CN118581025A

CN118581025A - 一种制备木糖醇的基因工程菌及应用

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Publication number: CN118581025A
Application number: CN202411060899.6A
Authority: CN
Inventors: 李培清; 徐瑶; 汤海斌; 高京伟; 苏飞虎
Original assignee: Zhejiang Rongrui Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Rongrui Technology Co ltd
Priority date: 2024-08-05
Filing date: 2024-08-05
Publication date: 2024-09-03

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备木糖醇的基因工程菌及应用，所述基因工程菌为共表达木糖还原酶基因、L‑阿拉伯糖醇‑4‑脱氢酶基因及L‑木酮糖还原酶基因的基因工程菌，以半纤维素水解液为底物，可以催化产生木糖醇。与现有产木糖醇的工程菌相比，本发明基因工程菌中的木糖还原酶基因、L‑阿拉伯糖醇‑4‑脱氢酶基因及L‑木酮糖还原酶基因来源广泛，发酵产物中木糖转化率可超过99%，且没有阿拉伯糖醇的生成，极大的简化了后续木糖醇分离纯化的工序。

Description

一种制备木糖醇的基因工程菌及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备木糖醇的基因工程菌及应用。

背景技术

木糖醇（Xylitol）的分子式为C₅H₁₂O₅，是一种五碳糖醇，为白色晶体或结晶性粉末。味凉，甜度相当于蔗糖，热量相当于葡萄糖。木糖醇易溶于水，溶于水时可吸收大量热量，食用时会在口中产生愉快的清凉感，微溶于乙醇与甲醇。木糖醇具有吸湿性、甜度较高、热稳定性好等特点。目前，木糖醇已被广泛用作高档食品的天然甜味剂，并在2004年被美国能源部评为12个最具有应用前景的来源于生物质的基础化学品。木糖醇已引起人们越来越多的关注，如在药学领域，作为药剂的辅料，木糖醇类表面活性剂；在医学领域，作为优质的输液载体，并能与抗菌药、心脑血管用药、消化系统用药、抗肿瘤药等一起制成输液，还可用于肠道外营养用药、糖尿病的治疗、肝病治疗、防龋齿、预防呼吸道感染、抑制巨噬细胞的粘附、治疗慢性鼻窦炎等。全球木糖醇的市场规模总体呈逐年上涨趋势，从2017年的8亿美元上涨至2023年的11.10亿美元，市场潜力较大。

木糖醇的制备方法主要包括天然提取、化学合成和生物转化法。由于木糖醇在自然界中含量较低，通过提取制备比较困难且成本较高，没有进行工业化生产的价值。化学合成首先是通过分离半纤维素（hemicellulose）水解糖得到纯木糖后，再经过高压加氢、将木糖还原为木糖醇，当前工业上普遍采用的方法；由于其生产工艺相对复杂，成本较高，导致木糖醇价格长期居高不下，与其它常用甜味剂相比，并没有价格优势。生物转化法生产木糖醇是最近兴起的一种制备工艺，相比化学法，该工艺有诸多优势：微生物发酵反应在常温常压下进行，具有能耗低、设备简单、操作安全等优点，所以逐渐受到人们重视并有望成为木糖醇生产的替代工艺。生物法生产木糖醇就是利用酶催化或微生物发酵的方法将木糖（Xylose）还原成木糖醇，然后进行精制获得木糖醇。

尽管微生物法有这些优势，但现有的基因工程菌中，木糖还原酶的专一性比较差，以半纤维素水解液（主要含有葡萄糖、D-木糖（D-Xylose）以及L-阿拉伯糖（L-Arabinose）等糖类）为底物发酵时，木糖还原酶在催化木糖还原为木糖醇的同时、还会将阿拉伯糖还原为阿拉伯糖醇；而木糖醇与阿拉伯糖醇互为差向异构体，其物理化学性质极为相似，生成的阿拉伯糖醇给木糖醇的分离精制带来困难。近几年不断有研究者通过筛选、优化、基因工程等手段来提高微生物中木糖还原酶对木糖的专一性，以提高木糖醇的产率、简化木糖醇分离纯化工序以及降低生产成本，但所获甚少，效果不佳。

发明内容

针对现有技术中，产品木糖醇中存在杂质阿拉伯糖醇且难以去除的问题，本发明提供了一种制备木糖醇的基因工程菌及应用，具体技术方案如下：

本发明首先提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌为共表达木糖还原酶基因、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因及L-木酮糖还原酶基因的基因工程菌。

