CN108795914A - 丹参倍半萜合酶基因SmTPS12、其克隆引物、表达载体、催化产物及应用 - Google Patents

丹参倍半萜合酶基因SmTPS12、其克隆引物、表达载体、催化产物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一条参与合成丹参次生代谢产物α‑金合欢烯的萜类合酶基因序列(SmTPS12)；本发明所提供的SmTPS12基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明基于丹参基因组信息获得SmTPS12基因序列，通过构建pGEX‑4T‑1‑SmTPS12原核表达载体并转化大肠杆菌，在大肠杆菌体内检测其催化产物，研究SmTPS12的生物学功能。结果表明SmTPS12具有催化合成α‑金合欢烯等化合物的功能。α‑金合欢烯可以作为柴油和化学品生产的前体化合物；广泛用于皂用、洗涤剂香精中和日化香精中。本发明为丹参功能性代谢化合物关联基因基因奠定研究基础，有利于开发商业开发和生物防治。

Description

丹参倍半萜合酶基因SmTPS12、其克隆引物、表达载体、催化产 物及应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学和植物基因工程技术领域，具体涉及一种参与合成丹参体内α-金合欢烯的倍半萜合酶的基因克隆、蛋白表达、产物鉴定及功能验证方法。
背景技术
萜类化合物是植物次生代谢产物中的主要成分之一，可以帮助植物抵御不良环境，可作为香料或调味剂，并具有显著生物活性，因此被广泛应于人类生产实践中。目前已鉴定的萜类化合物约有5万余种，多数萜类物质仅从植物中分离获得，且含量低微。
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科、鼠尾草属药用植物，其体内含有大量挥发性萜类化合物，其中有些成分具有温和香气，并在抗炎、抗焦虑等方面具有显著疗效。还有些成分可用于工业生产中，如α-金合欢烯可作为柴油和化学品生产的前体化合物，还可用于皂用、洗涤剂香精中和日化香精中。金合欢烯主要有顺-α-金合欢烯、反-α-金合欢烯和反-β-金合欢烯异构体，商用金合欢烯是这几种异构体的混合物。目前，α-金合欢烯面临巨大的市场需求。
在丹参基因组中，存在一类基因家族——萜类合酶(Terpene synthase，TPS)基因家族。TPS是萜类化合物合成途径的关键酶，主要分为单萜合酶、倍半萜合酶和二萜合酶。α-金合欢烯是一种倍半萜烯，研究丹参TPS(SmTPS)的生物学功能，鉴定到的催化α-金合欢烯合成的SmTPS，对于后续将这些基因及其产物用于工业产品开发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于研究丹参倍半萜合酶基因在丹参挥发性产物合成过程中的功能，提供一种参与α-金合欢烯合成的倍半萜合酶基因及其编码的蛋白质，其克隆引物、表达载体、催化产物及应用。
本发明的另一目的在于提供对倍半萜合酶基因SmTPS12的功能验证方法。
本发明提供的SmTPS12基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
本发明提供的SmTPS12基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明设计出了扩增SmTPS12基因的克隆引物，其碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。
构建表达载体pGEX-4T-1-SmTPS12，其碱基序列含SmTPS12基因的cDNA碱基序列。
本发明目的可通过如下技术方案实现：构建pGEX-4T-1-SmTPS12表达载体，转化至大肠杆菌表达菌株，以0.5mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)进行诱导蛋白表达；再通过固相微萃取技术和气质联用(GC-MS)技术检测基因在原核表达系统中的产物，获得SmTPS12的主要催化产物——α-金合欢烯。
本发明利用SmTPS12基因在大肠杆菌中合成了α-金合欢烯，该技术可以用于后续通过菌体发酵大量生产α-金合欢烯，对于满足α-金合欢烯面临的巨大市场需求提供有效方法。
附图说明
图1所示为SmTPS12在不同器官中的差异表达谱
图2所示为SmTPS12原核表达体系中GC-MS检测的产物结果
