CN109890832A - 脂肪醇和脂肪醛的半生物合成产生 - Google Patents

脂肪醇和脂肪醛的半生物合成产生 Download PDF

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Abstract

本申请涉及从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法，该方法是通过将从生物来源获得或产生该一种或多种不饱和脂质部分与由非生物方式将该一种或多种不饱和脂肪部分转化为一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛组合。本申请还涉及具有用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的重组微生物。该一种或多种脂肪醇可以进一步化学转化为一种或多种相应的脂肪乙酸酯。通过本文所述方法产生的该一种或多种脂肪醇、一种或多种脂肪醛和/或一种或多种脂肪乙酸酯可以是一种或多种昆虫信息素、一种或多种香料、一种或多种调味剂或一种或多种聚合物中间体。

Description

脂肪醇和脂肪醛的半生物合成产生
相关申请
本申请要求2016年6月6日提交的美国临时申请序列号62/346,335的优先权益，其全部内容特此通过引用并入。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质拷贝，并且通过引用特此并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是PRVI-017_01WO_SeqList_ST25.txt。文本文件为约103KB，创建于2017-06-05，并通过EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本申请涉及通过以下从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法：从一种或多种天然存在的生物体获得一种或多种不饱和脂质部分，或在被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的一种或多种重组微生物中产生该一种或多种不饱和脂质部分，将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种游离脂肪酸(FFA)和/或一种或多种脂肪酸烷基酯(FAAE)，以及还原该一种或多种FFA和/或一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。一种或多种脂肪醇可以进一步化学转化为一种或多种相应的脂肪乙酸酯。一种或多种脂肪醇、一种或多种脂肪醛和/或一种或多种脂肪乙酸酯可以用作昆虫信息素、香料、调味剂和聚合物中间体。本申请进一步涉及可用于生物合成不饱和脂质部分的重组微生物以及包含一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的组合物。
发明背景
随着全球对食品的需求增长，对有效控制有害生物的需求日益增加。常规的杀昆虫剂是最受欢迎的化学控制剂之一，因为它们易于获得、速效且高度可靠。然而，这些化学物质的过度使用、错用和滥用导致了抗性有害生物、自然生态的改变、以及环境破坏(在某些情况下)。
使用昆虫信息素控制有害生物种群作为常规杀昆虫剂的一种可行、安全和环境友好的替代品越来越受欢迎。自从在20世纪50年代后期发现它们以来，这些分子已经通过多种方法显示出减少昆虫种群的功效，这些方法包括大规模捕获、吸引并杀灭以及交配干扰。后一种方法特别代表了无毒的有害生物控制手段，并利用合成信息素的能力掩盖自然存在的信息素，从而导致混乱和交配干扰。
尽管信息素在农业昆虫控制方面具有显著的潜力，但使用现有可用技术合成信息素的成本非常高，这阻止了这种可持续技术在高价值作物之外的广泛使用。因此，现在需要开发用于昆虫信息素和相关香料、调味剂以及聚合物中间体的成本有效生产的新技术。本发明人通过开发用于从低成本原料半生物合成生产脂肪醇和/或脂肪醛(包括合成昆虫信息素)的方法来满足这种需要。
发明概述
本申请涉及从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法，该方法是通过将从生物来源获得或产生该一种或多种不饱和脂质部分与由非生物方式将该一种或多种不饱和脂肪部分转化为一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛组合。本申请还涉及具有用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的重组微生物。通过本文所述方法产生的一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛可以是一种或多种昆虫信息素、一种或多种香料、一种或多种调味剂或一种或多种聚合物中间体。
在一个方面，从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法包括以下步骤：从一种或多种天然存在的生物体获得一种或多种不饱和脂质部分；以及直接还原该一种或多种不饱和脂质部分，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。
在另一方面，从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法包括以下步骤：从一种或多种天然存在的生物体获得一种或多种不饱和脂质部分；将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种游离脂肪酸(FFA)；将该一种或多种FFA酯化成一种或多种脂肪酸烷基酯(FAAE)；以及还原该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在另一方面，从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法包括以下步骤：从一种或多种天然存在的生物体获得一种或多种不饱和脂质部分；将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种FAAE；以及还原该一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在一个实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体是昆虫。在另一个实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体不是昆虫。在一些实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体选自下组，该组由以下各项组成：植物、藻类和细菌。在一些实施方案中，该植物来自选自下组的家族，该组由以下各项组成：山龙眼科(Proteaceae)和鼠李科(Rhamnaceae)。在某些实施方案中，该植物包括来自以下属的物种：Gevuina属、金盏花属(Calendula)、沼沫花属(Limnanthes)、新月花属(Lunaria)、葛缕子属(Carum)、胡萝卜属(Daucus)、芫荽属(Coriandrum)、澳洲坚果属(Macadamia)、肉豆蔻属(Myristica)、Licania属、石栗属(Aleurites)、蓖麻属(Ricinus)、榛属(Corylus)、Kermadecia属、马利筋属(Asclepias)、Cardwellia属、银桦属(Grevillea)、Orites属、枣属(Ziziphus)、Hicksbeachia属、沙棘属(Hippophae)、麻黄属(Ephedra)、Placospermum属、木龙山龙眼属(Xylomelum)和/或希蒙得木属(Simmondsia)。在一些实施方案中，该植物选自下组，该组由以下各项组成：智利榛(Gevuina avellana)、欧洲榛(Corylus avellana)、Kermadecia sinuata、叙利亚马利筋(Asclepias syriaca)、蕾丝木(Cardwellia sublimis)、黄紫伊素银桦(Grevillea exulvar.rubiginosa)、Orites diversifolius、Orites revoluta、枣(Ziziphus jujube)、Hicksbeachia pinnatifolia和迪科拉银桦(Grevillea decora)。在一些实施方案中，该藻类包括绿藻。在某些实施方案中，该绿藻包括来自盘星藻属(Pediastrum)的物种。在一些实施方案中，该绿藻包括单角盘星藻(Pediastrum simplex)。在一些实施方案中，该细菌包括革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，该革兰氏阴性细菌包括来自粘球菌属(Myxococcus)的物种。在某些实施方案中，该革兰氏阴性细菌包括黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)。在一些实施方案中，该细菌包括蓝细菌。在一些实施方案中，该蓝细菌包括来自聚球蓝细菌属(Synechococcus)的物种。在某些实施方案中，该蓝细菌包括细长聚球菌(Synechococcuselongatus)。
在另一方面，从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法包括以下步骤：在被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的一种或多种重组微生物中产生该一种或多种不饱和脂质部分；将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种游离脂肪酸(FFA)和/或一种或多种脂肪酸甲酯(FAAE)；以及还原该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在一个实施方案中，该一种或多种重组微生物使用一种或多种碳源以产生一种或多种不饱和脂质部分。在另一个实施方案中，该一种或多种碳源包括糖、甘油、乙醇、有机酸、烷烃和/或脂肪酸。在某些实施方案中，该一种或多种碳源选自下组，该组由以下各项组成：烷烃和脂肪酸。在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物对烷烃和/或脂肪酸具有高耐受性。在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物累积脂质。在其他实施方案中，该一种或多种重组微生物包括一种或多种细菌和/或真菌。在某些实施方案中，该一种或多种真菌是含油酵母。在一个实施方案中，该含油酵母包括来自耶氏酵母(Yarrowia)属和/或假丝酵母(Candida)属的物种。在另一个实施方案中，该含油酵母包括解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和/或维斯假丝酵母(Candida viswanathii)/热带假丝酵母(Candida tropicalis)。
在一个实施方案中，被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的一种或多种重组微生物包含一种或多种选自以下项的外源生物合成酶：一种或多种去饱和酶、一种或多种酰基-CoA氧化酶、一种或多种酰基甘油脂肪酶、一种或多种黄素蛋白吡啶核苷酸细胞色素还原酶、一种或多种延伸酶、一种或多种硫酯酶、一种或多种甘油-3-磷酸酰基转移酶、一种或多种溶血磷脂酸酰基转移酶、一种或多种二酰基甘油酰基转移酶和/或一种或多种脂质结合蛋白。在另一个实施方案中，该一种或多种去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：脂肪酰基-CoA去饱和酶和脂肪酰基-ACP去饱和酶。在一些实施方案中，该一种或多种黄素蛋白吡啶核苷酸细胞色素还原酶选自下组，该组由以下各项组成：细胞色素-b5还原酶和NADPH依赖性细胞色素P450还原酶。在一些实施方案中，该一种或多种延伸酶选自下组，该组由以下各项组成：ELO1、ELO2、ELO3或其任何组合。在一些实施方案中，该一种或多种硫酯酶选自下组，该组由以下各项组成：酰基-ACP硫酯酶和酰基-CoA硫酯酶。在一些实施方案中，该一种或多种甘油-3-磷酸酰基转移酶是双甘油-3-磷酸O-酰基转移酶/二羟基丙酮磷酸酰基转移酶。在一些实施方案中，该一种或多种溶血磷脂酸酰基转移酶选自下组，该组由以下各项组成：SLC1、ALE1和LOA1或其任何组合。在一些实施方案中，该一种或多种二酰基甘油酰基转移酶选自下组，该组由以下各项组成：酰基-CoA依赖性酰基转移酶和磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。在一些实施方案中，该一种或多种脂质结合蛋白是甾醇载体蛋白2(SCP2)。在一些实施方案中，该一种或多种外源生物合成酶来自选自下组的属，该组由以下各项组成：酵母属(Saccharomyces)、耶氏酵母属、假丝酵母属、棉铃虫属(Helicoverpa)、黄地老虎属(Agrotis)、粉夜蛾属(Trichoplusia)、夜蛾属(Spodoptera)、玉米螟属(Ostrinia)、脐橙螟蛾属(Amyelois)、花翅小蛾属(Lobesia)、小卷蛾属、梨小食心虫属(Grapholita)、红醋栗穿孔蛾属(Lampronia)、蛀茎夜蛾属(Sesamia)、谷斑螟属(Plodia)、家蚕属(Bombyx)、刺葵属、鼠属(Rattus)、拟南芥属(Arabidopsis)、菜蛾属(Plutella)和蔽眼蝶属(Bicyclus)。在一些实施方案中，该一种或多种外源生物合成酶来自选自下组的物种，该组由以下各项组成：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母、白假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、维斯假丝酵母、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、玉米穗蛾(Helicoverpa zea)、黄地老虎(Agrotissegetum)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、棉灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、脐橙螟蛾(Amyelois transitella)、葡萄藤蛾(Lobesia botrana)、苹果小卷蛾(Cydia pomonella)、红醋栗穿孔蛾(Lampronia capitella)、梨小食心虫(Grapholita molesta)、麻田豆秆野螟(Ostrinia scapulalis)、亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、虎杖螟(Ostrinia latipennis)、Ostrinia ovalipennis、印度谷螟(Plodia interpunctella)、大螟(Sesamia inferens)、家蚕(Bombyx mori)、海枣(Phoenix dactylifera)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小菜蛾(Plutella xylostella)和偏瞳蔽眼蝶(Bicyclusanynana)。
在一些实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶是能够利用脂肪酰基-CoA作为底物的去饱和酶，该脂肪酰基-CoA具有6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个碳原子的链长。
在一些实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶能够在脂肪酸或其衍生物(如例如，脂肪酸CoA酯)的C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12或C13位置生成双键。
在一个示例性实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶是Z11去饱和酶。在本文所述的各个实施方案中，Z11去饱和酶或编码它的核酸序列可以分离自物种黄地老虎、脐橙螟蛾、红带卷蛾(Argyrotaenia velutiana)、蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana)、红醋栗穿孔蛾、粉纹夜蛾、玉米穗蛾或假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的生物体。另外的Z11去饱和酶或编码它们的核酸序列可以分离自家蚕、烟草天蛾(Manduca sexta)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、埃及金刚钻(Earias insulana)、翠纹金刚钻(Eariasvittella)、小菜蛾、家蚕或黄瓜绢野螟(Diaphania nitidalis)。在示例性实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自GenBank登录号JX679209、JX964774、AF416738、AF545481、EU152335、AAD03775、AAF81787和AY493438的序列。在一些实施方案中，密码子优化了编码Z11去饱和酶的核酸序列，其来自物种黄地老虎、脐橙螟蛾、红带卷蛾、蔷薇斜条卷叶蛾、红醋栗穿孔蛾、粉纹夜蛾、玉米穗蛾或假微型海链藻的生物体。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自粉纹夜蛾的SEQ ID NO:3、11、17和19。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自粉纹夜蛾的SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。在其他实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自黄地老虎的SEQ ID NO:4和9。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自黄地老虎的SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自假微型海链藻的SEQID NO:5和16。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的氨基酸序列：来自假微型海链藻的SEQ ID NO:26和27。在某些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自脐橙螟蛾的SEQ ID NO:6、10和23。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自脐橙螟蛾的SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列。在另外的实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:7、12、18、20和24。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自大螟的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含GenBank登录号AF416738、AGH12217.1、AII21943.1、CAJ43430.2、AF441221、AAF81787.1、AF545481、AJ271414、AY362879、ABX71630.1和NP001299594.1、Q9N9Z8、ABX71630.1和AIM40221.1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含嵌合多肽。在一些实施方案中，完全或部分Z11去饱和酶与另一种多肽融合。在某些实施方案中，Z11去饱和酶的N末端天然前导序列被来自另一物种的油质蛋白前导序列替代。在某些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：SEQ ID NO:8、21和22。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的氨基酸序列：SEQ ID NO:33、34、35、36、37和38。
在某些实施方案中，该Z11去饱和酶催化脂肪酰基-CoA转化为选自以下项的单或双不饱和产物：Z11-13:酰基-CoA、E11-13:酰基-CoA、(Z,Z)-7,11-13:酰基-CoA、Z11-14:酰基-CoA、E11-14:酰基-CoA、(E,E)-9,11-14:酰基-CoA、(E,Z)-9,11-14:酰基-CoA、(Z,E)-9,11-14:酰基-CoA、(Z,Z)-9,11-14:酰基-CoA、(E,Z)-9,11-15:酰基-CoA、(Z,Z)-9,11-15:酰基-CoA、Z11-16:酰基-CoA、E11-16:酰基-CoA、(E,Z)-6,11-16:酰基-CoA、(E,Z)-7,11-16:酰基-CoA、(E,Z)-8,11-16:酰基-CoA、(E,E)-9,11-16:酰基-CoA、(E,Z)-9,11-16:酰基-CoA、(Z,E)-9,11-16:酰基-CoA、(Z,Z)-9,11-16:酰基-CoA、(E,E)-11,13-16:酰基-CoA、(E,Z)-11,13-16:酰基-CoA、(Z,E)-11,13-16:酰基-CoA、(Z,Z)-11,13-16:酰基-CoA、(Z,E)-11,14-16:酰基-CoA、(E,E,Z)-4,6,11-16:酰基-CoA、(Z,Z,E)-7,11,13-16:酰基-CoA、(E,E,Z,Z)-4,6,11,13-16:酰基-CoA、Z11-17:酰基-CoA、(Z,Z)-8,11-17:酰基-CoA、Z11-18:酰基-CoA、E11-18:酰基-CoA、(Z,Z)-11,13-18:酰基-CoA、(E,E)-11,14-18:酰基-CoA或其组合。
在另一个示例性实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶是Z9去饱和酶。在本文所述的各个实施方案中，该Z9去饱和酶或编码它的核酸序列可以分离自物种亚洲玉米螟、欧洲玉米螟、蔷薇斜条卷叶蛾、红醋栗穿孔蛾、烟夜蛾(Helicoverpa assulta)或玉米穗蛾的生物体。在示例性实施方案中，该Z9去饱和酶包含选自GenBank登录号AY057862、AF243047、AF518017、EU152332，AF482906和AAF81788的序列。在一些实施方案中，编码Z9去饱和酶的核酸序列经密码子优化。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自亚洲玉米螟的SEQ IDNO:13中列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自亚洲玉米螟的SEQID NO:30中列出的氨基酸序列。在其他实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自红醋栗穿孔蛾的SEQ ID NO:14中列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自红醋栗穿孔蛾的SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:15中列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该Z9去饱和酶催化脂肪酰基-CoA转化为选自以下项的单不饱和或多不饱和产物：Z9-11:酰基-CoA、Z9-12:酰基-CoA、E9-12:酰基-CoA、(E,E)-7,9-12:酰基-CoA、(E,Z)-7,9-12:酰基-CoA、(Z,E)-7,9-12:酰基-CoA、(Z,Z)-7,9-12:酰基-CoA、Z9-13:酰基-CoA、E9-13:酰基-CoA、(E,Z)-5,9-13:酰基-CoA、(Z,E)-5,9-13:酰基-CoA、(Z,Z)-5,9-13:酰基-CoA、Z9-14:酰基-CoA、E9-14:酰基-CoA、(E,Z)-4,9-14:酰基-CoA、(E,E)-9,11-14:酰基-CoA、(E,Z)-9,11-14:酰基-CoA、(Z,E)-9,11-14:酰基-CoA、(Z,Z)-9,11-14:酰基-CoA、(E,E)-9,12-14:酰基-CoA、(Z,E)-9,12-14:酰基-CoA、(Z,Z)-9,12-14:酰基-CoA、Z9-15:酰基-CoA、E9-15:酰基-CoA、(Z,Z)-6,9-15:酰基-CoA、Z9-16:酰基-CoA、E9-16:酰基-CoA、(E,E)-9,11-16:酰基-CoA、(E,Z)-9,11-16:酰基-CoA、(Z,E)-9,11-16:酰基-CoA、(Z,Z)-9,11-16:酰基-CoA、Z9-17:酰基-CoA、E9-18:酰基-CoA、Z9-18:酰基-CoA、(E,E)-5,9-18:酰基-CoA、(E,E)-9,12-18:酰基-CoA、(Z,Z)-9,12-18:酰基-CoA、(Z,Z,Z)-3,6,9-18:酰基-CoA、(E,E,E)-9,12,15-18:酰基-CoA、(Z,Z,Z)-9,12,15-18:酰基-CoA或其组合。
在一些实施方案中，催化脂肪酰基-CoA转化为单或多不饱和中间体的脂肪酰基去饱和酶选自E5-10:酰基-CoA、E7-12:酰基-CoA、E9-14:酰基-CoA、E11-16:酰基-CoA、E13-18:酰基-CoA,Z7-12:酰基-CoA、Z9-14:酰基-CoA、Z11-16:酰基-CoA、Z13-18:酰基-CoA、Z8-12:酰基-CoA、Z10-14:酰基-CoA、Z12-16:酰基-CoA、Z14-18:酰基-CoA、Z7-10:酰基-coA、Z9-12:酰基-CoA、Z11-14:酰基-CoA、Z13-16:酰基-CoA、Z15-18:酰基-CoA、E7-10:酰基-CoA、E9-12:酰基-CoA、E11-14:酰基-CoA、E13-16:酰基-CoA、E15-18:酰基-CoA、E5Z7-12:酰基-CoA、E7Z9-12:酰基-CoA、E9Z11-14:酰基-CoA、E11Z13-16:酰基-CoA、E13Z15-18:酰基-CoA、E6E8-10:酰基-CoA、E8E10-12:酰基-CoA、E10E12-14:酰基-CoA、E12E14-16:酰基-CoA,Z5E8-10:酰基-CoA、Z7E10-12:酰基-CoA、Z9E12-14:酰基-CoA、Z11E14-16:酰基-CoA、Z13E16-18:酰基-CoA、Z3-10:酰基-CoA、Z5-12:酰基-CoA、Z7-14:酰基-CoA、Z9-16:酰基-CoA、Z11-18:酰基-CoA,Z3Z5-10:酰基-CoA、Z5Z7-12:酰基-CoA、Z7Z9-14:酰基-CoA、Z9Z11-16:酰基-CoA、Z11Z13-16:酰基-CoA和Z13Z15-18:酰基-CoA。
在一些实施方案中，该重组微生物可以表达能够催化两个双键随后的去饱和的双功能去饱和酶。
在一些实施方案中，该重组微生物可表达多于一种编码脂肪酰基去饱和酶的外源核酸分子，该脂肪酰基去饱和酶催化饱和C6-C24脂肪酰基-CoA转化为相应的单或多不饱和C6-C24脂肪酰基-CoA。例如，该重组微生物可以表达编码Z11去饱和酶的外源核酸分子和编码Z9去饱和酶的另一种外源核酸分子。
在一些实施方案中，被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的一种或多种重组微生物包含至少一种编码酰基-CoA氧化酶的外源核酸分子，该酰基-CoA氧化酶在酰基-CoA氧化酶活性的一个或多个逐次循环后催化单或多不饱和C6-C24脂肪酰基-CoA转化为截短的单或多不饱和脂肪酰基-CoA，其中给定循环产生相对于该循环中的起始单或多不饱和C6-C24脂肪酰基-CoA底物具有两个碳截短的单或多不饱和C4-C22脂肪酰基-CoA中间体。在一些实施方案中，该酰基-CoA氧化酶选自表3a。
在一些实施方案中，该重组微生物进一步包含至少一种编码酰基甘油脂肪酶和/或甾醇酯酯酶的内源或外源核酸分子，该酰基甘油脂肪酶和/或甾醇酯酯酶优选地水解>C16、>C14、>C12或>C10酰基甘油底物的酯键。在一些实施方案中，表达的酰基甘油脂肪酶和/或甾醇酯酯酶选自表3b。
在一个实施方案中，被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的一种或多种重组微生物进一步被操纵以使与用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径竞争的途径中的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在一些实施方案中，该一种或多种内源蛋白来自选自下组的属，该组由以下各项组成：酵母属、耶氏酵母属和假丝酵母属。在其他实施方案中，该一种或多种内源蛋白来自选自下组的物种，该组由以下各项组成：酿酒酵母、解脂耶氏酵母、白假丝酵母和热带假丝酵母/维斯假丝酵母。
在一些实施方案中，该重组微生物被操纵以使涉及一种或多种不希望的脂肪酸延伸途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在某些实施方案中，涉及一种或多种不希望的脂肪酸延伸途径的一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：β-酮脂酰基-CoA还原酶、β-羟酰基-CoA脱水酶、烯酰基-CoA还原酶或其任何组合。
在其他实施方案中，该重组微生物被操纵以使涉及一种或多种脂质体储存和/或回收途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在某些实施方案中，涉及一种或多种脂质体储存和/或回收途径的一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：三酰基甘油脂肪酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、甾醇酯水解酶、酰基-CoA合成酶或其任何组合。在一些实施方案中，其活性待缺失、破坏、突变和/或降低的三酰基甘油脂肪酶是YALI0D17534g(TGL3)。在一些实施方案中，其活性待缺失、破坏、突变和/或降低的脂肪酰基-CoA合成酶(脂肪酸转运蛋白)是YALI0E16016g(FAT1)。
在一些实施方案中，该重组微生物被操纵以使涉及一种或多种脂肪酸降解途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在某些实施方案中，该脂肪酸降解途径是β-氧化途径。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：酰基-CoA氧化酶、多功能烯酰基-CoA水合酶-β-羟酰基-CoA脱氢酶、β-酮脂酰基-CoA硫解酶或其任何组合。在一些优选的实施方案中，使微生物宿主编码酰基-CoA氧化酶的一个或多个基因缺失或下调以消除或减少超过所希望链长的所希望脂肪酰基-CoA的截短。在一些实施方案中，该重组微生物包含选自下组的一种或多种内源酰基-CoA氧化酶活性的缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：解脂耶氏酵母POX1(YALI0E32835g)、解脂耶氏酵母POX2(YALI0F10857g)、解脂耶氏酵母POX3(YALI0D24750g)、解脂耶氏酵母POX4(YALI0E27654g)、解脂耶氏酵母POX5(YALI0C23859g)、解脂耶氏酵母POX6(YALI0E06567g)；酿酒酵母POX1(YGL205W)；假丝酵母POX2(CaO19.1655、CaO19.9224、CTRG_02374、M18259)、假丝酵母POX4(CaO19.1652、CaO19.9221、CTRG_02377、M12160)和假丝酵母POX5(CaO19.5723、CaO19.13146、CTRG_02721、M12161)。
在一些实施方案中，使重组微生物编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)、甘油磷脂酰基转移酶(GPLAT)和/或二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的一个或多个基因缺失或下调，并用一种或多种异源GPAT、LPAAT、GPLAT或DGAT变体替代。在一些实施方案中，该一种或多种酰基转移酶变体衍生自选自表3c的一种或多种异源酰基转移酶。在一些实施方案中，该重组微生物包含选自下组的一种或多种内源酰基转移酶活性的缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：解脂耶氏酵母YALI0C00209g、解脂耶氏酵母YALI0E18964g、解脂耶氏酵母YALI0F19514g、解脂耶氏酵母YALI0C14014g、解脂耶氏酵母YALI0E16797g、解脂耶氏酵母YALI0E32769g和解脂耶氏酵母YALI0D07986g、酿酒酵母YBL011w、酿酒酵母YDL052c、酿酒酵母YOR175C、酿酒酵母YPR139C、酿酒酵母YNR008w和酿酒酵母YOR245c以及假丝酵母I503_02577、假丝酵母CTRG_02630、假丝酵母CaO19.250、假丝酵母CaO19.7881、假丝酵母CTRG_02437、假丝酵母CaO19.1881、假丝酵母CaO19.9437、假丝酵母CTRG_01687、假丝酵母CaO19.1043、假丝酵母CaO19.8645、假丝酵母CTRG_04750、假丝酵母CaO19.13439、假丝酵母CTRG_04390、假丝酵母CaO19.6941、假丝酵母CaO19.14203和假丝酵母CTRG_06209。
在某些实施方案中，该脂肪酸降解途径是ω-氧化途径。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：单加氧酶(CYP52)、脂肪醇氧化酶、脂肪醇脱氢酶、醇脱氢酶、脂肪醛脱氢酶或其任何组合。在一些优选的实施方案中，该重组微生物包含选自下组的一种或多种内源细胞色素P450单加氧酶活性的缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：解脂耶氏酵母YALI0E25982g(ALK1)、解脂耶氏酵母YALI0F01320g(ALK2)、解脂耶氏酵母YALI0E23474g(ALK3)、解脂耶氏酵母YALI0B13816g(ALK4)、解脂耶氏酵母YALI0B13838g(ALK5)、解脂耶氏酵母YALI0B01848g(ALK6)、解脂耶氏酵母YALI0A15488g(ALK7)、解脂耶氏酵母YALI0C12122g(ALK8)、解脂耶氏酵母YALI0B06248g(ALK9)、解脂耶氏酵母YALI0B20702g(ALK10)、解脂耶氏酵母YALI0C10054g(ALK11)和解脂耶氏酵母YALI0A20130g(ALK12)。
在其他实施方案中，该重组微生物被操纵以使涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在某些实施方案中，涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：PEX1、PEX2、PEX3、PEX4、PEX5、PEX6、PEX7、PEX8、PEX10、PEX11、PEX12、PEX13、PEX14、PEX15、PEX17、PEX18、PEX19、PEX21、PEX22、PEX25、PEX27、PEX28、PEX29、PEX30、PEX31、PEX32和PEX34或其任何组合。
在另一个实施方案中，该一种或多种重组微生物进一步被操纵以增加辅酶的细胞内水平。在某些实施方案中，该辅酶是NADH和/或NADPH。在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物进一步被操纵以表达选自下组的一种或多种内源或外源蛋白，该组由以下各项组成：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转醛醇酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸酮醇-异构酶、D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶、NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶、NAD+或NADP+依赖性苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、转氢酶或其任何组合。在另一个实施方案中，一种或多种内源或外源蛋白的表达与共底物补充结合。在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物进一步被操纵以使选自下组的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转醛醇酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸酮醇-异构酶、D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶或其任何组合。
在一些实施方案中，该重组微生物表达一种或多种酰基-CoA氧化酶，并被操纵以使一种或多种内源酰基-CoA氧化酶的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在一些实施方案中，表达的一种或多种酰基-CoA氧化酶与缺失或下调的一种或多种内源酰基-CoA氧化酶不同。在其他实施方案中，表达的一种或多种酰基-CoA氧化酶调节一种或多种不饱和脂质部分的链长。在其他实施方案中，表达的一种或多种酰基-CoA氧化酶选自表3a。
在另一方面，本文公开了用于从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法中的重组微生物。
在另一方面，本文公开了一种产生用于从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法中的重组微生物的方法。
在一个实施方案中，该一种或多种不饱和脂质部分选自(Z)-3-己烯酸、(Z)-3-壬烯酸、(Z)-5-癸烯酸、(E)-5-癸烯酸、(Z)-7-十二碳烯酸、(E)-8-十二碳烯酸、(Z)-8-十二碳烯酸、(Z)-9-十二碳烯酸、(E,E)-8,10-十二碳二烯酸、(7E,9Z)-十二碳二烯酸、(Z)-9-十四碳烯酸、(Z)-11-十四碳烯酸、(E)-11-十四碳烯酸、(Z)-7-十六碳烯酸、(Z)-9-十六碳烯酸、(Z)-11-十六碳烯酸、(Z,Z)-11,13-十六碳二烯酸、(11Z,13E)-十六碳二烯酸、(9Z,11E)-十六碳二烯酸、(Z)-13-十八碳烯酸、(Z,Z,Z,Z,Z)-3,6,9,12,15-二十三碳五烯酸或其任何组合。在另一个实施方案中，该一种或多种不饱和脂质部分选自下组，该组由以下各项组成：(Z)-9-十四碳烯酸(Z9-14:COOH)、(Z)-11-十六碳烯酸(Z11-16:COOH)和(Z)-11-十八碳烯酸(Z11-18:COOH)。在另一个实施方案中，该一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛包含一种或多种昆虫信息素、香料、调味剂和/或聚合物中间体。在某些实施方案中，该一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛包含一种或多种昆虫信息素。
呈能够使用本文所述的重组微生物和方法生成的脂肪醇、脂肪醛或脂肪乙酸酯形式的示例性昆虫信息素包括但不限于(Z)-11-十六碳烯醛、(Z)-11-十六碳烯基乙酸酯、(Z)-9-十四碳烯基乙酸酯、(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛、(9Z,11E)-十六碳二烯醛、(E,E)-8,10-十二碳二烯-1-醇、(7E,9Z)-十二碳二烯基乙酸酯、(Z)-3-壬烯-1-醇、(Z)-5-癸烯-1-醇、(Z)-5-癸烯基乙酸酯、(E)-5-癸烯-1-醇、(E)-5-癸烯基乙酸酯、(Z)-7-十二碳烯-1-醇、(Z)-7-十二碳烯基乙酸酯、(E)-8-十二碳烯-1-醇、(E)-8-十二碳烯基乙酸酯、(Z)-8-十二碳烯-1-醇、(Z)-8-十二碳烯基乙酸酯、(Z)-9-十二碳烯-1-醇、(Z)-9-十二碳烯基乙酸酯、(Z)-9-十四碳烯-1-醇、(Z)-11-十四碳烯-1-醇、(Z)-11-十四碳烯基乙酸酯、(E)-11-十四碳烯-1-醇、(E)-11-十四碳烯基乙酸酯、(Z)-7-十六碳烯-1-醇、(Z)-7-十六碳烯醛、(Z)-9-十六碳烯-1-醇、(Z)-9-十六碳烯醛、(Z)-9-十六碳烯基乙酸酯、(Z)-11-十六碳烯-1-醇、(Z)-13-十八碳烯-1-醇和(Z)-13-十八碳烯醛。
在包括化学转化步骤的本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法的一个实施方案中，将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种FFA和/或一种或多种FAAE的步骤进一步包括以下步骤：分离该一种或多种不饱和脂质部分；任选地富集具有特定链长的一种或多种不饱和脂质部分；以及加工该一种或多种不饱和脂质部分以产生脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，加工该一种或多种不饱和脂质部分的步骤包括将该一种或多种不饱和脂质部分皂化为一种或多种FFA。在一些实施方案中，加工该一种或多种不饱和脂质部分的步骤包括将该一种或多种不饱和脂质部分酯化为一种或多种FAAE。在一个实施方案中，富集具有特定链长的一种或多种不饱和脂质部分的任选步骤包括分离方法。在另一个实施方案中，该分离方法包括蒸馏和/或色谱法。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法的一个实施方案中，将该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE还原成一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的步骤包括使该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE与一种或多种化学计量还原剂接触。在一些实施方案中，该一种或多种化学计量还原剂包含双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠Vitride(红铝、Vitride、SMEAH)和/或二异丁基氢化铝(DIBAL)。在某些实施方案中，还原该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE的步骤包含大体积环状氮路易斯碱以修饰还原剂。在一个实施方案中，该大体积环状氮路易斯碱允许该还原步骤选择性地产生一种或多种脂肪醛。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法的一个实施方案中，将该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE还原成一种或多种脂肪醇的步骤包括使该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE与一种或多种过渡金属催化剂接触。在某些实施方案中，该一种或多种过渡金属催化剂包含一种或多种VIII族催化剂。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法的一个实施方案中，通过氧化步骤将产生的脂肪醇进一步氧化成脂肪醛。在一些实施方案中，该氧化步骤包括一种或多种部分氧化方法。在某些实施方案中，该一种或多种部分氧化方法包括NaOCl/TEMPO。在其他实施方案中，该氧化步骤包括铜催化的有氧氧化。
在本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法的一个实施方案中，将产生的一种或多种脂肪醇进一步化学转化为一种或多种相应的脂肪乙酸酯。在某些实施方案中，将该一种或多种脂肪醇化学转化为一种或多种相应的脂肪乙酸酯的步骤包括使该一种或多种脂肪醇与乙酸酐接触。
在本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇、一种或多种脂肪醛和/或一种或多种脂肪乙酸酯的任何方法的一个实施方案中，通过分离程序进一步富集该一种或多种脂肪醇、一种或多种脂肪醛和/或一种或多种脂肪乙酸酯。
在另一方面，提供了通过本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇、一种或多种脂肪醛和/或一种或多种脂肪乙酸酯的任何方法产生的一种或多种组合物。
附图简述
附图示出了本公开文本的说明性实施方案，其中：
图1示出了脂肪醇和脂肪醛的半生物合成产生的概念。
图2示出了饱和的和不饱和的分子向醇和醛的转化。
图3示出了提出的至(E)-5-癸烯的生物羟基化和脂肪酰基-CoA还原途径。
图4示出了从1976年预测至2016年的17种商品油的产生(Gunstone,F.D.Vegetable Oils in Food Technology:Composition,Properties and Uses.Wiley-Blackwell,2011)。
图5示出了不同植物油的色谱图的叠加图。仅5号(蓝色)智利榛子油在保留时间6.2min处示出对应于(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯的峰。
图6示出了与TMSH酯交换的智利榛子油(上图)和产生的生物柴油(下图)的比较，该生物柴油是通过碱性甲醇分解产生的。尽管色谱图看起来类似，但在表观峰面积中可以看到细微的差异。
图7示出了通过简单蒸馏收集的不同级分的GC-FID色谱图的叠加图。第一级分(红色)在55℃-82℃之间收集并含有最高的C16化合物级分(6min左右)。第二级分(绿色)在120℃-146℃之间收集。该材料中的大部分是不同的C18酸，但在该级分中仍可以发现显著量的C16。级分3(蓝色)包含种子剩余物。几乎没有C16可以被发现，但看到大部分高级链同系物(9至11min左右)。
图8示出了使用经修饰的红铝将酯还原为醛以及其制备(Shin WK et al.(2014)Bull.Korean Chem.Soc.35:2169–2171)。
图9示出了底物和产物混合物的覆盖层的一部分。底物((Z)-十六碳-11-烯酸甲酯，11Z-C16:1-COOH)光谱以黑色示出，并且产物((Z)-十六碳-11-烯醛，11Z-C16:-CHO；12％(Z)-十六碳-11-烯醇，11Z-C16:1-CH2OH)光谱以紫色示出。
图10示出了关于Vitride还原的不同光谱的汇编。图10A：将真实标准物[(Z)-十六碳-11-烯醛和(Z)-十六碳-11-烯醇)与在Vitride还原反应中获得的产物混合物叠加。图10B：观察到光谱中存在另外的峰。在一个月的较旧光谱中未观察到这种情况，其中未使用衍生化试剂代替BSTFA。图10C：真实标准物(Z)-十六碳-11-烯醇的破碎模式。图10D：4.1min处的产物峰的破碎模式。图10E：真实标准物(Z)-十六碳-11-烯醛的碎裂模式。图10F：5.75min处的产物峰的破碎模式。
图11示出了通过Vitride还原获得的产物混合物的叠加图。当在40℃下真空浓缩混合物时，主要产物(Z)-十六碳-11-烯醛(5.7min)随时间损失。然而在30min后可以发现相对较高的量，在150min后仅存在25％左右。这也表明产物中的一些在真空中在最初的30min内损失。可以进一步研究该步骤以用于纯化目的。
图12示出了在SPV140筛选中仅经密码子优化的玉米穗蛾去饱和酶变体产生可检测到的Z11-十六碳烯酸。对照＝SPV140的pPV101整合体，粉纹夜蛾天然＝具有天然密码子使用的粉纹夜蛾Z11去饱和酶(pPV195)，粉纹夜蛾HS opt＝具有智人密码子优化的粉纹夜蛾Z11去饱和酶(pPV196)，粉纹夜蛾HS opt Yl前导序列＝具有智人密码子优化和经交换的解脂耶氏酵母OLE1前导序列的粉纹夜蛾Z11去饱和酶(pPV197)，玉米穗蛾天然＝具有天然密码子使用的玉米穗蛾Z11去饱和酶(pPV198)，玉米穗蛾HS opt＝具有智人密码子优化的玉米穗蛾Z11去饱和酶(pPV199)，玉米穗蛾HS opt Yl前导序列＝具有智人密码子优化和经交换的解脂耶氏酵母OLE1前导序列的玉米穗蛾Z11去饱和酶(pPV200)，脐橙螟蛾天然＝具有天然密码子使用的脐橙螟蛾Z11去饱和酶(pPV201)。3个生物学重复的所有数据平均值。误差条代表标准偏差。
图13示出了在SPV300筛选中仅经密码子优化的玉米穗蛾去饱和酶变体产生可检测到的Z11-十六碳烯酸。标记表示亲本菌株和去饱和酶表达盒的质粒。pPV101＝hrGFP对照，pPV198＝具有天然密码子使用的玉米穗蛾Z11去饱和酶，pPV199＝具有智人密码子优化的玉米穗蛾Z11去饱和酶，pPV200＝具有智人密码子优化和经交换的解脂耶氏酵母OLE1前导序列的玉米穗蛾Z11去饱和酶，pPV201＝具有天然密码子使用的脐橙螟蛾Z11去饱和酶。
图14示出了在SPV140和SPV300背景下去饱和酶筛选的最终细胞密度。具有整合去饱和酶盒的SPV300菌株生长至更高的细胞密度。
图15示出了表达具有智人密码子优化的玉米穗蛾Z11去饱和酶的SPV140和SPV300菌株的单独分离株Z11-十六碳烯酸滴度。
图16示出了特征为Δ11去饱和酶的Z11-14酸(肉豆蔻酸甲酯进料-14ME)和Z11-16酸(棕榈酸甲酯进料-16ME)滴度。SPV300＝去饱和酶文库整合亲本。SPV298＝SPV300的原养型亲本，阴性对照。SPV459＝具有目前最佳去饱和酶的SPV300(玉米穗蛾，SEQ ID NO:1)，阳性对照。DST006中的去饱和酶在遗传上等同于SPV459中表达的玉米穗蛾去饱和酶，并用作内部文库对照。
图17示出了在棕榈酸甲酯(16ME)或肉豆蔻酸甲酯(14ME)上进料的SPV298(阴性对照，亲本菌株)和SPV459(具有玉米穗蛾去饱和酶SEQ ID NO:1的SPV298谱系)的C14和C18产物概况。
图18示出了下游过程(DSP)概述。示出了DSP过程的各个单元操作。
图19示出了Z11-十六碳烯醇起始材料的GC-FID迹线。
图20示出了从Z11-十六碳烯醇的TEMPO-漂白氧化物到Z11-十六碳烯醛的氧化产物的GC-FID迹线。
图21示出了Z11-16酸产生菌株谱系树。所有菌株的菌株谱系描述于实施例6中。SPV1199和SPV1200的基因型是相同的，但源自不同的亲本菌株。
图22A-图22C示出了在28℃和32℃下在高葡萄糖培养基中的生长速率和Z11-16酸产生。图22A：在第一底物添加之前的前7个小时内的初始生长速率。从在线细胞密度测量进行计算。图22B：最大比生产率(7-23小时)。使用板读数器从独立测量获取细胞密度。图22C：48小时(观察到的最大值)Z11-16酸滴度。插图数字表示独立测量的数量。
图23示出了不含甘油的高葡萄糖培养基中对照和GUT2缺失菌株的初始生长速率。在使用不含5g/L甘油的培养基测试的所有四种菌株中，初始生长速率较低。
图24A-图24B示出了最大比生产率随高葡萄糖培养基中的去饱和酶拷贝数而增加。SPV963、SPV968和SPV969谱系中每种菌株的平均比生产率用点表示。单一拷贝点是SPV458的平均比生产率。由于SPV459中存在侧翼重复序列，因此确切的拷贝数是未知的。SPV459的平均比生产率用虚线表示。菌株SPV1056、SPV1199和SPV1200都具有三个玉米穗蛾Z11去饱和酶拷贝并包括用红色轮廓表示的FAT1缺失。当在32℃下培养时，这些菌株显示出比生产率的下降。图24A：作为去饱和酶拷贝数的函数的在28℃下的平均比生产率。图24B：作为去饱和酶拷贝数的函数的在32℃下的平均比生产率。
图25A-图25F示出了高葡萄糖培养基中Z11-16酸性能指标的相关性。图25A：48hZ11-16酸滴度与观察到的最大比生产率适度相关。相关性在32℃下得到改进。图25B：48hZ11-16酸滴度和选择性也适度相关。图25C：23h和48h Z11-16酸选择性在32℃下微弱相关。图25D：48h Z11-16酸滴度和估计的脂质级分未很好地相关。图25E：23h Z11-16酸滴度和选择性紧密聚集。图25F：总脂质级分的估计值与观察到的最大比生产率无关。
图26A-图26B示出了在28℃和32℃下高葡萄糖培养基中的Z11-16酸选择性和估计的脂质级分。图26A：在48小时时间点处的Z11-16酸选择性。图26B：使用测量的脂肪酸浓度并通过将测量的OD600细胞密度乘以先前观察到的0.78gDCW/L/OD600的系数来估计脂质级分(总脂肪酸/干细胞重量)。插图数字表示独立测量的数量。TFA＝总脂肪酸，DCW＝干细胞重量。
图27示出了HSD062比较高葡萄糖和高甘油培养基的初始生长速率。两种培养基中的初始生长速率相似。
图28A-图28E示出了在28℃下对高甘油相比高葡萄糖培养基的菌株特异性响应。图28A：7-23小时的Z11-16酸比生产率。图28B：7-41.5小时的Z11-16酸比生产率。图28C：41.5小时处的Z11-16酸滴度。图28D：41.5小时处的Z11-16酸选择性。图28E：41.5小时处的估计的脂质级分(总脂肪酸/干细胞重量)。使用测量的脂肪酸浓度并通过将测量的OD600细胞密度乘以先前观察到的0.78gDCW/L/OD600的系数来估计脂质级分。
图29示出了来自HSD062的脂肪酸滴度。顶行：高葡萄糖培养基(FERM1)中的滴度。底行：高甘油培养基(FERM3)中的滴度。
图30示出了来自HSD062的总脂肪酸(TFA)滴度。顶行：高葡萄糖培养基(FERM1)中的TFA滴度。底行：高甘油培养基(FERM3)中的TFA滴度。
图31A-图31E示出了Z11-16酸Bd的性能参数，包括来自所有取样孔的数据。当在单个孔中的板密封的下侧上形成底物/生物膜时，一些复制培养物在缺氧条件下孵育。通过跟踪在线溶解氧浓度来鉴定受影响的孔。此外，这些孔中的细胞密度和脂肪酸滴度始终较低。这里呈现了所有实验中所有孔的数据。插图数字表示独立测量的数量。图31A：最大比生产率(7-23小时)。使用板读数器从独立测量获取细胞密度。图31B：48小时(观察到的最大值)Z11-16酸滴度。图31C：48小时Z11-16酸选择性。图31D：使用测量的脂肪酸浓度并通过将测量的OD600细胞密度乘以先前观察到的0.78gDCW/L/OD600的系数来估计脂质级分(总脂肪酸/干细胞重量)。图31E：在线溶解氧测量的例子表明HSD043的第3列孔的缺氧条件。所有孔在相同条件下开始并用相同菌株接种。在23和31小时替代密封。在添加底物(7小时)和第一次取样(23小时)后的期间，使孔D03、E03和F03缺氧不同的持续时间。
图32示出了通过由酰基-CoA氧化酶活性控制的选择性β-氧化生成的酰基-CoA中间体的例子。
序列
SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:47的序列表是本申请的部分，并且通过引用并入本文。在本文末尾提供了序列表。
发明详述
定义
以下定义和缩写将用于解释本公开。
当在本文和附带的权利要求中使用时，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。因此，例如提及“信息素”包括多种这类信息素，并且提及“微生物”包括提及一种或多种微生物等。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其他变化形式旨在涵盖非排他性的包括。包含一系列要素的组合物、混合物、工艺、方法、物品或设备不必仅限于那些要素，而可以包括其他未明确列出或此类组合物、混合物、工艺、方法、物品或设备所固有的要素。另外，除非明确相反地陈述，否则“或”是指包括性的“或”而不是排他性的“或”。
本文用于修改数值的术语“约”和“左右”指示围绕该明确值的近范围。如果“X”是该值，则“约X”或“X左右”将指示0.9X至1.1X的值，或在一些实施方案中，0.95X至1.05X的值。对“约X”或“X左右”的任何提及确切地说指示至少X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X和1.05X。因此，“约X”和“X左右”旨在传授和提供对例如“0.98X”的权利要求限制的书面描述支持。
如本文所用，术语“微生物的”、“微生物有机体”和“微生物”包括作为包括在古细菌、细菌或真核生物的结构域内的微观细胞存在的任何生物体，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或更高级的原生生物。因此，该术语旨在涵盖原核或真核细胞或具有微观尺寸的生物体，并且包括所有物种的细菌、古细菌和真细菌以及真核微生物如酵母和真菌。还包括可以培养用于生产化学品的任何物种的细胞培养物。
如本文所述，在一些实施方案中，该重组微生物是原核微生物。在一些实施方案中，该原核微生物是细菌。“细菌”或“真核生物”是指原核生物的结构域。细菌包括至少十一个不同的组，如下：(1)革兰氏阳性(gram+)细菌，其中有两个主要细分：(1)高G+C组(放线菌属(Actinomycetes)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、微球菌属(Micrococcus)等)(2)低G+C组(芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococci)、支原体属(Mycoplasmas))；(2)变形菌门(Proteobacteria)，例如紫色光合+非光合革兰氏阴性细菌(包括大多数“常见”革兰氏阴性细菌)；(3)蓝细菌(Cyanobacteria)，例如产氧光养生物；(4)螺旋体和相关物种；(5)浮霉状菌属(Planctomyces)；(6)拟杆菌属(Bacteroides)，黄杆菌(Flavobacteria)；(7)衣原体(Chlamydia)；(8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(也为厌氧光养生物)；(10)抗辐射微球菌和亲缘菌；(11)热袍菌属(Thermotoga)和嗜热栖热腔菌(Thermosipho thermophiles)。
“革兰氏阴性细菌”包括球菌、非肠道杆菌和肠杆菌。革兰氏阴性菌属包括例如奈瑟氏菌(Neisseria)、螺菌属(Spirillum)、巴斯德菌属(Pasteurella)、布鲁菌属(Brucella)、耶尔森菌属(Yersinia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、博德特氏菌属(Bordetella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、醋杆菌属(Acetobacter)、气杆菌属(Aerobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)、螺旋状菌属(Spirilla)、沙雷氏菌属(Serratia)、弧菌属(Vibrio)、根瘤菌属(Rhizobium)、衣原体属(Chlamydia)、立克次体属(Rickettsia)、密螺旋体属(Treponema)、和梭杆菌属(Fusobacterium)。
“革兰氏阳性细菌”包括球菌、非孢子杆菌和孢子杆菌。革兰氏阳性细菌的属包括例如放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、乳杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、粘球菌属(Myxococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。
术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用，并且指已经被遗传修饰以在整合构建体中表达或过表达内源酶，表达异源酶(如包括在载体中的那些)，或其内源基因的表达发生改变的微生物。通过“改变”意指基因的表达、或编码一种或多种多肽或多肽亚基的RNA分子或等同RNA分子的水平、或一种或多种多肽或多肽亚基的活性被上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于没有所述改变时观察到的。例如，术语“改变”可以意指“抑制”，但是单词“改变”的使用不限于这个定义。应理解的是，术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”不仅指特定的重组微生物，而且指这样的微生物的后代或潜在后代。因为某些变化可在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如在此使用的术语范围内。
就基因序列而言，术语“表达”指该基因的转录，并且视情况而定，指所得mRNA转录物翻译成蛋白质。因此，从上下文可以清楚地看出，蛋白质的表达是由开放阅读框序列的转录和翻译引起的。宿主细胞中所希望产物的表达水平可以基于存在于细胞中的相应mRNA的量或由所选序列编码的希望产物的量来确定。例如，可以通过qRT-PCR或Northern杂交量化从选定序列转录的mRNA(参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。由选定序列编码的蛋白质可通过各种方法量化，例如通过ELISA，通过测定该蛋白质的生物学活性，或通过采用独立于此类活性的测定(如蛋白质印迹法或放射免疫测定)，使用识别并结合该蛋白质的抗体。参见Sambrook et al.,1989，同上。
术语“多核苷酸”与术语“核酸”在本文中可互换使用，并且是指由两种或更多种单体(包括核苷酸、核苷或其类似物)组成的有机聚合物，包括但不限于任何长度的单链或双链的有义或反义脱氧核糖核酸(DNA)，以及适当时任何长度的单链或双链的有义或反义核糖核酸(RNA)，包括siRNA。术语“核苷酸”是指由连接到嘌呤或嘧啶碱基和磷酸基团的核糖或脱氧核糖组成并且是核酸的基本结构单元的几种化合物中的任何一种。术语“核苷”是指由与脱氧核糖或核糖组合的嘌呤或嘧啶碱基组成并且尤其发现于核酸中的化合物(如鸟苷或腺苷)。术语“核苷酸类似物”或“核苷类似物”分别指核苷酸或核苷，其中一个或多个单独的原子已被不同的原子或不同的官能团替代。因此，术语多核苷酸包括任何长度的核酸、DNA、RNA、其类似物和片段。三个或更多个核苷酸的多核苷酸也称为核苷酸寡聚物或寡核苷酸。
应理解，本文所述的多核苷酸包括“基因”并且本文所述的核酸分子包括“载体”或“质粒”。因此，术语“基因”，也称为“结构基因”，指编码特定氨基酸序列的多核苷酸，其包含一种或多种蛋白质或酶的全部或部分，并且可包括调节(非转录)DNA序列，如启动子序列，其确定例如该基因表达的条件。该基因的转录区可能包括非翻译区，包括内含子、5'非翻译区(UTR)和3'-UTR，以及编码序列。
如本文所用，术语“酶”是指催化或促进一种或多种化学或生物化学反应的任何物质，其通常包括完全或部分由一种或多种多肽组成的酶，但可包括由不同的分子(包括多核苷酸)组成的酶。
如本文所用，术语“非天然存在的”，当用于提及本公开文本的微生物时，旨在意指该微生物具有至少一种通常在参考物种的天然存在的菌株(包括参考物种的野生型菌株)中未发现的遗传改变。遗传改变包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其他核酸添加、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其他功能破坏。此类修饰包括例如所提及物种的异源、同源或者异源多肽和同源多肽的编码区及其功能片段。另外的修饰包括，例如，非编码调节区，其中修饰改变基因或操纵子的表达。示例性非天然存在的微生物包括工程化用于产生本文所述的不饱和脂质部分的重组微生物。
相反，术语“天然存在的”，当用于提及本公开文本的生物体时，旨在意指未被操纵以包含用于重组产生一种或多种不饱和脂质部分的基因工程生物合成途径的生物体。
如本文关于各种分子(例如多核苷酸、多肽、酶等)所用的术语“外源”是指通常不存在或天然不存在于给定的酵母、细菌、生物体、微生物或自然状态的细胞中和/或非由其产生的分子。
在另一方面，如本文关于各种分子(例如多核苷酸、多肽、酶等)所用的术语“内源”或“天然”是指通常或天然存在于给定的酵母、细菌、生物体、微生物或自然状态的细胞中和/或由其产生的分子。
如本文所用，在经修饰的宿主细胞的背景下，术语“异源”是指如下的各种分子(例如多核苷酸、多肽、酶等)，其中以下至少一项是真的：(a)该一种或多种分子对于宿主细胞来说是外来的(“外源”)(即，不是天然存在的)；(b)该一种或多种分子对于给定的宿主微生物或宿主细胞来说是天然存在的(例如，“内源”)，但在细胞中在非天然位置或以非天然量产生；和/或(c)该一种或多种分子在核苷酸或氨基酸序列上不同于内源核苷酸或氨基酸序列，使得在核苷酸或氨基酸序列上不同于以内源方式发现的内源核苷酸或氨基酸的分子在细胞中以非天然(例如，大于天然发现的)量产生或在细胞中以非天然(例如，大于天然发现的)活性产生。
如本文关于第一家族或物种的原始酶或基因所使用的术语“同系物”是指通过功能、结构或基因组分析确定的第二家族或物种的不同酶或基因，其是对应于该第一家族或物种的该原始酶或基因的该第二家族或物种的酶或基因。同系物最经常具有功能、结构或基因组相似性。可以使用遗传探针和PCR容易地克隆酶或基因的同系物的技术是已知的。可以使用功能测定和/或通过基因的基因组作图来确认为同系物的克隆序列的同一性。
如果由基因编码的氨基酸序列具有与第二基因相似的氨基酸序列，则蛋白质与第二蛋白质具有“同源性”或与其“同源”。可替代地，如果两种蛋白质具有“相似的”氨基酸序列，则蛋白质与第二蛋白质具有同源性。因此，术语“同源蛋白质”旨在意指两种蛋白质具有相似的氨基酸序列。在某些情况下，两种蛋白质之间的同源性指示其共有的祖先，进化上相关。
如本文所用，术语“脂肪酸”是指具有结构R-COOH的化合物，其中R是C6至C24饱和、不饱和、直链、支链或环状烃并且羧基在1位。在具体的实施方案中，R是C6至C24饱和或不饱和直链烃并且羧基在1位。
如本文所用，术语“脂肪醇”是指式R-OH的脂族醇，其中R是C6至C24饱和、不饱和、直链、支链或环状烃。在具体的实施方案中，R是C6至C24饱和或不饱和直链烃。
术语“脂肪酰基-CoA”是指具有结构R-(CO)-S-R1的化合物，其中R1是辅酶A，并且术语“脂肪酰基-ACP”是指具有结构R-(CO)-S-R1的化合物，其中R1是酰基载体蛋白ACP。
如本文所用，术语“脂肪酸衍生物”是指衍生自脂肪酸的任何有机分子实体。脂肪酸衍生物包括但不限于饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、支链脂肪酸、三酰基甘油(甘油三酯)和脂肪酸的烷基酯。
如本文所用，术语“半生物合成”是指通过组合生物和非生物方式合成产物。在一个实施方案中，该生物方式包括从一种或多种天然来源，如天然存在的生物体获得一种或多种化合物或分子。在一些实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体可以是植物、细菌、藻类、酵母和/或细胞培养物。在另一个实施方案中，该生物方式包括从一种或多种重组微生物获得一种或多种化合物或分子，该一种或多种重组微生物已被工程化以产生该化合物或分子。这些化合物或分子可以通过非生物方式如化学合成进一步修饰成最终产物。化学合成是通过使用起始材料进行各种化学反应并通过与其他化学物质反应改变其分子结构来制备化合物。用于有机合成的起始材料可以是从石油和天然气除去的简单化合物，或者是从植物和动物来源大量分离的更复杂的化学物质。在某些实施方案中，从一种或多种不饱和脂质部分半生物合成一种或多种脂肪醇和/或脂肪醛包括：从一种或多种天然存在的生物体获得一种或多种不饱和脂质部分，或在被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的一种或多种重组微生物中产生该一种或多种不饱和脂质部分，将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种游离脂肪酸(FFA)和/或一种或多种脂肪酸甲酯(FAAE)，以及还原该一种或多种FFA和/或一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。
如本文所用，术语“不饱和脂质部分”是指具有一个或多个双键的脂质或脂质衍生物。脂质是生物分子，其不溶于水性溶液并且可溶于有机溶剂。不饱和脂质部分可以包括但不限于单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、支链不饱和脂肪酸和不饱和三酰基甘油(不饱和甘油三酯)。不饱和脂质部分可以包括脂肪、甾醇、蜡、油、脂溶性维生素、磷脂、鞘脂、缩醛磷脂、类二十烷酸、萜烯以及肥皂和洗涤剂。
如本文所用，术语“非生物转化”是指使用化学方式将一种或多种底物转化为一种或多种产物。在一个实施方案中，将一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种FFA和/或一种或多种FAAE。在另一个实施方案中，通过使一种或多种不饱和脂质部分、一种或多种FFA和/或一种或多种FAAE与一种或多种化学计量还原剂(如双(2-甲氧基乙氧基)铝氢化钠Vitride(红铝、Vitride、SMEAH)和/或二异丁基氢化铝(DIBAL))接触，将该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE还原成一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。此外，大体积环状氮路易斯碱可以用于修饰该还原剂以允许该还原步骤选择性地产生一种或多种脂肪醛。在另一个实施方案中，将该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE还原成一种或多种脂肪醇的步骤包括使该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE与一种或多种过渡金属催化剂(如一种或多种VIII族催化剂)接触。在另一个实施方案中，通过氧化步骤将产生的脂肪醇进一步氧化成脂肪醛。该氧化步骤可以是一种或多种部分氧化方法(如NaOCl/TEMPO)。在其他实施方案中，该氧化步骤包括铜催化的有氧氧化。
引言
本公开文本涉及对用于从低成本原料有效生产有价值产品的新技术的需求。具体地，本发明人已通过开发从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法满足了这种需要，该方法是通过将从生物来源获得或产生该一种或多种不饱和脂质部分与由非生物方式将该一种或多种不饱和脂肪部分转化为一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛组合。该一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛可以用作昆虫信息素、香料、调味剂和聚合物中间体。因此，本公开文本的方面基于发明人的以下发现：不饱和脂质部分可以从天然存在的生物体获得或由已被工程化以从低成本原料产生不饱和脂质部分的重组微生物产生，并且可以与常规合成方法组合以产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛，其可以用作各种有价值的产品，包括但不限于昆虫信息素、香料、调味剂和聚合物中间体。
本申请进一步涉及可用于生物合成不饱和脂质部分的重组微生物以及包含一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的组合物。因此，本公开文本的各个实施方案可用于合成选自脂肪醇、脂肪醛和脂肪乙酸酯的多种昆虫信息素。此外，本文所述的实施方案也可以用于香料、调味剂和聚合物中间体的合成。
信息素
如上所述，本公开文本的实施方案提供了从一种或多种不饱和脂质部分半生物合成一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。该一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛可以用作昆虫信息素。信息素是挥发性化合物，其由特定昆虫分泌，功能是在该物种内进行化学通讯。也就是说，信息素是分泌或排泄的化学因子，其触发相同物种的成员中的社会反应。尤其存在影响行为或生理学的报警信息素、食物踪迹信息素、性信息素、聚集信息素、疏散信息素、释放信息素、引物信息素和领土信息素。
可以使用本文公开的重组微生物和方法合成的昆虫信息素的非限制性例子包括表1中列出的直链醇、醛和乙酸酯。
表1.C6-C20直链信息素
在一些方面，由本公开文本中传授的方法产生的一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛可以用作昆虫信息素。用于调节昆虫行为的示例性信息素列于表2中。然而，本文所述的方法和微生物不限于表1和表2中列出的C6-C20信息素的合成。相反，所公开的方法和微生物还可以用于合成各种脂肪醇、脂肪醛和脂肪乙酸酯，包括香料、调味剂和聚合物中间体。
表2.可以根据本公开文本中描述的方法合成的示例性信息素。
大多数信息素包含末端氢被官能团取代的烃骨架(Ryan MF(2002)InsectChemoreception.Fundamental and Applied.Kluwer Academic Publishers)。表2b显示了一些常见官能团及其化学式、前缀和后缀。由来自相邻碳原子的氢的损失产生的一个或多个双键的存在决定了分子的不饱和度，并改变了从烷烃(无多重键)到烯烃的名称。两个和三个双键的存在分别以-二烯和-三烯命名结尾来指示。每个双键的位置由与其开始的碳的位置相对应的数字表示，每个碳原子都由与该官能团附接的碳来编号。该官能团所附接的碳被称为-1-信息素可以具有但不限于编号10(癸)、12(十二)、14(十四)、16(十六)或18(十八)碳长度的烃链长度。双键的存在具有另一个影响。通过将其固定为两种可能的构型中的一种来排除分子的旋转，每种代表作为不同的分子的几何异构体。当碳链分别连接在双键的相反(反式)或相同(顺式)侧时，它们被指定为E(来自德国单词Entgegen，相反)或Z(Zusammen，一起)。
表2b.通用官能团的前缀和后缀
来自Howse,PE,Stevens,IDR and Jones,OT(1998).Insect pheromones andtheir use in pest management.London:Chapman and Hall。
