KR20120086328A - 효모를 사용하여 스쿠알렌을 생산하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
효모를 사용하여 스쿠알렌을 생산하기 위한 방법 및 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 명세서에서 스쿠알렌을 포함하는 아이소프레노이드의 조성물 및 생산방법이 제공된다. 특정 양태 및 구체예에서 유전적으로 변환된 효모 및 그에 따른 사용이 제공된다. 일부 양태 및 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 아이소프레노이드, 바람직하게는 스쿠알렌을 생산한다. 또한 유전적으로 변환된 효모 또는 비유전적으로 변환된 효모를 사용하는 스쿠알렌의 생산방법이 제공된다. 또한 본 발명은 유전적으로 변환된 효모 또는 비유전적으로 변환된 효모에 의해 생산된 스쿠알렌을 제공한다.
Description
관련 특허출원
이 출원은 미국 특허 가출원 61/263,775호(출원인 2009년 11월 23일, 발명의 명칭 "Methods and Compositions for Producing Squalene Using Yeast")의 우선권의 이익을 주장하며, 이 기초 출원의 전문이 모든 목적을 위하여 참고로써 본 명세서에 포함된다.
발명의 기술분야
효모를 사용하여 스쿠알렌과 같은 아이소프레노이드를 생산하는 방법 및 조성물이 제공된다.
다음의 본 발명의 배경기술의 설명은 단순히 본 발명을 이해하는데 도움으로서 제공되며, 본 발명에 대한 선행 기술을 설명하거나 구성하는 것으로 인정되지 않는다.
스쿠알렌과 같은 아이소프레노이드는 상업적으로 중요한 형태의 지질이다. 그것들은 탁월한 윤활성, 산화적 안정성, 낮은 유동점, 낮은 빙점, 높은 인화점, 및 수월한 생분해성을 가진다. 스쿠알렌은 현재 고 단위 비용으로 올리브유 또는 냉수 상어 간유로부터 추출에 의해 생산된다. 높은 단위 비용 때문에, 스쿠알렌 및 스쿠알란(스쿠알렌의 완전히 수소화된 유도체)에 대해 경제적으로 실현가능한 사용은 주시(watch) 윤활제, 제약/약효식품(nutraceuticals), 화장품, 향수, 및 고가의 제품을 위한 화학물질 중간체와 같이 소규모 시장 용도이다.
그러나, 생분해가능한 윤활제, 윤활 첨가제, 및 작동유(hydraulic fluid)에 대해 상당한 잠재적 시장이 존재한다. 이 제품들의 생분해성은 농업 용도와 같이 환경적으로 민감한 용도에 대해 특히 중요한데, 상당한 경우 윤활제 또는 작동유는 환경에 대해 무감각하다. 생분해가능한 윤활제, 윤활 첨가제 및 작동유에 대한 잠재적 시장은 꽤 크며, 대략 연간 5백만 메트릭톤으로 추정된다.
생분해가능한 윤활제, 윤활 첨가제, 및 식물 및 동물 지방 및 오일로부터 유래된 작동유가 이용가능하지만, 그것들은 문제점을 가진다. 그것들은 전형적으로 상대적으로 고온에서 고화되며(즉, 그것들은 추운 날씨에 고화된다), 뜨거운 상태로 사용하기에 너무 낮은 인화점을 가진다(즉, 그것들은 보통의 가열 엔진 상태하에서 분해되거나 연소된다).
따라서, 스쿠알렌의 비용 효과적인 방법은 생분해가능한 윤활제, 윤활 첨가제 및 작동유 중의 스쿠알렌 및 스쿠알란의 대규모 제조 및 광범위한 사용을 허용할 것이 요망된다.
Chang et al.은 문헌[Appl . Microbiol . Biotechnol . , 2008, 78, 963-72]에서 "많은 양의 스쿠알렌과 몇몇 다가불포화 지방산"을 생성하는 야생형 효모, 슈도지마(Pseudozyma) 속 JCC207의 발견을 개시한다. Chang et al.은 미국 괌 근처에서 수집된 해수로부터의 슈도지마 속 JCC207을 분리하는 단계를 설명하고, 슈도지마 속 JCC207이 슈도지마 레굴로사(P. regulosa) 또는 슈도지마 아피디스(P. aphidis)의 신종 또는 변이체인지 여부는 불확실하다. 상기 논문에서, "[슈도지마 속 JCC207]의 스쿠알렌 생산 효율성은 다른 조건 하에서 조사되었다".
다우 아그로사이언스 엘엘씨(Dow AgroSciences LLC)는 http://statusreports.atp.nist.gov/reports/95-01-0148PDF.pdf에서, 효모 발효를 사용하는 비용 효율적이고 생분해가능한 윤활제의 생산을 개시하며, "상기 회사는 유전자 조작의 사용으로 유성(기름이 있는) 효모의 대사 특징을 변경하여 효모의 능력을 증가시키고 생합성을 통해 아이소프렌을 생산하는 것을 제안한다". 구체적으로, 4가지 효소, 즉 ACCase, 하이드록시메틸글루타릴 CoA 환원효소(hydroxymethylglutaryl CoA 환원효소 : HMGR), 스쿠알렌 합성효소, 및 스쿠알렌 에폭시다제가 표적화되었다.
미국 특허 5,460,949호는 "효모 중에서 스쿠알렌의 축적 및 특정 스테롤을 증가시키는 방법"을 개시한다. 특히, "스쿠알렌 및 스테롤 축적은 HMG-CoA 환원효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 증가시킴으로써 증가된다"는 것이 개시된다.
본 발명은 효모로부터 스쿠알렌을 생산하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
특정 양태 및 구체예에서, 유전적으로 변환된 또는 비유전적으로 변환된 효모에 의해 생산된 아이소프레노이드(예를 들어, 스쿠알렌)의 증가된 양은 아이소프레노이드 생합성 경로 내에서 하나 이상의 효소 활성을 변화시키고, 변형시키고 및/또는 변경시킨 결과일 수 있다. 예를 들어, 아세틸-CoA 카복실라제(또는 "ACCase"), HMG-CoA 환원효소, 스쿠알렌 에폭시다제, 스쿠알렌 신타제, ATP 시트레이트 신타제, 메발로네이트 키나제(예를 들어, 야로이야 리폴리티카(Y. lipolytica) 메발로네이트 키나제(게놀레부레스 YALI0B16038g(Genolevures YALI0B16038g)), 글라이세롤 키나제(예를 들어, 야로이야 리폴리티카 글라이세롤 키나제(게놀레부레스 YALI0F00484g(Genolevures YALI0F00484g))) 및/또는 5-아미노레불리네이트 신타제(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) HEM1 유전자에 의해 암호화됨)가 변형되고, 변화될 수 있고 또는 변경된 활성을 가질 수 있다.
일부 바람직한 구체예에서, 변형된 효소를 발현시키는 유전적으로 변환된 효모는 본 명세서에서 설명되는 유전자 수선 올리고핵염기의 사용을 통해 효소 내에 돌연변이를 도입함으로써 생성된다. 일부 구체예에서 제공된 방법은 당업계에 잘 알려진 임의의 다수의 방법(예를 들어, 전기천공법, LiOAc, 바이오리스틱스(biolistics), 스페로플라스팅(spheroplasting) 및/또는 아그로박테리움(Agrobacterium)(예를 들어, 문헌[McClelland, CM., Chang, Y.C, and Kwon-Chung, K.J. (2005) Fungal Genetics and Biology 42:904-913]을 참조)에 의해 효모 세포 내로 관심의 표적 유전자의 특정 돌연변이를 함유하는 유전자 수선 올리고핵염기를 도입하는 단계 및 돌연변이된 효소를 갖는 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 본 명세서에 개시된 유전적으로 변환된 또는 비유전적 효모로부터 추출된 아이소프레노이드가 제공된다. 관련 양태에서, 본 명세서에서 설명되는 유전적으로 변환된 효모로부터 추출된 스쿠알렌이 제공된다.
다른 양태에서, 아이소프레노이드, 바람직하게 스쿠알렌을 생산하는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 본 방법은 본 명세서에 설명되는 유전적으로 변환된 또는 비유전적으로 변환된 효모를 제공하는 단계 및 효모로부터 스쿠알렌을 추출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 방법은 효모를(유전적으로 변환된 또는 비유전적으로 변환된 것 중 하나) 항진균제(예를 들어, 터비나핀(terbinafme)과 같은 알릴아민 항진균제)에 노출시키는 단계 및 효모로부터 스쿠알렌을 추출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명되는 것과 같은 유전적으로 변환된 효모를 항진균제(예를 들어 터비나핀과 같은 알릴아민 항진균제)에 노출시키는 단계 및 효모로부터 스쿠알렌을 추출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 방법은 본 명세서에서 설명되는 것과 같은 비유전적으로 변환된 효모를 항진균제(예를 들어 터비나핀과 같은 알릴아민 항진균제)에 노출시키는 단계 및 효모로부터 스쿠알렌을 추출하는 단계를 포함한다.
항진균제(예를 들어, 터비나핀과 같은 알릴아민 항진균제)를 포함하는 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 특정 구체예에서, 항진균제(예를 들어 터비나핀 또는 다른 항진균제)는 약 1 ㎍/㎖; 또는 약 5 ㎍/㎖; 또는 약 10 ㎍/㎖; 또는 약 11 ㎍/㎖; 또는 약 12 ㎍/㎖; 또는 약 12.5 ㎍/㎖; 또는 약 13 ㎍/㎖; 또는 약 15 ㎍/㎖; 또는 약 16 ㎍/㎖; 또는 약 20 ㎍/㎖; 또는 약 25 ㎍/㎖; 또는 약 30 ㎍/㎖; 또는 약 40 ㎍/㎖; 또는 약 50 ㎍/㎖ 또는 초과의 농도로 부가되거나 존재할 수 있다. 항진균제(예를 들어, 터비나핀과 같은 알릴아민 항진균제)를 포함하는 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 특정 구체예에서, 항진균제(예를 들어, 터비나핀 또는 다른 항진균제)는 약 0.5 내지 100 ㎍/㎖; 또는 0.5 내지 50 ㎍/㎖; 또는 1 내지 50 ㎍/㎖; 또는 5 내지 50 ㎍/㎖; 또는 8 내지 50 ㎍/㎖; 또는 10 내지 50 ㎍/㎖; 또는 12 내지 50 ㎍/㎖; 또는 15 내지 50 ㎍/㎖; 또는 15 내지 50 ㎍/㎖; 또는 25 내지 50 ㎍/㎖; 또는 1 내지 25 ㎍/㎖; 또는 5 내지 25 ㎍/㎖; 또는 10 내지 25 ㎍/㎖; 또는 10 내지 20 ㎍/㎖; 또는 10 내지 15 ㎍/㎖의 농도로 부가되거나 존재할 수 있다.
한 양태에서, 아이소프레노이드를 생산하는 유전적으로 변환된 효모가 제공된다. 특정 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 스쿠알렌을 생산한다.
다른 양태에서, 유전적으로 변환된 효모가 제공되며, 상기 효모는 대응하는 천연 효모와 비교하여 증가된 수준의 스쿠알렌을 생산하도록 유전적으로 변환된다. 본 발명의 상기 양태의 특정 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 하나 이상의 변형된 효소를 발현시킨다. 상기 양태의 특정 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 내 하나 이상의 효소의 발현은 대응하는 천연 효모에 비하여 증가되거나 감소된다. 관련 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 하나 이상의 변형된 효소를 발현시키며, 유전적으로 변환된 효모 내 하나 이상의 효소의 발현 수준은 대응하는 천연 효모에 비하여 증가되거나 감소된다. 특정 바람직한 구체예에서, 본 명세서에 제공된 유전적으로 변환된 효모는 유전자 수선 올리고베이스를 사용하여 효소 내로 돌연변이를 도입하는 것에 의해 유전적으로 변환된다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공되는 유전적으로 변환된 효모는, 예를 들어 미국 특허 출원 제10/411,969호 및 제11/625,586호에서 설명되는 것과 같이 효소를 암호화하는 유전자의 번역 시작 자리에서 또는 주변에서 하나 이상의 돌연변이를 도입하여 효소의 발현을 증가시키거나 감소시키는 것에 의해 유전적으로 변환된다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 제공된 유전적으로 변환된 효모 내 변환된 효소는 아세틸-CoA 카복실라제(또는 "ACCase"), HMG-CoA 환원효소, 스쿠알렌 에폭시다제, 스쿠알렌 신타제, ATP 시트레이트 리아제, ATP 시트레이트 신타제, 메발로네이트 키나제(예를 들어, 야로이야 리폴리티카 메발로네이트 키나제(게노레부레스 YALI0B16038g(Genolevures YALI0B16038g))), 글라이세롤 키나제(예를 들어, 야로이야 리폴리티카 글라이세롤 키나제(게노레부레스 YALI0F00484g)) 및 5-아미노레불리네이트 신타제로 이루어진 군으로부터 선택된 한 가지 이상의 효소를 포함한다.
핵염기는 퓨린, 피리미딘, 또는 그것의 유도체 또는 유사체인 염기를 포함한다. 뉴클레오사이드는 펜토세푸라노실 모이어티, 예를 들어 선택적으로 치환된 리보사이드 또는 2'-데옥시리보사이드를 함유하는 핵염기이다. 뉴클레오사이드는 몇몇 결합 모이어티 중 하나에 의해 연결될 수 있는데, 이것은 인을 함유할 수도 있고 함유하지 않을 수도 있다. 비치환 포스포다이에스터 결합에 의해 연결된 뉴클레오사이드는 뉴클레오타이드로 칭해진다. 본 명세서에서 사용되는 "핵염기"는 펩타이드 핵염기, 펩타이드 핵산의 서브유닛 및 모르폴린 핵염기뿐만 아니라 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 포함한다.
올리고핵염기는 핵염기의 폴리머인데, 이 폴리머는 상보적 서열을 갖는 DNA에 대해 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍에 의해 혼성화될 수 있다. 올리고핵염기 사슬(oligonucleobase chain)은 단일 5' 및 3' 말단을 갖는데, 이는 폴리머의 궁극적 핵염기이다. 특정 올리고핵염기 사슬은 모든 유형의 핵염기를 함유할 수 있다. 올리고핵염기 화합물은 상보적이고 왓슨-크릿 염기쌍에 의해 혼성화되는 하나 이상의 올리고핵염기 사슬을 포함하는 화합물이다. 핵염기는 데옥시리보형 또는 리보형 중 하나이다. 리보형 핵염기는 펜노스푸라노실 함유 핵염기이며, 2' 탄소는 하이드록실, 알킬옥시 또는 할로겐으로 치환되는 메틸렌이다. 데옥시리보형 핵염기는 리보형 핵염기 이외의 핵염기이고, 펜토스푸라노실 모이어티를 함유하지 않는 모든 핵염기를 포함한다.
