CN113308505A - 一种提高虫草素发酵产量的方法 - Google Patents

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王亮
李倩
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Abstract

本发明提供了一种提高虫草素发酵产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明是以可产虫草素的酿酒酵母工程菌为生产菌株，优化其发酵条件，在分批发酵对数生长中期添加0.2％‑0.6％(v/v)表面活性剂，改变酵母细胞膜通透性，增加具有细胞毒性的产物虫草素的发酵产量。本发明显著提高了虫草素的发酵产量，缩短了发酵时间，技术方案简单、环境友好、菌种遗传稳定性高。这对于虫草素的工业化生产具有重要的应用意义。

Description

一种提高虫草素发酵产量的方法
技术领域
本发明涉及工业微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高虫草素发酵产量的方法。
背景技术
虫草素(Cordycepin)，又称蛹虫草菌素，化学名3′-脱氧腺苷，是第一个从真菌中分离得到的核 苷类抗生素，作为蛹虫草菌的主要活性成分，因其具有抑菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等多种生物活性，使 得其在医药和保健食品的开发与应用方面具有巨大的研究价值和广阔的市场前景。
虫草素主要通过化学法和生物法两种途径获得：化学法原料成本高、合成工艺繁琐、产物收率低、 副产物多等劣势限制了其广泛应用；生物法具有原料成本低、工艺条件温和等优点，其中，液体发酵技术 具有空间利用率高、发酵过程容易控制、且产物生成目的性强等优势，逐渐成为虫草素的主要生产方式。 然而，蛹虫草菌发酵周期长，生产强度低，严重限制了虫草素的进一步发展及应用。因此，利用生长周期 短，高生产强度的酵母工程菌来实现虫草素的高效生产，对推动虫草素的生物学功能研究及工业化生产发 展具有重要意义。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为单细胞真核生物，因其具有遗传背景清晰、发酵周期短、 生物安全等优点，被众多研究学者青睐，酿酒酵母作为最常用的模式真菌，已经实现了多种代谢产物的异 源合成，其中包括青蒿酸、香紫苏醇、羽扇豆醇、麦角固醇等。
发明内容
本发明提供了一种提高虫草素发酵产量的方法。
本发明利用酿酒酵母作为底盘细胞，表达虫草素合成关键基因，异源合成虫草素。酿酒酵母在发 酵过程中，目标产物虫草素在胞内不断累积，增大了细胞毒性，同时增加酵母细胞的代谢负担。通过改变 细胞膜的通透性，促进细胞外的营养物质进入细胞内同时细胞内代谢产物分泌到细胞外，弱化细胞的反馈 抑制或反馈阻遏，增加目标产物的碳通量，进而增加目标产物的产量。
为达到上述目的，本发明以能够生产虫草素的酵母工程菌为生产菌株，在含有非离子型表面活性 剂的发酵培养基中发酵。
本发明可采用本领域已知的能够生产虫草素的酵母工程菌为生产菌株，优选以酿酒酵母S288C为 原始菌株构建可产虫草素的酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiaeSHC16(菌种保藏号CCTCC M 2021233)。
作为优选的实施方案，一种提高虫草素发酵产量的方法，具体包括以下步骤：以酿酒酵母S288C 为原始菌株构建可产虫草素的酿酒酵母工程菌SHC16，利用该工程菌分批发酵生产虫草素。通过向培养基 中添加非离子型表面活性剂增加细胞膜通透性的方法提高虫草素发酵产量。
在实施方案中，所述的酵母工程菌构建方法：将基因表达盒PTDH3-CNS1-TCYC1-PTEF1-CNS2-TADH1插入带有卡那霉素抗性基因的游离表达载体pYES2-Kan中，将得到的重组质粒导入酿酒酵母S288C得到 基因工程菌。
在实施方案中，以在培养基中添加非离子型表面活性剂为增加酿酒酵母工程菌SHC16细胞膜通 透性的方法。
在实施方案中，所述的非离子型表面活性剂为吐温-60、吐温-80及十二烷基硫酸钠(SDS)。
在实施方案中，所述的非离子型表面活性剂浓度为0.2％-0.6％(v/v)。
在实施方案中，所述的非离子型表面活性剂添加时间为分批发酵对数生长中期即发酵第35-40h。
在实施方案中，所述的发酵培养基的成分为25-30g/L葡萄糖、20-25g/L蛋白胨、10-15g/L酵母 浸粉、pH 6-7。
在实施方案中，所述的种子液制备方法：挑取单菌落接种于100mLYPD培养基中，培养条件为 28-30℃，180-200rpm培养16-24h。
