CN115725619A - 家蚕脂肪酶基因BmTGLc的应用及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了家蚕脂肪酶基因BmTGLc的应用及方法，本发明克隆得到了家蚕脂肪酶BmTGL(含BmTGLa、BmTGLb和BmTGLc)和野桑蚕同源基因(BmaTGL)，发现BmTGLc主要在家蚕中肠的前部和中部表达，且在家蚕中的表达量普遍高于野桑蚕，通过原核表达BmTGLc获得的重组蛋白具有脂肪酶活性；在家蚕中过表达BmTGLc获得的2个转基因品系，2个转基因品系家蚕的脂肪酶基因BmTGLc在中肠的表达量分别上调1.57倍和2.17倍；在相同的条件下饲养BmTGLc转基因和非转基因家蚕，转基因家蚕表现出较为明显的个体发育优势，且相关经济性状如全茧重和茧层率也有不同程度的提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及家蚕脂肪酶基因BmTGLc在培育高产家蚕品种中的的应用，还涉及培育高产家蚕品种的方法。
背景技术
动物对饲料的利用效率直接决定了动物养殖业的经济效益。昆虫利用其消化系统从获取的食物中汲取不同的营养和其他生命活动所需要的物质。食物中的物质多以大分子和其他复杂物质如蛋白质，多糖，脂肪和核酸的形式存在，这些大分子必须通过分解代谢反应分解成较小的分子如氨基酸、脂肪酸及单糖等，才能被身体细胞摄取用于生长发育和繁殖，此分解过程称为消化。昆虫的消化道可分为前肠，中肠和后肠。大多数消化发生在中肠，其中有丰富的消化酶。脂肪酶是家蚕消化桑叶中脂类物质的重要酶类。
脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是最重要的脂质水解酶，又称甘油三酯酰基水解酶，属于羧基酯水解酶类。脂肪酶在生物体内主要参与甘油三酰基酯的水解反应，同时也参与二酰甘油、半乳糖脂和磷脂的水解反应，生成相应的游离脂肪酸、甘油、甘油单酯和甘油二酯。因此脂肪酶的水解反应是控制脂质吸收，运输和利用的关键步骤。所有脂肪酶可分为六个家族，即中性脂肪酶家族，酸性脂肪酶家族，脂肪酶2家族，脂肪酶3家族，GDSL家族和激素敏感性脂肪酶家族。GDSL脂肪酶家族成员可以从三酰甘油，二酰甘油，单酰基甘油以及磷脂的sn-2位置水解，释放出脂肪酸；lipase2和lipase3家族成员可以水解具有不同脂肪酸成分的三酰甘油和羧酸酯；激素敏感性脂肪酶可以水解三酰甘油和胆固醇酯；中性脂肪酶因其水解中性脂质的能力而得名，但该家族成员还可以水解磷脂和半乳糖脂中的sn-1位置；酸性脂肪酶家族成员之所以如此命名是因为其在酸性pH条件下起作用，酸性脂肪酶主要水解三酰甘油和胆固醇酯。而根据脂肪酶的作用温度，可分为耐低温、耐高温和中温脂肪酶。其中耐低温脂肪酶的作用温度较低且在低温环境下仍具有高的催化活性；而耐高温脂肪酶具有在高温环境中有较高的催化活性，且对有机溶剂也有一定的耐受性。耐高温脂肪酶在食品加工、饲料、医药、洗涤等领域都有广泛的应用前景。
家蚕脂肪酶可分为消化类脂肪酶和溶酶体脂肪酶。家蚕消化类脂肪酶主要分布于家蚕中肠中，负责水解桑叶中的脂类物质；而家蚕溶酶体脂肪酶主要存在于溶酶体中，负责水解三酰甘油和胆固醇酯等。随着人们对家蚕脂肪酶的研究不断深入，越来越多的家蚕脂肪酶已经被研究和报道。2003年，日本学者首次报道了从家蚕的消化液中分离出来的脂肪酶，并将其命名为Bmlipase-1，初步证明其具有抗BmNPV病毒的活性。2022年，Shen等人通过全基因组分析，在家蚕总共鉴定获得38个脂肪酶候选基因，其中12个被证明在家蚕中肠中表达。3个相似度高达97％以上的脂肪酶被命名为BmTGLa、BmTGLb和BmTGLc。但是，除了Bmlipase-1之外，目前对家蚕脂肪酶的功能研究相对较为初步。