올리고핵염기 가닥은 올리고핵염기 사슬과 올리고핵염기 사슬의 절편 또는 영역을 둘 다 유전적으로 포함한다. 올리고핵염기 가닥은 3' 말단과 5' 말단을 가진다. 올리고핵염기 가닥이 사슬과 같은 공간을 차지할 때, 가닥의 3' 말단과 5' 말단은 또한 사슬의 3' 및 5' 말단이다.
용어 "유전자 수선 올리고핵염기"는 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드, 분자들을 함유하는 비뉴클레오타이드, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 이하에 상세하게 설명되는 다른 유전자 수선 분자를 포함하는 올리고핵염기를 정의하는 것으로 본 명세서에서 사용된다.
일부 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변환된 효모 또는 비유전적으로 변환된 효모는 유성의 효모로부터 유래된다. 특정 바람직한 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변환된 효모 또는 비유전적으로 변환된 효모는 크립토코쿠스 쿠르바투스(Cryptococcus curvatus), 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 로도토룰라 글루티누스(Rhodotorula glutinus), 및 로로스포리듐 토룰로이데스(Rhorosporidium toruloides)로 이루어진 군으로부터 선택된 효모로부터 유래된다. 일부 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 또는 비유전적으로 변환된 효모는 크립토코쿠스 쿠르바투스, 야로이야 리폴리티카 및 로도토룰라 글루티누스로 이루어진 군으로부터 선택된 효모로부터 유래된다. 관련 구체예에서, 유전적으로 변환된 또는 비유전적으로 변환된 효모는 크립토코쿠스 쿠르바투스 및 로도토룰라 글루티누스로 이루어진 군으로부터 유래된다. 특정 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 또는 비유전적으로 변환된 효모는 야로이야 리폴리티카로부터 유래되지 않는다. 특정 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 또는 비유전적으로 변환된 효모는 ATCC 20688, ATCC 90811, ATCC 90904, ATCC 90812, ATCC MYA-2613, 및 이스턴 폴그(Yeastern polg)로 이루어진 군으로부터 선택된 야로이야 리폴리티카이다.
특정 바람직한 구체예에서, 본원에서 제공되는 유전적으로 변환된 효모 내 변형된 효소는 아세틸-CoA 카복실라제(또는 "ACCase")이다. 일부 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 내 아세틸-CoA 카복실라제는 그것의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모에 비하여 감소되거나; 활성 및/또는 발현이 제거되도록 변형된다. 다른 구체예에서, 아세틸-CoA 카복실라제는 그것의 기질 선택성이 변경되도록 변형될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 아세틸-CoA 카복실라제의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모에 비하여 감소되지만 활성이 제거되지 않도록 변형된다. 일부 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 유전적으로 변환된 효모 내 아세틸-CoA 카복실라제의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모의 활성 및/또는 발현의 약 90%; 또는 약 80%; 또는 약 70%; 또는 약 60%; 또는 약 50%; 또는 약 40%; 또는 약 30%; 또는 약 20%; 또는 약 10%; 또는 약 5%로 감소되도록 변형된다. 관련 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 유전적으로 변환된 효모 내 아세틸-CoA 카복실라제의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모의 활성 및/또는 발현의 약 90 내지 95%; 또는 약 80 내지 90%; 또는 약 70 내지 80%; 또는 약 60 내지 70%; 또는 약 50 내지 60%; 또는 약 40 내지 50%; 또는 약 30 내지 40%; 또는 약 20 내지 30%; 또는 약 10 내지 20%; 또는 약 5 내지 10%; 또는 약 2 내지 5%로 되도록 변형된다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변환된 효모 내 변형된 효소는 HMG-CoA 환원효소이다. 일부 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 내 HMG-CoA 환원효소는 그것의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모에 비하여 증가되도록 변형된다. 다른 구체예에서, HMG-CoA 환원효소는 그것의 기질 선택성이 변경되도록 변형될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 유전적으로 변환된 효모 내 HMG-CoA 환원효소의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모의 활성 및/또는 발현보다 적어도 1.2배; 또는 1.5배; 또는 2배; 또는 3배; 또는 4배; 또는 5배; 또는 10배; 또는 15배; 또는 20배; 또는 50배; 또는 100배; 또는 1,000배; 또는 10,000배; 또는 100,000배; 또는 1,000,000배 더 크게 증가되도록 변형된다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변환된 효모 내 변형된 효소는 스쿠알렌 에폭시다제이다. 일부 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 내 스쿠알렌 에폭시다제는 그것의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모에 비하여 감소되도록; 또는 활성 및/또는 발현이 제거되도록 변형된다. 다른 구체예에서, 스쿠알렌 에폭시다제는 기질 선택성이 변경되도록 변형될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 스쿠알렌 에폭시다제의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모에 비하여 감소하지만, 활성이 제거되지 않도록 변형된다. 특정 구체예에서, 스쿠알렌 에폭시다제는 터비나핀과 증가된 선택성으로 결합되는 하나 이상의 돌연변이 또는 하나 이상의 돌연변이의 상동체를 포함하도록 변형된다. 특정 구체예에서, 효모는 사카로마이세스 세레비시아가 아니며, 스쿠알렌 에폭시다제는 사카로마이세스 세레비시아 ERG1 유전자 내 터비나핀과 증가된 선택성으로 결합되는 다음의 돌연변이: G30S, L37P, 및 R269G(예를 들어, 문헌[Turnowsky, 2005, 2007 및 2008] 참조) 중 하나 이상의 상동체를 포함하도록 변형된다. 특정 구체예에서, 효모는 야로이야 리폴리티카이며, 스쿠알렌 에폭시다제는 사카로마이세스 세레비시아 ERG1 유전자 내 터비나핀과 증가된 선택성으로 결합되는 다음의 돌연변이: G30S, L37P, 및 R269G(예를 들어, 문헌[Turnowsky, 2005, 2007 및 2008] 참조) 중 하나 이상의 상동체를 포함하도록 변형된다. 일부 구체예에서, 효모 스쿠알렌 에폭시다제 유전자는 야생형 유전자의 합성 및 치환에 의해 또는 RTDS에 의한 돌연변이의 도입에 의해 본 명세서에 설명되는 것과 같이 변형된다. 일부 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 유전적으로 변환된 효모 내 스쿠알렌 에폭시다제의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모의 활성 및/또는 발현의 약 90%; 또는 약 80%; 또는 약 70%; 또는 약 60%; 또는 약 50%; 또는 약 40%; 또는 약 30%; 또는 약 20%; 또는 약 10%; 또는 약 5%로 감소되도록 변형된다. 관련 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 유전적으로 변환된 효모 내 스쿠알렌 에폭시다제의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모의 활성 및/또는 발현의 약 90 내지 95%; 또는 약 80 내지 90%; 또는 약 70 내지 80%; 또는 약 60 내지 70%; 또는 약 50 내지 60%; 또는 약 40 내지 50%; 또는 약 30 내지 40%; 또는 약 20 내지 30%; 또는 약 10 내지 20%; 또는 약 5 내지 10%; 또는 약 2 내지 5%로 되도록 변형된다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변환된 효모 내 변형된 효소는 스쿠알렌 신타제이다. 일부 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 내 스쿠알렌 신타제는 그것의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모에 비하여 증가되도록 변형된다. 다른 구체예에서, 스쿠알렌 신타제는 그것의 기질 선택성이 변경되도록 변형될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 유전적으로 변환된 효모 내 스쿠알렌 신타제의 활성 및/또는 발현은 대응하는 천연 효모의 활성 및/또는 발현보다 적어도 1.2배; 또는 1.5배; 또는 2배; 또는 3배; 또는 4배; 또는 5배; 또는 10배; 또는 15배; 또는 20배; 또는 50배; 또는 100배; 또는 1,000배; 또는 10,000배; 또는 100,000배; 또는 1,000,000배 더 크게 증가되도록 변형된다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변환된 효모 내 변형된 효소는 ATP 시트레이트 리아제이다. 일부 구체예에서, ATP 시트레이트 리아제의 서브유닛 중 하나 또는 둘 다(예를 들어, 야로이야 리폴리티카 ATP 시트레이트 리아제; 게놀레부레스(Genoleveres) YALI0D24431g 및 YALI0E34793g)는 본 명세서에서 설명되는 바와 같이 변형된다. 특정 구체예에서, 변형된 효모 내 ATP 시트레이트 리아제의 활성은 단일 서브유닛 홀로효소(holoenzyme)를 포함하는 동물 ATP 리아제 유전자의 삽입 및/또는 이종성 발현에 의해 증가된다. 일부 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 내 ATP 시트레이트 리아제는 그것의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모에 비하여 증가되도록 변형된다. 특정 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 유전적으로 변환된 효모 내 ATP 시트레이트 리아제의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모의 활성 및/또는 발현보다 적어도 1.2배; 또는 1.5배; 또는 2배; 또는 3배; 또는 4배; 또는 5배; 또는 10배; 또는 10배; 또는 20배; 또는 50배; 또는 100배; 또는 1,000배; 또는 10,000배; 또는 100,000배; 또는 1,000,000배 더 크게 증가되도록 변형된다.
본 명세서에서 제공되는 조성물 및 방법의 특정 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 또는 비유전적으로 변환된 효모 내 변형된 효소는 ATP 시트레이트 신타제이다. 바람직하게, 그것의 활성 및/또는 발현은 대응하는 천연 효모에 비하여 증가된다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변환된 효모 내 변형된 효소는 메발로네이트 키나제(예를 들어, 야로이야 리폴리티카(Y . lipolytica) 메발로네이트 키나제(Genolevures YALI0B16038g))이다. 일부 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 내 메발로네이트 키나제(예를 들어, 야로이야 리폴리티카 메발로네이트 키나제(Genolevures YALI0B16038g))는 대응하는 천연 효모에 비하여 그것의 활성 및/또는 발현이 증가되도록 변형된다. 특정 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 유전적으로 변환된 효모 내 메발로네이트 키나제(예를 들어, 야로이야 리폴리티카 메발로네이트 키나제(Genolevures YALI0B16038g))의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모의 활성 및/또는 발현보다 적어도 1.2배; 또는 1.5배; 또는 2배; 또는 3배; 또는 4배; 또는 5배; 또는 10배; 또는 15배; 또는 20배; 또는 50배; 또는 100배; 또는 1,000배; 또는 10,000배; 또는 100,000배; 또는 1,000,000배 더 크게 증가되도록 변형된다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변환된 효모 내 변형된 효소는 글라이세롤 키나제(예를 들어, 야로이야 리폴리티카 글라이세롤 키나제(Genolevures YALI0F00484g))이다. 일부 바람직한 구체예에서 유전적으로 변환된 효모 내 글라이세롤 키나제(예를 들어, 야로이야 리폴리티카 글라이세롤 키나제(Genolevures YALI0F00484g))는 그것의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모에 비하여 증가되도록 변형된다. 특정 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 유전적으로 변환된 효모 내 메발로네이트 키나제 글라이세롤 키나제(예를 들어, 야로이야 리폴리티카 글라이세롤 키나제(Genolevures YALI0F00484g))의 활성 및/또는 발현이 대응하는 천연 효모보다 적어도 1.2배; 또는 1.5배; 또는 2배; 또는 3배; 또는 4배; 또는 5배; 또는 10배; 또는 15배; 또는 20배; 또는 50배; 또는 100배; 또는 1,000배; 또는 10,000배; 또는 100,000배; 또는 1,000,000배 더 크게 증가하도록 변형된다.
본 명세서에서 제공되는 조성물 및 방법의 특정 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모 또는 비유전적으로 변환된 효모 내 변형된 효소는 5-아미노레불리네이트 신타제(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아 HEM1 유전자에 의해 암호화됨)이다. 바람직하게, 그것의 활성 및/또는 발현은 대응하는 천연 효모에 비하여 증가된다.
상기 양태의 특정 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 유전적으로 변환된 효모이며; 다른 바람직한 구체예에서, 유전적으로 변환된 효모는 유전자 이식(transgenic) 효모이다. 추가 구체예는 유전자 이식과 유전자 변경을 둘 다 포함하는 효모이다.
특정 양태 및 구체예에서, 효모(예를 들어, 본 명세서에 개시되는 것과 같은 유전적으로 변환된 효모 및 비유전적으로 변환된 효모)를 포함하는 조성물이 제공되며, 총 지질 함량 중 적어도 10%는 스쿠알렌이고; 또는 총 지질 함량 중 적어도 20%는 스쿠알렌이며; 또는 총 지질 함량 중 적어도 25%는 스쿠알렌이고; 또는 총 지질 함량 중 적어도 28%는 스쿠알렌이며; 또는 총 지질 함량 중 적어도 30%는 스쿠알렌이고; 또는 총 지질 함량 중 적어도 32%는 스쿠알렌이고; 또는 총 지질 함량 중 적어도 35%는 스쿠알렌이며; 또는 총 지질 함량 중 적어도 37%는 스쿠알렌이고; 또는 총 지질 함량 중 적어도 38%는 스쿠알렌이며; 또는 총 지질 함량 중 적어도 40%는 스쿠알렌이고; 또는 총 지질 함량 중 적어도 42%는 스쿠알렌이며; 또는 총 지질 함량 중 적어도 45%는 스쿠알렌이며; 또는 총 지질 함량 중 적어도 47%는 스쿠알렌이고; 또는 총 지질 함량 중 적어도 50%는 스쿠알렌이며; 또는 총 지질 함량 중 적어도 52%는 스쿠알렌이며; 또는 총 지질 함량 중 적어도 55%는 스쿠알렌이며; 또는 총 지질 함량 중 적어도 57%는 스쿠알렌이고; 또는 총 지질 함량 중 적어도 60%는 스쿠알렌이다.
본 명세서에 개시되는 다양한 양태의 추가 구체예에서, 상기 또는 이하에 설명되는 유전적으로 변환된 어떤 것, 유전자 이식의 유전적으로 변환된 또는 비유전적으로 변환된 효모로부터 추출된 스쿠알렌과 같은 아이소프레노이드가 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "유전적으로 변환된 효모" 또는 "유전적으로 변경된 효모"는 하나 이상의 유전적 변형, 예컨대 유전자 이식 및/또는 하나 이상의 설계된 돌연변이(들)을 함유하는 변형된 효소를 갖는 효모를 말한다. 이러한 설계된 돌연변이는 천연 효소와 다른 활성을 갖는 변형된 효소를 초래할 수 있다. 이러한 차이는 기질 특이성 또는 활성 수준의 차이를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "유전자 이식 효모"는 "유전적으로 변환된 효모"의 한 유형이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "천연 효모"는 유전적으로 변환(즉, 유전자 이식 또는 유전적으로 변형)되지 않은 효모를 말한다. 천연 효모는 야생형 효모뿐만 아니라 특정 특징들을 획득하도록 선택적으로 재배된 효모를 포함한다.