本发明所提供的基因工程菌可以半纤维素水解液为底物进行发酵得到木糖醇，半纤维素水解液中主要含有葡萄糖、D-木糖以及L-阿拉伯糖等糖类。首先，基因工程菌所表达的木糖还原酶会催化半纤维素水解液中的木糖生成木糖醇。同时，水解液中的L-阿拉伯糖也会被木糖还原酶还原为L-阿拉伯糖醇，之后L-阿拉伯糖醇被L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶催化生成L-木酮糖，最后L-木酮糖被L-木酮糖还原酶进一步催化生成木糖醇，使得底物中的木糖和阿拉伯糖均转化为木糖醇，并且发酵后无阿拉伯糖醇副产物残留，极大地简化了木糖醇分离纯化的工序，降低了木糖醇的生产成本。

进一步地，所述木糖还原酶基因为XR基因，所述XR基因为NCBI登录号AF451326.3、KF752418.1、AF074484.1、AB002106.1、ALO17776.1、EAA34695.1、AAA99507.1、Q9P8R5.1中的一种；

所述L-木酮糖还原酶基因为LXR基因，所述LXR基因为NCBI登录号KAG7881166.1、VEU21754.1、KAF6014139.1、ANZ74972.1、CCE79252.1、EIF45204.1、ODV85849.1、GCF00616.1、AJ583159中的一种。

进一步地，所述XR基因与LXR基因的组合形式如下所示：

（1）AF451326.3、KAG7881166.1；（2）AF451326.3、GCF00616.1；

（3）KF752418.1、KAG7881166.1；（4）KF752418.1、GCF00616.1；

（5）AF074484.1、KAG7881166.1；（6）AF074484.1、GCF00616.1；

（7）AB002106.1、KAG7881166.1；（8）AB002106.1、GCF00616.1；

（9）ALO17776.1、KAG7881166.1；（10）ALO17776.1、GCF00616.1；

（11）EAA34695.1、KAG7881166.1；（12）EAA34695.1、GCF00616.1；

（13）AAA99507.1、KAG7881166.1；（14）AAA99507.1、GCF00616.1；

（15）Q9P8R5.1、KAG7881166.1；（16）Q9P8R5.1、GCF00616.1。

进一步地，L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因为LAD基因，所述LAD基因为NCBI登录号KX591955.1、KX591956.1、KX591957.1、AAL08944.1、EAA36547.1、BAC81768.1、EDP56335.1、XP_002569286.1、EDK37120.2、CAH69383.1中的一种。

进一步地，所述基因工程菌的出发菌株为野生型大肠杆菌，或为，敲除或沉默了ptsG基因、ptsF基因、xylA基因、xylB基因中至少一个基因后的大肠杆菌。

进一步地，所述ptsG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ptsF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

由于木糖还原酶催化的反应需要消耗辅酶NADPH，为了能够最大限度地将木糖转化为木糖醇，本发明的基因工程菌敲除了ptsG基因，可以减缓CCR效应，提高葡糖糖与其他糖类的共代谢效率，使得基因工程菌能够代谢葡萄糖从而产生辅酶NADPH，从而将半纤维素水解液中的葡萄糖清除。除此之外，ptsF的敲除可以降低木糖醇从胞外到胞内的转运；xylA和xylB的敲除可以阻断木糖的下游分解代谢途径。最终可以获得不含其他杂糖或糖醇的木糖醇溶液，再经过除菌、除蛋白等精制工艺后可获得高纯度的木糖醇产品。

在大肠杆菌中，xylA基因和xylB基因两个基因连在一起，将xylA基因和xylB基因两个基因合称为xylAB基因，在进行基因敲除或沉默时将两个基因一起敲除或沉默，也就是将xylAB基因敲除或沉默。

进一步地，xylA基因和xylB基因连在一起，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，即所述xylAB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述大肠杆菌为E.coliW3110。

本发明其次提供了上述基因工程菌的制备方法，包括：（1）将木糖还原酶基因、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因及L-木酮糖还原酶基因整合至出发菌株的基因组中；或，（2）将含有木糖还原酶基因、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因及L-木酮糖还原酶基因的质粒转化至出发菌株中；得到共表达木糖还原酶基因、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因及L-木酮糖还原酶基因的基因工程菌。

本发明提供了上述基因工程菌在生物法制备木糖醇中的应用。

本发明的基因工程菌中，所使用的木糖还原酶基因、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因及L-木酮糖还原酶基因可以为任一来源，所述三种基因分别在出发菌株中的表达产物具有相对应的正常功能及活性时，所述任一来源的木糖还原酶基因、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因及L-木酮糖还原酶基因的任一组合都可以实现以半纤维素水解液为底物催化产生木糖醇的功能。