基于此，本发明对家蚕中肠表达的BmTGL(含BmTGLa、BmTGLb和BmTGLc)系列基因的表达特征、与野桑蚕同源基因(BmaTGL)的比较、酶活性特征及功能应用进行了深入的分析和探讨，期望将家蚕脂肪酶BmTGL作为潜在分子靶标应用于家蚕品种的分子改良。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种家蚕脂肪酶基因BmTGLc在培育高产家蚕品种中的应用；本发明的目的之二在于提供一种含有蚕脂肪酶基因BmTGLc的表达载体；本发明的目的之三在于提供一种含有蚕脂肪酶基因BmTGLc的转化体；本发明的目的之四在于提供一种培育高产家蚕品种的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、家蚕脂肪酶基因BmTGLc在培育高产家蚕品种中的应用
所述家蚕脂肪酶基因BmTGLc的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明优选的，所述高产为全茧重提高。
本发明优选的，所述高产为茧层率提高。
2、含有蚕脂肪酶基因BmTGLc的表达载体在培育高产家蚕品种中的应用。
3、含有蚕脂肪酶基因BmTGLc的转化体在培育高产家蚕品种中的应用。
4、一种培育高产家蚕品种的方法
通过在家蚕中过表达家蚕脂肪酶基因BmTGLc，所述家蚕脂肪酶基因BmTGLc的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明优选的，所述过表达家蚕脂肪酶基因BmTGLc的步骤如下：构建含有家蚕脂肪酶基因BmTGLc的转基因载体，然后与辅助载体pHA3PIG混合后注射进已经解除滞育的家蚕早期胚胎中，催青至蚁蚕孵化，获得转基因G0代家蚕，饲养G0代家蚕至成虫，自交制种获得G1代家蚕，筛选获得转基因家蚕。
本发明优选的，所述含有家蚕脂肪酶基因BmTGLc的转基因载体构建方法如下：将核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的家蚕脂肪酶基因BmTGLc通过BamH I和Not I连入pSL1180[P3P+5UI-DsRed]载体，获得pSL1180[P3P+5UI-BmTGLc]载体，然后将获得的pSL1180[P3P+5UI-BmTGLc]载体和piggyBac[3×P3-DsRed]分别利用Asc I单酶切，回收目的片段和载体骨架后进行连接，获得含有家蚕BmTGLc的转基因载体，命名为piggyBac[3×P3-DsRed,P3P+5UI-BmTGLc]。
本发明优选的，所述家蚕脂肪酶基因BmTGLc的克隆方法如下：以SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示序列为引物，含家蚕BmTGLc的载体为模板扩增获得。
本发明的有益效果在于：本发明克隆得到了家蚕脂肪酶BmTGL(含BmTGLa、BmTGLb和BmTGLc)和野桑蚕同源基因(BmaTGL)，发现BmTGLc主要在家蚕中肠的前部和中部表达，且在家蚕中的表达量普遍高于野桑蚕，通过原核表达BmTGLc获得的重组蛋白具有脂肪酶活性；在家蚕中过表达BmTGLc获得的2个转基因品系，2个转基因品系家蚕的脂肪酶基因BmTGLc在中肠的表达量分别上调1.57倍和2.17倍；在相同的条件下饲养BmTGLc转基因和非转基因家蚕，经济性状统计分析发现，转基因家蚕表现出较为明显的长势，全茧重、茧层重等相关经济性状显著提高。我们推测脂肪酶BmTGL在中肠的过表达增强了家蚕对桑叶中脂质物质的消化吸收利用，从而导致相关经济性状得到提高。研究工作为通过基因工程手段提高家蚕对桑叶饲料的利用率，培育更加优良的家蚕品种提供了理论参考和技术支撑。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为不同品种桑蚕的CDS扩增结果；
图2为家蚕、野桑蚕脂肪酶基因(BmTGL)ORF的序列比较；
图3为家蚕脂肪酶(BmTGL)亲缘关系进化树分析；
图4中A：BmBmTGL的组织表达谱(五龄第三天)；B：BmBmTGL的时期表达谱；C：BmBmTGL蛋白水平的时空表达谱；He：头部；Fb：脂肪体；Sg：丝腺；Hc：血细胞；Ep：表皮；Mg：中肠；FG：前部中肠；MG：中部中肠；FG：后部中肠；Go：生殖腺；Mt：马氏管；L4M：四龄眠期；L4D*：四龄第*天；L5D*：五龄第*天；
图5为家蚕脂肪酶在不同品种的桑蚕中肠表达情况；A：家蚕脂肪酶在转录水平上的表达情况；B：家蚕脂肪酶在蛋白水平上的表达情况；
