WO2017047651A1 - 形質転換体、およびテルペノイドの製造方法 - Google Patents

形質転換体、およびテルペノイドの製造方法 Download PDF

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WO2017047651A1
WO2017047651A1 PCT/JP2016/077134 JP2016077134W WO2017047651A1 WO 2017047651 A1 WO2017047651 A1 WO 2017047651A1 JP 2016077134 W JP2016077134 W JP 2016077134W WO 2017047651 A1 WO2017047651 A1 WO 2017047651A1
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transformant
rhodotorula
carotenoid
terpenoid
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PCT/JP2016/077134
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基 小島
宗典 鈴木
Original Assignee
神戸天然物化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a transformant and a method for producing a terpenoid using the transformant.
  • Terpenoids also referred to as terpenes or isoprenoids
  • Terpenoids are a group of compounds from which about 40,000 types have been isolated so far from plants and microorganisms, and are the most complex and diverse group of compounds in nature. Terpenoids and their derivatives have been reported to have various physiological activities, and are widely distributed in the market as pharmaceuticals, functional foods, fragrances and the like.
  • Terpenoids have been expected to develop efficient production techniques for terpenoids because of their low abundance in nature and many compounds with complex structures.
  • Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Documents. (See 1-2).
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a novel transformant capable of producing a desired terpenoid, and a method for producing a terpenoid using the transformant. It is to provide.
  • microorganisms belonging to the genus Rhodotorula include species that produce a large amount of fatty acids, steroids, or carotenoids.
  • the present inventors have encoded genes that encode enzymes derived from biological species different from the species (specifically, enzymes that biosynthesize terpenoids or enzymes that use terpenoids as substrates). It is found that terpenoids with various structures (for example, terpenoids with novel structures that have not been known so far) can be efficiently produced by introducing transformants into a transformant.
  • the present invention has been completed.
  • the transformant of the present invention has a microorganism belonging to the genus Rhodotorula, an enzyme that biosynthesizes a terpenoid derived from a species different from the microorganism, or a terpenoid as a substrate. It is characterized in that a gene encoding the enzyme to be introduced is introduced.
  • the method for producing a terpenoid of the present invention comprises a culture step of culturing the transformant of the present invention, and a recovery step of recovering the terpenoid from the transformant obtained in the culture step. It is characterized by having.
  • the transformant according to the present invention produces an effect that terpenoids having various structures can be produced.
  • the terpenoid biosynthesis system can be activated by introducing a gene encoding an enzyme related to terpenoid biosynthesis.
  • FIG. 2 is a diagram showing a reaction catalyzed by ⁇ -amylin synthase derived from glycyrrhilar uralensis in Examples of the present application. It is a figure which shows the result of colony PCR in the Example of this application. It is a figure which shows the detection result of mRNA in the Example of this application. It is a figure which shows the analysis result by GC-MS in the Example of this application. It is a figure which shows the reaction catalyzed by the lupeol synthase derived from glycyrrhilar uralensis in the Example of this application. It is a figure which shows the result of colony PCR in the Example of this application. It is a figure which shows the detection result of mRNA in the Example of this application. It is a figure which shows the analysis result by GC-MS in the Example of this application.
  • the term “gene” is used interchangeably with “polynucleotide”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • the gene can be in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA) or RNA (eg, mRNA).
  • DNA or RNA may be double-stranded or single-stranded.
  • Single-stranded DNA or single-stranded RNA may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand).
  • the gene may be chemically synthesized, or may have a modified codon usage so that expression of the encoded protein is improved.
  • terpenoid refers to geranyl diphosphate (also referred to as GDP or GPP) (including various isomers of GPP), farnesyl diphosphate (FDP,) due to the catalytic activity of terpenoid biosynthetic enzymes.
  • C x H y O z also referred to as FPP
  • FPP farnesyl diphosphate
  • GGDP geranylgeranyl diphosphate
  • GGPP geranylgeranyl diphosphate
  • GGPP geranylgeranyl diphosphate
  • a compound with a reduction in the number of carbon atoms or a modification such as oxidation is intended.
  • a dehydration reaction or the like may be carried out by an in vivo enzyme reaction such as cyclization of a substrate due to the catalytic activity of a terpenoid, oxidation, hydroxylation, and the accompanying non-enzymatic reaction, but is not limited thereto.
  • Terpenoids can take any form, acyclic, monocyclic or polycyclic, but in common have a terpenoid basic skeleton. Accordingly, any compound having a terpenoid basic skeleton is encompassed by the concept of terpenoid herein.