어구 "유전자 이식 효모"는 다른 효모 종 또는 비효모 종으로부터의 유전자를 갖는 효모를 말한다. 이러한 유전자는 "이식 유전자"로서 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "표적 유전자"는 변형되는 효소를 암호화하는 유전자를 말한다.
어구 "유성의 효모"는 유기체로부터 추출가능한 적어도 약 20% 세포 건조 중량(cell dry weight : cdw) 지질을 함유하는 효모를 말한다. 적어도 약 20% cdw의 지질 수준을 축적하기 위한 수용력은 특정 속(genus)으로 국한되지 않으며; 약 20% cdw 초과의 지질이 리포마이세스 리포퍼(Lipomyces lipofer), 리포마이세스 스타르케이(L. starkeyi), 리포마이세스 테트라스포러스(L. tetrasporus), 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica), 칸디다 디드덴시애(C. diddensiae), 칸디다 파라리폴리티카(C. paralipolytica), 칸디다 쿠르바타(C. curvata), 크립토코쿠스 알비두스(Cryptococcus albidus), 크립토코쿠스 라우렌티(Cryptococcus laurentii), 게오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum), 로도토룰라 그라미누스(Rhodotorula graminus), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티누스, 로도토룰라 그라실리스(Rhodotorula gracilis), 및 야로이야 리폴리티카에서 보고되었다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Tatsumi, et al. 미국특허 4,032,405호, 및 Rattray, Microbial Lipids, Vol. 1 (1998)]을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 정량적 용어로 + 또는 - 10%를 의미한다. 예를 들어, "약 3%"는 2.7-3.3%를 포함하며, "약 10%"는 9-11%를 포함한다.
달리 표시되지 않는다면, 본 명세서에서 언급되는 임의의 백분율은 중량%이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 바람직한 구체예의 설명 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
효모의 유형
본 명세서에 개시되는 조성물 및 방법은 임의의 다수 효모 종 또는 균주를 기초로 할 수 있다. 특정 구체예에서, 효모는 유성의 효모가다. 예를 들어, 효모는 크립토코쿠스 쿠르바투스(예를 들어, ATCC 20508), 야로이야 리폴리티카(예를 들어, ATCC 20688 또는 ATCC 90811), 로도토룰라 글루티누스(예를 들어 ATCC 10788 또는 ATCC 204091), 및 로로스포리듐 토룰로이데스(Rhorosporidium toruloides)일 수 있다. 본 발명자들은 특정의 다른 효모(예컨대 야로이야 리폴리티카), 크립토코쿠스 쿠르바투스 및 로도토룰라 글루티누스에 대해 매우 다양한 기질 상에서 매우 높은 세포 밀도로 성장하고, 많은 배양 조건 하에서 다량의 총 지질을 생성한다는 것을 발견하였다.
따라서, 특정 구체예에서, 크립토코쿠스 쿠르바투스 및 로도토룰라 글루티누스는 본원에서 개시되는 조성물 및 방법에 대해 특히 유리할 수 있다. 야로이야 리폴리티카에 대해 잘 발생되고 특이적인 다수의 유전적 도구(tool)(예를 들어, 형질전환 프로토콜, 선택가능한 마커)가 있으며; 그것으로서 일부 구체예에서 야로이야 리폴리티카는 본 명세서에서 개시되는 조성물 및 방법에 대해 특히 유리할 수 있다. 본 명세서에서 개시되는 조성물 및 방법의 특정 구체예에서, 효모(유전적으로 변환된 또는 비유전적으로 변환된)는 ATCC 20688, ATCC 90811, ATCC 90904, ATCC 90812, ATCC MYA-2613, 또는 Yeastern polg와 같은 야로이야 리폴리티카 균주일 수 있다.
유전자 수선 올리고핵염기
본 발명은 이하에 상세하게 설명되는 입체구조 및 화학적 성질을 갖는 "유전자 수선 올리고핵염기"로 실행될 수 있다. 본 발명의 "유전자 수선 올리고핵염기"는 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드, 분자들을 함유하는 비뉴클레오타이드, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 이하에 주목되는 특허 및 특허 공개에서 설명되는 다른 유전자 수선 분자를 포함한다. 본 발명의 "유전자 수선 올리고핵염기"는 또한 "재조합유전자 올리고핵염기"; "RNA/DNA 키메라 올리고뉴클레오타이드"; "키메라 올리고뉴클레오타이드"; "혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드(MDON)"; "RNA/DNA 올리고뉴클레오타이드(RDO)"; "유전자 표적화 올리고뉴클레오타이드"; "게노플라스트(genoplast)"; "단일 가닥의 변형된 올리고뉴클레오타이드"; "단일 가닥의 올리고데옥시노클레오티드 돌연변이 벡터"; "듀플렉스 돌연변이 벡터"; 및 "헤테로듀플렉스 돌연변이 벡터"를 포함하는 다른 명칭을 사용하여 공개된 과학 및 특허 문헌에서 설명되었다.
본 명세서에 참고로써 포함되는 Kmiec(Kmiec I)에 의한 미국특허 5,565,350호 및 Kmiec(Kmiec II)에 의한 미국특허 5,731,181호에서 설명되는 입체구조 및 화학적 성질을 갖는 올리고핵염기는 본 발명의 "유전자 수선 올리고핵염기"로서 사용에 적당하다. Kmiec I 및/또는 Kmiec II의 유전자 수선 올리고핵염기는 2개의 상보적 가닥을 함유하며, 이 중 하나는 다른 가닥의 DNA형 뉴클레오타이드와 짝지어지는 염기가 있는 적어도 하나의 RNA형 뉴클레오타이드의 절편("RNA 절편")을 함유한다.
Kmiec II는 퓨린 및 피리미딘 염기-함유 비뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드로 치환될 수 있다는 것을 개시한다. 본 발명에 대해 사용될 수 있는 추가적인 유전자 수선 분자는 미국특허 5,756,325호; 5,871,984호; 5,760,012호; 5,888,983호; 5,795,972호; 5,780,296호; 5,945,339호; 6,004,804호; 및 6,010,907호 및 국제 특허 PCT/USOO/23457; 및 국제 특허 공개 WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; 및 WO 99/40789에서 설명되며, 그것 전체가 각각 본 명세서에 포함된다.
한 구체예에서, 유전자 수선 올리고핵염기는 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오티이며, 상기 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드의 RNA형 뉴클레오타이드는 2'-하이드록실이 플루오르, 염소 또는 브롬 작용기로 치환됨으로써 또는 2'-0 상에 치환체를 위치시킴으로써 RNase 저항성이 만들어진다. 적당한 치환체는 Kmiec II에 의해 교시되는 치환체를 포함한다. 대안의 치환체는 본 명세서에 참고로써 포함되는 미국특허 5,334,711(Sproat)에 의해 교시되는 치환체 및 특허공개 EP 629 387 및 EP 679 657(총괄하여 Martin 출원)에 의해 교시되는 치환체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, Martin 적용 또는 스프로트(Sproat)에서 설명되는 치환체로 치환되는 2'-OH를 갖는 리보뉴클레오타이드들 또는 리보뉴클레오타이드의 2'-플루오르, 염소 또는 브롬 유도체는 "2-치환된 리보뉴클레오타이드"로 칭해진다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "RNA형 뉴클레오타이드"는 비치환 포스포다이에스터 결합 또는 Kmiec I 또는 Kmiec II에 의해 교시되는 임의의 비자연적 결합에 의해 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드의 다른 뉴클레오타이드에 연결된 2'-하이드록실 또는 2'-치환된 뉴클레오타이드를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "데옥시리보형 뉴클레오타이드"는 비치환 포스포다이에스터 결합 또는 Kmiec I 또는 Kmiec II에 의해 교시되는 임의의 비자연적 결합에 의해 유전자 수선 올리고핵염기의 다른 뉴클레오타이드에 연결될 수 있는 2'-H를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 유전자 수선 올리고핵염기는 오직 비치환 포스포다이에스터 결합에 의해 결합되는 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드이다. 대안의 구체예에서, 결합은 Kmiec II에 의해 교시되는 바와 같이 치환된 포스포다이에스터, 포스포다이에스터 유도체 및 비-포스포러스-기반 결합에 의한다. 또 다른 구체예에서, 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드 내 각각의 RNA형 뉴클레오타이드는 2'-치환된 뉴클레오타이드이다. 2'-치환된 뉴클레오타이드의 특정 바람직한 구체예는 2'-플루오로, 2'-메톡시, 2'-프로필옥시, 2'-알릴옥시, 2'-히드록시에틸옥시, 2'-메톡시에틸옥시, 2'-플루오로프로필옥시 및 2'-트리플루오로프로필옥시 치환된 리보뉴클레오타이드이다. 2'-치환된 리보뉴크레오티드의 더 바람직한 구체예는 2'-플루오로, 2'-메톡시, 2'메톡시에틸옥시 및 2'-알릴옥시 치환된 뉴클레오타이드이다. 다른 구체예에서, 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드는 비치환된 포스포다이에스터 결합에 의해 연결된다.
2'-치환된 RNA형 뉴클레오타이드의 단지 한 가지 형태를 갖는 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드가 더 편리하게 합성되지만, 본 발명의 방법은 2이상 유형의 RNA형 뉴클레오타이드를 갖는 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드로 실행될 수 있다. RNA 절편의 기능은 2개의 RNA형 트리뉴클레오타이드 사이에 데옥시뉴클레오타이드의 도입에 의해 야기되는 방해에 의해 영향을 받지 않을 수 있고, 따라서 용어 RNA 절편은 예컨대 "방해된 RNA 절편"을 포함한다. 비방해된 RNA 절편은 인접한 RNA 절편을 칭한다. 대안의 구체예에서, RNA 절편은 대안의 RNase-저항성 및 비치환 2'-OH 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드늘 바람직하게는 100개 미만의 뉴클레오타이드 및 더 바람직하게는 85개 미만의 뉴클레오타이드를 가지지만, 50개 이상의 뉴크레오티드를 가진다. 제1 및 제2 가닥은 왓슨-크릭 염기쌍이다. 한 구체예에서 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드의 가닥은 단일가닥의 헥사, 펜타 또는 테트라뉴클레오타이드에 의해 공유적으로 결합되고, 따라서 제1 및 제2 가닥은 단일 3' 및 단일 5' 말단을 갖는 단일 올리고뉴클레오타이드의 절편이다. 3' 및 5' 말단은 "헤어핀 캡(hairpin cap)"의 부가에 의해 보호될 수 있고, 이것에 의해서 3' 및 5' 말단의 뉴클레오타이드는 인접한 뉴클레오타이드와 왓슨-크릭 쌍이 된다. 추가적으로 제2 헤어핀 캡은 3' 및 5' 말단과 떨어진 제1과 제2 가닥 사이의 연결지점(junction)에 위치될 수 있고, 따라서 제1과 제2 가닥 사이의 왓슨-크릭 쌍은 안정화된다.
제1 및 제2 가닥은 표적 유전자의 2개의 단편과 상동성인 2영역을 함유하며, 즉, 표적 유전자로서 동일한 서열을 가진다. 상동성 영역은 RNA 절편의 뉴클레오타이드를 함유하며, DNA 절편을 연결하는 하나 이상의 DNA형 뉴클레오타이드를 함유할 수 있고, 또한 사이에 있는 DNA 절편 내에 있지 않은 DNA형 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 두 영역의 상동성은 "이종성 영역"으로 칭해지는 표적 유전자의 서열과 다른 서열을 갖는 영역에 의해 분리되며, 각각은 상기 영역과 인접한다. 이종성 영역은 1, 2 또는 3개의 미스매칭(mismatch) 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 미스매칭된 뉴클레오타이드는 인접할 수 있고, 또 다르게는 표적 유전자와 상동성인 1 또는 2개의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다. 대안으로, 이종성 영역은 또한 삽입 또는 1, 2, 3 또는 5 이하의 뉴크레오티드를 함유할 수 있다. 대안으로, 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드의 서열은 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드로부터 단지 1, 2, 3 또는 5 이하의 뉴크레오티드의 결실에 의해 표적 유전자의 서열과 다를 수 있다. 이종성 영역 내에 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드가 없다 하더라도, 이 경우에 이종성 영역의 길이 및 위치는 결실 길이가 되는 것으로 여겨진다. 두 상동성 영역과 상보적인 표적 유전자의 단편 사이의 거리는 치환 또는 치환들이 의도될 때 이종성 영역의 길이와 같다. 이종성 영역이 삽입을 함유할 때, 상동성 영역은 그것에 의해 유전자 내에 있는 그것의 상보적 상동성 단편보다 더 먼 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드 내에서 분리되며, 이종성 영역이 결실을 암호화할 때 정반대도 적용가능하다.
혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드의 RNA 절편은 상동성 영역의 각 부분, 즉, 표적 유전자의 단편에 대한 서열 내 동일한 영역이며, 이 절편은 함께 바람직하게 적어도 13개의 RNA형 뉴클레오타이드 및 바람직하게 16 내지 25개의 RNA형 뉴클레오타이드 또는 훨씬 더 바람직하게는 18-22개의 RNA형 뉴클레오타이드 또는 가장 바람직하게는 20개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 한 구체예에서, 상동성 영역의 RNA 절편은 사이에 있는 DNA 절편에 의해 분리되고, 인접해 있으며, 즉 사이에 있는 DNA 절편에 의해 연결된다. 한 구체예에서, 이종성 영역의 각 뉴클레오타이드는 사이에 있는 DNA 절편의 뉴클레오타이드이다. 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드의 이종성 영역을 함유하는 사이에 있는 DNA 절편은 "뮤테이터(mutator) 절편"으로 칭해진다.
