CN101319220B - 一种丹参二萜合酶基因及其编码产物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种丹参二萜醌类化合物生物合成的二萜合酶基因，该基因为首次利用cDNA芯片技术从丹参中克隆而得，其全长cDNA长度为2601bp，其中开放阅读框位于106-2487位核苷酸，详细序列见SEQ ID No.1，编码793个氨基酸残基组成的蛋白质，见SEQ ID No.2。丹参二萜合酶是丹参二萜醌类化合物生物合成的一个关键酶，该基因控制着丹参二萜合酶的合成和表达，其表达量与丹参酮IIA含量密切相关。因此，该基因的克隆对于阐释丹参品质形成的分子机理及培育新品种具有重要的意义。

Description

一种丹参二萜合酶基因及其编码产物与应用

技术领域

本发明涉及利用cDNA芯片技术克隆二萜合酶基因及其编码产物与应用，尤其涉及丹参主要活性成分松香烷型二萜醌类化合物生物合成的二萜合酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。

背景技术

药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点(魏小勇，方花，李杰芬.植物中药功能基因研究.中草药，2005，36(8)：1251-1254)，这些基因的克隆将破解药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。

二萜类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一，在药用植物中很多活性成分如紫杉醇、丹参酮IIA、雷公藤甲、乙素等均为二萜类化合物。药用植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.为一味常用中药，素有“一味丹参，功同四物”的美称，具有活血化瘀，理气止痛的功效，是众多复方、保健品的主要成分。丹参主要含有两类活性成分：脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物。其中以丹参酮II A(tanshinone IIA)为代表的活性成分为松香烷型(abietane)二萜化合物(IkeshiroY，Mase I，Tomita Y.Abietane type diterpenoids from Salviamiltiorrhiza.Phytochemistry1989，28：3139-3141)。其中二萜合酶(diterpene synthase)，又称二萜环化酶(diterpene cyclase)被认为是合成萜类次生代谢终产物的关键酶(committed step)(Trapp SC，Croteau R.Genomic Organization of Plant Terpene Synthases and MolecularEvolutionary Implications.Genetics，2001，158：811-832)。二萜合酶基因的功能为催化二萜的共同前体牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(GGPP)形成具有特定立体结构的柯巴基焦磷酸(Capalylpyrophosphate，CDP)，进而形成结构多样的二萜类化合物。形成松香烷型母核的二萜环化酶已在冷杉、云杉等裸子植物中得到克隆和功能鉴定(Vogel BS，Wildung MR，Vogel G，Croteau R.Abietadiene Synthase from Grand Fir(Abies grandis).cDNA isolation，characterization，andbacterial expression of a bifunctional diterpene cyclase involved in resin acid biosynthesis.J BiolChem，1996；271：23262-23268)，但由于萜类环化酶的催化功能和基因结构在裸子植物和被子植物间存在显著差异(Martin DM，Faldt J，Bohlmann J.Functional Characterization of NineNorway Spruce TPS Genes and Evolution of Gymnosperm Terpene Synthases of the TPS-dSubfamily.Plant Physiology，2004，135：1908-1927)，不能仅通过序列相似性比较而确定其生化功能，常规的利用兼并引物克隆目的基因的策略也难以应用于该类基因的克隆。因此，丹参二萜合酶基因是首次得到的被子植物松香烷型二萜合酶基因，为丹参酮类成分合成的关键酶，但在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的丹参二萜合酶基因及其氨基酸序列。

植物基因克隆的方法有很多种，如功能克隆、表型克隆、定位克隆等。近年来，国外研究者采用经典的功能克隆法克隆到一些药用植物的关键酶基因，如紫杉醇合酶。然而在事先无目的蛋白或其相应基因定位的的情况下分离相关基因是相当困难的。因此，对于遗传背景不清，相关基因产物不明的情况下，表型克隆成为基因克隆的主要方法。基因芯片技术是20世纪80年代发展起来的一项高新技术，它可以对生物整个基因组的所有基因表达同时进行实时监测，作为一个全新的、强有力的技术平台，已广泛地应用于功能基因组的研究中，也成为挖掘新基因的强有力手段。cDNA芯片已在拟南芥、水稻、番茄、棉花等多个植物中得到了应用，但在药用植物功能基因研究中还没有相关报道。

发明内容

本发明提供了一种丹参cDNA芯片的制作、杂交、差异基因分析以及功能基因克隆的方法。

本发明提供了一种与丹参二萜醌类化合物合成有关的基因SmCPS(Salvia MiltiorrhizaBge copalyl pyrophosphate synthase)，它是下列核苷酸序列之一：

