CN110438168B - 一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于木糖醇生物制备领域，具体涉及一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法，包括甘蔗渣的预处理、蒸汽爆破处理、碱处理、纤维素酶酶解处理、乙醇提取半纤维素、木聚糖酶酶解处理、制备浓缩液、浓缩液中和、基因工程菌的培养和富集和全细胞催化合成木糖醇几个工序。本发明能低成本高效率地制备木糖醇，能够最大限度利用甘蔗渣，将其中的木糖和半纤维素转化成木糖醇。
Description
技术领域
本发明属于木糖醇生物制备领域，具体涉及一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇并分离提纯木糖醇的工艺流程。
背景技术
甘蔗渣是甘蔗制糖厂的主要副产物之一，据统计，每吨甘蔗能产生0.25-0.3吨甘蔗渣，一般甘蔗渣的用途是用来造纸或者进行可降解餐具的制造。但是甘蔗渣中大量的纤维素、半纤维素和木质素，其中半纤维素由木糖、阿拉伯糖、半乳糖等五碳糖和六碳糖组成，通过酸水解可以得到含量较高的木糖。
木糖醇是一种集许多优良特性而在医药、食品和化学等工业具有很高应用价值的多羟基化合物。木糖醇可以用来做糖尿病人的甜味剂、营养补充剂和辅助治疗剂，在生物体内代谢缓慢，不会使胰岛素突然上升或下降，食用非常安全。尽管木糖醇具有广泛的应用领域，但较高的生产成本限制了它的使用。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺点和不足，本发明旨在提供一种高效节约的生物方法来得到木糖醇，以期能降低生产成本，实现低成本高效率地制备木糖醇，能够最大限度利用甘蔗渣，将其中的木糖和半纤维素转化成木糖醇。
具体说来，发明人提供如下的技术方案：
一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法， 主要包括以下步骤：
（1）甘蔗渣的预处理：将甘蔗渣烘干至恒重后粉碎处理并过筛，备用；在1-3g甘蔗粉末中加入适量液氮处理5-10min，再在研钵中研磨成粉末，然后冷却至室温；将液氮处理好的粉末在烘箱中处理至恒重，加入30-40mL去离子水，在冰水浴条件下超声处理30-40min，再在真空冷冻装置中处理成粉末；再往粉末中加入10-14wt%的γ-戊内酯和5-15mL的1,3-二甲基咪唑磷酸二甲酯，将三种物质共同加入50mL三颈烧瓶中，在温度90-130℃下搅拌反应；反应结束后，真空抽滤、洗涤和烘干，备用，
（2）蒸汽爆破处理： 将预处理后的甘蔗渣与15-60mL蒸馏水（固液比为1：15-1:20）混和，倒入蒸汽爆破系统，设置压力为1.0-1.2MPa，维压时间为10-15min，过滤得到爆破液和爆破渣，爆破液保留，爆破渣使用去离子水和无水乙醇洗净后烘干至恒重，
（3）碱处理：取30-40mL的10%（wt%）的NaOH溶液与爆破处理的甘蔗渣混和，在60-65℃水浴中搅拌处理；处理结束后，利用浓HCl调节pH值至5.0-5.5，
（4）纤维素酶酶解处理：将上述处理液混入0.3-0.5g的纤维素酶，30-35℃水浴，250-300rpm搅拌反应1-2h；
（5）乙醇提取半纤维素：将上述处理液于60-65℃下浓缩体积至原体积的1/3-1/2，结束后用3倍体积的无水乙醇充分震荡反应，震荡结束后，真空抽滤，用去离子水冲洗，
（6）木聚糖酶酶解处理：将上述滤渣与30-40mL去离子水混和，调节pH=5.0-6.0，加入0.3-0.5g木聚糖酶，50-60℃水浴，250-300rpm搅拌反应2-3h，得到的水解液备用，