本文所述的信息素可以使用IUPAC命名法或本领域技术人员已知的各种缩写或变化来提及。例如，(11Z)-十六碳烯-1-醛也可以写成Z-11-十六碳烯-1-醛、Z-11-十六碳烯醛、Z-11-16:Ald或Z-x-y:Ald，其中x表示双键的位置，并且y表示烃骨架中的碳数目。本文所用和本领域技术人员已知的用于鉴定烃骨架上的官能团的缩写包括指示醛的“Ald”，指示醇的“OH”，以及指示乙酰基的“Ac”。此外，链中碳的数目可以使用数字指示，而不是使用书面名称。因此，如本文所用，由十六个碳组成的不饱和碳链可以写成十六碳烯或16。
本文使用相似的缩写和派生词来描述信息素前体。例如，(11Z)-十六碳烯-1-醛的脂肪酰基-CoA前体可以被鉴定为(11Z)-十六碳烯基-CoA或Z-11-16:酰基-CoA。羧酸官能团的缩写是“COOH”。脂肪酸是具有长烃链的羧酸。在IUPAC命名法中，羧基碳是C-1。常用命名法是指从C-1的α、β、γ、δ、ε等，并且离羧基最远的碳是ω。存在描述脂肪酸的简写符号：总碳数目:双键数目，Δ双键位置，其中双键的位置由Δn表示，其中n表示出现双键的每对的较低编号的碳。例如，18:3Δ8t、Δ10t、Δ12c是指18碳长的脂肪酸，其在烃链的位置C8、C10和C12处具有3个双键。位置C8和C10处的双键为反式(t)构型，而位置C12处的双键为顺式(c)构型。
在一个方面，从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法包括从一种或多种天然存在的生物体获得该一种或多种不饱和脂质部分。
作为不饱和脂质部分来源的天然存在的生物体
在一个实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体是一种或多种昆虫。在另一个实施方案中，该一种或多种昆虫包括鞘翅目、双翅目、膜翅目和鳞翅目。
在另一个实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体不是昆虫。
在一些实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体包括一种或多种植物。在一些实施方案中，该植物包括大豆、油菜、棉花、向日葵、花生、棕榈、椰子、橄榄、芝麻和/或亚麻籽。
在一个实施方案中，该大豆是大豆属(Glycine)的成员。在另一个实施方案中，该大豆是大豆(Glycine max)。大豆油甘油三酯中的主要不饱和脂肪酸是多不饱和物α-亚麻酸(C18:3，约7％至约10％)和亚油酸(C18:2，约51％)；和单不饱和油酸(C18:1，约23％)。它还含有饱和脂肪酸的硬脂酸(C18:0，约4％)和棕榈酸(C16:0，约10％)。由于遗传和/或气候，可能发生脂肪酸谱的变化。
在一个实施方案中，该油菜是十字花科(Brassicaceae)的成员。在另一个实施方案中，该油菜是芸苔属(Brassica)的成员。在某些实施方案中，该油菜选自下组，该组由以下各项组成：欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁(Brassica rapa)、甘蓝(Brassicaoleracea)和芥菜(Brassica juncea)。油菜油可以具有约61％的油酸、约21％的亚油酸、约9％至约11％的α-亚麻酸、约4％的棕榈酸和约2％的硬脂酸，其中剩余百分比是其他脂肪酸。由于遗传和/或气候，可能发生脂肪酸谱的变化。商业食品级油菜油被培育成含有少于2％的芥酸(C22:1)。
在一个实施方案中，该棉花是棉属(Gossypium)的成员。在另一个实施方案中，该棉花选自下组，该组由以下各项组成：陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypiumbarbadense)、亚洲棉(Gossypium arboretum)和草本棉(Gossypium herbaceum)。棉花具有由坚硬的外壳包围的含油仁。棉籽油可以具有约52％的亚油酸、约17％的油酸和约24％的棕榈酸，其中剩余百分比是其他脂肪酸。由于遗传和/或气候，可能发生脂肪酸谱的变化。
在一个实施方案中，该向日葵是向日葵属(Helianthus)的成员。在另一个实施方案中，该向日葵选自下组，该组由以下各项组成：agrestis向日葵、ambiguous向日葵、狭叶向日葵(Helianthus angustifolius)、annuus向日葵、anomalus向日葵、绢毛葵(Helianthus argophyllus)、arizonensis向日葵、黑紫向日葵(Helianthus atrorubens)、bolanderi向日葵、向日葵×brevifolius、californicus向日葵、carnosus向日葵、蓝茎向日葵(Helianthus ciliaris)、cinereus向日葵、coloradensis向日葵、cusickii向日葵、瓜叶向日葵(Helianthus debilis)、千瓣葵(Helianthus decapetalus)、deserticola向日葵、diffuses向日葵、dissectifolius向日葵、林地向日葵(Helianthus divaricatus)、向日葵×divariserratus、向日葵×doronicoides、eggertii向日葵、exilis向日葵、floridanus向日葵、大向日葵(Helianthus giganteus)、glaucophyllus向日葵、向日葵×glaucus、gracilentus向日葵、锯齿叶向日葵(Helianthus grosseserratus)、heterophyllus向日葵、多毛向日葵(Helianthus hirsutus)、向日葵×intermedius、laciniatus向日葵、美丽向日葵(Helianthus×laetiflorus)、laevigatus向日葵、lenticularis向日葵、longifolius向日葵、向日葵×luxurians、糙叶向日葵(Helianthusmaximiliani)、membranifolius向日葵、毛叶向日葵(Helianthus mollis)、千瓣葵(Helianthus multiflorus)、navarri向日葵、neglectus向日葵、niveus向日葵、nuttallii向日葵、occidentalis向日葵、向日葵×orgyaloides、paradoxus向日葵、pauciflorus向日葵、具柄向日葵(Helianthus petiolaris)、porteri向日葵、praecox向日葵、praetermissus向日葵、小向日葵(Helianthus pumilus)、radula向日葵、resinosus向日葵、柳叶向日葵(Helianthus salicifolius)、sarmentosus向日葵、scaberrimus向日葵、施魏尼茨向日葵(Helianthus schweinitzii)、silphioides向日葵、simulans向日葵、smithii向日葵、speciosus向日葵、strumosus向日葵、subcanescens向日葵、subtuberosus向日葵、菊芋(Helianthus tuberosus)、和轮生向日葵(Helianthus×verticillatus)。向日葵油可以含有约5％的棕榈酸、约6％的硬脂酸、约30％的油酸和约59％的亚油酸。然而，产生了几种类型的向日葵油，如高亚油酸、高油酸和中油酸。中油酸向日葵油典型地具有至少69％的油酸。高油酸向日葵油具有至少82％的油酸。不饱和脂肪酸谱的变化受到遗传和气候两者的强烈影响。
花生也称为落花生(groundnut)。在一个实施方案中，该花生是花生属(Arachis)的成员。在另一个实施方案中，该花生是落花生(Arachis hypogaea)。花生油可以具有约46％至约47％的油酸、约33％的亚油酸和约10％的棕榈酸。该油还可以具有硬脂酸、花生酸(二十烷酸，C20:0)、山嵛酸(二十二烷酸，C22:0)、二十四烷酸(木焦油酸，C24:0)和其他脂肪酸。由于遗传和/或气候，可能发生脂肪酸谱的变化。
在一个实施方案中，该棕榈是槟榔科(Arecaceae)的成员。在另一个实施方案中，该棕榈是油棕属(Elaeis)的成员。在某些实施方案中，该棕榈选自下组，该组由以下各项组成：油棕(Elaeis guineensis)(非洲油棕)和美洲油棕(Elaeis oleifera)(美国油棕)。棕榈油源自果实的中果皮或红色果肉。棕榈油可以具有约43.5％的棕榈酸、约36.6％的油酸、约9.1％的亚油酸、约4.3％的硬脂酸、约1％的肉豆蔻酸(C14:0)和约5.5％的其他脂肪酸。种子或棕榈仁也富含油。棕榈仁油比棕榈油更饱和，并且可以具有约48％的月桂酸(C12:0)、约16％的肉豆蔻酸、约15％的油酸、约8％的棕榈酸、约3％的癸酸(C10:0)、约3％的辛酸(C8:0)、约2％至约3％的硬脂酸和约2％的亚油酸。剩余百分比包括其他脂肪酸。由于遗传和/或气候，可能发生脂肪酸谱的变化。
在一个实施方案中，该椰子是槟榔科的成员。在另一个实施方案中，该椰子是椰子属(Cocos)的成员。在某些实施方案中，该椰子是可可椰子(Cocos nucifera)。椰子油可以具有约51％的月桂酸、约19％的肉豆蔻酸、约8％至约9％的棕榈酸、约6％的辛酸、约6％的癸酸和约6％的油酸。剩余百分比包括其他脂肪酸。由于遗传和/或气候，可能发生脂肪酸谱的变化。
在一个实施方案中，该橄榄是木犀科(Oleaceae)的成员。在另一个实施方案中，该橄榄是油橄榄属(Olea)的成员。在某些实施方案中，该橄榄是油橄榄(Olea europaea)。橄榄油可以主要由以下项组成：油酸(约55％至约83％)和棕榈酸(约7.5％至约20％)以及其他脂肪酸(亚油酸：约3.5％至约21％；硬脂酸：约0.5％至约5％)的混合甘油三酯；α-亚麻酸(约0％至约1.5％)，以及恒量的角鲨烯(高达约0.7％)和甾醇(约0.2％的植物甾醇和生育甾醇(tocosterols))。组成随品种、地区、海拔高度、收获时间和提取过程而变化。
在一个实施方案中，该芝麻是胡麻属(Sesamum)的成员。在另一个实施方案中，该芝麻是芝麻(Sesamumindicum)。芝麻油可以具有约41％的亚油酸、约39％的油酸、约8％的棕榈酸、约5％的硬脂酸，其中剩余百分比由其他脂肪酸构成。由于遗传和/或气候，可能发生脂肪酸谱的变化。
亚麻籽也称为亚麻(flax)或亚麻(common flax)。在一个实施方案中，该亚麻籽是亚麻科(Linaceae)的成员。在另一个实施方案中，该亚麻籽是亚麻属(Linum)的成员。在某些实施方案中，该亚麻籽是亚麻(Linum usitatissimum)。亚麻籽油，也称为亚麻油，是从亚麻植物的干燥成熟种子获得的无色至淡黄色油。亚麻籽油因其异常大量的α-亚麻酸(ω-3脂肪酸)(约51.9％至约55.2％)而与众不同。它还可以具有饱和酸棕榈酸(约7％)和硬脂酸(约3.4％至约4.6％)；单不饱和油酸(约18.5％至约22.6％)；双不饱和亚油酸(约14.2％至约17％)。由于遗传和/或气候，可能发生脂肪酸谱的变化。
在一些实施方案中，该植物来自选自下组的家族，该组由以下各项组成：山龙眼科和鼠李科。山龙眼科是主要分布在南半球的开花植物家族。该家族包括约80个属，具有约1,600个物种。它们与悬铃木科(Platanaceae)和莲科(Nelumbonaceae)一起组成了山龙眼目(Proteales)。公知的属包括海神花属(Protea)、班克木属(Banksia)、筒瓣花属(Embothrium)、银桦属、哈克木属(Hakea)、蓟序木属(Dryandra)和澳洲坚果属。物种，如新南威尔斯帝王花(红火球帝王花(Telopea speciosissima))、国王普罗蒂亚花(帝王花(Protea cynaroides))，以及各种物种的班克木属、银桦属和银叶树属(Leucadendron)是流行的切花，而澳洲坚果树(Macadamia integrifolia)的坚果在商业上广泛种植和消费。澳大利亚和南非具有最大的多样性集中。鼠李科是大的开花植物家族，主要是树木、灌木和一些藤蔓，通常称为鼠李科。该家族含有50-60个属和大约870-900个物种。鼠李科在世界范围内分布，但在亚热带和热带地区更常见。
在某些实施方案中，该植物包括来自以下的物种：Gevuina属、金盏花属、沼沫花属、新月花属、葛缕子属、胡萝卜属、芫荽属、澳洲坚果属、肉豆蔻属、Licania属、石栗属、蓖麻属、榛属、Kermadecia属、马利筋属、Cardwellia属、银桦属、Orites属、枣属、Hicksbeachia属、沙棘属、麻黄属、Placospermum属、木龙山龙眼属和/或希蒙得木属。
金盏花(Calendula)是菊科中约15-20个物种一年生和多年生草本植物的属，经常被称为万寿菊。它们原产于亚洲西南部、西欧、马卡罗尼西亚和地中海。山茱萸(C.officinalis)的油被用作抗炎剂、抗肿瘤剂和用于治疗伤口的药物。金盏花的物种包括小金盏花(Calendula arvensis)、denticulate金盏花、eckerleinii金盏花、incana金盏花、lanzae金盏花、maritima金盏花、maroccana金盏花、meuselii金盏花、officinalis金盏花、巴勒斯坦侧金盏花(Calendula palaestina)、stellate金盏花、suffruticosa金盏花和tripterocarpa金盏花。
沼沫花属是沼沫花科(Limnanthaceae)的一种属，由一年生草本植物组成，通常被称为白芒花(meadowfoam)。这七个物种都原产于北美洲西部的沿海和毗邻地区(内陆山谷、山麓和山脉)，在那里它们典型地生长在沼泽栖息地，如春池的边缘。有些是加利福尼亚特有的。该属分为两个部分，沼沫花属，其中萼片在果实成熟期间向后弯曲，和Inflexae，其中萼片在成熟果实上弯曲。部分沼沫花属包括短柱沼沫花(Limnanthes bakeri)、沼沫花(Limnanthes douglasii)、四瓣沼沫花(Limnanthes macounii)和大花沼沫花(Limnanthesvinculans)。部分Inflexae包括白花沼沫花(Limnanthes alba)、floccose沼沫花和山地沼沫花(Limnanthes montana)。
新月花属是十字花科的开花植物属，原产于欧洲中部和南部。它包括四个物种，一年生或两年生的银扇草(Lunaria annua)(诚实花(L.biennis))、Lunaria elongata，多年生的复苏银扇草(Lunaria rediviva)和罕见的巴尔干(Balkan)物种Lunaria telekiana。
葛缕子属是伞形科(Apiaceae)中的约20个物种的开花植物的属，原产于旧世界的温带地区。最重要的物种是葛缕子(C.carvi)，其种子被广泛用作烹饪调味品。在蒙古植物区系中有属于葛缕子属的两个物种(细葛缕子(C.carve L.)、田葛缕子(C.buriaticumTurcz.))。
胡萝卜属是伞形科的草本植物的世界范围内的属，其中最著名的物种是种植胡萝卜。伞形科(Umbelliferae Apiaceae)的胡萝卜属具有约25个物种。该物种包括aureus胡萝卜、azoricus胡萝卜、broteri胡萝卜、bicolor胡萝卜、carota胡萝卜、durieui胡萝卜、foliosus胡萝卜、glochidiatus胡萝卜、gadeceaui胡萝卜、guttatus胡萝卜、involucratus胡萝卜、littoralis胡萝卜、montanus胡萝卜、muricatus胡萝卜、pulcherrima胡萝卜、pusillus胡萝卜和visnaga胡萝卜。
芫荽属是伞形科中的草本植物的属，含有种植物种芫荽(Coriandrum sativum)(胡荽(coriander))和野生物种tordylium芫荽。芫荽的叶子和种子用于烹饪。该叶子在北美洲经常被称为芫荽叶。
澳洲坚果属是澳大利亚本土的四种树物种的属，并且属于植物山龙眼科的一部分。它们原产于新南威尔士州东北部和昆士兰州中部和东南部。这种树对其果实，澳大利亚坚果来说具有商业重要性。其他名称包括昆士兰坚果、灌木坚果、maroochi坚果、bauple坚果和夏威夷坚果。澳洲坚果属物种包括澳洲坚果树、Macadamia jansenii、澳洲坚果(Macadamia ternifolia)和四叶澳洲坚果(Macadamia tetraphylla)。坚果具有大量的单不饱和脂肪(占总含量的59％)。澳大利亚坚果油由于含有大约22％的ω-7棕榈油酸而具有价值，这使其成为貂油的植物替代品。这种相对高含量的棕榈油酸加澳大利亚坚果的高氧化稳定性使其成为化妆品中所希望的成分。
肉豆蔻属是肉豆蔻科(Myristicaceae)中的树木的属。在亚洲和西太平洋分布着约150个物种。最重要的商业物种是肉豆蔻(Myristica fragrans)，是香料肉豆蔻和肉豆蔻衣的主要来源。肉豆蔻属的物种可以包括M.acsmithii、M.agusanensis、M.alba、M.albertisii、M.amboinensis、M.ampliata、M.amplifolia、M.amygdalina、M.anceps、M.andamanica、M.apiculate、M.archboldiana、M.arfakensis、M.argentea、M.aruensis、M.atrescens、M.atrocorticata、M.attenuate、M.avis-paradisiacae、M.baeuerlenii、M.bancana、M.basilanica、M.batjanica、M.beccarii、M.beddomei、M.bivalvis、M.bombycina、M.brachiate、M.brachypoda、M.brassii、M.brevistipes、M.buchneriana、M.byssacea、台湾肉豆蔻(M.cagayanensis)、M.canariformis、M.cantleyi、M.carrii、M.castaneifolia、M.celebica、M.cerifera、M.ceylanica、M.chartacea、M.chrysophylla、M.cimicifera、M.cinerea、M.cinnamomea、M.clemensii、M.coacta、M.colinridsdalei、M.collettiana、M.commersonii、M.concinna、M.conspersa、M.contorta、M.contracta、M.cookie、M.coriacea、M.cornutiflora、M.corticata、M.corticosa、M.costata、M.costulata、M.crassa、M.crassifolia、M.crassinervis、M.crassipes、M.cucullata、M.cumingii、M.curtisii、M.cylindrocarpa、M.dactyloides、M.dardaini、M.dasycarpa、M.depressa、M.devogelii、M.diversifolia、M.duplopunctata、M.duthiei、M.elegans、M.elliptica、M.ensifolia、M.eugeniifolia、M.euryocarpa、M.extensa、M.fallax、M.faroensis、M.farquhariana、M.fasciculate、M.fatua、M.filipes、M.finlaysoniana、M.firmipes、M.fissiflora、M.fissurata、M.flavovirens、M.flocculosa、M.flosculosa、M.forbesii、M.fragrans、M.frugifera、M.fugax、M.furfurascerts、M.fusca、M.fusiformis、M.gamblei、M.garciniifolia、M.geminate、M.gibbosa、M.gigantean、M.gillespieana、M.globose、M.gracilipes、M.grandifolia、M.grandis、M.griffithii、M.guadalcanalensis、M.guatteriifolia、M.guillauminiana、M.hackenbergii、M.hellwigii、M.heritierifolia、M.hollrungii、M.hooglandii、M.horsfieldia、M.hypargyraea、M.hyposticta、M.impressa、M.impressinervia、M.inaequalis、M.incredibilis、M.iners、M.ingens、M.ingrate、M.inopinata、M.insipida、M.intermedia、M.inundata、M.inutilis、M.irya、M.iteophylla、M.johnsii、M.kajewskii、M.kalkmanii、M.kjellbergii、M.koordersii、M.korthalsii、M.kunstleri、M.kurzii、M.laevifolia、M.laevigata、M.laevis、M.lakilaki、M.lasiocarpa、M.laurella、M.laurina、M.laxiflora、M.lemanniana、M.lenta、M.lepidota、M.leptophylla、M.leucoxyla、M.litoralis、M.longipes、M.longipetiolata、M.lowiana、M.macgregori、M.macrantha、M.macrocarpa、M.macrocarya、M.macrocoma、M.macrothyrsa、M.magnifica、M.maingayi、M.majuscule、M.malabarica、M.malayana、M.mandaharan、M.markgraviana、M.mascula、M.maxima、M.mediovibex、M.mediterranea、M.micrantha、M.microcarpa、M.millepunctata、M.mindanaensis、M.mindorensis、M.miohu、M.mouchio、M.multinervia、M.murtoni、M.myrmecophila、M.nana、M.neglecta、M.negrosensis、M.nesophila、M.niobue、M.niohne、M.nitida、M.nivea、M.oblongifolia、M.olivacea、M.orinocensis、M.ornate、M.ovicarpa、M.pachycarpidia、M.pachyphylla、M.pachythyrsa、M.palawanensis、M.paludicola、M.papillatifolia、M.papuana、M.papyracea、M.parviflora、M.pectinate、M.pedicellata、M.peltata、M.pendulina、M.perlaevis、M.petiolate、M.philippensis、M.pilosella、M.pilosigemma、M.pinnaeformis、M.platysperma、M.plumeriifolia、M.polyantha、M.polyspherula、M.pseudoargentea、M.psilocarpa、M.pubicarpa、M.pulchra、M.pumila、M.pygmaea、M.quercicarpa、M.racemose、M.radja、M.resinosa、M.retusa、M.ridleyana、M.ridleyi、M.riedelii、M.robusta、M.rosselensis、M.rubiginosa、M.rubrinervis、M.rumphii、M.sagotiana、M.salomonensis、M.sangowoensis、M.sapida、M.sarcantha、M.schlechteri、M.schleinitzii、M.schumanniana、M.scortechinii、M.scripta、M.sericea、M.sesquipedalis、菲律宾肉豆蔻(M.simiarum)、M.simulans、M.sinclairii、M.smythiesii、M.sogeriensis、M.spanogheana、M.sphaerosperma、M.sphaerula、M.spicata、M.sprucei、M.stenophylla、M.suavis、M.subalulata、M.subglobosa、M.subtilis、M.succedanea、M.succosa、M.sulcata、M.suluensis、M.sumbavana、M.superba、M.tamrauensis、M.teijsmannii、M.tenuivenia、M.teysmanni、M.tingens、M.tomentella、M.tomentosa、M.trianthera、M.tristis、M.tuberculate、M.tubiflora、M.ultrabasica、M.umbellate、M.umbrosa、M.uncinata、M.undulatifolia、M.urdanetensis、M.uviformis、M.valida、M.velutina、M.verruculosa、M.villosa、M.vinkeana、M.vordermanni、M.wallaceana、M.wallichii、M.warburgii、M.wenzelii、M.womersleyi、M.wrayi、M.wyatt-smithii、云南肉豆蔻(M.yunnanensis)和M.zeylanica。
Licania是金壳果科(Chrysobalanaceae)的植物属。几个物种用作观赏植物。Licania果实是许多动物的重要食物并且还可以被人类食用。Licania中的物种包括Licania arborea、Licania caldasiana、Licania chiriquiensis、Licaniaconferruminata、Licania fasciculate、Licania grandibracteata、Licania hedbergii、Licania humilis、Licania kunthiana、Licania longicuspidata、Licania longipetala、Licania megalophylla、Licania michauxii、Licania morii、Licania pyrifolia、Licania rigida、Licania salicifolia、Licania splendens、Licania tomentosa、Licania vasquezii和Licania velutina。
石栗属是大戟科(Euphorbiaceae)中的小型树木开花植物的属。它原产于中国、印度次大陆、东南亚、Papuasia和昆士兰。据报道，它还在各个岛屿(太平洋和印度洋，加上加勒比海)以及非洲、南美洲和佛罗里达的分散位置自然化。这些雌雄同株的常绿树木是多年生植物或半多年生植物。果实是相当大的核果，具有肉质的外果皮和薄的木质内果皮。根据发育的子房数量，它们的形状各不相同。它们含有含油的有毒种子。该油已被用作石蜡、润滑剂以及用作清漆、油漆和肥皂的组分。一旦除去有毒物质，则其可以用作食用油。石栗属的物种包括A.cordatus、A.erraticus、A.fordii、A.japonicas、A.laccifer、A.montanus、A.peltatus、A.saponarius、A.trispermus、A.vernicifluus和A.vernicius。
蓖麻(Ricinus communis)、蓖麻子或蓖麻油植物，是大戟科中的开花植物的物种。它是单型属蓖麻和亚种蓖麻亚族(Ricininae)中的唯一物种。它的种子是蓖麻子，尽管其名字是这样，但它不是真正的豆。蓖麻属于东南地中海盆地、东非和印度，但在热带地区广泛分布(并在其他地方作为观赏植物广泛种植)。蓖麻籽是蓖麻油的来源，其具有广泛的用途。该种子含有40％至60％的富含甘油三酯的油，主要是蓖麻油酸。该种子还含有蓖麻毒素，一种水溶性毒素，其还在整个植物中以较低浓度存在。
榛属(榛树)是落叶乔木和大灌木的物种，原产于温带北半球。该属通常被置于桦木科中，尽管一些植物学家将榛树分成单独的榛木科(Corylaceae)。榛树的果实是榛子(hazelnut)。该果实是1-2.5cm长，1-2cm直径的坚果，被部分完全包封坚果的果壳包围。榛属的物种包括Corylus Americana、欧洲榛、榛(Corylus heterophylla)、滇榛(Corylusyunnanensis)、Corylus colchica、加州榛(Corylus cornuta)、马氏榛(Corylus maxima)、角榛(Corylus sieboldiana)(毛榛(C.mandshurica))、华榛(Corylus chinensis)、土耳其榛(Corylus colurna)、披针叶榛(Corylus fargesii)、Corylus jacquemontii、维西榛(Corylus wangii)和刺榛(Corylus ferox)。
Kermadecia是山龙眼科中的开花植物的属。该属包括四个物种(K.elliptica、K.pronyensis、K.rotundifolia和K.sinuata)，都是新喀里多尼亚特有的。Kermadeciasinuata是高达30m的高树，并且树干直径达1m。它存在于新喀里多尼亚大陆的中央范围，在北部罕见。它生长在地面平均海平面以上的茂密雨林中，或多或少在深沉淀底物上。K.sinuata具有淡金褐色或黄色的花，具有10-45cm的厚实的花序。该树具有核果(40-50x25-30mm)(www.endemia.nc)。马利筋属(乳草属(milkweed))，是美国多年生草本植物双子叶植物的属，其含有超过140个已知物种。它被归类于夹竹桃科(Apocynaceae)的萝藦亚科(Asclepiadoideae)。乳草以其乳状汁液命名，其由含有生物碱和其他几种复杂化合物(包括强心甾)的乳胶组成。马利筋属的物种包括albicans马利筋、amplexicaulis马利筋、asperula马利筋、californica马利筋、cordifolia马利筋、cryptoceras马利筋、curassavica马利筋、curtissii马利筋、eriocarpa马利筋、erosa马利筋、exaltata马利筋、fascicularis马利筋、humistrata马利筋、incarnata马利筋、lanceolata马利筋、linaria马利筋、linearis马利筋、longifolia马利筋、meadii马利筋、nyctaginifolia马利筋、obovate马利筋、purpurascens马利筋、quadrifolia马利筋、rubra马利筋、solanoana马利筋、speciose马利筋、subulata马利筋、subverticillata马利筋、sullivantii马利筋、叙利亚马利筋、tuberosa马利筋、uncialis马利筋、variegate马利筋、verticillata马利筋、vestita马利筋、viridiflora马利筋、翠绿马利筋(Asclepias viridis)和welshii马利筋。
Cardwellia是唯一描述的大型树木物种的属，属于山龙眼科植物的一部分。物种蕾丝木(北部丝绸橡木)是澳大利亚昆士兰州东北部湿热带地区的雨林特有的。其他常用名称包括木贼叶木麻黄(bull oak)、golden spanglewood、尼斯木、橡木和oongaary。复叶具有多达17个小叶。它产生白色花序，随后是木质果实，其突出显示在树冠外面。
银桦属是山龙眼科中近340个树木和灌木物种的大型属，仅原产于澳大利亚-较少见的是新喀里多尼亚(Bombarda I et al.(2010)J.Am.Oil Chem.Soc.87:981–986；Kato Mand Kawakita A.(2004)Am.J.Bot.91:1814–1827；Bailey LH and Miller W(1900)Cyclopedia of American Horticulture:Comprising Suggestions for Cultivation ofHorticultural Plants,Descriptions of the Species of Fruits,Vegetables,Flowers,and Ornamental Plants Sold in the United States and Canada；RandyStewart Landscape Design blog-rslandscapedesign.blogspot.com)。大多数物种不喜欢有机堆肥或富磷土壤。含有磷或钾的肥料可以杀死。在开花后进行修剪改进活力。它们具有抗鹿性，并且大多数物种可以忍受严重干旱，许多优选干燥的夏季。花吸引蜂鸟。它们还被一些鳞翅目物种(包括蓟序木蛾(dryandra moth)和菜青虫(小白(small white))的幼虫用作食用植物。疫霉属(Phytophora)腐烂是在夏季过度淹没的地中海物种的严重问题。它不仅发生在澳大利亚，而且还在其种植的其天然范围之外的地方(如意大利)被发现。
Exul银桦是小型树(其他来源称该植物也为灌木)，最大尺寸达到30英尺，是特有地原产于新喀里多尼亚的少数银桦中的一种。它与银桦(Grevillea robusta)密切相关。长度达9英寸的光滑边缘的非瓣叶片下面是生锈或柔滑的毛发。从冬季到夏季，白色的花朵都生长在长的牙刷状的簇上。它在排水良好的土壤中，在充足阳光下，在耐寒区9至12中茁壮成长。关于亚种黄紫伊素银桦的信息非常稀缺。已研究了Ni盐存在下的黄紫伊素银桦生长。种子已被分类为非休眠(ND)-在少于30天内完全发育的胚胎，水分可渗透的种子(或果实)外壳。该植物估计的传粉者是蜜蜂或鸟类。亚种黄紫伊素银桦的叶子更宽，并且下面是生锈红色。花朵生长在较大的簇上。
G.exul与银桦密切相关，可获得更多信息。银桦是快速生长、深根、半常绿的大型树，达到70英尺或更高，原产于澳大利亚昆士兰州的东南部。它在世界各地(包括圣地亚哥、智利、加利福尼亚和佛罗里达)的温和气候下生长为遮荫树。它还因其木材而具有价值，并在南非进行商业种植。有价值的木材经常用于建筑橱柜。该木材耐腐蚀。它在充足阳光下，在耐寒区8b至12(对应于美国的CA、TX、LA、FL)中茁壮成长，优选肥沃的、基于粘土但排水良好的土壤并且需要温暖干燥的夏季。幼年植物与成熟植物相比不耐寒得多(anpsa.org.au)。
迪科拉银桦是中等大小的直立灌木，高2-5m。叶子是狭窄的卵形或椭圆形，革质，暗灰绿色，7-18cm x 2.5-7cm，具有青铜红色和浓密多毛的新生体。这是一种色彩斑斓的植物，只要土壤排水良好，在干燥的热带地区就能很好地生长。它不适合寒冷、温带气候。该物种最好从划伤的种子繁殖。扦插已成功了但很难穿透。该物种已成功地接枝到银桦根茎上-接枝植物在较凉爽的地区成功生长。一些植物学家认为该植物是G.goodii的亚种。
Orites是山龙眼科中的九个已知物种的属。七个物种是澳大利亚特有的，两个在南美洲，一个在智利安第斯山脉并且一个在玻利维亚。该物种包括Orites acicularis、Orites diversifolius、Orites excelsus、Orites fiebrigii、Orites lancifolius、Orites megacarpus、Orites milliganii、Orites myrtoidea和Orites revolutus。
Orites diversifolius是一种常见的物种(缓慢生长到2m的灌木，耐霜和雪)，范围从塔斯马尼亚西部的低地雨林到高山地区的低层(亚高山林地)。叶子变化很大，但通常是长度的两倍多。雨林植物经常具有大约10cm长度的叶子，而来自暴露的亚高山地区的植物更可能达到约3-5cm的长度。尽管开花季节可能是不规则的，但在初夏出现有腋下穗状花序的有吸引力的白花。它们可能是完整的，但更经常具有尖锐的浅叶。叶子的下面是白霜。该物种需要良好的堆肥土壤、充足的水分和凉爽的位置。该物种可以在良好的条件下形成小型树。它生长在部分到全荫中(www.utas.edu.au；www.desertnorthwest.com；www.apstas.com；www.australianplants.com)。
Orites revolutus，也称为狭叶Orites，是塔斯马尼亚特有的植物物种。苏格兰植物学家Robert Brown于1810年在伦敦林奈学会会报中正式描述了来自圣克莱尔湖收集的标本的该物种。在高山和亚高山荒地丰富，Orites revolutus生长为蔓延灌木或直立、木质灌木，通常高0.5–1.5m(1英尺8英寸-4英尺11英寸)。分枝是密集的并且叶子在茎上交替。叶形是狭窄的并且在顶点处相当钝，长7–20mm，宽1-1.5mm，其边缘紧密旋转并且下面有毛状表面。开花发生在初夏至中夏，其在为叶子长度两倍的末端穗状花序上出现酸味的花。颜色是白色，长5mm，辐射对称且雌雄同体，具有4个贴生雄蕊和上位子房。花冠是瓣裂的，在芽中是管状的并且在成熟时分裂。果实是15mm的毛状卵泡，含有翅形种子。由于是山龙眼科的，O.revolutus可能为其范围内的食蜜动物物种提供重要的食物来源。该植物范围内的年平均温度在8℃左右徘徊，并且每年的降雨量往往高达1700或甚至2000mm。
枣属是鼠李科中的约40个物种的多刺灌木和小型树的属，分布于世界各地的温暖和亚热带地区。一些物种是落叶的，而其他物种是常绿的。果实是可食用的核果，黄褐色、红色或黑色，球状或长圆形，长1–5cm(0.39-1.97英寸)，经常非常甜和含糖，让人联想到椰枣(date)的质地和风味。枣属的物种包括abyssinica枣、angolito枣、apetala枣、毛果枣(Ziziphus attopensis)、budhensis枣、celata枣、cotinifolia枣、fungii枣、funiculosa枣、guaranitica枣、havanensis枣、horrida枣、hutchinsonii枣、incurve枣、joazeiro枣、jujube枣、laui枣、lotus枣、mairei枣、mauritiana枣、melastomoides枣、Mexicana枣、mistol枣、montana枣、mucronata枣、nummularia枣、obtusifolia枣、oenoplia枣、oxyphylla枣、parryi枣、platyphylla枣、quadrilocularis枣、robertsoniana枣、rugose枣、saeri枣、spina-christi枣、talanai枣、trinervia枣、undulata枣、xiangchengensis枣和xylopyrus枣。
枣(Ziziphus jujuba)通常被称为大枣(jujube)(有时是大枣(jujuba))、红枣、中国枣、朝鲜枣或印度枣。它主要用作遮荫树，也结出果实。它是一种小型落叶树或灌木，高度达到5-12m，通常具有多刺的树枝。叶子是闪亮的绿色，卵形锐尖，2-7cm宽且1-3cm宽阔，其在基部处具有三个明显的脉，和一个细齿边缘。花很小，宽5mm，具有五个不明显的黄绿色花瓣。果实是1.5-3cm深的可食用椭圆形核果；当不成熟时，它是光滑的绿色，具有苹果的稠度和味道，成熟时褐色到紫黑色并最终起皱，看起来像小椰枣。存在类似于橄榄核的单个硬核。果实产量为100-150g/树。间距为大约10m。果实中的脂质含量为约0.06％至0.10％并且在干果中为约1.1％。与荷荷巴(jojoba)相比，大枣果实具有较小的仁，以及还有较低的脂质含量。因此与荷荷巴相对比，大枣还未被视为生物柴油原料。干果和油性提取物是可商购的。
Hicksbeachia是山龙眼科中的两个树种树木的属。它们原产于新南威尔士州北部和昆士兰州东南部的雨林。由于它们的果实呈鲜红色，因此它们通常被称为红色坚果或牛肉坚果。这两个物种是Hicksbeachia pilosa和Hicksbeachia pinnatifolia。
Hicksbeachia pinnatifolia是一种罕见物种，原产于澳大利亚新南威尔士州和昆士兰州的亚热带雨林。常用名称包括红色bopple坚果、猴子坚果、红色坚果、牛肉坚果、玫瑰坚果和象牙丝绸橡木。该树在春季和夏季产生肉质红色果实。这些含有可食用的种子。H.pinnatifolia叶子是复合的或羽状的，长40-100cm。该植物一般在冬季开花。该红色Bopple坚果在春季和夏季产生肉质红色果实。果实是可食用、核果状、卵球形、2-4cm长、不裂、肉质、红色的，一侧上有沟裂，含有大杏仁大小的仁(坚果)。红色Bopple坚果具有类似于澳洲坚果的味道并且可以用于类似目的。该树具有相对大量的高质量坚果。树的繁殖是通过种子，但种子仅短暂的可行。由于幼苗容易发生各种病症，因此很难建立H.pinnatifolia。实际上，幼苗建立不良和发育不良限制了该物种的潜力(www.fruitandnuttrees.com)。它被认为类似但不如澳洲坚果。
沙棘属(沙棘(sea buckthorns))是胡颓子科(Elaeagnaceae)中的落叶灌木。它也被称为sandthorn、sallowthorn或seaberry。沙棘(Hippophae rhamnoides)(沙棘(commonsea buckthorn))是迄今为止该属中最广泛的物种，其八个亚种的范围从欧洲大西洋沿岸延伸到蒙古西北部和中国西北部。在中国、蒙古、俄罗斯、北欧和加拿大，发现超过90％或约1,500,000公顷的世界天然沙棘栖息地，在那里该植物用于土壤、水和野生动物保护、抗沙漠化目的并且用于消费品。由于属于该属的物种在中果皮中累积脂质，因此可以从果实的种子或果肉提取油。沙棘种子中的油含量为平均7％-11％，而果肉的油含量为1.5％-3％左右(每鲜重)。种子油的特征在于高含量的不饱和脂肪酸，而果肉油含有单不饱和脂肪酸和类胡萝卜素。同时亚油酸和α-亚麻酸是种子油中的主要脂肪酸，沙棘果肉油含有大约65％组合的单不饱和脂肪酸、棕榈油酸和饱和脂肪酸、棕榈酸。两种油还含有致密量的生育酚、生育三烯酚和植物甾醇。沙棘属的物种包括棱果沙棘(Hippophae goniocarpa)、江孜沙棘(Hippophae gyantsensis)、理塘沙棘(Hippophae litangensis)、肋果沙棘(Hippophaeneurocarpa)、沙棘(Hippophae rhamnoides)、柳叶沙棘(Hippophae salicifolia)和西藏沙棘(Hippophae tibetana)。
麻黄属是裸子植物灌木的属，是其家族(麻黄科和有序的麻黄目)中唯一的属。麻黄属的各种物种广泛存在于许多土地上，原产于北美洲西南部、欧洲南部、非洲北部，以及亚洲西南部和中亚、中国北部和南美西部。英语中的常用名称包括脆麻黄(joint-pine)、买麻藤(jointfir)、摩门茶(Mormon-tea)或布里格姆茶(Brigham tea)。麻黄属植物，包括草麻黄(E.sinica)和其他植物，传统上被原住民用于各种医学目的，包括治疗哮喘、枯草热和普通感冒。生物碱麻黄碱和伪麻黄碱是草麻黄和该属的其他成员的活性组分。这些化合物是具有兴奋剂和减充血剂质量的拟交感神经药，并且是化学取代的安非他明。麻黄属的物种包括alata麻黄、altissima麻黄、Americana麻黄、antisyphilitica麻黄、aphylla麻黄、麻黄×arenicola、aspera麻黄、aurantiaca麻黄、boelckei麻黄、botschantzevii麻黄、Breana麻黄、brevifoliata麻黄、californica麻黄、chilensis麻黄、compacta麻黄、coryi麻黄、cutleri麻黄、dahurica麻黄、dawuensis麻黄、distachya麻黄、麻黄×eleutherolepis、equisetina麻黄、fasciculata麻黄、fedtschenkoae麻黄、foeminea麻黄、foliata麻黄、fragilis麻黄、frustillata麻黄、funereal麻黄、gerardiana麻黄、glauca麻黄、holoptera麻黄、intermedia麻黄、麻黄×intermixta、kardangensis麻黄、khurikensis麻黄、laristanica麻黄、likiangensis麻黄、lomatolepis麻黄、major麻黄、milleri麻黄、minuta麻黄、monosperma麻黄、multiflora麻黄、nevadensis麻黄、ochreata麻黄、oxyphylla麻黄、pachyclada麻黄、pedunculata麻黄、pentandra麻黄、przewalskii麻黄、pseudodistachya麻黄、regeliana麻黄、rhytidosperma麻黄、rituensis麻黄、rupestris麻黄、sarcocarpa麻黄、sinica麻黄、somalensis麻黄、strobilacea麻黄、sumlingensis麻黄、tilhoana麻黄、torreyana麻黄、transitoria麻黄、triandra麻黄、trifurca麻黄、tweedieana麻黄、viridis麻黄和vvedenskyi麻黄。
Placospermum是单个物种大型树的属，构成山龙眼科植物的一部分。物种Placospermum coriaceum是澳大利亚昆士兰州东北部湿热带地区的雨林特有的。常用名称包括玫瑰丝绸橡木和板接种橡木。
木龙山龙眼属是山龙眼科植物中的六个物种的属。它们原产于澳大利亚，以高大的灌木和树木的形式生长。该属包括至少两个物种，其常用名称为木梨(woody pear)，澳大利亚东部的Xylomelum pyriforme和西澳大利亚的Xylomelum occidentale。木龙山龙眼属的物种包括Xylomelum angustifolium、Xylomelum benthamii、Xylomelumcunninghamianum、Xylomelum occidentale、Xylomelum pyriforme和Xylomelumscottianum。
荷荷巴(植物学名称油蜡树(Simmondsia chinensis))也被称为山羊坚果、鹿坚果、山胡桃果(pignut)、野生榛树、奎宁坚果、咖啡莓和灰盒子灌木。其原产于北美洲西南部。油蜡树是油蜡树科(Simmondsiaceae)的唯一物种，置于石竹目(Caryophyllales)中。荷荷巴被商业种植以生产荷荷巴油，一种从其种子提取的液体蜡酯。这种油是罕见的，因为它是极长的(C36-C46)直链蜡酯而不是甘油三酯，从而使得荷荷巴及其衍生物荷荷巴酯与传统的植物油相比更类似于人体皮脂和鲸油。荷荷巴油对于该行业来说是感兴趣的，因为它是无味的并且具有与温度无关的粘度。应用范围从发动机润滑油到食用油。荷荷巴蜡主要用于药物化合物，特别是用于皮肤产品。其作为生物柴油燃料的用途变得越来越重要。荷荷巴油由22至44个碳原子的长直单酯组成(与大多数由甘油三酯组成的植物油相反)，这使其在能量密度方面与柴油相当。
智利榛，也称为Hardy澳洲坚果、智利坚果，以及西班牙语的Avellano，原产于智利南部和阿根廷，并且在北半球很少种植或知晓(San B and Yildirim AN(2010)J.FoodCompos.Anal.23:706-710)。它是山龙眼科中的阔叶常绿植物，从灌木到60英尺高的树木不等。它从海平面到海拔近2,300英尺(700米)生长。其范围从南纬35度到44度延伸。该植物可能受到热的不利影响，而北美洲内部的冷冻可以杀死它。它能够在如爱尔兰、苏格兰、温和的英格兰地区和新西兰的位置茁壮成长。即使是孤植的树也可以结出可育的坚果。坚果可以每年生产。该坚果易于去壳。分析显示该坚果含有约12.5％的蛋白质、约49.5％的油和约24.1％的碳水化合物。在智利该高度单饱和油还被提取用于各种用途。发芽的种子易被啮齿动物吃掉。该树适应高度变化的土壤和光照水平。该物种不利于施磷(www.arthurleej.com)。在一些分类中，Gevuina属被认为具有三个物种，各是澳大利亚(Gevuina bleasdalei)、新几内亚(Gevuina papuana)特有的，并且一个物种在智利和阿根廷(智利榛)。其他分类学报告将澳大利亚和新几内亚物种置于Bleasdalea属或斐济特有Turrillia属中，并使Gevuina属仅留下智利榛。澳大利亚的植物区系在Gevuina属中保留了这2个物种，但最近的分类将澳大利亚和新几内亚物种分为Bleasdalea bleasdalei和B.papuana。
在一些实施方案中，该植物选自下组，该组由以下各项组成：智利榛(Gevuinaavellana)、欧洲榛(Corylus avellana)、Kermadecia sinuata、叙利亚马利筋(Asclepiassyriaca)、蕾丝木(Cardwellia sublimis)、黄紫伊素银桦(Grevillea exulvar.rubiginosa)、Orites diversifolius、Orites revoluta、枣(Ziziphus jujube)、Hicksbeachia pinnatifolia和迪科拉银桦(Grevillea decora)。
在一些实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体包括一种或多种藻类。在本文所述的各个实施方案中，该一种或多种藻类可以选自绿藻、黄绿藻和红藻。
在一些实施方案中，该一种或多种藻类包括一种或多种绿藻。在某些实施方案中，该一种或多种绿藻包括来自盘星藻属的物种。在一些实施方案中，该一种或多种绿藻包括单角盘星藻。在某些实施方案中，该一种或多种绿藻包括来自绿球藻属(Chlorococcum)的物种。在一些实施方案中，该一种或多种绿藻包括isabeliense绿球藻。在某些实施方案中，该一种或多种绿藻包括来自拟小球藻属(Parachlorella)的物种。在一些实施方案中，该一种或多种绿藻包括凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)。在某些实施方案中，该一种或多种绿藻包括来自卵囊藻属(Oocystis)的物种。在一些实施方案中，该一种或多种绿藻包括heteromucosa卵囊藻。在某些实施方案中，该一种或多种绿藻包括来自壳衣藻属(Phacotus)的物种。在一些实施方案中，该一种或多种绿藻包括透镜壳衣藻(Phacotuslenticularis)。在某些实施方案中，该一种或多种绿藻包括来自Dactylococcus属的物种。在某些实施方案中，该一种或多种绿藻包括来自独球藻属(Eremosphaera)的物种。在一些实施方案中，该一种或多种绿藻包括绿色独球藻(Eremosphaera viridis)。在某些实施方案中，该一种或多种绿藻包括来自衣藻属(Chlamydomonas)的物种。在一些实施方案中，该一种或多种绿藻包括monticola衣藻。在某些实施方案中，该一种或多种绿藻包括来自Dicranochaete属的物种。在一些实施方案中，该一种或多种绿藻包括Dicranochaetereniformis。
在一些实施方案中，该一种或多种藻类包括一种或多种黄绿藻。在某些实施方案中，该一种或多种黄绿藻包括来自Heterococcus属的物种。在一些实施方案中，该一种或多种黄绿藻包括Heterococcus crassulus。在一些实施方案中，该一种或多种黄绿藻包括Heterococcus pleurococcoides。在某些实施方案中，该一种或多种黄绿藻包括来自绿囊藻属(Chlorobotrys)的物种。在一些实施方案中，该一种或多种黄绿藻包括Chlorobotrysregularis。
在一些实施方案中，该一种或多种藻类包括一种或多种红藻。在某些实施方案中，该一种或多种红藻包括来自美芒藻属(Compsopogon)的物种。在一些实施方案中，该一种或多种红藻包括深紫美芒藻(Compsopogon coeruleus)。
在一些实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体包括一种或多种鞭毛虫。在一些实施方案中，该一种或多种鞭毛虫包括来自多形藻属(Distigma)的物种。在一些实施方案中，该一种或多种鞭毛虫包括Distigma curvata。在一些实施方案中，该一种或多种鞭毛虫包括来自螺肋藻属(Gyropaigne)的物种。在一些实施方案中，该一种或多种鞭毛虫包括Gyropaigne lefevrei。
在一些实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体包括一种或多种硅藻。在一些实施方案中，该一种或多种硅藻包括物种来自骨条藻属(Skeletonema)的物种。在一些实施方案中，该一种或多种硅藻包括敏盐骨条藻(Skeletonema subsalsum)。
在一些实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体包括一种或多种细菌。在一些实施方案中，该细菌包括革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，该革兰氏阴性细菌包括来自粘球菌属的物种。在某些实施方案中，该革兰氏阴性细菌包括黄色粘球菌。
在一些实施方案中，该细菌包括蓝细菌。在一些实施方案中，该蓝细菌包括来自聚球蓝细菌属的物种。在某些实施方案中，该蓝细菌包括细长聚球菌。在一些实施方案中，该蓝细菌包括来自拟绿胶蓝细菌属(Chlorogloeopsis)的物种。在某些实施方案中，该蓝细菌包括Chlorogloeopsis fritschii。在一些实施方案中，该蓝细菌包括来自隐杆藻属(Aphanothece)的物种。在某些实施方案中，该蓝细菌包括Aphanothece hegewaldii。在一些实施方案中，该蓝细菌包括来自色球藻属(Chroococcus)的物种。在某些实施方案中，该蓝细菌包括Aphanothece hegewaldii。
将酶和/或蛋白质引入一种或多种重组微生物中
本公开文本涉及从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法，该方法包括在被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的一种或多种重组微生物中产生该一种或多种不饱和脂质部分。在一个实施方案中，被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的该一种或多种重组微生物包含一种或多种外源生物合成酶。
去饱和酶
本公开文本描述了将脂肪酰基底物去饱和为相应的不饱和脂肪酰基底物的酶。
在一些实施方案中，去饱和酶用于催化将脂肪酰基-CoA或酰基-ACP转化为相应的不饱和脂肪酰基-CoA或酰基-ACP。去饱和酶是如下的酶，其催化饱和脂肪酸或脂肪酸衍生物(例如，脂肪酰基-CoA或脂肪酰基-ACP(在本文统称为“脂肪酰基”))中形成碳-碳双键，该催化通过去除至少两个氢原子以产生相应的不饱和脂肪酸/酰基。根据酶选择性催化在相对于脂肪酸/酰基的甲基末端的近末端碳或相对于脂肪酸/酰基的羰基末端的近末端碳处形成双键的能力对去饱和酶进行分类。ω(Omega)去饱和酶催化在相对于脂肪酸/酰基的甲基末端在固定近末端碳处形成碳-碳双键。例如，ω3去饱和酶催化在相对于脂肪酸/酰基的甲基末端的第三和第四个碳之间形成双键。Δ(Delta)去饱和酶催化在相对于脂肪酸的羧基或脂肪酰基CoA的羰基的特定位置处形成碳-碳双键。例如，Δ9去饱和酶催化在相对于脂肪酸的羧基末端或脂肪酰CoA的羰基的C9和C10碳之间形成双键。
如本文所用，去饱和酶可以参考去饱和酶催化双键形成的位置和不饱和烃的所得几何构型(即E/Z)来描述。因此，如本文所用，Z9去饱和酶是指如下的Δ去饱和酶，相对于脂肪酸/酰基的羰基末端，其催化C9和C10碳之间双键的形成，从而定向在顺式或Z构型的碳-碳双键相对侧上的两个烃。相似地，如本文所用，Z11去饱和酶是指如下的Δ去饱和酶，相对于脂肪酸/酰基的羰基末端，其催化C11和C12碳之间双键的形成。
去饱和酶具有保守的结构基序。跨膜去饱和酶的此序列基序由[HX3–4HX7–41(3non-His)HX2–3(1 nonHis)HHX61–189(40 non-His)HX2–3(1 non-His)HH]表征。可溶性去饱和酶的序列基序由[D/EEXXH]的两次发生表征。
在一些实施方案中，该去饱和酶是催化脂肪酰基-CoA中双键形成的脂肪酰基-CoA去饱和酶。在一些这样的实施方案中，本文所述的脂肪酰基-CoA去饱和酶能够利用脂肪酰基-CoA作为底物，该脂肪酰基-CoA具有6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个碳原子的链长。因此，该重组微生物中使用的去饱和酶可以基于底物的链长来选择。
在一些实施方案中，本文所述的脂肪酰基去饱和酶能够催化在相对于不饱和脂肪酰基-CoA上的末端CoA所希望的碳处形成双键。因此，在一些实施方案中，可以选择去饱和酶用于重组微生物，所述去饱和酶催化在相对于脂肪酰基-CoA上的羰基的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13位处插入双键。
在一些实施方案中，本文所述的脂肪酰基去饱和酶能够催化在饱和脂肪酰基-CoA中形成双键，使得所得不饱和脂肪酰基-CoA具有顺式或反式(即Z或E)几何构型。
在一些实施方案中，该去饱和酶是催化脂肪酰基-ACP中双键形成的脂肪酰基-ACP去饱和酶。在一些实施方案中，本文所述的脂肪酰基-ACP去饱和酶能够利用脂肪酰基-CoA作为底物，该脂肪酰基-CoA具有6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个碳原子的链长。因此，该重组微生物中使用的去饱和酶可以基于底物的链长来选择。
在一些实施方案中，本文所述的脂肪酰基-ACP去饱和酶能够催化在相对于不饱和脂肪酰基-ACP上的末端羰基所希望的碳处形成双键。因此，在一些实施方案中，可以选择去饱和酶用于重组微生物，所述去饱和酶催化在相对于脂肪酰基-ACP上的羰基的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13位处插入双键。
在一些实施方案中，本文所述的脂肪酰基去饱和酶能够催化在饱和脂肪酰基-CoA中形成双键，使得所得不饱和脂肪酰基-ACP具有顺式或反式(即Z或E)几何构型。
在一些实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶是硬脂基-CoAΔ9去饱和酶。在某些实施方案中，该硬脂基-CoAΔ9去饱和酶是OLE1。在一些实施方案中，该硬脂基-CoAΔ9去饱和酶是来自酿酒酵母的YGL055W。在一些实施方案中，该硬脂基-CoAΔ9去饱和酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0C05951g。在一些实施方案中，该硬脂基-CoAΔ9去饱和酶是来自白假丝酵母的CaO19.12583。在一些实施方案中，该硬脂基-CoAΔ9去饱和酶是来自白假丝酵母的CaO19.5117。在一些实施方案中，该硬脂基-CoAΔ9去饱和酶是来自热带假丝酵母的CTRG_05479。
在一些实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶是油酰基-CoAΔ12去饱和酶。在某些实施方案中，该油酰基-CoAΔ12去饱和酶是FAD2。在一些实施方案中，该油酰基-CoAΔ12去饱和酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0B10153g。在一些实施方案中，该油酰基-CoAΔ12去饱和酶是来自白假丝酵母的CaO19.118。在一些实施方案中，该油酰基-CoAΔ12去饱和酶是来自白假丝酵母的CaO19.7765。在一些实施方案中，该油酰基-CoAΔ12去饱和酶是来自热带假丝酵母的CTRG_02975。
在一些实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶是亚油酰基-CoAΔ15去饱和酶。在某些实施方案中，该亚油酰基-CoAΔ15去饱和酶是FAD3。在一些实施方案中，该亚油酰基-CoAΔ15去饱和酶是来自白假丝酵母的CaO19.4933。在一些实施方案中，该亚油酰基-CoAΔ15去饱和酶是来自白假丝酵母的CaO19.12399。在一些实施方案中，该硬脂基-CoAΔ9去饱和酶是来自热带假丝酵母的CTRG_03583。
在一个示例性实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶是Z11去饱和酶。在本文所述的各个实施方案中，Z11去饱和酶或编码它的核酸序列可以分离自物种黄地老虎、脐橙螟蛾、红带卷蛾、蔷薇斜条卷叶蛾、红醋栗穿孔蛾、粉纹夜蛾、玉米穗蛾或假微型海链藻的生物体。另外的Z11去饱和酶或编码它们的核酸序列可以分离自家蚕、烟草天蛾、西南玉米螟、埃及金刚钻、翠纹金刚钻、小菜蛾、家蚕或黄瓜绢野螟。在示例性实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自GenBank登录号JX679209、JX964774、AF416738、AF545481、EU152335、AAD03775、AAF81787和AY493438的序列。在一些实施方案中，密码子优化了编码Z11去饱和酶的核酸序列，其来自物种黄地老虎、脐橙螟蛾、红带卷蛾、蔷薇斜条卷叶蛾、红醋栗穿孔蛾、粉纹夜蛾、玉米穗蛾或假微型海链藻的生物体。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自粉纹夜蛾的SEQ ID NO:3、11、17和19。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自粉纹夜蛾的SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。在其他实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自黄地老虎的SEQ ID NO:4和9。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自黄地老虎的SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自假微型海链藻的SEQ ID NO:5和16。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的氨基酸序列：来自假微型海链藻的SEQID NO:26和27。在某些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自脐橙螟蛾的SEQ ID NO:6、10和23。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自脐橙螟蛾的SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列。在另外的实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:7、12、18、20和24。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自大螟的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含GenBank登录号AF416738、AGH12217.1、AII21943.1、CAJ43430.2、AF441221、AAF81787.1、AF545481、AJ271414、AY362879、ABX71630.1和NP001299594.1、Q9N9Z8、ABX71630.1和AIM40221.1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含嵌合多肽。在一些实施方案中，完全或部分Z11去饱和酶与另一种多肽融合。在某些实施方案中，Z11去饱和酶的N末端天然前导序列被来自另一物种的油质蛋白前导序列替代。在某些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：SEQ ID NO:8、21和22。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的氨基酸序列：SEQ ID NO:33、34、35、36、37和38。
在另一个示例性实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶是Z9去饱和酶。在本文所述的各个实施方案中，该Z9去饱和酶或编码它的核酸序列可以分离自物种亚洲玉米螟、欧洲玉米螟、蔷薇斜条卷叶蛾、红醋栗穿孔蛾、烟夜蛾或玉米穗蛾的生物体。在示例性实施方案中，该Z9去饱和酶包含选自GenBank登录号AY057862、AF243047、AF518017、EU152332，AF482906和AAF81788的序列。在一些实施方案中，编码Z9去饱和酶的核酸序列经密码子优化。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自亚洲玉米螟的SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自亚洲玉米螟的SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列。在其他实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自红醋栗穿孔蛾的SEQ ID NO:14中列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自红醋栗穿孔蛾的SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:15中列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列。
黄素蛋白吡啶核苷酸细胞色素还原酶
本公开文本描述了催化单电子载体与携带双电子的烟酰胺二核苷酸之间的还原当量的互换的酶。该酶可以包括铁氧还原蛋白:NADP+还原酶(FNR)、植物和真菌NAD(P)H:硝酸盐还原酶、NADH:细胞色素b5还原酶、NADPH:P450还原酶、NADPH:亚硫酸盐还原酶、一氧化氮合酶、邻苯二甲酸加双氧酶还原酶，以及各种其他黄素蛋白。
在一个实施方案中，该黄素蛋白吡啶核苷酸细胞色素还原酶是催化以下反应的NADH:细胞色素B5还原酶：2高铁细胞色素b5+NADH→2亚铁细胞色素b5+NAD++H+。
NADH:细胞色素B5还原酶(CBR)是一种黄素蛋白氧化还原酶，其用作细胞色素B5的电子供体，这是一种普遍存在的电子载体。细胞色素B5还原酶参与多种代谢途径，包括但不限于：类固醇生物合成、脂肪酸的去饱和和延伸、P450依赖性反应和高铁血红蛋白还原。
由于单个mRNA的可变剪接，细胞色素B5还原酶作为可溶性酶和膜结合酶两者发生。可溶形式主要存在于红细胞中，并涉及高铁血红蛋白的还原。膜结合形式的酶主要存在于内质网和线粒体外膜中，在那里其参与脂肪酸的去饱和、胆固醇生物合成和药物代谢。在膜结合形式中，N-末端残基是肉豆蔻酰化的。该酶的缺乏可能导致高铁血红蛋白血症。
细胞色素B5还原酶也称为高铁血红蛋白还原酶、NADH细胞色素B5还原酶、NADH高铁血红蛋白还原酶和NADH-高铁血红蛋白还原酶。
在一个实施方案中，该黄素蛋白吡啶核苷酸细胞色素还原酶是细胞色素B5还原酶。在一些实施方案中，该细胞色素B5还原酶是酿酒酵母YIL043C。在其他实施方案中，该细胞色素B5还原酶是解脂耶氏酵母YALI0D04983g。在一些实施方案中，该细胞色素B5还原酶是白假丝酵母CaO19.1801。在一些实施方案中，该细胞色素B5还原酶是白假丝酵母CaO19.9367。在一些实施方案中，该细胞色素B5还原酶是热带假丝酵母CTRG_03865。在一些实施方案中，该细胞色素B5还原酶是甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)HQ852050。在一些实施方案中，该细胞色素B5还原酶是甜菜夜蛾JX569756。在一些实施方案中，该细胞色素B5还原酶是棉铃虫HQ638220。在一些实施方案中，该细胞色素B5还原酶是棉铃虫HQ190046。在另一个实施方案中，该黄素蛋白吡啶核苷酸细胞色素还原酶是NADPH依赖性细胞色素P450还原酶(CPR1或NCP1)。在一些实施方案中，该NADPH依赖性细胞色素P450还原酶是酿酒酵母YHR042W。在其他实施方案中，该NADPH依赖性细胞色素P450还原酶是解脂耶氏酵母YALI0D04422g。在一些实施方案中，该NADPH依赖性细胞色素P450还原酶是白假丝酵母CaO19.10187。在一些实施方案中，该NADPH依赖性细胞色素P450还原酶是白假丝酵母CaO19.2672。在一些实施方案中，该NADPH依赖性细胞色素P450还原酶是热带假丝酵母CTRG_00485。在一些实施方案中，该NADPH依赖性细胞色素P450还原酶是棉灰翅夜蛾JX310073。在一些实施方案中，该NADPH依赖性细胞色素P450还原酶是甜菜夜蛾HQ852049。在一些实施方案中，该NADPH依赖性细胞色素P450还原酶是棉铃虫HM347785。
在一些实施方案中，本文所述的细胞色素还原酶用于催化将脂肪酰基-CoA或酰基-ACP转化为相应的不饱和脂肪酰基-CoA或酰基-ACP。
延伸酶
本公开文本描述了延长脂肪酸的链长的酶。
两种不同类型的脂肪酸延伸发生在不同的生物体中。这些延伸途径使用辅酶-A作为脂肪酸合成系统FAS I和FAS II的酰基载体而不是酰基载体蛋白(ACP)。第一类型，线粒体脂肪酸延伸，是脂肪酸氧化的逆转。这利用乙酰基-CoA作为底物并用两个碳延伸脂肪酸的链长。该过程主要作用于比C16短的酰基-CoA。
第二过程是内质网的延伸途径，其存在于植物、哺乳动物、酵母和其他低等真核生物中。这是由个体酶催化的四步反应。这些酶是β-酮脂酰基-CoA合酶、β-酮脂酰基-CoA还原酶、β-羟酰基-CoA脱水酶和反式-2-烯酰基-CoA还原酶。该途径主要与链长C16或更大的酰基-CoA起作用，并且在生成非常长链的脂肪酸中是重要的。该过程利用丙二酰-CoA而不是乙酰基-CoA进行链延伸。导致丙二酰-CoA与酰基-CoA(β-酮脂酰基-CoA合酶)缩合的第一种酶也称为延伸酶。
取决于宿主生物体，存在几个延伸酶变体。在酿酒酵母中，三种不同的基因编码延伸酶(ELO1、ELO2(FEN1)和ELO3(FEN12))，并且它们具有不同的底物特异性。ELO1优选较短的饱和脂肪酸(C14-C16)，ELO2优选较长的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，并且ELO3优选单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。相比之下，布氏锥虫(Trypanosoma brucei)具有两个对较短脂肪酸具有特异性的延伸酶基因(ELO1–C4至C10延伸和ELO2–C10至C14延伸)。该三种酵母延伸酶基因的直向同源物在恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)两者中被鉴定，并且它们可能具有与酵母相似的底物特异性。
在一些实施方案中，该延伸酶是来自酿酒酵母(YJL196C)的ELO1。在另一个实施方案中，该延伸酶是来自酿酒酵母(YCR034W)的ELO2(FEN1)。在某些实施方案中，该延伸酶是来自白假丝酵母的CaO19.6343。在某些实施方案中，该延伸酶是来自白假丝酵母的CaO19.13699。在某些实施方案中，该延伸酶是来自热带假丝酵母的CTRG_03563。在另一个实施方案中，该延伸酶是来自酿酒酵母(YLR372W)的ELO3(FEN12)。在某些实施方案中，该延伸酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0B20196g。在某些实施方案中，该延伸酶是来自白假丝酵母的CaO19.8526。在某些实施方案中，该延伸酶是来自白假丝酵母的CaO19.908。在某些实施方案中，该延伸酶是来自热带假丝酵母的CTRG_01179。
除脂肪酸延伸之外，脂肪酸回收也被包括在该途径中。在酰基-CoA结合蛋白(ACBP)的作用下从宿主回收的脂肪酸可以分别在ER-定位的酶二酰基甘油O-酰基转移酶(DGAT)和甾醇O-酰基转移酶的作用下转化为三酰基甘油酯和胆固醇酯，并且可以储存在脂质体中。恶性疟原虫和刚地弓形虫中存在强的生物化学证据支持从宿主获得脂肪酸。
硫酯酶
本公开文本描述了从酰基-ACP或酰基-CoA释放游离脂肪酸的酶。
酰基-ACP硫酯酶从酰基-ACP(由从头脂肪酸生物合成而合成的)释放游离脂肪酸。反应终止脂肪酸生物合成。在植物中，脂肪酸生物合成发生在质体中，并且因此需要质体定位的酰基-ACP硫酯酶。在所有植物的营养组织中，酰基-ACP硫酯酶的主要产物是油酸酯(C18:0)，并且在较小程度上为棕榈酸酯(C16:0)。释放的游离脂肪酸被重新酯化成质体包膜中的辅酶A，并从质体中输出。
存在两种酰基-ACP硫酯酶同种型FatA和FatB。这些同种型的底物特异性决定了植物中饱和脂肪酸的链长和水平。FatA对C18:1-ACP的活性最高。与C18:1-ACP相比，FatA对其他酰基-ACP的活性非常低。FatB对C16:0-ACP的活性最高。它也对C18:1-ACP具有显著的高活性，随后是C18:0-ACP和C16:1-ACP。FatA和FatB的动力学研究指示，它们对不同酰基-ACP的底物特异性来自Kcat值，而不是来自Km。两种同种型对不同底物的Km值在微摩尔级上相似。FatA和FatB的结构域交换指示同种型的N-末端决定了它们的底物特异性。对于在种子中主要累积中链长饱和脂肪酸的那些植物来说，它们演化出FatB和/或FatA硫酯酶(Voelker T,Kinney AJ(2001)Variations in the biosynthesis of seed-storagelipids.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52:335-361)。例如，月桂酸酯(12:0)是椰子中主要的种子油。相应地，在椰子种子中检测到中链特异性酰基-ACP硫酯酶活性。
脂肪酸经常以酰基-coA的活化形式存在于细胞中。酰基-CoA用于许多细胞产物和组分的生物合成。在植物中，它们涉及膜脂质、种子储存脂质、蜡、角质和木栓质的生物合成。
酰基-CoA硫酯酶将脂肪酰基-CoA水解成游离脂肪酸。在真核生物中，已在胞质溶胶、ER、线粒体和过氧化物酶体中检测到酶活性。在原核生物中，酶活性位于周质和胞质溶胶中。在原核生物中，酰基-CoA硫酯酶涉及分解代谢、作为唯一碳源支持脂肪酸或共轭脂肪酸的生长(Nie L et al.(2008)A novel paradigm of fatty acid beta-oxidationexemplified by the thioesterase-dependent partial degradation of conjugatedlinoleic acid that fully supports growth of Escherichia coli.Biochemistry 47(36):9618-26)。酰基-CoA硫酯酶在真核生物体中的生理作用仍不清楚。在动物和酵母中的研究揭示了关于酶参与脂肪酸氧化的一些初步线索。ACH2是第一种克隆植物酰基-CoA硫酯酶(Tilton GB et al(2004)Biochemical and molecular characterization of ACH2,anacyl-CoA thioesterase from Arabidopsis thaliana.J Biol Chem 279(9):7487-94)。该基因在成熟组织中高度表达，而不是在主要发生脂肪酸β-氧化的发芽幼苗中表达。它表明ACH2的作用与脂肪酸氧化无关。