图6为PET28a[BmTGL]载体酶切验证；M：marker；1：BmTGL的PCR产物；2：PET-28a空载质粒酶切产物；3：PET28a[BmTGL]重组载体；4：PET28a[BmTGL]载体BamHⅠ和NotⅠ酶切产物；
图7为BmTGLc重组蛋白的小量检测及纯化；A：BmTGLc重组蛋白的小量检测；B：BmTGLc重组蛋白咪唑洗脱蛋白检测；
图8为家蚕脂肪酶BmTGL的中肠组织定位分析；Control：阴性对照组，与磷酸盐缓冲液孵育；AMG：前部中肠，与1：1000的家蚕脂肪酶抗体孵育；MMG：中部中肠，与1：1000的家蚕脂肪酶抗体孵育；PMG：后部中肠，与1：1000的家蚕脂肪酶抗体孵育；MMG*：横截面图；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚，核标记(蓝色)；LM：肠腔；PM：围食膜；绿色表示BmTGL蛋白；
图9为BmTGLc重组蛋白的酶活性测定；A：重组蛋白的酶活性检测反应颜色指示；B：重组蛋白的酶活性检测数值；
图10为piggyBac[3×P3-DsRed,P3P+5UI-BmTGLc]载体构建过程；A：pSL1180[P3P+5UI-BmTGLc]酶切验证图；B：piggyBac[3×P3-DsRed,P3P+5UI-BmTGLc]酶切验证图；M：marker；1：pSL1180[P3P+5UI-BmTGLc]载体；2：pSL1180[P3P+5UI-BmTGLc]载体酶切产物；3：piggyBac[3×P3-DsRed,P3P+5UI-BmTGLc]载体；4：piggyBac[3×P3-DsRed,P3P+5UI-BmTGLc]载体酶切产物；C：piggyBac[3×P3-DsRed,P3P+5UI-BmTGLc]载体示意图；
图11为转基因家蚕的荧光筛选；
图12为转基因过表达家蚕和野生型的组织表达分析；He：头部；Fb：脂肪体；Sg：丝腺；Hc：血细胞；Ep：表皮；Mg：中肠；FG：前部中肠；MG：中部中肠；FG：后部中肠；Ov：卵巢；Te：精巢；Mt：马氏管；
图13为转基因过表达家蚕和非转基因家蚕的食下量比较；A：转基因过表达的雌蚕和野生型的食下量统计；B：转基因过表达的雄蚕和野生型的食下量统计；L5D*：五龄第*天；
图14为BmTGLc过表达家蚕和野生型的全茧重和茧层率统计；A：过表达雌蚕和野生型的全茧重统计；B：过表达雄蚕和野生型的全茧重统计；C：过表达雌蚕和野生型的茧层率统计；D：过表达雄蚕和野生型的茧层率统计。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实验材料：使用的家蚕品种大造(Dazao)、D9L、932、芙蓉、872、892、796、782、菁松、895、云秀8号A×B、土耳其、云秀10号日系A×B、云秀10号日系B×A、云秀9号中系A×B、新华、研百、871、东肥532、苏菊、八华、明珠、苏16、54A、云秀7号A×B、日锦×中锦、46、云秀9号日系B×A、皓月、7532和732，为本实验室保种。家蚕幼虫饲养在环境温度25±1℃，相对湿度75％±5％的条件下，并用新鲜的桑叶饲养。野桑蚕材料为本实验保存在桑园的长寿交北碚野桑蚕、浙江野桑蚕、陕西安康野桑蚕、长寿野桑蚕。时期表达谱的材料为五龄一天到五龄七天的大造(Dazao)中肠；而组织表达谱的材料为五龄第三天的大造(Dazao)的头、表皮、丝腺、脂肪体、中肠、生殖腺、马氏管和血细胞。其余品种的桑蚕都取五龄三天的中肠材料。
实施例中使用SilkBase数据库和SilkDB 3.0数据库鉴定的BmTGL基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计基因特异性引物，引物核苷酸序列如表1所示。
表1本发明中使用引物的核苷酸序列表
注：下划线表示酶切位点序列
实施例1、家蚕、野桑蚕脂肪酶基因(BmTGL)ORF序列的克隆与比对
