CN115960979A - 发酵生产透明质酸或其盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种发酵生产透明质酸或其盐的方法，所述方法包括：将菌株在含有油脂的发酵培养基中发酵得到透明质酸或其盐，本申请在生产透明质酸的发酵液中以油脂进行发酵生产，可以促进兽疫链球菌的生长及透明质酸的合成，即提高菌体活力，显著增加菌体量，并且显著提高单位体积透明质酸发酵产率。
Description
技术领域
本申请涉及发酵技术领域，尤其涉及一种发酵生产透明质酸或其盐的方法。
背景技术
透明质酸是一种广泛存在于动物及人体内的天然粘多糖，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖。几乎所有的动物组织中均含有HA，含量较高能够用于工业生产原料的主要为鸡冠和人脐带。随着HA用途越来越广泛，而动物来源的原料有限，提取法已经越来越无法满足工业化生产的需要。细菌发酵法是利用某些以HA为主要成分的荚膜的链球菌，通过对菌株筛选、诱变，优化发酵条件制备HA，极大程度上提高了HA的产量，降低了生产成本。
工业上发酵法制备透明质酸从20世纪90年代开始，随着发酵工艺的不断优化，产率从不到1g/L逐渐提升至10-12g/L。随着发酵产率的提升，发酵液黏度也逐渐从不到10000mPa·s,提升至60000～70000mPa·s，发酵过程中的均质和溶氧都面临巨大挑战，发酵产率的继续提升变得越来越困难。而透明质酸的应用场景不断增加，市场规模不断扩大。在现有产率的基础上，能够在实际生产过程中，单位体积产率提高3％-5％都具有显著的技术价值及经济价值。透明质酸的发酵培养基常采用蛋白胨、酵母粉等作为氮源，以葡萄糖、蔗糖等作为碳源，另外添加一些无机盐作为辅因子。而在透明质酸发酵的过程中，未见主动添加植物油脂作为培养基成分的报道。
发明内容
针对上述技术问题，本申请提供了一种发酵生产透明质酸或其盐的方法，本申请在发酵生产透明质酸的过程中加入油脂，可以显著提高菌体的活力，提高透明质酸或其盐的发酵产率。
本申请具体技术方案如下：
1.一种发酵生产透明质酸或其盐的方法，其中，所述方法包括：
将菌株在含有油脂的发酵培养基中发酵得到透明质酸或其盐。
2.根据项1所述的方法，其中，所述油脂为植物油脂；
优选地，所述植物油脂为大豆油、玉米油、花生油、菜籽油、米糠油、橄榄油、葵花籽油、蓖麻籽油或沙棘籽油，优选为大豆油、玉米油、花生油或菜籽油。
3.根据项1或2所述的方法，其中，以在发酵培养基中所占的质量体积百分比计，所述油脂为0.01-0.25％。
4.根据项1-3中任一项所述的方法，其中，所述菌株为兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，优选为兽疫链球菌。
5.油脂在提高透明质酸或其盐的发酵产率或生产透明质酸或其盐的菌株的菌体量中的用途。
6.根据项5所述的用途，其中，所述油脂为植物油脂；
优选地，所述植物油脂为大豆油、玉米油、花生油、菜籽油、米糠油、橄榄油、葵花籽油、蓖麻籽油或沙棘籽油，优选为大豆油、玉米油、花生油或菜籽油。
7.根据项5-6中任一项所述的用途，其中，发酵生产透明质酸或其盐的菌株为兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，优选为兽疫链球菌。
8.根据项5-7中任一项所述的用途，其中，所述油脂在发酵生产透明质酸或其盐中的发酵培养基中所占的质量体积百分比为0.01-0.25％。
9.一种用于生产透明质酸或其盐的发酵培养基，其中，发酵培养基中含有油脂，油脂添加量为0.01-0.25w/v％。
10.根据项9所述的发酵培养基，其中，所述油脂为植物油脂；
优选地，所述植物油脂为大豆油、玉米油、花生油、菜籽油、米糠油、橄榄油、葵花籽油、蓖麻籽油或沙棘籽油，优选为大豆油、玉米油、花生油或菜籽油。
发明的效果
本申请在生产透明质酸的发酵液中以油脂进行发酵生产，可以促进兽疫链球菌的生长及透明质酸的合成，即提高菌体活力，显著增加菌体量，并且显著提高单位体积透明质酸发酵产率。
具体实施方式
下面结合所描述的实施方式对本申请做以详细说明。虽然显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本申请提供了一种发酵生产透明质酸或其盐的方法，其中，所述方法包括：
将菌株在含有油脂的发酵培养基中发酵得到透明质酸或其盐。
本申请在发酵生产透明质酸或其盐的发酵培养基中加入油脂，能够提高用于发酵生产透明质酸或其盐的菌株的活力，并能提高菌体的数量，从而能够显著提高透明质酸或其盐的产率。