在一些实施方案中，该酰基-ACP硫酯酶是来自拟南芥(基因ID AT1G08510)的FatB。在一些实施方案中，该酰基-ACP硫酯酶是来自拟南芥(基因ID AT3G25110)的FatA。
在一些实施方案中，该酰基-CoA硫酯酶是来自大肠杆菌(基因ID EG11542)的tesA。在一些实施方案中，该酰基-CoA硫酯酶是来自拟南芥(基因ID AT1G01710)的ACH2。
甘油-3-磷酸酰基转移酶
本公开文本描述了催化甘油3-磷酸的sn-1位置处如下所示的酰化反应的酶：
长链酰基-CoA+sn-甘油3-磷酸→1-酰基-sn-甘油3-磷酸+辅酶A。
甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化甘油3-磷酸的sn-1位置处的酰化反应。植物细胞含有三种类型的GPAT，它们位于叶绿体、线粒体和细胞质中。叶绿体中的酶是可溶的并且使用酰基-(酰基-载体蛋白)作为酰基供体，而线粒体和细胞质中的酶与膜结合并使用酰基-CoA作为酰基供体(Nishida I et al.(1993)The gene and the RNA for theprecursor to the plastid-located glycerol-3-phosphate acyltransferase ofArabidopsis thaliana.Plant Mol Biol.21(2):267-77；Murata N and Tasaka Y(1997)Glycerol-3-phosphate acyltransferase in plants.Biochim Biophys Acta.1348(1-2):10-16)。
已在拟南芥中鉴定出8种GPAT基因(Zheng Z et al.(2003)ArabidopsisAtGPAT1,a member of the membrane-bound glycerol-3-phosphate acyltransferasegene family,is essential for tapetum differentiation and male fertility.PlantCell 15(8):1872-87)。GPAT1被证明编码线粒体酶(Zheng et al.2003)。GPAT4、GPAT5和GPAT8被证明对角质生物合成来说是必需的(Beisson F et al.(2007)Theacyltransferase GPAT5is required for the synthesis of suberin in seed coatand root of Arabidopsis.Plant Cell 19(1):351-368；Li,Y et al.(2007)Identification of acyltransferases required for cutin biosynthesis andproduction of cutin with suberin-like monomers.Proc Natl Acad Sci USA 104(46):18339-18344)。GPAT2、GPAT3、GPAT6和GPAT7尚未被表征。
细胞质GPAT负责合成三酰基甘油和非叶绿体膜磷脂。预期对棕榈酸酯(C16:0)和油酸酯(C18:1)具有底物偏好，因为这两种脂肪酸是在植物三酰基甘油的sn-1位置处发现的最常见的脂肪酸。从鳄梨部分纯化细胞质GPAT(Eccleston VS and Harwood JL(1995)Solubilisation,partial purification and properties of acyl-CoA:glycerol-3-phosphate acyltransferase from avocado(Persea americana)fruitmesocarp.Biochim Biophys Acta 1257(1):1-10)。
来自大肠杆菌(E.coli)的膜结合甘油-3-磷酸酰基转移酶(PlsB)催化磷脂生物合成中的第一个关键步骤，并且被认为与后续的酶1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(PlsC)非常接近地起作用(Kessels JM et al.(1983)Facilitated utilization ofendogenously synthesized lysophosphatidic acid by 1-acylglycerophosphateacyltransferase from Escherichia coli.Biochim Biophys Acta 753(2):227-235)。它特异于sn-甘油3-磷酸的位置1处的酰化，并且可以利用脂肪酰基-酰基载体蛋白(酰基-ACP)或脂肪酰基-辅酶A(酰基-CoA)硫酯作为酰基供体以形成1-酰基-sn-甘油3-磷酸。内源合成的脂肪酸与ACP附接，并且外源添加的脂肪酸与CoA附接。在大肠杆菌磷脂中，sn 1位置主要由棕榈酸酯或顺式-异油酸酯占据，而sn 2位置主要是棕榈油酸酯或顺式-异油酸酯。这被认为是由PlsB和PlsC酶的底物偏好引起的。
该plsB基因已被证明由应激反应调节子(如RNA聚合酶、sigma 24(sigma E)因子和ppGpp)调节(Wahl A et al.(2011)Antagonistic regulation of dgkA and plsBgenes of phospholipid synthesis by multiple stress responses in Escherichiacoli.Mol Microbiol 80(5):1260-75。PlsB是用于磷脂合成的蛋白质网络的一部分，并与全-[酰基-载体蛋白](ACP)、酯酶/硫酯酶(YbgC)和磷脂酰丝氨酸合酶(PssA)相互作用，以在内膜的细胞质侧处形成复合物。
plsB对生长来说是必需的(Baba T et al.(2006)Construction of Escherichiacoli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol SystBiol.2:2006-2008；Yoshimura M et al.(2007)Involvement of the YneS/YgiH andPlsX proteins in phospholipid biosynthesis in both Bacillus subtilis andEscherichia coli.BMC Microbiol 7:69)。
定点诱变和化学修饰研究已证明了PlsB中具有催化作用的重要氨基酸残基，包括对催化所必需的变体组氨酸残基(Lewin TM et al.(1999)Analysis of amino acidmotifs diagnostic for the sn-glycerol-3-phosphate acyltransferasereaction.Biochemistry 38(18):5764-5771)。遗传学研究已将plsB基因座鉴定为涉及多药耐受性持留细胞的形成。
在早期的工作中研究了大肠杆菌B酶的特性(Kito M et al.(1972)Inhibitionof L-glycerol 3-phosphate acyltransferase from Escherichia coli by cis-9,10-methylenehexadecanoic acid.J Biochem 71(1):99-105；Okuyama H and Wakil SJ(1973)Positional specificities of acyl coenzyme A:glycerophosphate and acylcoenzyme A:monoacylglycerophosphate acyltransferases in Escherichia coli.JBiol Chem 248(14):5197-5205；Kito M et al.(1978)Function of phospholipids onthe regulatory properties of solubilized and membrane-bound sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase of Escherichia coli.Biochim Biophys Acta 529(2):237-249)。
甘油-3-磷酸/二羟基丙酮磷酸双底物特异性sn-1酰基转移酶位于脂质颗粒和ER中，并且涉及甘油-3-磷酸和二羟基丙酮在脂质生物合成中的逐步酰化。最保守的基序和功能相关的残基朝向ER腔定向。
从酿酒酵母鉴定、克隆并生物化学表征编码双甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(GAT)/二羟基丙酮磷酸酰基转移酶(DHAT)的基因(SCT1)。在展现出非常低GAT/DHAT活性的酵母Δgpt1突变体中，SCT1通过质粒载体的过表达显示GAT/DHAT活性增加，强调所提出的分子作为甘油-3-磷酸O-酰基转移酶/二羟丙酮磷酸酰基转移酶起作用。针对酰基-供体的GAT/DHAT活性最高的是棕榈油酰基-CoA，随后是棕榈酰基-CoA、油酰基-CoA和硬脂酰基-CoA。SCT1p定位于胞质溶胶中的膜，最可能定位于内质网。Δsct1突变体的体内研究确实揭示了对所有四种磷脂的影响，但观察到的磷脂酰乙醇胺类中16:0脂肪酸的减少通过其他脂肪酸，特别是18:0分子种类的增加来平衡。SCT1和GPT2的无效突变体在酵母中是合成致死的(Zheng Z and Zou J(2001)The initial step of the glycerolipid pathway:identification of glycerol 3-phosphate/dihydroxyacetone phosphate dualsubstrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae.J Biol Chem 276(45):417104-41716)。
鉴定、克隆并生物化学表征了来自酿酒酵母的编码双甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(GAT)/二羟基丙酮磷酸酰基转移酶(DHAT)的基因(GPT2)。GPT2在缺乏GAT/DHAT活性的ΔplsB背景中在大肠杆菌中重组表达，并且显示出增加的GAT活性，但可能由于GPT2在膜中的不正确嵌入而无法拯救突变体。在展现出非常低GAT/DHAT活性的酵母Δgpt1突变体中，GPT2从质粒载体的过表达显示GAT/DHAT活性增加，强调所提出的分子作为甘油-3-磷酸O-酰基转移酶/二羟丙酮磷酸酰基转移酶起作用。针对酰基-供体的GAT/DHAT活性最高的是油酰基-CoA，随后是棕榈油酰基-CoA、棕榈酰基-CoA和硬脂酰基-CoA。
GPT2p定位于胞质溶胶中的膜。Δgpt2突变体的体内研究未揭示对总脂肪酸谱的任何显著影响，但观察到的磷脂酰乙醇胺类中16:1脂肪酸的减少通过16:0和18:1分子种类的增加来补偿。对缺乏GAT活性的已知酵母突变体TTA1的分析显示TTA1 GPT2基因具有错义突变，其中酰基转移酶的保守基序III中的一个核苷酸变化。SCT1和GPT2的无效突变体在酵母中是合成致死的(Zheng and Zou 2001)。
在一些实施方案中，该甘油-3-磷酸酰基转移酶是来自拟南芥(At1g02390)的GPAT。在一些实施方案中，该甘油-3-磷酸酰基转移酶是来自大肠杆菌(基因ID EG10740)的PlsB。在一些实施方案中，该甘油-3-磷酸酰基转移酶是来自酿酒酵母(YBL011w)的双甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(GAT)/二羟基丙酮磷酸酰基转移酶(DHAT)SCT1。在一些实施方案中，该甘油-3-磷酸酰基转移酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0C00209g。在一些实施方案中，该甘油-3-磷酸酰基转移酶是来自白假丝酵母的I503_02577。在一些实施方案中，该甘油-3-磷酸酰基转移酶是来自热带假丝酵母的CTRG_02630。在一些实施方案中，该甘油-3-磷酸酰基转移酶是来自酿酒酵母(YKR067w)的双甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(GAT)/二羟基丙酮磷酸酰基转移酶(DHAT)GPT2。在一些实施方案中，该甘油-3-磷酸酰基转移酶是来自白假丝酵母的CaO19.5815。在一些实施方案中，该甘油-3-磷酸酰基转移酶是来自白假丝酵母的CaO19.13237。在一些实施方案中，该甘油-3-磷酸酰基转移酶是来自热带假丝酵母的CTRG_02630。
溶血磷脂酸酰基转移酶
本公开文本描述了催化三酰基甘油的sn-2位置的酰化的酶。
由基因plsC编码的膜结合1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶催化磷脂生物合成中的第二步骤，并且被认为与由基因plsB编码的前述酶甘油-3-磷酸酰基转移酶非常接近地起作用(Kessels JM et al.1983)。它特异于1-酰基-sn-甘油3-磷酸的sn-2位置处的酰化，并且可以利用酰基-酰基载体蛋白(酰基-ACP)或酰基-辅酶A(酰基-CoA)作为脂肪酰基供体以形成1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸(磷脂酸，磷脂酸)。内源合成的脂肪酸与ACP附接，并且外源添加的脂肪酸与CoA附接(Greenway DL and Silbert DF(1983)Alteredacyltransferase activity in Escherichia coli associated with mutations inacyl coenzyme A synthetase.J Biol Chem 258(21):13034-13042)。在大肠杆菌磷脂中，sn 1位置主要由棕榈酸酯或顺式-异油酸酯占据，而sn 2位置主要是棕榈油酸酯或顺式-异油酸酯。这被认为是由PlsB和PlsC酶的底物偏好引起的(Rock CO et al.(1981)Phospholipid synthesis in Escherichia coli.Characteristics of fatty acidtransfer from acyl-acyl carrier protein to sn-glycerol 3-phosphate.J BiolChem 256(2):736-742；Goelz SE and Cronan JE(1980)The positional distributionof fatty acids in Escherichia coli phospholipids is not regulated by sn-glycerol 3-phosphate levels.J Bacteriol 144(1):462-464)。
定点诱变研究显示，将苏氨酸-122改变为丙氨酸或亮氨酸导致酰基-CoA底物特异性的变化(Morand LZ et al.(1998)Alteration of the fatty acid substratespecificity of lysophosphatidate acyltransferase by site-directedmutagenesis.Biochem Biophys Res Commun 244(1):79-84)。
在大肠杆菌的工程菌株中，PlsC和GalU的过表达导致糖基甘油脂质的产生增加(Mora-Buye N et al.(2012).An engineered E.coli strain for the production ofglycoglycerolipids.Metab Eng 14(5):551-559)。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的plsC基因编码与大肠杆菌酶同源的1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶。将该基因克隆并在大肠杆菌中表达，并且表达它的膜被证明催化预测的功能(Lu YJ et al.(2006)Acyl-phosphates initiate membranephospholipid synthesis in Gram-positive pathogens.Mol Cell 23(5):765-772)。
植物溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)催化三酰基甘油的sn-2位置的酰化。LPAAT在给定植物物种中的底物特异性通常决定了哪些脂肪酸物质在sn-2位置处结合。已从玉米和草甸泡沫克隆了LPAAT。草甸泡沫中存在两种LPAAT基因，而玉米中仅一种。通过体外测定证实了LAT1和LAT2两者在草甸泡沫中的酶活性。此外，LAT2被证明与大肠杆菌LPAAT缺陷菌株的功能互补(Brown AP et al.(2002)Limnanthes douglasii lysophosphatidic acidacyltransferases:immunological quantification,acyl selectivity and functionalreplacement of the Escherichia coli plsC gene.Biochem J 364(Pt 3):795-805)。
LAT1是仅使用18:1-CoA作为底物的高选择性酰基转移酶。LAT2的选择性较低。最高活性对22:1-CoA示出，随后是16:0-CoA和18:1-CoA。对于膜脂质生物合成中的LAT1和储存脂质生物合成中的LAT2，LAT1和LAT2的底物特异性与它们所发挥的作用一致。植物细胞膜主要含有C16和C18不饱和脂肪酸，而储存脂质含有大范围的脂肪酸，包括饱和脂肪酸和非常长链的不饱和脂肪酸。通过抗体检测不同植物组织中LAT1和LAT2的蛋白质水平。LAT1存在于叶子和发育中的种子两者中，而LAT2仅在发育中的种子中检测到。这再次与它们所发挥的作用一致。LAT2在三酰基甘油生物合成中的作用进一步通过LAT2在油菜中的转化来证明，其通常在sn-2位置处不含有22:1-CoA。草甸泡沫LAT2的转化在sn-2位置处插入22:1-CoA(Lassner MW et al.(1995)Lysophosphatidic acid acyltransferase frommeadowfoam mediates insertion of erucic acid at the sn-2 position oftriacylglycerol in transgenic rapeseed oil.Plant Physiol 109(4):1389-1394)。
利用缺乏鞘脂生物合成的活的突变酿酒酵母菌株，分离基因SLC1并证明其编码酰基-CoA:溶血磷脂酸酰基转移酶。与分类为1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶的大肠杆菌PLSC蛋白的序列同源性表明相似的功能。SLC1p的这种假定的分子功能通过拯救大肠杆菌的ΔplsC突变体的能力得到证实。可以证明，在位置131处将L-谷氨酰胺改变为L-亮氨酸的单个核苷酸改变将底物偏好从C16和C18脂肪酸转化为C26脂肪酸，该C26脂肪酸其在体内在野生型(SLC1)相比于突变体(SLC1-1)的相应脂肪酸组合物中得到反映(Nagiec MM et al.(1993)A suppressor gene that enables Saccharomyces cerevisiae to grow withoutmaking sphingolipids encodes a protein that resembles an Escherichia colifatty acyltransferase.J Biol Chem 268(29):22156-22163)。
在大肠杆菌中用重组表达和纯化的SLC1p进行的体外测定揭示了对溶血磷脂酸和油酰基-CoA的底物优选，但也接受1-棕榈酰甘油3-磷酸和1-硬脂酰基-sn-甘油3-磷酸。突变体如Δslc1、Δslc4(另一种潜在的酰基-CoA:磷脂酰基酰基转移酶)和带有质粒的Δslc1Δslc4的双突变体(其中SLC1或SLC4基因被称为2.ΔSLC1(或2.ΔSLC4))的体内研究表明SLC1促进了磷脂酸以及磷脂酰肌醇和二酰基甘油的生物合成。有人建议SLC1通过在体内交换甘油磷脂上的脂肪酸参与磷脂重塑(Benghezal M et al.(2007)SLC1 and SLC4encode partially redundant acyl-coenzyme A 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferases of budding yeast.J Biol Chem 282(42):30845-30855)。
用已知的酰基转移酶的候选开放阅读框(ORF)筛选酵母基因组并测试相关的缺失菌株，鉴定了编码酰基-CoA依赖性溶血磷脂酰基转移酶(ALE1)的基因。在Δale1菌株中，观察到溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶(LPEAT)活性显著降低，但也可以证明当酿酒酵母中的主要LPAAT，即SLC1p不存在或变为非活动状态时，ALE1p可以提供多余的溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)活性。ALE1p优选地将不同长度的不饱和酰基链附接到溶血磷脂的sn-2位置。利用高纯度细胞分级，将酶定位于微粒体和线粒体膜两者。有人提出ALE1可能是酵母外源溶血脂质代谢(ELM)途径中的主要LPEAT，但它也是内源Kennedy途径有效运行所需要的(Riekhof WR et al.(2007)Identification and characterization of the majorlysophosphatidylethanolamine acyltransferase in Saccharomyces cerevisiae.JBiol Chem 282(39):28344-28352)。
在同时研究中，通过应用合成遗传阵列分析鉴定LPT1(与ALE1同义)并且证明其具有溶血磷脂酰基转移酶活性。在该研究中，LPT1(＝ALE1)的最佳底物是溶血磷脂酰胆碱，因此充当溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)，并且还利用单个Δlpt1和双Δscl1Δlpt1突变体证明了较早报道的LPAAT的残余活性，后者是不能存活的。将油酸盐结合到磷脂酰胆碱中的比率确定为70％朝向从头合成且30％朝向重塑(Jain S et al.(2007)Identification of a novel lysophospholipid acyltransferase in Saccharomycescerevisiae.J Biol Chem 282(42):30562-30569)。
ALE1(也称为LCA1或SLC4)作为溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)的分子功能在另一监测放射性标记的溶血磷脂酰胆碱和/或棕榈酰基-CoA结合到磷脂酰胆碱(PC)中的同时研究中得到证实。该研究证实，ALE1p(在该研究中＝LCA1p)接受多种酰基-供体，但显示出最高活性为LPCAT，而不管溶血磷脂酰胆碱物质(16:0或18:1)的酰基链。此外，观察到对Zn2+的高灵敏度，其在高于0.1mM的浓度下是抑制性的并且在较低浓度(10至25μM)下活化。针对ALE1p(＝LCA1p)测量的高PC周转率强调了该酶是参与PC再酰化的关键催化剂(Chen Qet al.(2007)The yeast acylglycerol acyltransferase LCA1 is a key component ofLands cycle for phosphatidylcholine turnover."FEBS Lett 581(28):5511-5516)。
寻找引起酿酒酵母中脂质液滴(LD)形成异常的基因鉴定了编码酰基-CoA依赖性溶血磷脂酸酰基转移酶的基因LOA1(以前称为VPS66)。使用野生型和Δloa1酵母菌株的脂质组的比较确定LOA1p的体内分子功能。该分析表明，在LOA1缺陷突变体(Δloa1)中，含有磷脂酸分子物种的油酸盐的百分比显著降低，并且三酰基甘油(TGA)的含量降低了20％。该蛋白质在大肠杆菌中重组表达，并通过获得高度富集的脂质液滴级分并且通过亲和色谱法来部分纯化，其中LOA1p仍附着于基质珠粒。在体外测定中表征了纯化的LOA1p，证明LOA1p对溶血磷脂酸和油酰基-CoA具有特异性，因此在酵母中充当油酰基-CoA:溶血磷脂酸酰基转移酶。基于该结果，提出LOA1p显著涉及将含有过量油酸盐的磷脂酸物种引入TAG生物合成和脂质液滴(LD's)的适当发育。利用基因组标记构建体、亚细胞分级、免疫组织化学和荧光显微镜检查，LOA1可以定位于内质网(ER)和脂质液滴(LD's)两者(Ayciriex S et al.(2012)YPR139c/LOA1 encodes a novel lysophosphatidic acid acyltransferaseassociated with lipid droplets and involved in TAG homeostasis.Mol Biol Cell23(2):233-246)。
在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自大肠杆菌(MetaCyc登录IDEG11377)的plsC。在其他实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自肺炎链球菌(S.pneumoniae)(MetaCyc登录ID G-10763)的plsC。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自荷包蛋花的LAT1。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自荷包蛋花(MetaCyc登录ID G-9398)的LAT2。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自酿酒酵母(YDL052c)的SLC1。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0E18964g。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自白假丝酵母的CaO19.250。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自白假丝酵母的CaO19.7881。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自热带假丝酵母的CTRG_02437。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自酿酒酵母(YOR175C)的ALE1。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0F19514g。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自白假丝酵母的CaO19.1881。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自白假丝酵母的CaO19.9437。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自热带假丝酵母的CTRG_01687。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自酿酒酵母(YPR139C)的LOA1。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0C14014g。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自白假丝酵母的CaO19.1043。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自白假丝酵母的CaO19.8645。在一些实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是来自热带假丝酵母的CTRG_04750。
二酰基甘油酰基转移酶
本公开文本描述了将酰基添加到二酰基甘油(DAG)的sn-3位置以形成三酰基甘油(TAG)的酶。
二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)催化三酰基甘油生物合成中唯一的独特反应。它在二酰基甘油(DAG)的sn-3位置添加酰基并形成三酰基甘油(TAG)，如下所示：
酰基-CoA+1,2-二酰基-sn-甘油→三酰基-sn-甘油+辅酶A。
DGAT接受大范围的酰基-CoA作为酰基供体，包括C18:1、C18:2和C20:1酰基-CoA，如拟南芥DGAT所证明(Jako C et al.(2001)Seed-specific over-expression of anArabidopsis cDNA encoding a diacylglycerol acyltransferase enhances seed oilcontent and seed weight.Plant Physiol 126(2):861-874)。在昆虫细胞培养物和酵母中表达DGAT的拟南芥cDNA，以及在野生型拟南芥中过表达该cDNA，证明了DGAT在将酰基转移到DAG的sn-3位置中的活性(Hobbs DH et al.(1999)Cloning of a cDNA encodingdiacylglycerol acyltransferase from Arabidopsis thaliana and its functionalexpression.FEBS Lett 452(3):145-149；Zou J et al.(1999)The Arabidopsisthaliana TAG1 mutant has a mutation in a diacylglycerol acyltransferasegene.Plant J 19(6):645-653)。拟南芥cDNA在野生型拟南芥中的过表达增加了种子中的油沉积，并且这种增加与DGAT的mRNA表达水平的增加相关。这表明DGAT是三酰基甘油生物合成途径的调节点。
编码双功能酰基-CoA:酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因已在酿酒酵母中被鉴定为三酰基甘油生物合成的主要贡献者(Sandager L et al.(2002)Storage lipidsynthesis is non-essential in yeast.J Biol Chem 277(8):6478-6482)。该基因(DGA1)属于DGAT2家族，其成员的特征为酰基-CoA依赖性酰基转移酶(Lardizabal KD etal.(2001)DGAT2 is a new diacylglycerol acyltransferase gene family:purification,cloning,and expression in insect cells of two polypeptides fromMortierella ramanniana with diacylglycerol acyltransferase activity."J BiolChem 276(42):38862-38869)。已证明DGA1p是催化酵母基因组中二酰基甘油(DAG)酯化成三酰基甘油(TAG)的唯一酰基-CoA依赖性酰基转移酶。这已在DGA1的缺失突变体(Δdga1)中被证明，并且与在酵母中重要的其他二酰基甘油酰基转移酶(即利用磷脂酰基供体(Δlro1)酯化DAG的LRO1)的缺失相结合。在Δdga1Δlro1双突变体中，几乎所有的二酰基甘油酰基转移酶都已丢失，并且TAG合成被废除。携带DGA1基因的质粒可以拯救突变体中的TAG合成缺陷表明体内DGA1显著地涉及TAG生物合成途径(Sorger D,Daum G(2002).Synthesisof triacylglycerols by the acyl-coenzyme A:diacyl-glycerol acyltransferaseDga1p in lipid particles of the yeast Saccharomyces cerevisiae.J Bacteriol184(2):519-524；Oelkers P et al.(2002)The DGA1 gene determines a secondtriglyceride synthetic pathway in yeast.J Biol Chem 277(11):8877-8881)。在体外，观察到DGA1p对油酰基-CoA和棕榈酰基-CoA的优选，其对于磷脂依赖性酰基转移酶LRO1p是反向的(Oelkers et al.2002)。
此外，DGA1p作为酰基-CoA依赖性单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)的功能在体内利用损失超过60％MGAT活性的Δdga1突变体得到证实。DGA1的体外MGAT活性通过2-油酰基甘油的油酰基-CoA依赖性酯化证明，在该过程中产生1,2-二油酰甘油(Heier C et al.(2010)Identification of Yju3p as functional orthologue of mammalianmonoglyceride lipase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.Biochim BiophysActa 1801(9):1063-1071)。
通过计算机分析、特征基序的定点诱变以及C-和N-末端的缺失突变，已获得了对DGA1p的一级序列中序列基序的功能重要性和拓扑定向的更多见解。可以证明，除在其他DGAT2家族成员中发现的特征基序之外，酵母属还具有独特的亲水性拉伸，其被证明显著调节酶活性。此外，四个确定的跨膜结构域中的第二个中的组氨酸残基195被证明对酶活性是必需的。DGA1的拓扑结构揭示C-和N-末端两者都面向细胞质，并且C-末端对于DGA1活性来说比N-末端更重要(Liu Q et al.(2011)Functional and topological analysis ofyeast acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase 2,an endoplasmic reticulumenzyme essential for triacylglycerol biosynthesis.J Biol Chem 286(15):13115-13126)。
使用高度纯化的细胞片段和免疫印迹，Sorger等人(2002)和Liu等人(2011)证明DGA1定位于脂质液滴和微粒体膜，最可能是内质网。
不动杆菌属(Acinetobacter)物种ADP1表达双功能酶，该双功能酶展现出蜡酯合酶(WS)和酰基-coA:二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)活性(Kalscheuer R and SteinbuchelA(2003)A novel bifunctional wax ester synthase/acyl-CoA:diacylglycerolacyltransferase mediates wax ester and triacylglycerol biosynthesis inAcinetobacter calcoaceticus ADP1.J Biol Chem278(10):8075-8082)。该同二聚体催化TAG和WE生物合成的最后步骤(Stoveken T et al.(2005)The wax ester synthase/acylcoenzyme A:diacylglycerol acyltransferase from Acinetobacter sp.strain ADP1:characterization of a novel type of acyltransferase.J Bacteriol 187(4):1369-1376)。它介导氧代酯和硫代酯键的形成，并且具有广泛的底物范围、可接受中链脂肪醇和酰基-CoA酯以及单酰基甘油(MAG)(Uthoff S et al.(2005)Thio wax esterbiosynthesis utilizing the unspecific bifunctional wax ester synthase/acylcoenzyme A:diacylglycerol acyltransferase of Acinetobacter sp.strainADP1.Appl Environ Microbiol 71(2):790-796)。
在一些实施方案中，该二酰基甘油酰基转移酶是来自拟南芥(基因ID AT2G19450)的TAG1。在一些实施方案中，该二酰基甘油酰基转移酶是来自酿酒酵母(YOR245c)的DGA1。在一些实施方案中，该二酰基甘油酰基转移酶是来自不动杆菌属物种ADP1(MetaCyc登录IDACIAD0832)的atfA。在一些实施方案中，该二酰基甘油酰基转移酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0E32769g。在一些实施方案中，该二酰基甘油酰基转移酶是来自白假丝酵母的CaO19.6941。在一些实施方案中，该二酰基甘油酰基转移酶是来自白假丝酵母的CaO19.14203。在一些实施方案中，该二酰基甘油酰基转移酶是来自热带假丝酵母的CTRG_06209。
磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)催化以下反应：磷脂酰胆碱+1,2-二酰基-sn-甘油→三酰基-sn-甘油+1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
拟南芥PDAT可以使用不同的磷脂作为酰基供体，在任一个sn-位置处具有10-22个碳链长的酰基(Stahl U et al.(2004)Cloning and functional characterization of aphospholipid:diacylglycerol acyltransferase from Arabidopsis.Plant Physiol135(3):1324-1335)。然而，磷脂酰胆碱的sn-2位置处的酰基使用比sn-1位置处大三倍。具有最高活性的是具有多个双键、环氧基或羟基的酰基。在测试中，具有蓖麻油酰基的酶活性最高。18:0-和22:1-酰基给出最低的酶活性。在不同的磷脂物质中，磷脂酰乙醇胺具有的活性高于磷脂酸或磷脂酰胆碱。
在蓖麻籽微粒体级分中检测到PDAT活性。放射性标记的蓖麻油酰基和斑鸠菊油基(vernoloyl)基团从磷脂酰胆碱有效地转移到形成三酰基甘油的DAG(Dahlqvist A et al.(2000)Phospholipid:diacylglycerol acyltransferase:an enzyme that catalyzesthe acyl-CoA-independent formation of triacylglycerol in yeast andplants.Proc Natl Acad Sci USA 97(12):6487-6492)。
在其他实施方案中，该二酰基甘油酰基转移酶是磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)。在一些实施方案中，该PDAT来自拟南芥(基因ID AT5G13640)。在一些实施方案中，该PDAT来自蓖麻。在一些实施方案中，该PDAT是来自酿酒酵母(YNR008w)的LRO1。在一些实施方案中，该PDAT是来自解脂耶氏酵母的YALI0E16797g。在一些实施方案中，该PDAT是来自白假丝酵母的CaO19.13439。在一些实施方案中，该PDAT是来自热带假丝酵母的CTRG_04390。
在一些实施方案中，使重组微生物编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)、甘油磷脂酰基转移酶(GPLAT)和/或二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的一个或多个基因缺失或下调，并用一种或多种异源GPAT、LPAAT、GPLAT或DGAT变体替代。在一些实施方案中，该一种或多种酰基转移酶变体衍生自选自表3c的一种或多种异源酰基转移酶。在一些实施方案中，该重组微生物包含选自下组的一种或多种内源酰基转移酶活性的缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：解脂耶氏酵母YALI0C00209g、解脂耶氏酵母YALI0E18964g、解脂耶氏酵母YALI0F19514g、解脂耶氏酵母YALI0C14014g、解脂耶氏酵母YALI0E16797g、解脂耶氏酵母YALI0E32769g和解脂耶氏酵母YALI0D07986g、酿酒酵母YBL011w、酿酒酵母YDL052c、酿酒酵母YOR175C、酿酒酵母YPR139C、酿酒酵母YNR008w和酿酒酵母YOR245c以及假丝酵母I503_02577、假丝酵母CTRG_02630、假丝酵母CaO19.250、假丝酵母CaO19.7881、假丝酵母CTRG_02437、假丝酵母CaO19.1881、假丝酵母CaO19.9437、假丝酵母CTRG_01687、假丝酵母CaO19.1043、假丝酵母CaO19.8645、假丝酵母CTRG_04750、假丝酵母CaO19.13439、假丝酵母CTRG_04390、假丝酵母CaO19.6941、假丝酵母CaO19.14203和假丝酵母CTRG_06209。
表3c.可以衍生变体以在本公开文本的重组微生物中表达的示例性酰基转移酶
脂质结合蛋白
本公开文本描述了可以在细胞膜之间转移类固醇、磷脂和神经节苷脂的蛋白质。
甾醇载体蛋白也称为非特异性脂质转移蛋白。这些蛋白质与植物非特异性脂质转移蛋白不同，但在结构上类似于来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的未知功能的小蛋白质。人甾醇载体蛋白2(SCP2)是一种碱性蛋白，其被认为参与胆固醇和各种其他脂质的细胞内转运。
SCP-2属于SCP-2基因家族，包括SCP-X、SCP-2、17β-羟基类固醇脱氢酶IV、stomatin、UNC-24和Metallo-β-lactomase，并在许多物种(包括脊椎动物、昆虫、植物、酵母、细菌和真菌)中被鉴定。
甾醇载体蛋白主要涉及脊椎动物和昆虫中广泛的胆固醇/脂质相关功能。最近的研究证明，SCP-2具有胆固醇/脂质结合活性。SCP-2可以与胆固醇、棕榈酸、脂肪酰基-CoA、酸性磷脂和胆盐结合。SCP-2与胆固醇的结合亲和力是脂质中最强的。
SCP2被认为是一种可溶性甾醇载体，因为它能够与甾醇结合并定位于多种细胞器，如过氧化物酶体、线粒体、内质网和胞质溶胶。
甾醇载体蛋白-2(SCP-2)在细胞内脂质循环和代谢中的多种作用源于其基因和蛋白质结构。SCP-x/pro-SCP-2基因是融合基因，其具有独立的起始位点，编码15-kDa pro-SCP-2(无酶活性)和58-kDa SCP-x(3-酮脂酰基CoA硫解酶)。两种蛋白质在其C-末端处共享13-kDa SCP-2的相同cDNA和氨基酸序列。细胞13-kDa SCP-2源自15-kDa pro-SCP-2的完全翻译后切割和58-kDa SCP-x的部分翻译后切割。已提出了SCP-2的假定生理功能，其基于增强膜间脂质转移(例如，胆固醇、磷脂)和在体外、转染细胞和遗传操纵动物中参与脂肪酰基CoA转酰基作用(胆固醇酯、磷脂酸)的酶的活化。已鉴定了至少四个重要的SCP-2结构域，并与特定功能相关。首先，存在于58-kDa SCP-x中的46-kDa N-末端前序列是特异于支链酰基CoA的3-酮脂酰基-CoA硫解酶。其次，15-kDa pro-SCP-2中的N-末端20个氨基酸前序列显著调节SCP-2的二级和三级结构，并加强其由C-末端过氧化物酶体靶向序列编码的细胞内靶向。第三，N-末端32个氨基酸形成两亲性α-螺旋区，其中一个面代表膜结合结构域。两亲性螺旋的一个面上带正电荷的氨基酸残基允许SCP-2与含有阴离子磷脂的膜表面结合。第四，N-末端两亲性α螺旋的疏水面以及β链4,5和螺旋D形成配体结合腔，其能够容纳多种类型的脂质(例如，脂肪酸、脂肪酰基CoA、胆固醇、磷脂、类异戊二烯)(Stolowich NJ et al.(2002)Sterol carrier protein-2:structure reveals function.Cell Mol Life Sci59(2):193-212)。
在一个实施方案中，该脂质结合蛋白是甾醇载体蛋白。在另一个实施方案中，该甾醇载体蛋白是来自智人(Homo sapiens)(NP_002970)的甾醇载体蛋白-2(SCP-2)。在另一个实施方案中，该甾醇载体蛋白是来自解脂耶氏酵母(YALI0E01298-CAG78989.1-SCP2)的甾醇载体蛋白-2(SCP-2)。在另一个实施方案中，该甾醇载体蛋白来自热带假丝酵母(CTRG_02171-EER33353.1)。
脂肪酸合酶复合物
本公开文本描述了催化脂肪酸中碳链延长的酶。
在一些实施方案中，使用脂肪酸合酶复合物来催化脂肪酸中碳链的起始和延长。“脂肪酸合酶复合物”是指一组催化脂肪酸上碳链的起始和延长的酶。脂肪酸合酶(FAS)途径中的ACP与酶一起控制产生的脂肪酸的长度、饱和度和支化。此途径中的步骤由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰基-CoA羧化酶(acc)基因家族的酶催化。取决于所希望的产品，可以减弱、表达或过表达这些基因中的一种或多种。在示例性实施方案中，这些基因中的一种或多种被减毒、缺失、破坏和/或突变。
存在两种主要类别的脂肪酸合酶。I型(FAS I)系统利用单个大的多功能多肽，并且对哺乳动物和真菌两者都是常见的(尽管真菌和哺乳动物合酶的结构安排不同)。I型FAS系统在CMN细菌群(棒状杆菌、分枝杆菌和诺卡氏菌)中也有发现。II型FAS(FAS II)的特点是使用离散的单功能酶进行脂肪酸合成，并在古细菌和细菌中发现。
FAS I和FAS II延长和还原的机制基本相似，因为FAS I多酶多肽和FAS II酶的结构域在很大程度上是保守的。
脂肪酸通过一系列来自乙酰-CoA和丙二酰-CoA的脱羧Claisen缩合反应合成。此途径中的步骤由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰基-CoA羧化酶(acc)基因家族的酶催化。对于该途径的描述，参见例如，Heath et al.,Prog.Lipid Res.40:467,2001，其全部内容通过引用并入本文。不受理论限制，在细菌中，乙酰基-CoA被乙酰基-CoA羧化酶(Acc，由四个独立基因accABCD编码的多亚基酶)羧化以形成丙二酰基-CoA。在酵母中，乙酰基-CoA被由ACC1和ACC2编码的乙酰基-CoA羧化酶的酵母等效物羧化。在细菌中，通过丙二酰基-CoA:ACP转酰基酶(FabD)将丙二酸基团转移至ACP以形成丙二酰基-ACP。在酵母中，丙二酰基-棕榈酰转移酶结构域将来自丙二酰基-CoA的丙二酰基添加到FAS复合物的ACP结构域中。然后发生缩合反应，其中丙二酰基-ACP与酰基-CoA合并，得到β-酮脂酰基-ACP。以这种方式，碳氢化合物底物延长2个碳。
延长后，通过酮还原酶(KR)、脱水酶(DH)和烯醇还原酶(ER)的连续作用，β-酮基被还原为完全饱和的碳链。延长的脂肪酸链处于这些活性位点之间，同时与ACP的磷酸泛酰巯基乙胺辅基共价附接。首先，β-酮脂酰基-ACP被NADPH还原以形成β-羟酰基-ACP。在细菌中，这一步由β-酮脂酰基-ACP还原酶(FabG)催化。等效的酵母反应由FAS的酮还原酶(KR)结构域催化。然后使β-羟酰基-ACP脱水以形成反式-2-烯酰基-ACP，其通过细菌中的β-羟酰基-ACP脱水酶/异构酶(FabA)或β-羟酰基-ACP脱水酶(FabZ)或酵母中FAS的脱水酶(DH)结构域催化。细菌中的NADPH依赖性反式-2-烯酰基-ACP还原酶I、II或III(分别为Fabl、FabK和FabL)和酵母中FAS的烯醇还原酶(ER)结构域还原反式-2-烯酰基-ACP以形成酰基-ACP。随后的循环由通过β-酮脂酰基-ACP合酶I或β-酮脂酰基-ACP合酶II(在细菌中分别为FabB和FabF，或在酵母中β-酮脂酰合酶(KS)结构域)进行的丙二酰基-ACP与酰基-ACP的缩合而开始。
在一些实施方案中，可使用脂肪酸合酶复合物来催化脂肪酰基-ACP延长为相应的相对于底物具有两个碳延长的脂肪酰基-ACP。
在一些实施方案中，该乙酰基-CoA羧化酶是ACC1。在某些实施方案中，该乙酰基-CoA羧化酶是来自酿酒酵母的YNR016C。在某些实施方案中，该乙酰基-CoA羧化酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0C11407g。在某些实施方案中，该乙酰基-CoA羧化酶是来自白假丝酵母的CaO19.7466。在某些实施方案中，该乙酰基-CoA羧化酶是来自热带假丝酵母的CTRG_01007。在一些实施方案中，该脂肪酸合酶β亚基是FAS1。在某些实施方案中，该脂肪酸合酶β亚基是来自酿酒酵母的YKL182W。在某些实施方案中，该脂肪酸合酶β亚基是来自解脂耶氏酵母的YALI0B15059g。在某些实施方案中，该脂肪酸合酶β亚基是来自白假丝酵母的CaO19.979。在某些实施方案中，该脂肪酸合酶β亚基是来自白假丝酵母的CaO19.8594。在某些实施方案中，该脂肪酸合酶β亚基是来自热带假丝酵母的CTRG_05241。在一些实施方案中，该脂肪酸合酶α亚基是FAS2。在某些实施方案中，该脂肪酸合酶α亚基是来自酿酒酵母的S000006152。在某些实施方案中，该脂肪酸合酶α亚基是来自解脂耶氏酵母的YALI0B19382g。在某些实施方案中，该脂肪酸合酶α亚基是来自白假丝酵母的CaO19.13370-72。在某些实施方案中，该脂肪酸合酶α亚基是来自白假丝酵母的CaO19.5949-51。在某些实施方案中，该脂肪酸合酶α亚基是来自热带假丝酵母的CTRG_02501。
磷酸戊糖途径
磷酸戊糖途径(PPP)是位于真核细胞的细胞质中的碳水化合物代谢的中心且广泛保守的代谢途径。该途径具有两个主要功能：产生用于大分子生物合成的前体和产生呈NADPH形式的还原当量。因此，这两个作用反映在PPP的两个主要阶段：在“氧化阶段”中，葡萄糖6-磷酸(G6P)通过以下顺序作用转化为核酮糖5-磷酸(Ru5P)：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1)，其将G6P转化为6-磷酸D-葡糖酸-1,5-内酯同时生成NADPH；6-磷酸葡糖酸内酯酶(SOL3、SOL4)，其将6-磷酸D-葡糖酸-1,5-内酯转化为D-葡糖酸6-磷酸酯；6-磷酸葡糖酸脱氢酶(GND1、GND2)，其将D-葡糖酸6-磷酸酯转化为Ru5P同时生成NADPH。“非氧化阶段”将Ru5P异构化为核糖-5-磷酸(R5P)，将Ru5P差向异构化为木酮糖5-磷酸(X5P)，并通过转酮醇酶(TKL1、TKL2)和转醛醇酶(TAL1、NQM1)的作用，一系列碳骨架转移可以将磷酸戊糖转化为果糖6-磷酸(F6P)和甘油醛3-磷酸(GAP)——均为糖酵解中间体——和赤藓糖4-磷酸(E4P)。非氧化阶段的净效应是在大分子生物合成所需的戊糖与能量管理所需的己糖之间产生平衡，使两个糖池易于相互转化。
认为氧化分支在正常细胞条件下基本上是不可逆的，而非氧化分支是可逆的。PPP不是简单的线性途径，因为几个碳原子再循环回到糖酵解中。此外，酶转酮醇酶在该途径中催化两种不同的反应，从而导致这些反应的底物是彼此的竞争性抑制剂。PPP具有三种主要产物：呈NADPH形式的还原当量，其在氧化阶段产生，在生物合成途径中需要并用于维持细胞的氧化水平；R5P，用于所有核酸的生物合成；以及E4P，用于三种芳族氨基酸的生物合成。不同的生理状态需要以不同的模式操作该生物化学网络：在活跃生长的细胞中，如在反应器中的培养物生长期间，该途径必须产生足够量的所有三种产物，因为这些产物在新细胞的构建中都被需要。在压力条件下，生长减缓，并且唯一需求量大的产物是NADPH。
用于表达以增加一种或多种辅酶水平的酶
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，包括NAD+和NADH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP，包括NADP+和NADPH)属于各种生物过程(包括能量代谢、线粒体功能、钙稳态、抗氧化/生成氧化应激、基因表达、免疫功能、衰老和细胞死亡)的基本常见介质：NAD介导能量代谢和线粒体功能；NADPH是细胞抗氧化系统的关键组分；来自线粒体的NADH依赖性活性氧物种(ROS)生成和NADPH氧化酶依赖性ROS生成是ROS生成的两个关键机制；环状ADP-核糖和由NAD和NADP生成的几种其他分子可以介导钙稳态；NAD和NADP调节细胞死亡的多种关键因子，如线粒体通透性转换、能量状态、聚(ADP-核糖)聚合酶-1和凋亡诱导因子；以及NAD和NADP深刻影响衰老影响因子，如氧化应激和线粒体活性，并且NAD依赖性sirtuin也介导衰老过程。此外，还原烟酰胺辅因子(NAD(P)H)的原位再生对于重组微生物中的许多重要化学物质的实际合成来说是必需的。
本公开文本描述了催化给定底物的氧化和还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD(P)H)的同时产生的酶。存在几种酶组分涉及NADP和NADPH池的维持。NAD激酶(NADK)催化NAD直接磷酸化为NADP，并且因此有助于细胞NADP池的生成(Pollak N et al.(2007)The power to reduce:pyridine nucleotides–smallmolecules with a multitude of functions.Biochem.J.402:205–218；Agledal L etal.(2010)The phosphate makes a difference:cellular functions of NADP.RedoxRep.15:2-10)。在另一方面，光相期间光合细胞中的铁氧还蛋白-NADP还原酶(FNR)被认为是NADPH的主要来源。然而，在光合作用的黑暗阶段期间在非光合细胞中，能够以NADPH的形式生成能量减少的主要酶如下：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH，EC1.1.1.49)和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(6PGDH，EC1.1.1.44)(两者都属于磷酸戊糖途径)、NADP-异柠檬酸脱氢酶(NADP-ICDH，EC1.1.1.42)和NAD-或NADP-苹果酸酶(NADP-ME，EC1.1.1.40)，也称为NAD-或NADP-苹果酸脱氢酶。
在酿酒酵母中，各种NAD/NADP物质的可互换性对于维持细胞的氧化还原平衡是至关重要的，这又决定了生长效率和代谢物排泄(Marres CA et al.(1991)Isolation andinactivation of the nuclear gene encoding the rotenone-insensitive internalNADH:ubiquinone oxidoreductase of mitochondria from Saccharomycescerevisiae.Eur J Biochem 195(3):857-62)。各种吡啶核苷酸，特别是NADH，不能渗透线粒体的内膜。因此，NAD+和还原和/或磷酸化衍生物从细胞溶质到线粒体的直接横向交换是不可能的并且反之亦然。此外，酵母不具有转氢酶。因此，它们不能直接将NAD+和NADPH转化为NADP+和NADH(Bruinenberg PM(1986)The NADP(H)redox couple in yeastmetabolism.Antonie Van Leeuwenhoek 52(5):411-29)。因此，为了确保每个细胞器中所需的NAD+代谢物的可用性，酵母已开发了独立的转化间反应组，其通过各种酶促反应提供所有NAD+类型的供应。
在细胞质中，已表征了两种可以使NAD+磷酸化的NAD激酶。主要的胞质NAD激酶由UTR1编码(Kawai S et al.(2001)Molecular cloning and identification of UTR1of ayeast Saccharomyces cerevisiae as a gene encoding an NAD kinase.FEMSMicrobiol Lett 200(2):181-184；Shi F et al.(2005)Identification of ATP-NADHkinase isozymes and their contribution to supply of NADP(H)in Saccharomycescerevisiae.FEBS J 272(13):3337-3349)。用于磷酸化NAD+的第二种不太重要的NAD激酶(即YEF1)也已被描述和证明以补偿UTR1的损失(Shi et al.2005)。线粒体POS5和胞质UTR1两者的缺失在酵母中是致命的，并且YEF1仅可以在POS5仍起作用时进行补偿。这些发现支持以下观点：酵母的主要NADH激酶，即POS5和UTR1可以部分补偿每个的各自活性的损失(Bieganowski P et al.(2006)Synthetic lethal and biochemical analyses of NADand NADH kinases in Saccharomyces cerevisiae establish separation of cellularfunctions.J Biol Chem 281(32):22439-22445)。UTR1和YEF1两者都被证明展现出NADH激酶活性，同时提供具有磷酸化NADH的催化能力的酶的胞质组。
各种酶促反应已被证明解释了用生物合成途径和抗氧化功能所需的NADPH提供细胞溶质。由ALD6编码的胞质乙醛脱氢酶(Meaden PG et al.(1997)The ALD6gene ofSaccharomyces cerevisiae encodes a cytosolic,Mg(2+)-activated acetaldehydedehydrogenase.Yeast 13(14):1319-1327；Wang X et al.(1998)Molecular cloning,characterization,and potential roles of cytosolic and mitochondrial aldehydedehydrogenases in ethanol metabolismin Saccharomyces cerevisiae.J Bacteriol180(4):822-830)和催化磷酸戊糖途径中的第一步骤以将β-D-葡萄糖6-磷酸转化为6-磷酸D-葡糖酸-1,5-内酯的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1)(Nogae I and Johnston M(1990)Isolation and characterization of the ZWF1gene of Saccharomyces cerevisiae,encoding glucose-6-phosphate dehydrogenase.Gene 96(2):161-169；Grabowska D andChelstowska A(2003)The ALD6gene product is indispensable for providing NADPHin yeast cells lacking glucose-6-phosphate dehydrogenase activity.J Biol Chem278(16):13984-13988；Minard KI and McAlister-Henn L(2001)Antioxidant functionof cytosolic sources of NADPH in yeast.Free Radic Biol Med 31(6):832-843)被认为是NADPH的主要供应者。在细胞质中产生NADPH的第三种酶是胞质NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶(IDP2)(Loftus TM et al.(1994)Isolation,characterization,and disruption ofthe yeast gene encoding cytosolic NADP-specific isocitratedehydrogenase.Biochemistry 33(32):9661-9667；Contreras-Shannon V et al.(2005)Kinetic properties and metabolic contributions of yeast mitochondrial andcytosolic NADP+-specific isocitrate dehydrogenases.J Biol Chem 280(6):4469-4475)。已证明ZWF1与异柠檬酸脱氢酶(IDP2)和乙醛氧化还原酶(ALD6)具有重叠功能，这表明如果所涉及的反应之一无法操作，则补偿NADPH的缺乏(Minard KI and McAlister-HennL(2005)Sources of NADPH in yeast vary with carbon source.J Biol Chem 280(48):39890-39896)。
目前可用于NAD(P)H再生的酶系统包括用于NADH的甲酸/甲酸脱氢酶，用于NADH的异丙醇/醇脱氢酶(假单胞菌属物种)、用于NADPH的异丙醇/醇脱氢酶(T.brockii)、用于NADH和NADPH两者的H2/氢化酶(热自养甲烷杆菌(M.thermoautotrophicum))、用于NADPH的葡萄糖-6-磷酸/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(肠膜明串珠菌(L.mesenteroides))以及用于NADH和NADPH两者的葡萄糖/葡萄糖脱氢酶(Hummel W(1999)Large-scale applications ofNAD(P)-dependent oxidoreductases:Recent developments.Trends Biotechnol.17:487–492；Wichmann R and Vasic-Racki D(2005)Cofactor regeneration at the labscale.Adv Biochem Eng Biotechnol 92:225–260)。还已描述了来自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的高度稳定和活性的突变体亚磷酸盐脱氢酶的工程化及其作为有效的NADPH再生系统的潜力的评价(Johannes TW et al.(2007)Efficientregeneration of NADPH using an engineered phosphitedehydrogenase.Biotechnology and Bioengineering 96(1):18-26)。
在一个实施方案中，一种或多种重组微生物被操纵以增加辅酶的细胞内水平。在另一个实施方案中，该辅酶是NADH和/或NADPH。在一些实施方案中，一种或多种重组微生物表达脱氢酶。
在某些实施方案中，该一种或多种重组微生物表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是来自酵母的ZWF1。在另一个实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是来自酿酒酵母的ZWF1(YNL241C)。在另一个实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸酯-1-脱氢酶是来自细菌的zwf。在某些实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸酯-1-脱氢酶是来自大肠杆菌的zwf(NP_416366)。
在某些实施方案中，该一种或多种重组微生物表达6-磷酸葡糖酸脱氢酶。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酵母的GND1。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酿酒酵母的GND1(YHR183W)。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酵母的GND2。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酿酒酵母的GND2(YGR256W)。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自细菌的gnd。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自大肠杆菌的gnd(NP_416533)。
在某些实施方案中，该一种或多种重组微生物表达NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶。在一些实施方案中，该NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶是来自酵母的IDP2。在一些实施方案中，该NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0_F04095g。在其他实施方案中，该NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶是来自白假丝酵母的CaO19.3733。在某些实施方案中，该NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶是来自热带假丝酵母的CTRG_00909。在一些实施方案中，该NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶是来自酿酒酵母的YLR174W。
在某些实施方案中，该一种或多种重组微生物表达NAD+或NADP+依赖性苹果酸脱氢酶(苹果酸酶)。在一个实施方案中，该苹果酸脱氢酶是NAD+依赖性的。在另一个实施方案中，该苹果酸脱氢酶是NADP+依赖性的。在一个实施方案中，该苹果酸酶是来自细菌的NAD+依赖性苹果酸脱氢酶。在一些实施方案中，该NAD+依赖性苹果酸脱氢酶是来自大肠杆菌的maeA(NP_415996)。在一些实施方案中，该NAD+依赖性苹果酸脱氢酶是来自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的maeE(CAQ68119)。在另一个实施方案中，该苹果酸脱氢酶是来自酵母的线粒体NAD+依赖性苹果酸脱氢酶。在一些实施方案中，该NAD+依赖性苹果酸脱氢酶是来自酿酒酵母的MAE1(YKL029C)。在另一个实施方案中，该苹果酸脱氢酶是来自寄生线虫的线粒体NAD+依赖性苹果酸脱氢酶。在一些实施方案中，该NAD+依赖性苹果酸脱氢酶是来自猪蛔虫(Ascaris suum)的M81055。在一个实施方案中，该苹果酸脱氢酶是来自细菌的NADP+依赖性苹果酸脱氢酶。在一些实施方案中，该NADP+依赖性苹果酸脱氢酶是来自大肠杆菌的maeB(NP_416958)。在一个实施方案中，该苹果酸脱氢酶是来自玉米的NADP+依赖性苹果酸脱氢酶。在一些实施方案中，该NADP+依赖性苹果酸脱氢酶是来自玉蜀黍的me1。
在某些实施方案中，该一种或多种重组微生物表达醛脱氢酶。在一个实施方案中，该醛脱氢酶是NAD+依赖性的。在另一个实施方案中，该醛脱氢酶是NADP+依赖性的。在一个实施方案中，该醛脱氢酶是来自细菌的NAD+依赖性醛脱氢酶。在一些实施方案中，该NAD+依赖性醛脱氢酶是来自大肠杆菌的aldA(NP_415933)。在另一个实施方案中，该醛脱氢酶是来自酵母的胞质NADP+依赖性醛脱氢酶。在一些实施方案中，该NADP+依赖性醛脱氢酶是来自酿酒酵母的ALD6(YPL061W)。在另一个实施方案中，该醛脱氢酶是来自细菌的胞质NADP+依赖性醛脱氢酶。在一些实施方案中，该NADP+依赖性醛脱氢酶是来自大肠杆菌的aldB(NP_418045)。
在某些实施方案中，该一种或多种重组微生物表达转氢酶。在一个实施方案中，增加转氢酶的表达以将NADH和NADPH相互转化。在一些实施方案中，该转氢酶是吡啶核苷酸转氢酶。在一些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶来自细菌。在某些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶是来自大肠杆菌的pntAB(β亚基：NP_416119；α亚基：NP_416120)。在一些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶来自人。在某些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶是来自智人的NNT(NP_036475)。在某些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶来自马铃薯(Solanumtuberosum)。在某些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶来自菠菜(Spinacea oleracea)。
在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物表达葡萄糖-1-脱氢酶。在一些实施方案中，该葡萄糖-1-脱氢酶来自细菌。在某些实施方案中，该葡萄糖-1-脱氢酶是来自氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)(Gluconobacter suboxydans)(Q5FPE5)的GOX2015。在某些实施方案中，该葡萄糖-1-脱氢酶是来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)(O93715)的gdh。在某些实施方案中，该葡萄糖-1-脱氢酶是来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(P12310)的gdh。
在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物表达甘油脱氢酶。在某些实施方案中，该甘油脱氢酶是来自红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(里氏木霉(Trichodermareesei))(Q0GYU4)的NADP+依赖性甘油2-脱氢酶gld2。在某些实施方案中，该甘油脱氢酶是来自构巢裸胞壳(Emericella nidulans)(构巢曲霉)(Q7Z8L1)的NADP+依赖性甘油脱氢酶gldB。
在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物表达醇脱氢酶。在某些实施方案中，该醇脱氢酶是来自酿酒酵母的NADPH依赖性醇脱氢酶YMR318C。在某些实施方案中，该醇脱氢酶是来自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)的醇脱氢酶CAETHG_0553。
在一些实施方案中，将来自表3的醇脱氢酶用于NAD(P)H的再生。
在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物表达上述酶的组合以增加辅酶的细胞内水平。在一个实施方案中，与酶共底物补充偶联的酶过表达增加了辅酶的细胞内水平。
表3.示例性的醇脱氢酶。
酰基-CoA氧化酶
酰基-CoA氧化酶(ACO)作用于链长为8至18的脂肪酸的CoA衍生物。它们是每个亚基含有一个非共价结合的FAD的黄素酶，并且属于与线粒体酰基-CoA脱氢酶相同的超家族。如线粒体脂肪酰基-CoA脱氢酶，过氧化物酶体酰基-CoA氧化酶催化过氧化物酶体脂肪酸β-氧化途径的初始和速率决定步骤，即酰基-CoA的α,β-脱氢，从而在还原半反应中产生反式-2-烯酰基-CoA。在过氧化物酶体酰基-CoA氧化酶的氧化半反应中，还原的FAD被分子氧再氧化，从而产生过氧化氢。
酰基-CoA氧化酶是同二聚体，并且亚基的多肽链折叠成N-末端α-结构域、β-结构域和C-末端α-结构域。过氧化物酶体酰基-CoA氧化酶与线粒体酰基-CoA脱氢酶之间的功能差异归因于FAD环境中的结构差异。
在一些实施方案中，提供重组微生物和方法用于产生一种或多种不饱和脂质部分。在某些实施方案中，该一种或多种不饱和脂质部分的碳链长度短于或等于C18。在一些实施方案中，该短链不饱和脂质部分由长链不饱和脂质部分产生。合适的链缩短酶的例子包括FAD依赖性酰基-CoA氧化酶。在具有偶数碳的脂肪酸分子的情况下，链缩短酶产生乙酰基-CoA的分子，并且脂肪酰基-CoA缩短了两个碳。具有奇数碳的脂肪酸分子以类似的方式被氧化，在每轮氧化期间产生乙酰-CoA分子，直到链长减少至5个碳。在最后的氧化循环中，该5-碳酰基-CoA被氧化以产生乙酰基-CoA和丙酰基-CoA。
已知酰基-CoA氧化酶对具有不同链长的底物展现出不同的特异性(图32)。因此，控制脂肪酰基-CoA截短的程度依赖于工程或选择适当的酶变体。适用于该目的的酰基-CoA氧化酶的例子列于表3a中。
在用于产生一种或多种不饱和脂质部分的重组微生物和方法的一些优选的实施方案中，使微生物宿主编码酰基-CoA氧化酶的一个或多个基因缺失或下调以消除或减少超过所希望链长的所希望脂肪酰基-CoA的截短。这种缺失或下调靶标包括但不限于解脂耶氏酵母POX1(YALI0E32835g)、解脂耶氏酵母POX2(YALI0F10857g)、解脂耶氏酵母POX3(YALI0D24750g)、解脂耶氏酵母POX4(YALI0E27654g)、解脂耶氏酵母POX5(YALI0C23859g)、解脂耶氏酵母POX6(YALI0E06567g)；酿酒酵母POX1(YGL205W)；假丝酵母POX2(CaO19.1655、CaO19.9224、CTRG_02374、M18259)、假丝酵母POX4(CaO19.1652、CaO19.9221、CTRG_02377、M12160)和假丝酵母POX5(CaO19.5723、CaO19.13146、CTRG_02721、M12161)。在其他实施方案中，缺失、破坏、突变或下调的一种或多种内源酰基-CoA氧化酶控制一种或多种不饱和脂质部分的链长。