在实施方案中，所述的种子液按1％-5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，培养温度28-30℃， pH 6-7，转速180-200rpm，发酵时间不低于168h。
本发明中发酵生产虫草素的工艺较现有虫草素的生产工艺有益效果在以下几方面：
(1)本发明发酵工艺制备的虫草素产量可高达98.53mg/L。
(2)本发明利用酿酒酵母工程菌作为生产菌株，生产强度高，发酵周期短，技术方案简单、环 境友好、菌种遗传稳定性高。
(3)本发明向培养基中添加了非离子型表面活性剂，增加了细胞膜的通透性，使胞内虫草素大 量分泌至胞外，显著提高了虫草素的产量。
附图说明
图1添加不同浓度吐温-60的摇瓶发酵体系的菌体浓度。
图2添加不同浓度吐温-80的摇瓶发酵体系的菌体浓度。
图3添加不同浓度SDS的摇瓶发酵体系的菌体浓度。
图4添加不同浓度吐温-60的摇瓶发酵体系的虫草素产量。
图5添加不同浓度吐温-80的摇瓶发酵体系的虫草素产量。
图6添加不同浓度SDS的摇瓶发酵体系的虫草素产量。
具体实施方式
以下实施例对本发明进一步说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成 对本发明保护范围的限制，本发明保护范围以权利要求为准。
本发明所用菌种为酿酒酵母工程菌SHC16。
所述的酿酒酵母工程菌SHC16已提交保藏，具体保藏信息如下：
菌种名称：Saccharomyces cerevisiae SHC16
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；
保藏日期：2021年03月15日；
保藏编号：CCTCC No:M 2021233.
本发明所用菌种为酿酒酵母工程菌SHC16。构建方法：将基因表达盒PTDH3-CNS1-TCYC1-PTEF1-CNS2-TADH1插入游离表达载体pYES2-Kan中，得到的重组质粒导入酿酒酵母S288C中得到基 因工程菌。
YPD液体培养基组成：每升YPD液体培养基含有20g葡萄糖，20g蛋白胨和10g酵母浸粉， 定容后1×105pa灭菌20min。
发酵培养基组成：每升培养基含有30g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母浸粉和0.2％-0.6％(v/v) 非离子型表面活性剂。
虫草素的测定方法：取2mL发酵液，高速离心10min，上清液用0.22μm规格的滤膜过滤，滤 液即为样品。通过高效液相色谱法(HPLC)检测，色谱柱为Venusil MPC18(2)(4.6mm×250mm)。
对比实施例1
(1)菌种活化：将-80℃冻存的酵母甘油液体种子接种到新鲜YPD液体培养基中，培养16h，得 到菌种液。
(2)菌种的抗性筛选：将(1)得到菌种液稀释10-7倍后，取100μL涂布于含有200μg/mL G418 抗性的固体培养基，培养50h，得到酿酒酵母工程菌单菌落。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板上挑取单菌落，接种到种子培养基中，培养24h，得到种 子液。
(4)发酵培养：将(3)得到的种子液按1％-5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，不添加非 离子型表面活性剂。发酵168h，结束发酵，获得含有虫草素的发酵液。
(5)产物检测：取2mL发酵液，高速离心10min，上清液用0.22μm规格的滤膜过滤。所得滤 液通过高效液相色谱法(HPLC)检测，虫草素发酵产量为21.137mg/L。
实施例1
(1)菌种活化：将-80℃冻存的酵母工程菌SHC16的甘油液体种子接种到新鲜YPD液体培养基 中，培养16h，得到菌种液。
(2)菌种的抗性筛选：将(1)得到菌种液稀释10-7倍后，取100μL涂布于含有200μg/mL G418 抗生素(遗传霉素)的YPD固体培养基，培养50h,得到酿酒酵母工程菌单菌落。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板上挑取单菌落，接种到YPD液体培养基中，培养温度30℃， 转速180rpm，培养24h，得到种子液。
(4)发酵培养：将(3)得到的种子液按5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，在发酵第3天 添加0.2-0.6％(v/v)吐温-60，本实施例中分别以添加0.2％、0.4％、0.6％(v/v)吐温-60进行优化实验。 发酵168h，结束发酵，获得含有虫草素的发酵液。
(5)产物检测：取2mL发酵液，高速离心10min，上清液用0.22μm规格的滤膜过滤。所得滤 液通过高效液相色谱法(HPLC)检测，吐温-60最佳添加量为0.4％(v/v)，虫草素发酵产量为35.42mg/L。