（7）制备浓缩液：将爆破液和水解液混和，60-70℃水浴浓缩至原料液体积的1/3-1/4，使用对一溴苯胺定糖法测定木糖浓度，备用，
（8）浓缩液中和：将浓缩液使用NaOH调节pH值至6.5-7.5，
（9）基因工程菌的培养和富集：将构建好的含有木糖还原酶基因的大肠杆菌（卡那霉素抗性）BL21（DE3）甘油保菌在含50μg/mL的LB固体培养基进行划线接种，37℃培养过夜；将得到的单菌落挑取1-2个转接到50mL含50μg/mL的LB液体培养基中，重复转接多个，37℃，200rpm震荡培养至OD600=0.6～0.8，加入50μL 0.5mol/L的IPTG至培养基终浓度为0.5mmol/L，25℃，200rpm震荡诱导培养过夜；诱导结束后在8000rpm转速下离心5min，弃去上清液，收集菌体备用，再用pH=7.2-7.4的PBS缓冲液重悬菌体，8000rpm转速离心5min，再重复清洗，最终收集湿菌体，
（10）全细胞催化合成木糖醇：称取2-3g湿菌体与20-30mL中和后的浓缩液混和，将菌体打散，再加入50μL0.5mol/L的NADPH，置于50mL三颈烧瓶中，置于30-35℃水浴中，400-500rpm搅拌反应3-4h。
本发明的整个反应结束后，取1mL反应液，6000rpm离心3min，取上清液，使用Nash试剂法测定木糖醇浓度和对一溴苯胺定糖法测定木糖浓度，计算转化率。
作为优选方案，本发明中所述的步骤（1）甘蔗渣的预处理中：60-80目过筛；超声处理的功率调节成300-350w；在400-500rpm下搅拌反应1-3h。
作为优选方案，本发明中所述的步骤（3）碱处理中：在250-300rpm下搅拌处理30-40min。
与现有技术相比，本发明还具有以下优点：
1、使用液氮处理甘蔗渣，能够破坏纤维的结构，使甘蔗纤维呈现鳞片状，可以加快后期水解反应速率。
2、使用超声处理甘蔗渣，可以最大限度得将纳米半纤维素溶解出来，在后期水解反应中，可以加大反应接触面积，最大限度地将半纤维素水解成木糖。
3、甘蔗渣中含有木质素，木质素的存在会影响后期的酶催化效率，使用γ-戊内酯/1，3-二甲基咪唑磷酸二甲酯混合液处理可以将甘蔗渣中的木质素最大限度地溶解出来，防止在酶催化反应阶段阻碍酶催化反应，加大酶反应效率；将木质素除去还可以提高半纤维素与蒸汽接触的面积，更容易后期水解产木糖。
4、使用碱处理，可以去除纤维素和半纤维素之间的氢键，使后期去除纤维素更彻底。
5、使用纤维素酶和木聚糖酶联合处理，可以去除纤维素的影响，可以富集半纤维素，尽最大限度地水解半纤维素得到木糖，提高木糖的纯度。
6、使用蒸汽爆破处理和硫酸水解处理可以将交联在一起的半纤维素和纤维素有效地分离，并且可以将甘蔗渣中的游离木糖充分地溶解出来；被分离开来的半纤维素可以充分地和硫酸接触被水解掉，最大限度地得到甘蔗渣中地木糖。
7、使用基因工程菌可以高效率地对木糖进行转化，并且大肠杆菌代谢途径简单，尽可能减少副产物地产生；使用生物催化可以尽可能地降低成本，实现木糖醇低成本，高效率生产。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
一些说明：
甘蔗渣：浙江金晟环保股份有限公司
木糖；生工生物工程（上海）股份有限公司
木糖醇：生工生物工程（上海）股份有限公司
NADPH：生工生物工程（上海）股份有限公司
基因来源：莫格假丝酵母来源的木糖还原酶