图3所示为SmTPS12原核表达体系中催化得到各产物的质谱图结果
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1 丹参SmTPS12的基因克隆及结构分析
1)采用RT-qPCR技术对丹参不同组织器官中SmTPS12基因进行差异表达检测。结果以柱状图的形式呈现，如图1所示。可以发现SmTPS12在丹参茎中显著高表达。
2)依据丹参基因组中的SmTPS12序列设计引物，以丹参cDNA为模板进行PCR扩增，获得长度为1599bp的核苷酸序列，如SEQ ID No.1。根据全长cDNA序列翻译后获得丹参SmTPS12基因编码的氨基酸序列，如SEQ ID No.2。
实施例2 丹参SmTPS12基因的原核表达体系构建及催化产物检测
1)选取Sma I/Xho I作为酶切位点，对SmTPS12和pGEX-4T-1载体进行酶切连接反应，构建pGEX-4T-1-SmTPS12基因表达载体
2)分别将pGEX-4T-1空载体和pGEX-4T-1-SmTPS12转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有50mg/L Amp(氨苄霉素)的LB固体培养基中筛选阳性克隆。挑选阳性克隆单菌落并接种于含相应抗生素(50mg/L Amp)的LB液体培养基中，培养过夜；再将培养液按1∶50进行转接及扩大培养，待菌液的OD600达到0.4-0.6之间时，加入0.5mM的IPTG，于25℃摇床中避光诱导20h，转速设为150r/min。
3)取10mL诱导后菌液置于20mL顶空瓶中，萃取温度为60℃，震荡频率为500rpm，萃取时间约为30min，以固相微萃取柱(萃取纤维PDMS，100μm)作为萃取头进行萃取。
4)GCMS仪器为岛津QP2010ultra(HP-5ms：30m×0.25mm×0.25μm)，直接由固相微萃取柱进样。热脱附温度280℃，脱附时间：3min。色谱条件：40℃保持2min，以10℃/min涨至300℃保持5min，氦气流速1ml/min。质谱条件：离子源温度200℃，接口温度250℃，scan模式采集45-500。比对NIST库，获得如下结果：相对于空载体(对照菌株)，含pGEX-4T-1-SmTPS12的菌株在8.492min出现产物β-罗勒烯，14.905min出现产物(Z，E)-α-金合欢烯，15.097min出现产物α-金合欢烯，其中以α-金合欢烯为主要产物，如图2所示。各产物质谱图如图3所示。
本发明对SmTPS12基因进行克隆、表达载体构建、产物检测及功能验证，发现SmTPS12在大肠杆菌中主要催化金合欢烯成分。本发明为实现快速高效合成α-金合欢烯用作工业原料提供基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种丹参萜类合酶(SmTPS12)编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所诉的丹参中与α-金合欢烯合成相关基因SmTPS12，其特征在于，所诉基因SmTPS12编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种原核表达体系检测基因产物的方法，其特征在于，将pGEX-4T-1-SmTPS12载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，氨苄霉素筛选，经扩大培养后，加入0.5mM的IPTG，于25℃摇床中，110r/min，避光诱导20h。诱导完成后，取10mL菌液在萃取温度60℃、震动频率500rpm，萃取时间约30min条件下，以固相微萃取柱(萃取纤维PDMS，100μm)作为萃取头进行萃取。利用GC-MS仪器进行产物检测。仪器型号：岛津QP2010ultra(Restek-5MS：30m×0.25mm id，filmthickness 0.25μm)。
4.权利要求1编码α-金合欢烯合成的酶基因在植物基因工程中的应用。其特征在于金合欢烯合成酶SmTPS12基因在细菌、真菌和高等植物中通过基因工程手段参与萜类化合物的合成。
5.权利要求4所述的应用中，外源基因导入宿主需要一种用于携带α-金合欢烯合成酶SmTPS12基因的质粒，其特征在于：质粒可选自pET系列、pGEX系列等原核表达载体，并含有权利要求1的核苷酸序列。
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