分别以陕西安康野桑蚕(SXWT)、北碚野桑蚕(CQ1WT)、浙江野桑蚕(ZJWT)、长寿野桑蚕(CQ2WT)、932和芙蓉(FuRong)的中肠cDNA为模板，用BmTGL的全长引物(SEQ IDNO.1～2)进行PCR扩增，PCR扩增程序为：98℃预变性3min，然后98℃变性10s，59℃退火10s，72℃延伸15s，变性至延伸过程循环33次，72℃最终延伸8min，12℃保存产物，得到了该基因的扩增条带(见图1)，条带大小在750bp到1000bp之间。再将连到Blunt-simple载体上，送华大基因公司测序，得到其序列，结果表明家蚕和野桑蚕的CDS序列都为888bp。其次932总测序得到86条序列，存在3种不同的序列，如SEQ ID NO.16所示的BmTGLa、如SEQ ID NO.17所示的BmTGLb和如SEQ ID NO.18所示的BmTGLc，分别有22、28和36条序列；而浙江野桑蚕只有1种序列，如SEQ ID NO.19所示的BmaTGL，序列间的相似度为99.41％(表2，图2)，家蚕BmTGLc与野桑蚕BmaTGL相似度最高。研究结果暗示BmTGL在家蚕存在的多拷贝可能是由基因扩增引起。
表2不同BmTGL在家蚕932与野桑蚕中的随机克隆数统计
将得到的确定无误的扩增片段根据OMEGA公司的胶回收试剂盒Gel ExtractionKit的操作手册进行回收，然后将回收的目的片段与
-Blunt Simple载体进行连接，转化Trans1-T1感受态细胞，以M13-F/R引物(SEQ ID NO.3～4)做菌液PCR，选取阳性克隆测序验证，选择验证正确的阳性克隆菌液进行扩大培养后提取质粒。
为探究家蚕脂肪酶基因(BmTGL)与其他物种的的亲缘进化关系，我们将BmTGLc基因与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、西方蜜蜂(Apis mellifera)、家蚕(Bombyx mori)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)等生物的脂肪酶基因构建进化树，结果显示BmTGL基因与其他昆虫的中性脂肪酸共处一个分支(见图3)，故推测其可能是一种中性脂肪酶。
实施例2、BmTGLc基因的表达特征分析
根据家蚕脂肪酶基因的ORF序列，用Premier 5.0软件设计和目的基因BmTGL的荧光定量PCR引物(SEQ ID NO.5～6)和内参基因Bmsw22934的荧光定量PCR引物(SEQ IDNO.7～8)。为了解BmTGLc脂肪酶基因在家蚕不同组织中的表达情况，我们通过RT-qPCR方法检测了该基因在五龄三天家蚕的各组织的表达情况，发现该基因主要在家蚕中肠的前部和中部表达(见图4，A)。其次我们通过相同的方法检测了该基因在五龄起蚕到五龄六天的中肠的表达情况，发现该基因主要在家蚕中肠的五龄三天到五龄五天高量表达，同时这三天是家蚕取食的盛食期(见图4，B)。最后我们也在蛋白水平对该蛋白进行了蛋白定量分析(见图4，C)，结果发现与RT-qPCR结果一致，都是在家蚕中肠和盛食期高量表达。
为了解脂肪酶基因BmTGLc在不同品种的家蚕和野桑蚕中的表达情况，我们通过RT-qPCR方法检测了该基因在五龄三天中肠的表达，发现该基因在不同品种的家蚕中的表达普遍高于野桑蚕(见图5，A)，同时也在蛋白水平进行了定量，结果也发现该蛋白确实是家蚕明显高于野桑蚕(见图5，B)。
实施例3、BmTGLc的原核表达和纯化
使用SEQ ID NO.9～10所示引物PCR扩增获得带有BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点的目的基因片段，双酶切后连接到pET-28a载体上，得到PET28a[BmTGLc]的原核表达载体(图6，A)，双酶切验证结果显示载体构建成功(见图6，B)。
将构建的原核表达载体PET28a[BmTGLc]和PET28a空载体转化原核表达菌株BL21中，并在不同温度条件下用1mM IPTG诱导蛋白表达。结果显示(见图7，A)，在37℃诱导条件下，发现BmTGLc蛋白在沉淀中有表达，大小为37kDa左右，与预期的BmTGLc蛋白融合6×His标签的大小相一致；在25℃诱导条件下，蛋白大部分在在沉淀中表达，小部分在上清表达；在16℃诱导条件下，蛋白在上清表达增加；故后续选择该蛋白在16℃条件下诱导其表达。通过镍柱亲和层析法纯化目标蛋白，BmTGLc重组蛋白主要在200mM和500mM咪唑浓度下洗脱。再对重组蛋白的上述洗脱液用10kDa超滤管浓缩(图7，B)。