본 발명의 다른 구체예에서, 유전자 수선 올리고핵염기는 단일 가닥의 올리고데옥시노클레오티드 돌연변이 벡터(SSOMV)이며, 이는 전체가 참고로써 포함되는 국제특허 출원 PCT/USOO/23457, 미국특허 6,271,360호, 6,479,292호, 및 7,060,500호에서 개시된다. SSOMV의 서열은 미국특허 5,756,325호; 5,871,984호; 5,760,012호; 5,888,983호; 5,795,972호; 5,780,296호; 5,945,339호; 6,004,804호; 및6,010,907호 및 국제공개번호 WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; 및 WO 99/40789에서 설명되는 돌연변이 벡터로서 동일한 원칙을 기반으로 한다. SSOMV의 서열은 뮤테이터 영역을 칭하는 원하는 유전적 변경을 함유하는 영역에 의해 분리되는 표적 서열과 상동성인 2 영역을 함유한다. 뮤테이터 영역은 표적 서열 내 상동성 영역을 분리하는 서열과 동일한 길이의 서열을 가질 수 있지만, 다른 길이를 가질 수 있다. 이러한 뮤테이터 영역은 치환을 야기할 수 있다. 대안으로, SSOMV 내 상동성 영역은 서로 인접할 수 있는 한편, 동일 서열을 갖는 표적 유전자 내 영역은 1, 2 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 이러한 SSOMV는 SSOMV가 없는 뉴클레오타이드의 표적 유전자로부터 결실을 야기한다. 마지막으로, 상동성 영역과 동일한 표적 유전자의 서열은 표적 유전자 내에서 인접할 수도 있지만 SSOMV의 서열 내 1, 2 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수도 있다. 이러한 SSOMV는 표적 유전자의 서열 내 삽입을 야기한다.
SSOMV의 뉴클레오타이드는 3' 말단 및/또는 5' 말단의 뉴클레오타이드 사이의 결합을 제외한 비변형 포스포다이에스터 결합에 의해 연결된 데옥시리보뉴클레오타이드이며, 또 다르게는 2개의 3' 말단 및/또는 5' 말단의 뉴클레오타이드 사이의 결합은 포스포로티오에이트 또는 포스포아미데이트일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 뉴클레오타이드 사이의 결합은 SSOMV의 뉴클레오타이드 사이의 결합이며, 3' 말단 뉴클레오타이드 또는 5' 말단 뉴클레오타이드와 차단 치환체 사이의 결합을 포함하지 않는다, 상기 참조. 특정 구체예에서, SSOMV의 길이는 21 내지 55개의 데옥시뉴클레오타이드이며, 따라서 상동성 영역의 길이는 적어도 20개의 데옥시뉴클레오타이드의 총 길이이며, 적어도 2개의 상동성 영역은 각각 적어도 8개의 데옥시뉴클레오타이드 길이를 가져야 한다.
SSOMV는 표적 유전자의 암호 또는 비암호 가닥 중 하나와 상보적이 되도록 설계될 수 있다. 원하는 돌연변이가 단일 염기의 치환일 때, 뮤테이터 뉴클레오타이드는 둘 다 피리미딘인 것이 바람직하다. 원하는 작용 결과를 달성하는 것과 일치하는 정도로, 뮤테이터 뉴클레오타이드와 상보적 가닥 내 표적화된 뉴클레오타이드는 둘 다 피리미딘인 것이 바람직하다. 변위(transversion) 돌연변이를 암호화하는 SSOMV가 특히 바람직하며, 즉 C 또는 T 뮤테이터 뉴클레오타이드는 각각 상보적 스트랜드 내 C 또는 T 뉴클레오타이드와 미스매칭된다.
올리고데옥시노클레오티드에 더하여, SSOMV는 링커를 통해 5' 말단의 탄소에 부착되는 5' 차단 치환체를 함유할 수 있다. 링커의 화학적 성질은 그것의 길이 외에는 중요하지 않은데, 바람직하게는 적어도 6개 원자이어야 하고 링커는 유연성이 있어야 한다. 다양한 비독성 치환체, 예컨대 비오틴, 콜레스테롤 또는 다른 스테로이드 또는 끼어들지 않는(non-intercalating) 양이온성 형광 염료가 사용될 수 있다. SSOMV를 만드는 시약은 버지니아주 스털링시에 소재한 글렌 리서치(Glen Research)에 의해 Cy3(상표명) 및 Cy5(상표명)로서 시판되는 시약이 특히 바람직한데, 이것은 포스포르아미다이트를 차단하여, 올리고뉴클레오타이드에 포함 시 각각 3,3,3',3'-테트라메틸 Ν,Ν'-아이소프로필 치환된 인도모노카모모카보시아닌 및 인도다이카보시아닌 염료를 수득한다. Cy3가 가장 바람직하다. 인도카보시아닌이 N-옥시알킬 치환될 때, 5' 말단의 포스페이트를 갖는 포스포다이에스터를 통해 올리고데옥시노클레오티드의 5' 말단에 편리하게 연결될 수 있다. 염료와 올리고데옥시노클레오티드 사이의 염료 링커의 화학적 성질은 중요하지 않으며, 합성의 편의를 위해 선택된다. 상업적으로 이용가능한 Cy3 포스포르아미다이트가 지시된 바와 같이 사용될 때, 결과된 5' 변형은 차단 치환체와 링커로 함께 이루어지며, 이는 N-히드록시프로필, N'-포스파티딜프로필 3,3,3',3'-테트라메틸 인도모노카보시아닌이다.
한 바람직한 구체예에서, 인도카보시아닌 염료는 인돌 환의 3 및 3' 위치에서 테트라 치환된다. 이론에 의해 제한되지 않고, 이 치환은 염료가 끼어들기 염료가 되는 것을 막는다. 이 위치들에서 치환체의 동일성은 중요하지 않다. 게다가 SSOMV는 3' 차단 치환체를 가질 수 있다. 또한 3' 치단 치환체의 화학적 성질은 중요하지 않다.
이종성
발현
특정 구체예에서, 이종성 발현은 효모(예를 들어, 야로이야 리폴리티카) 내 외래 유전자 또는 내인성 유전자의 추가 복제물을 발현시키기 위해 사용된다.
효모 내 이종성 발현은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이종성 발현을 사용하는 효모 내 외래 유전자 또는 내인성 유전자의 추가적인 복제물의 발현은 (a) 전사 개시를 위한 프로모터 서열, (b) 전사 종결을 위한 터미네이터 서열, 및 (c) 선택가능한 마커를 포함하는 벡터의 사용을 수반할 수 있다. 이종성 발현 및 발현 벡터는, 예를 들어 문헌[Madzak, C, Gaillardin, C, and Beckerich, J-M., 2004 Heterologous Protein Expression and Secretion in the Non-Conventional Yeast Yarrowia lipolytica: a review, Journal of Biotechnology 109:63-81]에서 설명되는 것일 수 있다. 본 명세서의 조성물 및 방법의 특정 구체예에서, 벡터는 pYLEXl(Yeastern)이다. 사용될 수 있는 선택가능한 마커 유전자의 비제한적 열거는 하이그로마이신 저항성을 암호화하는 ura3 , lys5 , trp1, leu2 , adel , E. coli hph 및 사카로마이세스 세레비시아로부터의 SUC2를 포함한다. 사용될 수 있는 프로모터의 비제한적 열거는 pLEU2, pXPR2, pPOX2, pPOT1, pICL1, pG3P, pMTP, pTEF, 및 pRPS7을 포함한다. 특정 구체예에서, 프로모터는 강하고, 구성요소인 혼성 프로모터인 hp4d 프로모터이다(2000년 7월 4일 발행된 미국특허 6,083,717호). 사용될 수 있는 터미네이터 서열의 비제한적 열거는 XPR2t , LIP2t 및 PH05t를 포함한다.
특정 구체예에서, 야로이야 리폴리티카 LYS1(Genolevures YALI0B15444g), TRP1(Genolevures YALI0B07667g), 및 ADE1(Genolevures YALI0E33033g) 유전자 중 한 가지 이상이 선택가능한 마커로서 사용된다. 특정 구체예에서, 야로이야 리폴리티카 URA3(GenBank: U40564.1) 또는 LEU2(Genoluveres YALI0C00407) 유전자 중 한 가지 이상은 선택가능한 마커로서 사용된다.
특정 구체예에서, 통합 발현 벡터는 야로이야 리폴리티카 해당경로(glycolytic pathway) 유전자, 알칸 또는 글라이세롤 이용 유전자, XPR2 , ACC1 , HMGl , ERG1, 및 ERG 9로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터 및/또는 터미네이터 서열을 포함한다.
특정 구체예에서 야로이야 리폴리티카 내 야로이야 리폴리티카 ATP 시트레이트 리아제(Genoleveres YALI0D24431g 및 YALI0E34793g) 중 하나 또는 둘 다의 서브유닛은 과발현된다.
변형된 효소
본 발명의 변형된 또는 돌연변이된 효소는 염기쌍 변화, 삽입, 치환 등에 의해 변형되거나 돌연변이될 수 있다.
지방산 생합성 경로 및 아이소프레노이드 생합성 경로에 수반된 효소를 암호화하는 유전자는 돌연변이에 대한 바람직한 표적이다. 일부 구체예에서, 표적 유전자는 아실 CoA 카복실라제를 암호화한다. 다른 구체예에서 표적 유전자는 HMG-CoA 환원효소를 암호화한다. 다른 구체예에서, 표적 유전자는 스쿠알렌 에폭시다제를 암호화한다. 다른 구체예에서 표적 유전자는 스쿠알렌 신타제를 암호화한다. 특정 구체예에서, 표적 유전자는 ATP 시트레이트 리아제를 암호화한다. 돌연변이는 효소 활성을 감소시키거나 제거하고, 효소 활성을 향상시키도록 또는 효소 활성을 변경(예를 들어 기질 선택성을 변경)하도록 설계될 수 있다.
야생형 유성의 효모에서, 아세틸-CoA는 아세틸-CoA 카복실라제(ACCase)를 통해 지방산에 광범위하게 보내진다. 따라서 스쿠알렌 합성에 이용가능한 아세틸-CoA의 양을 증가시키기 위해서, ACCase의 효소 발현 또는 특이적 활성을 감소시키는 것이 바람직하다. ACCase에 대한 예시적인 유전자 서열은 등록번호 Z71631에서 나타내는 바와 같은 사카로마이세스 세레비시아 내 ACC1 유전자이다. 따라서 ACCase의 세포간 활성이 감소된 특정 구체예에서, 메발로네이트 생합성과 트리글리세라이드 생합성 사이의 분지점에서 효소는 오일 합성을 위해 구분된 아세틸-CoA의 양을 감소시키고, 그것에 의해서 아이소프렌 경로에 대한 그것의 이용가능성을 증가시킬 것이다.
HMG-CoA 환원효소 활성은 아이소프렌 생합성에 대한 율속 효소(rate-limiting)이다. HMG-CoA 환원효소에 대한 예시적인 유전자 서열은 각각 등록번호 NC_001145 및 NC_OO1144에서 나타내는 것과 같은 사카로마이세스 세레비시아 내 HMG1 및 HMG1 유전자를 포함한다. 따라서 특정 구체예에서, HMG-CoA 환원효소 활성은 HMGR 유전자를 변형시켜 전사를 증가시키고, 결과 단백질을 안정화시키고 및/또는 생성물 피드백 억제를 감소시킬 것이다.
효모 내 ACCase 활성을 감소시키고 및/또는 HMG-CoA 환원효소 활성을 증가시키는 것은 경로 내 후속하는 효소의 조작에 의해 다수의 관련된 아이소프레노이드 생성물을 생산할 수 있는 코어 아이소프레노이드 생성물 유기체를 만들 수 있다.
스쿠알렌 에폭시다제는 스테롤 생합성의 제1 개입단계(committed step)를 촉매한다. 스쿠알렌 에폭시다제에 대한 예시적인 유전자 서열은 등록 번호 NC_OO1139에서 나타내는 것과 같이 사카로마이세스 세레비시아 내 ERG1 유전자이다. 따라서, 특정 구체예에서 스쿠알렌 에폭시다제 활성, 억제제 및/또는 발현에 대한 선택성은, 예를 들어 효소의 아미노산 서열 내 촉매적으로 중요한 잔기에 의해 효모 내에서 약화될 것이다.
스쿠알렌 신타제는 2개의 c15 아이소프렌 전구체(파르네실 다이포스페이트(farnesyl diphosphate : FPP))를 축합함으로써 스쿠알렌의 합성을 촉매한다. 스쿠알렌 신타제에 대한 예시적인 유전자 서열은 등록번호 NC_OO1140에서 나타내는 바와 같은 사카로마이세스 세레비시아 내 ERG9 유전자이다. 따라서 특정 구체예에서, 스쿠알렌 신타제 활성 및/또는 발현은 효모 내에서 증가될 것이다.
ATP 시트레이트 리아제(E.C. 4.1.3.8)는 시트레이트를 촉매적으로 쪼개서 아세틸 CoA 및 옥살로아세테이트를 생성한다. 아세틸 CoA는 지방산 생합성을 위해 ACCase에 의해 또는 스쿠알렌과 같은 아이소프렌의 생성을 위해 아세틸 CoA 아세틸 트랜스퍼라제에 의해 사용될 수 있다.
메발로네이트 키나제는 메발로네이트 경로 중 HMG-CoA 환원효소 후 제1 효소이며, 메발로네이트의 메발로네이트-5-포스페이트로 변환을 촉매한다. 따라서 특정 구체예에서 메발로네이트 키나제 활성 및/또는 발현 수준은, 예를 들어 효소의 아미노산 서열 내 촉매적으로 중요한 잔기를 변화시킴으로써 또는 그것의 유전자량 또는 전사 수준을 증가시킴으로써 효모 내에서 증가될 것이다.
글라이세롤 키나제는 ATP로부터 글라이세롤에 포스페이트의 전달을 촉매하여 글라이세롤 포스페이트를 형성한다. 따라서 특정 구체예에서, 글라이세롤 키나제 활성 및/또는 발현 수준은, 예를 들어 효소의 아미노산 서열 내 촉매적으로 중요한 잔기를 변화시킴으로써 또는 그것의 유전자량 또는 전사 수준을 증가시킴으로써 효모 내에서 증가될 것이다.
특정 구체예에서 대사 변화의 결과는 아세틸-CoA로부터 스쿠알렌으로 탄소를 보낼 것이고, 이 탄소 흐름에 대해 주된 경쟁적 경로를 약화시키고, 생성된 스쿠알렌의 상당한 증가를 초래할 것이다.
효모 세포 내에 유전자 수선 올리고핵염기
의
전달
임의의 통상적으로 알려진 방법이 본 발명의 방법에서 사용되어 유전자 수선 올리고핵염기를 갖는 효소 세포를 형질전환할 수 있다. 예시적인 방법은 전기천공법, LiOAc, 바이오리스틱스(biolistics), 스페로플라스팅(spheroplasting) 및/또는 아그로박테리움(Agrobacterium )(예를 들어, 문헌[McClelland, CM., Chang, Y.C, and Kwon-Chung, K.J. (2005) Fungal Genetics and Biology 42:904-913]을 참조)의 사용을 포함한다.