本发明还提供了一种生产木糖醇的方法，具体为：以半纤维素水解液、葡萄糖、有机氮源为底物，使用上述的基因工程菌发酵生产木糖醇。

进一步地，所述发酵底物中，有机氮源为动物来源的或植物来源的细胞培养用有机氮源，优选为蛋白胨、酵母粉或玉米浆干粉中的一种或组合物。

进一步地，所述发酵底物中，木糖和葡萄糖的质量比为5:1 ~ 2:1。

进一步地，所述发酵过程中，所述发酵过程中，以接种后初始发酵条件下的溶氧为100%计，溶解氧维持在0～50%之间；pH为6.0-8.0；温度为18-37℃。

进一步地，所述半纤维素水解液由含丰富半纤维素的生物质经水解处理后获得；所述含丰富半纤维素的生物质为玉米芯、造纸短纤维、甘蔗渣、秸秆或稻壳。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明中基因工程菌中共表达XR基因、LAD基因及LXR基因，可以将半纤维素水解液中的木糖以及阿拉伯糖转化为木糖醇，木糖的转化率超过99%，且无底物杂糖剩余，产物中没有L-阿拉伯糖醇的产生，极大地简化了生物法制备木糖醇分离纯化的工序，进一步降低了木糖醇的生产成本。

（2）本发明中基因工程菌中XR基因、LAD基因及LXR基因的来源广泛，不同组合均有较好的催化效果。

（3）本发明中基因工程菌发酵后将原本发酵产物中的副产物L-阿拉伯糖醇转化为木糖醇，进一步提升了木糖醇生产的产率。

附图说明

图1为木糖还原酶（XR）、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶（LAD）及L-木酮糖还原酶（LXR）制备木糖醇的反应示意图。

图2为整合型大肠杆菌基因工程菌W3110△ptsG△ptsF△xylAB-3-XR6-LAD5-LXR1在工业级培养基中利用半纤维素水解液补料分批发酵生产木糖醇。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。应该指出，以下详细说明都是示例性的，且仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本发明实施例中所用的实验材料均为本领域常规的实验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法使按照常规实验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

糖醇的检测：高效液相色谱测定，流动相为超纯水，Agilent Hi-Plex Ca色谱柱（7.7 mm×300 mm），柱温85℃；流速为0.6 mL/min。

本发明中涉及的基因名称解释如下：

ptsG基因：葡萄糖磷酸转移酶系统酶II组分基因；

ptsF基因：果糖磷酸转移酶系统酶II组分基因；

xylA基因：木糖异构酶基因；

xylB基因：木酮糖激酶基因；

XR：木糖还原酶；

LAD：L-阿拉伯糖-4-脱氢酶；

LXR：L-木酮糖还原酶。

ptsG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ptsF基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在大肠杆菌中，xylA基因和xylB基因两个基因连在一起，在进行基因敲除时将两个基因一起敲除，以下实施例中，将xylA基因和xylB基因两个基因合称为xylAB基因，xylAB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

以下实施例中，所属卡那霉素在培养基中的终浓度为50 μg/mL，所述壮观霉素在培养基中的终浓度为100 μg/mL，所述氯霉素在培养基中的终浓度为25 μg/mL。

本发明中所得共表达XR、LAD及LXR基因的工程菌的对于木糖以及阿拉伯糖的代谢途径如图1所示。

实施例1 大肠杆菌基因工程菌E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB的构建

根据大肠杆菌中木糖代谢途径及其全局调控，本发明在菌株E.coliW3110的基础上构建了一系列工程菌，如ptsG、ptsF、xylA、和xylB等的敲除或失活。其中ptsG的敲除减缓了CCR效应，ptsF的敲除可以降低木糖醇从胞外到胞内的转运，xylA和xylB的敲除可以阻断木糖的下游分解代谢途径。利用CRISPR/Cas9基因编辑方法（Multigene Editing intheEscherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System, Jiang Y, Chen B, et al.Appl Environ Microbiol, 2015）进行大肠杆菌基因组中ptsF、ptsG、xylA和xylB基因的敲除。

以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示。

表1 引物列表

（1）敲除ptsG基因的菌株E.coliW3110△ptsG的构建

PCR扩增：分别以ptsG-u-F和ptsG-u-R、ptsG-d-F和ptsG-d-R为引物，E.coliW3110基因组为模板扩增片段，各500 bp，胶回收；再以ptsG--u-F和ptsG-d-R为引物，回收获得的两个500 bp片段为模板扩增获得约为1000 bp的修复模板片段，胶回收。

ptsG-N20质粒构建：以ptsG-N20-F和ptsG-N20-R为引物，以pTargetF-cadA为模板，PCR扩增约2.2 kb的片段，DpnI消化后，构建获得ptsG-N20质粒。