构建方法：本项目将莫格假丝酵母来源的木糖还原酶的序列提供给生工生物工程（上海）股份有限公司进行全基因合成，将合成的基因克隆到载体pET-28a（+）中，酶切位点为Ncol/Xhol，将连接好的重组载体转化导入到感受态E.coli Top10中，经过37℃平板过夜培养后扩增培养后，利用质粒小量抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）将E.coli Top10中的重组质粒提取出来转化导入到E.coli BL21（DE3）中，经过扩增培养后，与30%甘油按照1:1比例混合后放入到甘油管中于-80℃保藏。
本发明中：浓缩液（发酵液）中木糖含量测定：取1mL浓缩液（发酵液）于1.5mL离心管中6000rpm离心3min，取0.2mL，加1mL对一溴苯胺试剂，70℃恒温水浴10min，快速冷却，放入暗室，室温静置70min后，以空白试液为校准零点，在520nm波长处测定吸光度OD值，带入标准曲线中可得到木糖浓度。
Nash试剂法：取适当稀释样品1mL，加1mL 溶于0.12mol/L HCl的0.15mol/L高碘酸钠溶液，混匀，室温静置10min，再加2mL 0.1%的鼠李糖溶液，混匀，最后加入4.0mL新鲜配制的Nash试剂（150mL醋酸铵，2mL冰醋酸，2mL戊二酮混匀定容至1000mL），53℃恒温水浴保温15min，保温结束后冷却至室温。以空白试液调零点，再412nm波长处测定吸光度OD值，作OD-木糖醇浓度标准曲线。
对一溴苯胺定糖法：取硫脲4g左右溶于100mL冰醋酸，混匀，真空抽滤得到上清液得到硫脲醋酸饱和溶液。取对一溴苯胺2g溶于100mL硫脲醋酸饱和溶液中，得到对一溴苯胺试剂。取适当稀释样品0.2mL，加1mL对一溴苯胺试剂，70℃水浴保温10min，结束后置于冷水中快速冷却，置于暗室，室温静置70min，以空白试液为校准零点，在520nm波长处测定吸光度OD值，作OD-木糖浓度标准曲线。
发酵液中木糖醇浓度测定：取1mL发酵液于1.5mL离心管中，6000rpm离心3min，取上清液0.2mL,再加2mL 0.1%的鼠李糖溶液，混匀，最后再加4.0mL新鲜配制的Nash试剂，3℃恒温水浴保温15min，保温结束后冷却至室温。以空白试液调零点，再412nm波长处测定吸光度OD值，带入标准曲线中可得到木糖醇浓度。
实施例1
一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法，包括以下步骤：
（1）甘蔗渣的预处理：将准备好的甘蔗渣用去离子水和无水乙醇洗净后放入烘箱中，设置温度60℃，烘干至恒重。将烘干好的甘蔗渣进行粉碎处理，拿筛子筛选出60-80目的颗粒备用。准备1g甘蔗粉末，加入适量液氮处理8min，再在研钵中迅速研磨成粉末，将研钵置于冷水中，迅速冷却至室温。将液氮处理好的粉末在烘箱中处理至恒重，将烘干的粉末，加入30mL去离子水，置于超声破碎仪中，将功率调节成300w，在冰水浴中处理30min，处理结束后在真空冷冻装置中处理48h成粉末。再往粉末中加入10wt%的γ-戊内酯和5mL的1,3-二甲基咪唑磷酸二甲酯，将三种物质共同加入50mL三颈烧瓶中，在加热套中加热至90℃，400rpm搅拌反应1h。反应结束后，将反应液进行真空抽滤，弃去反应液，将固体重新使用去离子水和无水乙醇洗涤，60℃烘干备用。
（2）蒸汽爆破处理： 将预处理后的甘蔗渣与15mL蒸馏水（固液比为1：15）混和，倒入蒸汽爆破系统，设置压力为1.0MPa，维压时间为10min，过滤得到爆破液和爆破渣，爆破液保留，爆破渣使用去离子水和无水乙醇洗净后烘干至恒重。