实施例2
(1)菌种活化：将-80℃冻存的酵母工程菌SHC16的甘油液体种子接种到新鲜YPD液体培养基 中，培养16h，得到菌种液。
(2)菌种的抗性筛选：将(1)得到菌种液稀释10-7倍后，取100μL涂布于含有200μg/mL G418 抗生素的YPD固体培养基，培养50h,得到酿酒酵母工程菌单菌落。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板上挑取单菌落，接种到YPD液体培养基中，培养温度30℃， 转速180rpm，培养24h，得到种子液。
(4)发酵培养：将(3)得到的种子液按5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，在发酵第3天 添加0.2％-0.6％(v/v)吐温-80，本实施例中分别以添加0.2％、0.4％、0.6％(v/v)吐温-80进行优化实验。 发酵168h,结束发酵，获得含有虫草素的发酵液。
(5)产物检测：取2mL发酵液，高速离心10min，上清液用0.22μm规格的滤膜过滤。所得滤 液通过高效液相色谱法(HPLC)检测，吐温-80最佳添加量为0.6％(v/v)，虫草素发酵产量为32.45mg/L。
实施例3
(1)菌种活化：将-80℃冻存的酵母工程菌SHC16的甘油液体种子接种到新鲜YPD液体培养基 中，培养16h，得到菌种液。
(2)菌种的抗性筛选：将(1)得到菌种液稀释10-7倍后，取100μL涂布于含有200μg/mL G418 抗生素的YPD固体培养基，培养50h,得到酿酒酵母工程菌单菌落。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板上挑取单菌落，接种到YPD液体培养基中，培养温度30℃， 转速180rpm，培养24h，得到种子液。
(4)发酵培养：将(3)得到的种子液按5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，在发酵第3天 添加0.2％-0.6％(v/v)SDS，本实施例中分别以添加0.2％、0.4％、0.6％(v/v)SDS进行优化实验。发酵 168h，结束发酵，获得含有虫草素的发酵液。
(5)产物检测：取2mL发酵液，高速离心10min，上清液用0.22μm规格的滤膜过滤。所得滤 液通过高效液相色谱法(HPLC)检测，SDS最佳添加量为0.4％(v/v)，虫草素发酵产量为98.53mg/L。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉 本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等 同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种提高虫草素发酵产量的方法，其特征在于，以能够生产虫草素的酵母工程菌为生产菌株，在含有非离子型表面活性剂的发酵培养基中发酵，所述非离子型表面活性剂为吐温-80、吐温-60、十二烷基硫酸钠中一种；所述的非离子型表面活性剂添加量为0.2％-0.6％(v/v)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在分批发酵对数生长中期，发酵第35-40h时，向发酵培养基中添加非离子型表面活性剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基的成分为25-30g/L葡萄糖、20-25g/L蛋白胨、10-15g/L酵母浸粉、pH 6-7。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酵母工程菌是以酿酒酵母S288C为原始菌株构建可产虫草素的酿酒酵母工程菌SHC16，菌种保藏号CCTCC M 2021233。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将酵母工程菌种子液在以葡萄糖为碳源、并含有0.2％-0.6％(v/v)非离子型表面活性剂的发酵培养基中发酵；培养温度28-30℃，pH6-7，培养时间不低于168h，接种量为1％-5％(v/v)。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酵母工程菌种子液的制备方法：挑取单菌落接种于100mLYPD液体培养基中，培养条件为28-30℃，180-200rpm培养16-24h。
7.权利要求1-6任一方法在发酵生产虫草素及其衍生产品方面的应用。
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