表3a.示例性酰基-CoA氧化酶
酰基甘油脂肪酶和甾醇酯酶
在一些实施方案中，提供重组微生物和方法用于产生一种或多种短链不饱和脂质部分。在某些实施方案中，该一种或多种短链不饱和脂质部分的碳链长度短于或等于C18。在产生短链信息素的方法的一些优选的实施方案中，优选用于水解长链酰基甘油的酯键的选择酶与一种或多种脂肪酰基去饱和酶共表达。此类合适的酶例如异源或工程化的酰基甘油脂肪酶。适用于该目的的酰基甘油脂肪酶的例子列于表3b中。
羧酸酯水解酶(EC 3.1.1.-)是催化酯键的水解或合成的一大类酶。它们已在所有生命结构域、原核生物和真核生物中被描述。它们中的大多数属于α/β-水解酶超家族并且具有由His形成的保守的“催化三联体”(一种酸性氨基酸)和位于高度保守的GXSXG序列中的Ser残基。在水解期间，催化Ser将开始得益于来自三联体的其他两个残基的底物的亲核攻击，该残基位于紧邻的空间附近。推测它们通过类似于胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的机制促进酯的水解。另一个特征是存在其序列不像催化三联体那样保守的氨基酸区域，用于稳定催化过程中生成的过渡态的氧离子空穴。此外，这些酶通常不需要辅因子。酰基甘油脂肪酶和甾醇酯酶属于羧酸酯水解酶家族。
酰基甘油脂肪酶催化使用水分子破坏长链脂肪酸的甘油单酯的化学反应。该酶类的系统名称是甘油-酯酰基水解酶。常用的其他名称包括单酰基甘油脂肪酶、单酰基甘油脂肪酶、单甘油酯脂肪酶、单酸甘油酯水解酶、脂肪酰基单酯脂肪酶、单酰基甘油水解酶、单甘油脂肪酶和单甘油酯酶。该酶参与甘油脂代谢。
甾醇酯酶催化以下化学反应：
因此，该酶的两个底物是甾醇酯和H2O，而其两个产物是甾醇和脂肪酸。
该酶类的系统名称是甾醇酯酰基水解酶。常用的其他名称包括胆固醇酯酶、胆甾醇酯合酶、三萜醇酯酶、胆甾醇酯酶、胆甾醇酯水解酶、甾醇酯水解酶、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇酯酶和酰基胆固醇脂肪酶。该酶参与胆汁酸生物合成。甾醇酯酶在自然界中广泛存在，并且已从哺乳动物的组织(如胰腺、肠粘膜、肝脏、胎盘、主动脉和脑)鉴定为丝状真菌、酵母和细菌。
就底物特异性而言，许多甾醇酯酶能够催化水解或合成含有酯键的相当广泛的其他底物，如酰基甘油、芳基酯，并且在一些情况下，醇酯、肉桂基酯、叶黄素酯(xhantophylester)或合成聚合物。
表3b.示例性酰基甘油脂肪酶
在一些实施方案中，使重组微生物中的一种或多种酰基甘油脂肪酶或甾醇酯酯酶的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在一些实施方案中，其活性待缺失、破坏、突变和/或降低的三酰基甘油脂肪酶是YALI0D17534g(TGL3)。
重组微生物
本申请涉及具有用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的重组微生物，该一种或多种不饱和脂质部分通过非生物方式转化为一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。
在一个实施方案中，该一种或多种重组微生物使用一种或多种碳源以产生一种或多种不饱和脂质部分。在另一个实施方案中，该一种或多种碳源包括糖、甘油、乙醇、有机酸、烷烃和/或脂肪酸。在某些实施方案中，该一种或多种碳源选自下组，该组由以下各项组成：烷烃和脂肪酸。在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物对烷烃和/或脂肪酸具有高耐受性。在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物累积脂质。
本公开文本提供了可以被工程化以表达各种外源酶的微生物。在一个实施方案中，该一种或多种重组微生物被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径。
在一些实施方案中，该重组微生物包含一种或多种选自以下项的外源生物合成酶：一种或多种去饱和酶、一种或多种酰基-CoA氧化酶、一种或多种酰基甘油脂肪酶、一种或多种黄素蛋白吡啶核苷酸细胞色素还原酶、一种或多种延伸酶、一种或多种硫酯酶和/或一种或多种脂质结合蛋白。在另一个实施方案中，该一种或多种去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：脂肪酰基-CoA去饱和酶和脂肪酰基-ACP去饱和酶。在一些实施方案中，该一种或多种黄素蛋白吡啶核苷酸细胞色素还原酶选自下组，该组由以下各项组成：细胞色素-b5还原酶和NADPH依赖性细胞色素P450还原酶。在一些实施方案中，该一种或多种延伸酶选自下组，该组由以下各项组成：ELO1、ELO2、ELO3或其任何组合。在一些实施方案中，该一种或多种硫酯酶选自下组，该组由以下各项组成：酰基-ACP硫酯酶和酰基-CoA硫酯酶。在一些实施方案中，该一种或多种脂质结合蛋白是甾醇载体蛋白2(SCP2)。在一些实施方案中，该一种或多种外源生物合成酶来自选自下组的属，该组由以下各项组成：酵母属、耶氏酵母属、假丝酵母属、棉铃虫属、黄地老虎属、粉夜蛾属、夜蛾属、玉米螟属、脐橙螟蛾属、花翅小蛾属、小卷蛾属、梨小食心虫属、红醋栗穿孔蛾属、蛀茎夜蛾属、谷斑螟属、家蚕属、刺葵属、鼠属、拟南芥属、菜蛾属和蔽眼蝶属。在一些实施方案中，该一种或多种外源生物合成酶来自选自下组的物种，该组由以下各项组成：酿酒酵母、解脂耶氏酵母、白假丝酵母、热带假丝酵母、维斯假丝酵母、棉铃虫、玉米穗蛾、黄地老虎、粉纹夜蛾、棉灰翅夜蛾、甜菜夜蛾、脐橙螟蛾、葡萄藤蛾、苹果小卷蛾、红醋栗穿孔蛾、梨小食心虫、麻田豆秆野螟、亚洲玉米螟、欧洲玉米螟、虎杖螟、Ostrinia ovalipennis、印度谷螟、大螟、家蚕、海枣、褐家鼠、拟南芥、小菜蛾和偏瞳蔽眼蝶。
在一些实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶是能够利用脂肪酰基-CoA作为底物的去饱和酶，该脂肪酰基-CoA具有6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个碳原子的链长。
在一些实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶能够在脂肪酸或其衍生物(如例如，脂肪酸CoA酯)的C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12或C13位置生成双键。
在一个示例性实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶是Z11去饱和酶。在本文所述的各个实施方案中，Z11去饱和酶或编码它的核酸序列可以分离自物种黄地老虎、脐橙螟蛾、红带卷蛾、蔷薇斜条卷叶蛾、红醋栗穿孔蛾、粉纹夜蛾、玉米穗蛾或假微型海链藻的生物体。另外的Z11去饱和酶或编码它们的核酸序列可以分离自家蚕、烟草天蛾、西南玉米螟、埃及金刚钻、翠纹金刚钻、小菜蛾、家蚕或黄瓜绢野螟。在示例性实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自GenBank登录号JX679209、JX964774、AF416738、AF545481、EU152335、AAD03775、AAF81787和AY493438的序列。在一些实施方案中，密码子优化了编码Z11去饱和酶的核酸序列，其来自物种黄地老虎、脐橙螟蛾、红带卷蛾、蔷薇斜条卷叶蛾、红醋栗穿孔蛾、粉纹夜蛾、玉米穗蛾或假微型海链藻的生物体。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自粉纹夜蛾的SEQ ID NO:3、11、17和19。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自粉纹夜蛾的SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。在其他实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自黄地老虎的SEQ ID NO:4和9。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自黄地老虎的SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自假微型海链藻的SEQ ID NO:5和16。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的氨基酸序列：来自假微型海链藻的SEQID NO:26和27。在某些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自脐橙螟蛾的SEQ ID NO:6、10和23。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自脐橙螟蛾的SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列。在另外的实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:7、12、18、20和24。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含来自大螟的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含GenBank登录号AF416738、AGH12217.1、AII21943.1、CAJ43430.2、AF441221、AAF81787.1、AF545481、AJ271414、AY362879、ABX71630.1和NP001299594.1、Q9N9Z8、ABX71630.1和AIM40221.1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含嵌合多肽。在一些实施方案中，完全或部分Z11去饱和酶与另一种多肽融合。在某些实施方案中，Z11去饱和酶的N末端天然前导序列被来自另一物种的油质蛋白前导序列替代。在某些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的核苷酸序列：SEQ ID NO:8、21和22。在一些实施方案中，该Z11去饱和酶包含选自以下项的氨基酸序列：SEQ ID NO:33、34、35、36、37和38。
在某些实施方案中，该Z11去饱和酶催化脂肪酰基-CoA转化为选自以下项的单或双不饱和产物：Z11-13:酰基-CoA、E11-13:酰基-CoA、(Z,Z)-7,11-13:酰基-CoA、Z11-14:酰基-CoA、E11-14:酰基-CoA、(E,E)-9,11-14:酰基-CoA、(E,Z)-9,11-14:酰基-CoA、(Z,E)-9,11-14:酰基-CoA、(Z,Z)-9,11-14:酰基-CoA、(E,Z)-9,11-15:酰基-CoA、(Z,Z)-9,11-15:酰基-CoA、Z11-16:酰基-CoA、E11-16:酰基-CoA、(E,Z)-6,11-16:酰基-CoA、(E,Z)-7,11-16:酰基-CoA、(E,Z)-8,11-16:酰基-CoA、(E,E)-9,11-16:酰基-CoA、(E,Z)-9,11-16:酰基-CoA、(Z,E)-9,11-16:酰基-CoA、(Z,Z)-9,11-16:酰基-CoA、(E,E)-11,13-16:酰基-CoA、(E,Z)-11,13-16:酰基-CoA、(Z,E)-11,13-16:酰基-CoA、(Z,Z)-11,13-16:酰基-CoA、(Z,E)-11,14-16:酰基-CoA、(E,E,Z)-4,6,11-16:酰基-CoA、(Z,Z,E)-7,11,13-16:酰基-CoA、(E,E,Z,Z)-4,6,11,13-16:酰基-CoA、Z11-17:酰基-CoA、(Z,Z)-8,11-17:酰基-CoA、Z11-18:酰基-CoA、E11-18:酰基-CoA、(Z,Z)-11,13-18:酰基-CoA、(E,E)-11,14-18:酰基-CoA或其组合。
在另一个示例性实施方案中，该脂肪酰基去饱和酶是Z9去饱和酶。在本文所述的各个实施方案中，该Z9去饱和酶或编码它的核酸序列可以分离自物种亚洲玉米螟、欧洲玉米螟、蔷薇斜条卷叶蛾、红醋栗穿孔蛾、烟夜蛾或玉米穗蛾的生物体。在示例性实施方案中，该Z9去饱和酶包含选自GenBank登录号AY057862、AF243047、AF518017、EU152332，AF482906和AAF81788的序列。在一些实施方案中，编码Z9去饱和酶的核酸序列经密码子优化。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自亚洲玉米螟的SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自亚洲玉米螟的SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列。在其他实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自红醋栗穿孔蛾的SEQ ID NO:14中列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自红醋栗穿孔蛾的SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:15中列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，该Z9去饱和酶包含来自玉米穗蛾的SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该Z9去饱和酶催化脂肪酰基-CoA转化为选自以下项的单不饱和或多不饱和产物：Z9-11:酰基-CoA、Z9-12:酰基-CoA、E9-12:酰基-CoA、(E,E)-7,9-12:酰基-CoA、(E,Z)-7,9-12:酰基-CoA、(Z,E)-7,9-12:酰基-CoA、(Z,Z)-7,9-12:酰基-CoA、Z9-13:酰基-CoA、E9-13:酰基-CoA、(E,Z)-5,9-13:酰基-CoA、(Z,E)-5,9-13:酰基-CoA、(Z,Z)-5,9-13:酰基-CoA、Z9-14:酰基-CoA、E9-14:酰基-CoA、(E,Z)-4,9-14:酰基-CoA、(E,E)-9,11-14:酰基-CoA、(E,Z)-9,11-14:酰基-CoA、(Z,E)-9,11-14:酰基-CoA、(Z,Z)-9,11-14:酰基-CoA、(E,E)-9,12-14:酰基-CoA、(Z,E)-9,12-14:酰基-CoA、(Z,Z)-9,12-14:酰基-CoA、Z9-15:酰基-CoA、E9-15:酰基-CoA、(Z,Z)-6,9-15:酰基-CoA、Z9-16:酰基-CoA、E9-16:酰基-CoA、(E,E)-9,11-16:酰基-CoA、(E,Z)-9,11-16:酰基-CoA、(Z,E)-9,11-16:酰基-CoA、(Z,Z)-9,11-16:酰基-CoA、Z9-17:酰基-CoA、E9-18:酰基-CoA、Z9-18:酰基-CoA、(E,E)-5,9-18:酰基-CoA、(E,E)-9,12-18:酰基-CoA、(Z,Z)-9,12-18:酰基-CoA、(Z,Z,Z)-3,6,9-18:酰基-CoA、(E,E,E)-9,12,15-18:酰基-CoA、(Z,Z,Z)-9,12,15-18:酰基-CoA或其组合。
在一些实施方案中，催化脂肪酰基-CoA转化为单或多不饱和中间体的脂肪酰基去饱和酶选自E5-10:酰基-CoA、E7-12:酰基-CoA、E9-14:酰基-CoA、E11-16:酰基-CoA、E13-18:酰基-CoA,Z7-12:酰基-CoA、Z9-14:酰基-CoA、Z11-16:酰基-CoA、Z13-18:酰基-CoA、Z8-12:酰基-CoA、Z10-14:酰基-CoA、Z12-16:酰基-CoA、Z14-18:酰基-CoA、Z7-10:酰基-coA、Z9-12:酰基-CoA、Z11-14:酰基-CoA、Z13-16:酰基-CoA、Z15-18:酰基-CoA、E7-10:酰基-CoA、E9-12:酰基-CoA、E11-14:酰基-CoA、E13-16:酰基-CoA、E15-18:酰基-CoA、E5Z7-12:酰基-CoA、E7Z9-12:酰基-CoA、E9Z11-14:酰基-CoA、E11Z13-16:酰基-CoA、E13Z15-18:酰基-CoA、E6E8-10:酰基-CoA、E8E10-12:酰基-CoA、E10E12-14:酰基-CoA、E12E14-16:酰基-CoA,Z5E8-10:酰基-CoA、Z7E10-12:酰基-CoA、Z9E12-14:酰基-CoA、Z11E14-16:酰基-CoA、Z13E16-18:酰基-CoA、Z3-10:酰基-CoA、Z5-12:酰基-CoA、Z7-14:酰基-CoA、Z9-16:酰基-CoA、Z11-18:酰基-CoA,Z3Z5-10:酰基-CoA、Z5Z7-12:酰基-CoA、Z7Z9-14:酰基-CoA、Z9Z11-16:酰基-CoA、Z11Z13-16:酰基-CoA和Z13Z15-18:酰基-CoA。
在一些实施方案中，该重组微生物可以表达能够催化两个双键随后的去饱和的双功能去饱和酶。
在一些实施方案中，该重组微生物可表达多于一种编码脂肪酰基去饱和酶的外源核酸分子，该脂肪酰基去饱和酶催化饱和C6-C24脂肪酰基-CoA转化为相应的单或多不饱和C6-C24脂肪酰基-CoA。例如，该重组微生物可以表达编码Z11去饱和酶的外源核酸分子和编码Z9去饱和酶的另一种外源核酸分子。
在一些实施方案中，被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的一种或多种重组微生物包含至少一种编码酰基-CoA氧化酶的外源核酸分子，该酰基-CoA氧化酶在酰基-CoA氧化酶活性的一个或多个逐次循环后催化单或多不饱和C6-C24脂肪酰基-CoA转化为截短的单或多不饱和脂肪酰基-CoA，其中给定循环产生相对于该循环中的起始单或多不饱和C6-C24脂肪酰基-CoA底物具有两个碳截短的单或多不饱和C4-C22脂肪酰基-CoA中间体。在一些实施方案中，该酰基-CoA氧化酶选自表3a。
在一些实施方案中，该重组微生物进一步包含至少一种编码酰基甘油脂肪酶和/或甾醇酯酯酶的内源或外源核酸分子，该酰基甘油脂肪酶和/或甾醇酯酯酶优选地水解>C16、>C14、>C12或>C10酰基甘油底物的酯键。在一些实施方案中，表达的酰基甘油脂肪酶和/或甾醇酯酯酶选自表3b。
在一个实施方案中，被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的一种或多种重组微生物进一步被操纵以使与用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径竞争的途径中的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。
在一些实施方案中，该重组微生物被操纵以使涉及一种或多种不希望的脂肪酸延伸途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在某些实施方案中，涉及一种或多种不希望的脂肪酸延伸途径的一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：β-酮脂酰基-CoA还原酶、β-羟酰基-CoA脱水酶、烯酰基-CoA还原酶或其任何组合。
在其他实施方案中，该重组微生物被操纵以使涉及一种或多种脂质体储存和/或回收途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在某些实施方案中，涉及一种或多种脂质体储存和/或回收途径的一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：三酰基甘油脂肪酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、甾醇酯水解酶、酰基-CoA合成酶或其任何组合。在一些实施方案中，其活性待缺失、破坏、突变和/或降低的三酰基甘油脂肪酶是YALI0D17534g(TGL3)。在一些实施方案中，其活性待缺失、破坏、突变和/或降低的脂肪酰基-CoA合成酶(脂肪酸转运蛋白)是YALI0E16016g(FAT1)。
在一些实施方案中，该重组微生物被操纵以使涉及一种或多种脂肪酸降解途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在某些实施方案中，该脂肪酸降解途径是β-氧化途径。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：酰基-CoA氧化酶、多功能烯酰基-CoA水合酶-β-羟酰基-CoA脱氢酶、β-酮脂酰基-CoA硫解酶或其任何组合。在一些优选的实施方案中，使微生物宿主编码酰基-CoA氧化酶的一个或多个基因缺失或下调以消除或减少超过所希望链长的所希望脂肪酰基-CoA的截短。在一些实施方案中，该重组微生物包含选自下组的一种或多种内源酰基-CoA氧化酶活性的缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：解脂耶氏酵母POX1(YALI0E32835g)、解脂耶氏酵母POX2(YALI0F10857g)、解脂耶氏酵母POX3(YALI0D24750g)、解脂耶氏酵母POX4(YALI0E27654g)、解脂耶氏酵母POX5(YALI0C23859g)、解脂耶氏酵母POX6(YALI0E06567g)；酿酒酵母POX1(YGL205W)；假丝酵母POX2(CaO19.1655、CaO19.9224、CTRG_02374、M18259)、假丝酵母POX4(CaO19.1652、CaO19.9221、CTRG_02377、M12160)和假丝酵母POX5(CaO19.5723、CaO19.13146、CTRG_02721、M12161)。
在一些实施方案中，使重组微生物编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)、甘油磷脂酰基转移酶(GPLAT)和/或二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的一个或多个基因缺失或下调，并用一种或多种异源GPAT、LPAAT、GPLAT或DGAT变体替代。在一些实施方案中，该一种或多种酰基转移酶变体衍生自选自表3c的一种或多种异源酰基转移酶。在一些实施方案中，该重组微生物包含选自下组的一种或多种内源酰基转移酶活性的缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：解脂耶氏酵母YALI0C00209g、解脂耶氏酵母YALI0E18964g、解脂耶氏酵母YALI0F19514g、解脂耶氏酵母YALI0C14014g、解脂耶氏酵母YALI0E16797g、解脂耶氏酵母YALI0E32769g和解脂耶氏酵母YALI0D07986g、酿酒酵母YBL011w、酿酒酵母YDL052c、酿酒酵母YOR175C、酿酒酵母YPR139C、酿酒酵母YNR008w和酿酒酵母YOR245c以及假丝酵母I503_02577、假丝酵母CTRG_02630、假丝酵母CaO19.250、假丝酵母CaO19.7881、假丝酵母CTRG_02437、假丝酵母CaO19.1881、假丝酵母CaO19.9437、假丝酵母CTRG_01687、假丝酵母CaO19.1043、假丝酵母CaO19.8645、假丝酵母CTRG_04750、假丝酵母CaO19.13439、假丝酵母CTRG_04390、假丝酵母CaO19.6941、假丝酵母CaO19.14203和假丝酵母CTRG_06209。
在某些实施方案中，该脂肪酸降解途径是ω-氧化途径。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：单加氧酶(CYP52)、脂肪醇氧化酶、脂肪醇脱氢酶、醇脱氢酶、脂肪醛脱氢酶或其任何组合。在一些优选的实施方案中，该重组微生物包含选自下组的一种或多种内源细胞色素P450单加氧酶活性的缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：解脂耶氏酵母YALI0E25982g(ALK1)、解脂耶氏酵母YALI0F01320g(ALK2)、解脂耶氏酵母YALI0E23474g(ALK3)、解脂耶氏酵母YALI0B13816g(ALK4)、解脂耶氏酵母YALI0B13838g(ALK5)、解脂耶氏酵母YALI0B01848g(ALK6)、解脂耶氏酵母YALI0A15488g(ALK7)、解脂耶氏酵母YALI0C12122g(ALK8)、解脂耶氏酵母YALI0B06248g(ALK9)、解脂耶氏酵母YALI0B20702g(ALK10)、解脂耶氏酵母YALI0C10054g(ALK11)和解脂耶氏酵母YALI0A20130g(ALK12)。
在其他实施方案中，该重组微生物被操纵以使涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在某些实施方案中，涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：PEX1、PEX2、PEX3、PEX4、PEX5、PEX6、PEX7、PEX8、PEX10、PEX11、PEX12、PEX13、PEX14、PEX15、PEX17、PEX18、PEX19、PEX21、PEX22、PEX25、PEX27、PEX28、PEX29、PEX30、PEX31、PEX32和PEX34或其任何组合。
在另一个实施方案中，该一种或多种重组微生物进一步被操纵以增加辅酶的细胞内水平。在某些实施方案中，该辅酶是NADH和/或NADPH。在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物进一步被操纵以表达选自下组的一种或多种内源或外源蛋白，该组由以下各项组成：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转醛醇酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸酮醇-异构酶、D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶、NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶、NAD+或NADP+依赖性苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、转氢酶或其任何组合。在另一个实施方案中，一种或多种内源或外源蛋白的表达与共底物补充结合。在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物进一步被操纵以使选自下组的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转醛醇酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸酮醇-异构酶、D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶或其任何组合。
在一些实施方案中，该重组微生物表达一种或多种酰基-CoA氧化酶，并被操纵以使一种或多种内源酰基-CoA氧化酶的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在一些实施方案中，表达的一种或多种酰基-CoA氧化酶与缺失或下调的一种或多种内源酰基-CoA氧化酶不同。在其他实施方案中，表达的一种或多种酰基-CoA氧化酶调节一种或多种不饱和脂质部分的链长。在其他实施方案中，表达的一种或多种酰基-CoA氧化酶选自表3a。
在本文所述的各个实施方案中，该重组微生物是真核微生物。在一些实施方案中，该真核微生物是酵母。在示例性实施方案中，该酵母是选自下组的属的成员，该组由以下各项组成：耶氏酵母属、假丝酵母属、酵母属、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、伊萨酵母属(Issatchenkia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、红酵母属(Rhodotorula)、以及Myxozyma。
在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物累积脂质。在示例性实施方案中，本发明的重组微生物是产油酵母。在另外的实施方案中，该产油酵母是选自下组的属的成员，该组由以下各项组成：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、以及油脂酵母属(Lipomyces)。在甚至另外的实施方案中，该产油酵母是选自以下项的物种的成员：解脂耶氏酵母、维斯假丝酵母、圆红冬孢酵母、斯达油脂酵母(Lipomyces starkey)、产脂油脂酵母(L.lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(C.revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、产朊假丝酵母(C.utilis)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、小红酵母(Rhodotorula minuta)、黑色丝孢酵母(Trichosporon pullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)、粘红酵母(R.glutinis)、以及禾本红酵母(R.graminis)。
在一些实施方案中，该重组微生物是原核微生物。在示例性实施方案中，该原核微生物是选自下组的属的成员，该组由以下各项组成：埃希氏菌属(Escherichia)、梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、以及短杆菌属(Brevibacterium)。
在一些实施方案中，该重组微生物用于产生一种或多种不饱和脂质部分。
因此，在另一方面，本发明提供了一种使用本文所述的重组微生物产生一种或多种不饱和脂质部分的方法。在一个实施方案中，该方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培养重组微生物直至产生一种或多种不饱和脂质部分。在另一个实施方案中，该一种或多种不饱和脂质部分被回收。回收可以通过本领域已知的方法进行，如蒸馏、基于膜的分离气提、溶剂萃取和膨胀床吸附。
在一些实施方案中，该原料包含碳源。在本文所述的各个实施方案中，该碳源可以选自糖、甘油、醇、有机酸、烷烃、脂肪酸、木质纤维素、蛋白质、二氧化碳和一氧化碳。在另一个实施方案中，该糖选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、果糖和蔗糖。
在一些实施方案中，该一种或多种重组微生物对烷烃和/或脂肪酸具有高耐受性。
在另一方面，本文公开了用于从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法中的重组微生物。
产生脂肪醇和/或醛的方法
如上所述，在一个方面，从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法包括以下步骤：从一种或多种天然存在的生物体获得一种或多种不饱和脂质部分；以及直接还原该一种或多种不饱和脂质部分，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。
在另一方面，从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法包括以下步骤：从一种或多种天然存在的生物体获得一种或多种不饱和脂质部分；将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种游离脂肪酸(FFA)；将该一种或多种FFA酯化成一种或多种脂肪酸烷基酯(FAAE)；以及还原该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在另一方面，从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法包括以下步骤：从一种或多种天然存在的生物体获得一种或多种不饱和脂质部分；将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种FAAE；以及还原该一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在一个实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体是昆虫。在另一个实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体不是昆虫。在一些实施方案中，该一种或多种天然存在的生物体选自下组，该组由以下各项组成：植物、藻类和细菌。在一些实施方案中，该植物来自选自下组的家族，该组由以下各项组成：山龙眼科和鼠李科。在某些实施方案中，该植物包括来自以下属的物种：Gevuina属、金盏花属、沼生花属、新月花属、葛缕子属、胡萝卜属、芫荽属、澳洲坚果属、肉豆蔻属、Licania属、石栗属、蓖麻属、榛属、Kermadecia属、马利筋属、Cardwellia属、银桦属、Orites属、枣属、Hicksbeachia属、沙棘属、麻黄属、Placospermum属、木龙山龙眼属和/或希蒙得木属。在一些实施方案中，该植物选自下组，该组由以下各项组成：智利榛(Gevuina avellana)、欧洲榛(Corylus avellana)、Kermadeciasinuata、叙利亚马利筋(Asclepias syriaca)、蕾丝木(Cardwellia sublimis)、黄紫伊素银桦(Grevillea exul var.rubiginosa)、Orites diversifolius、Orites revoluta、枣(Ziziphus jujube)、Hicksbeachia pinnatifolia和迪科拉银桦(Grevillea decora)。在一些实施方案中，该藻类包括绿藻。在某些实施方案中，该绿藻包括来自盘星藻属(Pediastrum)的物种。在一些实施方案中，该绿藻包括单角盘星藻。在一些实施方案中，该细菌包括革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，该革兰氏阴性细菌包括来自粘球菌属的物种。在某些实施方案中，该革兰氏阴性细菌包括黄色粘球菌。在一些实施方案中，该细菌包括蓝细菌。在一些实施方案中，该蓝细菌包括来自聚球蓝细菌属的物种。在某些实施方案中，该蓝细菌包括细长聚球菌。
在另一方面，从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法包括以下步骤：在被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的一种或多种重组微生物中产生该一种或多种不饱和脂质部分；将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种游离脂肪酸(FFA)和/或一种或多种脂肪酸甲酯(FAAE)；以及还原该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在包括化学转化步骤的本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法的一个实施方案中，将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种FFA和/或一种或多种FAAE的步骤进一步包括以下步骤：分离该一种或多种不饱和脂质部分；任选地富集具有特定链长的一种或多种不饱和脂质部分；以及加工该一种或多种不饱和脂质部分以产生脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，加工该一种或多种不饱和脂质部分的步骤包括将该一种或多种不饱和脂质部分皂化为一种或多种FFA。在一些实施方案中，加工该一种或多种不饱和脂质部分的步骤包括将该一种或多种不饱和脂质部分酯化为一种或多种FAAE。在一个实施方案中，富集具有特定链长的一种或多种不饱和脂质部分的任选步骤包括分离方法。在另一个实施方案中，该分离方法包括蒸馏和/或色谱法。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法的一个实施方案中，将该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE还原成一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的步骤包括使该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE与一种或多种化学计量还原剂接触。在一些实施方案中，该一种或多种化学计量还原剂包含双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠Vitride(红铝、Vitride、SMEAH)和/或二异丁基氢化铝(DIBAL)。在某些实施方案中，还原该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE的步骤包含大体积环状氮路易斯碱以修饰还原剂。在一个实施方案中，该大体积环状氮路易斯碱允许该还原步骤选择性地产生一种或多种脂肪醛。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法的一个实施方案中，将该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE还原成一种或多种脂肪醇的步骤包括使该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE与一种或多种过渡金属催化剂接触。在某些实施方案中，该一种或多种过渡金属催化剂包含一种或多种VIII族催化剂。在一个实施方案中，该FAAE包括脂肪酸甲酯(FAME)。
在本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法的一个实施方案中，通过氧化步骤将产生的脂肪醇进一步氧化成脂肪醛。在一些实施方案中，该氧化步骤包括一种或多种部分氧化方法。在某些实施方案中，该一种或多种部分氧化方法包括NaOCl/TEMPO。在其他实施方案中，该氧化步骤包括铜催化的有氧氧化。
在本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法的一个实施方案中，将产生的一种或多种脂肪醇进一步化学转化为一种或多种相应的脂肪乙酸酯。在某些实施方案中，将该一种或多种脂肪醇化学转化为一种或多种相应的脂肪乙酸酯的步骤包括使该一种或多种脂肪醇与乙酸酐接触。
在本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇、一种或多种脂肪醛和/或一种或多种脂肪乙酸酯的任何方法的一个实施方案中，通过分离程序进一步富集该一种或多种脂肪醇、一种或多种脂肪醛和/或一种或多种脂肪乙酸酯。
在另一方面，本文公开了一种产生能够产生一种或多种不饱和脂质部分的重组微生物的方法，该一种或多种不饱和脂质部分在产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法中使用。
酶工程
可以工程化重组微生物中的酶以改进底物向产物转化的一个或多个方面。可以进一步工程化以用于本公开文本的方法中的酶的非限制性例子包括去饱和酶(例如，脂肪酰基-CoA去饱和酶或脂肪酰基-ACP去饱和酶)、细胞色素-b5还原酶、延伸酶、硫酯酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、二酰基甘油酰基转移酶、脂质结合蛋白、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或6-磷酸葡糖酸脱氢酶及其组合。这些酶可针对改进的催化活性、改进的选择性、改进的稳定性、改进的对各种发酵条件(温度、pH等)的耐受性、或改进的对各种代谢底物、产品、副产物、中间体等的耐受性而工程化。
去饱和酶可针对改进的不饱和底物去饱和中的催化活性、改进的烃选择性、改进的Z产物相对于E产物的选择性或E产物相对于Z产物的选择性而工程化。例如，可以工程化Z9脂肪酰基去饱和酶以改进将饱和脂肪酰基-CoA转化为相应的不饱和脂肪酰基-CoA的底物至产物转化的产率，并且另外或可替代地，改进9位去饱和的选择性以产生相应的Z-9脂肪酰基-CoA。在进一步的非限制性例子中，可以工程化细胞色素-b5还原酶以用于改进单电子载体与携带双电子的烟酰胺二核苷酸之间的还原当量的交换中的催化活性；可以工程化延伸酶以用于改进脂肪酸底物的延伸的催化活性；可以工程化硫酯酶以用于改进酰基-ACP或酰基-CoA转化为游离脂肪酸的催化活性；可以工程化甘油-3-磷酸酰基转移酶以用于改进甘油3-磷酸的sn-1位置处的酰化的催化活性；可以工程化溶血磷脂酸酰基转移酶以用于改进三酰基甘油的sn-2位置的酰化的催化活性；可以工程化二酰基甘油酰基转移酶以用于改进向二酰基甘油的sn-3位置加入酰基以形成三酰基甘油的催化活性；可以工程化脂质结合蛋白以用于改进甾醇结合；可以工程化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以用于改进葡萄糖-6-磷酸氧化成6-磷酸D-葡糖酸-1,5-内酯的催化活性，并且另外地或可替代地，用于改变或改进该酶对辅酶的选择性；并且可以工程化6-磷酸葡糖酸脱氢酶以用于改进D-葡糖酸6-磷酸酯氧化成核酮糖5-磷酸的催化活性，并且另外地或可替代地，用于改变或改进该酶对辅酶的选择性。
如本文关于具体的酶活性所用的术语“改进的催化活性”是指相对于可比较的非工程化酶(如非工程化去饱和酶(例如脂肪酰基-CoA去饱和酶或脂肪酰基-ACP去饱和酶)、细胞色素-b5还原酶、延伸酶、硫酯酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、二酰基甘油酰基转移酶、脂质结合蛋白、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或6-磷酸葡糖酸脱氢酶)测量的更高的酶活性水平。例如，特定酶的过表达可以导致细胞中该酶活性水平的增加。可以将突变引入去饱和酶(例如脂肪酰基-CoA去饱和酶或脂肪酰基-ACP去饱和酶)、细胞色素-b5还原酶、延伸酶、硫酯酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、二酰基甘油酰基转移酶、脂质结合蛋白、萄糖-6-磷酸脱氢酶或6-磷酸葡糖酸脱氢酶，从而得到具有改进的催化活性的工程化酶。用以增加酶活性的方法是本领域技术人员已知的。此类技术可以包括：通过增加质粒拷贝数和/或使用更强的启动子和/或使用激活型核糖开关来增加该酶的表达，引入突变以减轻该酶的负调节，引入特定突变以增加比活性和/或降低底物的KM，或通过定向进化。参见例如Methods in Molecular Biology(vol.231),ed.Arnold andGeorgiou,Humana Press(2003)。
代谢工程-酶过表达和基因缺失/下调以增加途径通量
在本文所述的各个实施方案中，参与本文所述生物合成途径的重组微生物中的外源和内源酶可被过表达。
术语“过表达的”或“过表达”是指与相似的相应的未经修饰的表达基础水平的mRNA或具有基础水平的蛋白质的细胞相比，细胞中编码一种或多种蛋白质的mRNA的水平升高(例如，异常水平)和/或一种或多种蛋白质水平升高。在具体的实施方案中，在工程化以展现增加的基因mRNA、蛋白质和/或活性的微生物中，一种或多种mRNA或一种或多种蛋白质可以过表达至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、15倍或更多倍。
在一些实施方案中，本公开文本的重组微生物由含有合成底物脂肪酸的酶能力的宿主生成。在该特定实施方案中，增加脂肪酸的合成或累积可能是有用的，以例如增加可用于化学转化为FFA和/或FAAE并随后还原成一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的脂肪酸的量。
在一些实施方案中，它可用于增加内源或外源酶的表达，以增加辅酶的细胞内水平。在一个实施方案中，该辅酶是NADH。在另一个实施方案中，该辅酶是NADPH。在一个实施方案中，增加磷酸戊糖途径中蛋白质的表达以增加NADPH的细胞内水平。磷酸戊糖途径是提供还原等效物的重要分解代谢途径并且是生物合成反应的重要合成代谢途径。在一个实施方案中，将葡萄糖-6-磷酸酯转化为6-磷酸D-葡糖酸-1,5-内酯的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶过表达。在一些实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是来自酵母的ZWF1。在另一个实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是来自酿酒酵母的ZWF1(YNL241C)。在一个实施方案中，将D-吡喃葡萄糖-6-磷酸酯转化为6-磷酸D-葡糖酸-1,5-内酯的葡萄糖-6-磷酸酯-1-脱氢酶过表达。在另一个实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸酯-1-脱氢酶是来自细菌的zwf。在某些实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸酯-1-脱氢酶是来自大肠杆菌的zwf(NP_416366)。在一个实施方案中，将6-磷酸D-葡糖酸-1,5-内酯转化为D-葡糖酸6-磷酸酯的6-磷酸葡糖酸内酯酶过表达。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是酵母的SOL3。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是酿酒酵母的SOL3(NP_012033)。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是酵母的SOL4。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是酿酒酵母的SOL4(NP_011764)。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是细菌的pgl。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是大肠杆菌的pgl(NP_415288)。在一个实施方案中，将D-葡糖酸6-磷酸转化为D-核酮糖5-磷酸酯的6-磷酸葡糖酸脱氢酶过表达。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酵母的GND1。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酿酒酵母的GND1(YHR183W)。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酵母的GND2。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酿酒酵母的GND2(YGR256W)。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自细菌的gnd。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自大肠杆菌的gnd(NP_416533)。在一个实施方案中，将D-甘油醛3-磷酸酯和D-景天庚酮糖7-磷酸酯与β-D-呋喃果糖6-磷酸酯和D-赤藓糖4-磷酸酯相互转化的转醛醇酶过表达。在一些实施方案中，该转醛醇酶是酵母的TAL1。在某些实施方案中，该转醛醇酶是酿酒酵母的TAL1(NP_013458)。在一些实施方案中，该转醛醇酶是酵母的NQM1。在某些实施方案中，该转醛醇酶是酿酒酵母的NQM1(NP_011557)。在一些实施方案中，该转醛醇酶是细菌的tal。在某些实施方案中，该转醛醇酶是大肠杆菌的talB(NP_414549)。在某些实施方案中，该转醛醇酶是大肠杆菌的talA(NP_416959)。在一个实施方案中，将D-赤藓糖4-磷酸酯和D-木酮糖5-磷酸酯与β-D-呋喃果糖6-磷酸酯和D-甘油醛3-磷酸酯相互转化和/或将D-景天庚酮糖7-磷酸酯和D-甘油醛3-磷酸酯与D-核糖5-磷酸酯和D-木酮糖5-磷酸酯相互转化的转酮醇酶过表达。在一些实施方案中，该转酮醇酶是酵母的TKL1。在某些实施方案中，该转酮醇酶是酿酒酵母的TKL1(NP_015399)。在一些实施方案中，该转酮醇酶是酵母的TKL2。在一些实施方案中，该转酮醇酶是酿酒酵母的TKL2(NP_009675)。在一些实施方案中，该转酮醇酶是细菌的tkt。在某些实施方案中，该转酮醇酶是大肠杆菌的tktA(YP_026188)。在某些实施方案中，该转酮醇酶是大肠杆菌的tktB(NP_416960)。在一个实施方案中，将D-核糖5-磷酸酯与D-核酮糖5-磷酸酯相互转化的核糖-5-磷酸酯酮醇-异构酶过表达。在一些实施方案中，该核糖-5-磷酸酯酮醇-异构酶是酵母的RKI1。在某些实施方案中，该核糖-5-磷酸酯酮醇-异构酶是酿酒酵母的RKI1(NP_014738)。在一些实施方案中，该核糖-5-磷酸酯异构酶是细菌的rpi。在某些实施方案中，该核糖-5-磷酸酯异构酶是大肠杆菌的rpiA(NP_417389)。在某些实施方案中，该核糖-5-磷酸酯异构酶是大肠杆菌的rpiB(NP_418514)。在一个实施方案中，将D-核酮糖5-磷酸酯和D-木酮糖5-磷酸酯相互转化的D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶过表达。在一些实施方案中，该D-核酮糖-5-磷酸酯3-差向异构酶是酵母的RPE1。在某些实施方案中，该D-核酮糖-5-磷酸酯3-差向异构酶是酿酒酵母的RPE1(NP_012414)。在一些实施方案中，该D-核酮糖-5-磷酸酯3-差向异构酶是细菌的rpe。在某些实施方案中，该D-核酮糖-5-磷酸酯3-差向异构酶是大肠杆菌的rpe(NP_417845)。
在一个实施方案中，增加NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶的表达以增加辅酶的细胞内水平。在一个实施方案中，NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶将D-苏式-异柠檬酸酯氧化为2-氧代戊二酸，伴随NADPH的生成。在另一个实施方案中，NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶将D-苏式-异柠檬酸酯氧化为2-草酰琥珀酸盐酯，伴随NADPH的生成。在一些实施方案中，该NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶是来自酵母的IDP。在某些实施方案中，该NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶是来自酿酒酵母的IDP2(YLR174W)。在一些实施方案中，该NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶是来自细菌的icd。在某些实施方案中，该NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶是来自大肠杆菌的icd(NP_415654)。
在一些实施方案中，增加将苹果酸酯脱羧为丙酮酸酯伴随生成NADH或NADPH的苹果酸酶的表达，以增加辅酶的细胞内水平。在一个实施方案中，该苹果酸酶是NAD+依赖性的。在另一个实施方案中，该苹果酸酶是NADP+依赖性的。在一个实施方案中，该苹果酸酶是来自细菌的NAD+依赖性苹果酸脱氢酶。在一些实施方案中，该NAD+依赖性苹果酸脱氢酶是来自大肠杆菌的maeA(NP_415996)。在一些实施方案中，该NAD+依赖性苹果酸脱氢酶是来自干酪乳杆菌的maeE(CAQ68119)。在另一个实施方案中，该苹果酸酶是来自酵母的线粒体NAD+依赖性苹果酸脱氢酶。在一些实施方案中，该NAD+依赖性苹果酸脱氢酶是来自酿酒酵母的MAE1(YKL029C)。在另一个实施方案中，该苹果酸酶是来自寄生线虫的线粒体NAD+依赖性苹果酸脱氢酶。在一些实施方案中，该NAD+依赖性苹果酸脱氢酶是来自猪蛔虫(Ascarissuum)的M81055。在一个实施方案中，该苹果酸酶是来自细菌的NADP+依赖性苹果酸脱氢酶。在一些实施方案中，该NADP+依赖性苹果酸脱氢酶是来自大肠杆菌的maeB(NP_416958)。在一个实施方案中，该苹果酸酶是来自玉米的NADP+依赖性苹果酸脱氢酶。在一些实施方案中，该NADP+依赖性苹果酸脱氢酶是来自玉蜀黍的me1。
在一些实施方案中，增加将醛氧化为羧酸伴随生成NADH或NADPH的醛脱氢酶的表达，以增加辅酶的细胞内水平。在一个实施方案中，该醛脱氢酶是NAD+依赖性的。在另一个实施方案中，该醛脱氢酶是NADP+依赖性的。在一个实施方案中，该醛脱氢酶是来自细菌的NAD+依赖性醛脱氢酶。在一些实施方案中，该NAD+依赖性醛脱氢酶是来自大肠杆菌的aldA(NP_415933)。在另一个实施方案中，该醛脱氢酶是来自酵母的胞质NADP+依赖性醛脱氢酶。在一些实施方案中，该NADP+依赖性醛脱氢酶是来自酿酒酵母的ALD6(YPL061W)。在另一个实施方案中，该醛脱氢酶是来自细菌的胞质NADP+依赖性醛脱氢酶。在一些实施方案中，该NADP+依赖性醛脱氢酶是来自大肠杆菌的aldB(NP_418045)。
在一个实施方案中，过表达酶以增加辅酶的细胞内水平包括将共底物的补充和该酶的过表达偶联。在一个实施方案中，与酶共底物补充偶联的酶过表达增加了通过生物化学途径的通量。在一个实施方案中，NAD+或NADP+依赖性醇脱氢酶与共底物一起表达。在某些实施方案中，醇脱氢酶与异丙醇共底物一起表达。在一个实施方案中，NAD+或NADP+依赖性葡萄糖脱氢酶与共底物一起表达。在某些实施方案中，葡萄糖脱氢酶与葡萄糖共底物一起表达。
在一个实施方案中，增加转氢酶的表达以将NADH和NADPH相互转化。在一些实施方案中，该转氢酶是吡啶核苷酸转氢酶。在一些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶来自细菌。在某些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶是来自大肠杆菌的pntAB(β亚基：NP_416119；α亚基：NP_416120)。在一些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶来自人。在某些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶是来自智人的NNT(NP_036475)。在某些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶来自马铃薯(Solanum tuberosum)。在某些实施方案中，该吡啶核苷酸转氢酶来自菠菜(Spinacea oleracea)。
增加的合成或累积可以通过例如编码一种或多种上述酶以用于产生一种或多种不饱和脂质部分的核酸的过表达来实现。可用于产生一种或多种不饱和脂质部分的一种或多种酶的过表达可以例如通过增加的一个或多个内源基因的表达，或通过一个或多个外源基因的表达或增加的一个或多个外源基因的表达而发生。因此，通过过表达编码一种或多种可用于产生一种或多种不饱和脂质部分的酶的一种或多种核酸分子，可以容易地修饰天然存在的生物体，以生成产生一种或多种不饱和脂质部分的非天然微生物。此外，非天然存在的生物体可以通过诱导内源基因生成，这导致用于产生一种或多种不饱和脂质部分的途径中酶的活性增加。
配备本公开文本的技术人员将能够容易地构建本文所述的重组微生物，因为本公开文本的重组微生物可以使用如上文例示的本领域公知的方法构建，以外源表达编码用于以足够产生一种或多种不饱和脂质部分的量产生一种或多种不饱和脂质部分的途径中的酶的至少一种核酸。
用于构建和测试非天然存在的产生一种或多种不饱和脂质部分的宿主的表达水平的方法可以例如通过本领域公知的重组和检测方法进行。此类方法可以发现描述于例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Ed.,Cold SpringHarbor Laboratory,New York(2001)；Ausubo et al.,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1999)。
可使用本领域已知的多种机制来表达或过表达外源或内源基因。例如，可以构建一种或多种表达载体以含有如本文所例示的一种或多种编码可在用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径中有用的酶的可操作地连接至在宿主生物体中起作用的表达控制序列的核酸。适用于本发明的微生物宿主生物中的表达载体包括例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，包括载体和可操作地稳定整合到宿主染色体中的选择序列或标记。也可以包括选择性标记基因，例如提供对抗生素或毒素的抗性，补足营养缺陷型缺陷或提供培养基中没有的关键营养素。表达控制序列可以包括本领域公知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两种或更多种外源编码核酸将被共表达时，两种核酸都可以被插入例如单个表达载体或分开的表达载体中。对于单个载体表达，编码核酸可以与一个常见的表达控制序列可操作地连接或与不同的表达控制序列连接，如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以使用本领域公知的方法来确认代谢或合成途径涉及的外源核酸序列的转化。
表达控制序列在本领域中是已知的，并且包括例如提供多核苷酸序列在宿主细胞中的表达的启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等。表达控制序列与转录涉及的细胞蛋白特异性地相互作用(Maniatis et al.,Science,236:1237-1245(1987))。示例性表达控制序列描述于例如Goeddel,Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。
在各个实施方案中，表达控制序列可以可操作地连接至多核苷酸序列。“可操作地连接”意指多核苷酸序列和一个或多个表达控制序列以如下的方式连接，即在适当的分子(例如转录激活蛋白)结合到该一个或多个表达控制序列上时允许基因表达。根据转录和翻译的方向，可操作地连接的启动子位于所选多核苷酸序列的上游。可操作地连接的增强子可位于所选多核苷酸的上游、内部或下游。
在一些实施方案中，该重组微生物被操纵以使与用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径竞争的途径中的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。
在一些实施方案中，该重组微生物被操纵以使一种或多种内源酶催化脂肪酸转化为ω-羟基脂肪酸的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在一些这样的实施方案中，催化脂肪酸转化为ω-羟基脂肪酸的酶选自下组，该组由以下各项组成：XP_504406、XP_504857、XP_504311、XP_500855、XP_500856、XP_500402、XP_500097、XP_501748、XP_500560、XP_501148、XP_501667、XP_500273、BAA02041、CAA39366、CAA39367、BAA02210、BAA02211、BAA02212、BAA02213、BAA02214、AAO73952、AAO73953、AAO73954、AAO73955、AAO73956、AAO73958、AAO73959、AAO73960、AAO73961、AAO73957、XP_002546278、BAM49649、AAB80867、AAB17462、ADL27534、AAU24352、AAA87602、CAA34612、ABM17701、AAA25760、CAB51047、AAC82967、WP_011027348或其同系物。
在一些实施方案中，催化脂肪酸转化为ω-羟基脂肪酸的酶是单加氧酶(CYP52)。在一些实施方案中，该单加氧酶选自下组，该组由以下各项组成：ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7、ALK8、ALK9、ALK10、ALK11和ALK12。在某些实施方案中，该单加氧酶是选自下组的解脂耶氏酵母单加氧酶，该组由以下各项组成：YALI0B13838g、YALI0A15488g、YALI0B01848g、YALI0B13816g、YALI0E23474g、YALI0A20130g、YALI0C12122g、YALI0E25982g、YALI0B06248g、YALI0F01320g、YALI0B20702g和YALI0C10054g。在某些实施方案中，该单加氧酶是选自下组的白假丝酵母单加氧酶，该组由以下各项组成：CaO19.10、CaO19.7683、CaO19.7512、CaO19.13150、CaO19.13927和CaO19.6574。在某些实施方案中，该单加氧酶是选自下组的热带假丝酵母单加氧酶，该组由以下各项组成：CTRG_03115、CTRG_03120、CTRG_01061、CTRG_01060、CTRG_02725、CTRG_03114和CTRG_04959。
在一些实施方案中，催化脂肪酸转化为ω-羟基脂肪酸的酶是脂肪醇氧化酶。在一些实施方案中，该脂肪醇氧化酶选自下组，该组由以下各项组成：FAO1和FAO2。在某些实施方案中，该脂肪醇氧化酶是解脂耶氏酵母YALI0B14014g。在某些实施方案中，该脂肪醇氧化酶是选自下组的白假丝酵母脂肪醇氧化酶，该组由以下各项组成：CaO19.6143和CaO19.13562。在某些实施方案中，该脂肪醇氧化酶是选自下组的热带假丝酵母脂肪醇氧化酶，该组由以下各项组成：CTRG_03062和CTRG_03063。
在一些实施方案中，催化脂肪酸转化为ω-羟基脂肪酸的酶是脂肪醇脱氢酶。在一些实施方案中，该脂肪醇脱氢酶是FADH。在某些实施方案中，该脂肪醇脱氢酶是解脂耶氏酵母YALI0F09603g。在某些实施方案中，该脂肪醇脱氢酶是选自下组的白假丝酵母脂肪醇脱氢酶，该组由以下各项组成：I503_06411和CaO19.7600。在某些实施方案中，该脂肪醇脱氢酶是热带假丝酵母脂肪醇脱氢酶CTRG_05836。
在一些实施方案中，催化脂肪酸转化为ω-羟基脂肪酸的酶是醇脱氢酶。在一些实施方案中，该醇脱氢酶选自下组，该组由以下各项组成：ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7和ADH8。在某些实施方案中，该醇脱氢酶是选自下组的解脂耶氏酵母醇脱氢酶，该组由以下各项组成：YALI0E07766g、YALI0D25630g、YALI0E17787g、YALI0A16379g、YALI0A15147g、YALI0E15818g、YALI0D02167g和YALI0C12595g。在某些实施方案中，该醇脱氢酶是选自下组的白假丝酵母醇脱氢酶，该组由以下各项组成：CaO19.11480、CaO19.12579、CaO19.5113、CaO19.4287、CaO19.11763、CaO19.10139、CaO19.2608、CaO19.11981、CaO19.4504、CaO19.11980、CaO19.12963和CaO19.5517。在某些实施方案中，该醇脱氢酶是选自下组的热带假丝酵母醇脱氢酶，该组由以下各项组成：CTRG_06113、CTRG_05482、CTRG_05127和CTRG_05197。
在一些实施方案中，催化脂肪酸转化为ω-羟基脂肪酸的酶是脂肪醛脱氢酶。在一些实施方案中，该脂肪醛脱氢酶选自下组，该组由以下各项组成：FALDH1、FALDH2、FALDH3和FALDH4。在某些实施方案中，该脂肪醛脱氢酶是选自下组的解脂耶氏酵母脂肪醛脱氢酶，该组由以下各项组成：YALI0A17875g、YALI0E15400g、YALI0B01298g和YALI0F23793g。在某些实施方案中，该脂肪醛脱氢酶是选自下组的白假丝酵母脂肪醛脱氢酶，该组由以下各项组成：CaO19.13871、CaO19.6518、CaO19.13487和CaO19.6066。在某些实施方案中，该脂肪醛脱氢酶是选自下组的热带假丝酵母脂肪醛脱氢酶，该组由以下各项组成：CTRG_05010、CTRG_04471和CTRG_04473。
在其他实施方案中，该重组微生物被操纵以使一种或多种内源酶催化脂肪酰基-CoA转化为α,β-烯酰基-CoA的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在一些这样的实施方案中，催化脂肪酰基-CoA转化为α,β-烯酰基-CoA的酶选自下组，该组由以下各项组成：CAA04659、CAA04660、CAA04661、CAA04662、CAA04663、CAG79214、AAA34322、AAA34361、AAA34363、CAA29901、BAA04761、AAA34891、AAB08643、CAB15271、BAN55749、CAC44516、ADK16968、AEI37634、WP_000973047、WP_025433422、WP_035184107、WP_026484842、CEL80920、WP_026818657、WP_005293707、WP_005883960或其同系物。
在一些实施方案中，催化脂肪酰基-CoA转化为α,β-烯酰基-CoA的酶是酰基-CoA氧化酶。在一些实施方案中，该酰基-CoA氧化酶选自下组，该组由以下各项组成：POX1、POX2、POX3、POX4、POX5、POX6和PXP2。在某些实施方案中，该酰基-CoA氧化酶是酿酒酵母YGL205W。在某些实施方案中，该酰基-CoA氧化酶是选自下组的解脂耶氏酵母酰基-CoA氧化酶，该组由以下各项组成：YALI0E32835g、YALI0F10857g、YALI0D24750g、YALI0E27654g、YALI0C23859g和YALI0E06567g。在某些实施方案中，该酰基-CoA氧化酶是选自下组的白假丝酵母酰基-CoA氧化酶，该组由以下各项组成：CaO19.1655、CaO19.9224、CaO19.1652、CaO19.9221、CaO19.5723和CaO19.13146。在某些实施方案中，该酰基-CoA氧化酶是选自下组的热带假丝酵母酰基-CoA氧化酶，该组由以下各项组成：CTRG_02374、CTRG_02377和CTRG_02721。在某些实施方案中，该酰基-CoA氧化酶是选自下组的维斯假丝酵母酰基-CoA氧化酶，该组由以下各项组成：M18259、M12160和M12161。
在一些实施方案中，催化脂肪酰基-CoA转化为α,β-烯酰基-CoA的酶是多功能烯酰基-CoA水合酶-β-羟酰基-CoA脱氢酶。在一些实施方案中，该多功能烯酰基-CoA水合酶-β-羟酰基-CoA脱氢酶是FOX2(MFE1)。在某些实施方案中，该多功能烯酰基-CoA水合酶-β-羟酰基-CoA脱氢酶是酿酒酵母YKR009C。在某些实施方案中，该多功能烯酰基-CoA水合酶-β-羟酰基-CoA脱氢酶是解脂耶氏酵母YALI0E15378g。在某些实施方案中，该多功能烯酰基-CoA水合酶-β-羟酰基-CoA脱氢酶是白假丝酵母CaO19.1809。在某些实施方案中，该多功能烯酰基-CoA水合酶-β-羟酰基-CoA脱氢酶是热带假丝酵母CTRG_05506。
在一些实施方案中，催化脂肪酰基-CoA转化为α,β-烯酰基-CoA的酶是β-酮脂酰基-CoA硫解酶。在一些实施方案中，该β-酮脂酰基-CoA硫解酶选自下组，该组由以下各项组成：POT1和FOX3。在某些实施方案中，该β-酮脂酰基-CoA硫解酶是酿酒酵母YIL160C。在某些实施方案中，该β-酮脂酰基-CoA硫解酶是解脂耶氏酵母YALI0E18568g。在某些实施方案中，该β-酮脂酰基-CoA硫解酶是选自下组的白假丝酵母β-酮脂酰基-CoA硫解酶，该组由以下各项组成：CaO19.7520、CaO19.1704和CaO19.9271。在某些实施方案中，该β-酮脂酰基-CoA硫解酶是选自下组的热带假丝酵母β-酮脂酰基-CoA硫解酶，该组由以下各项组成：CTRG_01068和CTRG_02168。
在一些实施方案中，该重组微生物被操纵以使过氧化物酶体生物发生涉及的一种或多种蛋白质的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在这样的实施方案中，过氧化物酶体生物发生涉及的一种或多种蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：XP_505754、XP_501986、XP_501311、XP_504845、XP_503326、XP_504029、XP_002549868、XP_002547156、XP_002545227、XP_002547350、XP_002546990、EIW11539、EIW08094、EIW11472、EIW09743、EIW0828或其同系物。
在一些实施方案中，涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种蛋白选自下组，该组由以下各项组成：PEX1、PEX2、PEX3、PEX4、PEX5、PEX6、PEX7、PEX8、PEX10、PEX11、PEX12、PEX13、PEX14、PEX15、PEX17、PEX18、PEX19、PEX21、PEX22、PEX25、PEX27、PEX28、PEX29、PEX30、PEX31、PEX32和PEX34。在某些实施方案中，涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种蛋白是PEX2。在一些实施方案中，该PEX2是来自酿酒酵母的YJL210W。在一些实施方案中，该PEX2是来自解脂耶氏酵母的YALI0_F01012g。在一些实施方案中，该PEX2是来自白假丝酵母的CaO19.11030。在一些实施方案中，该PEX2是来自白假丝酵母的CaO19.3546。在一些实施方案中，该PEX2是来自热带假丝酵母的CTRG_01657。在某些实施方案中，涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种蛋白是PEX12。在一些实施方案中，该PEX12是来自酿酒酵母的YMR026C。在一些实施方案中，该PEX12是来自解脂耶氏酵母的YALI0_D26642g。在一些实施方案中，该PEX12是来自白假丝酵母的CaO19.2009。在一些实施方案中，该PEX12是来自白假丝酵母的CaO19.9560。在一些实施方案中，该PEX12是来自热带假丝酵母的CTRG_01296。在某些实施方案中，涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种蛋白是PEX10。在一些实施方案中，该PEX10是来自酿酒酵母的YDR265W。在一些实施方案中，该PEX10是来自解脂耶氏酵母的YALI0_C01023g。在一些实施方案中，该PEX10是来自白假丝酵母的CaO19.13105。在一些实施方案中，该PEX10是来自白假丝酵母的CaO19.5660。在一些实施方案中，该PEX10是来自热带假丝酵母的CTRG_00008。在某些实施方案中，涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种蛋白是PEX1。在一些实施方案中，该PEX1是来自酿酒酵母的YKL197C。在一些实施方案中，该PEX1是来自解脂耶氏酵母的YALI0_C15356g。在一些实施方案中，该PEX1是来自白假丝酵母的CaO19.13818。在一些实施方案中，该PEX1是来自白假丝酵母的CaO19.6460。在一些实施方案中，该PEX1是来自热带假丝酵母的CTRG_04869。在某些实施方案中，涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种蛋白是PEX22。在一些实施方案中，该PEX22是来自酿酒酵母的YAL055W。在一些实施方案中，该PEX22是来自解脂耶氏酵母的YALI0_F06226g。在某些实施方案中，涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种蛋白是PEX16。在一些实施方案中，该PEX16是来自解脂耶氏酵母的YALI0_E16599g。在某些实施方案中，涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种蛋白是PEX14。在一些实施方案中，该PEX14是来自酿酒酵母的YGL153W。在一些实施方案中，该PEX14是来自解脂耶氏酵母的YALI0_E09405g。在一些实施方案中，该PEX14是来自白假丝酵母的CaO19.1805。在一些实施方案中，该PEX14是来自白假丝酵母的CaO19.9371。在一些实施方案中，该PEX14是来自热带假丝酵母的CTRG_00541。
在一些实施方案中，该重组微生物被操纵以使涉及一种或多种脂质体储存和/或回收途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是三酰基甘油脂肪酶。在一个实施方案中，该三酰基甘油脂肪酶是酿酒酵母TGL3(YMR313c)。在一些实施方案中，该三酰基甘油脂肪酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0D17534g。在一些实施方案中，该三酰基甘油脂肪酶是来自白假丝酵母的W5Q_03398。在一些实施方案中，该三酰基甘油脂肪酶是来自热带假丝酵母的CTRG_00057。在另一个实施方案中，该脂肪酶是酿酒酵母TGL4(YKR089c)。在一些实施方案中，该三酰基甘油脂肪酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0F10010g。在一些实施方案中，该三酰基甘油脂肪酶是来自白假丝酵母的CaO19.5426。在一些实施方案中，该三酰基甘油脂肪酶是来自白假丝酵母的CaO19.12881。在一些实施方案中，该三酰基甘油脂肪酶是来自热带假丝酵母的CTRG_06185。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是介导来自含有脂肪酸的三酰基甘油酯的脂肪酰基转移的溶血磷脂酸酰基转移酶。在一个实施方案中，该溶血磷脂酸酰基转移酶是酿酒酵母TGL5(YOR081c)。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是介导含有脂肪酸的甾醇酯的水解的甾醇酯水解酶。在一个实施方案中，该甾醇酯水解酶是酿酒酵母TGL1(YKL140w)。在一些实施方案中，该甾醇酯水解酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0E32035g。在一些实施方案中，该甾醇酯水解酶是来自白假丝酵母的CaO19.2050。在一些实施方案中，该甾醇酯水解酶是来自白假丝酵母的CaO19.9598。在一些实施方案中，该甾醇酯水解酶是来自热带假丝酵母的CTRG_01138。在一个实施方案中，该甾醇酯水解酶是酿酒酵母YEH1(YLL012W)。在一些实施方案中，该甾醇酯水解酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0E00528g。在一些实施方案中，该甾醇酯水解酶是来自白假丝酵母的CaO19.1887。在一些实施方案中，该甾醇酯水解酶是来自白假丝酵母的CaO19.9443。在一些实施方案中，该甾醇酯水解酶是来自热带假丝酵母的CTRG_01683。在一个实施方案中，该甾醇酯水解酶是酿酒酵母YEH2(YLR020C)。在一些实施方案中，该甾醇酯水解酶是来自热带假丝酵母的CTRG_04630。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是将脂肪酰基部分再活化为脂肪酰基-CoA硫酯的酰基-CoA合成酶。在一个实施方案中，该酰基-CoA合成酶是FAT1(AAC17118)。