序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；

与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有一个或几个碱基突变，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

一种由上述基因SmCPS编码的蛋白质，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代且具有序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。

本发明SEQ ID No.1的DNA序列由2601个碱基组成，编码序列表中由793个氨基酸残基组成的蛋白质序列SEQ ID No.2。

本发明克隆基因SmCPS经茉莉酸甲酯诱导后，其表达量明显增加，伴随着丹参二萜醌类化合物如丹参酮IIA及隐丹参酮的快速积累。

含有本发明基因SmCPS的表达载体及细胞系也在本发明的保护范围之内。将SEQ ID No.1基因的cDNA克隆到原核表达载体pET30a的限制性内切酶KpnI和EcoRV位点间，得到表达载体，利用CaCl₂等方法即会得到含有该表达载体的大肠杆菌菌株。利用气相色谱-质谱联用技术，分析SmCPS基因的功能。研究结果表明，本发明与丹参二萜醌类化合物合成有关的基因具有二萜合酶基因的DXDD特征结构域，酶促反应分析发现该基因催化丹参二萜醌类化合物的早期合成步骤，对于培育高品质的药用植物品种特别是丹参具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1丹参CPS与其他植物CPS家族蛋白的分子进化树

10种CPS(copalyl diphosphate synthase)蛋白的物种来源为：番茄Sl(Solanum lycopersicum)、黄瓜Cs(Cucumis sativus)、烟草Nt(Nicotiana tabacum)、野甘草Sd(Scoparia dulcis)、笋瓜Cm(Cucurbita maxima)、玉米Zm(Zea mays)、拟南芥At(Arabidopsis thaliana)、琴叶巴豆Cs(Croton sublyratus)、水稻Os(Oryza sativa)；松香二烯合酶AS(abietadienesynthase)来源与北美冷衫Ag(Abies grandis)。

图2SmCPS实时荧光定量PCR结果

1-0d，2-1d，3-2d，4-3d，5-5d，6-15d

图3丹参受茉莉酸甲酯诱导后SmCPS表达量与丹参酮IIA含量相对变化曲线

图4酶促反应产物的GC-MS分析

A-GGPP标准品，B-CDP标准品，C-酶促反应产物。

具体实施方式

实施例1、丹参cDNA芯片的制作

1、丹参总RNA的分离和检测

取陕西商洛丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge)根2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至65℃预热的10mL提取缓冲液中(CTAB(W/V)2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol·L^-1，EDTA25m mol·L^-1，NaCl2.0mol·L^-1，PVP402％，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2％)，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10M LiCl，混匀后放置4℃沉淀过夜；7500g离心20分钟，沉淀用500μL SSTE(SDS0.5％，NaCl1mol·L^-1，Tris-HCl(pH8.0)10mmol·L^-1，EDTA1mmol·L^-1，在65℃溶解5分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70℃放置2h；4℃13000g离心20分钟，沉淀室温干燥10分钟后溶于100μL DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。

2、cDNA文库的构建

采用mRNA纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA PurifiCation Kit，Pharmacia公司)分离mRNA后，通过在cDNA分子两端加上EcoR I/Not I接头，在T4多核苷酸激酶的作用下磷酸化，与表达载体λZAP Express Predigested Vector(ZAP Express Predigested VectorKit，stratagene公司)连接，然后采用stratagene公司的ZAP Express Pridigested Gigapack CloningKits(EcoRI/CIAP-Treated)将包装蛋白在体外包装连接产物，感染E.coli XL1-Blue MRF’构建成cDNA文库。

3、cDNA芯片的制备

3.1PCR扩增

挑取分离良好的噬菌斑溶于100μL SM缓冲液(Amresco公司)中混匀后作为PCR模板。PCR扩增引物为λZAP Express多克隆位点两侧的部分序列：M13-20引物：5′-GTAAAACGACGGC CAGTG-3′，BK反向引物：5′-GGAAACAGCTATGACCTTG-3′。96孔板PCR反应体系，准备如下混合物：dNTP(25mmol·L-1)，600μL；Mg2+600μL，10×缓冲液1000μL；Taq(TakaraEx Taq，5U·μL^-1)，40μL；M13-20引物(12.5μmol·L-1)，200μL；BK反向引物(12.5μmol·L-1)200μL；高纯水补足至10mL。混合均匀后，用排枪分装至96孔PCR板。然后各加入6μL DNA模板，混合均匀。在ABI9700型基因扩增仪上进行PCR反应，反应条件为94℃预变性3分钟，然后进行35个循环，为94℃30s，54℃30s，72℃2分钟，循环结束后72℃后延伸5分钟。取3μL反应产物在含EB的1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，在SYNGENE型凝胶成像系统下观察、拍照。