电转感受态细胞制备：a) 挑取大肠杆菌单菌落于5 mL LB试管培养基中，37℃，200 rpm 培养至OD₆₀₀约为0.6；b) 使用灭菌的2 mL Ep管，菌液分装1.5 mL每管，4℃，4000rpm离心10 min，弃上清；c) 加入1 mL预冷的灭菌的10%甘油，轻轻重悬，4℃，4000 rpm离心10 min，小心地弃去上清；此步骤再重复2次；d) 用100 μL 10%的甘油重悬。用上述电转感受态制备方法制备大肠杆菌W3110感受态，将pCas质粒电转(电转条件：2.5 kV，200 Ω，25μF)入感受态细胞中，挑取W3110/pCas单菌落于5 mL含卡那霉素和10 mM阿拉伯糖的LB试管中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6，再用上述方法制备W3110/pCas电转感受态。

电转：将ptsG修复模板片段及ptsG-N20质粒电转入W3110/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜；长出单菌落利用特异性引物进行菌落PCR验证。

质粒丢失：挑取菌落PCR验证为阳性单菌落，接种于含卡那霉素的LB试管中，同时加入终浓度为10 mM鼠李糖，37℃过夜培养；次日试管中菌液接种于含有10 g/L蔗糖的无抗LB试管，37℃过夜培养；次日试管中菌液直接划线于无抗的LB平板上，37℃过夜培养；次日挑取单菌落分别转接于含壮观霉素或卡那霉素LB平板上；若都不能生长，表明pCas和ptsG-N20质粒均已丢失，得到E.coliW310△ptsG菌株。

（2）敲除ptsF基因的菌株E.coliW3110△ptsG△ptsF的构建

PCR扩增：分别以ptsF-u-F和ptsF-d-R、ptsF-d-F和ptsF-d-R为引物，W3110基因组为模板扩增片段，各500 bp，胶回收；再以ptsF--u-F和ptsF-d-R为引物，回收获得的两个500 bp片段为模板扩增获得约为1000 bp的修复模板片段，胶回收。

ptsF-N20质粒构建：以ptsF-N20-F和ptsF-N20-R为引物，以pTargetF-cadA为模板，PCR扩增约2.2 kb的片段，DpnI消化后，构建获得ptsF-N20质粒。

用上述电转感受态制备方法制备W3110△ptsG感受态，将pCas质粒电转入感受态细胞中，挑取W3110△ptsG/pCas单菌落于5 mL含卡那霉素和10 mM阿拉伯糖的LB试管中，37℃培养至OD600约为0.6，再用上述方法制备W3110△ptsG/pCas感受态。

电转：将ptsF修复模板片段及ptsF-N20质粒电转入W3110△ptsG/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜；长出单菌落利用特异性引物进行菌落PCR验证。

质粒丢失：用前述方法丢除pCas和ptsF-N20两个质粒，得到E.coliW3110△ptsG△ptsF菌株。

（3）敲除xylA和xylB基因的菌株E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB的构建

PCR扩增：分别以xylAB-u-F和xylAB-d-R、xylAB-d-F和xylAB-d-R为引物，W3110基因组为模板扩增片段，各500 bp，胶回收；再以xylAB--u-F和xylAB-d-R为引物，回收获得的两个500 bp片段为模板扩增获得约为1000 bp的修复模板片段，胶回收。

xylAB-N20质粒构建：以xylAB-N20-F和xylAB-N20-R为引物，以pTargetF-cadA为模板，PCR扩增约2.2 kb的片段，DpnI消化后，构建获得xylAB-N20质粒。

用上述电转感受态制备方法制备W3110△ptsG△ptsF感受态，将pCas质粒电转入感受态细胞中，挑取W3110△ptsG△ptsF/pCas单菌落于5 mL含卡那霉素和10 mM阿拉伯糖的LB试管中，37℃培养至OD600约为0.6，再用上述方法制备W3110△ptsG△ptsF/pCas感受态。

电转：将xylAB修复模板片段及xylAB-N20质粒电转入W3110△ptsG△ptsF/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜；长出单菌落利用特异性引物进行菌落PCR验证。

质粒丢失：用前述方法丢除pCas和xylAB-N20两个质粒，得到E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB菌株。

实施例2 表达不同来源木糖还原酶的基因工程菌的构建及摇瓶发酵

（1）获取不同来源的XR基因

根据 NCBI 上公开的XR基因序列，筛选出11个不同来源的野生型或突变型XR基因，将不同来源的野生型或突变型XR特定的基因序列进行全基因合成得到分别含有不同来源XR基因的质粒。