（3）碱处理：准备10%（wt%）的NaOH溶液，取30mL与爆破处理的甘蔗渣混和，在60℃水浴中250rpm搅拌处理30min；处理结束后，利用浓HCl调节pH至5.0。
（4）纤维素酶酶解处理：将上述处理液混入0.3g的纤维素酶，30℃水浴，250rpm搅拌反应1-2h；
（5）乙醇提取半纤维素：将上述处理液于60℃旋转蒸发仪中浓缩体积至原体积的1/3，结束后用3倍体积的无水乙醇充分震荡反应，震荡结束后，真空抽滤，用去离子水冲洗2-3遍；
（6）木聚糖酶酶解处理：将上述滤渣与30mL去离子水混和，调节pH=5.0，加入0.3g木聚糖酶，50℃水浴，250rpm搅拌反应2h，得到的水解液备用。
（7）制备浓缩液：将爆破液和水解液混和起来置于旋转蒸发仪中，60℃水浴旋转蒸发浓缩至原料液体积的1/3，使用对一溴苯胺定糖法测定木糖浓度，备用。
8、浓缩液NaOH中和：将浓缩液使用1mol/L NaOH调节pH至6.5。
9、基因工程菌的培养和富集：将构建好的含有木糖还原酶基因的大肠杆菌（卡那霉素抗性）BL21（DE3）甘油保菌在含50μg/mL的LB固体培养基进行划线接种，37℃培养过夜；将得到的单菌落挑取1-2个转接到50mL含50μg/mL的LB液体培养基中，重复转接多个，37℃，200rpm震荡培养至OD600=0.6，加入50μL 0.5mol/L的IPTG至培养基终浓度为0.5mmol/L，25℃，200rpm震荡诱导培养过夜。诱导结束后在8000rpm转速下离心5min，弃去上清液，收集菌体备用，再用pH=7.2-7.4的PBS缓冲液重悬菌体，8000rpm转速离心5min，再重复清洗一遍，最终收集湿菌体。
（10）全细胞催化合成木糖醇：称取2g湿菌体与20mL浓缩液混和，用漩涡振荡器将菌体打散，再加入50μL0.5mol/L的NADPH，置于50mL三颈烧瓶中，置于30℃水浴中，400rpm搅拌反应3h。
反应结束后，取1mL反应液，6000rpm离心3min，取上清液，使用Nash试剂法测定木糖醇浓度和对一溴苯胺定糖法测定木糖浓度，计算转化率。
实施例2
一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法，包括以下步骤：
（1）甘蔗渣的预处理：将准备好的甘蔗渣拿去离子水和无水乙醇洗净后放入烘箱中，设置温度60-70℃，烘干至恒重。将烘干好的甘蔗渣进行粉碎处理，拿筛子筛选出60-80目的颗粒备用。准备2g甘蔗粉末，加入适量液氮处理10min，再在研钵中迅速研磨成粉末，将研钵置于冷水中，迅速冷却至室温。将液氮处理好的粉末在烘箱中处理至恒重，将烘干的粉末，加入30-40mL去离子水，置于超声破碎仪中，将功率调节成300w，在冰水浴中处理40min，处理结束后在真空冷冻装置中处理48h成粉末。再往粉末中加入12wt%的γ-戊内酯和10mL的1,3-二甲基咪唑磷酸二甲酯，将三种物质共同加入50mL三颈烧瓶中，在加热套中加热至90℃，500rpm搅拌反应2h。反应结束后，将反应液进行真空抽滤，弃去反应液，将固体重新使用去离子水和无水乙醇洗涤，60℃烘干备用。
（2）蒸汽爆破处理： 将烘干后的甘蔗渣与30mL蒸馏水（固液比为1：15）混和，倒入蒸汽爆破系统，设置压力为1.1MPa，维压时间为13min，过滤得到爆破液和爆破渣，爆破液保留，爆破渣使用去离子水和无水乙醇洗净后烘干至恒重。
（3）碱处理：准备10%（wt%）的NaOH溶液，取30mL与爆破处理的甘蔗渣混和，在60℃水浴中250rpm搅拌处理40min；处理结束后，利用浓HCl调节pH至5.5。
（4）纤维素酶酶解处理：将上述处理液混入0.4g的纤维素酶，30℃水浴，300rpm搅拌反应1-2h；