实施例4、BmTGL基因的免疫荧光分析
我们进一步研究了BmTGLc蛋白在中肠的定位。免疫荧光分析发现该蛋白在肠道前、中、后部都有表达，且在前肠中表达量最高(见图4)。将中肠部分放大，发现在中肠上皮细胞，围食膜和肠腔中都存在该脂肪酶(见图8)，因此，我们推测BmTGLc在中肠上皮细胞合成并分泌，并能通过围食膜释放到肠腔。
实施例5、BmTGLc的酶活性检测
把实施例3中纯化得到的BmTGLc重组蛋白用甲基卤灵底物法测其蛋白活性。首先用PBS、BSA和谷蛋白作为阴性对照，以试剂盒中的标准品蛋白牛源脂肪酶作为阳性对照，测定其酶活性。结果显示，在常温下BmTGLc重组蛋白酶活性为15.0U/L(见图9)。
实施例6、BmTGLc的在家蚕中转基因过表达
使用带有BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点引物(SEQ ID NO.10～11)扩增BmTGLc,连入T5克隆载体，获得重组载体T5-BmTGL质粒。对带有BamH I和Not I酶切位点的T5-BmTGLc载体和pSL1180[P3P+5UI-DsRed]载体进行双酶切后连接，获得pSL1180[P3P+5UI-BmTGLc]质粒。质粒piggyBac[3×P3-DsRed]用Asc I进行单酶切并去磷酸化处理后与Asc I单酶切后的pSL1180[P3P+5UI-BmTGLc]进行连接，转化，获得piggyBac[3×P3-DsRed,P3P+5UI-BmTGLc]质粒。
过表达中间载体pSL1180[P3P+5UI-BmTGLc]的双酶切验证结果显示(图10，A)，在750bp和1000bp出现一条条带，表明载体构建成功。piggyBac[3×P3-DsRed,P3P+5UI-BmTGLc]载体的双酶切验证结果显示(图10，B)，在3000bp出现一条条带，表明piggyBac[3×P3-DsRed,P3P+5UI-BmTGLc]重组载体构建成功。
转基因家蚕的制备过程如下：
1)提取上述piggyBac[3×P3-DsRed,P3P+5UI-BmTGLc]质粒和本实验保存的编码piggyBac转座酶的辅助载体pHA3PIG的超纯质粒(浓度大于500ng/μL)，再将其等摩尔比均匀混合；
2)利用Eppendorf显微注射仪将上述混匀的质粒注射到家蚕产卵2小时以内的蚕卵中，每颗蚕卵注射量为3～5nL，并用胶水封口；
3)蚕卵孵化后在环境温度25±1℃，相对湿度75％±5％的条件下，并用新鲜的桑叶饲养至成虫，自交获得G1代蚕卵；
4)将发育到5-6天的G1代蚕卵用荧光显微镜筛选出发红色荧光的转基因蚕卵，再将其饲养成虫、制种传代，获得稳定遗传的转基因家蚕品系。
在后代中通过荧光显微镜观察蛾子眼睛是否发红光确定阳性个体(图11)，成功筛选获得了2个阳性个体P3P∶BmTGLc_1和P3P∶BmTGLc_2。
提取转基因家蚕基因组DNA，用Hae III对基因组进行酶切，酶切后基因组自连环化，以上述自连环化处理后的基因组为模板，用pBacL-F/R(SEQ ID NO.12～13)和pBacR-F/R(SEQ ID NO.14～15)引物进行PCR扩增，获得T克隆重组载体，并对连入片段进行测序。根据测序结果，在SilkBase数据库(http://silkbase.ab.a.u-tokyo.ac.jp/cgi-bin/index.cgi)中比对，定位到准确的插入位点。结果显示，P3P∶BmTGLc_1插入到16号染色体，P3P∶BmTGLc_2插入到10号染色体，且它们都没有插入到基因编码区(见表3)。
表3转基因过表达家蚕的插入位点分析
我们以五龄三天的转基因家蚕和非转基因家蚕各组织为模板，检测该基因的表达情况，发现两个转基因过表达家蚕的脂肪酶基因BmTGLc中肠分别上调1.57倍和2.17倍(见图12)。我们选择了表达量高的P3P∶BmTGLc_1进行了后续的进一步研究。
实施例7、转基因家蚕相关经济性状统计分析
(1)转基因家蚕饲养