（2）构建含有不同来源的野生型XR基因的基因工程菌

a) 按照实施例1中方法制备大肠杆菌E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB电转感受态；

b) 将制备好的电转感受态细胞冰浴5 min，加入2-3 μL不同的XR表达的质粒进行电转；

c) 最后均匀涂布于含有氯霉素的LB平板中，置于37℃培养箱中培养过夜即得到含有不同来源XR质粒的基因工程菌：E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR1、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR2、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR3、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR4、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR5、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR6、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR7、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR8、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR9、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR10、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR11。

（3）不同来源的野生型木糖还原酶的摇瓶发酵实验

a) 分别挑取单克隆菌于5 mL LB-cm 培养基中，37℃振荡220 rpm培养8 h后获取种子液。

b) 以2%的接种量将菌液接种至摇瓶发酵培养基中，37℃下培养至OD为0.6-0.8。

c) 在各摇瓶发酵培养基中分别加入适量的木糖、葡萄糖和L-阿拉伯糖母液，使得发酵液中各底物的终浓度为：木糖20 g/L、葡萄糖10 g/L、L-阿拉伯糖2.5 g/L。底物添加后于30℃培养20-30 h。发酵培养后检测发酵产物木糖醇的浓度及L-阿拉伯糖醇的浓度。

由表2可以看出，不同来源的野生型XR催化木糖及L-阿拉伯糖产木糖醇和L-阿拉伯糖醇的效果近似，大部分的XR催化特异性较差，在催化木糖的同时，也能将L-阿拉伯糖催化成L-阿拉伯糖醇。摇瓶发酵20-30 h后，部分XR（XR-1/XR-4/XR-6/XR-11）将木糖全部转化为木糖醇，L-阿拉伯糖也几乎全部转化为了L-阿拉伯糖醇。11种不同来源的野生型XR的序列信息及发酵结果如表2所示。

表2. 不同来源的野生型木糖还原酶序列信息及发酵结果

实施例3 不同来源L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因的获取及表征

（1）获取不同来源的LAD基因

根据NCBI上公开的LAD基因，筛选出10个不同来源的野生型或突变型LAD基因，将不同来源的野生型或突变型LAD特定的基因序列进行全基因合成得到分别含有不同来源LAD基因的质粒p18-LAD1、p18-LAD2、p18-LAD3、p18-LAD4、p18-LAD5、p18-LAD6、p18-LAD7、p18-LAD8、p18-LAD9、p18-LAD10。

（2）构建含有不同来源的野生型或突变型LAD基因的基因工程菌

按照实施例1中方法制备E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB电转感受态并电转LAD表达质粒，得到含有不同来源LAD质粒的基因工程菌：E.coliW3110 △ptsG△ptsF△xylAB/LAD1、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LAD2、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LAD3、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LAD4、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LAD5、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LAD6、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LAD7、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LAD8、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LAD9、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LAD10。

（3）不同来源的LAD酶活的测定

a) 将10组LAD工程菌分别挑取单克隆接种于5 mL含有卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡220 rpm培养8 h后获取种子液；

b) 以2%的接种量将种子液转接至新鲜装有50 mL含有卡那霉素的LB培养基中培养30-40 h后收集菌液。其中LB培养基的组成为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl10g/L；

c) 取3-5 mL步骤（b）培养的菌液，于4℃下4000 rpm离心10 min，收集菌泥，用0.2M 的磷酸钾缓冲液（pH 8.0）重悬菌体，冰浴中超声破碎（每次超声持续2 s，两次超声之间间隔4 s，全程时间5 min）后即得不同来源的LAD粗酶液；

d) 酶活反应：取100 μL 1 M L-阿拉伯糖醇溶液、50 μL 40 mM NAD⁺、825 μL 0.1M Tris-HCl缓冲液于1.5 mL EP管中混匀，于30℃金属浴预热10 min。将25 μL稀释数倍的LAD酶粗酶液加入装有反应液的1.5 mL EP管中，快速上下颠倒数次后转移至1 cm比色皿中，测量1 分钟（每隔15 s）内OD₃₄₀的数值。