특정 구체예에서, 유전자 수선 올리고핵염기는 전기천공법에 의해 효모 세포에 도입된다. 일부 구체예에서, 유전자 수선 올리고핵염기는 전기천공법에 의해 PEG(3350 또는 4000 mw) 및/또는 리튬 아세테이트로 화학적으로 처리된 효모 세포에 도입된다. 특정 구체예에서, 유전자 수선 올리고핵염기는 PEG(3350 또는 4000 mw) 및/또는 리튬 아세테이트를 사용하여 효모 세포에 도입된다.
본 발명의 방법에서 마이크로캐리어를 사용하기 위한 특정 조건은 국제 공개 WO 99/07865, US09/129,298에서 설명된다. 예를 들어, 빙냉 마이크로캐리어(60 ㎎/㎖), 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드(60 ㎎/㎖), 2.5 M CaCl2 및 0.1M 스페르미딘이 그 순서로 첨가되며; 혼합물은, 예를 들어 10분 동안 소용돌이에 의해 부드럽게 교반되고, 10분 동안 실온에 두어서, 그 결과 마이크로캐리어는 5부피의 에탄올 중에서 희석되고, 100% 에탄올 중에서 원심분리되고 재현탁된다. 부착 용액 내 성분의 예시적인 농도는 8-10 ㎍/㎕ 마이크로담체, 14-17 ㎍/㎕ 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드, 1.1-1.4 M CaCl2 및 18-22 mM 스페르미딘을 포함한다. 한 실시예에서, 성분 농도는 8 ㎍/㎕ 마이크로담체, 16.5 ㎍/㎕ 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드, 1.3 M CaCl2 및 21 mM 스페르미딘이다.
일부 구체예에서, 유전자 수선 올리고핵염기는 당업자에게 잘 알려진 기법에 따라서 전기천공법에 의해 효모 세포로 전달될 수 있다(예를 들어, 문헌[Becker, D. M., and Guarente, L. High Efficiency Transformation of Yeast by Electroporation. Methods in Enzymology, vol. 194, section [12] pp. 182-186. 1991. Elsevier Academic Press, London] 참조).
원하는 변형된 효소를 갖는 효모의 선택
변형된 효소를 발현시키는 효모는 임의의 다수의 수단을 통해 확인될 수 있다. 한 방법에서, 유전자 수선 올리고핵염기(gene repair oligonuclobase : GRON)를 사용하는 공동 변환 전략은 동일 실험 중에 선택가능한 변환(즉, 마커)와 선택가능하지 않은 변환(예를 들어, 관심의 표적 유전자) 둘 다를 표적화한다. 이 방법에서, GRON이 전달되지 않았거나 또는 GRON에 의해 특정된 변환을 전할 수 없는 세포는 제거된다. 관련없는 유전자를 표적화하는 GRON의 전달이 선택적인 것으로 기대되지 않기 때문에, 일부 주파수에서, 성공적으로 선택된 변환이 있는 콜로니는 또한 다른 표적화된 유전자 중 하나에서 변환을 갖는 것을 기대되었다. 변환 사건은 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism : SNP) 분석에 의해 해결될 수 있다.
따라서 게놈 DNA는 효모로부터 추출되고, 각 표적에 대해 SNP 검출 기법, 예를 들어 대립유전자-특이적 중합효소연쇄반응(allele-specific Polymerase Chain Reaction : ASPCR)을 사용하여 개개의 DNA 샘플을 스크리닝한다. 양성 효모 내 서열 변화를 독립적으로 확인하기 위해, 표적 유전자의 적절한 영역이 PCR 증폭될 수 있고, 직접 시퀀싱되거나 클로닝된 결과된 앰플리콘 및 다수의 삽입은 시퀀싱된다.
대안으로, 관심의 유전자에 돌연변이의 삽입은 추출된 핵산 내 단일 뉴클레오타이드 돌연변이를 검출하도록 설계된 임의의 다수의 분자 생물학 기법(예를 들어, PCR 및 단일 뉴클레오타이드 프라이머 신장 분석과 같은 증폭방법)에 의해 확인될 수 있다. 더 큰 돌연변이가 돌연변이되는 표적 유전자 영역의 증폭 및 시퀀싱에 의해 검출될 수 있다.
대안으로, 변형된 효소를 함유하는 효모 또는 효모 세포는, 예를 들어 효모에 의해 생성되는 아이소프레노이드의 조성물 분석에 의해 확인될 수 있다. 따라서, 효모는 성장될 수 있고, 오일 추출되고, 당업계에 알려진 방법을 사용하여 분석된다(예를 들어, 기체 크로마토그래피 또는 HPLC).
실시예
실시예
1.
크립토코쿠스
쿠르바투스
및
로도토룰라
글루티누스
형질전환 시스템
크립토코쿠스 쿠르바투스(ATCC 균주 20508) 및 로도토룰라 글루티누스(ATCC 균주 10788 및 204091) 형질전환 시스템을 만들기 위해, 사카로마이세스 세레비시아에 카나마이신 저항성을 부여한 KANMX 발현 카세트(프로모터-유전자-터미네이터)를 선택가능한 마커로서 사용하여 균주를 카나마이신 선택성에서 저항성으로 변환시킨다(예를 들어, 문헌[Baudin, A., et al. (1993) Nucleic Acids Research (21) 3329-3330] 참조). 균주를 발현 카세트 단독으로뿐만 아니라 DNA 복제원점을 함유하는 로도토룰라 글루티누스(R. glutinus)(예를 들어, 문헌[Oloke, J.K., and Glick, B.R. (2006) African Journal of Biotechnology 5(4):327-332] 참조)에서 보고한 플라스미드의 제한 단편에 결찰된 KANMX와 함께 형질전환시킨다. DNA를 크립토코쿠스 쿠르바투스(C. curvatu) 및 로도토룰라 글루티누스에 전기천공법, LiOAc, 바이오리스틱스, 스페로플라스팅 및/또는 아그로박테리움(Agrobacterium)(예를 들어, 문헌[McClelland, CM., Chang, Y.C, and Kwon-Chung, K.J. (2005) Fungal Genetics and Biology 42:904-913]을 참조)에 의해 도입한다.
실시예
2. 선택가능한
마커
크립토코쿠스 쿠르바투스 및 로도토룰라 글루티누스 내 우라실 영양요구성(auxotrophic) 돌연변이체를 만들기 위해, 세포를 항-대사물질 5-플루오로오르트산을 함유하는 최소 배지 중에서 성장시켜 ura3 또는 ura5 유전자 내 병변이 있는 저항성 돌연변이체를 선택하였다. 크립토코쿠스 쿠르바투스의 33개의 안정한 5-FOAR 콜로니 및 로도토룰라 글루티누스의 20개의 안정한 5-FOAR 콜로니를 쌓았다. 크립토코쿠스 쿠르바투스와 로도토룰라 글루티누스 둘 다로부터의 야생형 URA3 유전자를 클로닝하고, 5 -FOAR 분리주 내 돌연변이체 ura3 유전자를 시퀀싱한다.
다른 영양요구성 마커를 사카로마이세스 세레비시아 중의 기능 상보성에 의해 클로닝한다(문헌[Ho, Y.R., and Chang, M.C. (1988) Chinese Journal of Microbiology and Immunology 21(1): 1-8] 참조). 균주 YPH500(MATα ura3-52 lys 2-801 ade2 -101 trp1 -Δ63 his3 -A200 Ieu2 -Δ1)으로 형질전환을 위한 우라실-선택가능한 사카로마이세스(Saccharomyces) 발현 벡터에 결찰을 위해 게놈 및/또는 cDNA 라이브러리를 크립토코쿠스 쿠르바투스 및 로도토룰라 글루티누스로부터 구성하여, 리신, 아데닌, 트립토판, 히스티딘, 및 류신 원영양체(prototroph)를 선택한다. 이 원영양체들로부터, LYS2, ADE2, TRP1, HIS3, 및 LEU2에 대한 대응하는 유전자는 게놈 또는 cDNA 삽입으로부터 시퀀싱된다.
실시예
2.
RTDS
기법을 사용하는 효모 내 유전자 조작
야로이야 리폴리티카 균주 ATCC 90811(leu2-35 lys5-12 ura3-18 XPR2B)로부터의 leu2, lys5 및 ura3의 대립유전자를 PCR에 의해 클로닝하였고, 그것의 서열을 야생형 대립유전자와 비교하여 차이를 확인하였다.
ura3에 대해, 위치 1365(A→G 돌연변이, 리신에 대해 AAA→AAG 암호의 침묵 변화를 초래), 1503(GenBank에서 YL URA3로서 서열이 계속된 후 프레임 변화를 초래하지만 1511에서 7개의 추가적인 아미노산이 생겨서 프레임 내에 되돌아오는 ATCC 90811 내 AAGAA 추가 서열), 1511(ATCC 90811 내 추가 T) 및 1978(C→T 돌연변이, 카복시 말단 외의 단백질 24개 아미노산을 절단하는 정지 돌연변이를 유발)에서 차이점을 발견하였다.
GRON 올리고뉴클레오타이드를 정지(TGA)→R(CGA)를 변환시킴으로써 원영양성을 회복하도록 설계하여 Y1Ura3 - YLU40564 아미노산 넘버링에 기반한 264R을 수득하였다. 사용한 GRON은 서열 VCGAGGTCTGTACGGCCAGAACCGAGATCCTATTGAGGAGGH를 갖는 Y1Ura31264/C/40/5'Cy3/3'idC과, 서열 CCTCCTCAATAGGATCTCGGTTCTGGCCGTACAGACCTCGH를 갖는 Y1Ura31264/NC/40/5'Cy3/3'idC이며, 여기서 V=CY3이고; H=3'DMT dC CPG이다. 10, 30, 및 50 ㎍의 각각의 GRON를 리튬 아세테이트계 방법을 사용하여 야로이야 리폴리티카 균주로 형질전환하였고, ura-2% 글루코스에 플레이팅하였다. 총 82개의 ura+ 콜로니를 암호 가닥을 사용하여 설계한 GRON에 의해 얻었고, 6개의 콜로니를 비암호 가닥을 사용하여 설계한 GRON에 의해 얻어서, 갭-수선 올리고뉴클레오타이드를 형질전환하는 통상의 가닥 바이어스(bias)를 증명하였다. 18개의 암호-가닥 형질전환체의 시퀀싱은 17개의 클론에서 의도된 변화를 증명하였다.
LEU2에 대해 위치 1710(프레임 이동 및 조기의 단백질 종결을 야기하는 것이 없는 추가 C); 1896(추가 T); 2036(정지 코돈 뒤에 위치된 T→A 돌연변이); 2177(정지 코돈 후 위치된 추가 T의 없어짐)에서 차이점을 발견하였다.
LEU2에 대해 위치 1092(G→A TCG→TCA, 보존적 치환(세린)); 1278(G→A CAG→CAA, 보존적 치환(글루타민)); 1279(G→A GGT→ATT, V→I로 변화)에서 차이점을 발견하였다.
따라서, 돌연변이는 다양한 목적을 위해, 예를 들어 원영양성을 영양요구성이 되도록 변환시켜 또는 그 반대로 변환시켜 사용할 수 있다.
크립토코쿠스 쿠르바투스 및 로도토룰라 글루티누스 내 RTDS 기법의 유효성을 증명하기 위한 유사한 전략을 야로이야 리폴리티카에 대해 설명하며, 이때 ura3 돌연변이를 수정하여 원영양성을 회복한다.
특정 구체예에서, 야로이야 리폴리티카 내 RTDS의 유효성을 E. coli 하이그로마이신 유전자의 그것의 게놈으로 돌연변이된 버전을 통합함으로써 증명할 수 있다. G34T에서 점 돌연변이를 은닉하는 이 유전자 버전은 야로이야 리폴리티카의 자연적 하이그로마이신 선택성이 영향받지 않는 E12STOP 변화를 암호화한다. 이 돌연변이를 수정하는 GRON에 의한 형질전환은, 예를 들어 1000 ug/ml까지의 하이그로마이신으로 야로이야 리폴리티카 균주의 저항성을 부여할 것이다. 하이그로마이신 저항성(hygromycin resistance : HGH) 유전자 내 이중 돌연변이는 또한 단일 GRON에 의해 수정될 수 있는 G34T A37T(E12ASTOP K13STOP) 및 2개의 GRON에 의해 수정될 수 있는 G34T T149G(E12STOP Y46 STOP)을 포함하여 구성할 수 있다.
야로이야 내 GRON 활성을 시험하기 위해서, 아미노글리코시드 항생물질인 하이그로마이신 B에 대해 야생형 야로이야 리폴리티카의 자연 선택성을 사용할 수 있다. 하이그로마이신 B(hmB)는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해 생산되는 아미노글리코시드 항생물질이며, 이는 원핵생물과 진핵생물 둘 다에서 리보솜 전좌와 아미노아실tRNA 인식을 방해하여 단백질 합성을 억제한다. 저항은 E. coli(GENBANK V01499)로부터 hph 유전자(또한 aph(4)로서 알려짐)의 도입에 의해 부여될 수 있으며, 이것은 사이클리톨 환의 4-위치에 포스페이트 기의 공유 부가에 의해 하이그로마이신 B를 불활성화하는 아미노사이클리톨 포스포트랜스퍼라제를 암호화한다. 야로이야 리폴리티카 균주 Polg(Yeastern으로부터의 Mat a ura3-302::URA3 leu2-270 xpr2-322 axp-2)를 벡터 pyLEXl-2u-ura3-13에 클로닝된 하나(G34T로부터의 E12정지) 또는 2개의 돌연변이 E12정지K13정지(G34T.A37T) 돌연변이 중 하나를 함유하는 E. coli hph 유전자로 형질전환하였고, hpd4 프로모터 및 XPR2 터미네이터의 조절하에서 유전자를 두었다. LEU2 마커에 의해 부여된 원영양성의 회복을 위한 선택 시 선형화된 벡터를 게놈에 통합하였다. 결과물 균주는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 장애가 있는 버전을 은닉하며(따라서 하이그로마이신 민감성), 야생형에 대해(하이그로마이신 저항성) G34T 또는 G34T.A37T 중 하나를 회복하는 다음의 GRON에 의해 변환하였다.