在一些实施方式中，所述油脂为植物油脂，优选地，所述植物油脂为大豆油、玉米油、花生油、菜籽油、米糠油、橄榄油、葵花籽油、蓖麻籽油或沙棘籽油，优选为大豆油、玉米油、花生油或菜籽油。
所述植物油脂指的是从植物种子、果肉及其它部分提取所得的脂肪，所述植物油脂含不饱和脂肪酸，溶点低，常温下呈液态，消化吸收率高。植物油脂肪含量在99％以上，此外含有丰富的维生素E，少量的钾、钠、钙和微量元素。
在一些实施方式中，以在发酵培养基中所占的质量体积百分比计，所述油脂为0.01-0.25％。
例如，以在发酵培养基中所占的质量体积百分比计，所述油脂可以为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.20％、0.21％、0.22％、0.23％、0.24％、0.25％等。
在一些实施方式中，所述油脂可以在配制发酵培养基时加入或者以补料的方式加入。
例如，所述油脂可以在配制培养基时加入，或者在菌株接种后以补料的方法加入使得最终发酵培养基中的油脂的含量为0.01％-0.25w/v％。
在一些实施方式中，所述菌株为兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌等，优选为兽疫链球菌。
所述兽疫链球菌又称马链球菌兽医亚种(Streptococcus equissp.zooepidemicus，SEZ)，本申请中使用的兽疫链球菌为ATCC35246及菌株ATCC39920，其可以通过市售得到。
在一些实施方式中，所述方法包括：
活化菌株并培养得到菌株种子液；
将菌株种子液接种到含有油脂的发酵培养基进行发酵得到透明质酸或其盐。
在一些实施方式中，所述方法包括：将菌株在含有油脂的发酵培养基中发酵得到透明质酸或其盐。在一些实施方式中，所述油脂为植物油脂；
优选地，所述植物油脂为大豆油、玉米油、花生油、菜籽油、米糠油、橄榄油、葵花籽油、蓖麻籽油或沙棘籽油，优选为大豆油、玉米油、花生油或菜籽油。在一些实施方式中，以在发酵培养基中所占的质量体积百分比计，所述油脂为0.01-0.25％，例如，以在发酵培养基中所占的质量体积百分比计，所述油脂可以为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.20％、0.21％、0.22％、0.23％、0.24％、0.25％等。在一些实施方式中，所述菌株为兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，优选为兽疫链球菌。
本申请提供了油脂在提高透明质酸或其盐的发酵产率或生产透明质酸或其盐的菌株的菌体量中的用途。在一些实施方式中，所述油脂为植物油脂；优选地，所述植物油脂为大豆油、玉米油、花生油、菜籽油、米糠油、橄榄油、葵花籽油、蓖麻籽油或沙棘籽油，优选为大豆油、玉米油、花生油或菜籽油。在一些实施方式中，所述油脂在配制发酵培养基时加入或者以补料的方式加入。在一些实施方式中，发酵生产透明质酸或其盐的菌株为兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，优选为兽疫链球菌。在一些实施方式中，所述油脂在发酵生产透明质酸或其盐中的发酵培养基中所占的质量体积百分比为0.01-0.25％。
例如，所述油脂在发酵生产透明质酸或其盐中的发酵培养基中所占的质量体积百分比可以为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.20％、0.21％、0.22％、0.23％、0.24％、0.25％等。
在一些实施方式中，菌株的菌体量为4.0-5.1g/L，优选地，透明质酸或其盐的产率为5.5-6.2g/L。
例如，所述菌株的菌体量为4.0g/L、4.1g/L、4.2g/L、4.3g/L、4.4g/L、4.5g/L、4.6g/L、4.7g/L、4.8g/L、4.9g/L、5.0g/L、5.1g/L；
透明质酸或其盐的产率可以为5.5g/L、5.6g/L、5.7g/L、5.8g/L、5.9g/L、6.0g/L、6.1g/L、6.2g/L等。
在本申请中，对于菌株的菌体量和透明质酸或其盐的产率的测定方法，本申请不作任何限制，其可以采用本领域常规的方法进行测定，例如，菌株的菌体量的测定方法可以为：
取发酵液100ml，加入50000IU透明质酸酶，37℃酶解10min后，10000rpm，10min离心去上清，加入100ml纯化水冲洗沉淀，10000rpm，10min离心去上清。将离心管放于60℃烘箱中干燥24h，测定离心管中菌体重量，即为含菌体的管总重量与空管重量的差值。
透明质酸或其盐的产率的测定方法为(酶解—HPLC法)：