酶活计算：将30℃下每分钟催化生成1 μmol NADH的酶量定义为1 U；计算公式（Eq. 3-1）如下：

U⁄mL=(△A)/min×1/ε×1/d×Vt/Vs……………………………（Eq. 3-1）

上述公式可简化为（Eq. 3-2）：

U⁄mL=△A×1/6.402×40×粗酶液稀释倍数…………………（Eq. 3-2）

其中，ΔA/min表示每分钟吸光度的变化值，Vt表示反应液总体积（总反应1000 μL），Vs表示样品体积（样品体积250 μL），d表示比色杯光径（1 cm），ε表示摩尔消光系数。10种不同来源的野生型及突变型LAD的序列信息及表达酶活测定结果如表3所示。

表3. 不同来源的L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶序列信息及表达酶活测定结果

实施例4 不同来源L-木酮糖还原酶基因基因的获取及表征

（1）获取不同来源的LXR基因

根据 NCBI上公开的LXR基因序列，筛选出11个不同来源的野生型或突变型LXR基因，将不同来源的LXR特定的基因序列进行全基因合成，得到分别含有不同来源LXR基因的质粒p18-LXR1、p18-LXR2、p18-LXR3、p18-LXR4、p18-LXR5、p18-LXR6、p18-LXR7、p18-LXR8、p18 -LXR9、p18-LXR10、p18-LXR11。

（2）构建含有不同来源的LXR基因的基因工程菌

按照实施例1中方法制备E.coliW3110 △ptsG△ptsF△xylAB电转感受态并电转LXR表达质粒，获得含有不同来源LXR质粒的基因工程菌：E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LXR1、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LXR2、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LXR3、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LXR4、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LXR5、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LXR6、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LXR7、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LXR8、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LXR9、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LXR10、W3110△ptsG△ptsF△xylAB/p18-LXR11。

（3）不同来源LXR酶活的测定

a) 将11组LXR工程菌分别挑取单克隆接种于5 mL LB含有卡那霉素的培养基中，37℃振荡220 rpm培养8 h后获取种子液；

c) 取3-5 mL步骤（b）培养的菌液，于4℃下4000 rpm离心10 min，收集菌泥，用0.2M 的磷酸钾缓冲液（pH 8.0）重悬菌体，冰浴中超声破碎（每次超声持续2 s，两次超声之间间隔4 s，全程时间5 min）后即得不同来源的LXR粗酶液；

d) 酶活反应体系的配置：以100 mM Tris-HCl (pH 9.0)为缓冲体系，分别配制250 mM木糖醇溶液，20 mM NAD⁺和0.5 M MnCl₂溶液，4℃下保存；

e) 酶催化反应：向1.5 mL EP管中加入500 μL 粗酶液，400 μL 250 mM木糖醇，100μL NAD⁺以及1μL 0.5 M MnCl₂。在30℃金属浴中反应5 min，然后在100℃下煮沸10 min终止反应。

酶活力定义：通过HPLC分析测定反应过程木糖醇的消耗量，LXR活性的一个单位(U)被定义为1 min消耗1 μmol木糖醇所需的酶量。

11种不同来源的野生型及突变型LXR的序列信息及表达酶活测定结果如表4所示。

表4. 不同来源的L-木酮糖还原酶的序列信息及表达酶活测定结果

实施例5 共表达不同来源XR、LAD及LXR基因的质粒型基因工程菌摇瓶发酵实验

（1）构建共表达不同来源的LAD及LXR基因的重组质粒

除去酶库中酶活为0的LAD及LXR酶，分别从LAD酶库和LXR酶库中选取LAD5（酶活最高）以及LAD8（酶活最低），从LXR酶库中选择LXR1 (酶活最高)和LXR10（酶活最低），以BamHI和XbaI分别对质粒p18-LAD1和质粒p18-LAD8）进行酶切，重组至经相同酶切（BamHI和XbaI）的p18-LXR1和p18-LXR8的质粒中，获得p18-LAD5-LXR1、p18-LAD5-LXR10、p18-LAD8-LXR1和p18-LAD8-LXR10重组质粒。

（2）构建质粒型基因工程大肠杆菌DH5α-p18-LAD5-LXR1、DH5α-p18-LAD5-LXR10、DH5α-p18-LAD8-LXR1和DH5α-p18-LAD8-LXR10

从-80℃冰箱中取100 μL大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞悬液，冰浴中融化10min；分别加入2-10 μL重组质粒p18-LAD5-LXR1、p18-LAD5-LXR10、p18-LAD8-LXR1和p18-LAD8-LXR10，混匀后冰中放置30 min；42℃水浴中热击45 s后迅速置于冰上冷却1-2 min；向管中加入890 μL液体LB培养基，混匀后37℃复苏1 h；将上述菌液摇匀后取100 μL涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养。分别挑取平板上的单克隆于5 mL加有卡那霉素的LB培养基中培养菌液进行测序，获得序列正确的不同来源LAD和LXR重组质粒。