3.2PCR产物纯化

使用96孔Multiscreen filter plates(Millipore公司)纯化板进行PCR产物的纯化。将1.4.1项下琼脂糖凝胶检测为单一条带的PCR产物(100μL)转入纯化板中；将纯化板放于Millipore的真空装置上，于15mmHg真空抽滤10分钟，直至抽干；加入100μL水，15mmHg真空抽滤10分钟，直至抽干；从真空抽滤装置上取下PCR纯化板，加入40μL(pH8.0左右)的水，将纯化板放至摇床上轻摇20～30分钟重悬DNA；将纯化产物吸出，置于酶标板上测定浓度和纯度；取1μL纯化产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测；将纯化产物真空干燥。

3.3cDNA芯片点制

根据上述测定的浓度差异加入适量50％DMSO作为点样液，调节浓度至约250ng·μL-1后，将样品转移至384孔板中准备芯片点制。点样仪为GeneMachine公司OmniGrid100。点样参数为：针：2×12，X：8000，Y：6000；点间距：300microns；点阵：13×14；点阵间距：500microns；矩阵模式：4×12。

实施例2：丹参二萜合酶基因的克隆

1、芯片杂交分析

丹参毛状根为发根农杆菌15834直接感染的方式进行Ri-质粒转化诱导的毛状根。取生长良好的丹参毛状根(各0.1g)继代培养于6，7V固体培养基上，置于25℃培养箱中暗培养，分别于30天、45天、60天收获复。将30天材料作为参照，分别与45天和60天的材料进行杂交，重复两次，每组均采用正反标记以消除染料的误差。

采用间接标记法进行探针标记，包括双链cDNA合成、T7介导的RNA体外转录合成cRNA、随机引物反转录、cDNA用KLENOW酶标记等步骤。

(1)双链cDNA合成：取5g总RNA，以T7—Oligo(dT)15，(5′-AAACGACGGCCAGTGAAT TGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3′，V可以是G、C和A，上海博亚生物技术有限公司)为引物，用cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)合成双链cDNA；双链合成以后用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化。

(2)体外转录合成cRNA：用T7RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(Promega公司)将双链cDNA进行体外转录合成cRNA；然后用RNeasy试剂盒(Qiagen公司)纯化。

(3)随机引物反转录：取2g cRNA，用SuperscriptII反转录酶，200U·μL^-1(Invitrogen公司)，9Random Primer进行反转录，反转录产物用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化。

(4)cDNA用KLENOW酶标记：取1g cRNA反转录产物，用随机引物进行KLENOW标记，标记产物用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化，纯化后抽干。标记过程中dATP，dGTP，dTTP使用浓度为120M，dCTP使用浓度为60M，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP使用浓度为40M。

将不同样品分别用cy3、cy5(Amersham公司)进行标记，然后溶于30L杂交液中(3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5分钟，而后在0.2×SSC中室温洗5分钟，玻片甩干后进行扫描。将不同样品分别用cy3、cy5(Amersham公司)进行标记，然后溶于30L杂交液中(3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5分钟，而后在0.2×SSC中室温洗5分钟，玻片甩干后进行扫描。芯片用LuxScan10K/A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行扫描。采用GenePix Pro4.0图像分析软件(Axon Instruments公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化；最后用Ttest方法结合两倍差异的标准来确定差异表达基因。

2、差异基因的获得和分析

将每组芯片两次重复的共同差异基因进行5’单向测序，获得的EST序列采用Windows系统下的Staden Pachage(gap4)(http://staden.sourceforge.net)软件进行序列前处理以及拼接聚类。去掉载体、接头以及低质量序列和较短的序列。使用BLASTX(6December2005：BLAST2.2.13released；http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)将处理后的EST序列在蛋白质水平上与NCBI非冗余蛋白质数据库(non-redundant protein database)进行同源性比较，结果克隆号为chip16g09的基因在60/30天杂交结果中表现为上调基因，B1ASTX注释为copalyl diphosphatesynthase(CPS)基因，命名为SmCPS，该片段具有终止密码子，为丹参CPS基因的3’末端。3、5`-RACE

采用SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)试剂盒进行扩增SmCPS的5’末端，按照说明书进行操作。总RNA用Trizol(Invitrogene公司)试剂盒提取，步骤详见试剂盒操作手册。根据上述CPS基因基因设计特异引物为：GSP1：5`-GCA TCCTCATAAGCCTCATTCCC-3`，进行cDNA5’末端的扩增。PCR条件为94℃5min，94℃30s，68℃30s，72℃3min(35个循环)，72℃7min。扩增出约1500bp的DNA片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收目的片段，按pMD19T载体(Takara)试剂盒操作手册将上述片段克隆至pMD19-T载体中，鉴定阳性克隆并测序(北京三博远志生物有限公司)。