1)对照品溶液制备：精密称取透明质酸钠对照品约50mg于50ml容量瓶中，酶解缓冲液溶解并定容至刻度，混匀。取上述溶液0.2ml置于10ml容量瓶中，加入400IU透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解2h，煮沸2min使酶失活，流动相定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，即得对照品溶液。
2)供试品(也可以称为待测样品)溶液制备：取透明质酸发酵液50ml，2倍体积乙醇沉淀，离心，采用纯化水将沉淀溶解至500ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀。取上述溶液0.2ml置于10ml容量瓶中，加入400IU透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解2h，煮沸2min使酶失活，流动相定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，即得供试品溶液。
3)HPLC测定含量：色谱柱MCI GEL CK08EH色谱柱(三菱化学，8×300mm，5μm)；流动相为1％磷酸溶液；流速0.6ml/min；进样量20μl；柱温40℃；检测波长232nm。分别取对照品，供试品溶液20μl进样，按照上述色谱条件进行检测，以外标法峰面积计算供试品溶液中透明质酸钠含量。按以下公式计算供试品溶液中的HA含量：
式中，X—供试品溶液中HA含量，mg/mL
As—供试品溶液峰面积
Ar—对照品溶液峰面积
Wr—对照品称样量，mg
Z—对照品含量
h—对照品干燥失重
另外，理论塔板数(N)是反映色谱柱的柱效参数，计算公式为：
N＝5.54×(保留时间/半峰宽)2
理论塔板数一般由色谱工作站数据处理软件自动计算给出。
实施例
本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
以兽疫链球菌ATCC35246为发酵菌株，将兽疫链球菌接种至种子固体培养基上进行培养，于37℃培养16h，其中，所述种子固体培养基的配方为：蛋白胨浓度为10g/L，酵母粉浓度为5g/L，磷酸二氢钾浓度为1g/L，硫酸镁浓度为1g/L，葡萄糖5g/L，琼脂20g/L；培养基配置后灭菌温度115℃，灭菌时间为20分钟。
然后，将兽疫链球菌接种至摇瓶种子培养基中进行培养，于37℃振荡培养12h，得到兽疫链球菌摇瓶种子培养液，所述摇瓶种子培养基的配方为：蛋白胨浓度为10g/L，酵母粉浓度为5g/L，磷酸二氢钾浓度为2g/L，硫酸镁浓度为1g/L，葡萄糖5g/L；培养基配置后灭菌温度115℃，灭菌时间为20分钟；
接着将兽疫链球菌摇瓶种子培养液接种至10L发酵罐中，培养温度为37℃，通气比1(vvm)，用30％的氢氧化钠调节培养液pH，使其维持在pH7.5±0.5，培养至残糖为0，结束发酵，所述发酵培养基的配方为：蛋白胨浓度为15g/L，酵母粉浓度为10g/L，磷酸二氢钾浓度为2g/L,硫酸镁浓度为1.5g/L，葡萄糖浓度为70g/L，大豆油0.1w/v％；培养基配置后灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。
将发酵进行3批次发酵，按照上述的方法测定菌体量以及透明质酸的产率，测得菌体量为4.54g/L，透明质酸平均产率为6.04g/L。
实施例2
与实施例1相比，区别在于，将发酵培养基中的大豆油替换为花生油，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为4.37g/L，透明质酸平均产率为6.11g/L。
实施例3
与实施例1相比，区别在于，将发酵培养基中的大豆油替换为玉米油，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为4.39g/L，透明质酸平均产率为6.07g/L。
实施例4
与实施例1相比，区别在于，将发酵培养基中的大豆油替换为菜籽油，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为4.52g/L，透明质酸平均产率为6.13g/L。
实施例5
与实施例1相比，区别在于，将发酵培养基中的大豆油替换为米糠油，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为4.44g/L，透明质酸平均产率为5.98g/L。
实施例6
与实施例1相比，区别在于，将发酵培养基中的大豆油替换为橄榄油，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为4.49g/L，透明质酸平均产率为6.04g/L。