야생형(T34G)에 대해 E12정지를 회복하기 위한 GRON
야생형(T34G T37A)에 대해 E12정지K13정지를 회복하기 위한 GRON
30㎍의 표시한 GRON을 사용하여 하나 또는 2개의 hph 돌연변이 균주를 자기복제하도록(x6) 변환시켰고, 이것을 모으고, 알리쿼트(aliquot)를 100 내지 1000 ㎍/㎖ 하이그로마이신을 함유하는 YEPD 플레이트 상에 플레이팅하여 신호 대 노이즈 비율을 최적화하였다. 두 균주로, 상당수의 추정적으로 변환된 콜로니를 'DNA 없음' 대조군 이상으로 임의의 주어진 하이그로마이신 농도에서 얻었고, 두 경우에 비암호 GRON 가닥에 대해 강한 바이어스가 있었다. 종합해서, 이 결과들은 야로이야 리폴리티카 내 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 GRON 변환과, 추가로 두 돌연변이(T34G T37A)의 변환은 단일 GRON을 사용하여 수행될 수 있다는 것을 제안한다. DNA 시퀀싱을 수행하여 야생형 유전자형의 회복을 확인한다.
실시예
3. 표적 유전자의
클로닝
사카로마이세스(Saccharomyces) 및 다른 효모로부터 이용가능한 ACCase, HMGR, 스쿠알렌 신타제 및 스쿠알렌 에폭시다제에 대한 서열을 PCR 프라이머의 공급원으로서 사용하였고, 대응하는 유전자를 그것의 대응하는 조절 영역(프로모터, 터미네이터)과 함께 크립토코쿠스 쿠르바투스 및 로도토룰라 글루티누스로부터 클로닝한다. 각각 전사를 증가시키거나 또는 감소시키는 '상향' 및 '하향' 프로모터 돌연변이를 확인하게 위해, 이 4개의 유전자에 대한 프로모터를 상대적으로 실수를 유발하는(error-prone) DNA 폴리머라제로 클로닝하여 프로모터 내에서 점 돌연변이를 만들었고, 이 단편들을 사카로마이세스 세레비시아(S. cerevisiae) 또는 E. coli에서 시험관 내 시험을 위해 녹색형광단백질(Green Fluorescent Protein : GFP) 또는 베타-갈락토시다제 리포터 유전자와 융합된 플라스미드에 클로닝한다. 프로모터 "상향" 돌연변이를 RTDS에 의해 HMGR 및 스쿠알렌 신타제 게놈 서열에 재도입하는 한편, "하향" 프로모터 돌연변이는 게놈 ACCase 및 스쿠알렌 에폭시다제 서열로 만든다. 로도토룰라 글루티누스(R. glutinis) 및 크립토코쿠스 쿠르바투스(C. curvatus) 내 필수 유전자(예를 들어, GAPDH, 액틴)로부터 프로모터를 이종성 유전자 발현에서 사용을 위해 클로닝한다. PCR 클로닝을 위한 프라이머를 사카로마이세스 세레비시아 내 이 유전자들에 대한 상동성으로부터 설계한다.
실시예
4.
증가된
스쿠알렌 생산을 위한 표적 유전자의 조작.
ACCase . ACCase 유전자의 복제물의 수는 로도토룰라 글루티누스 및 크립토코쿠스 쿠르바투스 및 다른 효모에서 결정한다. RTDS를 이용하여 임의의 추가 복제물 내 번역 출발 자리 바로 뒤에 정지 코돈을 도입함으로써 ACCase 발현을 감소시킨다
스쿠알렌 에폭시다제 . 유사하게 사카로마이세스 세레비시아 내 스쿠알렌 축적의 증가를 2배체(diploid) 내 스쿠알렌 에폭시다제의 한 복제물의 파쇄(disruption)에 의해 달성하였다. 문헌[Kamimura, N., Hidaka, M., Masaki, H., and Uozumi, T. (1994) Appl. Microb. Biotech. 42: 353-357]. 로도토룰라 글루티누스 및 크립토코쿠스 쿠르바투스 및 다른 효모 내 스쿠알렌 에폭시다제의 복제물의 수를 결정하고, RTDS를 사용하여 첫번째 복제물을 지나서 추가 복제물 내 번역 출발 자리 바로 뒤에 정지 코돈을 만들거나 삽입한다.
일부 구체예에서, 배지에 터비나핀(스쿠알렌 에폭시다제의 억제제)의 첨가에 의해 스쿠알렌 에폭시다제 활성을 약화시켰다. 특정 구체예에서, 스쿠알렌 에폭시다제로 아미노산 변화는 터비나핀에 대한 스쿠알렌 에폭시다제의 선택성을 증가시키도록 만들었다(예를 들어 사카로마이세스 ERG1 상에 맵핑된 G30S, L37P, 및 R269G과 상동성인 아미노산 변화). 일부 구체예에서, 아미노산 변화는 유전자 합성 및 상동성 재조합에 의한 야생형 유전자의 돌연변이 버전으로 치환에 의해 만든다. 다른 구체예에서, RTDS에 의해 야생형 유전자에 변화를 도입한다.
HMGR . 사카로마이세스 세레비시아와 포유류 HMGR 효소는 둘 다 그것의 링커 영역에 아미노산 서열을 함유하는데, 이것은 진핵세포 내 빠른 세포간 턴오버(turnover)를 받는 다수의 단수명 단백질 중에 존재한다(문헌[Rogers, S., Wells, R., and Rechsteiner, M. (1986) Science 234: 364-368; 및 Chun, K.T., and Simoni, R.D. (1991) J. Biol. Chem. 267(6): 4236-4246] 참조). 존재한다면, 유사한 서열을 야로이야 리폴리티카, 로도토룰라 글루티누스 및 크립토코쿠스 쿠르바투스 내 HMGR 유전자에서 확인하고, RTDS를 사용하여 제거하여 HMGR 단백질 턴오버를 감소시킨다. 이러한 유사한 서열을 사카로마이세스 세레비시아 스쿠알렌 신타제 유전자에서 발견하였고, 또한 이러한 서열이 야로이야 리폴리티카, 로도토룰라 글루티누스 및/또는 크립토코쿠스 쿠르바투스에 존재하는지 여부를 결정한다. 야로이야 리폴리티카, 로도토룰라 글루티누스 및/또는 크립토코쿠스 쿠르바투스 스쿠알렌 신타제 내에 존재한다면, 또한 RTDS를 사용하여 서열을 제거하여 단백질 턴오버를 감소시킨다.
사카로마이세스 세레비시아 내 HMGR은 2개의 매우 보존된 도메인을 포함하며, 그것의 N-말단 552개 아미노산은 막 결합을 초래한다. 단지 C-말단의 촉매적 부분을 함유하는 절단된 HMG1 단백질의 과발현은 5.5%의 건조 물질에 스쿠알렌의 증가된 축적과 함께 사카로마이세스 세레비시아에서 HMG-CoA의 40배 증가를 유발한다(문헌[Polakowski, T., Stahl, U., and Lang, C. (1998) Appl. Microbiol. Biotech. 49:66-71]). 야로이야 리폴리티카, 로도토룰라 글루티누스 및 크립토코쿠스 쿠르바투스 HMGR 단백질이 유사한 구조를 갖는지 여부를 결정하고, 만약에 그렇다면 가용성 촉매 도메인만을 갖는 단편을 발현시킬 수 있다.
HMGR의 단백질 구조 및 DNA 서열은 막-결합된 N-말단 도메인 및 촉매적 C-말단 도메인을 갖는 진균으로부터 포유류까지 진핵생물 사이에서 크게 보존된다. 두 도메인 사이의 경계는 야로이야 리폴리티카 HMG1 유전자(Genelouvres Yarrowia lipolytica YALI0E04807g) 내 아미노산 500 내지 600의 영역에 맵핑될 수 있는데, 소수성 플롯은 소수성으로부터 친수성으로 전이한다. 잔기 548 및 544를 야로이야 리폴리티카 HMG1의 소수성 플롯 및 절단된 사카로마이세스 세레비시아(문헌[Donald, K.A.G., et al, 1997. Appl. Environ. Micro. 63(9): 3341-3344] 및 칸디다 유틸리스(Candida utilis)(문헌[Shimada, H. et al, 1998. Appl. Environ. Micro. 64(7):2676-2680] 단백질)의 N-말단과 그것의 상동성의 평가로부터 선택한다. 따라서 한 예에서, 야로이야 리폴리티카 HMG1 I의 C-말단 도메인의 아미노산 548 내지 1000개를 발현시키고; 제2 실시예에서 야로이야 리폴리티카 HMG1 I의 C-말단 도메인의 아미노산 544 내지 1000개를 발현시킨다. 관련 예에서, 야로이야 리폴리티카 HMG1 I의 C-말단 도메인의 아미노산 543 내지 1000개를 발현시키고; 또는 야로이야 리폴리티카 HMG1 I의 C-말단 도메인의 아미노산 545 내지 1000개를 발현시키고; 또는 야로이야 리폴리티카 HMG1 I의 C-말단 도메인의 아미노산 546 내지 1000개를 발현시키고; 또는 야로이야 리폴리티카 HMG1 I의 C-말단 도메인의 아미노산 547 내지 1000개를 발현시키고; 또는 야로이야 리폴리티카 HMG1 I의 C-말단 도메인의 아미노산 549 내지 1000개를 발현시킨다.
야로이야 리폴리티카 균주 Polg 내 HMGR(잔기 543-1000)의 457 아미노산 C-말단의 촉매적 도메인의 발현으로 진탕플라스크를 사용하는 실험에서 벡터를 단독으로 함유하는 대조군 균주의 0%와 비교하여 2% 스쿠알렌/총 지질을 수득하였다. 본 과정을 반복하였고 발효기를 사용하여 확대시킨다.
시리아 햄스터에서, HMGR 촉매적 도메인의 활성을 AMP-의존성 키나제에 의한 인산화반응에 의해 하향 조절하고(문헌[Omkumar, R.V., Darnay, B.G., and Rodwell, V.W. (1994) J. Biol. Chem. 269:6810-6814]), 유사한 방식의 조절을 사카로마이세스 세레비시아에서 설명하였다. 로도토룰라 글루티누스, 크립토코쿠스 쿠르바투스 및 다른 효모들 내 HMGT 단백질이 유사하게 조절되는지 여부를 결정하고, 만약에 그렇다면, RTDS를 사용하여 인산화반응 자리를 제거한다.
스쿠알렌 합성. 포유류 시스템 내 스쿠알렌 신타제를 HMG-CoA 신타제 및 파르네실 다이포스페이트 신타제와 함께 SREBP(스테롤 조절 요소 결합 단백질(sterol regulatory element binding proteins))에 의해 전사적 수준으로 대등하게 조절한다(문헌[Szkopinsda, A., Swiezewska, E., and Karst, F (2000) Biochem. Biophys. Res. Comm. 267:473-477]). SREBP는 3가지 형태로 존재하며, 그 중 하나는 스쿠알렌 신타제 프로모터와 결합한다. 이러한 전사 인자 및/또는 결합 자리가 R. glutinis, C. curvatus 및 다른 효모 내 스쿠알렌 신타제 프로모터 상에 존재하는지 여부를 결정하고, 만약 존재한다면, RTDS를 사용하여 이러한 전사 인자 및/또는 스쿠알렌 신타제의 전사를 향상시키는 결합 자리로 변경한다.
야로이야 리폴리티카 균주 Polg 내 야로이야 리폴리티카 스쿠알렌 신타제의 과발현으로 진탕플라스크를 사용하여 벡터를 단독으로 함유하는 대조군 균주의 0%와 비교하여 2% 스쿠알렌/총 지질을 수득하였다. 본 과정을 반복하였고 발효기를 사용하여 확대시킨다.
실시예
5.
크립토코쿠스
쿠르바투스에
대한 성장 조건
크립토코쿠스 쿠르바투스 성장을 평가하여 배양물 내 그것의 세포 질량을 최대화하는 최고의 탄소 공급원을 결정하였다. 효모 추출물-기반 풍부 배지(10 g/L 표모 추출물, 20 g/L 펩톤)에서, 크립토코쿠스 쿠르바투스는 2-20% w/v 글루코스 내에서 잘 성장하였고, 16% w/v 글루코스에서 4일 이상 후에 55 g/L 세포 건조 중량(CDW)의 최대 수준을 달성하였다. 유사하게 크립토코쿠스 쿠르바투스를 3-12% w/v 글라이세롤과 함께 동일 배지 내에서 성장시켰고, 5일 후 12% w/v 글라이세롤 중에서 40 g/L의 CDW를 달성하였다. 크립토코쿠스 쿠르바투스를 또한 바이오디젤 글라이세롤(캘리포니아주 코첼라시에 소재한 임페리얼 웨스턴(Imperial Western) 제품) 중에서 3.5% w/v까지 성장시켜, 23 g/L CDW를 초래하였다.
실시예
6.
증가된
스쿠알렌 생성을 위한 표적 유전자의 환경적 조작
환경적 조작을 시험하여 스쿠알렌의 순수율을 증가시킨다. 이것은 (a) 올레산, 올리브 또는 다른 식물성 오일(들), 이노시톨, 콜린, 소라펜, 플루아지폽, 및 클레토딤 또는 다른 ACCase 억제 제초제로 ACCase 발현 및/또는 활성을 억제하는 단계, (b) 터비나핀, 톨나프테이트, 및 에르고스테롤 또는 다른 스쿠알렌 에폭시다제 억제 살진균제로 스쿠알렌 에폭시다제 발현 및/또는 활성을 억제하는 단계, (c) 글라이세롤-기반 배지(출발 배지 또는 증설물(add-in) 내) 내 C/N 비율을 조종하는 단계 , (d) 배지 내 질소 공급원을 변화시키는 단계(유기 대 무기 대 단순/복합), (e) 탄소 첨가 섭생을 변화시키는 단계(예를 들어, 뱃치 대 먹이공급), (f) 탄소 공급원 이외의 영양분을 고갈시킨 효과를 시험하는 단계, (g) 당, 당 알코올, 알코올, 폴리알코올 및 유기산의 혼합물을 포함하는 탄소 공급원을 변화시키는 단계, (h) 로바스타틴 또는 다른 스타틴형 억제제와 같은 HMGR-억제제 화합물 상의 성장을 선택하는 단계, 및 (i) 친유성 염료 또는 염색을 사용하여 및/또는 예를 들어 비중측정 또는 기체 크로마토그래피 방법을 사용하여 추출가능한 지질에 대해 분석함으로써 배양물 내 높은 오일 생성에 대해 선택하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 야로이야 리폴리티카 ATCC 90904를 0 내지 50㎍/㎖ 터비나핀으로 보충한 높은 탄소/질소 비율 배지(C/N = 420, Li, Y-H., 문헌[Liu, B., Zhao, Z-B., and Bai, F-W. 2006 "Optimized Culture Medium and Fermentation Conditions for Lipid Production by Pvhodosporidium toruloides" Chinese Journal of Biotechnology 22(4): 650-656])(본 명세서의 이하에 "CYMOO1 배지")에서 30℃, 300 rpm에서 120 h동안 배양하였다. 12.5㎍/ml 또는 더 높은 농도의 터비나핀은 스쿠알렌으로서 18.5%까지의 총 지질을 초래하였다.