（3）构建共表达任不同来源XR、LAD和LXR的质粒型基因工程菌

按照实施例1中方法制备E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB/（XR1-7,11）电转感受态并电转LAD和LXR重组表达质粒，得到共表达任一组合不同来源XR、LAD和LXR的质粒型基因工程菌。

（4）共表达XR、LAD和LXR的基因工程菌摇瓶发酵实验

a) 分别挑取长势良好的单克隆菌于5 mL加有卡那霉素和氯霉素的LB培养基中，37℃下培养12 h后为种子液；

b) 以2%的接种量分别将培养好的种子液接种于发酵培养基中，37℃下培养至OD为0.6-0.8，在各摇瓶发酵培养基中分别加入适量的木糖、葡萄糖和L-阿拉伯糖母液，使得发酵液中各底物的终浓度为：木糖20 g/L、葡萄糖10 g/L、L-阿拉伯糖2.5 g/L。底物添加后于30℃培养96 h。发酵培养后检测发酵产物木糖醇的浓度及L-阿拉伯糖醇的浓度，计算木糖及L-阿拉伯糖醇的转化率；

由表5可以看出，不同XR、LAD和LXR组合表达时发酵产木糖醇及L-阿拉伯糖醇的效率也不同，每个XR、LAD及LXR组合中一部分L-阿拉伯糖醇都转化成了木糖醇，提升了木糖醇的产量，其中XR-6、LAD-5及LXR-1组合表达的基因工程菌产木糖醇的效率最高，发酵30 h后，木糖转化率为98.88%，L-阿拉伯糖醇的转化率为91.96%。随着发酵时间的延长，96 h以后，木糖和L-阿拉伯糖醇的转化率均超过了99.9%，说明木糖还原酶基因、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因及L-木酮糖还原酶基因，只要能在宿主细胞中功能表达，其来源可以为任一来源，不影响最终木糖和L-阿拉伯糖醇的转化率。

表5 质粒型基因工程菌E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB/XR/LAD-LXR摇瓶发酵结果

实施例6 共表达XR、LAD及LXR基因的多拷贝基因组整合型工程菌构建及摇瓶发酵

（1）大肠杆菌基因组3拷贝目的基因XR、LAD及LXR整合系统的构建

利用实施例1中的CRISPR/Cas9基因编辑工具分别将不同来源的XR、LAD及LXR基因整合至大肠杆菌E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB基因组中，得到3拷贝XR、LAD及LXR基因的整合型基因工程菌E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB::3(XR-LAD-LXR)。

（2）共表达XR、LAD及LXR整合型基因工程菌摇瓶发酵培养

摇瓶发酵培养实验同实施例5。整合型基因工程菌摇瓶发酵实验结果如表6所示。从表6可以看出，不同组合的3 拷贝XR、LAD及LXR基因的整合型基因工程菌发酵转化木糖及L-阿拉伯糖醇的效率各不相同。对比质粒型表达基因工程菌摇瓶发酵的结果，发现整合型基因工程菌摇瓶发酵的效果要明显优于质粒型的基因工程菌，整合型的基因工程菌发酵木糖转化率和L-阿拉伯糖醇的转化率更高，其中XR-6、LAD-5 及LXR-1组合表达的整合型基因工程菌产木糖醇的效果最好，发酵30 h后，木糖和L-阿拉伯糖醇的转化率均超过了99.9%，这说明共表达XR、LAD及LXR基因的形式，也可以是将相关基因整合进宿主菌的基因组中进行共表达。

表6. 整合型基因工程菌E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB::3(XR-LAD-LXR)摇瓶发酵结果

实施例7 共表达XR、LAD及LXR基因的多拷贝基因组整合型工程菌发酵罐发酵

根据实施例5及实施例6摇瓶发酵的结果，以3 拷贝XR-6、LAD-5及LXR-1基因组整合型基因工程菌G1（E.coliW3110△ptsG△ptsF△xylAB::3(XR6-LAD5-LXR1)）为发酵菌种。发酵具体步骤为：

以10%的接种量将整合型菌种接种至15 L发酵罐于30℃下培养72 h，其中，初始装液量为6 L、转速为400 rpm，通气比为0.8 vvm，pH为7.0（流加 NH₃·H₂O 控制）。发酵过程中，通过转速调节使溶氧维持在30%；当OD600达到15左右时（约8 h），添加适量经过浓缩的半纤维素水解液，使木糖的终浓度约为40 g/L。于此同时，添加终浓度为10 g/L有机氮源；在发酵20 h和 40 h左右，各添加1 L的半纤维素水解液使木糖终浓度约为60 g/L，同时各添加终浓度为40 g/L葡萄糖以及5 g/L有机氮源。去除稀释效应，木糖的总浓度约为160 g/L，发酵罐中总的培养物体积为12 L，发酵过程中每隔8 h取样，检测发酵液中剩余底物葡萄糖、木糖及L-阿拉伯糖的浓度以及产物木糖醇和L-阿拉伯糖醇的浓度。