在一些实施方案中，该重组微生物被操纵以使一种或多种内源酶催化与一种或多种不饱和脂肪酰基-CoA中间体的生物合成途径竞争的途径中的反应的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在一个实施方案中，该一种或多种内源酶包含一种或多种二酰基甘油酰基转移酶。在重组酵母微生物的背景下，该重组酵母微生物被工程化以使选自下组的一种或多种二酰基甘油酰基转移酶的活性缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：YALI0E32769g、YALI0D07986g和CTRG_06209或其同系物。在另一个实施方案中，该一种或多种内源酶包含一种或多种甘油磷脂酰基转移酶。在重组酵母微生物的背景下，该重组酵母微生物被工程化以使选自下组的一种或多种甘油磷脂酰基转移酶的活性缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：YALI0E16797g和CTG_04390或其同系物。在另一个实施方案中，该一种或多种内源酶包含一种或多种酰基-CoA/甾醇酰基转移酶。在重组酵母微生物的背景下，该重组酵母微生物被工程化以使选自下组的一种或多种酰基-CoA/甾醇酰基转移酶的活性缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：YALI0F06578g、CTRG_01764和CTRG_01765或其同系物。
在一些实施方案中，该重组微生物被操纵以使涉及一种或多种脂肪酸延伸途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是催化丙二酰基-ACP与酰基-CoA的缩合从而产生β-酮脂酰基-ACP的β-酮脂酰基-CoA合酶。在一个实施方案中，该β-酮脂酰基-CoA合酶是酵母FAS的β-酮脂酰基-CoA合酶结构域。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是将丙二酰基-ACP与酰基-ACP缩合以形成β-酮脂酰基-ACP的β-酮脂酰基-ACP合酶I。在一个实施方案中，该β-酮脂酰基-ACP合酶I是来自细菌的FabB。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是将丙二酰基-ACP与酰基-ACP缩合以形成β-酮脂酰基-ACP的β-酮脂酰基-ACP合酶II。在一个实施方案中，该β-酮脂酰基-ACP合酶II是来自细菌的FabF。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是用NADPH还原β-酮脂酰基-ACP的β-酮基以形成β-羟酰基-ACP的β-酮脂酰基-ACP还原酶。在一个实施方案中，该β-酮脂酰基-ACP还原酶是来自细菌的FabG。在另一个实施方案中，该β-酮脂酰基-ACP还原酶是酵母FAS的酮还原酶(KR)结构域。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是β-酮脂酰基-CoA还原酶。在一些实施方案中，该β-酮脂酰基-CoA还原酶是来自酿酒酵母(YBR159W)的IFA38。在一些实施方案中，该β-酮脂酰基-CoA还原酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0A06787g。在一些实施方案中，该β-酮脂酰基-CoA还原酶是来自白假丝酵母的CaO19.11340。在一些实施方案中，该β-酮脂酰基-CoA还原酶是来自白假丝酵母的CaO19.3859。在一些实施方案中，该β-酮脂酰基-CoA还原酶是来自热带假丝酵母的CTRG_00620。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是使β-羟酰基-ACP脱水以形成反式-2-烯酰基-ACP的β-羟酰基-ACP脱水酶。在一个实施方案中，该脱水酶是β-羟酰基-ACP脱水酶/异构酶。在另一个实施方案中，该β-羟酰基-ACP脱水酶/异构酶是来自细菌的FabA。在一个实施方案中，该脱水酶是β-羟酰基-ACP脱水酶。在另一个实施方案中，该β-羟酰基-ACP脱水酶是来自细菌的FabZ。在另一个实施方案中，该脱水酶是酵母FAS的脱水酶(DH)结构域。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是β-羟酰基-CoA脱水酶。在一些实施方案中，该β-羟酰基-CoA脱水酶是来自酿酒酵母(YJL097W)的PHS1(TPL1)。在一些实施方案中，该β-羟酰基-CoA脱水酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0F11935g。在一些实施方案中，该β-羟酰基-CoA脱水酶是来自白假丝酵母的CaO19.5156。在一些实施方案中，该β-羟酰基-CoA脱水酶是来自白假丝酵母的CaO19.12623。在一些实施方案中，该β-羟酰基-CoA脱水酶是来自热带假丝酵母的CTRG_05224。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是还原反式-2-烯酰基-ACP以形成酰基-ACP的烯酰基-ACP还原酶。在一个实施方案中，该还原酶是NADPH依赖性反式-2-烯酰基-ACP还原酶I。在另一个实施方案中，该NADPH依赖性反式-2-烯酰基-ACP还原酶I是来自细菌的Fabl。在一个实施方案中，该还原酶是NADPH依赖性反式-2-烯酰基-ACP还原酶II。在另一个实施方案中，该NADPH依赖性反式-2-烯酰基-ACP还原酶II是来自细菌的FabK。在一个实施方案中，该还原酶是NADPH依赖性反式-2-烯酰基-ACP还原酶III。在另一个实施方案中，该NADPH依赖性反式-2-烯酰基-ACP还原酶III是来自细菌的FabL。在另一个实施方案中，该还原酶是酵母中FAS的烯醇还原酶(ER)结构域。在某些实施方案中，该一种或多种内源蛋白是烯酰基-CoA还原酶。在一些实施方案中，该烯酰基-CoA还原酶是来自酿酒酵母(YDL015C)的TSC13。在一些实施方案中，该烯酰基-CoA还原酶是来自解脂耶氏酵母的YALI0A04983g。在一些实施方案中，该烯酰基-CoA还原酶是来自白假丝酵母的CaO19.10803。在一些实施方案中，该烯酰基-CoA还原酶是来自白假丝酵母的CaO19.3293。在一些实施方案中，该烯酰基-CoA还原酶是来自热带假丝酵母的CTRG_04406。
在另一个实施方案中，该重组微生物被操纵以使涉及磷酸戊糖途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。在一些实施方案中，减少磷酸戊糖途径中蛋白质的表达以增加NADH的细胞内水平。在一个实施方案中，该一种或多种内源蛋白是将葡萄糖-6-磷酸酯转化为6-磷酸D-葡糖酸-1,5-内酯的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是来自酵母的ZWF1。在另一个实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是来自酿酒酵母的ZWF1(YNL241C)。在一个实施方案中，该一种或多种内源蛋白是将D-吡喃葡萄糖-6-磷酸酯转化为6-磷酸D-葡糖酸-1,5-内酯的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶。在另一个实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸酯-1-脱氢酶是来自细菌的zwf。在某些实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸酯-1-脱氢酶是来自大肠杆菌的zwf(NP_416366)。在一个实施方案中，该一种或多种内源蛋白是将6-磷酸D-葡糖酸-1,5-内酯转化为D-葡糖酸6-磷酸酯的6-磷酸葡糖酸内酯酶。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是酵母的SOL3。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是酿酒酵母的SOL3(NP_012033)。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是酵母的SOL4。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是酿酒酵母的SOL4(NP_011764)。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是细菌的pgl。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸内酯酶是大肠杆菌的pgl(NP_415288)。在一个实施方案中，该一种或多种内源蛋白是将D-葡糖酸6-磷酸酯转化为D-核酮糖5-磷酸酯的6-磷酸葡糖酸脱氢酶。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酵母的GND1。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酿酒酵母的GND1(YHR183W)。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酵母的GND2。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自酿酒酵母的GND2(YGR256W)。在一些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自细菌的gnd。在某些实施方案中，该6-磷酸葡糖酸脱氢酶是来自大肠杆菌的gnd(NP_416533)。在一个实施方案中，该一种或多种内源蛋白是将D-甘油醛3-磷酸酯和D-景天庚酮糖7-磷酸酯与β-D-呋喃果糖6-磷酸酯和D-赤藓糖4-磷酸酯相互转化的转醛醇酶。在一些实施方案中，该转醛醇酶是酵母的TAL1。在某些实施方案中，该转醛醇酶是酿酒酵母的TAL1(NP_013458)。在一些实施方案中，该转醛醇酶是酵母的NQM1。在某些实施方案中，该转醛醇酶是酿酒酵母的NQM1(NP_011557)。在一些实施方案中，该转醛醇酶是细菌的tal。在某些实施方案中，该转醛醇酶是大肠杆菌的talB(NP_414549)。在某些实施方案中，该转醛醇酶是大肠杆菌的talA(NP_416959)。在一个实施方案中，该一种或多种内源蛋白是将D-赤藓糖4-磷酸酯和D-木酮糖5-磷酸酯与β-D-呋喃果糖6-磷酸酯和D-甘油醛3-磷酸酯相互转化和/或将D-景天庚酮糖7-磷酸酯和D-甘油醛3-磷酸酯与D-核糖5-磷酸酯和D-木酮糖5-磷酸酯相互转化的转酮醇酶。在一些实施方案中，该转酮醇酶是酵母的TKL1。在某些实施方案中，该转酮醇酶是酿酒酵母的TKL1(NP_015399)。在一些实施方案中，该转酮醇酶是酵母的TKL2。在一些实施方案中，该转酮醇酶是酿酒酵母的TKL2(NP_009675)。在一些实施方案中，该转酮醇酶是细菌的tkt。在某些实施方案中，该转酮醇酶是大肠杆菌的tktA(YP_026188)。在某些实施方案中，该转酮醇酶是大肠杆菌的tktB(NP_416960)。在一个实施方案中，该一种或多种内源蛋白是将D-核糖5-磷酸酯与D-核酮糖5-磷酸酯相互转化的核糖-5-磷酸酯酮醇-异构酶。在一些实施方案中，该核糖-5-磷酸酯酮醇-异构酶是酵母的RKI1。在某些实施方案中，该核糖-5-磷酸酯酮醇-异构酶是酿酒酵母的RKI1(NP_014738)。在一些实施方案中，该核糖-5-磷酸酯异构酶是细菌的rpi。在某些实施方案中，该核糖-5-磷酸酯异构酶是大肠杆菌的rpiA(NP_417389)。在某些实施方案中，该核糖-5-磷酸酯异构酶是大肠杆菌的rpiB(NP_418514)。在一个实施方案中，该一种或多种内源蛋白是将D-核酮糖5-磷酸酯与D-木酮糖5-磷酸酯相互转化的D-核酮糖-5-磷酸酯3-差向异构酶。在一些实施方案中，该D-核酮糖-5-磷酸酯3-差向异构酶是酵母的RPE1。在某些实施方案中，该D-核酮糖-5-磷酸酯3-差向异构酶是酿酒酵母的RPE1(NP_012414)。在一些实施方案中，该D-核酮糖-5-磷酸酯3-差向异构酶是细菌的rpe。在某些实施方案中，该D-核酮糖-5-磷酸酯3-差向异构酶是大肠杆菌的rpe(NP_417845)。
在一些实施方案中，向其中引入用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的解脂耶氏酵母微生物是H222ΔPΔAΔFΔURA3。ΔP表示解脂耶氏酵母中酰基-CoA氧化酶基因(POX 1-6)的缺失。ΔA表示解脂耶氏酵母中(脂肪)醇脱氢酶基因(FADH，ADH 1-7)的缺失。ΔF表示解脂耶氏酵母中(脂肪)醇氧化酶基因(FAO1)的缺失。ΔURA3表示解脂耶氏酵母中URA3基因的缺失，从而使该酵母成为尿嘧啶营养缺陷型。在一些实施方案中，向其中引入用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的解脂耶氏酵母微生物是H222ΔPΔAΔF。在一些实施方案中，向其中引入用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的解脂耶氏酵母微生物是MATA ura3-302::SUC2Δpox1Δpox2Δpox3Δpox4Δpox5Δpox6ΔfadhΔadh1 Δadh2Δadh3Δadh4Δadh5Δadh6Δadh7Δfao1。
酵母解脂耶氏酵母，优选菌株H222的野生型分离物可以用作构建根据本公开文本的菌株的起始菌株。根据关于国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约，菌株H222于2013年4月29日以编号DSM 27185保藏于DSMZ(德国微生物保藏中心(DeutscheSammlung fur Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH)，D-38142 Braunschweig)。使用菌株进行进一步的遗传加工需要选择标记。该选择标记可以以本身已知的方式(例如以尿嘧啶营养缺陷型的形式)引入菌株。可替代地，可以使用已知的尿嘧啶营养缺陷型菌株，优选菌株H222-S4(Mauersberger S,Wang HJ,Gaillard in C,Barth G&Nicaud JM(2001)JBacterial 183:5102-5109)。根据Barth和Gaillardin(Barth G&Gaillardin C(1996)Yarrowia lipolytica.Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg,New York)，通过PCR或限制获得各自的缺失盒(例如POX 1-6、FADH、ADH 1-7、FAO1)并转化为解脂耶氏酵母H222-S4，其可以由解脂耶氏酵母H222产生(Mauers-berger et al.(2001))。H222ΔPΔAΔFΔURA3的产生描述于WO 2015/086684中，其全部内容通过引用并入本文。将解脂耶氏酵母菌株H222ΔPΔAΔF用作本公开文本中引入去饱和酶的起始微生物(参见例如，实施例3、4和6)。
来自天然存在的生物体或来自微生物合成的产物的化学转化
本公开文本描述了化学转化，其可以用于将从一种或多种天然存在的生物体获得的产物或由一种或多种重组微生物合成的产物转化为一种或多种下游产物。
在一些实施方案中，从一种或多种天然存在的生物体获得或由一种或多种重组微生物产生的一种或多种不饱和脂质部分可以经历随后的化学转化以产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。该一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛可用作信息素、香料、调味剂、聚合物或聚合物中间体。化学转化的非限制性例子包括皂化、酯化、还原、氧化、易位和聚合。
不饱和脂肪羧酸可以通过本领域已知的方法酯化。例如，可使用费舍尔(Fischer)酯化来将脂肪羧酸转化为相应的脂肪酸酯。参见例如Komura,K.et al.,Synthesis2008.3407-3410。
通过与水和碱反应，酯可以经历皂化以形成羧酸根离子和醇。皂化方法包括热皂化、冷皂化、微波皂化和超声辅助皂化。
碳链的延长可以通过已知方法进行，以将不饱和脂肪醇转化为其延长的衍生物。可以使用烯烃易位催化剂以增加脂肪碳链上的碳原子数目并赋予相应的不饱和产物的Z或E立体化学。
通常，在本公开文本中可以使用在反应条件下稳定且不与脂肪底物(例如醇、酯、羧酸、醛或乙酸酯)上的官能团反应的任何易位催化剂。此类催化剂是例如通过引用以全部内容并入本文的Grubbs(Grubbs,R.H.,“Synthesis of large and small moleculesusing olefin metathesis catalysts.”PMSE Prepr.,2012)所述的那些。依赖于所希望的烯烃异构体，可以使用顺式选择性易位催化剂，例如通过引用以全部内容并入本文的Shahane等人(Shahane,S.,et al.ChemCatChem,2013.5(12):p.3436-3459)中描述的那些中的一种。展现出顺式选择性的特定催化剂1-5如下所示(方案1)并且先前已经描述过(Khan,R.K.,et al.J.Am.Chem.Soc.,2013.135(28):p.10258-61；Hartung,J.etal.J.Am.Chem.Soc.,2013.135(28):p.10183-5.；Rosebrugh,L.E.,etal.J.Am.Chem.Soc.,2013.135(4):p.1276-9.；Marx,V.M.,et al.J.Am.Chem.Soc.,2013.135(1):p.94-7.；Herbert,M.B.,et al.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,2013.52(1):p.310-4；Keitz,B.K.,et al.J.Am.Chem.Soc.,2012.134(4):p.2040-3.；Keitz,B.K.,etal.J.Am.Chem.Soc.,2012.134(1):p.693-9.；Endo,K.et al.J.Am.Chem.Soc.,2011.133(22):p.8525-7)。
方案1
另外的Z选择性催化剂描述于(Cannon and Grubbs 2013；Bronner et al.2014；Hartung et al.2014；Pribisko et al.2014；Quigley and Grubbs 2014)，并且通过引用以全部内容并入本文。由于其优异的稳定性和官能团耐受性，在一些实施方案中，易位催化剂包括但不限于具有形式上处于+2氧化态的金属中心、电子数为16、为五配位并且具有通式LL′AA′M═CRbRc或LL′AA′M═(C═)nCRbRc的中性钌或锇金属碳烯络合物(Pederson和Grubbs 2002)；其中
M是钌或锇；
L和L'各自独立地为任何中性电子供体配体并且选自膦、磺化膦、亚磷酸酯、次膦酸酯、亚膦酸酯(phosphonite)、胂、辉锑矿、醚、胺、酰胺、亚胺、亚砜、羧基、亚硝酰基、吡啶、硫醚或杂环碳烯；并且
A和A'是独立地选自以下项的阴离子配体：卤素、氢、C1-C20烷基、芳基、C1-C20醇盐、芳基酚盐、C2-C20烷氧基羰基、芳基羧酸酯、C1-C20羧酸酯、芳基磺酰基、C1-C20烷基磺酰基、C1-C20烷基亚硫酰基；每个配体任选地被以下项取代：C1-C5烷基、卤素、C1-C5烷氧基；或被苯基取代，该苯基任选被卤素、C1-C5烷基或C1-C5烷氧基取代；并且A和A'一起可以任选地包含双齿配体；并且
Rb和Rc独立地选自氢、C1-C20烷基、芳基、C1-C20羧酸酯、C1-C20烷氧基、芳氧基、C1-C20烷氧基羰基、C1-C20烷硫基、C1-C20烷基磺酰基以及C1-C20烷基亚硫酰基，Rb和Rc中每个任选地被C1-C5烷基、卤素、C1-C5烷氧基取代或被苯基取代，该苯基任选被卤素、C1-C5烷基、或C1-C5烷氧基取代。
也可使用其他易位催化剂，如“明确定义的催化剂”。此类催化剂包括但不限于由Grubbs等人(Tetrahedron 1998,54:4413-4450)描述的施罗克(Schrock)钼易位催化剂2,6-二异丙基苯基亚氨基新植二烯双(六氟叔丁醇)钼(VI)和由Couturier,J.L.等人(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1992,31:628)描述的巴塞特(Basset)钨易位催化剂。
在本公开文本的方法中有用的催化剂还包括由以下描述的那些：Peryshkov,etal.J.Am.Chem.Soc.2011,133:20754-20757；Wang,et al.Angewandte Chemie,2013,52:1939-1943；Yu,et al.J.Am.Chem.Soc.,2012,134:2788-2799；Halford.Chem.Eng.News,2011,89(45):11；Yu,et al.Nature,2011,479:88-93；Lee.Nature,2011,471:452-453；Meek,et al.Nature,2011:471,461-466；Flook,et al.J.Am.Chem.Soc.2011,133:1784–1786；Zhao,et al.Org Lett.,2011,13(4):784-787；Ondi,et al.“High activity,stabilized formulations,efficient synthesis and industrial use of Mo-and W-based metathesis catalysts”XiMo Technology Updates,2015:http://www.ximo-inc.com/files/ximo/uploads/download/Summary_3.11.15.pdf；Schrock,etal.Macromolecules,2010:43,7515–7522；Peryshkov,et al.Organometallics 2013:32,5256-5259；Gerber,et al.Organometallics 2013:32,5573-5580；Marinescu,etal.Organometallics 2012:31,6336-6343；Wang,et al.Angew.Chem.Int.Ed.2013:52,1939–1943；Wang,et al.Chem.Eur.J.2013:19,2726-2740；以及Townsend etal.J.Am.Chem.Soc.2012:134,11334-11337。
在本公开文本的方法中有用的催化剂还包括以下项中描述的那些：国际公开号WO2014/155185；国际公开号WO 2014/172534；美国专利申请公开号2014/0330018；国际公开号WO 2015/003815；以及国际公开号WO 2015/003814。
在本公开文本的方法中有用的催化剂还包括以下项中描述的那些：美国专利号4,231,947；美国专利号4,245,131；美国专利号4,427,595；美国专利号4,681,956；美国专利号4,727,215；国际公开号WO 1991/009825；美国专利号5,0877,10；美国专利号5,142,073；美国专利号5,146,033；国际公开号WO 1992/019631；美国专利号6,121,473；美国专利号6,346,652；美国专利号8,987,531；美国专利申请公开号2008/0119678；国际公开号WO 2008/066754；国际公开号WO 2009/094201；美国专利申请公开号2011/0015430；美国专利申请公开号2011/0065915；美国专利申请公开号2011/0077421；国际公开号WO 2011/040963；国际公开号WO 2011/097642；美国专利申请公开号2011/0237815；美国专利申请公开号2012/0302710；国际公开号WO 2012/167171；美国专利申请公开号2012/0323000；美国专利申请公开号2013/0116434；国际公开号WO 2013/070725；美国专利申请公开号2013/0274482；美国专利申请公开号2013/0281706；国际公开号WO 2014/139679；国际公开号WO 2014/169014；美国专利申请公开号2014/0330018；以及美国专利申请公开号2014/0378637。
在本公开文本的方法中有用的催化剂还包括以下项中描述的那些：国际公开号WO2007/075427；美国专利申请公开号2007/0282148；国际公开号WO 2009/126831；国际公开号WO 2011/069134；美国专利申请公开号2012/0123133；美国专利申请公开号2013/0261312；美国专利申请公开号2013/0296511；国际公开号WO 2014/134333；以及美国专利申请公开号2015/0018557。
在本公开文本的方法中有用的催化剂还包括下表中列出的那些：
在本公开文本的方法中有用的催化剂还包括以下项中描述的那些：美国专利申请公开号2008/0009598；美国专利申请公开号2008/0207911；美国专利申请公开号2008/0275247；美国专利申请公开号2011/0040099；美国专利申请公开号2011/0282068；以及美国专利申请公开号2015/0038723。
在本公开文本的方法中有用的催化剂包括以下项中描述的那些：国际公开号WO2007/140954；美国专利申请公开号2008/0221345；国际公开号WO 2010/037550；美国专利申请公开号2010/0087644；美国专利申请公开号2010/0113795；美国专利申请公开号2010/0174068；国际公开号WO 2011/091980；国际公开号WO 2012/168183；美国专利申请公开号2013/0079515；美国专利申请公开号2013/0144060；美国专利申请公开号2013/0211096；国际公开号WO 2013/135776；国际公开号WO 2014/001291；国际公开号WO 2014/067767；美国专利申请公开号2014/0171607；以及美国专利申请公开号2015/0045558。
典型地，在反应混合物中以亚化学计量的量(例如，催化量)提供催化剂。在某些实施方案中，关于化学反应的限制试剂，该量在约0.001mol％至约50mol％的范围内，其取决于哪种试剂处于化学计量过量。在一些实施方案中，该催化剂以相对于限制试剂的小于或等于约40mol％存在。在一些实施方案中，该催化剂以相对于限制试剂的小于或等于约30mol％存在。在一些实施方案中，该催化剂以相对于限制试剂的小于约20mol％、小于约10mol％、小于约5mol％、小于约2.5mol％、小于约1mol％、小于约0.5mol％、小于约0.1mol％、小于约0.015mol％、小于约0.01mol％、小于约0.0015mol％或更小存在。在一些实施方案中，该催化剂以相对于限制试剂的约2.5mol％至约5mol％的范围存在。在一些实施方案中，该反应混合物含有约0.5mol％催化剂。在催化剂络合物的分子式包括多于一种金属的情况下，可以相应地调整反应中使用的催化剂络合物的量。
在一些情况下，本文所述的方法可以在不存在溶剂(例如，不掺水)的情况下进行。在一些情况下，这些方法可包括使用一种或多种溶剂。可适用于本公开文本的溶剂的例子包括但不限于苯、对甲酚、甲苯、二甲苯、二乙醚、乙二醇、二乙醚、石油醚、己烷、环己烷、戊烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二噁烷、四氢呋喃(THF)、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、六甲基磷酸三酰胺、乙酸乙酯、吡啶、三乙胺、皮考啉等，以及其混合物。在一些实施方案中，该溶剂选自苯、甲苯、戊烷、二氯甲烷和THF。在某些实施方案中，该溶剂是苯。
在一些实施方案中，该方法在减压下进行。在易位反应过程中可能产生挥发性副产物如乙烯的情况下，这可能是有利的。例如，从反应容器中除去乙烯副产物可有利地使易位反应的平衡转向形成所希望的产物。在一些实施方案中，该方法在约小于760托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于700托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于650托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于600托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于550托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于500托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于450托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于400托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于350托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于300托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于250托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于200托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于150托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于100托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于90托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于80托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于70托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于60托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于50托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于40托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于30托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约小于20托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约20托的压力下进行。
在一些实施方案中，该方法在约19托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约18托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约17托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约16托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约15托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约14托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约13托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约12托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约11托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约10托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约10托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约9托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约8托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约7托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约6托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约5托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约4托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约3托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约2托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在约1托的压力下进行。在一些实施方案中，该方法在小于约1托的压力下进行。
在一些实施方案中，两种易位反应物以等摩尔量存在。在一些实施方案中，两种易位反应物不以等摩尔量存在。在某些实施方案中，两种反应物按以下摩尔比率存在：约20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、或1:20。在某些实施方案中，两种反应物以约10:1的摩尔比存在。在某些实施方案中，两种反应物以约7:1的摩尔比存在。在某些实施方案中，两种反应物以约5:1的摩尔比存在。在某些实施方案中，两种反应物以约2:1的摩尔比存在。在某些实施方案中，两种反应物以约1:10的摩尔比存在。在某些实施方案中，两种反应物以约1:7的摩尔比存在。在某些实施方案中，两种反应物以约1:5的摩尔比存在。在某些实施方案中，两种反应物以约1:2的摩尔比存在。
通常，用本文公开的许多易位催化剂进行的反应提供的产率优于15％、优于50％、优于75％或优于90％。另外，选取反应物和产物以提供沸点上至少5℃的差异、大于20℃的差异或大于40℃的差异。此外，使用易位催化剂使得产物形成比副产物更快，尽可能快地运行这些反应是理想的。具体而言，以少于约24小时、少于12小时、少于8小时、或少于4小时进行反应。
本领域技术人员将会理解，时间、温度和溶剂可以相互依赖，并且在本公开文本的方法中改变一者可能需要改变其他的，以制备拟除虫菊酯产物和中间体。易位步骤可以在多个温度和时间下进行。通常，本公开文本的方法中的反应使用几分钟到几天的反应时间进行。例如，可以使用约12小时至约7天的反应时间。在一些实施方案中，可以使用1-5天的反应时间。在一些实施方案中，可以使用约10分钟至约10小时的反应时间。通常，本公开文本的方法中的反应在约0℃至约200℃的温度下进行。例如，反应可以在15℃-100℃下进行。在一些实施方案中，反应可以在20℃-80℃下进行。在一些实施方案中，反应可以在100℃-150℃下进行。
可以使用合适的还原剂还原不饱和脂肪酸酯，该还原剂可将该酯选择性还原为相应的醛或醇，但不会还原双键。使用二异丁基卤化铝(DIBAL)或可将不饱和脂肪酸酯还原为相应的不饱和脂肪醛。可以用例如DIBAL或将不饱和脂肪醛还原为相应的脂肪醇。在一些实施方案中，可使用AlH3或9-硼杂双环(3.3.1)壬烷(9-BBN)将不饱和脂肪酸酯还原为相应的脂肪醇。(参见Galatis,P.Encyclopedia of Reagents forOrganic Synthesis.2001.New York:John Wiley&Sons；and Carey&Sunderburg.OrganicChemistry,Part B:Reactions and Synthesis,5th edition.2007.New York.SpringerSciences.)。
在一些实施方案中，将酯部分还原为醛而不过度还原为醇可用于醛的合成。部分还原剂包括二异丁基叔丁氧基氢化铝锂(LDBBA)(Kim MS et al.(2007)TetrahedronLett.48:5061)和二异丁基叔丁氧基氢化铝钠(SDBBA)(Song JI and An DK(2007)Chem.Lett.36:886)。仲胺(例如，吗啉、N-甲基哌嗪或吡咯烷)的红铝(双[2-甲氧基乙氧基]氢化铝钠)衍生物可以用于酯或二酯的部分还原。在某些实施方案中，该还原剂包括大体积环状氮路易斯碱，以允许将不饱和脂肪酸酯选择性还原成脂肪醛。在一些实施方案中，通过使可商购的红铝与顺式-2,6-二甲基吗啉反应制备经修饰的红铝(Shin WK et al.(2014)Bull.Korean Chem.Soc.35:2169)。
通过使用过渡金属催化剂的氢解，还可以实现将酯还原成相应的醇。均相氢解催化剂的例子包括但不限于由Goussev等人(US 20160023200 A1)描述的VIII族催化剂，其全部内容并入本文。
由Goussev等人公开的催化剂或预催化剂可以呈式IV或V的过渡金属络合物的形式
M(PWNN)XkY (IV)
M(PWNWP)XkY (V)
其中M是过渡金属；
每个X同时或独立地表示氢或卤原子、C1-C5烷基、羟基或C1-C7烷氧基；
Y是CO、NO、卡宾、异腈、腈、亚磷酸酯、次亚膦酸酯或膦，如PMe3、PPh3、PCy3、P(iPr)3；
k是整数1或2；并且
PWNN和PWNWP是由式A表示的配体，
其中
每个R1、R2、R3和R4各自独立地为H、取代或未取代的直链或支链C1-C12烷基(如C1-C8烷基或C8-C12烷基)、取代或未取代的环状C3-C12烷基(如环状C3-C8烷基或环状C8-C12烷基)、取代或未取代的C3-C12烯基(如C3-C8烯基或C8-C12烯基)或取代或未取代的芳基或杂芳基，或者当与它们所附接的原子一起时，R2、R3、R4基团中任两个形成任选取代的饱和或部分饱和的环烷基，或任选取代的芳基或杂芳基；
W是氧原子或NH基团；
W'是氧或氮原子；
虚线存在并表示存在一个双键或者不存在；
R为不存在、H、取代或未取代的直链或支链C1-C12烷基(如C1-C8烷基或C8-C12烷基)、取代或未取代的环状C3-C12烷基(如环状C3-C8烷基或环状C8-C12烷基)、取代或未取代的C3-C12烯基(如C3-C8烯基或C8-C12烯基)或取代或未取代的芳基或杂芳基；
R’为H、取代或未取代的直链或支链C1-C12烷基(如C1-C8烷基或C8-C12烷基)、取代或未取代的环状C3-C12烷基(如环状C3-C8烷基或环状C8-C12烷基)、取代或未取代的C3-C12烯基(如C3-C8烯基或C8-C12烯基)或取代或未取代的芳基或杂芳基PR2，或者当R5和它们所附接的原子一起时，形成取代或未取代的杂芳基(其非限制性例子是吡啶基、呋喃基、咪唑基、吡唑基或噁唑基)；并且
n和m各自独立地为整数1或2
其中在PWNN配体中，W'是氮原子，并且在PWNWP配体中，W'是氧或氮原子，并且R'是PR2，并且
其中式IV或V的金属络合物是中性或阳离子的。
本申请还包括由Goussev等人(US 20160023200 A1)公开的催化剂的其他实施方案。
Saudan等人(美国专利号8,124,816)公开了用于将酯还原成相应醇的均相氢解催化剂的其他示例性实施方案，其全部内容并入本文。
由Saudan等人公开的钌络合物的催化剂或预催化剂可以呈离子或中性物质的形式。
根据本发明的实施方案，该钌络合物可以具有通式
[Ru(L4)Y2] (1)
[Ru(L4)(X)n(Y)2-n](Z)n (2)
其中L4表示四齿配体，其中配位基团由至少一个氨基或亚氨基和至少一个膦基组成；并且
每个Y同时或独立地表示CO、氢或卤原子、羟基或C1-C6烷氧基或羧基，或者还有BH4或AlH4基团；
X表示C3-C30单膦或溶剂；
Z表示非配位阴离子；并且
n为0、1或2。
具体而言，L4是四齿配体，如C8-C45化合物，其中配位基团由两个氨基或亚氨基和两个膦基组成，并且具体地该氨基是伯(即NH2)或仲(即NH)氨基。
在本发明的特定实施方案中，在式(1)或(2)中，每个Y同时或独立地表示氢或氯原子、羟基、C1-C6烷氧基，如甲氧基、乙氧基或异丙氧基，或C1-C6酰氧基，如CH3COO或CH3CH2COO基。更优选地，每个Y同时或独立地表示氢或氯原子、甲氧基、乙氧基或异丙氧基，或CH3COO或CH3CH2COO基。
在本发明的特定实施方案中，在式(2)中，X表示式PRd 3的单膦，其中Rd是C1-C12基团，如任选取代的直链、支链或环状烷基、烷氧基或芳氧基，取代的或未取代的苯基、二苯基或萘基或二萘基。更具体地，Rd可以表示取代或未取代的苯基、二苯基或萘基或二萘基。
X还可以是溶剂，术语“溶剂”必须根据本领域的通常含义来理解，并且包括在络合物的制备中或在本发明方法期间用作稀释剂的化合物，非限制性例子是二甲亚砜、乙腈、二甲基甲酰胺、醇(例如C1-C4醇)、或者还有THF、丙酮、吡啶或C3-C8酯或本发明方法的底物。
在本发明的特定实施方案中，在式(2)中，Z表示卤原子、羟基或C1-C6烷氧基、苯氧基或羧基。
通常出于实际原因，式(1)的络合物表示本发明的优选实施方案。
L4四齿配体的实施方案如Saudan等人所公开。本申请包括由Saudan等人(美国专利号8,124,816)公开的催化剂的其他实施方案。
可以通过氧化步骤将脂肪醇氧化成脂肪醛。在一些实施方案中，该氧化步骤包括一种或多种部分氧化方法。在某些实施方案中，该一种或多种部分氧化方法包括NaOCl/TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基)。通过短时间运行，该氧化可以在醛阶段处停止。可替代地，可以通过添加相转移催化剂使其进入羧酸阶段，该相转移催化剂引起氧化的大的加速。其全部内容并入本文的美国专利号6,127,573描述了使用CaClO3和NaClO用TEMPO催化剂将伯醇氧化成羧酸的方法。Zhao et al.,Organic Synthesis,Vol.81,p.195(2005)描述了用由TEMPO和漂白剂催化的亚氯酸钠将伯醇氧化成羧酸。
在TEMPO氧化中，二级氧化剂在作为主要氧化剂的氧代铵盐中转化TEMPO或相关的稳定基团，从而将醇转化为相应的醛。这导致形成羟胺，其被氧化成TEMPO基，从而实现催化循环。
来自Tojo G.and Fernandez,MI.Oxidation of Primary Alcohols toCarboxylic Acids:A Guide to Current Common Practice.2007,XVI,116p.ISBN:978-0-387-35431-6,Chapter 6—TEMPO-mediated Oxidations
TEMPO介导的伯醇转化为醛和羧酸中最常见的化学计量氧化剂是：次氯酸钠(NaOCl)(Anelli氧化，Anelli PL.et al.(1987)J.Org.Chem.52:2559)；亚氯酸钠(NaClO2)(Zhao修改的Anelli氧化，Zhao M et al.(1999)J.Org.Chem.64:2564)；以及PhI(OAc)2(Epp和Widlanski的氧化，Epp JB and Widlanski TS(1999)J.Org.Chem.64:293)。其他较少使用的化学计量氧化剂包括：MCPBA(Cella JA et al.(1975)J.Org.Chem.40:1860)；Ca(ClO)2(游泳池漂白剂，Ying L and Gervay-Hague J(2003)Carbohydr.Res.338:835)；t-BuOCl(Li K and Helm RF(1995)Carbohydr.Res.273:249；Rye CS and Withers SG(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9756)；CuCl-O2(Semmelhack MF et al.(1984)J.Am.Chem.Soc.106:3374)；NaBrO2(Inokuchi T et al.(1990)J.Org.Chem.55:462)；Cl2(Merbouh N et al.(2002)J.Carbohydr.Res.21:65)；Br2(Merbouh et al.2002)；以及三氯异氰尿酸(De LucaL et al.(2003)J.Org.Chem.68:4999)。可以在催化TEMPO存在下在电化学条件下进行该氧化(Schnatbaum K and Schafer HJ(1999)Synthesis 5:864)。
在一些实施方案中，其他二叔烷基硝酰基，如4,4-二甲基噁唑烷-N-氧基(DOXYL)、2,2,5,5-四甲基吡咯烷-N-氧基(PROXYL)和4-羟基-TEMPO及其衍生物以及WO 95/07303中描述的那些可以代替TEMPO。
在其他实施方案中，该氧化步骤包括如由McCann和Stahl 2015所述的铜催化的有氧氧化(McCann SD and Stahl SS(2015)Acc.Chem.Res.48:1756-1766)，其全部内容并入本文。
信息素组合物及其用途
在一个方面，提供了通过本文公开的从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的任何方法产生的一种或多种组合物。
呈能够使用本文所述的重组微生物和方法生成的脂肪醇、脂肪醛或脂肪乙酸酯形式的示例性昆虫信息素包括但不限于(Z)-11-十六碳烯醛、(Z)-11-十六碳烯基乙酸酯、(Z)-9-十四碳烯基乙酸酯、(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛、(9Z,11E)-十六碳二烯醛、(E,E)-8,10-十二碳二烯-1-醇、(7E,9Z)-十二碳二烯基乙酸酯、(Z)-3-壬烯-1-醇、(Z)-5-癸烯-1-醇、(Z)-5-癸烯基乙酸酯、(E)-5-癸烯-1-醇、(E)-5-癸烯基乙酸酯、(Z)-7-十二碳烯-1-醇、(Z)-7-十二碳烯基乙酸酯、(E)-8-十二碳烯-1-醇、(E)-8-十二碳烯基乙酸酯、(Z)-8-十二碳烯-1-醇、(Z)-8-十二碳烯基乙酸酯、(Z)-9-十二碳烯-1-醇、(Z)-9-十二碳烯基乙酸酯、(Z)-9-十四碳烯-1-醇、(Z)-11-十四碳烯-1-醇、(Z)-11-十四碳烯基乙酸酯、(E)-11-十四碳烯-1-醇、(E)-11-十四碳烯基乙酸酯、(Z)-7-十六碳烯-1-醇、(Z)-7-十六碳烯醛、(Z)-9-十六碳烯-1-醇、(Z)-9-十六碳烯醛、(Z)-9-十六碳烯基乙酸酯、(Z)-11-十六碳烯-1-醇、(Z)-13-十八碳烯-1-醇和(Z)-13-十八碳烯醛。
如上所述，通过本文描述的方法制备的产品是信息素。可以配制根据本发明的方法制备的信息素用作昆虫控制组合物。该信息素组合物可以包括载体，和/或含在分配器中。该载体可以是但不限于惰性液体或固体
固体载体的例子包括但不限于填充剂如高岭土、膨润土、白云石、碳酸钙、滑石、氧化镁粉、富勒土、蜡、石膏、硅藻土、橡胶、塑料、瓷土，矿物土如二氧化硅、硅胶、硅酸盐、粘土、石灰石、白垩、黄土、粘土、白云石、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁，磨碎的合成材料，肥料如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、硫脲和尿素，植物来源的产物如谷物粉、树皮粉、木粉和坚果壳粉，纤维素粉，绿坡缕石，蒙脱土，云母，蛭石，合成二氧化硅和合成硅酸钙，或这些的组合物。
液体载体的例子包括但不限于水；醇，如乙醇、丁醇或二醇，以及它们的醚或酯，如甲基乙二醇乙酸酯；酮，如丙酮、环己酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或异佛尔酮；烷烃，如己烷、戊烷或庚烷；芳族烃，如二甲苯或烷基萘；矿物油或植物油；脂族氯化烃，如三氯乙烷或二氯甲烷；芳香族氯化烃，如氯苯；水溶性或强极性溶剂，如二甲基甲酰胺、二甲亚砜或N-甲基吡咯烷酮；液化气体；蜡，如蜂蜡、羊毛脂、紫胶蜡、巴西棕榈蜡、果蜡(如杨梅或甘蔗蜡)、小烛树蜡，其他蜡如微晶、地蜡、矿蜡或褐煤蜡；盐，如单乙醇胺盐、硫酸钠、硫酸钾、氯化钠、氯化钾、乙酸钠、硫酸氢铵、氯化铵、乙酸铵、甲酸铵、草酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、硫代硫酸铵、二磷酸氢铵、单磷酸二氢铵、磷酸氢铵钠、硫氰酸铵、氨基磺酸铵或氨基甲酸铵，以及其混合物。也可以将诱饵或摄食刺激剂添加到载体中。
增效剂
在一些实施方案中，该信息素组合物与活性化学试剂组合，从而产生协同效应。可以根据Colby公式(即(E)＝X+Y-(X*Y/100))来量化由所传授的方法获得的协同效应。参见Colby,R.S.,“Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of HerbicideCombinations”,1967Weeds,vol.15,pp.20-22，通过引用将其全部内容并入本文。因此，“协同”是指由于其存在而将所希望的效果增加超过加和量的组分。本发明方法的信息素组合物和佐剂可以协同增加农业活性化合物以及农业辅助化合物的有效性。
因此，在一些实施方案中，可以用增效剂配制信息素组合物。如本文所用，术语“增效剂”是指可与信息素一起使用的物质，来减少用于吸引至少一个昆虫物种的信息素剂量的量或增强信息素有效性。在没有信息素的情况下，增效剂可能是也可能不是昆虫的独立引诱剂。
在一些实施方案中，该增效剂是吸引至少一个鳞翅目物种的挥发性植物化学物质。如本文所用，术语“植物化学物质”意指在植物物种中天然存在的化合物。在具体的实施方案中，该增效剂选自β-石竹烯、异石竹烯、α-律草烯、里哪醇、Z3-己烯醇基乙酸酯、β-法呢烯、苯甲醛、苯乙醛及其组合。
该信息素组合物可以含有混合或其他组合形式的信息素和增效剂，或者它可以独立地含有处于非混合形式的信息素和增效剂。
杀昆虫剂
该信息素组合物可以包括一种或多种杀昆虫剂。在一个实施方案中，这些杀昆虫剂是本领域技术人员已知的化学杀昆虫剂。化学杀昆虫剂的例子包括以下项中的一种或多种：拟除虫菊酯或有机磷杀昆虫剂，包括但不限于氟氯氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯(bifinthrin)、氰戊菊酯、氟氰菊酯、谷硫磷、甲基对硫磷、噻嗪酮、吡丙醚、氟啶虫酰胺、啶虫脒、呋虫胺、可尼丁、高灭磷、马拉硫磷、喹诺磷、氯吡磷、丙硫磷、苯二烃、双氰菊酯、毒死蜱、氟氯氰菊酯、噻嗪农、除虫菊酯、甲氰菊酯、烯虫炔酯、杀虫皂或油、新烟碱类、二酰胺类、阿维菌素及其衍生物、多杀菌素及其衍生物、印楝素、啶虫丙醚(pyridalyl)，以及其混合物。
在另一个实施方案中，这些杀昆虫剂是本领域技术人员已知的一种或多种生物杀昆虫剂。生物杀昆虫剂的例子包括但不限于印楝素(印楝油(neem oil))、来自天然除虫菊酯的毒素，苏云金芽孢杆菌和球孢白僵菌、病毒(例如，CYD-XTM、CYD-X HPTM、GermstarTM、Madex HPTM和Spod-XTM)、肽(Spear-TTM、Spear-PTM和Spear-CTM)
在另一个实施方案中，这些杀昆虫剂是靶向神经和肌肉的杀昆虫剂。例子包括：乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂(如氨基甲酸酯(例如，灭多威和硫双灭多威)和有机磷酸酯(例如，毒死蜱)GABA-门控氯通道拮抗剂，如环二烯有机氯(例如，硫丹)和苯基吡唑(例如，氟虫腈))，钠通道调节剂(如除虫菊酯和拟除虫菊酯(例如，氯氰菊酯和λ-三氯氟氰菊酯))，烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)激动剂(如新烟碱类(例如，啶虫脒、噻虫啉、噻虫嗪))，烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)变构调节剂(如多杀菌素(例如，spinose和乙基多杀菌素(spinetoram))，氯化物通道活化剂(如阿维菌素和米尔倍霉素(例如，阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐))，烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)阻断剂(如杀虫磺和杀螟丹)，电压依赖性钠通道阻断剂(如茚虫威和氰氟虫胺)，兰尼碱受体调节剂(如二酰胺(例如，氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺))。在另一个实施方案中，这些杀昆虫剂是靶向呼吸的杀昆虫剂。例子包括通过破坏质子梯度使氧化磷酸化解偶联的化学物质，如溴虫腈和线粒体复合物I电子传递抑制剂。
在另一个实施方案中，这些杀昆虫剂是靶向中肠的杀昆虫剂。例子包括昆虫的中肠膜的微生物干扰者，如苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)。
在另一个实施方案中，这些杀昆虫剂是靶向生长和发育的杀昆虫剂。例子包括保幼激素模拟物(如保幼激素类似物(例如，苯氧威))，几丁质生物合成抑制剂(0型，如苯甲酰脲(例如，氟虫脲、氟苯脲和诺瓦龙))，以及蜕皮激素受体激动剂(如二酰肼(例如，甲氧虫酰肼和虫酰肼))。
稳定剂
根据本公开文本的另一个实施方案，该信息素组合物可包括一种或多种增强该组合物的稳定性的添加剂。添加剂的例子包括但不限于脂肪酸和植物油，如例如橄榄油、大豆油、玉米油、红花油、芥花油及其组合。
填充剂
根据本公开文本的另一个实施方案，该信息素组合物可以包括一种或多种填充剂。填充剂的例子包括但不限于一种或多种矿物粘土(例如，绿坡缕石)。在一些实施方案中，该引诱剂-组合物可以包括一种或多种有机增稠剂。这种增稠剂的例子包括但不限于甲基纤维素、乙基纤维素及其任何组合。
溶剂
根据另一个实施方案，本公开文本的信息素组合物可以包括一种或多种溶剂。当使用者采用液体组合物时，理想的是含有溶剂的组合物，可以通过刷涂、浸涂、滚涂、喷涂或以其他方式将液体组合物施加到用户希望提供信息素涂层(例如，诱饵)的底物上。在一些实施方案中，选择要使用的一种或多种溶剂以增溶或基本增溶该信息素组合物的一种或多种成分。溶剂的例子包括但不限于水、水性溶剂(例如，水和乙醇的混合物)、乙醇、甲醇、氯化烃、石油溶剂、松节油、二甲苯及其任何组合。
在一些实施方案中，本公开文本的信息素组合物包含有机溶剂。有机溶剂主要用于配制可乳化浓缩物、ULV配制品，并且在较小程度上用于配制粒状配制品。有时使用溶剂的混合物。在一些实施方案中，本公开文本传授使用包括脂族石蜡油如煤油或精制石蜡的溶剂。在其他实施方案中，本公开文本传授使用芳族溶剂，如二甲苯以及C9和C10芳族溶剂的更高分子量级分。在一些实施方案中，当该配制品被乳化成水时，氯化烃可用作共溶剂以防止结晶。醇有时被用作共溶剂来增加溶剂的能力。
增溶剂
在一些实施方案中，本公开文本的信息素组合物包含增溶剂。增溶剂是一种表面活性剂，它将在浓度高于临界胶束浓度时在水中形成胶束。然后胶束能够在该胶束的疏水部分内部溶解或增溶不溶于水的物质。通常用于增溶的表面活性剂的类型为非离子表面活性剂：脱水山梨醇单油酸酯；脱水山梨醇单油酸酯乙氧基化物；和油酸甲酯。
粘合剂
根据本公开文本的另一个实施方案，该信息素组合物可以包括一种或多种粘合剂。可使用粘合剂来促进该信息素组合物与涂覆了所述组合物的材料表面的缔合。在一些实施方案中，可使用粘合剂来促进另一种添加剂(例如杀昆虫剂、昆虫生长调节剂等)与该信息素组合物和/或材料表面的缔合。例如，粘合剂可以包括典型地用于油漆和涂层的合成或天然树脂。这些可以被修饰以使涂覆的表面足够脆弱以允许昆虫咬掉并摄入该组合物的组分(例如，杀昆虫剂、昆虫生长调节剂等)，同时仍保持涂层的结构完整性。
粘合剂的非限制性例子包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、部分水解的聚乙酸乙烯酯、羧甲基纤维素、淀粉、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物和聚乙酸乙烯酯、或这些的组合物；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钠、滑石或聚乙二醇、或这些的组合物；消泡剂(如硅酮乳液、长链醇、磷酸酯、乙炔二醇、脂肪酸或有机氟化合物)以及络合剂(如：乙二胺四乙酸(EDTA)盐、三硝基三乙酸盐或多磷酸盐，或者这些的组合物)。
在一些实施方案中，该粘合剂还起到填充剂和/或增稠剂的作用。此类粘合剂的例子包括但不限于以下项中的一种或多种：虫胶、丙烯酸树脂、环氧树脂、醇酸树脂、聚氨酯、亚麻籽油、桐油及其任何组合。
表面活性剂
在一些实施方案中，该信息素组合物包含表面活性剂。在一些实施方案中，向液态农业组合物中添加该表面活性剂。在其他实施方案中，将该表面活性剂添加到固体配制品中，尤其是设计成在施用前用载体稀释的那些。因此，在一些实施方案中，该信息素组合物包含表面活性剂。有时使用表面活性剂，无论是单独使用还是与其他添加剂(如矿物油或植物油，作为喷雾罐混合物的佐剂)一起使用，以改进该信息素对靶标的生物学性能。表面活性剂可以是阴离子型、阳离子型或非离子型，并且可用作乳化剂、润湿剂、悬浮剂或其他目的。在一些实施方案中，该表面活性剂是非离子型的，如：烷基乙氧基化物、直链脂肪醇乙氧基化物和脂族胺乙氧基化物。常规用于配制品领域并且也可用于本发明配制品的表面活性剂描述于McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual,MC Publishing Corp.,Ridgewood,N.J.,1998,and in Encyclopedia of Surfactants,Vol.I-III,ChemicalPublishing Co.,New York,1980-81。在一些实施方案中，本公开文本传授使用表面活性剂，该表面活性剂包括芳族磺酸(例如木质素磺酸、苯酚磺酸、萘磺酸和二丁基萘磺酸)的碱金属盐、碱土金属盐或铵盐，以及芳基磺酸酯的脂肪酸、烷基醚、月桂基醚、脂肪醇硫酸酯和脂肪醇乙二醇醚硫酸酯的碱金属盐、碱土金属盐或铵盐，磺化萘及其衍生物与甲醛的缩合物，萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物，苯酚或苯酚磺酸与甲醛的缩合物，苯酚与甲醛和亚硫酸钠的缩合物，聚氧乙烯辛基苯基醚，乙氧基化的异辛基苯酚、辛基苯酚或壬基苯酚，三丁基苯基聚乙二醇醚，烷基芳基聚醚醇，异十三烷基醇，乙氧基化蓖麻油，乙氧基化三芳基苯酚，磷酸化三芳基苯酚乙氧基化物盐，月桂醇聚乙二醇醚乙酸酯，山梨醇酯，木质素-亚硫酸盐废液或甲基纤维素，或这些的组合物。
在一些实施方案中，本公开文本传授了其他合适的表面活性剂，包括烷基硫酸盐，如月桂基硫酸二乙醇铵；烷基芳基磺酸盐，如十二烷基苯磺酸钙；烷基苯酚-氧化烯加成产物，如乙氧基化壬基苯酚-C18；醇-氧化烯加成产物，如乙氧基化十三烷醇-C16；皂，如硬脂酸钠；烷基萘磺酸盐，如二丁基-萘磺酸钠；磺基琥珀酸盐的二烷基酯，如二(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠；山梨醇酯，如山梨醇油酸酯；季胺，如月桂基三甲基氯化铵；脂肪酸的聚乙二醇酯，如聚乙二醇硬脂酸酯；环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物；单和二烷基磷酸酯的盐；植物油，如大豆油、菜籽油/芥花油、橄榄油、蓖麻油、葵花籽油、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、棕榈油、花生油、红花油、芝麻油、桐油等；以及上述植物油的酯，特别是甲酯。
润湿剂
在一些实施方案中，该信息素组合物包含润湿剂。润湿剂是当添加到液体中时，通过降低液体与其铺展的表面之间的界面张力来增加该液体的铺展力或渗透力的一种物质。润湿剂用于农业化学配制品中的两个主要功能：在加工和生产过程中，用于增加粉末在水中的润湿速率，以便为可溶性液体或悬浮浓缩物制备浓缩物；并且在产物与水在喷雾罐或其他容器中混合期间，用以减少可湿性粉剂的润湿时间并改进水向水分散性颗粒的渗透。在一些实施方案中，用于本公开文本的信息素组合物(包括可湿性粉剂、悬浮浓缩物和水分散性颗粒配制品)中的润湿剂的例子是：月桂基硫酸钠；二辛基磺基琥珀酸钠；烷基苯酚乙氧基化物；和脂肪醇乙氧基化物。
分散剂
在一些实施方案中，本公开文本的信息素组合物包含分散剂。分散剂是吸附在颗粒表面并有助于保持颗粒分散状态并防止它们重新聚集的物质。在一些实施方案中，将分散剂添加到本公开文本的信息素组合物中以促进制造过程中的分散和悬浮，并确保颗粒再分散到喷雾罐中的水中。在一些实施方案中，分散剂用于可湿性粉剂、悬浮浓缩物和水分散性颗粒剂中。用作分散剂的表面活性剂具有强力吸附到颗粒表面的能力，并为颗粒的重新聚集提供带电屏障或空间屏障。在一些实施方案中，最常用的表面活性剂是阴离子型、非离子型或两种类型的混合物。
在一些实施方案中，对于可湿性粉剂配制品，最常见的分散剂是木质素磺酸钠。在一些实施方案中，悬浮浓缩物使用聚电解质如萘磺酸钠甲醛缩合物提供非常好的吸附和稳定性。在一些实施方案中，还使用三苯乙烯基苯酚乙氧基化磷酸酯。在一些实施方案中，如烷基芳基环氧乙烷缩合物和EO-PO嵌段共聚物有时与阴离子表面活性剂组合作为悬浮浓缩物的分散剂。
聚合物表面活性剂
在一些实施方案中，本公开文本的信息素组合物包含聚合物表面活性剂。在一些实施方案中，该聚合物表面活性剂具有非常长的疏水“主链”和大量形成“梳子”表面活性剂的“齿”的环氧乙烷链。在一些实施方案中，这些高分子量聚合物可以为悬浮浓缩物给出非常好的长期稳定性，因为疏水性主链在颗粒表面上具有许多锚定点。在一些实施方案中，本公开文本的信息素组合物中使用的分散剂的例子是：木质素磺酸钠；萘磺酸钠甲醛缩合物；三苯乙烯基苯酚乙氧基化物磷酸酯；脂肪醇乙氧基化物；烷基乙氧基化物；EO-PO嵌段共聚物；和接枝共聚物。
乳化剂
在一些实施方案中，本公开文本的信息素组合物包含乳化剂。乳化剂是一种物质，它可以稳定一种液相的液滴在另一种液相中的悬浮液。如果没有乳化剂，两种液体会分离成两个不混溶的液体相。在一些实施方案中，最常用的乳化剂共混物包括具有12个或更多个环氧乙烷单元的烷基苯酚或脂肪醇和十二烷基苯磺酸的油溶性钙盐。亲水-亲油平衡(“HLB”)值范围为8至18，一般会提供良好的稳定乳液。在一些实施方案中，乳液稳定性有时可通过添加少量EO-PO嵌段共聚物表面活性剂来改进。
胶凝剂
在一些实施方案中，该信息素组合物包含胶凝剂。增稠剂或胶凝剂主要用于配制悬浮浓缩物、乳液和悬乳液，以修饰液体的流变性或流动性并防止分散的颗粒或液滴沉降。增稠剂、胶凝剂和抗沉降剂通常分为两类，即水不溶性微粒和水溶性聚合物。可以使用粘土和二氧化硅生产悬浮浓缩物配制品。在一些实施方案中，该信息素组合物包含一种或多种增稠剂，包括但不限于：蒙脱土，例如膨润土；硅酸铝镁；和绿坡缕石。在一些实施方案中，本公开文本传授使用多糖作为增稠剂。最常用的多糖类型是种子和海藻的天然萃取物或纤维素的合成衍生物。一些实施方案利用黄原胶，并且一些实施方案利用纤维素。在一些实施方案中，本公开文本传授使用增稠剂，包括但不限于：瓜尔胶；刺槐豆胶；角叉菜胶；藻酸酯；甲基纤维素；羧甲基纤维素钠(SCMC)；羟乙基纤维素(HEC)。在一些实施方案中，本公开文本传授使用其他类型的抗沉降剂，如改性淀粉、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇和聚环氧乙烷。另一种好的抗沉降剂是黄原胶。
消泡剂
在一些实施方案中，降低界面张力的表面活性剂的存在会导致水基配配制品在生产中的混合操作过程中起泡和通过喷雾罐施用时起泡。因此，在一些实施方案中，为了减少起泡趋势，通常在生产阶段中或在灌装到瓶/喷雾罐中之前添加消泡剂。一般来说，有两种类型的消泡剂，即硅酮和非硅酮。硅酮通常是二甲基聚硅氧烷的水性乳液，而非硅酮消泡剂是水不溶性油，如辛醇和壬醇，或二氧化硅。在这两种情况下，消泡剂的功能都是从气-水界面置换表面活性剂。
防腐剂
在一些实施方案中，该信息素组合物包含防腐剂。
额外的活性剂
根据本公开文本的另一个实施方案，该信息素组合物可以包括一种或多种昆虫摄食刺激剂。昆虫进食刺激剂的例子包括但不限于粗棉籽油、植醇的脂肪酸酯、香叶基香叶醇的脂肪酸酯、其他植物醇的脂肪酸酯、植物萃取物及其组合。
根据本公开文本的另一个实施方案，该信息素组合物可以包括一种或多种生长调节剂(“IGR”)。可使用IGR来改变昆虫的生长并产生变形的昆虫。昆虫生长调节剂的例子包括例如敌灭灵(dimilin)。
根据本公开文本的另一个实施方案，该引诱剂-组合物可以包括一种或多种昆虫杀菌剂，其使所捕获的昆虫绝育或以其他方式阻断其繁殖能力，从而减少下一代的种群。在一些情况下，允许绝育的昆虫存活并与未捕获的昆虫竞争配偶比直接杀灭它们更有效。
可喷雾组合物
在一些实施方案中，本文公开的信息素组合物可以配制成可喷雾组合物(即，可喷雾信息素组合物)。可以在可喷雾组合物中使用水性溶剂，例如，水或水与一种醇、乙二醇、酮或其他水混溶性溶剂的混合物。在一些实施方案中，这种混合物的水含量为至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一些实施方案中，该可喷雾组合物是浓缩物，即信息素和其他添加剂(例如，蜡质物质、稳定剂等)在水性溶剂中的浓缩悬浮液，并且可以通过添加溶剂(例如水)稀释至最终使用浓度。
在一些实施方案中，蜡状物质可以用作可喷雾组合物中信息素及其位置异构体的载体。蜡状物质可以是例如生物可降解蜡如蜂蜡、巴西棕榈蜡等、小烛树蜡(烃蜡)、褐煤蜡、虫胶和相似的蜡，饱和或不饱和脂肪酸如月桂酸、棕榈酸、油酸或硬脂酸，脂肪酸酰胺和酯，羟基脂肪酸酯如羟乙基或羟丙基脂肪酸酯，脂肪醇，以及低分子量聚酯如聚亚烷基琥珀酸酯。
在一些实施方案中，稳定剂可以与可喷雾信息素组合物一起使用。可使用稳定剂来调节浓缩物的粒径和/或制备稳定的信息素组合物悬浮液。在一些实施方案中，该稳定剂选自羟基和/或乙氧基化聚合物。例子包括环氧乙烷和环氧丙烷共聚物、多元醇(包括淀粉、麦芽糖糊精和其他可溶性碳水化合物或其醚或酯)、纤维素醚、明胶、聚丙烯酸及其盐和偏酯等。在其他实施方案中，该稳定剂可以包括聚乙烯醇及其共聚物，如部分水解的聚乙酸乙烯酯。可以以足以调节粒度和/或制备稳定悬浮液的量使用稳定剂，例如在水溶液的0.1％至15％之间。
在一些实施方案中，粘合剂可以与可喷雾信息素组合物一起使用。在一些实施方案中，该粘合剂可用来进一步稳定分散体和/或改进喷雾分散体与靶标场所(例如，诱捕器、诱饵、植物等)的粘附。该粘合剂可以是多糖(如藻酸盐)、纤维素衍生物(乙酸纤维素、烷基纤维素、羧甲基纤维素、羟烷基纤维素)、淀粉或淀粉衍生物、糊精、树胶(阿拉伯树胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、黄蓍胶、角叉菜胶等)、蔗糖等等。粘合剂还可以是非碳水化合物，水溶性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，或酸和/或盐形式的酸性聚合物如聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸，或此类聚合物的混合物。
微囊化信息素
在一些实施方案中，本文公开的信息素组合物可以配制为微囊化的信息素，如描述于Ill’lchev,AL et al.,J.Econ.Entomol.2006；99(6):2048-54；以及Stelinki,LL etal.,J.Econ.Entomol.2007；100(4):1360-9。微囊化信息素(MEC)是封闭在胶囊内的小滴信息素。该胶囊控制信息素释放到周围环境中的速率，并且对于应用在喷雾所用的相同方法中施用来说足够小。尤其取决于气候条件、胶囊大小和化学性质，微囊化信息素配制品的有效田间寿命范围可以为几天到略多于一周。
缓释配制品
信息素组合物可以配制为缓慢释放到大气中，和/或在释放后保护其免于降解。例如，信息素组合物可以包括在载体如微胶囊、生物可降解薄片和基于石蜡的基质中。可替代地，该信息素组合物可以配制成缓释可喷雾剂。
在某些实施方案中，该信息素组合物可以包括本领域技术人员已知的一种或多种聚合物试剂。该聚合物试剂可以控制该组合物释放到环境中的速率。在一些实施方案中，该聚合物引诱剂-组合物不受环境条件影响。该聚合物试剂也可以是持续释放剂，其使得该组合物能够以持续的方式释放到环境中。
聚合物试剂的例子包括但不限于纤维素、蛋白质如酪蛋白、基于氟碳的聚合物、氢化松香、木质素、三聚氰胺、聚氨酯、乙烯基聚合物如聚乙酸乙烯酯(PVAC)、聚碳酸酯、聚偏二乙烯二腈(polyvinylidene dinitrile)、聚酰胺、聚乙烯醇(PVA)、聚酰胺-醛、聚乙烯醛、聚酯、聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯、聚苯乙烯、聚偏二乙烯、硅酮及其组合。纤维素的例子包括但不限于甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、乙酸-丁酸纤维素、乙酸-丙酸纤维素、丙酸纤维素及其组合。
可以用于缓释或持续释放配制品的其他试剂包括脂肪酸酯(如癸二酸酯、月桂酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯或花生酸酯)或脂肪醇(如十一醇、十二醇、十三醇、十三醇、十四醇、十四碳烯醇、十四碳二烯醇、十五醇、十五碳烯醇、十六醇、十六碳烯醇、十六碳二烯醇、十八碳烯醇和十八碳二烯醇)。
可使用根据本发明的方法制备的信息素以及含有该信息素的组合物来控制昆虫在各种环境中的行为和/或生长。例如，该信息素可用于吸引或排斥雄性或雌性昆虫进出特定靶标区域。可使用信息素来吸引易感作物区域的昆虫。信息素也可以用来吸引昆虫，作为昆虫监测、大规模捕获、引诱/吸引并杀灭或交配干扰策略的一部分。
诱饵
本公开文本的信息素组合物可以涂覆或喷涂在诱饵上，或者诱饵可以用信息素组合物浸渍。
诱捕器
本公开文本的信息素组合物可用于诱捕器，如通常用于吸引任何昆虫物种(例如，鳞翅目昆虫)的那些。这样的诱捕器对于本领域技术人员是公知的，并且通常用于许多州和国家的昆虫根除计划中。在一个实施方案中，诱捕器包括用于容纳该信息素组合物的一个或多个中隔、容器或贮器。因此，在一些实施方案中，本公开文本提供装载有至少一种信息素组合物的诱捕器。因此，本公开文本的信息素组合物可用于诱捕器中，例如用于诱捕昆虫，作为昆虫监测、大规模捕获、交配干扰或引诱/吸引并杀灭策略的一部分，例如通过将毒性物质掺入诱捕器来杀灭捕获的昆虫。
大规模捕获包括将高密度的诱捕器放在要保护的作物中，以便在作物受到损害之前将大部分昆虫清除。诱饵/吸引并杀灭技术是相似的，除了一旦昆虫被诱饵吸引，它就会经受杀灭剂。如果该杀灭剂是杀昆虫剂，分配器也可以含有诱饵或摄食刺激剂，其将诱使昆虫摄取有效量的杀昆虫剂。该杀昆虫剂可以是本领域技术人员已知的杀昆虫剂。可将杀昆虫剂与引诱剂-组合物混合或可分开存在于诱捕器中。混合物可以发挥吸引和杀灭昆虫的双重功能。
这种诱捕器可以采取任何适当的形式，并且杀灭诱捕不一定需要掺入有毒物质，这些昆虫可以通过其他手段如溺水或电击来杀灭。可替代地，诱捕器可以用会在后期杀灭昆虫的真菌或病毒来污染昆虫。即使在昆虫没有被杀灭时，诱捕器也可以用来从雌性昆虫的场所除去雄性昆虫以防止繁殖。
本领域的技术人员将会理解，多种不同的诱捕器都是可能的。这种诱捕器的适当例子包括水诱捕器、粘性诱捕器和单向诱捕器。粘性诱捕器有许多种类。粘性诱捕器的一个例子是纸板结构，横截面为三角形或楔形，其内表面涂有非干燥粘性物质。昆虫接触粘性表面并被捕获。水诱捕器包括用于捕获昆虫的水和洗涤剂的盘状器皿。该洗涤剂破坏水的表面张力，导致被吸引到盘状器皿的昆虫在水中淹死。单向诱捕器允许昆虫进入诱捕器但阻止其退出。本公开文本的诱捕器可以明亮地着色，以为昆虫提供额外的吸引力。
在一些实施方案中，含有该组合物的信息素诱捕器可以与其他种类的捕获机制组合。例如，除该信息素组合物之外，诱捕器可以包括一个或多个荧光灯、一种或多种粘性物质和/或用于吸引飞蛾的一个或多个着色表面。在其他实施方案中，含有该组合物的信息素诱捕器可以不具有其他种类的捕获机制。
诱捕器可能在一年中的任何时间在田中设置。本领域技术人员可以容易地确定适用于特定诱捕器的组合物的量，并且还可以确定要保护的作物田的适当密度(诱捕器数/英亩)。
诱捕器可以放置在被昆虫侵染(或可能侵染)的区域。通常，诱捕器放置在树木或植物上或附近。信息素的香气将昆虫吸引到诱捕器。然后可以将该昆虫在诱捕器内捕获、固定和/或杀灭，例如，通过存在于诱捕器中的杀灭剂。
诱捕器也可能被放置在果园内以覆盖雌性发射的信息素，因此雄性根本无法定位雌性。在这方面，诱捕器需要的不过是一个简单的装置，例如，受保护的可分配信息素的灯芯(wickable)。
本公开文本的组合物可以制成形式提供，其中已经施加了本公开文本的化合物。在这种情况下，取决于化合物的半衰期，可将该化合物暴露，或可以常规方式密封，如与其他芳香剂分配器一起使用，一旦诱捕器就位，则密封件只能被移除。
可替代地，诱捕器可以单独出售，并且本公开文本的化合物以非必需形式提供，使得一旦诱捕器就位，就可以将一个量应用于诱捕器。因此，在本公开文本中可以在小袋或其他分配器中提供该化合物。
分配器
信息素组合物可以与分配器结合使用，以在特定环境中释放该组合物。可以使用本领域已知的任何适合的分配器。此类分配器的例子包括但不限于气溶胶发射器，手工分配器，包含具有缓慢释放信息素的可渗透屏障的贮存器的泡罩，由橡胶构成的垫、珠、管棒、螺旋状物或球，用信息素组合物浸渍的塑料、皮革、棉花、棉绒、木材或木制品。例如，聚氯乙烯层压材料、丸粒、颗粒、蒸发出信息素组合物的绳索或螺旋状物、或橡胶隔片。本领域技术人员将能够选择合适的载体和/或分配器以用于希望的施用模式、存储、运输或处理。