다양한 야로이야 리폴리티카 균주를 ATCC 20688, ATCC 90811, ATCC 90904, ATCC 90812, ATCC MYA-2613, 및 Yeastern polg을 포함하는 지질 및 스쿠알렌 생성을 위해 사용한다. 예를 들어, 야로이야 리폴리티카 균주 polg(Yeastern)를 0 내지 50㎍/㎖ 터비나핀으로 보충한 높은 탄소/질소 비율 배지(C/N = 420, Li, Y-H., 문헌[Liu, B., Zhao, Z-B., and Bai, F-W. 2006 "Optimized Culture Medium and Fermentation Conditions for Lipid Production by Pvhodosporidium toruloides" Chinese Journal of Biotechnology 22(4): 650-656])(본 명세서의 이하에 "CYMOO1 배지")에서 30℃, 300 rpm에서 120 h동안 배양하였다. 12.5㎍/ml 또는 더 높은 농도의 터비나핀은 스쿠알렌으로서 38%까지의 총 지질을 초래하였고, 51%까지의 총 지질/세포 건조 중량의 값을 달성하였다.
다른 예에서, 야로이야 리폴리티카 ATCC 90904를 30 내지 50 ㎍/㎖ 올레산으로 보충한 CYMOO1 배지 중에서 0℃, 300rpm에서 120h 동안 배양하였다.
10㎕/ml 올레산에 의한 보충은 보충이 없는 것에 비해 지질/CDW(세포 건조 중량) 중의 지질 축적을 개선시킨다는 것을 발견하였다.
추가 실시예에서, 야로이야 리폴리티카 ATCC 90904를 0 내지 200 μM 클레토딤으로 보충한 CYMOOl 배지 중에서 30℃, 300 rpm에서 120 h동안 배양하였다. 200 μM 클레토딤의 보충물은 60ml 플라스크 당 스쿠알렌의 수율(㎎)의 60배 증가를 초래하였다.
증가된 산소는 사카로마이세스 세레비시아에서 HMG2의 빠른 분화를 초래하는 HMG1 및 HMG2의 차별적인 조절을 야기하며, 호기성 조건 하에서 HMG1의 발현을 증가시킨다는 것을 나타내었다(문헌[Casey, W.M., Keesler, G.A., Parks, L.W. (1992) J. Bact. 174:7283-7288]). 본 발명자들의 유성의 효모 내 HMGR 유전자의 수가 산소에 의해 영향을 받는지 여부를 결정하고, 만약에 그렇다면, 그것의 발현 및 활성을 산소 수준을 변경함으로써 발효기 내에서 조작한다.
"CYMOO1 배지"(문헌[Li, Y-H., Liu, B., Zhao, Z-B., and Bai, F-W. (2006) Chinese Journal of Biotechnology 22(4):650-656])에서 출발하여, 다양한 성분 및 성분의 농도를 변경하여(새로운 성분의 첨가를 포함) 세포 성장, 총 지질 함량/세포의 질량 단위 %, 및 스쿠알렌/총 지질 %를 개선시킨다. 평가한 배지 성분은 탄소 공급원: 글라이세롤, 글루코스, 질소 공급원: 암모늄 화합물, 나이트레이트, 아미노산, 무기염: 칼륨, 마그네슘, 나트륨, 철, 망간, 아연, 칼슘, 구리, 효모 추출물, 지질 전구체 및 지질 합성 작용자: 터비나핀, 클레토딤, 올레산, 팔미톨산, 리놀레산, 리놀렌산 및 소포제를 포함한다. 평가한 다른 인자들은 접종물%, 경과된 발효 시간, 온도, pH, 배압, 용존 산소(DO), 먹이 조성, 먹이 전략 및 교반 전략을 포함한다.
실시예
7. 균주 선택
전통적인 균주 선택 방법을 유성의 효모 중에서 사용하여 그것의 순 스쿠알렌 생산력을 증가시킨다. UV, 니트로소구아니딘, 또는 에탄 메틸 설포네이트에 의해 돌연변이 시킨 균주를 스크리닝하고 및/또는 증가된 스쿠알렌 축적을 위해 선택한다. 또한 균주는 반복적인 선택 압박, 예컨대 3% 글라이세롤을 함유하는 YEP(15 g/L 효모 추출물, 5 g/L 펩톤) 배지 또는 로바스타틴 및 다른 알려진 HMGR 억제제를 함유하는 배지 상에서 반복된 처리를 받는다. 또한 균주는 CYMOO1에서 반복된 처리를 받는다.
다양한 양의 글라이세롤 및/또는 글루코스를 함유하는 배지 또는 로바스타틴 및/또는 다른 알려진 HMGR 억제제 및/또는 스쿠알렌 신타제 억제제를 함유하는 배지로 증가된 HMGR 및/또는 스쿠알렌 신타제 활성을 갖는 자발적 돌연변이체를 얻는다. 이러한 돌연변이는 HMGR, 스쿠알렌 신타제 또는 다른 유전자("2차 자리 돌연변이")에 있을 수 있다.
달리 한정되지 않는다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에서 예시적으로 설명되는 발명은 본 명세서의 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들 없이 적절하게 실시될 수 있으며, 본 명세서에 구체적으로 개시되어 있지 않다. 따라서 예를 들어, 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(comprising)", "함유하는" 등은 포괄적으로 제한 없이 이해될 것이다. 추가적으로, 본 명세서에서 사용하는 용어 및 표현은 설명에 대해서 제한하지 않고 사용되었고, 제시하고 설명한 특징 또는 그것의 부분의 임의의 동등물을 배제하는 이러한 용어 및 표현을 의도하는 것은 아니지만, 다양한 변형이 청구된 본 발명의 범주 내에서 가능하다는 것이 인식된다.
따라서, 본 발명이 바람직한 구체예에 의해 구체적으로 개시되지만, 개시된 본 명세서 내에 포함되는 본 발명의 선택적 특징, 변형, 개선 및 변화는 당업자에 의해 다시 구분될 수 있고, 이러한 변형, 개선 및 변화는 본 발명의 범주 내인 것으로 고려되는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 제공되는 재료, 방법 및 실시예는 대표적인 바람직한 구체예이고, 예시이며, 본 발명의 범주의 제한으로서 의도되지 않는다.
본 발명은 본 명세서에서 광범위하고 일반적으로 설명되었다. 일반적 개시 내에 속하는 각각의 더 좁은 종 및 하위 속의 그룹화는 본 발명의 부분을 형성한다. 이는 본 발명의 일반적 설명, 또는 조건부로 속(genus)으로부터 임의의 대상 물질을 제거하는 부정적 제한을 포함하며, 없앤 물질이 본 명세서에서 구체적으로 열거되는지 여부와 상관없다.
게다가, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠시(Markush) 그룹에 대해서 설명되는 경우, 당업자는 본 발명이 또한 마쿠시 그룹의 임의의 개개의 구성요소 또는 구성요소의 하위 군에 대해 설명된다는 것을 인식할 것이다.
본 명세서에서 언급되는 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 각각이 참고에 의해 개별적으로 포함되는 것과 동일한 정도로 그것 전체가 참고로써 명백하게 포함된다. 충돌이 있는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 제어할 것이다.
Claims (68)
- 변형되어 증가된 수준의 아이소프레노이드를 생산하는 효모를 포함하는 조성물로서, 상기 효모는 ATCC 20688, ATCC 90811, ATCC 90904, ATCC 90812, ATCC MYA-2613, 또는 이스턴 폴그(Yeastern polg)로 이루어진 군으로부터 선택된 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 균주인 것인 조성물.
- 유전적으로 변환된 또는 비유전적으로 변환된 효모로부터 추출된 아이소프레노이드를 포함하는 조성물로서, 상기 효모는 ATCC 20688, ATCC 90811, ATCC 90904, ATCC 90812, ATCC MYA-2613, 또는 이스턴 폴그로 이루어진 군으로부터 선택된 야로이야 리폴리티카 균주인 것인 조성물.
- 유전적으로 변환된 효모를 포함하는 조성물로서, 상기 유전적으로 변환된 효모는 하나 이상의 설계된 돌연변이를 갖는 하나 이상의 변형된 효모를 발현시키며,
상기 하나 이상의 설계된 돌연변이는 상기 효소 내에서 정해진 위치에 있고,
상기 효모는 천연 효모와 비교하여 증가된 양의 아이소프레노이드를 생산하며,
상기 효모는 ATCC 20688, ATCC 90811, ATCC 90904, ATCC 90812, ATCC MYA-2613, 또는 이스턴 폴그로 이루어진 군으로부터 선택된 야로이야 리폴리티카 균주인 것인 조성물. - 유전적으로 변환된 효모에 의한 스쿠알렌의 생산방법으로서, 상기 방법은
아이소프레노이드 생합성 경로 내에서 하나 이상의 효소의 활성 또는 발현을 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함하되,
상기 효소 활성 또는 발현은 하나 이상의 설계된 돌연변이에 의해 증가되거나 감소되고,
상기 하나 이상의 설계된 돌연변이는 상기 효소 내에서 정해진 위치에 있으며,
상기 유전적으로 변환된 효모는 천연 효모와 비교하여 증가된 양의 아이소프레노이드를 생산하고,
상기 효모는 ATCC 20688, ATCC 90811, ATCC 90904, ATCC 90812, ATCC MYA-2613, 또는 이스턴 폴그로 이루어진 군으로부터 선택된 야로이야 리폴리티카 균주인 것인 스쿠알렌의 생산방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아이소프레노이드는 스쿠알렌인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모는 대응하는 천연 효모와 비교하여 증가된 수준의 스쿠알렌을 생산하는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적으로 변환된 효모는 유성의 효모로부터 유래되는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 효소는 아이소프레노이드 생합성 경로에 있는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 효소는 메발로네이트 키나제, 아세틸-CoA 카복실라제("ACCase"), HMG-CoA 환원효소, 스쿠알렌 에폭시다제, 스쿠알렌 신타제, ATP 시트레이트 리아제, ATP 시트레이트 신타제, 글라이세롤 키나제 및 5-아미노레불리네이트 신타제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 효소는 아세틸-CoA 카복실라제인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 아세틸-CoA 카복실라제는 감소된 활성 또는 발현을 갖는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 또는 발현은 대응하는 천연 효모의 활성 또는 발현의 약 90%; 또는 약 80%; 또는 약 70%; 또는 약 60%; 또는 약 50%; 또는 약 40%; 또는 약 30%; 또는 약 20%; 또는 약 10%; 또는 약 5%로 감소되는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 또는 발현은 대응하는 천연 효모의 활성 또는 발현의 90 내지 95%; 또는 80 내지 90%; 또는 70 내지 80%; 60 내지 70%; 또는 50 내지 60%; 또는 40 내지 50%; 또는 약 30 내지 40%; 또는 약 20 내지 30%; 약 10 내지 20%; 또는 약 5 내지 10%; 또는 약 2 내지 5%로 감소되는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 효소는 HMG-CoA 환원효소인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HMG-CoA 환원효소는 증가된 활성 또는 발현을 갖는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 활성 또는 발현은 대응하는 천연 효모의 활성 또는 발현보다 적어도 1.2배; 또는 1.5배; 또는 2배; 또는 3배; 또는 4배; 또는 5배; 또는 10배; 또는 10배; 또는 20배; 또는 50배; 또는 100배; 또는 1,000배; 또는 10,000배; 또는 100,000배; 또는 1,000,000배 더 크게 증가된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 효소는 스쿠알렌 에폭시다제인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스쿠알렌 에폭시다제는 감소된 활성 또는 발현을 갖는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 활성 또는 발현은 대응하는 천연 효모의 활성 또는 발현의 약 90%; 또는 약 80%; 또는 약 70%; 또는 약 60%; 또는 약 50%; 또는 약 40%; 또는 약 30%; 또는 약 20%; 또는 약 10%; 또는 약 5%로 감소되는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 활성 또는 발현은 대응하는 천연 효모의 활성 또는 발현의 90 내지 95%; 또는 80 내지 90%; 또는 70 내지 80%; 60 내지 70%; 또는 50 내지 60%; 또는 40 내지 50%; 또는 약 30 내지 40%; 또는 약 20 내지 30%; 약 10 내지 20%; 또는 약 5 내지 10%; 또는 약 2 내지 5%인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 효소는 스쿠알렌 신타제 또는 ATP 시트레이트 리아제인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스쿠알렌 신타제 또는 ATP 시트레이트 리아제는 증가된 활성 또는 발현을 갖는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 활성 또는 발현은 대응하는 천연 효모의 활성 또는 발현보다 적어도 1.2배; 또는 1.5배; 또는 2배; 또는 3배; 또는 4배; 또는 5배; 또는 10배; 또는 10배; 또는 20배; 또는 50배; 또는 100배; 또는 1,000배; 또는 10,000배; 또는 100,000배; 또는 1,000,000배 더 크게 증가된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 효소는 메발로네이트 키나제인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제24항에 있어서, 상기 변형된 효소는 야로이야 리폴리티카(Y. lipolytica) 메발로네이트 키나제(Genolevures YALI0B16038g)인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 메발로네이트 키나제는 증가된 활성 또는 발현을 갖는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 또는 발현은 대응하는 천연 효모의 활성 또는 발현보다 적어도 1.2배; 또는 1.5배; 또는 2배; 또는 3배; 또는 4배; 또는 5배; 또는 10배; 또는 10배; 또는 20배; 또는 50배; 또는 100배; 또는 1,000배; 또는 10,000배; 또는 100,000배; 또는 1,000,000배 더 크게 증가된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 효소는 글라이세롤 키나제인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제24항에 있어서, 상기 변형된 효소는 야로이야 리폴리티카(Y. lipolytica) 글라이세롤 키나제(Genolevures YALI0F00484g)인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 글라이세롤 키나제는 증가된 활성 또는 발현을 갖는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 또는 발현은 대응하는 천연 효모의 활성 또는 발현보다 적어도 1.2배; 또는 1.5배; 또는 2배; 또는 3배; 또는 4배; 또는 5배; 또는 10배; 또는 10배; 또는 20배; 또는 50배; 또는 100배; 또는 1,000배; 또는 10,000배; 또는 100,000배; 또는 1,000,000배 더 크게 증가된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 효소는 유전자 수선 올리고핵염기에 의해 돌연변이된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 수선 올리고핵염기는 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드, 비뉴클레오타이드 함유 분자 및 단일 가닥의 올리고데옥시노클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 수선 올리고핵염기는 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드의 RNA형 뉴클레오타이드는 2'-하이드록실을 치환하는 플루오르, 염소 또는 브롬 작용기를 갖는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드의 RNA형 뉴클레오타이드는 2'-0 상의 치환체를 갖는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드는 단지 비치환 포스포다이에스터 결합에 의해서 연결되는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드는 2'-치환된 뉴클레오타이드인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2'-치환된 뉴클레오타이드는 2'-플루오로, 2'-메톡시, 2'-프로필옥시, 2'-알릴옥시, 2'-히드록시에틸옥시, 2'-메톡시에틸옥시, 2'-플루오로프로필옥시 및 2'-트리플루오로프로필옥시 치환된 리보뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2'-치환된 뉴클레오타이드는 2'-플루오로, 2'-메톡시, 2'-메톡시에틸옥시, 및 2'-알릴옥시 치환된 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드는 비치환 포스포다이에스터 결합에 의해 연결된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드는 100개 미만의 뉴클레오타이드이지만 50개 이상의 뉴클레오타이드인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드는 85개 미만의 뉴클레오타이드이지만 50개 이상의 뉴클레오타이드인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드는 링커에 의해 공유적으로 결합된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제44항에 있어서, 상기 링커는 단일 가닥의 헥사, 펜타 또는 테트라뉴클레오타이드이며,
제1 및 제2 가닥은 단일 3' 및 단일 5' 말단을 갖는 단일 올리고뉴클레오타이드 사슬의 절편인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법. - 제45항에 있어서, 상기 3' 및 5' 말단은 헤어핀 캡을 포함하며,
상기 3' 및 5' 말단의 뉴클레오타이드는 인접한 뉴클레오타이드와 왓슨-크릭(Watson-Crick) 쌍인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법. - 제45항에 있어서, 상기 3' 및 5' 말단으로부터 떨어진 제1가닥과 제2가닥 사이의 연결지점(junction)에서 제2 헤어핀 캡을 더 포함하되,
제1가닥과 제2가닥 사이의 왓슨-크릭 쌍은 안정화된 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법. - 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합된 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드의 제1 및 제2가닥은 표적 유전자의 2개 단편과 상동성인 2개의 영역을 함유하는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제3항 내지 제48항 중 어느 한 항의 유전적으로 변환된 효모로부터 추출된 아이소프레노이드를 포함하는 조성물.
