His Arg His Val Leu Phe Ala Arg

195 200 205

Asp Pro Pro His Val Thr Arg Thr His Arg Glu Tyr Asp Glu Val Pro

210 215 220

Asp Thr Lys Gly Thr Ile Ile Pro Leu Asp Glu Met Ala His Arg Ser

225 230 235 240

Phe Phe Phe Gly Pro Thr Glu Ile Ser Ala Ile Arg Arg Phe Val Pro

245 250 255

Pro His Leu Arg Asn Cys Ser Thr Phe Glu Ile Leu Thr Ala Cys Leu

260 265 270

Trp Arg Leu Arg Thr Ile Ala Leu Arg Pro Asp Pro Glu Glu Glu Met

275 280 285

Arg Ile Ile Cys Ile Ile Asn Ala Arg Gly Lys Ser Asn Ser Pro Ile

290 295 300

Pro Lys Gly Tyr Tyr Gly Asn Ala Phe Ala Phe Pro Val Ala Val Ala

305 310 315 320

Ser Ala Lys Glu Leu Arg Asp Asn Pro Leu Gly Phe Ala Leu Glu Lys

325 330 335

Val Arg Glu Val Lys Ala Gly Val Asp Gly Glu Tyr Met Lys Ser Val

340 345 350

Ala Asp Leu Met Val Val Lys Gly Arg Pro His Phe Thr Val Val Arg

355 360 365

Ser Tyr Leu Val Ser Asp Val Thr Arg Ala Gly Phe Gly Glu Met Asp

370 375 380

Leu Gly Trp Gly Met Pro Ala Tyr Gly Gly Pro Ala Lys Gly Gly Val

385 390 395 400

Gly Ala Ile Pro Gly Val Ala Ser Phe Tyr Ile Pro Leu Lys Asn Asn

405 410 415

Lys Gly Glu Glu Gly Ile Leu Val Pro Leu Cys Leu Pro Ala Pro Ala

420 425 430

Met Glu Arg Phe Glu Lys Gln Leu Gly Gly Met Leu Lys Asp Gln Asn

435 440 445

Thr Ser Ser Ser Ser Leu Ile Ile Ser Ala Leu Leu Glu

450 455 460

<210> 2

<211> 1383

<212> DNA

<213> 苦皮藤

<400> 2

atgggcggat ccgccagtcc tccgacctct ttagtgttca aagtgcaccg taatgagccg 60

gagttaatta gcccggccaa gcccgttccg cgtgagctga aactgctgag cgacatcgac 120

gatcaagaag gtctgcgttt tcacatcccc gttatccagc tgtaccgcta caatccgagc 180

atgaagggca aagatcccgc taaagttgtt aaggaagctt tagccaaggc actggtgttc 240

tactatccgt ttgccggtcg tttacgtgag ggtcccggtc gtaagctgac cgttgactgt 300

aacggcgagg gtattctgtt cgtggaaggt gatgcagacg tgagcattga ggagttcggc 360

gaagctttac atccgccgtt tccgtgttta gaagaactga tctttgatgt gccgggcagc 420

agcgcagtgc tgaacagtcc gctgatttta gtgcaagtta cccgtttacg ttgcggtggt 480

ttcattttag ctttacgtct gaatcacact atggctgatg caccgggtct ggtgcagttt 540

atgagcgcag ttggcgaaat ggcccgtggc gcaacagtgc cgagcttaca gccggtgtgg 600

caccgtcatg ttctgtttgc acgcgatccg ccgcacgtta cccgcacaca ccgcgaatac 660

gatgaggtgc cggacaccaa aggtaccatt atcccgctgg atgagatggc acaccgcagc 720

tttttcttcg gtccgaccga aatcagtgcc atccgccgct tcgttcctcc gcatttacgt 780

aattgcagca ccttcgagat tctgaccgct tgtttatggc gtctgcgcac aattgcctta 840

cgtcccgatc cggaggaaga aatgcgtatc atctgtatca tcaacgcccg cggcaaaagc 900

aacagcccga tcccgaaggg ctattatggc aacgcctttg cctttccggt ggccgtggca 960

agcgccaagg aactgcgcga taatccgctg ggcttcgctt tagaaaaagt gcgcgaagtg 1020

aaagccggtg tggatggcga atacatgaaa agcgtggccg atttaatggt tgtgaaaggt 1080

cgtccgcact tcaccgtggt tcgcagttat ttagtgagtg atgttacacg tgccggcttt 1140

ggtgaaatgg atctgggttg gggtatgccg gcatacggtg gtcccgctaa aggtggtgtt 1200

ggtgccattc cgggtgtggc cagtttttac attccgctga agaataacaa gggcgaagaa 1260

ggtattctgg tgcctctgtg tctgcccgct ccggctatgg aacgttttga aaagcagctg 1320

ggcggcatgc tgaaagatca gaataccagc agtagtagtc tgatcatcag cgctttactc 1380

gag 1383

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggatccc atgggcggat ccgccag 29

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcctcg agtaaagcgc tgatgatcag ac 32

Claims

1.一种苦皮藤酰基转移酶，记为18466，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述苦皮藤酰基转移酶的基因，记为C-18466，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组质粒，记为pET28a-His6-18466，其特征在于，含有权利要求2所述基因，T7启动子，6个组氨酸筛选标签。

4.一种重组菌，记为BL21/pET28a-His6-18466，其特征在于，含有权利要求3所述重组质粒。