在另一个实施方案中，可以使用如下装置，该装置用含有信息素物质本身的粉末污染雄性昆虫。然后受污染的雄性会飞出，并通过向大气中渗透该信息素物质或通过吸引其他雄性到达受污染的雄性而不是真正的雌性来提供交配干扰的来源。
行为修饰
根据本文公开的方法制备的信息素组合物可用于控制或调节昆虫的行为。在一些实施方案中，靶标昆虫的行为尤其可以通过改变组合物中信息素与位置异构体的比率以可调方式进行调节，使得该昆虫被吸引到特定场所但不接触所述场所，或使得该昆虫实际上接触所述场所。因此，在一些实施方案中，可使用信息素来吸引易感作物区域的昆虫。因此，本公开还提供了将昆虫吸引到场所的方法。该方法包括向某个场所给予有效量的信息素组合物。
干扰交配的方法可包括定期监测所捕获昆虫的总数或数量。该监测可以通过对预定的时间段捕获的昆虫数目进行计数来进行，如例如每天、每周、每两周、每月、每隔三个月或由监测器选择的任何其他时间段。对所捕获的昆虫的这种监测可有助于估计该特定时间段的昆虫种群，并且从而有助于确定综合有害生物管理系统中有害生物控制的特定类型和/或剂量。例如，高昆虫种群的发现可能需要使用去除昆虫的方法。在新栖息地侵染的早期预警允许在种群变得难以管理之前采取行动。相反，低昆虫种群的发现可导致足以继续监测种群的决定。昆虫种群可以定期监测，这样昆虫只有在达到某一阈值时才被控制。这提供了具有成本效益的昆虫控制，并减少了使用杀昆虫剂对环境的影响。
交配干扰
根据本公开文本的方法制备的信息素也可用于干扰交配。交配干扰是一种有害生物管理技术，其设计用于通过引入混淆昆虫并干扰交配定位和/或求偶的人工刺激(例如，本文公开的信息素组合物)来控制有害生物，从而阻止交配和阻断生殖周期。
在许多农业上感兴趣的昆虫物种中，如鳞翅目的那些，雌性会发射构成该物种的性信息素的特定化学共混物的空中踪迹。这条航线被称为信息素羽流(plume)。该物种的雄性使用信息素羽流中含有的信息来定位发射信号的雌性(称为“召唤”雌性)。交配干扰通过将合成信息素引入昆虫栖息地利用雄性昆虫跟随羽流的自然反应，其被设计为模拟雌性昆虫产生的性信息素。因此，在一些实施方案中，用于交配干扰的合成信息素是合成衍生的信息素组合物，其包含具有性信息素的化学结构的信息素及其不由靶标昆虫产生的位置异构体。
交配干扰的总体效应是通过掩盖天然信息素羽流来混淆雄性昆虫，导致雄性以找到配偶为代价跟随“虚假信息素踪迹”，并且影响雄性对“召唤”雌性响应的能力。因此，雄性群体成功定位雌性和与雌性交配的可能性降低，导致最终停止繁殖和昆虫侵染坍塌。
交配干扰的策略包括混淆、掩蔽踪迹和错误跟踪。昆虫不断暴露于高浓度的信息素可以防止雄性昆虫对雌性昆虫释放的正常水平的信息素做出反应。掩蔽踪迹使用信息素来消除雌性释放的信息素的踪迹。通过在高浓度下铺设许多信息素斑点来进行虚假跟踪，为雄性呈现许多虚假踪迹进行追随。如果释放量足够高，雄性昆虫就无法找到性信息素(雌性昆虫)的天然来源，从而不会发生交配。
在一些实施方案中，灯芯或诱捕器可被适配为发射信息素持续至少等于蠓的一个或多个繁殖季节的时间段，从而引起交配干扰。如果蠓繁殖季节延长或繁殖季节重复，则本公开文本提供了灯芯或诱捕器，其能够发射信息素一段时间，尤其约两周，并且通常约1周和4周之间和最多6周，该灯芯或诱捕器可循环使用或被随后的相似诱捕器所替代。可将含有该信息素组合物的多个诱捕器放置在所在地，例如邻近作物田。可以根据本领域技术人员已知的方法来选择诱捕器的位置以及诱捕器离地的高度。
可替代地，该信息素组合物可以从配制品如微胶囊或扭结(twist-tie)分配，如通常用于干扰昆虫有害生物的分配。
吸引并杀灭
吸引并杀灭方法利用引诱剂(如性信息素)将靶标物种的昆虫引诱到杀昆虫化学物质、表面、装置等，用于大规模杀灭和终极群体抑制，并且可以具有与大规模捕获相同的效果。例如，当使用合成的雌性性信息素来吸引雄性有害生物(例如飞蛾)时，吸引并杀灭策略中，大量雄性飞蛾必须在延长时间内杀灭，以减少交配和繁殖，并最终抑制有害生物种群。由于不需要任何诱捕服务或其他频繁的维护，吸引并杀灭方法可以是大规模捕获的有利替代方案。在本文所述的各个实施方案中，重组微生物可共表达(i)产生昆虫信息素的途径和(ii)对该昆虫有毒的蛋白质、肽、寡核苷酸或小分子。以这种方式，该重组微生物可以共同产生适用于吸引并杀灭方法的物质。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，用于特定应用的信息素或信息素组合物的量可以取决于若干因素而变化，如侵染的类型和水平；使用的组合物的类型；活性组分的浓度；如何提供组合物，例如，使用的分配器类型；要处理的位置的类型；使用该方法的时间长度；以及环境因素，如温度、风速和风向、降雨量和湿度。本领域技术人员将能够确定用于给定应用的信息素或信息素组合物的有效量。
如本文所用，“有效量”意指所公开的信息素组合物的足以影响所希望结果的量。有效量能够以一次或多次给予来给予。例如，该组合物的有效量可以指足以将给定昆虫吸引到给定场所的信息素组合物的量。另外，该组合物的有效量可以指足以干扰给定位置中特定感兴趣的昆虫种群的交配的信息素组合物的量。
实施例
实施例1.从天然来源得到脂肪酸前体
通过表达脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)的细胞还原脂肪酸是提出的基于生物羟基化的昆虫信息素合成的替代合成途径，参见图3。预期将脂肪酸还原成醇比末端羟基化容易得多，因为：(i)已知更多的FAR序列，并且其是这些酶的天然反应；和(ii)用异质催化剂将该酸氢化成醇是已很好地建立的。得到具有适当不饱和度的靶标脂肪酸的能力是该方法的主要挑战。
为了了解从天然来源得到靶标昆虫信息素的脂肪酸前体的潜力，调查了种子油脂肪酸数据库(sofa.mri.bund.de)、来自哥廷根大学(SAG)培养物保藏中心的微藻菌株的报告脂肪酸谱(Lang IK et al.(2011)Fatty acid profiles and their distributionpatterns in microalgae:a comprehensive analysis of more than 2000strains fromthe SAG culture collection.BMC Plant Biol.11:124)以及一般文献。
检索了可以用作昆虫信息素前体的14种脂肪酸(参见表4)。在这14种脂肪酸中，据报道在种子油中仅发现了三种：Z-11-十八碳烯酸、Z-13-十八碳烯酸和Z-11-十六碳烯酸。产生最高纯度的这些脂肪酸的植物分别是：叙利亚马利筋：Z-11-十八碳烯酸(44.9％)(Kuemmel DF and Chapman LR(1968)9-hexadecenoic and 11-octadecenoic acidcontent of natural fats and oils.Lipids 3:313-316)；蕾丝木：Z-13十八碳烯酸(22％)(Vickery JR(1971)The fatty acid composition of the seed oils ofproteaceae:A chemotaxonomic study.Phytochemistry 10:123-130)。含有Z-11-十六碳烯酸的植物是Kermadecia sinuata(40.3％)(Vickery 1971)；智利榛(25.4％)(B.San,A.N.Yildirim,J.Food Compos.Anal.2010,23,706–710)；无刺枣(Ziziphus jujubevar.inermis)(33.3％)(B.San,A.N.Yildirim,J.Food Compos.Anal.2010,23,706–710)；Orites revoluta(35.6％)(G.Hill,RS and Jordan,Pap.Proc.R.Soc.Tasmania 1996,130,9–15)；黄紫伊素银桦(45.6％)(I.Bombarda,C.Zongo,C.R.McGill,P.Doumenq,B.Fogliani,J.Am.Oil Chem.Soc.2010,87,981–986和M.Kato,A.Kawakita,Am.J.Bot.2004,91,1814–1827)。类似地，对于微藻，在数据库中仅鉴定了14种脂肪酸中的两种：由单角盘星藻制成的Z-11-十八碳烯酸(68％)和由细长聚球菌制成的Z-11-十六碳烯酸(35％)。在一般文献的搜索中，已从诺丽果的果汁中鉴定出2E,4Z,7Z-十碳三烯酸(BasarS and Westendor J(2011)Identification of(2E,4Z,7Z)-decatrienoic acid in Nonifruit and its use in quality screening of commercial Noni products.FoodAnal.Meth.4:57-65)并且从产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)Tu 6105分离(7.7mg/L)(Maier A et al.(1999)(2E,4Z)-decadienoic acid and(2E,4Z,7Z)-decatrienoic acid,two herbicidal metabolites from Streptomycesviridochromogenes Tu 6105.Pestic.Sci.55:733-739)。
表4：靶标脂肪酸的SOFA和SAG搜索结果。
为了确定可以从作为商品生产的种子油得到的脂肪酸，检索文献以鉴定商品种子油及其组成。图4列出了1976年至2000年生产的主要种子油以及2006年至2020年的预测。该主要种子油是大豆、棉籽、花生(落花生)、向日葵、油菜、芝麻、玉米、橄榄、棕榈、棕榈仁、椰子、亚麻籽、蓖麻和牛脂。这些油的脂肪酸组成列于表5中。商品种子油的主要组成是：月桂酸(12:0)：椰子(47.8％)和棕榈仁(48.4％)；棕榈酸(16:0)：棕榈(44％)和棉花(24.7％)；油酸(18:1Δ9c)：油菜(64.1％)、花生(46.5％)、棕榈(39.2％)、橄榄(76.9％)和芝麻(40.6％)；亚油酸(18:2Δ9c、Δ12c)：大豆(53.2％)、棉花(53.3％)、向日葵(68.2％)、花生(31.4％)和芝麻(42.6％)；以及亚麻酸(18:3Δ9c、Δ12c、Δ15c)：亚麻籽(47.4％)。除基础作物之外，还工程化了经修饰的作物以增加特定脂肪酸的含量。经修饰的大豆和油菜作物的例子列于表6中。在这些作物中，如果可以鉴定出来自油酸的信息素，则高纯度生产的油酸(>75％)可能是最有希望的原料。
除在主要商品种子油中发现的脂肪酸之外，具有感兴趣的脂肪酸组成的次要作物列于表7中。这些次要作物产生独特的单烯：20:Δ5c、22:Δ9c、18:1Δ6c、16:1Δ9c；三烯：18:3Δ8t、Δ10t、Δ12c，18:3Δ9c、Δ11t、Δ13t；和氧化三烯：18:3Δ9、Δ11、Δ13、4-氧，18:1Δ9c、Δ12-羟基。
由植物和微藻产生以下脂肪酸：Z-11-十八碳烯酸：叙利亚马利筋(44.9％)、单角盘星藻(68％)；Z-13十八碳烯酸：蕾丝木(22％)；以及Z-11-十六碳烯酸：Kermadeciasinuata(40.3％)、细长聚球菌(35％)。商品种子油的主要组成是：月桂酸(12:0)：椰子(47.8％)和棕榈仁(48.4％)；棕榈酸(16:0)：棕榈(44％)和棉花(24.7％)；油酸(18:1Δ9c)：油菜(64.1％)、花生(46.5％)、棕榈(39.2％)、橄榄(76.9％)和芝麻(40.6％)；亚油酸(18:2Δ9c、Δ12c)：大豆(53.2％)、棉花(53.3％)、向日葵(68.2％)、花生(31.4％)和芝麻(42.6％)以及亚麻油(18:3Δ9c、Δ12c、Δ15c)：亚麻籽(47.4％)。商品种子油主要由饱和脂肪酸和单烯组成。
次要作物(金盏花、白芒花、Honesty、葛缕子、胡萝卜、胡荽、澳洲坚果、肉豆蔻、奥蒂、桐和蓖麻)产生独特的单烯：20:Δc、22:Δ9c、18:1Δc、16:1Δ9c，三烯：18:3Δt、Δ10t、Δc，18:3Δc、Δ11t、Δt和氧化三烯：18:3Δ、Δ11、Δ、-氧，18:1Δ9c、Δ12-羟基。
实施例2：通过半还原天然存在的油产生(Z)-十六碳-11-烯醛
背景和基本原理
该靶标信息素非常类似于天然存在的脂肪酸，但天然存在的脂肪酸作为用于产生靶标信息素的底物的用途尚未阐明。为了确定具有合理量的(Z)-十六碳-11-烯酸的植物油是否可以用于该目的，关于底物侧的特定植物的更多信息是必要的。
将含有大量(Z)-十六碳-11-烯酸的唯一可商购植物油(智利榛子油)用作用于产生(Z)-十六碳-11-烯醛的原料。
示出总体反应方案的概要描绘于图1中。从天然来源分离脂质后，使它们经受酯交换。甲酯的制备是用于生产生物柴油的标准程序。该反应可以是酸催化的或碱催化的。由于双键在酸性条件下易于异构化，因此该方法优选碱性条件(Li H-Y et al.(2005)Chem.Phys.Lett.404:384-388)。
取决于原材料，所得混合物仅含有一部分靶标材料。为了使随后的还原反应所需的还原当量的量最小化，纯化或至少富集前体酸似乎是有利的。其中可行的选择是例如蒸馏和模拟移动床(SMB)色谱法。由于初步纯化的主题是单独的主题，因此进行小规模蒸馏以探测感兴趣的化合物在升高温度下的稳定性。然后在下一步骤中，使纯化的(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯经受还原成相应的醛。用于该目的的可能试剂可以是Vitride(双(2-甲氧基乙氧基)铝氢化钠)(Abe,T et al.(2001)Tetrahedron 57:2701–2710)。Vitride是一种铝基氢化物还原剂，其具有与DIBAL(二异丁基氢化铝)相当的反应特性。与DIBAL不同，Vitride在与空气接触时不自燃，并且与水的反应不太剧烈，从而使其更安全其更易于处理。将Vitride与文献中其他已知的部分还原剂进行比较，该试剂可以在0℃下使用，而其他试剂需要-78℃，并且对类似的底物显示高选择性，而且仅具有少量过量还原副产物(Shin WKet al.(2014)Bull.Korean Chem.Soc.35:2169–2171)。
方法概述
比较了具有高含量(Z)-十六碳-11-烯酸(>20％)的不同报道的植物。相关参数是油含量、培养条件、总产量和市场可得到性。
购买并分析了代表性植物油样品(智利榛-智利榛树)。
进行碱催化的酯交换以产生植物油脂肪酸的甲酯(生物柴油生产)。
通过蒸馏实现(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯的小规模纯化/底物富集。
用Vitride的经修饰的变体(2,6-二甲基吗啉修饰的双[2-甲氧基乙氧基]铝氢化钠)实现该甲酯的半还原以产生(Z)-十六碳-11-烯醛。
结果
该研究集中于得到天然油的一般实用性，并将其还原成信息素。作为主要靶标的是(Z)-十六碳-11-烯醛，该化合物是研究的中心。回顾了SOFA(种子油脂肪酸)和SAG(哥廷根大学的藻类培养物保藏中心)数据库(参见实施例1)。
该报告的部分I集中于鉴定具有高含量的适合作为信息素产生的前体的不常见脂肪酸的植物。部分II证明了利用油产生信息素的原理证据。部分I确认了候选植物的先前调查。对整体技术的研究似乎是合理的，因为其他脂质来源(如微生物脂质)将通过非常相同的程序进行处理。图1示出了用于开发中间体产生平台的路径。
1.1得到植物油的细节
在研究植物油的不常见脂肪酸谱的许多研究中提到了具有高含量(Z)-十六碳-11-烯酸的植物(Aitzetmuller K,J.Am.Oil Chem.Soc.81:721-723)。令人感兴趣的是，除属于鼠李科的无刺枣之外，具有超过20％的(Z)-十六碳-11-烯酸级分的所有其他植物都属于山龙眼科。
关于油产量和培养条件的信息非常缺乏。然而，其他参数可以用于评估植物的潜力。该研究集中于两种植物。首先，黄紫伊素银桦在迄今为止所有报道的植物中具有最高量的(Z)-十六碳-11-烯酸，其种子油中含有45.6％。根据该报告，G.exul是一种灌木或高度达到30英尺的小型树，并且它特有地原产于新喀里多尼亚。更多信息仅适用于其他密切相关的物种，如银桦和一般银桦属。耐寒区一般是9到12，匹配，例如，南加利福尼亚州。它们具有抗旱和抗鹿性、生长快但对肥料敏感。关于生产率或油产量没有可得信息。许多银桦物种被鳞翅目物种(包括蓟序木蛾)用作食用植物。
第二种感兴趣的植物是智利榛树，因为该植物油天然含有25％左右的(Z)-十六碳-11-烯酸并且可是可商购的。该植物未广泛种植。
1.2通过GC-FID比较几种植物油
智利榛子油因其防晒特性而被用于许多乳液中。在许多情况下，脂肪酸的不同区域异构体未被零售商区分。比较了智利和欧洲榛子油。结果总结在表8中，并且不同GC-FID的叠加在图5中示出。唯一含有(Z)-十六碳-11-烯酸的油是智利榛子油。22.5％的级分与文献中报道的约22.7％和约23.83％的值接近(Bertoli C et al.J.Am.Oil Chem.Soc.75:1037–1040；Medel F and Carillo T in Acta Hortic.,International Society ForHorticultural Science(ISHS),Leuven,Belgium,2005,pp.631–638)。尽管未对其他来源进行详尽研究，但其他商业油不太可能含有类似的大量(Z)-十六碳-11-烯酸。欧洲榛树(欧洲榛)完全不同的事实并不令人惊讶，因为它与智利榛树(智利榛)无关。令人惊讶的是，澳大利亚坚果油仅显示0.59％的棕榈油酸-通常观察到更高的含量16％-34％。在另一方面，油酸含量略高，其通常被发现在41％-59％之间。通常还存在3％左右的Z11-C18:1(KaijserA et al.(2000)Food Chem.71:67-70)。这些参数都不符合报告的数据，从而得出该油不是纯澳洲坚果油的结论。
表8：各种植物油的脂肪酸组成的比较。报告的值表示总脂质含量的百分比值[％]。1：榛子油。2：Sibu Beauty沙棘种子油。3：澳洲坚果油。4：La Tourangelle榛子油。5：智利榛子油。
2.(Z)-十六碳-11-烯酸的酯交换和纯化
在该研究中研究的生产路径是通过半还原相应的脂肪酸衍生物直接产生醛。与完全还原相对比，其还可以从游离脂肪酸开始进行，该半还原需要甲酯。甲酯通常具有约20K较低沸点，从而使得可以通过蒸馏更容易地进行纯化。因此，在该方法中采用的路径利用酯交换代替皂化以及蒸馏代替色谱法。
2.1(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯/智利榛子生物柴油的制备
使用来自Ullah等人(2013)的优化方案对智利榛子油进行酯交换以从亚麻籽油生产生物柴油(Ullah F et al.(2013)Polish J.Chem.Technol.15:74)。所用试剂的实际组成总结在表9和图6中。材料与方法部分描述了详细的方案。
表9：酯交换反应的试剂组成。
将反应在65℃下搅拌180min并且得到8.97g浅黄色液体，产率为88％。生物柴油组成示于表10中，并与使用TMSH对原始智利榛子油的直接甲基化进行比较。
与直接甲基化榛子油相比，生物柴油的组成略有变化(表10)。对于Z11-十六碳烯酸甲酯，明显降低了2.85％。其他化合物，尤其是较高链长化合物的相对量增加了10.63％。总的来说，该方法证明了适合于将结合在三酰基甘油酯中的Z11-C16:1酸转移到其甲基衍生物。
表10：智利榛子油用TMSH直接甲基化与生物柴油反应产物的比较。所有值都以百分比[％]列出。
2.2(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯的蒸馏
为了富集(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯的量并且还评估该化合物在这些所需条件下的稳定性，使混合物经受蒸馏。使用5英寸Vigreux柱以分级方式进行蒸馏。将油加热至210℃。将压力保持恒定，范围为0.95–1.22毫巴。在两小时的过程中，收集两种级分，部分I(2.21g头温度55℃-82℃)和部分II(2.25g头温度120℃-146℃)。表11示出了还与粗混合物相比的不同级分的组成。
在收集第二级分之前，将Vigreux柱移除，因为用最初使用的设置无法达到所需的高头温度。
从初始的(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯含量为23.4％开始，通过相对简单的蒸馏可以将浓度富集至60％。由于55℃-82℃的温度框架由5个不同的头温度(55℃-60℃、63℃、68℃、79℃和82℃)组成，因此可以收集甚至更小的级分。该级分的详细概述在表11和图7中示出。
表11：不同级分与生物柴油起始材料的比较。所有值都以百分比[％]列出。
3.(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯的Vitride还原
然后使用含有最高量的(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯的级分，使用经修饰形式的Vitride进行部分还原。出于该目的，使用该试剂的经修饰的变体。如图8所示，该反应包括两个步骤。在第一步骤中，必须使用氮碱(在这种情况下为2，6-二甲基吗啉)制备经修饰的还原剂。在第二步骤中，将该试剂用于还原实际的底物。
尽管不像二异丁基氢化铝那样敏感，但该试剂易受湿度影响，并且惰性气体以及干燥溶剂的使用是至关重要的。因此，使用氩气作为惰性气氛，并且仅使用干燥溶剂。如材料与方法部分中所述进行该反应。当采用粗混合物时，不可能计算该第一反应的产率。图9示出了底物和产物混合物的覆盖层的一部分。该底物被定量转化。唯一的(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯相关产物是88％的(Z)-十六碳-11-烯醛和12％的(Z)-十六碳-11-烯醇。
通过与真实标准物的比较鉴定产物的保留时间和断裂模式(图10A-图10F)。
此外，观察到11Z-C16:1醛的挥发性足以在40℃下在完全真空下蒸发，尽管速率非常慢。图11示出了使用旋转蒸发仪去除溶剂期间不同时间点处的比较。使用相同量的物质，但在真空中另外2小时后仅剩下约24％的产物。在进行该反应时应避免完全下拉。峰值5.4min对应于十六醛。该观察结果可以用于开发相对容易和温和的纯化方法。
因此，可以说，Z11-十六碳烯醛可以通过该途径以良好的选择性生产。
4.具有高含量“棕榈异油酸”的植物
尽管已进行了SOFA和SAG数据库搜索，但搜索范围扩展到了SciFinder和GoogleScholar，使用了随着时间推移而出现的各种俗名。除系统名称11Z-十六碳烯酸之外，还使用了以下俗名：石松子油酸(Lycopodiumoleic acid)(Arch.Pharm.227,241,289,625(1889)，其后来被证明为混合物，但后来由Riebsomer和Johnson重新引入(Riebsomer JLand Johnson JR(1933)J.Am.Chem.Soc.55:3352-3357)。有时也使用俗名艾菊油酸(tanacetumoleic acid)和棕榈异油酸，但棕榈异油酸是最重要的俗名。
另外的信息从植物爱好者、植物协会、种子商店和维基百科的几个博客(如果有的话)收集。
山龙眼科中的黄紫伊素银桦在种子油中具有45.6％的11Z-十六碳烯酸。
山龙眼科中的Kermadecia sinuata在种子油中具有40.3％的11Z-十六碳烯酸。
山龙眼科中的Orites diversifolius在种子油中具有35.6％的11Z-十六碳烯酸。
山龙眼科中的Orites revoluta在种子油中具有35.6％的11Z-十六碳烯酸。
鼠李科中的无刺枣在种子油中具有33.3％的11Z-十六碳烯酸。
山龙眼科中的Hicksbeachia pinnatifolia在种子油中具有28.5％的11Z-十六碳烯酸。
山龙眼科中的智利榛在种子油中具有25.4％的11Z-十六碳烯酸。
山龙眼科中的迪科拉银桦在种子油中具有21.4％的11Z-十六碳烯酸。
结论
几乎所有含有一定量(Z)-十六碳-11-烯酸的植物都属于山龙眼科。取决于物种和位置，样本生长为灌木或小型到相对较大的树木。
智利榛树是一种容易得到的油源，其具有大量(Z)-十六碳-11-烯酸(22.5％)。
酯交换/生物柴油生产是一种易于进行的已建立化学过程。在10g规模上，可以以88％的产率进行该反应。
由于理论塔板数较少，因此难以进行小规模蒸馏。然而，(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯可以从最初的23.4％富集至高达60％。数据显示双键构型在升高的温度下稳定延长时间(在200℃下30min)并且可以相对容易地实现大量富集。
使用两摩尔当量的Vitride/2,6-二甲基吗啉，可以定量进行半还原。由于使用了复杂的混合物，因此在该阶段无法计算实际产率。结果证明，可以通过该途径产生(Z)-十六碳-11-烯醛。衍生自(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯的化合物(相对选择性)的产物分布为88％的(Z)-十六碳-11-烯醛和12％的(Z)-十六碳-11-烯醇。
除植物来源之外，富含(Z)-十六碳-11-烯酸的来自基因工程化微生物(如热带假丝酵母和解脂耶氏酵母)的脂质也是用于使用该方法进行昆虫脂肪醇/醛合成的合适底物。从微生物质生产油与从植物得到油相比可能是更有利的，因为微生物培养是易于扩展的过程。与植物培养不同，微生物培养不依赖于空气土地供应、气候、灌溉和肥料。
材料与方法
表12：使用的可商购植物油
分析
在1.8mL螺旋盖GC-玻璃小瓶中，将10μL植物油溶于450μl甲基叔丁基醚中。在加帽GC-FID分析之前，加入50μl 0.2M三甲基氢氧化锍于甲醇中的溶液。该程序源自Macherey-Nagel(申请号213060)，基于来自Butte等人1983(Butte W(1983)J.Chromatogr.A 261:142–145)的方案。使用的GC程序是KO-DESATUR01.M，具有以下参数(表13)。
表13：仪器参数
通过使用相同的GC-FID方法将10μL生物柴油溶于1mL氯仿中来分析生物柴油。通过将10μL底物或产物混合物溶于1mL氯仿中来分析Vitride反应。在加入100μL含有1％三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺后，通过GC-FID分析样品。对于GC-MS分析，使用相同的温度程序并且将MS以SCAN模式配置。
智利榛子油的酯交换
基于来自Ullah等人(2013)的优化方案，用6:1摩尔比的甲醇与TAG(三酰基甘油酯)进行酯交换。将10.22g智利榛子油(10.84mmol)置于配备有磁力搅拌棒的25mL圆底烧瓶中。将1mL于甲醇中的5％NaOH与2mL甲醇混合并加入到圆底烧瓶中。将混合物在65℃下剧烈搅拌180min。在用20mL甲基叔丁基醚萃取两次之前，将混合物用20mL水稀释。将有机相合并，经无水硫酸钠干燥，并且在真空中浓缩。该反应产生8.97g淡黄色液体(88％产率)，将其通过GC-FID分析。
智利榛子生物柴油的蒸馏
将8.62g生物柴油置于配备有磁力搅拌棒的25mL圆底烧瓶中。该烧瓶配有5英寸Vigreux柱，该柱连接到5.5英寸短路径蒸馏头并用水冷却。将冷凝器连接到三通玻璃接收器，该接收器附接到三个10mL玻璃圆底烧瓶。使用铝箔将Vigreux柱绝缘。使用连接到JKEMModel 210温度控制器的PTFE涂覆的T型热电偶监测头温度。使用热电偶压力传感器(Mastercool Model 98061)监测压力。将含有种子油甲酯的圆底烧瓶置于油浴中，并通过磁性热板搅拌器在搅拌下小心加热至210℃。在2h的时间过程中收集了两个不同的级分。在55℃-80℃的温度范围内收集第一级分(部分I-2.21g)，并在120℃-146℃之间收集第二级分(部分II-2.25g)。由于使用Vigreux柱无法达到用于部分II的高头温度，因此在收集第二级分之前将其移除。在蒸馏程序后，将3.54g留在25mL圆底烧瓶中。通过GC-FID分析不同的级分。
第一部分-具有最高含量的(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯的粗级分的Vitride还原
还原剂(顺式-2,6-二甲基吗啉修饰的红铝)的制备。
使干燥的三颈烧瓶配备有干燥滴液漏斗、磁力搅拌棒和隔膜。在用氩气进行四次泵-吹扫循环后，将烧瓶置于冰浴中。向烧瓶中装入14mL无水四氢呋喃和1.17mL(9.54mmol)。在使混合物冷却至0℃后，滴加3.5M双(2-甲氧基乙氧基)铝氢化钠溶液于甲苯中的溶液(2.48mL，8.67mmol)并搅拌1小时，以得到澄清的无色均匀溶液。
来自智利榛子生物柴油的部分I的部分还原
使干燥的三颈烧瓶配备有滴液漏斗、磁力搅拌棒和隔膜。在用氩气进行四次泵-吹扫循环后，将烧瓶置于冰浴中。向烧瓶中装入20mL无水四氢呋喃和0.97g来自智利榛子生物柴油的部分I(3.81mmol：假设仅11Z-C16:1-COOMe)。通过套管转移使滴液漏斗配备有先前制备的顺式-2,6-二甲基吗啉修饰的红铝。在将混合物冷却至0℃后，滴加经修饰的红铝(该试剂在该阶段未冷却)。将混合物搅拌30min，允许其温热至室温。通过80mL2N盐酸淬灭反应，并且用50mL甲基叔丁基醚萃取产物两次。将有机相合并，并经无水硫酸钠干燥，并且在真空中浓缩。通过GC-MS分析还原的混合物，并通过与真实标准物在保留时间和断裂模式上的比较鉴定衍生自(Z)-十六碳-11-烯酸甲酯的产物。
实施例3：跨膜去饱和酶在解脂耶氏酵母中的表达
背景和基本原理
不饱和脂质部分的工程化微生物生产需要合成途径的功能性表达。一种此类途径包含跨膜去饱和酶以介导脂肪酰基-CoA转化为区域和立体特异性不饱和脂肪酰基-CoA。在一些昆虫以及一些微藻中发现了许多编码这些酶的基因。区域和立体特异性去饱和酶可以用于生产富含脂肪酸前体的微生物油。然后可以将微生物油衍生化并还原为活性成分。筛选许多基因变体以鉴定如下酶活性，其允许建立能够高水平合成单一不饱和脂质部分或其共混物的途径。此外，在多个宿主(酿酒酵母、维斯假丝酵母(热带假丝酵母)和解脂耶氏酵母)中对这些酶进行筛选，以优化搜索来寻找用于这些跨膜蛋白最佳表达的适合宿主。
在酿酒酵母和维斯假丝酵母(热带假丝酵母)中对去饱和酶的初始筛选鉴定了来自脐橙螟蛾、玉米穗蛾和粉纹夜蛾的三种活性Z11-C16:1去饱和酶变体。酿酒酵母筛选使用编码序列，其中酿酒酵母Ole1p Z9去饱和酶的N-末端前导序列与全长昆虫Z11去饱和酶序列融合。此策略以前在科学文献中用于在酿酒酵母中表达真核生物去饱和酶。当在OLE1缺失背景中表达时，所有三种上述去饱和酶在与Ole1p前导序列融合的情况下都展示Z11去饱和酶活性。具有白假丝酵母Ole1p前导序列的类似设计与来自玉米穗蛾的Z11去饱和酶一起使用。虽然有活性，这种Ole1p-玉米穗蛾脱氢酶融合不会显著增加Z11-十六碳烯酸滴度。此外，保守优化的脐橙螟蛾Z11去饱和酶在酿酒酵母和维斯假丝酵母中均有活性。以下研究集中于测试两个不同的解脂耶氏酵母菌株SPV140和SPV300中玉米穗蛾、粉纹夜蛾和脐橙螟蛾Z11去饱和酶的功能性表达。将天然和智人密码子优化的序列用于玉米穗蛾和粉纹夜蛾去饱和酶，而仅将天然序列用于脐橙螟蛾。最后，与来自酿酒酵母或白假丝酵母的Ole1p的N末端相比，解脂耶氏酵母Ole1p Z9硬脂酰基-CoA去饱和酶的N末端和昆虫去饱和酶的比对更接近。基于此比对，建立了两个额外的去饱和酶形式。将推定的前导序列从解脂耶氏酵母Ole1p交换到粉纹夜蛾和玉米穗蛾去饱和酶上。
方法概述
将在酿酒酵母或维斯假丝酵母中具有观察到的活性的Z11去饱和酶的聚焦文库(昆虫来源：脐橙螟蛾、玉米穗蛾、粉纹夜蛾)克隆到靶向XPR2基因座的具有URA3选择标记的双交换盒中。蛋白编码序列使用天然昆虫序列(SEQ ID NO:17、18)、智人优化的编码序列(SEQ ID NO:19、20)、或其中用N末端84个碱基(玉米穗蛾，SEQ ID NO:22)或81个碱基(粉纹夜蛾，SEQ ID NO:21)交换解脂耶氏酵母OLE1(YALI0C05951)基因N末端96个碱基的智人优化的序列。不同于在酿酒酵母和维斯假丝酵母筛选中，前导序列嵌合体测试前导序列的直接交换，而不是将宿主前导序列连接到全长去饱和酶编码序列的N末端。仅将天然编码序列用于脐橙螟蛾去饱和酶(SEQ ID NO:23)。
将7种去饱和酶构建体中的每种转化到SPV140(PO1f)和SPV300(H222ΔPΔAΔFΔURA3)中，并确认位点特异性整合体。
在YPD培养基中，通过将十六烷酸(棕榈酸)体内生物转化为(Z)-11-十六碳烯酸(棕榈异油酸(palmitvaccenic acid))来测试去饱和酶活性。
使用GC-FID分析来鉴定和量化代谢物。
结果
菌株构建
将去饱和酶变体克隆到pPV101载体中，其含有靶向整合到XPR2基因座中的解脂耶氏酵母表达盒。
分别使用被来自解脂耶氏酵母OLE1去饱和酶的前导序列(SEQ ID NO:21、22)替代的天然昆虫序列(SEQ ID NO:17、18)、智人密码子优化的全长昆虫序列(SEQ ID NO:19、20)或推定的前导序列来合成粉纹夜蛾和玉米穗蛾去饱和酶。还使用天然昆虫编码序列(SEQID NO:23)合成脐橙螟蛾去饱和酶。将所有七种去饱和酶变体转化到SPV140中。基于先前的活性结果，仅玉米穗蛾和脐橙螟蛾去饱和酶变体被转化到SPV300中。
功能性表达测定
通过修饰用于维斯假丝酵母SPV053中跨膜去饱和酶表达的方案来评估功能活性。简而言之，将表达昆虫去饱和酶的解脂耶氏酵母SPV140和SPV300衍生的菌株在丰富(YPD)中培养以生成生物质。使用YPD生成的生物量，在24个深孔板中，将小规模(2ml)培养物与棕榈酸一起共培养48小时(详情参见材料与方法)。
在粉纹夜蛾、玉米穗蛾和脐橙螟蛾变体的初始筛选中，仅经智人密码子优化的玉米穗蛾去饱和酶变体产生可检测到的Z11-十六碳烯酸(图12)。天然玉米穗蛾去饱+++和酶的表达使得可产生100±5mg/L Z11-十六碳烯酸，并且具有解脂耶氏酵母OLE1前导序列的形式产生83±11mg/L。如图12所示，其他主要脂肪酸物质的分布相对不受功能性去饱和酶表达的影响。在活性菌株中，Z11-十六碳烯酸占脂肪酸物质(包括可能吸附到细胞外表面的棕榈酸底物)的约10％(g/g)。
进行了后续实验，将SPV140背景中的活性变体与SPV300衍生的去饱和酶菌株进行比较。将表达hrGFP的亲本SPV300和SPV140用作阴性对照。使用相同的生物转化测定方案。与SPV140中一样，仅智人优化的变体产生可检测到的活性(图13)。SPV300菌株生长至更高的最终细胞密度(SPV300OD600＝26-28，SPV140OD600＝19-22)(图14)。对表达具有智人密码子优化的天然玉米穗蛾Z11-去饱和酶(pPV199)的菌株观察到最高滴度。重复测试的SPV140菌株产生113±1mg/L(5.5±0.2mg/L/OD)Z11-十六碳烯酸，比第一次实验中观察到的滴度高13％(图15)。表达相同去饱和酶的SPV300菌株产生更广泛的生产力。它们平均产生89±18mg/L(3.3±1.2mg/L/OD)Z11-十六碳烯酸，但一个克隆产生124mg/L(4.6mg/L/OD)Z11-十六碳烯酸(图15)。
总之，仅具有智人密码子优化的玉米穗蛾Z11去饱和酶变体产生可检测到的Z11-十六碳烯酸。在目前的测定条件下，与SPV300相比，在SPV140背景中观察到略高的滴度。表14总结了Z11-十六碳烯酸滴度。
表14：从解脂耶氏酵母中的示例性去饱和酶表达获得的Z11-十六碳烯酸滴度
在SPV300中，测试了pPV200(解脂耶氏酵母OLE1-具有智人密码子优化的玉米穗蛾Z11去饱和酶)的一种非位点特异性整合体。此整合体没有产生可检测到的Z11-十六碳烯酸，而两种位点特异性整合体产生55±1mg/L。
从SPV140或SPV300衍生菌株的沉淀中未观察到主要的羟基或二酸峰，并且在当前的测定条件下(相对低的底物浓度，丰富培养基)，SPV300中的β-氧化/ω-氧化基因的缺失没有增加Z11-十六碳烯酸累积。
结论
玉米穗蛾Z11去饱和酶具有活性，并且可从约500mg/L棕榈酸底物产生约100mg/LZ11-十六碳烯酸。在24孔板测定中，三种阳性整合体和重复实验证明了功能性表达。
针对解脂耶氏酵母中的活性，需要对玉米穗蛾去饱和酶进行密码子优化(智人或潜在的解脂耶氏酵母)。
粉纹夜蛾Z11去饱和酶虽然在酿酒酵母中有活性，但在解脂耶氏酵母中不产生可检测到的Z11-十六碳烯酸。
可以从甘油原料开始确认针对解脂耶氏酵母菌株的测定的重现性。
脐橙螟蛾去饱和酶可以进行密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达。
由于解脂耶氏酵母是候选生产宿主，因此可以在解脂耶氏酵母中整合额外的活性去饱和酶拷贝，可以鉴定改进生物转化的培养条件，并且可以量化底物转化。
材料与方法
菌株构建
合成所有的去饱和酶基因(金斯瑞公司)。使用天然序列或智人密码子优化。将合成的基因亚克隆到pPV101中。转化质粒并使用Zyppy质粒小量制备试剂盒(酶研究公司(Zymo Research)，欧文，加利福尼亚州)从大肠杆菌EPI400进行制备。使用Frozen-EZ酵母转化II试剂盒(酶研究公司(Zymo Research)，欧文，加利福尼亚州)转化约1-2μg线性化DNA。将整个转化混合物铺板在CM葡萄糖-ura琼脂板上。发现阳性整合体是位点特异性的，并且通过检查PCR进行基因分型。
功能性表达测定
在YPD中补充棕榈酸
将阳性分离株在YPD上进行再次斑块生长，使其生长过夜，并且然后在4℃下储存。将菌株从斑块板接种到24深孔板(方孔，锥体底部)中的2ml YPD中。针对每种去饱和酶变体接种三个阳性克隆。将SPV140中的三个pPV101分离株和亲本SPV300用作阴性对照。在Infors Multitron冷藏烧瓶振荡器中，在28℃和250rpm下，将深孔板孵育24小时。在孵育24小时后，通过以500xg离心使1ml体积的每种培养物沉淀。将每种沉淀重悬于2ml的YPD中。将500mg/L棕榈酸添加到来自乙醇中90g/L储备溶液的培养物中。结果是添加0.5％乙醇与棕榈酸底物。将所有培养物在终点采样前孵育48小时。使用Tecan Infinite 200pro读板仪测量最终细胞密度。将0.75或0.8ml的每种培养物收获在1.7ml微量离心管中并使其沉淀。去除上清液并且如下所述处理沉淀。
代谢物萃取和GC-FID分析
总脂质组成以及(Z)-11-十六碳烯酸量化是基于Moss等人(1982)(Moss,C.W.,Shinoda,T.&Samuels,J.W.Determination of cellular fatty acid compositions ofvarious yeasts by gas-liquid chromatography.J.Clin.Microbiol.16:1073–1079(1982))和Yousuf等人(2010)(Yousuf,A.,Sannino,F.,Addorisio,V.&Pirozzi,D.Microbial Conversion of Olive Oil Mill Wastewaters into Lipids Suitable forBiodiesel Production.J.Agric.Food Chem.58:8630–8635(2010))的修改程序。将通常约10mg至80mg的沉淀细胞(在1.5mL塑料管中)重浮于含有5％(w/w)氢氧化钠的甲醇中。将碱性细胞悬浮液转移至1.8mL钳口小瓶(crimp vial)中。将混合物在90℃的加热块中加热1小时。在用400 2.5N HCl酸化之前，使小瓶冷却至室温。添加含1mM十七烷酸甲酯的500μL氯仿并剧烈振荡混合物，然后将水相和有机相转移至1.5mL塑料管中。将混合物以13,000rpm离心，之后将450μL有机相转移至GC小瓶中。为了分析脂质和量化脂肪酸，添加50μL的0.2MTMSH(甲醇中的三甲基氢氧化锍)，并通过GC-FID分析样品。
实施例4：Z11-14酸在解脂耶氏酵母中的产生
背景和基本原理
工程化解脂耶氏酵母以生产Z11-14酸，其是靶标鳞翅目信息素Z11-14Ac的前体。
选择73种去饱和酶的文库以靶向潜在的信息素，包括Z11-14Ac、Z7-12Ac、Z9E12-14Ac、E8E10-C12OH和Z9E11-14Ac。在H222ΔPΔAΔF(SPV300)背景中测试所有去饱和酶。
从文献鉴定出11种去饱和酶具有Δ11活性(DST001-DST009、DST030和DST039，表15)。通过进料棕榈酸甲酯(C16)、肉豆蔻酸甲酯(C14)或月桂酸甲酯(C12)作为底物来筛选所有去饱和酶，并通过GC分析测定完整的产物谱。
讨论了所谓的Δ11去饱和酶文库和其他去饱和酶的所得活性，其显示产生Δ11化合物，特别是Z11-14酸。
表15.实施例4中讨论的去饱和酶
结果
当向去饱和酶文库中进料2g/L肉豆蔻酸甲酯时，观察到高达69mg/L的Z11-14酸产生(图16)。目前最佳去饱和酶即玉米穗蛾(Hz)DST(SPV459，由SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列、SEQ ID NO:20中列出的核苷酸序列编码)加之去饱和酶DST001至DST007、DST030和DST039产生一定量的Z11-14酸，范围为16mg/L至69mg/L。DST001(红带卷蛾)、DST004(烟草天蛾)和DST039(脐橙螟蛾)对Z11-14酸产生比Z11-16酸产生更具特异性，尽管这些去饱和酶产生约20mg/L的Z11-14酸。产生较高Z11-14酸滴度的菌株还从肉豆蔻酸甲酯底物以20-30mg/L产生Z9-14酸，这与阴性对照SPV298相比有所降低。与SPV298相比，Hz DST(SPV459)的C14-C18产物概况在图17中示出。
示出了Z11-14酸合成的概念证明。尝试鉴定了与玉米穗蛾DST(1.05g/L Z11-16酸；69mg/L Z11-14酸)相比具有改进Z11-16酸滴度或产物特异性的酶。虽然没有去饱和酶具有比Hz DST(SPV459)更高的产量，但DST003(SEQ ID NO:2)具有与HzDesat菌株相似的生产表型，并且DST002和DST005具有相似的Z11-16酸产生且具有减少的Z11-14酸。DST006中的去饱和酶在遗传上等同于SPV459中表达的玉米穗蛾去饱和酶，并用作文库对照。当进料棕榈酸甲酯时，DST006产生相同水平的Z11-16酸；然而，该菌株在肉豆蔻酸甲酯上产生较低滴度的Z11-14酸。菌株背景的遗传变异可以解释观察到的差异。
DST039(脐橙螟蛾)先前在不同条件下进行了筛选。在富营养培养基中，未观察到由天然脐橙螟蛾编码序列进行的Z11-16酸产生。测试了智人优化的序列，并且在富营养培养基条件下仍未观察到活性。在该筛选中，在氮限制条件下用Hs优化的序列测试DST039，并在相关底物上得到235mg/L的Z11-16酸产生和21mg/L的Z11-14酸产生。
未观察到SPV300背景中来自DST008(黑腹果蝇)或DST009(棉灰翅夜蛾)的Δ11产品。
概述
在10种去饱和酶中观察到Z11-14酸产生，其中滴度范围为16mg/L至69mg/L(2g/L肉豆蔻酸甲酯进料)。
玉米穗蛾DST(由SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列、SEQ ID NO:20中列出的核苷酸序列编码)仍然是最好的Z11-16酸生产者(当用棕榈酸甲酯进料时>1g/L)。
DST003(大螟，SEQ ID NO:2)具有与玉米穗蛾DST最相似的表型。
DST002(斜纹夜蛾)和DST005(欧洲玉米螟)对Z11-16酸产生比玉米穗蛾DST更具特异性(减少Z11-14酸产生)。
DST001(红带卷蛾)、DST004(烟草天蛾)和DST039(脐橙螟蛾)对Z11-14酸产生比玉米穗蛾DST更具特异性。
结论
当进料肉豆蔻酸甲酯时，可以在解脂耶氏酵母中用异源表达特定去饱和酶来产生Z11-14酸。
将去饱和酶的多个拷贝(相同或序列的组合)整合在改进的菌株背景中，以改进Z11-14酸滴度、产物特异性和遗传稳定性。
材料与方法
文库生成
使用PacI/SapI限制性消化将去饱和酶序列提供给Genscript用于密码子优化(智人表达生物体)克隆到pPV266(具有TEF启动子和终止子的XPR2基因座整合载体)中。提供冻干的DNA以及EPI400琼脂刺。去饱和酶构建体列于表16中。
使用PmeI限制酶将构建体线性化并直接转化到宿主菌株SPV300中。使用XPR2整合连接外部和pTEF启动子内的引物通过检查PCR验证转化物。
表16.去饱和酶构建体
质粒消化
从Genscript订购约10μg冻干的DNA。将DNA重悬于50μL水中使最终浓度为约200ng/μL。将10μL DNA与1.25μL 10x CutSmart缓冲液和1.25μL PmeI限制酶(12.5μL反应体积)混合。将反应物在PCR仪器中于37℃下孵育1.5小时，并在65℃下加热灭活30分钟。
转化
通过在带挡板的烧瓶中以0.001OD接种YPD培养物使SPV300感受态细胞生长，并生长直到0.5-1.0OD。以800xg收获细胞，并用来自用于酵母的Zymo Frozen-EZ转化II试剂盒的0.25倍体积的溶液1洗涤。将细胞以1000x浓度的原始培养物体积重悬于溶液2中，并在-80℃下缓慢冷冻，同时在泡沫聚苯乙烯容器中绝热(冷冻细胞可能具有比新鲜细胞更好的转化效率)。首先将50μL细胞与12.5μL消化反应(不需要净化)混合，并且然后与500μL溶液3混合。在不摇动的情况下将转化物在28℃下孵育3小时，然后将完全转化混合物接种到适当的选择性琼脂培养基。将培养皿在菌落出现前孵育3-4天。
检查PCR
将转化菌落挑取到PCR板中的7μL水中。通过多通道将5μL细胞修补到选择性全向托盘并生长过夜。将剩余的2μL细胞微波处理2分钟，然后加入15μL PCR主混合物。
PCR主混合物 1X反应
2x Phusion主混合物(HF缓冲液) 7.5μL
100μM oPV204(XPR2基因座F) 0.1μL
100μM oPV195(pTEF R) 0.1μL
水 7.3μL
PCR循环：
菌落修补
将阳性克隆重新修补到呈24孔格式的YPD全向托盘，包括测定对照。使全向托盘在28℃下生长过夜并用于接种生物测定培养物。
生物测定
将阳性转化物(每个构建体N＝4个克隆)接种到24孔培养板中的1mL YPD中，并在Infors HT Mulitron Pro中于28℃下以1000rpm摇动孵育24小时。将细胞以800xg沉淀并重悬于具有5μL底物(约2g/L浓度)的S2培养基中。在生物转化48小时后，将250μL培养物取样到玻璃钳口顶部小瓶中。
S2培养基
2g/L酵母提取物，1g/L蛋白胨，0.1M磷酸盐缓冲液，1.7g/L YNB w/o aa，NH4，60g/L葡萄糖，5g/L甘油
GC样品处理
前入口/检测器：
系统 6890GC，ChemStation Rev.B.03.02(341)
柱 J&W DB-23 30m x 25mm x 25um
运行时间＝14.4min
入口 加热器＝240℃；压力＝9.0psi；总流量{H2}＝36.2mL/min
载气 H2@1.0mL/min，9.0psi，35cm/sec
信号 数据速率＝2Hz/0.1min
烘箱 150℃持续1min
升温12℃/min至220℃，保持3min
升温35℃/min至240℃，保持4min
平衡时间：2min
进样 分流，240℃
分流比–30:1；29.1mL/min
检测器 FID，240℃
H2@35.0mL/min，空气@350mL/min
静电计{点火补偿值}@2.0pA
样品 进样体积＝1μL
后入口/检测器：
系统 6890GC，ChemStation Rev.B.03.02(341)
柱 J&W DB-23 30m x 25mm x 25um
运行时间＝14.4min
入口 加热器＝240℃；压力＝9.8psi；总流量{H2}＝40.1mL/min
载气 H2@1.1mL/min，9.8psi，38cm/sec
信号 数据速率＝2Hz/0.1min
烘箱 150℃持续1min
升温12℃/min至220℃，保持3min
升温35℃/min至240℃，保持4min
平衡时间：2min
进样 分流，240℃
分流比–30:1；32.3mL/min
检测器 FID，240℃
H2@35.0mL/min，空气@350mL/min
静电计{点火补偿值}@2.0pA
样品 进样体积＝1μL
TMSH：三甲基氢氧化锍(0.2mol/L，在甲醇中)–VWR TCT1576-025ML
实施例5：将脂肪酸甲酯(Z11-16FAME)前体转化为Z11-16Ald
背景和基本原理
Z11-16Ald是本公开文本中感兴趣的一种活性成分(AI)。围绕合成该AI的研究和开发集中在四个主要区域，即：1.生物催化剂工程化2.发酵过程开发3.下游过程(DSP)开发(将微生物产生的Z11-16前体转化为纯化的Z11-16FAME)。4.将FAME前体最终化学转化为靶标AI(乙酸盐或醛)。
DSP涉及将含有Z11-16酸的微生物脂质转化为Z11-16FAME，并且随后通过蒸馏将其富集，并化学转化为Z11-16Ald。用于产生粗Z11-16FAME的设计过程的说明描绘于图18中。最初，发现每个阶段都有多个DSP选项。确定了最有效的方法及其与每个阶段的工业仪器的兼容性。还基于其在整体信息素制造成本中的估计成本贡献来评估方法的选择。
该实施例集中于将Z11-16FAME前体最终化学转化为Z11-16Ald的概念证明。
结果
Z11-16FAME的生成
1.热杀发酵，和2.细胞的分离
将SPV459的发酵培养物加热至70℃并保持3h以热杀细胞和无活性脂肪酶。在过滤之前，添加助滤剂。使Seitz过滤器外壳配备有滤布。在填充Seitz过滤器并施加0.5巴的压力后，立即收集大约250mL的第一滤液并停止过滤。将混浊的滤液重新填充到Seitz过滤器中，并在1巴N2下继续过滤。
3.挤压
将滤饼压入叶片中并形成颗粒，用刮刀刮下新生的酵母颗粒。
4.干燥
在通风烘箱中进行干燥。将颗粒均匀地分布在金属托盘上的单层中，并在通风烘箱中在36℃下干燥20h。
5.TAG提取，6.Debri分离，7.蒸发
使500mL三颈烧瓶配备有65g细胞沉淀、机械搅拌器、温度计和回流冷凝器。在加入330mL正庚烷后，将混合物加热至70℃并以40rpm搅拌。将混合物在70℃下保持3h。使用相同的20微米滤布通过Seitz压力过滤器直接过滤仍然热的混合物，该滤布最初用于细胞过滤。在第一次过滤后，将空的三颈烧瓶用50mL正庚烷洗涤。将洗涤庚烷用于冲洗通过过滤器并将其收集到与第一滤液相同的烧瓶中。在过滤后，将颗粒放回与以前相同的烧瓶中，并在50℃下将滤液在减压下蒸发。测定提取物的重量并取出提取物样品用于GC和酸值分析。
对于第二次提取步骤，加入250mL正庚烷并将混合物搅拌1.5h。处理和取样与第一次提取步骤相同。除提取时间延长至2h之外，与第二次提取几乎相同地进行第三次提取。
8.酯化，9.酯交换，10.分离/蒸发，11.干燥
使500mL三颈烧瓶配备有17.36g TAG提取物、100ml甲醇、机械搅拌器、温度计和回流冷凝器。在加入0.506g对甲苯磺酸一水合物(2.66mmol)后，将混合物加热至60℃(设定温度60℃；实际温度53.8℃)并以180rpm搅拌。在达到最终温度后，将搅拌增加至240rpm并加入3mL原乙酸三甲酯(23.57mmol)。用TLC监测反应。在60min后，TLC表明所有棕榈酸剩余物都被转化。在加入1mL甲醇钠溶液(25％，在甲醇中，4.36mmol)之前，加入另一份2mL原乙酸三甲酯(15.71mmol)。将混合物再搅拌80min并通过TLC监测。在转化所有TAG后，用0.4mL乙酸淬灭反应。用100ml正庚烷萃取混合物。分离有机层并且将水层用另外20mL正庚烷萃取。合并有机相并用30mL dH2O洗涤。真空浓缩有机相。
12.蒸馏
用30g粗FAME填充100mL圆底烧瓶。将磁力搅拌棒加入罐内容物中。使该烧瓶配备有Vigreux柱，该柱连接到微量蒸馏可变回流蒸馏头以用于馏分的级分收集。使该蒸馏头配有温度计、冷指、收集烧瓶和真空管线。该设置是绝缘的。在大约500毫托的减压下进行蒸馏，其温度高达250℃。收集不同的级分并通过GC分析。
还原
简要地基于(V.,et al."Properties of sodium-bis-(2-methoxyethoxy)aluminiumhydride.I.Reduction of some organic functionalgroups."Tetrahedron Letters 9.29(1968):3303-3306)和(Anonymous 2014)的方案，使干燥的三颈烧瓶配备有滴液漏斗、磁力搅拌棒和隔膜。在用氩气吹扫烧瓶后，将烧瓶置于冰浴中。向烧瓶中装入10mL无水四氢呋喃和2.36g Z11-16FAME(约70％纯度)。使滴液漏斗配备有20mL无水四氢呋喃和3.13mL(21.98mmol)于甲苯中的60％SMEAH。在将混合物冷却至0℃后，在30min的时间段内滴加SMEAH溶液。在加入SMEAH后，更换冰浴并将混合物搅拌4h。用5mL10％硫酸淬灭反应，并用20mL甲基叔丁基醚萃取产物两次。将有机相合并，并经无水硫酸钠干燥，并且在真空中浓缩。
将Z11-十六碳烯醇TEMPO-漂白氧化为Z11-十六碳烯醛
向含有50mL缓冲溶液(将10.08g NaHCO3、15.3g Na2HPO4和1.44g NaH2PO4溶于500mL H2O中，pH＝7.8)、四丁基硫酸氢铵(TBAH)(407mg)的250mL玻璃烧杯中加入30mL含有2.89g Z11-十六碳烯醇(54.3％纯度)的甲苯和1mL HO-TEMPO溶液(207mg/mL，在甲苯中)。通过Silverson混合器以4000RPM搅拌混合物30秒，之后通过注射泵在90秒内加入25mL的4.4％漂白溶液(pH 8.58)。在搅拌下，在8分钟内监测反应的温度和pH。在搅拌8min后，通过加入550μL浓HCl中和反应至测定的pH 7.06。将反应混合物转移到分液漏斗中并用甲苯萃取。收集有机层并在真空中浓缩。
Z11-十六碳烯醇起始材料的GC-FID迹线在图19中示出。
氧化反应过程中的pH和温度如下所示：
氧化产物的GC-FID迹线在图20中示出。
反应结果如下所示：
产品浓度计算
基于1-十四碳烯醇内标的校准曲线：
分析
所有样品均在配备有J&W DB-23柱的Agilent 6890GC上进行分析。对于漂白氧化样品的分析，使用以下温度程序：100℃1min，升温5℃/min至200℃，保持3min，升温35℃/min至240℃，保持10min。所有其他样品用KOH/H2SO4衍生化并用以下程序分析：150℃1min，升温12℃/min至220℃，保持3min，升温35℃/min至240℃，保持4min。
实施例6：改进的Z11-16酸产生菌株
背景和基本原理
筛选Z11特异性昆虫去饱和酶的小型文库鉴定了来自玉米穗蛾的变体在16酸底物上的解脂耶氏酵母H222ΔPΔAΔF背景中最具活性(参见实施例3)。筛选玉米穗蛾去饱和酶的三个整合体，并将其作为SPV458、SPV459和SPV460储存在菌株数据库中。在初始筛选中，SPV459产生比姐妹菌株SPV458和SPV460更高的滴度，并被选择用于进一步的过程开发。最初还选择了SPV459进行进一步的菌株工程化，但不能从该菌株稳定地除去选择标记。选择SPV458代替SPV459用于菌株工程化目的，并且成功地从SPV458拯救了标记。将总共22个质粒构建体整合到SPV739中，该标记拯救了SPV458的后代。含有额外的玉米穗蛾去饱和酶拷贝的菌株产生了增加的Z11-16酸滴度。在Biolector小规模测定和DASGIP 1L发酵罐两者中评估了其中4种菌株的改进性能。含有额外去饱和酶拷贝的菌株表现优于其SPV458亲本，但未超过SPV459。基于这些结果，选择两个菌株SPV968和SPV969用于进一步工程化。使这两个菌株进行标记拯救，并且整合另外的DNA盒以产生具有2或3个拷贝的Z11去饱和酶的小型菌株文库和关键脂质代谢基因的缺失(图21)。
此外，还进行了一些改变以改进Biolector测定。虽然通常预测1L规模的菌株性能，但在Biolector测定中观察到较低的细胞密度和最大滴度。为了增加细胞密度，增强滴度并改进与发酵性能的相关性，选择用于发酵批处理v1.1(SOP026.2)的半定义培养基。目前的发酵过程也使用32℃的孵育温度。使用新培养基比较28℃和32℃的温度。最后，目前的发酵进料分批过程利用具有较高甘油和较低葡萄糖浓度的初始分批阶段。用60g/L甘油和40g/L葡萄糖测试可替代Biolector批次培养基。
通过脂质动员基因的基因缺失和额外的Z11-16酸去饱和酶拷贝的整合来鉴定改进的Z11-16酸Bd(生物去饱和)菌株。
研究了改进的Z11-16酸Bd菌株对共底物质组成(甘油和葡萄糖浓度)的差异的响应。
方法
在多个基因座处将表达玉米穗蛾去饱和酶(SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列；SEQ ID NO:20中列出的密码子优化的核苷酸序列)或大螟Z11去饱和酶(SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列；SEQ ID NO:39中列出的密码子优化的核苷酸序列)的线性DNA盒整合到解脂耶氏酵母H222ΔPΔAΔF(SPV298)衍生菌株中。
在M2P Labs Biolector中使用48孔花板在700μl生物转化中测定所得菌株。
测试了两个孵育温度，28和32℃。
测试了两种培养基组合物的菌株子集。除葡萄糖和甘油含量之外，培养基相同。两种培养基都含有：1.7g/L不含硫酸铵或氨基酸的酵母氮碱、1g/L酵母提取物、3.3g/L硫酸铵、100mM磷酸钾缓冲液和8.5mg/L硫酸铁。加入总共20g/L 16ME(棕榈酸甲酯)作为两个10g/L的团块。共底物浓度如下：
高葡萄糖初级培养基：120g/L葡萄糖和5g/L甘油
高甘油培养基：40g/L葡萄糖和60g/L甘油
比较菌株的生长速率、Z11-16酸比生产率、最大Z11-16酸滴度和Z11-16酸选择性。
选择性定义为：
这里g16Acids是未转化的底物并且g16AcidI是16酸，其已被内化并作为三酰基甘油酯或另一种细胞内脂质储存。
结果
除第一代对照SPV458和SPV459之外，还测试了9个第二代和第三代菌株。所有构建体都含有玉米穗蛾Z11去饱和酶的拷贝，除SPV1060之外，其含有一个玉米穗蛾Z11去饱和酶的拷贝和一个在第一代去饱和酶文库中鉴定的大螟Z11去饱和酶的拷贝(DSTg1)(参见实施例4)。一些菌株还含有脂质代谢中关键基因的缺失：FAT1(脂肪酰基-CoA合成酶/脂肪酸转运蛋白)、TGL3(细胞内三酰基甘油脂肪酶)和GUT2(甘油-3-磷酸脱氢酶)。Gut2p脱氢酶催化甘油利用途径中的第二反应，从而将甘油-3-磷酸转化为DHAP。在高浓度甘油存在下生长的GUT2敲除可能将形成高浓度的甘油-3-磷酸，这可能导致分解代谢失调。这在第二代菌株的筛选中观察到。为了避免这种生长抑制，使GUT2缺失菌株在不含甘油的培养基中生长(参见材料与方法)。
高葡萄糖培养基与28和32℃孵育温度比较(HSD036、HSD043、HSD055、HSD056和HSD061)
生长速率
运行了五次独立实验，在28和32℃下在高葡萄糖培养基中测试生物转化。在至少一个温度条件下测试所有11个菌株。无论基因型如何，初始生长速率都相似(图22A)。在28℃下，生长速率在0.21与0.23h-1之间。一些菌株在32℃下的生长速率略高，其总体范围为0.23-0.24h-1。在HSD043中使用的不含甘油培养基的高葡萄糖中孵育的菌株以较慢的速率(0.13-0.14h-1)生长，表明即使5g/L甘油也可以对生长速率产生显著的积极影响(图23)。
比生产率
在高葡萄糖培养基中，在23小时第一次取样时观察到最大比生产率(gZ11-16酸/L-OD-h)(其中底物添加发生在7小时)。在一些情况下，特别是在32℃下，比生产率维持至较晚时间点。在28℃下，源自SPV458的第二代和第三代菌株两者显示出比SPV459更高的比生产率(图22B)。对于前两个去饱和酶拷贝，观察到比生产率对去饱和酶拷贝数(约2mg/L-OD-h-拷贝数)的几乎线性依赖性(图24A)。添加第三个去饱和酶拷贝导致比生产率的较小增加。
在32℃下，在所有菌株中观察到更高的比生产率，除了以下三个：SPV1056、SPV1199和SPV1200(图22B、图24B)。这三个都是含有三个玉米穗蛾去饱和酶拷贝的菌株，并且都含有FAT1缺失。SPV1199和SPV1200具有相同的含TGL3缺失的基因型，但分别源自单独的谱系SPV968和SPV969(图21)。观察到的下降不仅仅取决于FAT1缺失的存在，因为SPV968(SPV1056和SPV1199的亲本)含有FAT1缺失并在32℃下显示出更高的平均比生产率(图22B、图24B)。在32℃下观察到比生产率对去饱和酶拷贝数的相同线性依赖性(图24B)。斜率增加到约2.5(mg/L-OD-h-拷贝数)。
Z11-16酸滴度
在最后的48小时取样中始终观察到最大Z11-16酸滴度。最大比生产率与48小时滴度适度相关(图25A)。生产率维持得如何中的变化导致数据的扩散。
含有TGL3缺失的SPV969谱系中的三个菌株持续生产率更长，从而导致更高的滴度(图22C)。SPV969在32℃下产生5.06±0.17g/L。具有三个玉米穗蛾去饱和酶拷贝的菌株SPV1058一致地持续生产率导致观察到的最大滴度，在28℃下为5.79±0.01g/L，并且在32℃下为6.1±0.08g/L。SPV969的第二个后代SPV1059含有TGL3和GUT2两种缺失。当在不含甘油培养基的高葡萄糖中培养时，SPV1059的单个复制存活而不会由于密封堵塞而变得缺氧并且达到5.39g/L的滴度(关于密封堵塞的描述参见材料与方法)。
虽然菌株SPV968和SPV1056在28℃下显示出与SPV969谱系中的菌株相似的最大比生产率，但生产率更快地逐渐减少导致48小时滴度分别为2.27±0.07g/L和3.09±0.23g/L。在32℃下，生产率持续更长时间导致更高的最终滴度。SPV968产生3.55±0.22g/L Z11-16酸。SPV1056在32℃下达到3.80±0.09g/L的最终48小时滴度。对照SPV459在28℃下产生2.36±0.03g/L，并在32℃下产生3.70±0.33g/L(图22C)。
选择性和脂质含量
48小时的选择性还用于测量菌株性能。如上所定义，选择性表明生物催化剂如何选择性地产生Z11-16酸而不是其他脂肪酸产物以及16酸底物转化为产物的程度如何两者。对于大多数菌株，选择性在32℃下更高(图26A)。这主要是由于16酸持续转化为Z11-16酸，因为天然脂肪酸滴度在两个温度下是一致的且相对较低。因此，选择性与Z11-16酸滴度适度相关(图25)。对于大多数菌株，选择性在23与48小时之间相对恒定(图25C)。在28℃下，具有多个去饱和酶拷贝的第二代和第三代菌株显示出比SPV459显著更高的选择性。观察到SPV1058和SPV1059的选择性最高，接近59％(图26A)。选择性的差异在32℃下降低，其中SPV459为45％Z11-16酸且SPV1058再次为59％(图26A)。
虽然通过OD600吸光度测量细胞密度，但对于中度肥胖的解脂耶氏酵母细胞，使用0.78gDCW/L-OD的系数通过将吸光度转换为干细胞重量(DCW)来进行生物量的脂质级分的估计。通过将脂肪酸滴度之和除以该干细胞重量浓度的估计值来计算脂质级分。通常，这些估计的脂质级分在48小时落在总细胞重量的30％与40％之间。SPV969和SPV1058在32℃下的最高脂质级分分别为44％和43％(图26B)。SPV459和SPV1056两者在32℃下具有较低的脂质级分(图26B)。相反，SPV1058在32℃下产生略高的级分(图26B)。
脂质级分似乎独立于其他测量参数进行控制，表明总脂质储存的独立调节。该假设与以下观察结果一致：SPV459输入16酸，并且在DASGIP发酵罐实验中将16酸级分进一步转化为Z11-16酸之前，最初储存16酸和Z11-16酸的组合。在Biolector测定中，没有观察到Z11-16酸生产率与最终脂质级分之间的相关性，表明增加的Z11-16酸通量不影响脂质储存(图25F)。对于所测试的菌株，脂质级分与Z11-16酸滴度也不相关(图25D和图25E)。如上所提及，所有菌株的脂质级分相似，并且Z11-16酸滴度的差异主要是16酸转化为Z11-16酸的程度的函数。通过增加细胞的脂质含量可以实现Z11-16酸滴度的进一步增加。
28℃下高葡萄糖培养基和高甘油培养基性能的比较(HSD062)
在实验HSD062中，使用SPV459将初级高葡萄糖培养基与当前进料分批发酵过程的分批阶段中使用的高甘油培养基进行比较(参见培养基组合物的材料与方法)。高葡萄糖与高甘油培养基之间的唯一差异是葡萄糖和甘油共底物的浓度。高葡萄糖培养基含有120g/L葡萄糖和5g/L甘油，而高甘油培养基含有40g/L葡萄糖和60g/L甘油。在高葡萄糖和高甘油培养基中，实验HSD062的初始生长速率相似(图27)。
比生产率
比生产率随菌株、培养基和时间点的变化而变化。专用于高葡萄糖培养基中的23小时SPV459样品的孔被丢失以密封堵塞，从而无法准确测量比生产率。高甘油条件下23小时的比生产率低于先前在高葡萄糖值下观察到的比生产率(2.4±0.1mg/L-OD-h)(图28A)。尽管早期比生产率较低，但SPV459后来在高甘油培养基中增加了Z11-16酸产生。从41.5小时时间点计算的比生产率对于高甘油培养基为4.2±0.2mg/L-OD-h，并且对于高葡萄糖培养基为2.1±0.5mg/L-OD-h(图28B)。
如先前在高葡萄糖培养基中观察到的，SPV968和SPV1056在生物转化早期具有更高的比生产率(图28A)。与高葡萄糖培养基相比，两种菌株在高甘油培养基中具有较低的早期比生产率，但至41.5小时时间点维持较低的生产率(图28A和图28B)。
Z11-16酸滴度
由于上述比生产率模式，Z11-16酸滴度因菌株和培养基而变化。SPV458和SPV459在高甘油培养基中产生更多Z11-16酸，而SPV968和SPV1056滴度在两种培养基中相似(图28C)。
选择性和脂质含量
选择性和脂质含量对培养基的依赖性也因菌株而变化。尽管Z11-16酸滴度存在显著差异，但两种培养基中SPV459选择性相当(图28D)。高甘油培养基中SPV458选择性高出35％，而Z11-16酸滴度高出56％(图28D和图28C)。从SPV968(17％)和SPV1056(6％)观察到Z11-16酸选择性的较小增加(图28D)。
对于高葡萄糖培养基观察到的Z11-16酸选择性与滴度之间的相关性未转移到高甘油培养基，因为SPV459在高甘油培养基中累积更高的16酸、Z9-18酸和Z9Z12-18酸滴度。菌株SPV968和SPV1056通过还原16酸累积保持相似的选择性，同时增加高甘油培养基中的Z9-18酸和Z9Z12-18酸滴度(图29)。
估计脂质含量的趋势与关于Z11-16酸滴度和选择性的观察结果一致。高甘油培养基中SPV459和SPV458的估计脂质含量分别高出95％和56％(图28E、图30)。SPV968和SPV1056在两种培养基中累积相似的脂质含量。
概述
当组合时，这些结果支持以下假设：SPV459和SPV458中更高的16酸摄取率导致去饱和酶的更高的细胞内底物浓度，并导致更高的Z11-16酸滴度。SPV968和SPV1056在高甘油培养基中未累积增加的16酸，这与摄取率对这些菌株中的甘油和葡萄糖浓度不敏感一致。SPV968和SPV1056两者都含有FAT1缺失，这可以解释对培养基变化的不敏感性。FAT1已被鉴定为涉及脂质动员的脂质体/过氧化物酶体脂肪酸转运蛋白(Dulermo,R.,Gamboa-Meléndez,H.,Ledesma-Amaro,R.,Thévenieau,F.,&Nicaud,J.M.(2015)Unraveling fattyacid transport and activation mechanisms in Yarrowia lipolytica.Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids,1851(9):1202-1217)。不受任何一种理论的束缚，Fat1p可能以中等依赖性方式差异地靶向不同的膜，并且在一些条件下有助于脂肪酸摄取。可替代地，它可能有助于细胞内脂肪酸的活化。对于所有菌株，天然C18脂肪酸的增加支持高甘油培养基中更高的从头脂肪酸合成率或CoA-伸长率。
在初级高葡萄糖培养基下生长的关键菌株的生产率、最大滴度和选择性在下表17中给出。可以从该数据得出几个关键的观察结果：
在28℃下比生产率随着去饱和酶拷贝数而增加。该增加是非线性的；当添加第三个去饱和酶拷贝时，观察到较小的增加。
当孵育温度从28℃增加到32℃时，大多数菌株的比生产率增加。SPV1056、SPV1199和SPV1200例外。这些菌株都具有三个玉米穗蛾去饱和酶的拷贝和FAT1缺失。
Z11-16酸滴度通常随着去饱和酶拷贝数而增加。TGL3缺失菌株SPV969和SPV1058在48小时产生最高滴度(5-6g/L)。
所有菌株在32℃下的Z11-16酸滴度都较高。
选择性与Z11-16酸滴度相关。对于SPV1056(0.57±0.02)和SPV1058(0.59±0.01)观察到最高的可重复选择性。
表17.关键Z11-16酸产生菌株的菌株性能指标。
实验HSD062比较了SPV459、SPV458、SPV968和SPV1056在高葡萄糖和高甘油培养基条件下在28℃下的性能(表18)。
当在高甘油培养基中培养时，SPV458和SPV459显示出更高的总脂肪酸滴度(分别为7.8和10.6gTFA/L)、Z11-16酸滴度(2.1和3.8gZ11-16酸/L)和脂质级分(0.47和0.52gZ11-16酸/gTFA)。
在高葡萄糖培养基中，SPV968和SPV1056在最初的23小时内显示出更高的比生产率。对于SPV1056，两种培养基的总体性能相似，并且对于SPV968，高葡萄糖培养基中的总体性能更好。
表18.相对于高葡萄糖培养基的高甘油培养基中的菌株性能(HSD062)数值显示在28℃下高甘油培养基中每种菌株相对于高葡萄糖培养基中该菌株性能增加或减少的百分比。
在初级高葡萄糖培养基下生长的所有菌株的观察到的比生产率、估计的比生产率、最大滴度和选择性在下表19中给出。
表19.所有测试菌株的菌株性能指标。
结论
在高葡萄糖培养基中：
额外的Z11去饱和酶拷贝提高了Z11-16酸比生产率
脂质代谢缺失导致Z11-16酸滴度增加
当与SPV459(3.7g/L，3.7mg/L-OD-h)比较时，SPV1058中额外的去饱和酶拷贝和细胞内脂肪酶TGL3缺失的组合导致Z11-16酸滴度(6.1g/L)增加约65％并且比生产率(5.7mg/L-OD-h)增加约55％。
高甘油培养基的变化不同地影响菌株。在700μl规模下，与高葡萄糖培养基相比，SPV459和SPV458在高甘油培养基中产生显著更高的Z11-16酸滴度。SPV1056在两种培养基中的表现相似。
SPV1056和/或SPV1058可以用作过程开发的第二代菌株。
第二代过程的开发考虑了共底物的组成。
测试重组酰基转移酶表达以增加脂肪酸储存含量(gTFA/gDCW)。目前的菌株在Biolector 700μl测定中显示40％-50％的脂肪酸。
材料与方法
Biolector菌株筛选生物转化
从YPD琼脂贴片接种解脂耶氏酵母菌株并使其在28℃和1000rpm(Infors板孵育箱)下在2ml YPD种子培养物中生长16小时至OD600≈10。将种子培养物沉淀并在新鲜YPD中浓缩至OD600≈80。使用1.5-2.5％的接种物在M2Plabs 48孔花板中接种新鲜培养基。通常，使用700μl体积，除了在32℃下测试600和700μl两个体积的实验HSD061。通常，使用高葡萄糖培养基，除了其中GUT2缺失和对照菌株使用不含甘油培养基的高葡萄糖的实验HSD043，和其中菌株在高甘油培养基中培养的实验HSD062(下表20)。在Biolector中在28或32℃和1500rpm下生长7小时后，取出板并将8.4μl 37℃棕榈酸甲酯作为液体加入到每个孔中，并将板重新密封并返回到Biolector。在接种后23小时，从A行和B行取出250μl样品，并转移到玻璃钳口顶部GC小瓶中。将样品小瓶冷冻并储存在-80℃下。在取样后，向每个孔中加入另外8.4μl 37℃棕榈酸甲酯。更换花板密封并再孵育8小时(31小时时间点)。然后如对于A行和B行所述对C行和D行进行取样。然后将板孵育17小时(48小时时间点)并从E行和F行取出样品。每次取样时用Tecan M200Pro读板器测量细胞密度。如上所述进行HSD062，不同之处在于在31小时未取样，并且在接种后41.5小时从C-F行取出四个重复样品。
在所有实验中，使用Biolector板上的氧敏感光极监测溶解氧(DO)。由于生物膜堵塞板密封而产生的缺氧条件导致一些实验重复丢失(参见用于示例的图31A-图31E)。基于DO数据，堵塞可能因各种原因而发生，从而导致生长速率和Z11-16酸产生的不同程度的扰动。在分析中仅使用来自具有持续氧转移的重复的数据。所有数据的图呈现于图31A-图31E中。
表20.培养基组成
GC样品处理-冻干样品
将250μL培养物在开口玻璃钳口顶部小瓶中冻干至少3小时。将500μL TMSH加入到小瓶中并用钳口盖密封。将这些小瓶排列在架子中，以250rpm将该架子置于28℃的板振荡器中2小时。在将这些干燥的细胞与衍生剂混合后，将小瓶在加热块中在85℃下温育1小时以裂解细胞膜。最后，将甲基化样品的液体部分转移到带有玻璃插入物的干净GC小瓶中，以防止固体碎片在GC分析期间堵塞柱。使用PROVIVI_002_DUAL_EXTRAWASH_1.M方法在GC-FID上运行样品，其参数可以在以下找到。
前入口/检测器：
系统 6890GC，ChemStation Rev.B.03.02(341)
柱 J&W DB-23 30mx 25mm x 25μm
运行时间＝14.4min
入口 加热器＝240℃；压力＝9.0psi；总流量{H2}＝36.2mL/min
载气 H2@1.0mL/min，9.0psi，35cm/sec
信号 数据速率＝2Hz/0.1min
烘箱 150℃持续1min
升温12℃/min至220℃，保持3min
升温35℃/min至240℃，保持4min
平衡时间：2min
进样 分流，240℃
分流比–30:1；29.1mL/min
检测器 FID，240℃
H2@35.0mL/min，空气@350mL/min
静电计{点火补偿值}@2.0pA
样品 进样体积＝1μL
后入口/检测器：
系统 6890GC，ChemStation Rev.B.03.02(341)
柱 J&W DB-23 30m x 25mm x 25μm
运行时间＝14.4min
入口 加热器＝240℃；压力＝9.8psi；总流量{H2}＝40.1mL/min
载气 H2@1.1mL/min，9.8psi，38cm/sec
信号 数据速率＝2Hz/0.1min
烘箱 150℃持续1min
升温12℃/min至220℃，保持3min
升温35℃/min至240℃，保持4min
平衡时间：2min
进样 分流，240℃
分流比–30:1；32.3mL/min
检测器 FID，240℃
H2@35.0mL/min，空气@350mL/min
静电计{点火补偿值}@2.0pA
样品 进样体积＝1μL
TMSH：三甲基氢氧化锍(0.2mol/L，在甲醇中)–VWR TCT1576-025ML
序列表
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以引用的方式并入
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序列表
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Otte, Konrad B.