通过cDNA杂交所得EST序列和5’-RACE获得的部分片段测序结果可得到序列表SEQID NO：1所示的丹参CPS基因全长cDNA序列，其所推导的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4、全长cDNA的克隆和测序

根据5`-RACE的结果和已知部分的序列，采用5`和3`末端引物直接扩增5`-RACE所逆转录的5`-RACE-Ready cDNA，使用LA Taq(Takara)进行LA-PCR方法扩增CPS全长序列。引物：CPS-F：5`-GGGCAAGCAGTGTATCAACGC-3`；CPS-R：5`-TTCCCGTGGCGACACAAACAA-3`。扩增出约2500bp片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收目的片段，按上述方法克隆至pMD19-T载体中(Takara)，鉴定阳性克隆并进行双向测序(北京三博远志生物有限公司)。

实施例3、SmCPS基因的生物信息学分析

本发明涉及的丹参二萜合酶基因全长cDNA的长度为2601bp，详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于106～2487bp。将丹参全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索，结果核苷酸水平没有发现同源性序列，可见利用常规的兼并引物克隆该基因难度很大。该基因在氨基酸水平上与野甘草Scoparia dulcis中的柯巴基焦磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase)基因有48％的同源性，且在370-373位置上具有二萜合酶基因的结构域DXDD。蛋白质进化树分析表明，丹参CPS基因与琴叶巴豆(Croton sublyratus)、野甘草(Scoparia dulcis)等亲缘关系较近，而与单子叶植物水稻、玉米等较远，与裸子植物的香烷型二萜合酶如北美冷杉的松香二烯合酶亲缘关系最远(图1)，表明所克隆到的丹参CPS基因为一个新基因。利用密码子分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对SmCPS基因的密码子使用频率进行分析，并依据该基因的密码子使用表改变部分碱基。利用生物信息学软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/VirtualRibosome/)和BLAST程序对突变后的基因序列进行分析，结果发现，其氨基酸序列保持不变，其仍具有DXDD结构域。

实施例4、茉莉酸甲酯处理后SmCPS基因表达与丹参酮II A含量的分析

利用茉莉酸甲酯(100mM)处理丹参毛状根，收集不同时间点的材料用于丹参CPS基因表达量和隐丹参酮的含量。CPS基因表达量采用荧光实时定量PCR。总RNA用Trizol(Invitrogene公司)试剂盒提取，步骤详见试剂盒操作手册。取1μg RNA模板按RT试剂盒(Takara公司)说明书反转录得到cDNA。Real-time定量PCR采用ABI Prism7000SequenceDetection System(Applied Biosystems，USA)和SYBGREEN PCR Master Mix(AppliedBiosystems，UK)试剂盒，以丹参actin基因(GenBank登录号DQ243702)(引物序列actin-222：5’-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3’，actin-488：5’-AGGAACCACCGATCCAGACA-3’)作为对照，确证不同时间都符合要求而且cDNA的量都相差不多。CPS基因引物为：SmCPS F5’GATCGGAAGACGCTGTA，3’SmCPS R5’TCGCCAAGAAATAGGAAA3’。按94℃for5min，(94℃for30sec，55℃for30sec and72℃for1min)40cycles，72℃7min的PCR条件进行扩增。结果表明：经过MJ处理后，SmCPS基因表达水平于24h内迅速升高，之后逐渐降低到对照组水平(图2)。经actin内参基因均一化之后，与对照组比较，处理后24h，MJ处理组是同时期对照组的5.8倍(图3)，说明丹参毛状根经茉莉酸甲酯处理后，SmCPS基因表达水平内迅速升高，从而有利于其编码的蛋白CPS催化GGPP的环化，推动代谢流向目的产物丹参酮类成分流动。