- 제49항에 있어서, 상기 아이소프레노이드는 스쿠알렌인 것인 조성물.
- 유전적으로 변환된 또는 비유전적으로 변환된 효모에 의한 스쿠알렌의 생산방법으로서, 상기 방법은
상기 효모를 항진균제와 함께 배양시키는 단계를 포함하는 것인 스쿠알렌의 생산방법. - 유전적으로 변환된 또는 비유전적으로 변환된 효모에 의한 스쿠알렌의 생산방법으로서, 상기 방법은
상기 효모를 항진균제와 함께 배양시키는 단계를 포함하되; 효모는 ATCC 20688, ATCC 90811, ATCC 90904, ATCC 90812, ATCC MYA-2613, 또는 이스턴 폴그로 이루어진 군으로부터 선택된 야로이야 리폴리티카 균주인 것인 스쿠알렌의 생산방법. - 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모는 ATCC 20688, ATCC 90811, ATCC 90904, ATCC 90812, ATCC MYA-2613, 또는 이스턴 폴그로 이루어진 군으로부터 선택된 야로이야 리폴리티카 균주인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모는 야로이야 리폴리티카의 이스턴 폴그 균주인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 본 방법의 효모에 부가되는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 0.5 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 본 방법의 효모에 부가되는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 1 내지 25 ㎍/㎖의 농도로 본 방법의 효모에 부가되는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 10 내지 15 ㎍/㎖의 농도로 본 방법의 효모에 부가되는 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 본 방법의 효모에 부가되며; 상기 항진균제는 알릴아민 항진균제인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 본 방법의 효모에 부가되며; 상기 항진균제는 0.5 내지 100㎍/㎖의 농도인 알릴아민 항진균제인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 본 방법의 효모에 부가되며; 상기 항진균제는 1 내지 25㎍/㎖의 농도인 알릴아민 항진균제인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 본 방법의 효모에 부가되며; 상기 항진균제는 10 내지 15㎍/㎖의 농도인 알릴아민 항진균제인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 본 방법의 효모에 부가되며; 상기 항진균제는 터비나핀인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 본 방법의 효모에 부가되며; 상기 항진균제는 0.5 내지 100㎍/㎖의 농도인 터비나핀인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 본 방법의 효모에 부가되며; 상기 항진균제는 1 내지 25㎍/㎖의 농도인 터비나핀인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 항진균제는 조성물 내에 존재하거나 또는 본 방법의 효모에 부가되며; 상기 항진균제는 10 내지 15㎍/㎖의 농도인 터비나핀인 것인 조성물 또는 스쿠알렌의 생산방법.
- 유전적으로 변환된 또는 비유전적으로 변환된 효모에 의한 스쿠알렌의 생산방법으로서, 상기 방법은
상기 효모를 항진균제와 함께 배양하는 단계를 포함하되; 상기 효모는 야로이야 리폴리티카의 이스턴 폴그 균주이며, 상기 항진균제는 터비나핀인 것인 스쿠알렌의 생산방법. - 유전적으로 변환된 또는 비유전적으로 변환된 효모에 의한 스쿠알렌의 생산방법으로서, 상기 방법은
상기 효모를 항진균제와 함께 배양하는 단계를 포함하되; 상기 효모는 야로이야 리폴리티카의 이스턴 폴그 균주이며, 상기 항진균제는 약 12.5 ㎍/㎖ 또는 초과 농도의 터비나핀인 것인 스쿠알렌의 생산방법.
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|---|---|---|---|---|
| DK3219815T3 (da) * | 2009-11-23 | 2019-12-16 | Cibus Europe Bv | Fremgangsmåder og sammensætninger til at fremstille squalen under anvendelse af gær |
| EP2571991A1 (en) * | 2010-05-20 | 2013-03-27 | Evolva SA | Method of producing isoprenoid compounds in yeast |
| CN103930541A (zh) * | 2011-04-29 | 2014-07-16 | 丹尼斯科美国公司 | 用于增强甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的产量的重组微生物 |
| IL290273B2 (en) * | 2013-03-15 | 2024-03-01 | Cibus Us Llc | Methods and compositions for increasing the efficiency of targeted gene modification through the use of gene repair with oligonucleotides - mediators |
| US9957515B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-05-01 | Cibus Us Llc | Methods and compositions for targeted gene modification |
| GB2518927A (en) * | 2013-05-21 | 2015-04-08 | Univ Swansea | The production of biomolecules using yeast |
| WO2015156369A1 (ja) * | 2014-04-09 | 2015-10-15 | 株式会社Adeka | 変異酵素及び前記変異酵素を用いたテルペノイドの製造方法 |
| WO2016027943A1 (ko) * | 2014-08-21 | 2016-02-25 | 중앙대학교 산학협력단 | rDNA NTS 기반 유전자 다중 삽입 카세트 세트 및 이를 이용한 GRAS 등급의 재조합 효모 균주 |
| CN104560731B (zh) * | 2014-12-26 | 2018-10-09 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种高产角鲨烯的类酵母菌及其应用 |
| WO2017047651A1 (ja) * | 2015-09-18 | 2017-03-23 | 神戸天然物化学株式会社 | 形質転換体、およびテルペノイドの製造方法 |
| ES2925017T3 (es) | 2015-10-29 | 2022-10-13 | Firmenich Incorporated | Edulcorantes de alta intensidad |
| JP7285786B2 (ja) | 2017-05-03 | 2023-06-02 | フィルメニッヒ インコーポレイテッド | 高強度の甘味料の製造方法 |
| CN110452931A (zh) * | 2018-05-08 | 2019-11-15 | 中国科学院微生物研究所 | 一种提高酵母中角鲨烯含量的方法 |
| CN109666683B (zh) * | 2019-02-27 | 2021-10-29 | 昆明理工大学 | 乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2及其应用 |
| CN110607247B (zh) * | 2019-08-15 | 2021-06-08 | 宜昌东阳光生化制药有限公司 | 一种提高酿酒酵母合成角鲨烯能力的方法 |
| CN110628795B (zh) * | 2019-09-30 | 2021-07-16 | 北京市农林科学院 | 以失活的筛选剂抗性基因为报告体系的a·g碱基替换的细胞富集技术及其应用 |
| CN113234610B (zh) * | 2021-03-05 | 2023-06-13 | 江南大学 | 一种合成角鲨烯的酿酒酵母菌株及其应用 |
| CN113444701B (zh) * | 2021-06-30 | 2024-01-30 | 江南大学 | 酿酒酵母内源角鲨烯单加氧酶突变体及应用 |
| CN114058525A (zh) * | 2021-10-29 | 2022-02-18 | 湖北冠众通科技有限公司 | 一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN117487681A (zh) * | 2023-11-16 | 2024-02-02 | 湖南农业大学 | 一种生产角鲨烯的酵母工程菌及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008130372A2 (en) * | 2006-09-28 | 2008-10-30 | Microbia, Inc. | Production of sterols in oleaginous yeast and fungi |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US625586A (en) | 1899-05-23 | Cooking utensil | ||
| US411969A (en) | 1889-10-01 | Apparatus for forming glasses | ||
| JPS5834114B2 (ja) | 1975-04-17 | 1983-07-25 | フジセイユ カブシキガイシヤ | カカオバタ−ダイヨウシノセイゾウホウ |
| US4628033A (en) * | 1983-10-06 | 1986-12-09 | Pfizer Inc. | Novel host strain for transformation of Yarrowia lipolytica |
| US5100792A (en) | 1984-11-13 | 1992-03-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues |
| US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
| US5302523A (en) | 1989-06-21 | 1994-04-12 | Zeneca Limited | Transformation of plant cells |
| US5204253A (en) | 1990-05-29 | 1993-04-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method and apparatus for introducing biological substances into living cells |
| US5460949A (en) | 1990-11-15 | 1995-10-24 | Amoco Corporation | Method and composition for increasing the accumulation of squalene and specific sterols in yeast |
| DE4216134A1 (de) | 1991-06-20 | 1992-12-24 | Europ Lab Molekularbiolog | Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen |
| IT230274Y1 (it) | 1993-06-11 | 1999-06-02 | Silc Spa | Pannolone assorbente sagomato per incontinenza |
| EP0733059B1 (en) | 1993-12-09 | 2000-09-13 | Thomas Jefferson University | Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells |
| ATE244723T1 (de) | 1994-04-27 | 2003-07-15 | Novartis Pharma Gmbh | Nukleoside und oligonukleotide mit 2'- ethergruppen |
| US5780296A (en) | 1995-01-17 | 1998-07-14 | Thomas Jefferson University | Compositions and methods to promote homologous recombination in eukaryotic cells and organisms |
| EP0747484A1 (en) | 1995-06-08 | 1996-12-11 | Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) | Upstream activator sequences and recombinant promoter sequences functional in yarrowia and vectors containing them |
| US5888983A (en) | 1996-05-01 | 1999-03-30 | Thomas Jefferson University | Method and oligonucleobase compounds for curing diseases caused by mutations |
| US5760012A (en) | 1996-05-01 | 1998-06-02 | Thomas Jefferson University | Methods and compounds for curing diseases caused by mutations |
| US5731181A (en) | 1996-06-17 | 1998-03-24 | Thomas Jefferson University | Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides |
| US6524613B1 (en) | 1997-04-30 | 2003-02-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Hepatocellular chimeraplasty |
| WO1998049350A1 (en) | 1997-04-30 | 1998-11-05 | Regents Of The University Of Minnesota | In vivo use of recombinagenic oligonucleobases to correct genetic lesions in hepatocytes |
| CN100419083C (zh) | 1997-08-05 | 2008-09-17 | 金默拉根有限公司 | 用混合双链寡核苷酸在植物中实现定点遗传改变的用途 |
| US6010907A (en) | 1998-05-12 | 2000-01-04 | Kimeragen, Inc. | Eukaryotic use of non-chimeric mutational vectors |
| US6004804A (en) | 1998-05-12 | 1999-12-21 | Kimeragen, Inc. | Non-chimeric mutational vectors |
| US6531303B1 (en) | 1998-07-06 | 2003-03-11 | Arkion Life Sciences Llc | Method of producing geranylgeraniol |
| US6271360B1 (en) | 1999-08-27 | 2001-08-07 | Valigen (Us), Inc. | Single-stranded oligodeoxynucleotide mutational vectors |
| US6822142B2 (en) * | 2001-01-05 | 2004-11-23 | Monsanto Company | Transgenic plants containing altered levels of steroid compounds |
| BRPI0510115B1 (pt) | 2004-05-21 | 2022-09-27 | The Regents Of The University Of California | Método para produzir um isoprenóide ou precursor de isoprenóide através de uma via de mevalonato em escherichia coli e célula hospedeira geneticamente modificada que os produz |
| EP2371967B1 (en) * | 2005-03-18 | 2015-06-03 | DSM IP Assets B.V. | Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi |
| WO2006102755A1 (en) * | 2005-03-30 | 2006-10-05 | National Research Council Of Canada | Identification of a sterol acyltransferase gene |
| US9119132B2 (en) | 2007-10-10 | 2015-08-25 | Qualcomm Incorporated | Efficient system identification schemes for communication systems |
| US8425310B2 (en) | 2008-04-18 | 2013-04-23 | Konami Gaming, Inc. | System and method for tracking patrons non-gaming casino spend |
| KR20110023862A (ko) | 2008-05-23 | 2011-03-08 | 시부스 오일즈, 엘엘씨 | 효모를 사용한 스쿠알렌 생산 |
| CA2735404C (en) * | 2008-08-28 | 2013-04-16 | Novartis Ag | Production of squalene from hyper-producing yeasts |
| DK3219815T3 (da) * | 2009-11-23 | 2019-12-16 | Cibus Europe Bv | Fremgangsmåder og sammensætninger til at fremstille squalen under anvendelse af gær |
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2008130372A2 (en) * | 2006-09-28 | 2008-10-30 | Microbia, Inc. | Production of sterols in oleaginous yeast and fungi |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Molec. gen. Genet. Vol. 154, No. 3, 페이지 269-277 (1977.01.)* * |
Also Published As
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| US11952577B2 (en) | Yarrowia lipolytica yeast strains expressing an HMG-CoA reductase having increased activity or expression | |
| AU2015238919B2 (en) | Production Of Squalene Using Yeast | |
| US20220186267A1 (en) | Biosynthetic Cannabidiol Production In Engineered Microorganisms | |
| JP4803584B2 (ja) | 脂質生産性の高い形質転換微生物 | |
| CN107849586B (zh) | 芳香化合物的生产 |
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