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Bui, Vu
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<120> 脂肪醇和脂肪醛的半生物合成产生
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<211> 338
<212> PRT
<213> 玉米穗蛾
<400> 1
Met Ala Gln Ser Tyr Gln Ser Thr Thr Val Leu Ser Glu Glu Lys Glu
1 5 10 15
Leu Thr Leu Gln His Leu Val Pro Gln Ala Ser Pro Arg Lys Tyr Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Leu Ile Thr Phe Gly Tyr Trp His Ile Ala Gly
35 40 45
Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Ala Thr Ile
50 55 60
Leu Phe Ser Tyr Ile Leu Phe Val Leu Ala Glu Ile Gly Ile Thr Ala
65 70 75 80
Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys Thr Tyr Lys Ala Lys Leu Pro
85 90 95
Leu Glu Ile Leu Leu Met Val Phe Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asn Ser
100 105 110
Ala Ile Asp Trp Val Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser Asp
115 120 125
Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His
130 135 140
Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Glu Val Lys Lys Arg Gly
145 150 155 160
Lys Glu Leu Asn Met Ser Asp Ile Tyr Asn Asn Pro Val Leu Arg Phe
165 170 175
Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Ala Val Cys Phe Ala Leu
180 185 190
Pro Thr Met Ile Pro Val Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Trp Ser Asn Ala
195 200 205
Trp His Ile Thr Met Leu Arg Tyr Ile Met Asn Leu Asn Val Thr Phe
210 215 220
Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly Asn Lys Pro Tyr Asp Ala
225 230 235 240
Lys Ile Leu Pro Ala Gln Asn Val Ala Val Ser Val Ala Thr Gly Gly
245 250 255
Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ala
260 265 270
Ala Glu Leu Gly Asn Asn Ser Leu Asn Leu Thr Thr Lys Phe Ile Asp
275 280 285
Leu Phe Ala Ala Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Glu
290 295 300
Asp Met Ile Lys Gln Arg Ile Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp Leu
305 310 315 320
Trp Gly His Glu Gln Asn Cys Asp Glu Val Trp Asp Val Lys Asp Lys
325 330 335
Ser Ser
<210> 2
<211> 324
<212> PRT
<213> 大螟
<400> 2
Met Leu Ser Gln Glu Glu Pro Thr Asp Thr Ser Leu Val Pro Arg Ala
1 5 10 15
Ala Pro Arg Lys Tyr Gln Ile Val Tyr Pro Asn Leu Ile Thr Phe Gly
20 25 30
Tyr Trp His Leu Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser
35 40 45
Ala Lys Trp Thr Thr Ile Leu Phe Ser Phe Ile Leu Cys Val Ile Ala
50 55 60
Glu Ile Gly Val Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Asn Leu Pro Leu Gln Ile Leu Leu Met Val Met Asn Ser
85 90 95
Ile Ala Phe Gln Asn Ser Ala Ile Asp Trp Val Arg Asp His Arg Leu
100 105 110
His His Lys Tyr Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Ser Arg
115 120 125
Gly Phe Phe Tyr Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro
130 135 140
Glu Val Lys Lys Arg Gly Lys Glu Leu Asp Met Ser Asp Ile Tyr Ser
145 150 155 160
Asn Pro Val Leu Arg Phe Gln Lys Gln Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly
165 170 175
Ala Val Cys Phe Ile Leu Pro Thr Val Ile Pro Val Tyr Cys Trp Gly
180 185 190
Glu Thr Trp Thr Asn Ala Trp His Ile Thr Met Leu Arg Tyr Ile Thr
195 200 205
Asn Leu Asn Val Thr Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly
210 215 220
Tyr Lys Pro Tyr Asp Glu Asn Ile Leu Pro Ala Gln Asn Ile Ala Val
225 230 235 240
Ser Ile Ala Thr Cys Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Val Phe
245 250 255
Pro Trp Asp Tyr Arg Ala Ala Glu Leu Gly Asn Asn Asn Leu Asn Leu
260 265 270
Thr Thr Lys Phe Ile Asp Phe Phe Ala Trp Leu Gly Trp Ala Tyr Asp
275 280 285
Leu Lys Thr Val Ser Ser Asp Met Ile Lys Leu Arg Ala Lys Arg Thr
290 295 300
Gly Asp Gly Thr Asn Leu Trp Gly Glu His Asn Asp Glu Leu Lys Glu
305 310 315 320
Gly Lys Glu Asp
<210> 3
<211> 1050
<212> DNA
<213> 粉纹夜蛾
<400> 3
atggctgtga tggctcaaac agtacaagaa acggctacag tgttggaaga ggaagctcgc 60
acagtgactc ttgtggctcc aaagacaacg ccaaggaaat ataaatatat atacaccaac 120
tttcttacat tttcatatgc gcatttagct gcattatacg gactttattt gtgcttcacc 180
tctgcgaaat gggaaacatt gctattctct ttcgtactct tccacatgtc aaatataggc 240
atcaccgcag gggctcaccg actctggact cacaagactt tcaaagccaa attgcctttg 300
gaaattgtcc tcatgatatt caactcttta gcctttcaaa acacggctat tacatgggct 360
agagaacatc ggctacatca caaatacagc gatactgatg ctgatcccca caatgcgtca 420
agagggttct tctactcgca tgttggctgg ctattagtaa aaaaacatcc cgatgtcctg 480
aaatatggaa aaactataga catgtcggat gtatacaata atcctgtgtt aaaatttcag 540
aaaaagtacg cagtaccctt aattggaaca gtttgttttg ctctgccaac tttgattcca 600
gtctactgtt ggggcgaatc gtggaacaac gcttggcaca tagccttatt tcgatacata 660
ttcaatctta acgtgacttt cctagtcaac agtgctgcgc atatctgggg gaataagcct 720
tatgataaaa gcatcttgcc cgctcaaaac ctgctggttt ccttcctagc aagtggagaa 780
ggcttccata attaccatca cgtctttcca tgggattacc gcacagcaga attagggaat 840
aacttcctga atttgacgac gctgttcatt gatttttgtg cctggtttgg atgggcttat 900
gacttgaagt ctgtatcaga ggatattata aaacagagag ctaaacgaac aggtgacggt 960
tcttcagggg tcatttgggg atgggacgac aaagacatgg accgcgatat aaaatctaaa 1020
gctaacattt tttatgctaa aaaggaatga 1050
<210> 4
<211> 1011
<212> DNA
<213> 黄地老虎
<400> 4
atggctcaag gtgtccaaac aactacgata ttgagggagg aggagccgtc attgactttc 60
gtggtacctc aagaaccgag aaagtatcaa atcgtgtacc caaaccttat cacatttggg 120
tactggcata tagctggttt atacgggcta tatttgtgct ttacttcggc aaaatggcaa 180
acaattttat tcagtttcat gctcgttgtg ttagcagagt tgggaataac agccggcgct 240
cacaggttat gggcccacaa aacatataaa gcgaagcttc ccttacaaat tatcctgatg 300
atactgaact ccattgcctt ccaaaattcc gccattgatt gggtgaggga ccaccgtctc 360
catcataagt acagtgacac tgatgcagac cctcacaatg ctactcgtgg tttcttctat 420
tctcatgttg gatggttgct cgtaagaaaa catccagaag tcaagagacg tggaaaggaa 480
cttgacatgt ctgatattta caacaatcca gtgctgagat ttcaaaagaa gtatgctata 540
cccttcatcg gggcaatgtg cttcggatta ccaactttta tccctgttta cttctgggga 600
gaaacctgga gtaatgcttg gcatatcacc atgcttcggt acatcctcaa cctaaacatt 660
actttcctgg tcaacagtgc tgctcatatc tggggataca aaccttatga catcaaaata 720
ttgcctgccc aaaatatagc agtttccata gtaaccggcg gcgaagtttc cataactacc 780
accacgtttt ttccttggga ttatcgtgca gcagaattgg ggaacaatta tcttaatttg 840
acgactaagt tcatagattt cttcgcttgg atcggatggg cttacgatct taagacggtg 900
tccagtgatg ttataaaaag taaggcggaa agaactggtg atgggacgaa tctttggggt 960
ttagaagaca aaggtgaaga agattttttg aaaatctgga aagacaatta a 1011
<210> 5
<211> 1440
<212> DNA
<213> 假微型海链藻
<400> 5
actagtatgg actttctctc cggcgatcct ttccggacac tcgtccttgc agcacttgtt 60
gtcatcggat ttgctgcggc gtggcaatgc ttctacccgc cgagcatcgt cggcaagcct 120
cgtacattaa gcaatggtaa actcaatacc agaatccatg gcaaattgta cgacctctca 180
tcgtttcagc atccaggagg ccccgtggct ctttctcttg ttcaaggtcg cgacggaaca 240
gctctatttg agtcacacca tcccttcata cctcgaaaga atctacttca gatcctctcc 300
aagtacgagg ttccgtcgac tgaagactct gtttccttca tcgccaccct agacgaactc 360
aatggtgaat ctccgtacga ttggaaggac attgaaaatg atgatttcgt atctgaccta 420
cgagctctcg taattgagca cttttctcct ctcgccaagg aaaggggagt ttcactcgtt 480
gagtcgtcga aggcaacacc tcagcggtgg atggtggttc tactgctcct tgcgtcgttc 540
ttcctcagca tcccattata tttgagtggt tcgtggactt tcgttgtcgt cactcccatc 600
ctcgcttggc tggcggttgt caattactgg cacgatgcta ctcactttgc attgagcagc 660
aactggattt tgaatgctgc gctcccatat ctcctccctc tcctatcgag tccgtcaatg 720
tggtatcatc atcacgtcat tggacatcac gcatacacca acatttccaa aagagatcca 780
gatcttgctc acgctccaca actcatgaga gaacacaaga gtatcaaatg gagaccatct 840
cacttaaatc aaacacagct tccgcggatt ctcttcatct ggtcgattgc agtcggtatt 900
gggttgaact tactgaacga cgtgagagca ctaaccaagc tttcatacaa caacgttgtt 960
cgggtggaga agatgtcatc gtcgcgaaca ttactccatt tccttggacg tatgttgcac 1020
atctttgtga ctacactttg gccctttttg gcgtttccgg tgtggaaggc catcgtttgg 1080
gcgactgtac cgaatgccat actgagtttg tgcttcatgc tgaatacgca aatcaatcac 1140
ctcatcaaca cgtgtgcaca tgcttccgat aacaactttt acaagcatca agttgtaact 1200
gctcagaact ttggccgatc aagtgccttt tgcttcatct tctcgggagg tctcaactac 1260
caaattgaac atcatttgtt gccgacggtg aaccattgcc atttgccagc tttggccccg 1320
ggtgtagagc gtttgtgtaa gaaacacggg gtgacataca actctgttga aggatacaga 1380
gaggccatca ttgcacactt tgcacatacc aaagatatgt cgacgaagcc tactgattga 1440
<210> 6
<211> 981
<212> DNA
<213> 脐橙螟蛾
<400> 6
atggtcccta acaagggttc cagtgacgtt ttgtctgaac attctgagcc ccagttcact 60
aaactcatag ctccacaagc agggccgagg aaatacaaga tagtgtatcg aaatttgctc 120
acattcggct attggcactt atcagctgtt tatgggctct acttgtgctt tacttgtgcg 180
aaatgggcta ccatcttatt tgcatttttc ttatacgtga tcgcggaaat cggtataaca 240
ggtggcgctc ataggctatg ggcacatcgg acttataaag ccaagttgcc tttagagatt 300
ttgttactca taatgaactc tattgccttc caagacactg ctttcacctg ggctcgtgat 360
caccgccttc atcacaaata ttcggatact gacgctgatc cccacaatgc taccagaggg 420
tttttctatt cacatgtagg ctggcttttg gtgaagaaac accctgaagt caaagcaaga 480
ggaaaatact tgtcgttaga tgatcttaag aataatccat tgcttaaatt ccaaaagaaa 540
tacgctattc tagttatagg cacgttatgc ttccttatgc caacatttgt gcccgtatac 600
ttctggggcg agggcatcag cacggcctgg aacatcaatc tattgcgata cgtcatgaat 660
cttaacatga ctttcttagt taacagtgca gcgcatatct ttggcaacaa accatacgat 720
aagagcatag cctcagtcca aaatatttca gttagcttag ctacttttgg cgaaggattc 780
cataattacc atcacactta cccctgggat tatcgtgcgg cagaattagg aaataatagg 840
ctaaatatga ctactgcttt catagatttc ttcgcttgga tcggctgggc ttatgacttg 900
aagtctgtgc cacaagaggc cattgcaaaa aggtgtgcga aaactggcga tggaacggat 960
atgtggggtc gaaaaagata a 981
<210> 7
<211> 1017
<212> DNA
<213> 玉米穗蛾
<400> 7
atggcccaaa gctatcaatc aactacggtt ttgagtgagg agaaagaact aacactgcaa 60
catttggtgc cccaagcatc gcccaggaag tatcaaatag tgtatccgaa cctcattacg 120
tttggttact ggcacatagc cggactttat ggcctttact tgtgcttcac ttctgctaaa 180
tgggctacga ttttattcag ctacatcctc ttcgtgttag cagaaatagg aatcacggct 240
ggcgctcaca gactctgggc ccacaaaact tacaaagcga aactaccatt agaaatactc 300
ttaatggtat tcaactccat cgcttttcaa aactcagcca ttgactgggt gagggaccac 360
cgactccacc ataagtatag cgatacagat gctgatcccc acaatgccag ccgagggttc 420
ttttattccc atgtaggatg gctacttgtg agaaaacatc ctgaagtcaa aaagcgaggg 480
aaagaactca atatgtccga tatttacaac aatcctgtcc tgcggtttca gaaaaaatac 540
gccataccct tcattggggc tgtttgtttc gccttaccta caatgatacc tgtttacttc 600
tggggagaaa cctggtccaa tgcttggcat atcaccatgc ttcgctacat catgaacctc 660
aatgtcacct ttttggtaaa cagcgctgct catatatggg gaaacaagcc ttatgacgca 720
aaaatattac ctgcacaaaa tgtagctgtg tcggtcgcca ctggtggaga aggtttccat 780
aattaccacc atgtcttccc ctgggattat cgagcagcgg aactcggtaa caatagcctc 840
aatctgacga ctaaattcat agatttattc gcagcaatcg gatgggcata tgatctgaag 900
acggtttcgg aggatatgat aaaacaaagg attaaacgca ctggagatgg aacggatctt 960
tggggacacg aacaaaactg tgatgaagtg tgggatgtaa aagataaatc aagttaa 1017
<210> 8
<211> 1092
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合至黄地老虎去饱和酶的白假丝酵母OLE1前导序列
<400> 8
atgactacag ttgaacaact tgaaactgtt gatatcacta aattgaatgc cattgctgct 60
ggtactaata agaaggtgcc aatggctcaa ggtgtccaaa caactacgat attgagggag 120
gaagagccgt cattgacttt cgtggtacct caagaaccga gaaagtatca aatcgtgtac 180
ccaaacctta tcacatttgg gtactggcat atagctggtt tatacgggct atatttgtgc 240
tttacttcgg caaaatggca aacaatttta ttcagtttca tgctcgttgt gttagcagag 300
ttgggaataa cagccggcgc tcacaggtta tgggcccaca aaacatataa agcgaagctt 360
cccttacaaa ttatcttaat gatattaaac tccattgcct tccaaaattc cgccattgat 420
tgggtgaggg accaccgtct ccatcataag tacagtgaca ctgatgcaga ccctcacaat 480
gctactcgtg gtttcttcta ttctcatgtt ggatggttgc tcgtaagaaa acatccagaa 540
gtcaagagac gtggaaagga acttgacatg tctgatattt acaacaatcc agtgttaaga 600
tttcaaaaga agtatgctat acccttcatc ggggcaatgt gcttcggatt accaactttt 660
atccctgttt acttctgggg agaaacctgg agtaatgctt ggcatatcac catgcttcgg 720
tacatcctca acctaaacat tactttctta gtcaacagtg ctgctcatat ctggggatac 780
aaaccttatg acatcaaaat attgcctgcc caaaatatag cagtttccat agtaaccggc 840
ggcgaagttt ccataactac caccacgttt tttccttggg attatcgtgc agcagaattg 900
gggaacaatt atcttaattt gacgactaag ttcatagatt tcttcgcttg gatcggatgg 960
gcttacgatc ttaagacggt gtccagtgat gttataaaaa gtaaggcgga aagaactggt 1020
gatgggacga atctttgggg tttagaagac aaaggtgaag aagatttttt gaaaatctgg 1080
aaagacaatt aa 1092
<210> 9
<211> 1011
<212> DNA
<213> 黄地老虎
<400> 9
atggctcaag gtgtccaaac aactacgata ttgagggagg aagagccgtc attgactttc 60
gtggtacctc aagaaccgag aaagtatcaa atcgtgtacc caaaccttat cacatttggg 120
tactggcata tagctggttt atacgggcta tatttgtgct ttacttcggc aaaatggcaa 180
acaattttat tcagtttcat gctcgttgtg ttagcagagt tgggaataac agccggcgct 240
cacaggttat gggcccacaa aacatataaa gcgaagcttc ccttacaaat tatcttaatg 300
atattaaact ccattgcctt ccaaaattcc gccattgatt gggtgaggga ccaccgtctc 360
catcataagt acagtgacac tgatgcagac cctcacaatg ctactcgtgg tttcttctat 420
tctcatgttg gatggttgct cgtaagaaaa catccagaag tcaagagacg tggaaaggaa 480
cttgacatgt ctgatattta caacaatcca gtgttaagat ttcaaaagaa gtatgctata 540
cccttcatcg gggcaatgtg cttcggatta ccaactttta tccctgttta cttctgggga 600
gaaacctgga gtaatgcttg gcatatcacc atgcttcggt acatcctcaa cctaaacatt 660
actttcttag tcaacagtgc tgctcatatc tggggataca aaccttatga catcaaaata 720
ttgcctgccc aaaatatagc agtttccata gtaaccggcg gcgaagtttc cataactacc 780
accacgtttt ttccttggga ttatcgtgca gcagaattgg ggaacaatta tcttaatttg 840
acgactaagt tcatagattt cttcgcttgg atcggatggg cttacgatct taagacggtg 900
tccagtgatg ttataaaaag taaggcggaa agaactggtg atgggacgaa tctttggggt 960
ttagaagaca aaggtgaaga agattttttg aaaatctgga aagacaatta a 1011
<210> 10
<211> 981
<212> DNA
<213> 脐橙螟蛾
<400> 10
atggtcccta acaagggttc cagtgacgtt ttgtctgaac attctgagcc ccagttcact 60
aaactcatag ctccacaagc agggccgagg aaatacaaga tagtgtatcg aaatttgctc 120
acattcggct attggcactt atcagctgtt tatgggctct acttgtgctt tacttgtgcg 180
aaatgggcta ccatcttatt tgcatttttc ttatacgtga tcgcggaaat cggtataaca 240
ggtggcgctc ataggctatg ggcacatcgg acttataaag ccaagttgcc tttagagatt 300
ttgttactca taatgaattc tattgccttc caagacactg ctttcacctg ggctcgagat 360
caccgccttc atcacaaata ttcggatact gacgctgatc cccacaatgc taccagaggg 420
tttttctatt cacatgtagg ctggcttttg gtgaagaaac accctgaagt caaagcaaga 480
ggaaaatact tgtcgttaga tgatcttaag aataatccat tgcttaaatt ccaaaagaaa 540
tacgctattc tagttatagg cacgttatgc ttccttatgc caacatttgt gcccgtatac 600
ttctggggcg agggcatcag cacggcctgg aacatcaatc tattgcgata cgtcatgaat 660
cttaacatga ctttcttagt taacagtgca gcgcatatct ttggcaacaa accatacgat 720
aagagcatag cctcagtcca aaatatttca gttagcttag ctacttttgg cgaaggattc 780
cataattacc atcacactta cccctgggat tatcgtgcgg cagaattagg aaataatagg 840
ctaaatatga ctactgcttt catagatttc ttcgcttgga tcggctgggc ttatgacttg 900
aagtctgtgc cacaagaggc cattgcaaaa aggtgtgcga aaactggcga tggaacggat 960
atgtggggtc gaaaaagata a 981
<210> 11
<211> 1050
<212> DNA
<213> 粉纹夜蛾
<400> 11
atggctgtga tggctcaaac agtacaagaa acggctacag tgttggaaga ggaagctcgc 60
acagtgactc ttgtggctcc aaagacaacg ccaaggaaat ataaatatat atacaccaac 120
tttcttacat tttcatatgc gcatttagct gcattatacg gactttattt gtgcttcacc 180
tctgcgaaat gggaaacatt gctattctct ttcgtactct tccacatgtc aaatataggc 240
atcaccgcag gggctcaccg actctggact cacaagactt tcaaagccaa attgcctttg 300
gaaattgtcc tcatgatatt caactcttta gcctttcaaa acacggctat tacatgggct 360
agagaacatc ggctacatca caaatacagc gatactgatg ctgatcccca caatgcgtca 420
agagggttct tctactcgca tgttggctgg ctattagtaa aaaaacatcc cgatgtctta 480
aaatatggaa aaactataga catgtcggat gtatacaata atcctgtgtt aaaatttcag 540
aaaaagtacg cagtaccctt aattggaaca gtttgttttg ctcttccaac tttgattcca 600
gtctactgtt ggggcgaatc gtggaacaac gcttggcaca tagccttatt tcgatacata 660
ttcaatctta acgtgacttt cctagtcaac agtgctgcgc atatctgggg gaataagcct 720
tatgataaaa gcatcttgcc cgctcaaaac ttattagttt ccttcctagc aagtggagaa 780
ggcttccata attaccatca cgtctttcca tgggattacc gcacagcaga attagggaat 840
aacttcttaa atttgacgac gttattcatt gatttttgtg cctggtttgg atgggcttat 900
gacttgaagt ctgtatcaga ggatattata aaacagagag ctaaacgaac aggtgacggt 960
tcttcagggg tcatttgggg atgggacgac aaagacatgg accgcgatat aaaatctaaa 1020
gctaacattt tttatgctaa aaaggaatga 1050
<210> 12
<211> 1017
<212> DNA
<213> 玉米穗蛾
<400> 12
atggcccaaa gctatcaatc aactacggtt ttgagtgagg agaaagaact aacattacaa 60
catttggtgc cccaagcatc gcccaggaag tatcaaatag tgtatccgaa cctcattacg 120
tttggttact ggcacatagc cggactttat ggcctttact tgtgcttcac ttctgctaaa 180
tgggctacga ttttattcag ctacatcctc ttcgtgttag cagaaatagg aatcacggct 240
ggcgctcaca gactctgggc ccacaaaact tacaaagcga aactaccatt agaaatactc 300
ttaatggtat tcaactccat cgcttttcaa aactcagcca ttgactgggt gagggaccac 360
cgactccacc ataagtatag cgatacagat gctgatcccc acaatgccag ccgagggttc 420
ttttattccc atgtaggatg gctacttgtg agaaaacatc ctgaagtcaa aaagcgaggg 480
aaagaactca atatgtccga tatttacaac aatcctgtct tacggtttca gaaaaaatac 540
gccataccct tcattggggc tgtttgtttc gccttaccta caatgatacc tgtttacttc 600
tggggagaaa cctggtccaa tgcttggcat atcaccatgc ttcgctacat catgaacctc 660
aatgtcacct ttttggtaaa cagcgctgct catatatggg gaaacaagcc ttatgacgca 720
aaaatattac ctgcacaaaa tgtagctgtg tcggtcgcca ctggtggaga aggtttccat 780
aattaccacc atgtcttccc ctgggattat cgagcagcgg aactcggtaa caatagcctc 840
aatttaacga ctaaattcat agatttattc gcagcaatcg gatgggcata tgatttaaag 900
acggtttcgg aggatatgat aaaacaaagg attaaacgca ctggagatgg aacggatctt 960
tggggacacg aacaaaactg tgatgaagtg tgggatgtaa aagataaatc aagttaa 1017
<210> 13
<211> 1068
<212> DNA
<213> 亚洲玉米螟
<400> 13
atggctccta atattaagga cggagctgat ttgaacggag ttttatttga agatgacgct 60
agcacccccg attatgccct tgccacggcc ccagtccaga aagcagacaa ctatcccaga 120
aaactagtgt ggagaaacat catactcttt gcataccttc accttgccgc tgtgtatgga 180
gcatacctat tcttattttc agcgaaatgg cagacagata tttttgccta cattctttac 240
gtgatctcag gactcggcat cacagcggga gcccaccgcc tttgggcgca caagtcatac 300
aaggctaagt ggccacttag actcattctt attatcttca acactgtatc attccaggac 360
tctgctctcg actggtcacg tgaccaccgc atgcaccaca aatactcgga gaccgacgcc 420
gacccgcaca acgcgactcg agggttcttc ttctctcata tcggctggtt attagtccgc 480
aagcacccgg aattaaagag aaagggcaag ggattagact taagcgactt gtatgctgat 540
cccatcctcc gtttccagaa gaagtactat ttactattaa tgcctcttgg ctgcttcatc 600
atgccgacgg tggtcccggt gtacttctgg ggtgagactt ggactaacgc tttcttcgtc 660
gccgcgctct tccgatacac cttcatcctc aatgtcacct ggttggtcaa ctccgccgcg 720
cacaagtggg gccacaagcc ctatgacagc agcatcaagc cttccgagaa cctctcagtc 780
tccttattcg cgttgggcga aggattccac aactaccacc acacattccc ctgggactac 840
aaaactgccg agctcggcaa caacagactc aatttcacaa caaacttcat caacttcttc 900
gctaaaatcg gatgggctta cgacttgaaa acggtctccg acgagattat tcagaataga 960
gtcaagcgca caggagatgg ctcccaccac ttatggggtt ggggcgacaa ggatcaacct 1020
aaagaggagg taaacgcagc cattagaatt aatcctaaag acgagtaa 1068
<210> 14
<211> 1059
<212> DNA
<213> 红醋栗穿孔蛾
<400> 14
atgccgccga acgtgacaga ggcgaacgga gtgttatttg agaatgacgt gcagactcct 60
gacatggggc tagaagtggc ccctgtgcag aaggctgacg agcgtaagat ccagctcgtt 120
tggaggaaca tcatcgcttt tgcatgtctt catttagcag ctgtgtatgg agcttattta 180
ttcttcacct cggctatatg gcagacagac atatttgcat acatccttta cgttatgtct 240
ggattaggaa tcacggcggg agcgcacaga ttatgggctc ataagtcata caaggcgaag 300
tggccgttaa gattaatcct cgtcgcattc aacactttgg cattccagga ttcggcaatc 360
gactgggcgc gcgaccaccg catgcaccac aagtactcgg agacggatgc ggacccacat 420
aacgccactc gcggcttctt cttttcgcac attggttggt tactctgccg aaaacacccg 480
gagctaaagc gcaagggcca gggcctcgac ttaagtgacc tctacgcaga tcctattatt 540
cgcttccaaa agaagtacta cttattgtta atgccgttag cctgctttgt tcttcccacc 600
ataattccgg tctacctctg gggcgagtcc tggaaaaacg cgttcttcgt agctgcaatg 660
ttccgttaca cgttcatcct caacgtaaca tggctcgtca actccgccgc ccacaaatgg 720
ggaggcaagc cctatgataa gaacatccag cccgctcaga acatctctgt agctatcttc 780
gcattaggcg agggcttcca caactaccac cacacgttcc cctgggacta caagaccgct 840
gaattaggaa acaacaggtt aaatttcaca acttcgttta tcaatttctt cgcaagcttc 900
ggatgggcct acgacttaaa gaccgtgtcg gacgagatta tacaacagcg cgttaagagg 960
acgggagatg ggagccatca cttacggggc tggggcgacc aggacatacc ggccgaagaa 1020
gctcaagctg ctttacgcat taaccgtaaa gatgattag 1059
<210> 15
<211> 1062
<212> DNA
<213> 玉米穗蛾
<400> 15
atggctccaa atatatcgga ggatgtgaac ggggtgctct tcgagagtga tgcagcgacg 60
ccggacttag cgttatccac gccgcctgtg cagaaggctg acaacaggcc caagcaatta 120
gtgtggagga acatactatt attcgcgtat cttcacttag cggctcttta cggaggttat 180
ttattcctct tctcagctaa atggcagaca gacatatttg cctacatctt atatgtgatc 240
tccgggcttg gtatcacggc tggagcacat cgcttatggg cccacaagtc ctacaaagct 300
aaatggcctc tccgagttat cttagtcatc tttaacacag tggcattcca ggatgccgct 360
atggactggg cgcgcgacca ccgcatgcat cacaagtact cggaaaccga tgctgatcct 420
cataatgcga cccgaggatt cttcttctct cacattggct ggttacttgt caggaaacat 480
cccgacctta aggagaaggg caagggactc gacatgagcg acttacttgc tgaccccatt 540
ctcaggttcc agaaaaaata ctacttaatc ttaatgccct tggcttgctt cgtgatgcct 600
accgtgattc ctgtgtactt ctggggtgaa acctggacca acgcattctt tgtggcggcc 660
atgttccgct acgcgttcat cctaaatgtg acgtggctcg tcaactctgc cgctcacaag 720
tggggagaca agccctacga caaaagcatt aagccttccg aaaacttgtc ggtcgccatg 780
ttcgctctcg gagaaggatt ccacaactac caccacactt tcccttggga ctacaaaact 840
gctgagttag gcaacaacaa actcaacttc actaccacct ttattaactt cttcgctaaa 900
attggctggg cttacgactt aaagacagtg tctgatgata tcgtcaagaa cagggtgaag 960
cgcactggtg acggctccca ccacttatgg ggctggggag acgaaaatca atccaaagaa 1020
gaaattgatg ccgctatcag aatcaatcct aaggacgatt aa 1062
<210> 16
<211> 1434
<212> DNA
<213> 假微型海链藻
<400> 16
atggactttc tctccggcga tcctttccgg acactcgtcc ttgcagcact tgttgtcatc 60
ggatttgctg cggcgtggca atgcttctac ccgccgagca tcgtcggcaa gcctcgtaca 120
ttaagcaatg gtaaactcaa taccagaatc catggcaaat tgtacgacct ctcatcgttt 180
cagcatccag gaggccccgt ggctctttct cttgttcaag gtcgcgacgg aacagctcta 240
tttgagtcac accatccctt catacctcga aagaatctac ttcagatcct ctccaagtac 300
gaggttccgt cgactgaaga ctctgtttcc ttcatcgcca ccctagacga actcaatggt 360
gaatctccgt acgattggaa ggacattgaa aatgatgatt tcgtatctga cctacgagct 420
ctcgtaattg agcacttttc tcctctcgcc aaggaaaggg gagtttcact cgttgagtcg 480
tcgaaggcaa cacctcagcg gtggatggtg gttctattac tccttgcgtc gttcttcctc 540
agcatcccat tatatttgag tggttcgtgg actttcgttg tcgtcactcc catcctcgct 600
tggttagcgg ttgtcaatta ctggcacgat gctactcact ttgcattgag cagcaactgg 660
attttgaatg ctgcgctccc atatctcctc cctctcctat cgagtccgtc aatgtggtat 720
catcatcacg tcattggaca tcacgcatac accaacattt ccaaaagaga tccagatctt 780
gctcacgctc cacaactcat gagagaacac aagagtatca aatggagacc atctcactta 840
aatcaaacac agcttccgcg gattctcttc atctggtcga ttgcagtcgg tattgggttg 900
aacttattaa acgacgtgag agcactaacc aagctttcat acaacaacgt tgttcgggtg 960
gagaagatgt catcgtcgcg aacattactc catttccttg gacgtatgtt gcacatcttt 1020
gtgactacac tttggccctt tttggcgttt ccggtgtgga aggccatcgt ttgggcgact 1080
gtaccgaatg ccatattaag tttgtgcttc atgttaaata cgcaaatcaa tcacctcatc 1140
aacacgtgtg cacatgcttc cgataacaac ttttacaagc atcaagttgt aactgctcag 1200
aactttggcc gatcaagtgc cttttgcttc atcttctcgg gaggtctcaa ctaccaaatt 1260
gaacatcatt tgttgccgac ggtgaaccat tgccatttgc cagctttggc cccgggtgta 1320
gagcgtttgt gtaagaaaca cggggtgaca tacaactctg ttgaaggata cagagaggcc 1380
atcattgcac actttgcaca taccaaagat atgtcgacga agcctactga ttga 1434
<210> 17
<211> 1050
<212> DNA
<213> 粉纹夜蛾
<400> 17
atggctgtga tggctcaaac agtacaagaa acggctacag tgttggaaga ggaagctcgc 60
acagtgactc ttgtggctcc aaagacaacg ccaaggaaat ataaatatat atacaccaac 120
tttcttacat tttcatatgc gcatttagct gcattatacg gactttattt gtgcttcacc 180
tctgcgaaat gggaaacatt gctattctct ttcgtactct tccacatgtc aaatataggc 240
atcaccgcag gggctcaccg actctggact cacaagactt tcaaagccaa attgcctttg 300
gaaattgtcc tcatgatatt caactcttta gcctttcaaa acacggctat tacatgggct 360
agagaacatc ggctacatca caaatacagc gatactgatg ctgatcccca caatgcgtca 420
agagggttct tctactcgca tgttggctgg ctattagtaa aaaaacatcc cgatgtcctg 480
aaatatggaa aaactataga catgtcggat gtatacaata atcctgtgtt aaaatttcag 540
aaaaagtacg cagtaccctt aattggaaca gtttgttttg ctctgccaac tttgattcca 600
gtctactgtt ggggcgaatc gtggaacaac gcttggcaca tagccttatt tcgatacata 660
ttcaatctta acgtgacttt cctagtcaac agtgctgcgc atatctgggg gaataagcct 720
tatgataaaa gcatcttgcc cgctcaaaac ctgctggttt ccttcctagc aagtggagaa 780
ggcttccata attaccatca cgtctttcca tgggattacc gcacagcaga attagggaat 840
aacttcctga atttgacgac gctgttcatt gatttttgtg cctggtttgg atgggcttat 900
gacttgaagt ctgtatcaga ggatattata aaacagagag ctaaacgaac aggtgacggt 960
tcttcagggg tcatttgggg atgggacgac aaagacatgg accgcgatat aaaatctaaa 1020
gctaacattt tttatgctaa aaaggaatga 1050
<210> 18
<211> 1017
<212> DNA
<213> 玉米穗蛾
<400> 18
atggcccaaa gctatcaatc aactacggtt ttgagtgagg agaaagaact aacactgcaa 60
catttggtgc cccaagcatc gcccaggaag tatcaaatag tgtatccgaa cctcattacg 120
tttggttact ggcacatagc cggactttat ggcctttact tgtgcttcac ttctgctaaa 180
tgggctacga ttttattcag ctacatcctc ttcgtgttag cagaaatagg aatcacggct 240
ggcgctcaca gactctgggc ccacaaaact tacaaagcga aactaccatt agaaatactc 300
ttaatggtat tcaactccat cgcttttcaa aactcagcca ttgactgggt gagggaccac 360
cgactccacc ataagtatag cgatacagat gctgatcccc acaatgccag ccgagggttc 420
ttttattccc atgtaggatg gctacttgtg agaaaacatc ctgaagtcaa aaagcgaggg 480
aaagaactca atatgtccga tatttacaac aatcctgtcc tgcggtttca gaaaaaatac 540
gccataccct tcattggggc tgtttgtttc gccttaccta caatgatacc tgtttacttc 600
tggggagaaa cctggtccaa tgcttggcat atcaccatgc ttcgctacat catgaacctc 660
aatgtcacct ttttggtaaa cagcgctgct catatatggg gaaacaagcc ttatgacgca 720
aaaatattac ctgcacaaaa tgtagctgtg tcggtcgcca ctggtggaga aggtttccat 780
aattaccacc atgtcttccc ctgggattat cgagcagcgg aactcggtaa caatagcctc 840
aatctgacga ctaaattcat agatttattc gcagcaatcg gatgggcata tgatctgaag 900
acggtttcgg aggatatgat aaaacaaagg attaaacgca ctggagatgg aacggatctt 960
tggggacacg aacaaaactg tgatgaagtg tgggatgtaa aagataaatc aagttaa 1017
<210> 19
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 智人密码子优化的粉纹夜蛾Z11去饱和酶
<400> 19
atggccgtga tggcccagac cgtgcaggag accgcaacag tgctggagga ggaggcaagg 60
accgtgacac tggtggcacc caagaccaca cctagaaagt acaagtatat ctacaccaac 120
ttcctgacct tcagctacgc acacctggcc gccctgtatg gactgtacct gtgctttacc 180
tccgccaagt gggagacact gctgttctct tttgtgctgt tccacatgag caatatcgga 240
atcaccgcag gagcacacag gctgtggacc cacaagacat tcaaggccaa gctgcctctg 300
gagatcgtgc tgatgatctt caactctctg gcctttcaga ataccgccat cacatgggcc 360
cgggagcaca gactgcacca caagtatagc gacaccgatg cagacccaca caacgcaagc 420
aggggcttct tttactccca cgtgggctgg ctgctggtga agaagcaccc cgacgtgctg 480
aagtatggca agacaatcga catgtccgac gtgtacaaca atcccgtgct gaagtttcag 540
aagaagtatg ccgtgcctct gatcggcacc gtgtgcttcg ccctgccaac actgatcccc 600
gtgtattgtt ggggcgagtc ttggaacaat gcctggcaca tcgccctgtt ccggtacatc 660
tttaacctga atgtgacctt tctggtgaac tccgccgccc acatctgggg caataagcct 720
tacgacaagt ctatcctgcc agcccagaac ctgctggtgt ccttcctggc ctctggcgag 780
ggctttcaca attatcacca cgtgttccca tgggactaca ggaccgcaga gctgggcaac 840
aattttctga acctgaccac actgttcatc gatttttgtg cctggttcgg ctgggcctat 900
gacctgaagt ctgtgagcga ggatatcatc aagcagaggg caaagaggac aggcgatggc 960
agctccggcg tgatctgggg atgggacgat aaggatatgg acagagatat caagagcaag 1020
gccaatatct tctacgccaa gaaggagtga 1050
<210> 20
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 智人密码子优化的玉米穗蛾Z11去饱和酶
<400> 20
atggcacagt catatcagag cactaccgtc ctgagcgaag agaaggaact gacactgcag 60
cacctggtcc cacaggcatc acctagaaag taccagatcg tgtatccaaa cctgatcacc 120
ttcggctact ggcacatcgc cggcctgtac ggcctgtatc tgtgctttac ctccgccaag 180
tgggccacaa tcctgttctc ttacatcctg tttgtgctgg cagagatcgg aatcaccgca 240
ggagcacaca gactgtgggc acacaagaca tataaggcca agctgcccct ggagatcctg 300
ctgatggtgt tcaacagcat cgcctttcag aattccgcca tcgattgggt gcgggaccac 360
agactgcacc acaagtactc cgacaccgat gccgaccccc acaacgcctc taggggcttc 420
ttttatagcc acgtgggatg gctgctggtg cggaagcacc ctgaggtgaa gaagagaggc 480
aaggagctga atatgtctga tatctacaac aatcctgtgc tgcgcttcca gaagaagtat 540
gccatcccat tcatcggcgc cgtgtgcttt gccctgccca ccatgatccc cgtgtacttt 600
tggggcgaga catggagcaa cgcctggcac atcacaatgc tgcggtatat catgaacctg 660
aatgtgacat tcctggtgaa ctccgccgcc cacatctggg gcaataagcc atacgacgcc 720
aagatcctgc ccgcccagaa cgtggccgtg agcgtggcaa ccggaggaga gggcttccac 780
aattaccacc acgtgtttcc ttgggattat cgggccgccg agctgggcaa caattctctg 840
aatctgacca caaagttcat cgacctgttt gccgccatcg gctgggccta tgatctgaag 900
acagtgagcg aggacatgat caagcagagg atcaagcgca ccggcgatgg cacagacctg 960
tgggggcacg agcagaactg tgatgaagtg tgggatgtga aagacaagtc ctcctaa 1017
<210> 21
<211> 1065
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 具有由解脂耶氏酵母OLE1前导序列替代的前导序列
的智人密码子优化的粉纹夜蛾Z11去饱和酶
<400> 21
atggtgaaga acgtggacca ggtggatctg tctcaggtgg acaccatcgc aagcggaagg 60
gatgtgaatt ataaggtgaa gtacacatct ggcgtgaaga ccacaccaag aaagtacaag 120
tatatctaca ccaacttcct gacattttct tacgcccacc tggccgccct gtatggcctg 180
tacctgtgct ttaccagcgc caagtgggag acactgctgt tctcctttgt gctgttccac 240
atgtctaata tcggaatcac cgcaggagca cacaggctgt ggacccacaa gacattcaag 300
gccaagctgc ccctggagat cgtgctgatg atcttcaact ccctggcctt tcagaatacc 360
gccatcacat gggcccggga gcacagactg caccacaagt attctgacac cgatgcagac 420
ccacacaacg caagcagggg cttcttttac tcccacgtgg gctggctgct ggtgaagaag 480
caccctgacg tgctgaagta tggcaagaca atcgacatga gcgacgtgta caacaatcct 540
gtgctgaagt ttcagaagaa gtatgccgtg ccactgatcg gcaccgtgtg cttcgccctg 600
cccacactga tccccgtgta ctgttggggc gagtcctgga acaatgcctg gcacatcgcc 660
ctgttccggt acatctttaa cctgaatgtg acctttctgg tgaacagcgc cgcccacatc 720
tggggcaata agccatacga caagtccatc ctgcccgccc agaacctgct ggtgtccttc 780
ctggcctctg gcgagggctt tcacaattat caccacgtgt tcccttggga ctacaggacc 840
gcagagctgg gcaacaattt tctgaacctg accacactgt tcatcgattt ttgtgcctgg 900
ttcggctggg cctatgacct gaagtctgtg agcgaggata tcatcaagca gagggcaaag 960
aggacaggcg atggcagctc cggcgtgatc tggggatggg acgataagga tatggacaga 1020
gatatcaagt ccaaggccaa tatcttctac gccaagaagg agtga 1065
<210> 22
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 具有由解脂耶氏酵母OLE1前导序列替代的前导序列
的智人密码子优化的玉米穗蛾Z11去饱和酶
<400> 22
atggtgaaaa acgtggacca agtggatctc tcgcaggtcg acaccattgc ctccggccga 60
gatgtcaact acaaggtcaa gtacacctcc ggcgttcgca agtatcagat cgtgtatcct 120
aacctgatca ccttcggcta ctggcatatc gctggactgt acggactgta tctgtgcttc 180
acttccgcca agtgggccac catcctgttc tcttacatcc tgtttgtgct ggcagagatc 240
ggaatcaccg caggagcaca cagactgtgg gcacacaaga catataaggc caagctgcca 300
ctggagatcc tgctgatggt gttcaacagc atcgcctttc agaattccgc catcgattgg 360
gtgcgggacc acagactgca ccacaagtac tccgacacag atgccgaccc ccacaacgcc 420
tctaggggct tcttttatag ccacgtggga tggctgctgg tgcggaagca ccctgaggtg 480
aagaagagag gcaaggagct gaatatgtct gatatctaca acaatcctgt gctgcgcttc 540
cagaagaagt atgccatccc attcatcggc gccgtgtgct ttgccctgcc caccatgatc 600
cccgtgtact tttggggcga gacatggagc aacgcctggc acatcacaat gctgcggtat 660
atcatgaacc tgaatgtgac attcctggtg aactccgccg cccacatctg gggcaataag 720
ccatacgacg ccaagatcct gcccgcccag aacgtggccg tgagcgtggc aaccggagga 780
gagggcttcc acaattacca ccacgtgttt ccatgggatt atagggcagc agagctggga 840
aacaattctc tgaatctgac cacaaagttc atcgacctgt ttgccgccat cggctgggcc 900
tatgatctga agacagtgag cgaggacatg atcaagcaga ggatcaagcg caccggcgat 960
ggcacagacc tgtgggggca cgagcagaat tgtgatgaag tgtgggatgt gaaggataaa 1020
agcagttga 1029
<210> 23
<211> 981
<212> DNA
<213> 脐橙螟蛾
<400> 23
atggtcccta acaagggttc cagtgacgtt ttgtctgaac attctgagcc ccagttcact 60
aaactcatag ctccacaagc agggccgagg aaatacaaga tagtgtatcg aaatttgctc 120
acattcggct attggcactt atcagctgtt tatgggctct acttgtgctt tacttgtgcg 180
aaatgggcta ccatcttatt tgcatttttc ttatacgtga tcgcggaaat cggtataaca 240
ggtggcgctc ataggctatg ggcacatcgg acttataaag ccaagttgcc tttagagatt 300
ttgttactca taatgaattc tattgccttc caagacactg ctttcacctg ggctcgagat 360
caccgccttc atcacaaata ttcggatact gacgctgatc cccacaatgc taccagaggg 420
tttttctatt cacatgtagg ctggcttttg gtgaagaaac accctgaagt caaagcaaga 480
ggaaaatact tgtcgttaga tgatcttaag aataatccat tgcttaaatt ccaaaagaaa 540
tacgctattc tagttatagg cacgttatgc ttccttatgc caacatttgt gcccgtatac 600
ttctggggcg agggcatcag cacggcctgg aacatcaatc tattgcgata cgtcatgaat 660
cttaacatga ctttcttagt taacagtgca gcgcatatct ttggcaacaa accatacgat 720
aagagcatag cctcagtcca aaatatttca gttagcttag ctacttttgg cgaaggattc 780
cataattacc atcacactta cccctgggat tatcgtgcgg cagaattagg aaataatagg 840
ctaaatatga ctactgcttt catagatttc ttcgcttgga tcggctgggc ttatgacttg 900
aagtctgtgc cacaagaggc cattgcaaaa aggtgtgcga aaactggcga tggaacggat 960
atgtggggtc gaaaaagata a 981
<210> 24
<211> 1017
<212> DNA
<213> 玉米穗蛾
<400> 24
atggcccaaa gctatcaatc aactacggtt ttgagtgagg agaaagaact aacattacaa 60
catttggtgc cccaagcatc gcccaggaag tatcaaatag tgtatccgaa cctcattacg 120
tttggttact ggcacatagc cggactttat ggcctttact tgtgcttcac ttctgctaaa 180
tgggctacga ttttattcag ctacatcctc ttcgtgttag cagaaatagg aatcacggct 240
ggcgctcaca gactctgggc ccacaaaact tacaaagcga aactaccatt agaaatactc 300
ttaatggtat tcaactccat cgcttttcaa aactcagcca ttgactgggt gagggaccac 360
cgactccacc ataagtatag cgatacagat gctgatcccc acaatgccag ccgagggttc 420
ttttattccc atgtaggatg gctacttgtg agaaaacatc ctgaagtcaa aaagcgaggg 480
aaagaactca atatgtccga tatttacaac aatcctgtct tacggtttca gaaaaaatac 540
gccataccct tcattggggc tgtttgtttc gccttaccta caatgatacc tgtttacttc 600
tggggagaaa cctggtccaa tgcttggcat atcaccatgc ttcgctacat catgaacctc 660
aatgtcacct ttttggtaaa cagcgctgct catatatggg gaaacaagcc ttatgacgca 720
aaaatattac ctgcacaaaa tgtagctgtg tcggtcgcca ctggtggaga aggtttccat 780
aattaccacc atgtcttccc ctgggattat cgagcagcgg aactcggtaa caatagcctc 840
aatttaacga ctaaattcat agatttattc gcagcaatcg gatgggcata tgatttaaag 900
acggtttcgg aggatatgat aaaacaaagg attaaacgca ctggagatgg aacggatctt 960
tggggacacg aacaaaactg tgatgaagtg tgggatgtaa aagataaatc aagttaa 1017
<210> 25
<211> 349
<212> PRT
<213> 粉纹夜蛾
<400> 25
Met Ala Val Met Ala Gln Thr Val Gln Glu Thr Ala Thr Val Leu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Ala Arg Thr Val Thr Leu Val Ala Pro Lys Thr Thr Pro Arg
20 25 30
Lys Tyr Lys Tyr Ile Tyr Thr Asn Phe Leu Thr Phe Ser Tyr Ala His
35 40 45
Leu Ala Ala Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp
50 55 60
Glu Thr Leu Leu Phe Ser Phe Val Leu Phe His Met Ser Asn Ile Gly
65 70 75 80
Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Thr His Lys Thr Phe Lys Ala
85 90 95
Lys Leu Pro Leu Glu Ile Val Leu Met Ile Phe Asn Ser Leu Ala Phe
100 105 110
Gln Asn Thr Ala Ile Thr Trp Ala Arg Glu His Arg Leu His His Lys
115 120 125
Tyr Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe
130 135 140
Tyr Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Asp Val Leu
145 150 155 160
Lys Tyr Gly Lys Thr Ile Asp Met Ser Asp Val Tyr Asn Asn Pro Val
165 170 175
Leu Lys Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Val Pro Leu Ile Gly Thr Val Cys
180 185 190
Phe Ala Leu Pro Thr Leu Ile Pro Val Tyr Cys Trp Gly Glu Ser Trp
195 200 205
Asn Asn Ala Trp His Ile Ala Leu Phe Arg Tyr Ile Phe Asn Leu Asn
210 215 220
Val Thr Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly Asn Lys Pro
225 230 235 240
Tyr Asp Lys Ser Ile Leu Pro Ala Gln Asn Leu Leu Val Ser Phe Leu
245 250 255
Ala Ser Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp
260 265 270
Tyr Arg Thr Ala Glu Leu Gly Asn Asn Phe Leu Asn Leu Thr Thr Leu
275 280 285
Phe Ile Asp Phe Cys Ala Trp Phe Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Ser
290 295 300
Val Ser Glu Asp Ile Ile Lys Gln Arg Ala Lys Arg Thr Gly Asp Gly
305 310 315 320
Ser Ser Gly Val Ile Trp Gly Trp Asp Asp Lys Asp Met Asp Arg Asp
325 330 335
Ile Lys Ser Lys Ala Asn Ile Phe Tyr Ala Lys Lys Glu
340 345
<210> 26
<211> 479
<212> PRT
<213> 假微型海链藻
<400> 26
Thr Ser Met Asp Phe Leu Ser Gly Asp Pro Phe Arg Thr Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Ala Leu Val Val Ile Gly Phe Ala Ala Ala Trp Gln Cys Phe Tyr
20 25 30
Pro Pro Ser Ile Val Gly Lys Pro Arg Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu
35 40 45
Asn Thr Arg Ile His Gly Lys Leu Tyr Asp Leu Ser Ser Phe Gln His
50 55 60
Pro Gly Gly Pro Val Ala Leu Ser Leu Val Gln Gly Arg Asp Gly Thr
65 70 75 80
Ala Leu Phe Glu Ser His His Pro Phe Ile Pro Arg Lys Asn Leu Leu
85 90 95
Gln Ile Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro Ser Thr Glu Asp Ser Val Ser
100 105 110
Phe Ile Ala Thr Leu Asp Glu Leu Asn Gly Glu Ser Pro Tyr Asp Trp
115 120 125
Lys Asp Ile Glu Asn Asp Asp Phe Val Ser Asp Leu Arg Ala Leu Val
130 135 140
Ile Glu His Phe Ser Pro Leu Ala Lys Glu Arg Gly Val Ser Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Ser Lys Ala Thr Pro Gln Arg Trp Met Val Val Leu Leu Leu
165 170 175
Leu Ala Ser Phe Phe Leu Ser Ile Pro Leu Tyr Leu Ser Gly Ser Trp
180 185 190
Thr Phe Val Val Val Thr Pro Ile Leu Ala Trp Leu Ala Val Val Asn
195 200 205
Tyr Trp His Asp Ala Thr His Phe Ala Leu Ser Ser Asn Trp Ile Leu
210 215 220
Asn Ala Ala Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Ser Ser Pro Ser Met
225 230 235 240
Trp Tyr His His His Val Ile Gly His His Ala Tyr Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Lys Arg Asp Pro Asp Leu Ala His Ala Pro Gln Leu Met Arg Glu His
260 265 270
Lys Ser Ile Lys Trp Arg Pro Ser His Leu Asn Gln Thr Gln Leu Pro
275 280 285
Arg Ile Leu Phe Ile Trp Ser Ile Ala Val Gly Ile Gly Leu Asn Leu
290 295 300
Leu Asn Asp Val Arg Ala Leu Thr Lys Leu Ser Tyr Asn Asn Val Val
305 310 315 320
Arg Val Glu Lys Met Ser Ser Ser Arg Thr Leu Leu His Phe Leu Gly
325 330 335
Arg Met Leu His Ile Phe Val Thr Thr Leu Trp Pro Phe Leu Ala Phe
340 345 350
Pro Val Trp Lys Ala Ile Val Trp Ala Thr Val Pro Asn Ala Ile Leu
355 360 365
Ser Leu Cys Phe Met Leu Asn Thr Gln Ile Asn His Leu Ile Asn Thr
370 375 380
Cys Ala His Ala Ser Asp Asn Asn Phe Tyr Lys His Gln Val Val Thr
385 390 395 400
Ala Gln Asn Phe Gly Arg Ser Ser Ala Phe Cys Phe Ile Phe Ser Gly
405 410 415
Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu Leu Pro Thr Val Asn His
420 425 430
Cys His Leu Pro Ala Leu Ala Pro Gly Val Glu Arg Leu Cys Lys Lys
435 440 445
His Gly Val Thr Tyr Asn Ser Val Glu Gly Tyr Arg Glu Ala Ile Ile
450 455 460
Ala His Phe Ala His Thr Lys Asp Met Ser Thr Lys Pro Thr Asp
465 470 475
<210> 27
<211> 477
<212> PRT
<213> 假微型海链藻
<400> 27
Met Asp Phe Leu Ser Gly Asp Pro Phe Arg Thr Leu Val Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Val Val Ile Gly Phe Ala Ala Ala Trp Gln Cys Phe Tyr Pro Pro
20 25 30
Ser Ile Val Gly Lys Pro Arg Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Asn Thr
35 40 45
Arg Ile His Gly Lys Leu Tyr Asp Leu Ser Ser Phe Gln His Pro Gly
50 55 60
Gly Pro Val Ala Leu Ser Leu Val Gln Gly Arg Asp Gly Thr Ala Leu
65 70 75 80
Phe Glu Ser His His Pro Phe Ile Pro Arg Lys Asn Leu Leu Gln Ile
85 90 95
Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro Ser Thr Glu Asp Ser Val Ser Phe Ile
100 105 110
Ala Thr Leu Asp Glu Leu Asn Gly Glu Ser Pro Tyr Asp Trp Lys Asp
115 120 125
Ile Glu Asn Asp Asp Phe Val Ser Asp Leu Arg Ala Leu Val Ile Glu
130 135 140
His Phe Ser Pro Leu Ala Lys Glu Arg Gly Val Ser Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Ser Lys Ala Thr Pro Gln Arg Trp Met Val Val Leu Leu Leu Leu Ala
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Ser Ile Pro Leu Tyr Leu Ser Gly Ser Trp Thr Phe
180 185 190
Val Val Val Thr Pro Ile Leu Ala Trp Leu Ala Val Val Asn Tyr Trp
195 200 205
His Asp Ala Thr His Phe Ala Leu Ser Ser Asn Trp Ile Leu Asn Ala
210 215 220
Ala Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Ser Ser Pro Ser Met Trp Tyr
225 230 235 240
His His His Val Ile Gly His His Ala Tyr Thr Asn Ile Ser Lys Arg
245 250 255
Asp Pro Asp Leu Ala His Ala Pro Gln Leu Met Arg Glu His Lys Ser
260 265 270
Ile Lys Trp Arg Pro Ser His Leu Asn Gln Thr Gln Leu Pro Arg Ile
275 280 285
Leu Phe Ile Trp Ser Ile Ala Val Gly Ile Gly Leu Asn Leu Leu Asn
290 295 300
Asp Val Arg Ala Leu Thr Lys Leu Ser Tyr Asn Asn Val Val Arg Val
305 310 315 320
Glu Lys Met Ser Ser Ser Arg Thr Leu Leu His Phe Leu Gly Arg Met
325 330 335
Leu His Ile Phe Val Thr Thr Leu Trp Pro Phe Leu Ala Phe Pro Val
340 345 350
Trp Lys Ala Ile Val Trp Ala Thr Val Pro Asn Ala Ile Leu Ser Leu
355 360 365
Cys Phe Met Leu Asn Thr Gln Ile Asn His Leu Ile Asn Thr Cys Ala
370 375 380
His Ala Ser Asp Asn Asn Phe Tyr Lys His Gln Val Val Thr Ala Gln
385 390 395 400
Asn Phe Gly Arg Ser Ser Ala Phe Cys Phe Ile Phe Ser Gly Gly Leu
405 410 415
Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu Leu Pro Thr Val Asn His Cys His
420 425 430
Leu Pro Ala Leu Ala Pro Gly Val Glu Arg Leu Cys Lys Lys His Gly
435 440 445
Val Thr Tyr Asn Ser Val Glu Gly Tyr Arg Glu Ala Ile Ile Ala His
450 455 460
Phe Ala His Thr Lys Asp Met Ser Thr Lys Pro Thr Asp
465 470 475
<210> 28
<211> 326
<212> PRT
<213> 脐橙螟蛾
<400> 28
Met Val Pro Asn Lys Gly Ser Ser Asp Val Leu Ser Glu His Ser Glu
1 5 10 15
Pro Gln Phe Thr Lys Leu Ile Ala Pro Gln Ala Gly Pro Arg Lys Tyr
20 25 30
Lys Ile Val Tyr Arg Asn Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Trp His Leu Ser
35 40 45
Ala Val Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Cys Ala Lys Trp Ala Thr
50 55 60
Ile Leu Phe Ala Phe Phe Leu Tyr Val Ile Ala Glu Ile Gly Ile Thr
65 70 75 80
Gly Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Arg Thr Tyr Lys Ala Lys Leu
85 90 95
Pro Leu Glu Ile Leu Leu Leu Ile Met Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asp
100 105 110
Thr Ala Phe Thr Trp Ala Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser
115 120 125
Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser
130 135 140
His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Lys Ala Arg
145 150 155 160
Gly Lys Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Leu Lys Asn Asn Pro Leu Leu Lys
165 170 175
Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Leu Val Ile Gly Thr Leu Cys Phe Leu
180 185 190
Met Pro Thr Phe Val Pro Val Tyr Phe Trp Gly Glu Gly Ile Ser Thr
195 200 205
Ala Trp Asn Ile Asn Leu Leu Arg Tyr Val Met Asn Leu Asn Met Thr
210 215 220
Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Phe Gly Asn Lys Pro Tyr Asp
225 230 235 240
Lys Ser Ile Ala Ser Val Gln Asn Ile Ser Val Ser Leu Ala Thr Phe
245 250 255
Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Thr Tyr Pro Trp Asp Tyr Arg
260 265 270
Ala Ala Glu Leu Gly Asn Asn Arg Leu Asn Met Thr Thr Ala Phe Ile
275 280 285
Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Ser Val Pro
290 295 300
Gln Glu Ala Ile Ala Lys Arg Cys Ala Lys Thr Gly Asp Gly Thr Asp
305 310 315 320
Met Trp Gly Arg Lys Arg
325
<210> 29
<211> 336
<212> PRT
<213> 黄地老虎
<400> 29
Met Ala Gln Gly Val Gln Thr Thr Thr Ile Leu Arg Glu Glu Glu Pro
1 5 10 15
Ser Leu Thr Phe Val Val Pro Gln Glu Pro Arg Lys Tyr Gln Ile Val
20 25 30
Tyr Pro Asn Leu Ile Thr Phe Gly Tyr Trp His Ile Ala Gly Leu Tyr
35 40 45
Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Gln Thr Ile Leu Phe
50 55 60
Ser Phe Met Leu Val Val Leu Ala Glu Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala
65 70 75 80
His Arg Leu Trp Ala His Lys Thr Tyr Lys Ala Lys Leu Pro Leu Gln
85 90 95
Ile Ile Leu Met Ile Leu Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asn Ser Ala Ile
100 105 110
Asp Trp Val Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser Asp Thr Asp
115 120 125
Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His Val Gly
130 135 140
Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Glu Val Lys Arg Arg Gly Lys Glu
145 150 155 160
Leu Asp Met Ser Asp Ile Tyr Asn Asn Pro Val Leu Arg Phe Gln Lys
165 170 175
Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Ala Met Cys Phe Gly Leu Pro Thr
180 185 190
Phe Ile Pro Val Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Trp Ser Asn Ala Trp His
195 200 205
Ile Thr Met Leu Arg Tyr Ile Leu Asn Leu Asn Ile Thr Phe Leu Val
210 215 220
Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly Tyr Lys Pro Tyr Asp Ile Lys Ile
225 230 235 240
Leu Pro Ala Gln Asn Ile Ala Val Ser Ile Val Thr Gly Gly Glu Val
245 250 255
Ser Ile Thr Thr Thr Thr Phe Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ala Ala Glu
260 265 270
Leu Gly Asn Asn Tyr Leu Asn Leu Thr Thr Lys Phe Ile Asp Phe Phe
275 280 285
Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Ser Asp Val
290 295 300
Ile Lys Ser Lys Ala Glu Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asn Leu Trp Gly
305 310 315 320
Leu Glu Asp Lys Gly Glu Glu Asp Phe Leu Lys Ile Trp Lys Asp Asn
325 330 335
<210> 30
<211> 355
<212> PRT
<213> 亚洲玉米螟
<400> 30