采用HPLC测定隐丹参酮含量，色谱条件为：Waters2695高效液相色谱仪，Waters2996二极管阵列检测器，Millennium32工作站，色谱甲醇(天津)；水为三重蒸馏水，氯仿(分析纯)，无水乙醇(分析纯)，隐丹参酮(购自北京市药品检定所)。RP-Waters C18(150mm×3.9mm，5μm)柱，检测波长：270nm；柱温：30℃，其流动相条件为：流速1.0mL.min^-1，流动相为0.5％醋酸甲醇(A)和0.5％醋酸水(B)线性梯度洗脱：0～25min，30％～60％A；25～30min，60％～65％A；30～50min，65％～70％A；50～60min，70％～80％A；60～61min，80％～30％A。在该色谱条件下对丹参毛状根丹参酮II A进行含量测定。结果显示：经过MJ处理后5d，丹参酮类成分含量迅速上升，处理后第5d，丹参酮IIA成分是对照组的1.3倍，处理后第10d，丹参酮IIA成分含量是对照组的6.3倍；处理后第15d，丹参酮IIA成分含量是对照组的6.9倍(图3)。结果表明：丹参毛状根经茉莉酸甲酯处理后，丹参CPS基因表达量能被显著的诱导表达，且伴随丹参酮IIA、隐丹参酮成分的迅速积累。可知所得到的丹参CPS基因为丹参酮类成分生物合成途径的关键酶基因。

实施例5、SmCPS基因原核表达分析

1、大肠杆菌表达载体的构建

依据丹参二萜合酶的全长cDNA序列(表1)，设计扩增完整开放阅读框的引物，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点KpnI和EcoRV。以全长cDNA片段为模板，经PCR扩增后，保证丹参二萜合酶基因的阅读框完全正确，并用KpnI和EcoRV内切酶进行酶切反应，回收目的片段2533bp；大肠杆菌表达载体pET30a用KpnI和EcoRV内切酶进行酶切反应，回收目的片段5kb。将经酶切的丹参二萜合酶基因的目的片段克隆至酶切过的pET30a表达载体上，转化大肠杆菌BL21，进行重组子的PCR鉴定和酶切鉴定。

2、蛋白表达的诱导

挑取蛋白接种于2mL的LB液体培养基(含卡那霉素)中，于37℃振荡培养过夜。次日按1：100稀释加入到50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.3-0.5，加入IPTG至终浓度0.5mM，诱导目标蛋白表达，继续于37℃摇床培养3-4小时。当细菌培养至OD₆₀₀为1.0时，10000rpm离心5分钟，弃上清，收集菌体。

3、丹参二萜合酶活性的分析

取上述菌体加入溶菌酶至终浓度为100μg/mL，然后加入1/10体积的Triton-100，30℃培养15分钟，冰浴条件下用超声波处理，12000rpm，4℃离心15分钟，上清液备用。取1ml上清液，加入0.25nmol的GGPP，55℃条件下反应2小时。用乙酸乙酯提取反应混合物，然后用GC-MS进行酶活分析，检测CDP是否存在，同时以未加入上清液的GGPP作为对照。结果表明，在酶溶液和GGPP存在的情况下，可以检测到CDP的存在(图4)。

4、丹参二萜合酶衍生物的活性分析

分别将SEQ ID No.1序列171bp处的G突变为C、1043bp处C突变为G、1992bp处T突变为A，得到各自衍生序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7。其编码氨基酸序列分别为SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8，经GC-MS进行酶活分析，发现均具备与SEQ ID No.2相同的生物学功能。

序列表

<110>中国中医科学院中药研究所

<120>一种丹参二萜合酶基因及其编码产物与应用

<160>8

<170>PatentIn version3.4

<210>1

<211>2601

<212>DNA

<213>丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge.)

<220>

<221>CDS

<222>(106)..(2487)

<400>1

<210>2

<211>793

<212>PRT

<213>丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge.)

<400>2

<210>3

<211>2601

<212>DNA

<213>丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge.)

<220>

<221>CDS

<222>(106)..(2487)

<400>3

<210>4

<211>793

<212>PRT

<213>丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)

<400>4

<210>5

<211>2601

<212>DNA

<213>丹参(Salvia mi ltiorrhiza Bge.)

<220>

<221>CDS

<222>(106)..(2487)

<400>5

<210>6

<211>793

<212>PRT

<213>丹参(Salvia mi ltiorrhiza Bge.)

<400>6

<210>7

<211>2601

<212>DNA

<213>丹参(Salvia mi ltiorrhiza Bge.)

<220>

<221>CDS

<222>(106)..(2487)

<400>7

<210>8

<211>793

<212>PRT

<213>丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)

<400>8

Claims (6)

1.一种二萜合酶基因SmCPS，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于：该基因的读码框为SEQ ID No.1的第106-2487位核苷酸。

3.一种由权利要求1所述的基因SmCPS编码的蛋白质，其氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。

4.含有权利要求1所述的基因的表达载体。

5.含有权利要求1所述的基因的转基因细胞系。

6.权利要求1所述的基因在丹参育种中的应用。

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