（5）乙醇提取半纤维素：将上述处理液于60℃旋转蒸发仪中浓缩体积至原体积的1/3，结束后用3倍体积的无水乙醇充分震荡反应，震荡结束后，真空抽滤，用去离子水冲洗2-3遍；
（6）木聚糖酶酶解处理：将上述滤渣与35mL去离子水混和，调节pH5.0，加入0.3g木聚糖酶，50℃水浴，250rpm搅拌反应2h，得到的水解液备用。
（7）制备浓缩液：将爆破液和水解液混和起来置于旋转蒸发仪中，60℃水浴旋转蒸发浓缩至原料液体积的1/3，使用对一溴苯胺定糖法测定木糖浓度，备用。
（8）浓缩液NaOH中和：将浓缩液使用1mol/L NaOH调节pH至7.0。
（9）基因工程菌的培养和富集：将构建好的含有木糖还原酶基因的大肠杆菌（卡那霉素抗性）BL21（DE3）甘油保菌在含50μg/mL的LB固体培养基进行划线接种，37℃培养过夜；将得到的单菌落挑取1-2个转接到50mL含50μg/mL的LB液体培养基中，重复转接多个，37℃，200rpm震荡培养至OD600=0.6，加入50μL 0.5mol/L的IPTG至培养基终浓度为0.5mmol/L，25℃，200rpm震荡诱导培养过夜。诱导结束后在8000rpm转速下离心5min，弃去上清液，收集菌体备用，再用pH=7.2-7.4的PBS缓冲液重悬菌体，8000rpm转速离心5min，再重复清洗一遍，最终收集湿菌体。
（10）全细胞催化合成木糖醇：称取2g湿菌体与20mL中和后的浓缩液混和，用漩涡振荡器将菌体打散，再加入50μL0.5mol/L的NADPH，置于50mL三颈烧瓶中，置于30℃水浴中，400rpm搅拌反应3h。
反应结束后，取1mL反应液，6000rpm离心3min，取上清液，使用Nash试剂法测定木糖醇浓度和对一溴苯胺定糖法测定木糖浓度，计算转化率。
实施例3
一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法，包括以下步骤：
（1）甘蔗渣的预处理：将准备好的甘蔗渣拿去离子水和无水乙醇洗净后放入烘箱中，设置温度60℃，烘干至恒重。将烘干好的甘蔗渣进行粉碎处理，拿筛子筛选出60-80目的颗粒备用。准备3g甘蔗粉末，加入适量液氮处理10min，再在研钵中迅速研磨成粉末，将研钵置于冷水中，迅速冷却至室温。将液氮处理好的粉末在烘箱中处理至恒重，将烘干的粉末，加入40mL去离子水，置于超声破碎仪中，将功率调节成350w，在冰水浴中处理40min，处理结束后在真空冷冻装置中处理48h成粉末。再往粉末中加入14wt%的γ-戊内酯和15mL的1，3-二甲基咪唑磷酸二甲酯，将三种物质共同加入50mL三颈烧瓶中，在加热套中加热至130℃，400rpm搅拌反应1h。反应结束后，将反应液进行真空抽滤，弃去反应液，将固体重新使用去离子水和无水乙醇洗涤，60℃烘干备用。
（2）蒸汽爆破处理： 将烘干后的甘蔗渣与60mL蒸馏水（固液比为1:20）混和，倒入蒸汽爆破系统，设置压力为1.2MPa，维压时间为15min，过滤得到爆破液和爆破渣，爆破液保留，爆破渣使用去离子水和无水乙醇洗净后烘干至恒重。
（3）碱处理：准备10%（wt%）的NaOH溶液，取30mL与爆破处理的甘蔗渣混和，在60℃水浴中250rpm搅拌处理30min；处理结束后，利用浓HCl调节pH至5.0。
（4）纤维素酶酶解处理：将上述处理液混入0.5g的纤维素酶，30℃水浴，300rpm搅拌反应1-2h；
（5）乙醇提取半纤维素：将上述处理液于60℃旋转蒸发仪中浓缩体积至原体积的1/2，结束后用3倍体积的无水乙醇充分震荡反应，震荡结束后，真空抽滤，用去离子水冲洗2-3遍；