Met Ala Pro Asn Ile Lys Asp Gly Ala Asp Leu Asn Gly Val Leu Phe
1 5 10 15
Glu Asp Asp Ala Ser Thr Pro Asp Tyr Ala Leu Ala Thr Ala Pro Val
20 25 30
Gln Lys Ala Asp Asn Tyr Pro Arg Lys Leu Val Trp Arg Asn Ile Ile
35 40 45
Leu Phe Ala Tyr Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly Ala Tyr Leu Phe
50 55 60
Leu Phe Ser Ala Lys Trp Gln Thr Asp Ile Phe Ala Tyr Ile Leu Tyr
65 70 75 80
Val Ile Ser Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala
85 90 95
His Lys Ser Tyr Lys Ala Lys Trp Pro Leu Arg Leu Ile Leu Ile Ile
100 105 110
Phe Asn Thr Val Ser Phe Gln Asp Ser Ala Leu Asp Trp Ser Arg Asp
115 120 125
His Arg Met His His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn
130 135 140
Ala Thr Arg Gly Phe Phe Phe Ser His Ile Gly Trp Leu Leu Val Arg
145 150 155 160
Lys His Pro Glu Leu Lys Arg Lys Gly Lys Gly Leu Asp Leu Ser Asp
165 170 175
Leu Tyr Ala Asp Pro Ile Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr Leu Leu
180 185 190
Leu Met Pro Leu Gly Cys Phe Ile Met Pro Thr Val Val Pro Val Tyr
195 200 205
Phe Trp Gly Glu Thr Trp Thr Asn Ala Phe Phe Val Ala Ala Leu Phe
210 215 220
Arg Tyr Thr Phe Ile Leu Asn Val Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala
225 230 235 240
His Lys Trp Gly His Lys Pro Tyr Asp Ser Ser Ile Lys Pro Ser Glu
245 250 255
Asn Leu Ser Val Ser Leu Phe Ala Leu Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr
260 265 270
His His Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Thr Ala Glu Leu Gly Asn Asn
275 280 285
Arg Leu Asn Phe Thr Thr Asn Phe Ile Asn Phe Phe Ala Lys Ile Gly
290 295 300
Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Asp Glu Ile Ile Gln Asn Arg
305 310 315 320
Val Lys Arg Thr Gly Asp Gly Ser His His Leu Trp Gly Trp Gly Asp
325 330 335
Lys Asp Gln Pro Lys Glu Glu Val Asn Ala Ala Ile Arg Ile Asn Pro
340 345 350
Lys Asp Glu
355
<210> 31
<211> 352
<212> PRT
<213> 红醋栗穿孔蛾
<400> 31
Met Pro Pro Asn Val Thr Glu Ala Asn Gly Val Leu Phe Glu Asn Asp
1 5 10 15
Val Gln Thr Pro Asp Met Gly Leu Glu Val Ala Pro Val Gln Lys Ala
20 25 30
Asp Glu Arg Lys Ile Gln Leu Val Trp Arg Asn Ile Ile Ala Phe Ala
35 40 45
Cys Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly Ala Tyr Leu Phe Phe Thr Ser
50 55 60
Ala Ile Trp Gln Thr Asp Ile Phe Ala Tyr Ile Leu Tyr Val Met Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys Ser
85 90 95
Tyr Lys Ala Lys Trp Pro Leu Arg Leu Ile Leu Val Ala Phe Asn Thr
100 105 110
Leu Ala Phe Gln Asp Ser Ala Ile Asp Trp Ala Arg Asp His Arg Met
115 120 125
His His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg
130 135 140
Gly Phe Phe Phe Ser His Ile Gly Trp Leu Leu Cys Arg Lys His Pro
145 150 155 160
Glu Leu Lys Arg Lys Gly Gln Gly Leu Asp Leu Ser Asp Leu Tyr Ala
165 170 175
Asp Pro Ile Ile Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr Leu Leu Leu Met Pro
180 185 190
Leu Ala Cys Phe Val Leu Pro Thr Ile Ile Pro Val Tyr Leu Trp Gly
195 200 205
Glu Ser Trp Lys Asn Ala Phe Phe Val Ala Ala Met Phe Arg Tyr Thr
210 215 220
Phe Ile Leu Asn Val Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Lys Trp
225 230 235 240
Gly Gly Lys Pro Tyr Asp Lys Asn Ile Gln Pro Ala Gln Asn Ile Ser
245 250 255
Val Ala Ile Phe Ala Leu Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Thr
260 265 270
Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Thr Ala Glu Leu Gly Asn Asn Arg Leu Asn
275 280 285
Phe Thr Thr Ser Phe Ile Asn Phe Phe Ala Ser Phe Gly Trp Ala Tyr
290 295 300
Asp Leu Lys Thr Val Ser Asp Glu Ile Ile Gln Gln Arg Val Lys Arg
305 310 315 320
Thr Gly Asp Gly Ser His His Leu Arg Gly Trp Gly Asp Gln Asp Ile
325 330 335
Pro Ala Glu Glu Ala Gln Ala Ala Leu Arg Ile Asn Arg Lys Asp Asp
340 345 350
<210> 32
<211> 353
<212> PRT
<213> 玉米穗蛾
<400> 32
Met Ala Pro Asn Ile Ser Glu Asp Val Asn Gly Val Leu Phe Glu Ser
1 5 10 15
Asp Ala Ala Thr Pro Asp Leu Ala Leu Ser Thr Pro Pro Val Gln Lys
20 25 30
Ala Asp Asn Arg Pro Lys Gln Leu Val Trp Arg Asn Ile Leu Leu Phe
35 40 45
Ala Tyr Leu His Leu Ala Ala Leu Tyr Gly Gly Tyr Leu Phe Leu Phe
50 55 60
Ser Ala Lys Trp Gln Thr Asp Ile Phe Ala Tyr Ile Leu Tyr Val Ile
65 70 75 80
Ser Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys
85 90 95
Ser Tyr Lys Ala Lys Trp Pro Leu Arg Val Ile Leu Val Ile Phe Asn
100 105 110
Thr Val Ala Phe Gln Asp Ala Ala Met Asp Trp Ala Arg Asp His Arg
115 120 125
Met His His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr
130 135 140
Arg Gly Phe Phe Phe Ser His Ile Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His
145 150 155 160
Pro Asp Leu Lys Glu Lys Gly Lys Gly Leu Asp Met Ser Asp Leu Leu
165 170 175
Ala Asp Pro Ile Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr Leu Ile Leu Met
180 185 190
Pro Leu Ala Cys Phe Val Met Pro Thr Val Ile Pro Val Tyr Phe Trp
195 200 205
Gly Glu Thr Trp Thr Asn Ala Phe Phe Val Ala Ala Met Phe Arg Tyr
210 215 220
Ala Phe Ile Leu Asn Val Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Lys
225 230 235 240
Trp Gly Asp Lys Pro Tyr Asp Lys Ser Ile Lys Pro Ser Glu Asn Leu
245 250 255
Ser Val Ala Met Phe Ala Leu Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His
260 265 270
Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Thr Ala Glu Leu Gly Asn Asn Lys Leu
275 280 285
Asn Phe Thr Thr Thr Phe Ile Asn Phe Phe Ala Lys Ile Gly Trp Ala
290 295 300
Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Asp Asp Ile Val Lys Asn Arg Val Lys
305 310 315 320
Arg Thr Gly Asp Gly Ser His His Leu Trp Gly Trp Gly Asp Glu Asn
325 330 335
Gln Ser Lys Glu Glu Ile Asp Ala Ala Ile Arg Ile Asn Pro Lys Asp
340 345 350
Asp
<210> 33
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有由SEQ ID NO: 21编码的解脂耶氏酵母
OLE1前导序列的粉纹夜蛾去饱和酶
<400> 33
Met Val Lys Asn Val Asp Gln Val Asp Leu Ser Gln Val Asp Thr Ile
1 5 10 15
Ala Ser Gly Arg Asp Val Asn Tyr Lys Val Lys Tyr Thr Ser Gly Val
20 25 30
Lys Thr Thr Pro Arg Lys Tyr Lys Tyr Ile Tyr Thr Asn Phe Leu Thr
35 40 45
Phe Ser Tyr Ala His Leu Ala Ala Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe
50 55 60
Thr Ser Ala Lys Trp Glu Thr Leu Leu Phe Ser Phe Val Leu Phe His
65 70 75 80
Met Ser Asn Ile Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Thr His
85 90 95
Lys Thr Phe Lys Ala Lys Leu Pro Leu Glu Ile Val Leu Met Ile Phe
100 105 110
Asn Ser Leu Ala Phe Gln Asn Thr Ala Ile Thr Trp Ala Arg Glu His
115 120 125
Arg Leu His His Lys Tyr Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala
130 135 140
Ser Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys
145 150 155 160
His Pro Asp Val Leu Lys Tyr Gly Lys Thr Ile Asp Met Ser Asp Val
165 170 175
Tyr Asn Asn Pro Val Leu Lys Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Val Pro Leu
180 185 190
Ile Gly Thr Val Cys Phe Ala Leu Pro Thr Leu Ile Pro Val Tyr Cys
195 200 205
Trp Gly Glu Ser Trp Asn Asn Ala Trp His Ile Ala Leu Phe Arg Tyr
210 215 220
Ile Phe Asn Leu Asn Val Thr Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile
225 230 235 240
Trp Gly Asn Lys Pro Tyr Asp Lys Ser Ile Leu Pro Ala Gln Asn Leu
245 250 255
Leu Val Ser Phe Leu Ala Ser Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His
260 265 270
Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Thr Ala Glu Leu Gly Asn Asn Phe Leu
275 280 285
Asn Leu Thr Thr Leu Phe Ile Asp Phe Cys Ala Trp Phe Gly Trp Ala
290 295 300
Tyr Asp Leu Lys Ser Val Ser Glu Asp Ile Ile Lys Gln Arg Ala Lys
305 310 315 320
Arg Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Val Ile Trp Gly Trp Asp Asp Lys
325 330 335
Asp Met Asp Arg Asp Ile Lys Ser Lys Ala Asn Ile Phe Tyr Ala Lys
340 345 350
Lys Glu
<210> 34
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有由SEQ ID NO: 22编码的解脂耶氏酵母
OLE1前导序列的玉米穗蛾去饱和酶
<400> 34
Met Val Lys Asn Val Asp Gln Val Asp Leu Ser Gln Val Asp Thr Ile
1 5 10 15
Ala Ser Gly Arg Asp Val Asn Tyr Lys Val Lys Tyr Thr Ser Gly Val
20 25 30
Arg Lys Tyr Gln Ile Val Tyr Pro Asn Leu Ile Thr Phe Gly Tyr Trp
35 40 45
His Ile Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys
50 55 60
Trp Ala Thr Ile Leu Phe Ser Tyr Ile Leu Phe Val Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys Thr Tyr Lys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Leu Glu Ile Leu Leu Met Val Phe Asn Ser Ile Ala
100 105 110
Phe Gln Asn Ser Ala Ile Asp Trp Val Arg Asp His Arg Leu His His
115 120 125
Lys Tyr Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe
130 135 140
Phe Tyr Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Glu Val
145 150 155 160
Lys Lys Arg Gly Lys Glu Leu Asn Met Ser Asp Ile Tyr Asn Asn Pro
165 170 175
Val Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Ala Val
180 185 190
Cys Phe Ala Leu Pro Thr Met Ile Pro Val Tyr Phe Trp Gly Glu Thr
195 200 205
Trp Ser Asn Ala Trp His Ile Thr Met Leu Arg Tyr Ile Met Asn Leu
210 215 220
Asn Val Thr Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly Asn Lys
225 230 235 240
Pro Tyr Asp Ala Lys Ile Leu Pro Ala Gln Asn Val Ala Val Ser Val
245 250 255
Ala Thr Gly Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp
260 265 270
Asp Tyr Arg Ala Ala Glu Leu Gly Asn Asn Ser Leu Asn Leu Thr Thr
275 280 285
Lys Phe Ile Asp Leu Phe Ala Ala Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys
290 295 300
Thr Val Ser Glu Asp Met Ile Lys Gln Arg Ile Lys Arg Thr Gly Asp
305 310 315 320
Gly Thr Asp Leu Trp Gly His Glu Gln Asn Cys Asp Glu Val Trp Asp
325 330 335
Val Lys Asp Lys Ser Ser
340
<210> 35
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有由SEQ ID NO: 8编码的白假丝酵母OLE1
前导序列的黄地老虎去饱和酶
<400> 35
Met Thr Thr Val Glu Gln Leu Glu Thr Val Asp Ile Thr Lys Leu Asn
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ala Gly Thr Asn Lys Lys Val Pro Met Ala Gln Gly Val
20 25 30
Gln Thr Thr Thr Ile Leu Arg Glu Glu Glu Pro Ser Leu Thr Phe Val
35 40 45
Val Pro Gln Glu Pro Arg Lys Tyr Gln Ile Val Tyr Pro Asn Leu Ile
50 55 60
Thr Phe Gly Tyr Trp His Ile Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys
65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Trp Gln Thr Ile Leu Phe Ser Phe Met Leu Val
85 90 95
Val Leu Ala Glu Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala
100 105 110
His Lys Thr Tyr Lys Ala Lys Leu Pro Leu Gln Ile Ile Leu Met Ile
115 120 125
Leu Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asn Ser Ala Ile Asp Trp Val Arg Asp
130 135 140
His Arg Leu His His Lys Tyr Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn
145 150 155 160
Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Arg
165 170 175
Lys His Pro Glu Val Lys Arg Arg Gly Lys Glu Leu Asp Met Ser Asp
180 185 190
Ile Tyr Asn Asn Pro Val Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro
195 200 205
Phe Ile Gly Ala Met Cys Phe Gly Leu Pro Thr Phe Ile Pro Val Tyr
210 215 220
Phe Trp Gly Glu Thr Trp Ser Asn Ala Trp His Ile Thr Met Leu Arg
225 230 235 240
Tyr Ile Leu Asn Leu Asn Ile Thr Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His
245 250 255
Ile Trp Gly Tyr Lys Pro Tyr Asp Ile Lys Ile Leu Pro Ala Gln Asn
260 265 270
Ile Ala Val Ser Ile Val Thr Gly Gly Glu Val Ser Ile Thr Thr Thr
275 280 285
Thr Phe Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ala Ala Glu Leu Gly Asn Asn Tyr
290 295 300
Leu Asn Leu Thr Thr Lys Phe Ile Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp
305 310 315 320
Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Ser Asp Val Ile Lys Ser Lys Ala
325 330 335
Glu Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asn Leu Trp Gly Leu Glu Asp Lys Gly
340 345 350
Glu Glu Asp Phe Leu Lys Ile Trp Lys Asp Asn
355 360
<210> 36
<211> 361
<212> PRT
<213> 黑腹果蝇
<400> 36
Met Ala Pro Tyr Ser Arg Ile Tyr His Gln Asp Lys Ser Ser Arg Glu
1 5 10 15
Thr Gly Val Leu Phe Glu Asp Asp Ala Gln Thr Val Asp Ser Asp Leu
20 25 30
Thr Thr Asp Arg Phe Gln Leu Lys Arg Ala Glu Lys Arg Arg Leu Pro
35 40 45
Leu Val Trp Arg Asn Ile Ile Leu Phe Ala Leu Val His Leu Ala Ala
50 55 60
Leu Tyr Gly Leu His Ser Ile Phe Thr Arg Ala Lys Leu Ala Thr Thr
65 70 75 80
Leu Phe Ala Ala Gly Leu Tyr Ile Ile Gly Met Leu Gly Val Thr Ala
85 90 95
Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Arg Thr Tyr Lys Ala Lys Trp Pro
100 105 110
Leu Arg Leu Leu Leu Val Ile Phe Asn Thr Ile Ala Phe Gln Asp Ala
115 120 125
Val Tyr His Trp Ala Arg Asp His Arg Val His His Lys Tyr Ser Glu
130 135 140
Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Phe Ser His
145 150 155 160
Val Gly Trp Leu Leu Cys Lys Lys His Pro Asp Ile Lys Glu Lys Gly
165 170 175
Arg Gly Leu Asp Leu Ser Asp Leu Arg Ala Asp Pro Ile Leu Met Phe
180 185 190
Gln Arg Lys His Tyr Tyr Ile Leu Met Pro Leu Ala Cys Phe Val Leu
195 200 205
Pro Thr Val Ile Pro Met Val Tyr Trp Asn Glu Thr Leu Ala Ser Ser
210 215 220
Trp Phe Val Ala Thr Met Phe Arg Trp Cys Phe Gln Leu Asn Met Thr
225 230 235 240
Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Lys Phe Gly Asn Arg Pro Tyr Asp
245 250 255
Lys Thr Met Asn Pro Thr Gln Asn Ala Phe Val Ser Ala Phe Thr Phe
260 265 270
Gly Glu Gly Trp His Asn Tyr His His Ala Phe Pro Trp Asp Tyr Lys
275 280 285
Thr Ala Glu Trp Gly Cys Tyr Ser Leu Asn Ile Thr Thr Ala Phe Ile
290 295 300
Asp Leu Phe Ala Lys Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ala
305 310 315 320
Pro Asp Val Ile Gln Arg Arg Val Leu Arg Thr Gly Asp Gly Ser His
325 330 335
Glu Leu Trp Gly Trp Gly Asp Lys Asp Leu Thr Ala Glu Asp Ala Arg
340 345 350
Asn Val Leu Leu Val Asp Lys Ser Arg
355 360
<210> 37
<211> 359
<212> PRT
<213> 红醋栗穿孔蛾
<400> 37
Met Pro Pro Tyr Pro Glu Glu Val Asp Thr Asn His Ile Phe Glu Glu
1 5 10 15
Asp Ile Ser His Glu Glu Ser Lys Pro Ala Leu Lys Pro Leu Val Ala
20 25 30
Pro Gln Ala Asp Asn Arg Lys Pro Glu Ile Val Pro Leu Asn Leu Ile
35 40 45
Thr Phe Gly Tyr Gly His Leu Ala Ala Ile Tyr Gly Ile Tyr Leu Cys
50 55 60
Phe Thr Ser Ala Lys Trp Ala Thr Ile Val Phe Ala Phe Val Leu Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Ala Glu Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ser
85 90 95
His Arg Ser Tyr Lys Ala Lys Leu Pro Leu Arg Leu Ile Leu Leu Leu
100 105 110
Phe Asn Thr Leu Ala Phe Gln Asn Thr Ala Ile Asp Trp Val Arg Asp
115 120 125
His Arg Met His His Lys Tyr Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn
130 135 140
Ala Thr Arg Gly Phe Phe Phe Ser His Val Gly Trp Leu Leu Thr Arg
145 150 155 160
Lys His Pro Glu Val Lys Arg Arg Gly Lys Asp Ile Asp Met Met Asp
165 170 175
Ile Tyr Asn Asp Ser Leu Leu Lys Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro
180 185 190
Phe Val Gly Leu Val Cys Phe Val Ile Pro Thr Leu Met Pro Met Tyr
195 200 205
Phe Trp Asn Glu Thr Leu Asn Asn Ser Trp His Ile Ala Thr Met Leu
210 215 220
Arg Tyr Ile Val Asn Leu Asn Met Thr Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala
225 230 235 240
His Ile Trp Gly Tyr Lys Pro Tyr Asp Lys Ser Ile Lys Pro Val Gln
245 250 255
Asn Ile Thr Val Ser Ile Leu Ile Leu Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr
260 265 270
His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Thr Ser Glu Leu Gly Asn Asp
275 280 285
Phe Leu Asn Phe Thr Thr Leu Phe Ile Asn Leu Phe Ala Lys Ile Gly
290 295 300
Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Ala Ser Asp Lys Val Val Ala Ala Arg
305 310 315 320
Arg Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asn Leu Trp Gly Trp Glu Asp Lys
325 330 335
Ser Leu Asn Glu Glu Glu Arg Gln Ala Ala Thr Val Leu Tyr Pro Asn
340 345 350
Lys Tyr Leu Asn Leu Lys Asp
355
<210> 38
<211> 352
<212> PRT
<213> 苹果小卷蛾
<400> 38
Met Ala Pro Asn Val Thr Asp Val Asn Gly Val Leu Phe Glu Ser Asp
1 5 10 15
Ala Ala Thr Pro Asp Leu Ala Leu Ala Asn Ala Pro Val Gln Gln Ala
20 25 30
Asp Asp Ser Pro Arg Ile Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile Leu Phe Ala
35 40 45
Tyr Leu His Ile Ala Ala Leu Tyr Gly Gly Tyr Leu Phe Leu Val Ser
50 55 60
Ala Lys Trp Gln Thr Asp Ile Phe Ala Tyr Phe Leu Tyr Val Ala Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys Ser
85 90 95
Tyr Lys Ala Lys Trp Pro Leu Arg Leu Ile Leu Val Ile Phe Asn Thr
100 105 110
Ile Ala Phe Gln Asp Ser Ala Ile Asp Trp Ala Arg Asp His Arg Met
115 120 125
His His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg
130 135 140
Gly Phe Phe Phe Ser His Ile Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro
145 150 155 160
Glu Leu Lys Arg Lys Gly Lys Gly Leu Asp Leu Ser Asp Leu Tyr Ala
165 170 175
Asp Pro Ile Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr Leu Ile Leu Met Pro
180 185 190
Leu Ala Cys Phe Val Leu Pro Thr Val Ile Pro Val Tyr Leu Trp Asn
195 200 205
Glu Thr Trp Thr Asn Ala Phe Phe Val Ala Ala Leu Phe Arg Tyr Ala
210 215 220
Phe Ile Leu Asn Val Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Lys Trp
225 230 235 240
Gly Asp Lys Pro Tyr Asp Lys Ser Ile Lys Pro Ser Glu Asn Ile Ser
245 250 255
Val Ser Leu Phe Ala Phe Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Thr
260 265 270
Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Thr Ala Glu Leu Ser Ser Asn Arg Leu Asn
275 280 285
Phe Thr Thr Lys Phe Ile Asn Phe Phe Ala Lys Ile Gly Trp Ala Tyr
290 295 300
Asp Met Lys Thr Val Ser Asp Glu Ile Ile Gln Lys Arg Val Asn Arg
305 310 315 320
Thr Gly Asp Gly Ser His His Leu Trp Gly Trp Gly Asp Lys Asp His
325 330 335
Ser Lys Glu Glu Val Asn Ala Ala Val Arg Ile Asn Pro Lys Asp Asp
340 345 350
<210> 39
<211> 975
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 密码子优化的大螟Z11去饱和酶
<400> 39
atgctgtctc aggaggagcc aaccgataca agcctggtgc caagggcagc acctagaaag 60
taccagatcg tgtatcccaa tctgatcacc ttcggctact ggcacctggc agggctgtac 120
ggcctgtatc tgtgctttac atccgccaag tggaccacaa tcctgttcag cttcatcctg 180
tgcgtgatcg ccgagatcgg agtgaccgca ggagcacaca ggctgtgggc ccacaagaca 240
tataaggcca acctgcccct gcagatcctg ctgatggtca tgaattccat cgccttccag 300
aactctgcca tcgattgggt gcgggaccac agactgcacc acaagtactc tgacaccgat 360
gccgaccctc acaatgccag cagaggcttc ttttattccc acgtgggctg gctgctggtg 420
aagaagcacc cagaggtgaa gaagaggggc aaggagctgg atatgtctga catctacagc 480
aaccccgtgc tgcgcttcca gaagcagtat gccatccctt tcatcggcgc cgtgtgcttt 540
atcctgccaa ccgtgatccc cgtgtactgt tggggcgaga catggacaaa tgcctggcac 600
atcacaatgc tgaggtatat caccaatctg aacgtgacat ttctggtgaa cagcgccgcc 660
cacatctggg gctacaagcc ttatgatgag aatatcctgc cagcccagaa catcgccgtg 720
tccatcgcaa cctgcggaga gggcttccac aattaccacc acgtgtttcc ttgggattat 780
cgggccgccg agctgggcaa caataacctg aacctgacca caaagtttat cgacttcttt 840
gcctggctgg gctgggccta cgatctgaag acagtgagct ccgacatgat caagctgagg 900
gcaaagagga ccggcgacgg aacaaatctg tggggcgagc acaacgatga gctgaaggag 960
ggcaaggagg actga 975
<210> 40
<211> 326
<212> PRT
<213> 脐橙螟蛾
<400> 40
Met Val Pro Asn Lys Gly Ser Ser Asp Val Leu Ser Glu His Ser Glu
1 5 10 15
Pro Gln Phe Thr Lys Leu Ile Ala Pro Gln Ala Gly Pro Arg Lys Tyr
20 25 30
Lys Ile Val Tyr Arg Asn Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Trp His Leu Ser
35 40 45
Ala Val Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Cys Ala Lys Trp Ala Thr
50 55 60
Ile Leu Phe Ala Phe Phe Leu Tyr Val Ile Ala Glu Ile Gly Ile Thr
65 70 75 80
Gly Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Arg Thr Tyr Lys Ala Lys Leu
85 90 95
Pro Leu Glu Ile Leu Leu Leu Ile Met Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asp
100 105 110
Thr Ala Phe Thr Trp Ala Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser
115 120 125
Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser
130 135 140
His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Lys Ala Arg
145 150 155 160
Gly Lys Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Leu Lys Asn Asn Pro Leu Leu Lys
165 170 175
Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Leu Val Ile Gly Thr Leu Cys Phe Leu
180 185 190
Met Pro Thr Phe Val Pro Val Tyr Phe Trp Gly Glu Gly Ile Ser Thr
195 200 205
Ala Trp Asn Ile Asn Leu Leu Arg Tyr Val Met Asn Leu Asn Met Thr
210 215 220
Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Phe Gly Asn Lys Pro Tyr Asp
225 230 235 240
Lys Ser Ile Ala Ser Val Gln Asn Ile Ser Val Ser Leu Ala Thr Phe
245 250 255
Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Thr Tyr Pro Trp Asp Tyr Arg
260 265 270
Ala Ala Glu Leu Gly Asn Asn Arg Leu Asn Met Thr Thr Ala Phe Ile
275 280 285
Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Ser Val Pro
290 295 300
Gln Glu Ala Ile Ala Lys Arg Cys Ala Lys Thr Gly Asp Gly Thr Asp
305 310 315 320
Met Trp Gly Arg Lys Arg
325
<210> 41
<211> 338
<212> PRT
<213> 棉灰翅夜蛾
<400> 41
Met Ala Gln Cys Val Gln Thr Thr Thr Ile Leu Glu Gln Lys Glu Glu
1 5 10 15
Lys Thr Val Thr Leu Leu Val Pro Gln Ala Gly Lys Arg Lys Phe Glu
20 25 30
Ile Val Tyr Phe Asn Ile Ile Thr Phe Ala Tyr Trp His Ile Ala Gly
35 40 45
Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Thr Lys Trp Ala Thr Val
50 55 60
Leu Phe Ser Phe Phe Leu Phe Val Val Ala Glu Val Gly Val Thr Ala
65 70 75 80
Gly Ser His Arg Leu Trp Ser His Lys Thr Tyr Lys Ala Lys Leu Pro
85 90 95
Leu Gln Ile Leu Leu Met Val Met Asn Ser Leu Ala Phe Gln Asn Thr
100 105 110
Val Ile Asp Trp Val Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser Asp
115 120 125
Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His
130 135 140
Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Asp Val Lys Lys Arg Gly
145 150 155 160
Lys Glu Ile Asp Ile Ser Asp Ile Tyr Asn Asn Pro Val Leu Arg Phe
165 170 175
Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Ala Val Cys Phe Val Leu
180 185 190
Pro Thr Leu Ile Pro Val Tyr Gly Trp Gly Glu Thr Trp Thr Asn Ala
195 200 205
Trp His Val Ala Met Leu Arg Tyr Ile Met Asn Leu Asn Val Thr Phe
210 215 220
Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Tyr Gly Lys Arg Pro Tyr Asp Lys
225 230 235 240
Lys Ile Leu Pro Ser Gln Asn Ile Ala Val Ser Ile Ala Thr Phe Gly
245 250 255
Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ala
260 265 270
Ala Glu Leu Gly Asn Asn Ser Leu Asn Phe Pro Thr Lys Phe Ile Asp
275 280 285
Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Lys
290 295 300
Glu Met Ile Lys Gln Arg Ser Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asn Leu
305 310 315 320
Trp Gly Leu Glu Asp Val Asp Thr Pro Glu Asp Leu Lys Asn Thr Lys
325 330 335
Gly Glu
<210> 42
<211> 336
<212> PRT
<213> 黄地老虎
<400> 42
Met Ala Gln Gly Val Gln Thr Thr Thr Ile Leu Arg Glu Glu Glu Pro
1 5 10 15
Ser Leu Thr Phe Val Val Pro Gln Glu Pro Arg Lys Tyr Gln Ile Val
20 25 30
Tyr Pro Asn Leu Ile Thr Phe Gly Tyr Trp His Ile Ala Gly Leu Tyr
35 40 45
Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Gln Thr Ile Leu Phe
50 55 60
Ser Phe Met Leu Val Val Leu Ala Glu Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala
65 70 75 80
His Arg Leu Trp Ala His Lys Thr Tyr Lys Ala Lys Leu Pro Leu Gln
85 90 95
Ile Ile Leu Met Ile Leu Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asn Ser Ala Ile
100 105 110
Asp Trp Val Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser Asp Thr Asp
115 120 125
Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His Val Gly
130 135 140
Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Glu Val Lys Arg Arg Gly Lys Glu
145 150 155 160
Leu Asp Met Ser Asp Ile Tyr Asn Asn Pro Val Leu Arg Phe Gln Lys
165 170 175
Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Ala Met Cys Phe Gly Leu Pro Thr
180 185 190
Phe Ile Pro Val Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Trp Ser Asn Ala Trp His
195 200 205
Ile Thr Met Leu Arg Tyr Ile Leu Asn Leu Asn Ile Thr Phe Leu Val
210 215 220
Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly Tyr Lys Pro Tyr Asp Ile Lys Ile
225 230 235 240
Leu Pro Ala Gln Asn Ile Ala Val Ser Ile Val Thr Gly Gly Glu Val
245 250 255
Ser Ile Thr Thr Thr Thr Phe Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ala Ala Glu
260 265 270
Leu Gly Asn Asn Tyr Leu Asn Leu Thr Thr Lys Phe Ile Asp Phe Phe
275 280 285
Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Ser Asp Val
290 295 300
Ile Lys Ser Lys Ala Glu Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asn Leu Trp Gly
305 310 315 320
Leu Glu Asp Lys Gly Glu Glu Asp Phe Leu Lys Ile Trp Lys Asp Asn
325 330 335
<210> 43
<211> 349
<212> PRT
<213> 粉纹夜蛾
<400> 43
Met Ala Val Met Ala Gln Thr Val Gln Glu Thr Ala Thr Val Leu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Ala Arg Thr Val Thr Leu Val Ala Pro Lys Thr Thr Pro Arg
20 25 30
Lys Tyr Lys Tyr Ile Tyr Thr Asn Phe Leu Thr Phe Ser Tyr Ala His
35 40 45
Leu Ala Ala Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp
50 55 60
Glu Thr Leu Leu Phe Ser Phe Val Leu Phe His Met Ser Asn Ile Gly
65 70 75 80
Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Thr His Lys Thr Phe Lys Ala
85 90 95
Lys Leu Pro Leu Glu Ile Val Leu Met Ile Phe Asn Ser Leu Ala Phe
100 105 110
Gln Asn Thr Ala Ile Thr Trp Ala Arg Glu His Arg Leu His His Lys
115 120 125
Tyr Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe
130 135 140
Tyr Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Asp Val Leu
145 150 155 160
Lys Tyr Gly Lys Thr Ile Asp Met Ser Asp Val Tyr Asn Asn Pro Val
165 170 175
Leu Lys Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Val Pro Leu Ile Gly Thr Val Cys
180 185 190
Phe Ala Leu Pro Thr Leu Ile Pro Val Tyr Cys Trp Gly Glu Ser Trp
195 200 205
Asn Asn Ala Trp His Ile Ala Leu Phe Arg Tyr Ile Phe Asn Leu Asn
210 215 220
Val Thr Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly Asn Lys Pro
225 230 235 240
Tyr Asp Lys Ser Ile Leu Pro Ala Gln Asn Leu Leu Val Ser Phe Leu
245 250 255
Ala Ser Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp
260 265 270
Tyr Arg Thr Ala Glu Leu Gly Asn Asn Phe Leu Asn Leu Thr Thr Leu
275 280 285
Phe Ile Asp Phe Cys Ala Trp Phe Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Ser
290 295 300
Val Ser Glu Asp Ile Ile Lys Gln Arg Ala Lys Arg Thr Gly Asp Gly
305 310 315 320
Ser Ser Gly Val Ile Trp Gly Trp Asp Asp Lys Asp Met Asp Arg Asp
325 330 335
Ile Lys Ser Lys Ala Asn Ile Phe Tyr Ala Lys Lys Glu
340 345
<210> 44
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 来自密码子优化的DTU WO 2016/207339_SEQ ID
NO: 1的脐橙螟蛾去饱和酶
<400> 44
atggttccaa acaagggttc ctctgatgtt ttgtctgaac attctgaacc acaattcacc 60
aagttgattg ctccacaagc tggtccaaga aagtacaaaa tcgtttacag aaacttgttg 120
accttcggtt actggcattt gtctgctgtt tatggtttgt acttgtgttt cacttgtgct 180
aagtgggcta ctattttgtt cgctttcttc ttgtacgtta tcgccgaaat tggtattact 240
ggtggtgctc atagattatg ggctcataga acttacaaag ccaagttgcc attggaaatc 300
ttgttgttga tcatgaactc cattgccttc caagatactg cttttacttg ggctagagat 360
catagattgc atcacaagta ctctgatact gatgctgatc cacataatgc tactagaggt 420
ttcttctact ctcatgttgg ttggttgttg gttaagaaac acccagaagt taaggctaga 480
ggtaagtact tgtctttgga tgacttgaag aacaaccctt tgttgaagtt ccaaaagaag 540
tacgccattt tggtcattgg tactttgtgc tttttgatgc caactttcgt tccagtttac 600
ttttggggtg aaggtatttc tactgcctgg aacattaact tgttaagata cgtcatgaac 660
ttgaacatga cctttttggt taactccgct gctcatattt ttggtaacaa gccatacgat 720
aagtctatcg cctctgttca aaacatctct gtttctttgg ctactttcgg tgaaggtttc 780
cataactacc atcatactta tccatgggat tacagagctg ctgaattggg taacaataga 840
ttgaatatga ccaccgcctt cattgatttc tttgcttgga ttggttgggc ctacgatttg 900
aaatctgttc cacaagaagc tattgctaag agatgtgcta aaactggtga tggtactgat 960
atgtggggta gaaagagatg a 981
<210> 45
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 来自密码子优化的DTU WO 2016/207339_SEQ ID
NO: 40的棉灰翅夜蛾去饱和酶
<400> 45
ggacactgac atggactgaa ggagtagaga atcggcccgt ggagttggcc ttcattttca 60
gtcttatctc tcggtgttat ggtagtcact tatatcggta ttaaaataag tgaataaggc 120
ttgtaaaaat ggcgcaatgt gtacaaacaa caacgatttt ggaacaaaaa gaagagaaaa 180
cagtaacttt gctggtacct caagcgggaa agaggaagtt tgaaattgtg tattttaata 240
tcatcacctt cgcttactgg catatagctg gactatatgg cctttatttg tgcttcactt 300
caacaaaatg ggcgacagtt ttattctcat tctttctatt cgtcgtagca gaagtagggg 360
tcacggctgg ctcccacaga ctttggtcgc ataaaactta caaagcaaaa ctacctttac 420
aaattctgct aatggtgatg aattcccttg catttcaaaa cacagtcatt gattgggtga 480
gagaccatcg actccatcat aagtatagcg acactgatgc cgatccccat aatgcctccc 540
gaggattttt ctattcgcac gtcggttggc tgcttgtgag aaaacaccct gatgtcaaga 600
aacgaggaaa ggaaattgat atatctgata tttacaacaa tccggtactg aggttccaga 660
agaagtacgc aattcctttc atcggggcag tttgtttcgt cttaccaaca ttgataccgg 720
tttacggttg gggagaaacc tggactaatg cctggcacgt cgccatgctg cggtacatta 780
tgaaccttaa cgtcaccttc ctggtcaaca gcgctgctca tatatatgga aagagacctt 840
atgacaagaa gatcctacca tctcaaaaca tagctgtgtc cattgcaacc tttggggaag 900
gtttccataa ttatcatcat gtatttccat gggattatcg cgcagctgaa cttggaaata 960
acagtttgaa tttccctacg aaatttattg atttctttgc gtggatcgga tgggcgtatg 1020
acctaaagac tgtttcgaaa gaaatgataa aacaaaggtc aaaaagaact ggtgatggaa 1080
ctaatctatg ggggttagaa gatgtggata ccccggagga tttaaaaaat acaaaaggcg 1140
aataggcaaa cccttaaact caaacagtga ggtttaatgt gatatttaga attagaatta 1200
atttatttga aattaaatga aggttttgga taactgtttt taataataaa aatagttttt 1260
cgattaaatt ccttagatta ttttaaagga aatgtataag gtactcgcgt ggttagcaac 1320
ccagcagtcc ctgtttatct gtttttatga atttattcta tgaatgtaga tgtcgcatga 1380
aattttaaaa tgttgcattt gtataatttt acttatgaat aaataaattt atttttaaaa 1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1470
<210> 46
<211> 1011
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 来自密码子优化的DTU WO 2016/207339_SEQ ID NO: 42
的黄地老虎去饱和酶
<400> 46
atggctcaag gtgtccaaac aactacgata ttgagggagg aagagccgtc attgactttc 60
gtggtacctc aagaaccgag aaagtatcaa atcgtgtacc caaaccttat cacatttggg 120
tactggcata tagctggttt atacgggcta tatttgtgct ttacttcggc aaaatggcaa 180
acaattttat tcagtttcat gctcgttgtg ttagcagagt tgggaataac agccggcgct 240
cacaggttat gggcccacaa aacatataaa gcgaagcttc ccttacaaat tatcctgatg 300
atactgaact ccattgcctt ccaaaattcc gccattgatt gggtgaggga ccaccgtctc 360
catcataagt acagtgacac tgatgcagac cctcacaatg ctactcgtgg tttcttctat 420
tctcatgttg gatggttgct cgtaagaaaa catccagaag tcaagagacg tggaaaggaa 480
cttgacatgt ctgatattta caacaatcca gtgctgagat ttcaaaagaa gtatgctata 540
cccttcatcg gggcaatgtg cttcggatta ccaactttta tccctgttta cttctgggga 600
gaaacctgga gtaatgcttg gcatatcacc atgcttcggt acatcctcaa cctaaacatt 660
actttcctgg tcaacagtgc tgctcatatc tggggataca aaccttatga catcaaaata 720
ttgcctgccc aaaatatagc agtttccata gtaaccggcg gcgaagtttc cataactacc 780
accacgtttt ttccttggga ttatcgtgca gcagaattgg ggaacaatta tcttaatttg 840
acgactaagt tcatagattt cttcgcttgg atcggatggg cttacgatct taagacggtg 900
tccagtgatg ttataaaaag taaggcggaa agaactggtg atgggacgaa tctttggggt 960
ttagaagaca aaggtgaaga agattttttg aaaatctgga aagacaatta a 1011
<210> 47
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 来自密码子优化的DTU WO 2016/207339_SEQ ID NO: 44
的粉纹夜蛾去饱和酶
<400> 47
atggctgtga tggctcaaac agtacaagaa acggctacag tgttggaaga ggaagctcgc 60
acagtgactc ttgtggctcc aaagacaacg ccaaggaaat ataaatatat atacaccaac 120
tttcttacat tttcatatgc gcatttagct gcattatacg gactttattt gtgcttcacc 180
tctgcgaaat gggaaacatt gctattctct ttcgtactct tccacatgtc aaatataggc 240
atcaccgcag gggctcaccg actctggact cacaagactt tcaaagccaa attgcctttg 300
gaaattgtcc tcatgatatt caactcttta gcctttcaaa acacggctat tacatgggct 360
agagaacatc ggctacatca caaatacagc gatactgatg ctgatcccca caatgcgtca 420
agagggttct tctactcgca tgttggctgg ctattagtaa aaaaacatcc cgatgtcctg 480
aaatatggaa aaactataga catgtcggat gtatacaata atcctgtgtt aaaatttcag 540
aaaaagtacg cagtaccctt aattggaaca gtttgttttg ctcttccaac tttgattcca 600
gtctactgtt ggggcgaatc gtggaacaac gcttggcaca tagccttatt tcgatacata 660
ttcaatctta acgtgacttt cctagtcaac agtgctgcgc atatctgggg gaataagcct 720
tatgataaaa gcatcttgcc cgctcaaaac ctgctggttt ccttcctagc aagtggagaa 780
ggcttccata attaccatca cgtctttcca tgggattacc gcacagcaga attagggaat 840
aacttcctga atttgacgac gctgttcatt gatttttgtg cctggtttgg atgggcttat 900
gacttgaagt ctgtatcaga ggatattata aaacagagag ctaaacgaac aggtgacggt 960
tcttcagggg tcatttgggg atgggacgac aaagacatgg accgcgatat aaaatctaaa 1020
gctaacattt tttatgctaa aaaggaatga 1050

Claims (112)

1.一种从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法，该方法包括以下步骤：
从一种或多种天然存在的生物体获得该一种或多种不饱和脂质部分；以及
还原该一种或多种不饱和脂质部分，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。
2.一种从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法，该方法包括以下步骤：
从一种或多种天然存在的生物体获得该一种或多种不饱和脂质部分；
将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种游离脂肪酸(FFA)；
将该一种或多种FFA酯化成一种或多种脂肪酸烷基酯(FAAE)；以及
还原该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。
3.一种从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法，该方法包括以下步骤：
从一种或多种天然存在的生物体获得该一种或多种不饱和脂质部分；
将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种FAAE；以及还原该一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中该一种或多种天然存在的生物体是昆虫。
5.权利要求1至3中任一项的方法，其中该一种或多种天然存在的生物体不是昆虫。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中该一种或多种天然存在的生物体选自下组，该组由以下各项组成：植物、藻类和细菌。
7.权利要求6的方法，其中该植物来自选自下组的家族，该组由以下各项组成：山龙眼科和鼠李科。
8.权利要求6的方法，其中该植物包括来自以下属的物种：Gevuina属、金盏花属、沼沫花属、新月花属、葛缕子属、胡萝卜属、芫荽属、澳洲坚果属、肉豆蔻属、Licania属、石栗属、蓖麻属、榛属、Kermadecia属、马利筋属、Cardwellia属、银桦属、Orites属、枣属、Hicksbeachia属、沙棘属、麻黄属、Placospermum属、木龙山龙眼属和/或希蒙得木属。
9.权利要求8的方法，其中该植物选自下组，该组由以下各项组成：智利榛、欧洲榛、Kermadecia sinuata、叙利亚马利筋、蕾丝木、黄紫伊素银桦、Orites diversifolius、Orites revoluta、枣、Hicksbeachia pinnatifolia和迪科拉银桦。
10.权利要求6的方法，其中该藻类包括绿藻类。
11.权利要求10的方法，其中该绿藻包括来自盘星藻属的物种。
12.权利要求10的方法，其中该绿藻包括单角盘星藻。
13.权利要求6的方法，其中该细菌包括革兰氏阴性细菌。
14.权利要求13的方法，其中该革兰氏阴性细菌包括来自粘球菌属的物种。
15.权利要求13的方法，其中该革兰氏阴性细菌包括黄色粘球菌。
16.权利要求6的方法，其中该细菌包括蓝细菌。
17.权利要求16的方法，其中该蓝细菌包括来自聚球蓝细菌属的物种。
18.权利要求16的方法，其中该蓝细菌包括细长聚球菌。
19.一种从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法，该方法包括以下步骤：
在被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径的一种或多种重组微生物中产生该一种或多种不饱和脂质部分；
将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种游离脂肪酸(FFA)和/或一种或多种脂肪酸烷基酯(FAAE)；以及
还原该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。
20.权利要求19的方法，其中该一种或多种重组微生物使用一种或多种碳源以产生该一种或多种不饱和脂质部分。
21.权利要求20的方法，其中该一种或多种碳源包括糖、甘油、乙醇、有机酸、烷烃和/或脂肪酸。
22.权利要求21的方法，其中该一种或多种碳源选自下组，该组由以下各项组成：烷烃和脂肪酸。
23.权利要求19-22中任一项的方法，其中该一种或多种重组微生物对烷烃和/或脂肪酸具有高耐受性。
24.权利要求19-23中任一项的方法，其中该一种或多种重组微生物累积脂质。
25.权利要求19-24中任一项的方法，其中该一种或多种重组微生物包括一种或多种细菌和/或真菌。
26.权利要求19-25中任一项的方法，其中该一种或多种真菌是含油酵母。
27.权利要求26的方法，其中该含油酵母包括来自耶氏酵母属和/或假丝酵母属的物种。
28.权利要求26的方法，其中该含油酵母包括解脂耶氏酵母和/或维斯假丝酵母(热带假丝酵母)。
29.权利要求19-28中任一项的方法，其中该一种或多种重组微生物包含一种或多种选自以下项的外源生物合成酶：一种或多种去饱和酶、一种或多种酰基-CoA氧化酶、一种或多种酰基甘油脂肪酶或甾醇酯酯酶、一种或多种黄素蛋白吡啶核苷酸细胞色素还原酶、一种或多种延伸酶、一种或多种硫酯酶、一种或多种甘油-3-磷酸酰基转移酶、一种或多种溶血磷脂酸酰基转移酶、一种或多种二酰基甘油酰基转移酶和/或一种或多种脂质结合蛋白。
30.权利要求29的方法，其中该一种或多种去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：脂肪酰基-CoA去饱和酶和脂肪酰基-ACP去饱和酶。
31.权利要求29的方法，其中该一种或多种黄素蛋白吡啶核苷酸细胞色素还原酶选自下组，该组由以下各项组成：细胞色素-b5还原酶和NADPH依赖性细胞色素P450还原酶。
32.权利要求29的方法，其中该一种或多种延伸酶选自下组，该组由以下各项组成：ELO1、ELO2和ELO3或其任何组合。
33.权利要求29的方法，其中该一种或多种硫酯酶选自下组，该组由以下各项组成：酰基-ACP硫酯酶和酰基-CoA硫酯酶。
34.权利要求29的方法，其中该一种或多种甘油-3-磷酸酰基转移酶是双甘油-3-磷酸O-酰基转移酶/二羟基丙酮磷酸酰基转移酶。
35.权利要求29的方法，其中该一种或多种溶血磷脂酸酰基转移酶选自下组，该组由以下各项组成：SLC1、ALE1和LOA1或其任何组合。
36.权利要求29的方法，其中该一种或多种二酰基甘油酰基转移酶选自下组，该组由以下各项组成：酰基-CoA依赖性酰基转移酶和磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
37.权利要求29的方法，其中该一种或多种脂质结合蛋白是甾醇载体蛋白2(SCP2)。
38.权利要求29-37中任一项的方法，其中该一种或多种外源生物合成酶来自选自下组的属，该组由以下各项组成：酵母属、耶氏酵母属、假丝酵母属、夜蛾属、棉铃虫属、玉米螟属、脐橙螟蛾属、花翅小蛾属、小卷蛾属、梨小食心虫属、红醋栗穿孔蛾属、蛀茎夜蛾属、谷斑螟属、家蚕属、刺葵属、鼠属、拟南芥属、菜蛾属和蔽眼蝶属。
39.权利要求29-38中任一项的方法，其中该一种或多种外源生物合成酶来自选自下组的物种，该组由以下各项组成：酿酒酵母、解脂耶氏酵母、白假丝酵母、热带假丝酵母/维斯假丝酵母、棉灰翅夜蛾、甜菜夜蛾、玉米穗蛾、棉铃虫、脐橙螟蛾、葡萄藤蛾、苹果小卷蛾、红醋栗穿孔蛾、梨小食心虫、麻田豆秆野螟、亚洲玉米螟、欧洲玉米螟、虎杖螟、Ostriniaovalipennis、印度谷螟、大螟、家蚕、海枣、褐家鼠、拟南芥、小菜蛾和偏瞳蔽眼蝶。
40.权利要求19-39中任一项的方法，其中该一种或多种重组微生物进一步被操纵以使与用于产生一种或多种不饱和脂质部分的生物合成途径竞争的途径中的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。
41.权利要求40的方法，其中该重组微生物被操纵以使涉及一种或多种不希望的脂肪酸延伸途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。
42.权利要求41的方法，其中涉及一种或多种不希望的脂肪酸延伸途径的该一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：β-酮脂酰基-CoA还原酶、β-羟酰基-CoA脱水酶、烯酰基-CoA还原酶或其任何组合。
43.权利要求40的方法，其中该重组微生物被操纵以使涉及一种或多种脂质体储存和/或回收途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。
44.权利要求43的方法，其中涉及一种或多种脂质体储存和/或回收途径的该一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：三酰基甘油脂肪酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、二酰基甘油酰基转移酶、酰基转移酶、甾醇酯水解酶、酰基-CoA合成酶或其任何组合。
45.权利要求40的方法，其中该重组微生物被操纵以使涉及一种或多种脂肪酸降解途径的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。
46.权利要求45的方法，其中该脂肪酸降解途径是β-氧化途径。
47.权利要求46的方法，其中该一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：酰基-CoA氧化酶、多功能烯酰基-CoA水合酶-β-羟酰基-CoA脱氢酶、β-酮脂酰基-CoA硫解酶或其任何组合。
48.权利要求45的方法，其中该脂肪酸降解途径是ω-氧化途径。
49.权利要求48的方法，其中该一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：单加氧酶(CYP52)、脂肪醇氧化酶、脂肪醇脱氢酶、醇脱氢酶、脂肪醛脱氢酶或其任何组合。
50.权利要求40的方法，其中该重组微生物被操纵以使涉及过氧化物酶体生物发生的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低。
51.权利要求50的方法，其中涉及过氧化物酶体生物发生的该一种或多种内源蛋白选自下组，该组由以下各项组成：PEX1、PEX2、PEX3、PEX4、PEX5、PEX6、PEX7、PEX8、PEX10、PEX11、PEX12、PEX13、PEX14、PEX15、PEX17、PEX18、PEX19、PEX21、PEX22、PEX25、PEX27、PEX28、PEX29、PEX30、PEX31、PEX32和PEX34或其任何组合。
52.权利要求40-51中任一项的方法，其中该一种或多种内源蛋白来自选自下组的属，该组由以下各项组成：酵母属、耶氏酵母属和假丝酵母属。
53.权利要求40-52中任一项的方法，其中该一种或多种内源蛋白来自选自下组的物种，该组由以下各项组成：酿酒酵母、解脂耶氏酵母、白假丝酵母和热带假丝酵母/维斯假丝酵母。
54.权利要求19-53中任一项的方法，其中该一种或多种重组微生物进一步被操纵以增加辅酶的细胞内水平。
55.权利要求54的方法，其中该辅酶是NADH和/或NADPH。
56.权利要求54或权利要求55的方法，其中该一种或多种重组微生物进一步被操纵以表达选自下组的一种或多种内源或外源蛋白，该组由以下各项组成：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转醛醇酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸酮醇-异构酶、D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶、NADP+依赖性异柠檬酸脱氢酶、NAD+或NADP+依赖性苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、转氢酶或其任何组合。
57.权利要求56的方法，其中一种或多种内源或外源蛋白的表达与共底物补充结合。
58.权利要求54或权利要求55的方法，其中该一种或多种重组微生物进一步被操纵以使选自下组的一种或多种内源蛋白的活性缺失、破坏、突变和/或降低，该组由以下各项组成：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转醛醇酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸酮醇-异构酶、D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶或其任何组合。
59.权利要求1-58中任一项的方法，其中该一种或多种不饱和脂质部分选自(Z)-3-己烯酸、(Z)-3-壬烯酸、(Z)-5-癸烯酸、(E)-5-癸烯酸、(Z)-7-十二碳烯酸、(E)-8-十二碳烯酸、(Z)-8-十二碳烯酸、(Z)-9-十二碳烯酸、(E,E)-8,10-十二碳二烯酸、(7E,9Z)-十二碳二烯酸、(Z)-9-十四碳烯酸、(Z)-11-十四碳烯酸、(E)-11-十四碳烯酸、(Z)-7-十六碳烯酸、(Z)-9-十六碳烯酸、(Z)-11-十六碳烯酸、(Z,Z)-11,13-十六碳二烯酸、(11Z,13E)-十六碳二烯酸、(9Z,11E)-十六碳二烯酸、(Z)-13-十八碳烯酸、(Z,Z,Z,Z,Z)-3,6,9,12,15-二十三碳五烯酸或其任何组合。
60.权利要求1-58中任一项的方法，其中该一种或多种不饱和脂质部分选自下组，该组由以下各项组成：(Z)-9-十四碳烯酸(Z9-14:COOH)、(E)-11-十四碳烯酸(E11-14:COOH)、(Z)-11-十四碳烯酸(Z11-14:COOH)、(Z)-9-十六碳烯酸(Z9-16:COOH)、(Z)-11-十六碳烯酸(Z11-16:COOH)、(Z)-13-十八碳烯酸(Z13-18:COOH)和(Z)-11-十八碳烯酸(Z11-18:COOH)。
61.权利要求1-60中任一项的方法，其中该一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛包含一种或多种昆虫信息素、香料、调味剂和/或聚合物中间体。
62.权利要求61的方法，其中该一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛包含一种或多种昆虫信息素。
63.一种在权利要求19-62中任一项的方法中使用的重组微生物，其用于产生不饱和脂质部分。
64.一种产生权利要求63的重组微生物的方法。
65.权利要求2-62中任一项的方法，其中将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种FFA和/或一种或多种FAAE的步骤进一步包括以下步骤：
分离该一种或多种不饱和脂质部分；
任选地富集具有特定链长的一种或多种不饱和脂质部分；以及
加工该一种或多种不饱和脂质部分以产生脂肪酸衍生物。
66.权利要求65的方法，其中加工该一种或多种不饱和脂质部分的步骤包括将该一种或多种不饱和脂质部分皂化为一种或多种FFA。
67.权利要求65的方法，其中加工该一种或多种不饱和脂质部分的步骤包括将该一种或多种不饱和脂质部分酯化为一种或多种FAAE。
68.权利要求65的方法，其中富集具有特定链长的一种或多种不饱和脂质部分的任选步骤包括分离方法。
69.权利要求68的方法，其中该分离方法包括蒸馏、色谱法和/或蒸馏。
70.权利要求1-69中任一项的方法，其中将该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE还原成一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的步骤包括使该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE与一种或多种化学计量还原剂接触。
71.权利要求70的方法，其中该一种或多种化学计量还原剂包含双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠Vitride(红铝、Vitride、SMEAH)和/或二异丁基氢化铝(DIBAL)。
72.权利要求70或权利要求71的方法，其中还原该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE的步骤包含大体积环状氮路易斯碱以修饰还原剂。
73.权利要求72的方法，其中该大体积环状氮路易斯碱允许该还原步骤选择性地产生一种或多种脂肪醛。
74.权利要求1-69中任一项的方法，其中将该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAAE还原成一种或多种脂肪醇的步骤包括使该一种或多种不饱和脂质部分、该一种或多种FFA和/或该一种或多种FAME与一种或多种过渡金属催化剂接触。
75.权利要求74的方法，其中该一种或多种过渡金属催化剂包含一种或多种VIII族催化剂。
76.权利要求1-70或73-75中任一项的方法，其中通过氧化步骤将产生的该脂肪醇进一步氧化成脂肪醛。
77.权利要求76的方法，其中该氧化步骤包括一种或多种部分氧化方法。
78.权利要求77的方法，其中该一种或多种部分氧化方法包括NaOCl/TEMPO。
79.权利要求76的方法，其中该氧化步骤包括铜催化的有氧氧化。
80.权利要求1-79中任一项的方法，其中通过分离程序进一步富集该一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。
81.一种由权利要求1-80中任一项的方法产生的组合物。
82.权利要求29的方法，其中该一种或多种去饱和酶包含选自由SEQ ID NO:3-24组成的组的核苷酸序列。
83.权利要求29的方法，其中该一种或多种去饱和酶包含选自由SEQ ID NO:1、2、25-38组成的组的氨基酸序列。
84.权利要求29的方法，其中该一种或多种酰基-CoA氧化酶选自表3a。
85.权利要求29的方法，其中该一种或多种酰基甘油脂肪酶或甾醇酯酯酶选自表3b。
86.权利要求44的方法，其中该酰基转移酶选自下组，该组由以下各项组成：解脂耶氏酵母YALI0C00209g、解脂耶氏酵母YALI0E18964g、解脂耶氏酵母YALI0F19514g、解脂耶氏酵母YALI0C14014g、解脂耶氏酵母YALI0E16797g、解脂耶氏酵母YALI0E32769g和解脂耶氏酵母YALI0D07986g、酿酒酵母YBL011w、酿酒酵母YDL052c、酿酒酵母YOR175C、酿酒酵母YPR139C、酿酒酵母YNR008w和酿酒酵母YOR245c以及假丝酵母I503_02577、假丝酵母CTRG_02630、假丝酵母CaO19.250、假丝酵母CaO19.7881、假丝酵母CTRG_02437、假丝酵母CaO19.1881、假丝酵母CaO19.9437、假丝酵母CTRG_01687、假丝酵母CaO19.1043、假丝酵母CaO19.8645、假丝酵母CTRG_04750、假丝酵母CaO19.13439、假丝酵母CTRG_04390、假丝酵母CaO19.6941、假丝酵母CaO19.14203和假丝酵母CTRG_06209。
87.权利要求47的方法，其中该酰基-CoA氧化酶选自下组，该组由以下各项组成：解脂耶氏酵母POX1(YALI0E32835g)、解脂耶氏酵母POX2(YALI0F10857g)、解脂耶氏酵母POX3(YALI0D24750g)、解脂耶氏酵母POX4(YALI0E27654g)、解脂耶氏酵母POX5(YALI0C23859g)、解脂耶氏酵母POX6(YALI0E06567g)；酿酒酵母POX1(YGL205W)；假丝酵母POX2(CaO19.1655、CaO19.9224、CTRG_02374、M18259)、假丝酵母POX4(CaO19.1652、CaO19.9221、CTRG_02377、M12160)和假丝酵母POX5(CaO19.5723、CaO19.13146、CTRG_02721、M12161)。
88.权利要求19的方法，其中该方法进一步包括将该一种或多种脂肪醇化学转化为一种或多种相应的脂肪乙酸酯。
89.权利要求88的方法，其中将该一种或多种脂肪醇化学转化为一种或多种相应的脂肪乙酸酯的步骤包括使该一种或多种脂肪醇与乙酸酐接触。
90.权利要求88或89的方法，其中通过分离程序进一步富集该一种或多种脂肪乙酸酯。
91.权利要求1-80或82-90中任一项的方法，其中该FAAE包含脂肪酸甲酯(FAME)。
92.一种从一种或多种不饱和脂质部分产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的方法，该方法包括以下步骤：
在解脂耶氏酵母微生物中产生该一种或多种不饱和脂质部分，该解脂耶氏酵母微生物被操纵以包含用于产生一种或多种不饱和脂质部分的至少一种编码脂肪酰基去饱和酶的核酸分子，该脂肪酰基去饱和酶与选自下组的脂肪酰基去饱和酶具有95％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1、2、32、34、36-38；
将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种脂肪酸烷基酯(FAAE)；以及
还原该一种或多种FAAE，其中该还原产生一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛。
93.权利要求92的方法，其中产生该一种或多种不饱和脂质部分的步骤进一步包括：
向该解脂耶氏酵母微生物中引入或在其中表达该至少一种编码脂肪酰基去饱和酶的核酸分子，该脂肪酰基去饱和酶与选自下组的脂肪酰基去饱和酶具有95％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1、2、32、34、36-38；以及
在含有原料的培养基中培养该经操纵的解脂耶氏酵母微生物，该原料提供足以产生该一种或多种不饱和脂质部分的碳源。
94.权利要求92的方法，其中该解脂耶氏酵母微生物包含一种或多种内源酶活性的缺失、破坏、突变和/或降低，该一种或多种内源酶在脂质动员中起作用和/或催化与用于产生该一种或多种不饱和脂质部分的该生物合成途径竞争的途径中的反应。
95.权利要求92的方法，其中该解脂耶氏酵母微生物包含选自以下项的一种或多种内源酶的活性的缺失、破坏、突变和/或降低：
(i)选自下组的一种或多种酰基-CoA氧化酶，该组由以下各项组成：YALI0E32835g(POX1)、YALI0F10857g(POX2)、YALI0D24750g(POX3)、YALI0E27654g(POX4)、YALI0C23859g(POX5)、YALI0E06567g(POX6)；
(ii)选自下组的一种或多种(脂肪)醇脱氢酶，该组由以下各项组成：YALI0F09603g(FADH)、YALI0D25630g(ADH1)、YALI0E17787g(ADH2)、YALI0A16379g(ADH3)、YALI0E15818g(ADH4)、YALI0D02167g(ADH5)、YALI0A15147g(ADH6)、YALI0E07766g(ADH7)；
(iii)(脂肪)醇氧化酶YALI0B14014g(FAO1)；
(iv)脂肪酰基-CoA合成酶/脂肪酸转运蛋白YALI0E16016g(FAT1)；以及
(v)细胞内三酰基甘油脂肪酶YALI0D17534g(TGL3)。
96.权利要求92的方法，其中用选自表3c的异源酰基转移酶基因的一种或多种变体替代一种或多种内源酰基转移酶基因。
97.权利要求92的方法，其中该一种或多种不饱和脂质部分选自下组，该组由以下各项组成：(Z)-3-己烯酸、(Z)-3-壬烯酸、(Z)-5-癸烯酸、(E)-5-癸烯酸、(Z)-7-十二碳烯酸、(E)-8-十二碳烯酸、(Z)-8-十二碳烯酸、(Z)-9-十二碳烯酸、(E,E)-8,10-十二碳二烯酸、(7E,9Z)-十二碳二烯酸、(Z)-9-十四碳烯酸、(Z)-11-十四碳烯酸、(E)-11-十四碳烯酸、(Z)-7-十六碳烯酸、(Z)-9-十六碳烯酸、(Z)-11-十六碳烯酸、(Z,Z)-11,13-十六碳二烯酸、(11Z,13E)-十六碳二烯酸、(9Z,11E)-十六碳二烯酸、(Z)-13-十八碳烯酸、(Z,Z,Z,Z,Z)-3,6,9,12,15-二十三碳五烯酸或其任何组合。
98.权利要求92的方法，其中将该一种或多种不饱和脂质部分化学转化为一种或多种FAAE的步骤进一步包括以下步骤：
分离该一种或多种不饱和脂质部分；
任选地富集具有特定链长的一种或多种不饱和脂质部分；以及
将该一种或多种不饱和脂质部分酯化和/或酯交换成一种或多种FAAE。
99.权利要求98的方法，其中富集具有特定链长的一种或多种不饱和脂质部分的任选步骤包括分离方法。
100.权利要求99的方法，其中该分离方法包括蒸馏、色谱法和/或蒸馏。
101.权利要求92的方法，其中将该一种或多种FAAE还原成一种或多种脂肪醇和/或一种或多种脂肪醛的步骤包括使该一种或多种FAAE与一种或多种化学计量还原剂接触。
102.权利要求101的方法，其中该一种或多种化学计量还原剂包含双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠Vitride(红铝、Vitride、SMEAH)和/或二异丁基氢化铝(DIBAL)。
103.权利要求92的方法，其中该方法进一步包括将该一种或多种脂肪醇氧化成一种或多种相应的脂肪醛。
104.权利要求103的方法，其中该氧化步骤包括使该一种或多种脂肪醇与NaOCl/TEMPO接触。
105.权利要求92的方法，其中该方法进一步包括将该一种或多种脂肪醇化学转化为一种或多种相应的脂肪乙酸酯。
106.权利要求105的方法，其中将该一种或多种脂肪醇化学转化为一种或多种相应的脂肪乙酸酯的步骤包括使该一种或多种脂肪醇与乙酸酐接触。
107.权利要求92的方法，其中该方法进一步包括：
将该一种或多种脂肪醇氧化成一种或多种相应的脂肪醛；和/或
将该一种或多种脂肪醇化学转化为一种或多种相应的脂肪乙酸酯，
其中通过分离程序进一步富集该一种或多种脂肪醇、一种或多种脂肪醛和/或一种或多种脂肪乙酸酯。
108.权利要求92的方法，其中该一种或多种FAAE包括一种或多种脂肪酸甲酯(FAME)。
109.权利要求92的方法，其中该脂肪酰基去饱和酶不包括包含选自下组的氨基酸序列的脂肪酰基去饱和酶，该组由以下各项组成：SEQ ID No:40、41、42和43。
110.权利要求92的方法，其中该脂肪酰基去饱和酶不包括选自以下项的脂肪酰基去饱和酶：脐橙螟蛾、棉灰翅夜蛾、黄地老虎或粉纹夜蛾衍生的去饱和酶。
111.权利要求92的方法，其中该解脂耶氏酵母微生物是MATA ura3-302::SUC2 Δpox1Δpox2 Δpox3 Δpox4 Δpox5 Δpox6 Δfadh Δadh1 Δadh2 Δadh3 Δadh4 Δadh5Δadh6 Δadh7 Δfao1。
112.一种组合物，其由权利要求92或107的方法产生。
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