G3代转基因家蚕幼虫和野生型在环境温度25±1℃，相对湿度75％±5％的条件下各养三盒，并用新鲜的桑叶饲养。并在五龄起蚕时，分雌雄，从每一盒中随机挑选出30头雄蚕和30头雌蚕分开饲养，直到上簇结茧。
(2)相关经济性状统计分析
1)在五龄起蚕至五龄第六天对每盒转基因家蚕和野生型进行食下量统计，雌、雄分别进行统计；
2)对每盒平均上簇六天的转基因家蚕和野生型进行全茧重、茧层重和蛹重进行称量统计，最后分别计算出茧层率，雌、雄分别进行统计。茧层率＝(茧层重/全茧重)×100％；
3)以上数据用GraphPad Prism 8.0软件进行分析，并用双尾T检验进行分析。
首先对五龄起蚕和五龄六天的转基因家蚕和野生型的食下量进行统计，雌雄分开统计，结果显示过表达家蚕雌雄幼虫取食量与野生型变化不明显(见图13)。
对转基因家蚕和野生型的全茧重和茧层率进行统计，雌雄分开统计，结果显示转基因过表达家蚕雌、雄平均全茧重分别比野生型提高3.57％和2.49％(见图14，A和B)；而转基因过表达家蚕雌、雄平均茧层率分别比野生型提高4.88％和9.12％(见图14，C和D)。
研究结果显示，在相同的条件下饲养BmTGL转基因和非转基因家蚕，经济性状统计分析发现，转基因家蚕表现出较为明显的长势，全茧重、茧层重等相关经济性状显著提高。我们推测脂肪酶BmTGL在中肠的过表达增强了家蚕对桑叶中脂质物质的消化吸收利用，从而导致相关经济性状得到提高。研究工作为通过基因工程手段提高家蚕对桑叶饲料的利用率，培育更加优良的家蚕品种提供了理论参考和技术支撑。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (9)
1.家蚕脂肪酶基因BmTGLc在培育高产家蚕品种中的应用，其特征在于：所述家蚕脂肪酶基因BmTGLc的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述高产为全茧重提高。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述高产为茧层率提高。
4.含有蚕脂肪酶基因BmTGLc的表达载体在培育高产家蚕品种中的应用。
5.含有蚕脂肪酶基因BmTGLc的转化体在培育高产家蚕品种中的应用。
6.一种培育高产家蚕品种的方法，其特征在于：通过在家蚕中过表达家蚕脂肪酶基因BmTGLc，所述家蚕脂肪酶基因BmTGLc的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
7.根据权利要求6所述的培育高产家蚕品种的方法，其特征在于：所述过表达家蚕脂肪酶基因BmTGLc的步骤如下：构建含有家蚕脂肪酶基因BmTGLc的转基因载体，然后与辅助载体pHA3PIG混合后注射进已经解除滞育的家蚕早期胚胎中，催青至蚁蚕孵化，获得转基因G0代家蚕，饲养G0代家蚕至成虫，自交制种获得G1代家蚕，筛选获得转基因家蚕。
8.根据权利要求7所述的培育高产家蚕品种的方法，其特征在于：所述含有家蚕脂肪酶基因BmTGLc的转基因载体构建方法如下：将核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的家蚕脂肪酶基因BmTGLc通过BamH I和Not I连入pSL1180[P3P+5UI-DsRed]载体，获得pSL1180[P3P+5UI-BmTGLc]载体，然后将获得的pSL1180[P3P+5UI-BmTGLc]载体和piggyBac[3×P3-DsRed]分别利用Asc I单酶切，回收目的片段和载体骨架后进行连接，获得含有家蚕BmTGLc的转基因载体，命名为piggyBac[3×P3-DsRed,P3P+5UI-BmTGLc]。
9.根据权利要求8所述的培育高产家蚕品种的方法，其特征在于：所述家蚕脂肪酶基因BmTGLc的克隆方法如下：以SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示序列为引物，含家蚕BmTGLc的载体为模板扩增获得。
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|---|---|
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