（6）木聚糖酶酶解处理：将上述滤渣与30mL去离子水混和，调节pH=5.0，加入0.5g木聚糖酶，50℃水浴，250rpm搅拌反应2h，得到的水解液备用。
（7）制备浓缩液：将爆破液和水解液混和起来置于旋转蒸发仪中，70℃水浴旋转蒸发浓缩至原料液体积的1/4，使用对一溴苯胺定糖法测定木糖浓度，备用。
（8）浓缩液NaOH中和：将浓缩液使用1mol/L NaOH调节pH至7.0。
（9）基因工程菌的培养和富集：将构建好的含有木糖还原酶基因的大肠杆菌（卡那霉素抗性）BL21（DE3）甘油保菌在含50μg/mL的LB固体培养基进行划线接种，37℃培养过夜；将得到的单菌落挑取1-2个转接到50mL含50μg/mL的LB液体培养基中，重复转接多个，37℃，200rpm震荡培养至OD600=0.8，加入50μL 0.5mol/L的IPTG至培养基终浓度为0.5mmol/L，25℃，200rpm震荡诱导培养过夜。诱导结束后在8000rpm转速下离心5min，弃去上清液，收集菌体备用，再用pH=7.2-7.4的PBS缓冲液重悬菌体，8000rpm转速离心5min，再重复清洗一遍，最终收集湿菌体。
（10）全细胞催化合成木糖醇：称取3g湿菌体与20-30mL中和后的浓缩液混和，用漩涡振荡器将菌体打散，再加入50μL0.5mol/L的NADPH，置于50mL三颈烧瓶中，置于35℃水浴中，500rpm搅拌反应4h。
反应结束后，取1mL反应液，6000rpm离心3min，取上清液，使用Nash试剂法测定木糖醇浓度和对一溴苯胺定糖法测定木糖浓度，计算转化率。
比较例1 没有经过蒸汽爆破处理直接水解得到的木糖
其余步骤和条件同本发明实施例1，只是缺少蒸汽爆破处理工序。
比较例2
没有经过液氮，超声处理和γ-戊内酯/1，3-二甲基咪唑磷酸二甲酯处理的木糖醇（没有经过γ-戊内酯/1，3-二甲基咪唑磷酸二甲酯处理，其余步骤和条件同本发明实施例1）
比较例3
没有经过碱处理和纤维素酶/木聚糖酶联合处理得到的木糖（没有经过碱处理和纤维素酶/木聚糖酶联合处理得到的木糖，其余步骤和条件同本发明实施例1）；
比较例4 传统木糖醇制备（使用传统技术直接从玉米芯/甘蔗渣等作物中提取）
传统木糖醇制备方法为：取1-3g甘蔗渣，使用去离子水和无水乙醇洗净后在60-70℃烘箱中烘干至恒重；烘干结束后与20-30mL 3-5%稀硫酸混和倒入50mL三颈烧瓶中100-120℃搅拌反应2-3h；反应结束后加入适当浓度的CaCl2将硫酸中和成石膏沉淀掉；将中和液过滤，所得滤液在活性炭中脱色；脱色结束后首先通过阴离子交换树脂D296，然后通过732阳离子交换树脂，将离子交换后的溶液浓缩，加氢催化处理，可得木糖醇。
比较例和本发明实施例木糖醇制备的过程中，对木糖产量和木糖转化成木糖醇的产量及转化率进行测定，测试结果如表1所示。
表1 产量测试表
| 测试指标 | 每千克甘蔗渣木糖产量 | 每千克甘蔗渣木糖醇产量 |
| 比较例1 | 8.3g | 7.9g（转化率95%） |
| 比较例2 | 10.3g | 8.1g（转化率78%） |
| 比较例3 | 8.8g | 8.3g（转化率94%） |
| 比较例4 | / | 4.5g |
| 本发明实施例1产品 | 10.2g | 9.9g（转化率97%） |
| 本发明实施例2产品 | 10.3g | 9.7g（转化率94%） |
| 本发明实施例3产品 | 10.1g | 9.8g（转化率97%） |