其中发酵罐中的发酵培养基其他组分如下：Na₂HPO₄6-10 g/L，KH₂PO₄3-5 g/L，NH₄Cl 1-5 g/L，NaCl 0.5-2 g/L，MgSO₄0.1-0.5 g/L，CaCl₂0.1-0.5 g/L。

由图2可以看出，通过15 L发酵罐发酵培养64 h后，半纤维素水解液中的底物木糖的转化率超过99.9%，且没有其他底物（葡萄糖、L-阿拉伯糖）剩余，产物中没有L-阿拉伯糖醇的生成，L-阿拉伯糖醇转化为木糖醇的转化率超过99.9%，木糖醇的产量高达169.48 g/L。

对比例1

按照实施例5的方法，构建共表达L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶及L-木酮糖还原酶基因的基因工程菌E.coliW3110 △ptsG△ptsF△xylAB/p18-LAD5-LXR1。

同样按照实施例5进行基因工程菌摇瓶发酵实验。发酵培养后检测发酵产物木糖醇的浓度及L-阿拉伯糖醇的浓度，计算木糖及L-阿拉伯糖醇的转化率。

发酵48 h后，木糖转化率为1.09%，没有检测到L-阿拉伯糖醇。

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为共表达木糖还原酶基因、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因及L-木酮糖还原酶基因的基因工程菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述木糖还原酶基因为XR基因，所述XR基因为NCBI登录号AF451326.3、KF752418.1、AF074484.1、AB002106.1、ALO17776.1、EAA34695.1、AAA99507.1、Q9P8R5.1中的一种；

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于：所述XR基因与LXR基因的组合形式如下所示：

（1）AF451326.3、KAG7881166.1；（2）AF451326.3、GCF00616.1；

（3）KF752418.1、KAG7881166.1；（4）KF752418.1、GCF00616.1；

（5）AF074484.1、KAG7881166.1；（6）AF074484.1、GCF00616.1；

（7）AB002106.1、KAG7881166.1；（8）AB002106.1、GCF00616.1；

（9）ALO17776.1、KAG7881166.1；（10）ALO17776.1、GCF00616.1；

（11）EAA34695.1、KAG7881166.1；（12）EAA34695.1、GCF00616.1；

（13）AAA99507.1、KAG7881166.1；（14）AAA99507.1、GCF00616.1；

（15）Q9P8R5.1、KAG7881166.1；（16）Q9P8R5.1、GCF00616.1。

4.根据权利要求1所述的所述基因工程菌，其特征在于：所述L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因为LAD基因，所述LAD基因为NCBI登录号KX591955.1、KX591956.1、KX591957.1、AAL08944.1、EAA36547.1、BAC81768.1、EDP56335.1、XP_002569286.1、EDK37120.2、CAH69383.1中的一种。

5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的出发菌株为野生型大肠杆菌，或为，敲除或沉默了ptsG基因、ptsF基因、xylA基因、xylB基因中至少一个基因后的大肠杆菌。

6. 根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli W3110。

7.如权利要求1~6任一项所述的基因工程菌在生物法制备木糖醇中的应用。

8.如权利要求1~6任一项所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于：

（1）将木糖还原酶基因、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因及L-木酮糖还原酶基因整合至出发菌株的基因组中；

或，（2）将含有木糖还原酶基因、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因及L-木酮糖还原酶基因的质粒转化至出发菌株中；

得到共表达木糖还原酶基因、L-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶基因及L-木酮糖还原酶基因的基因工程菌。

9.一种制备木糖醇的方法，其特征在于：以半纤维素水解液、葡萄糖、有机氮源为底物，使用权利要求1~6任一项所述的基因工程菌发酵生产木糖醇。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述发酵底物中，有机氮源为动物来源或植物来源的细胞培养用有机氮源。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述有机氮源为蛋白胨、酵母粉或玉米浆干粉中的一种或多种。

12. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述发酵底物中，木糖和葡萄糖的质量比为5:1 ~ 2:1。

13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述发酵过程中，以接种后初始发酵条件下的溶氧为100%计，溶解氧维持在0～50%之间；pH为6.0~8.0；温度为18~37℃。