实施例7
与实施例1相比，区别在于，将发酵培养基中的大豆油用量由0.1％替换为0.01％，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为4.36g/L，透明质酸平均产率为5.96g/L。
实施例8
与实施例1相比，区别在于，将发酵培养基中的大豆油用量由0.1％替换为0.15％，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为4.57g/L，透明质酸平均产率为5.95g/L。
实施例9
与实施例1相比，区别在于，将发酵培养基中的大豆油用量由0.1％替换为0.25％，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为4.88g/L，透明质酸平均产率为6.08g/L。
实施例10
与实施例1相比，区别在于，将兽疫链球菌ATCC35246替换为ATCC39920兽疫链球菌为发酵菌株，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为5.02g/L，透明质酸平均产率为6.41g/L。
对比例1
与实施例1相比，区别在于，发酵培养基中不添加油脂，加入同样量的消泡剂聚二甲基硅氧烷，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为2.73g/L，透明质酸平均产率为4.17g/L。
对比例2
与实施例1相比，区别在于，将发酵培养基中的大豆油用量由0.1％替换为0.3％，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为4.64g/L，透明质酸平均产率为6.11g/L。发酵产率没有明显提升，但是由于添加油脂过多，油脂无法完全利用，造成搅拌桨黏附过多油脂与培养基混合物，难以清洗。
对比例3
与对比例1相比，区别在于，将兽疫链球菌替换为ATCC39920菌株为发酵菌株，加入同样量的消泡剂聚二甲基硅氧烷，将发酵进行3批次发酵，按照与实施例1相同的方法测定菌体量和透明质酸的量，其中，菌体量为3.44g/L，透明质酸平均产率为4.32g/L。
表1实施例和对比例使用的油脂类型、用量、菌体量以及透明质酸的产率表
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种发酵生产透明质酸或其盐的方法，其中，所述方法包括：
将菌株在含有油脂的发酵培养基中发酵得到透明质酸或其盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述油脂为植物油脂；
优选地，所述植物油脂为大豆油、玉米油、花生油、菜籽油、米糠油、橄榄油、葵花籽油、蓖麻籽油或沙棘籽油，优选为大豆油、玉米油、花生油或菜籽油。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，以在发酵培养基中所占的质量体积百分比计，所述油脂为0.01-0.25％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述菌株为兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，优选为兽疫链球菌。
5.油脂在提高透明质酸或其盐的发酵产率或生产透明质酸或其盐的菌株的菌体量中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述油脂为植物油脂；
优选地，所述植物油脂为大豆油、玉米油、花生油、菜籽油、米糠油、橄榄油、葵花籽油、蓖麻籽油或沙棘籽油，优选为大豆油、玉米油、花生油或菜籽油。
7.根据权利要求5-6中任一项所述的用途，其中，发酵生产透明质酸或其盐的菌株为兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，优选为兽疫链球菌。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的用途，其中，所述油脂在发酵生产透明质酸或其盐中的发酵培养基中所占的质量体积百分比为0.01-0.25％。
9.一种用于生产透明质酸或其盐的发酵培养基，其中，发酵培养基中含有油脂，油脂添加量为0.01-0.25w/v％。
10.根据权利要求9所述的发酵培养基，其中，所述油脂为植物油脂；
优选地，所述植物油脂为大豆油、玉米油、花生油、菜籽油、米糠油、橄榄油、葵花籽油、蓖麻籽油或沙棘籽油，优选为大豆油、玉米油、花生油或菜籽油。
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