结果表明，本发明方法制备得到的木糖产量、木糖醇产量和转化率最高，依次通过本发明制备过程中甘蔗渣经过液氮，超声处理以及γ-戊内酯/1，3-二甲基咪唑磷酸二甲酯处理，高压蒸汽爆破，碱处理，纤维素酶/木聚糖酶联合处理，全细胞催化，木糖产量和木糖醇产量会显著提高。因此，通过本发明的方法能制备出高效、经济的木糖醇。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有许多变形。凡是从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法，其特征在于主要包括以下步骤：
（1）甘蔗渣的预处理：将甘蔗渣烘干至恒重后粉碎处理并60-80目过筛，备用；在1-3g甘蔗粉末中加入适量液氮处理5-10min，再在研钵中研磨成粉末，然后冷却至室温；将液氮处理好的粉末在烘箱中处理至恒重，加入30-40mL去离子水，在冰水浴条件下超声处理30-40min，功率调节成300-350w，再在真空冷冻装置中处理成粉末；再往粉末中加入10-14wt%的γ-戊内酯和5-15mL的1,3-二甲基咪唑磷酸二甲酯，将三种物质共同加入50mL三颈烧瓶中，在温度90-130℃下且在400-500rpm下搅拌反应1-3h；反应结束后，真空抽滤、洗涤和烘干，备用，
（2）蒸汽爆破处理：将预处理后的甘蔗渣与15-60mL蒸馏水混和，固液比为1：15-1:20，倒入蒸汽爆破系统，设置压力为1.0-1.2MPa，维压时间为10-15min，过滤得到爆破液和爆破渣，爆破液保留，爆破渣使用去离子水和无水乙醇洗净后烘干至恒重，
（3）碱处理：取30-40mL的10%（wt%）的NaOH溶液与爆破处理的甘蔗渣混和，在60-65℃水浴中搅拌处理，在250-300rpm下搅拌处理30-40min；处理结束后，利用浓HCl调节pH值至5.0-5.5，
（4）纤维素酶酶解处理：将上述处理液混入0.3-0.5g的纤维素酶，30-35℃水浴，250-300rpm搅拌反应1-2h；
（5）乙醇提取半纤维素：将上述处理液于60-65℃下浓缩体积至原体积的1/3-1/2，结束后用3倍体积的无水乙醇充分震荡反应，震荡结束后，真空抽滤，用去离子水冲洗，
（6）木聚糖酶酶解处理：将上述滤渣与30-40mL去离子水混和，调节pH=5.0-6.0，加入0.3-0.5g木聚糖酶，50-60℃水浴，250-300rpm搅拌反应2-3h，得到的水解液备用，
（7）制备浓缩液：将爆破液和水解液混和，60-70℃水浴浓缩至原料液体积的1/3-1/4，使用对一溴苯胺定糖法测定木糖浓度，备用，
（8）浓缩液中和：将浓缩液使用NaOH调节pH值至6.5-7.5，
（9）基因工程菌的培养和富集：将构建好的含有木糖还原酶基因的大肠杆菌BL21（DE3）甘油保菌在含50μg/mL的LB固体培养基进行划线接种，37℃培养过夜，基因来源：莫格假丝酵母来源的木糖还原酶；将得到的单菌落挑取1-2个转接到50mL含50μg/mL的LB液体培养基中，重复转接多个，37℃，200rpm震荡培养至OD600=0.6～0.8，加入50μL 0.5mol/L的IPTG至培养基终浓度为0.5mmol/L，25℃，200rpm震荡诱导培养过夜；诱导结束后在8000rpm转速下离心5min，弃去上清液，收集菌体备用，再用pH=7.2-7.4的PBS缓冲液重悬菌体，8000rpm转速离心5min，再重复清洗，最终收集湿菌体，
（10）全细胞催化合成木糖醇：称取2-3g湿菌体与20-30mL中和后的浓缩液混和，将菌体打散，再加入50μL0.5mol/L的NADPH，置于50mL三颈烧瓶中，置于30-35℃水浴中，400-500rpm搅拌反应3-4h。
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