  • microorganisms belonging to the genus Rhodotorula have species that produce a large amount of fatty acids, steroids, or carotenoids. That is, these species contain a large amount of fatty acids, steroids, carotenoids, and metabolites thereof (for example, compounds that are precursors thereof and / or compounds that are synthesized therefrom).
  • a desired enzyme derived from a biological species different from the microorganism is expressed in these microorganisms, so that the enzyme comes into contact with a large amount of substrate.
  • the present invention can produce a large amount of a desired terpenoid (for example, a terpenoid having a novel structure).
  • the amount of the terpenoid contained in 1 g of bacterial cells is higher when the transformant of the present invention is cultured using a liquid medium than when cultured using a solid medium.
  • the culture scale of the transformant (in other words, the terpenoid production scale) can be easily adjusted to a desired scale.
  • the culture scale of the transformant can be easily increased.
  • the transformant can be continuously cultured in liquid culture, terpenoids can be produced continuously and in large quantities.
  • the amount of terpenoid contained in 1 g of bacterial cells is higher when the transformant of the present invention is cultured using a liquid medium than when cultured using a solid medium. This indicates that the transformant of the present invention does not require an excessive amount of oxygen in its own growth or terpenoid production.
  • the culture apparatus for the transformant can be made inexpensive (in other words, the terpenoid can be produced at a low cost).
  • metabolic pathways that did not originally exist in microorganisms for example, metabolic pathways for synthesizing terpenoids, metabolic pathways for modifying terpenoids (for example, functional groups), or converting terpenoids to other compounds
  • a microorganism capable of producing a desired terpenoid in a large amount by artificially constructing a metabolic pathway in the microorganism or by further improving the metabolic pathway originally present in the microorganism. it can.
  • the microorganism into which the gene is introduced (in other words, the host) may be at least one, at least two, or three microorganisms with high production ability selected from the group consisting of fatty acids, steroids, and carotenoids. Good. More specifically, the microorganism into which the gene is introduced may be a microorganism having a high production capacity for fatty acids and steroids, or a microorganism having a high production capacity for carotenoids.
  • the microorganism having a high fatty acid production capacity means that the amount of fatty acid contained in 1 g of dry cells is 100 mg or more, preferably 110 mg or more when measured by the method described in ⁇ 1> of the Examples of the present application. , More preferably 120 mg or more, more preferably 130 mg or more, more preferably 140 mg or more, more preferably 150 mg or more, more preferably 160 mg or more, and most preferably 170 mg or more.
  • the upper limit of the amount of fatty acid contained in 1 g of dry cells is not particularly limited, and may be, for example, 500 mg, 300 mg, or 200 mg.
  • the microorganism having high steroid production ability means that the amount of steroid contained in 1 g of dried microbial cells is 50 mg or more, more preferably 60 mg when measured by the method described in ⁇ 1> of the Examples of the present application. As mentioned above, a microorganism of 70 mg or more, more preferably 80 mg or more, and most preferably 90 mg or more is contemplated.
  • the upper limit value of the amount of steroid contained in 1 g of dry cells is not particularly limited, and may be, for example, 500 mg, 300 mg, 200 mg, or 100 mg.
  • the microorganism having a high carotenoid production capacity means that the amount of carotenoid contained in 1 g of dry cells is 5 mg or more, preferably 6 mg or more when measured by the method described in ⁇ 1> of the Examples of the present application. , More preferably 7 mg or more, more preferably 8 mg or more, more preferably 9 mg or more, most preferably 10 mg or more.
  • the upper limit of the amount of carotenoid contained in 1 g of dry cells is not particularly limited, and may be, for example, 500 mg, 300 mg, 200 mg, 100 mg, or 50 mg.
  • microorganisms into which genes are introduced include microorganisms belonging to the genus Rhodotorula.
  • Rhodotorula include Rhodotorula aurantiaca, Rhodotorula acheniorum, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula ⁇ ⁇ acuta, Rhodotorula (Rhodotorula araucariae), Rhodotorula armeniaca, Rhodotorula aurantiaca, Rhodotorula auriculariae, Rhodotorula RRautruum, Rhodotorula Rhod Biodotei (Rhodotorula biourgei), Rhodotorula bogoriensis, Rhodotorula bronchialis, Rhodotorula ⁇ fonchialis (Rhodotorula biourgei) buffonii), Rhodotorula calyptogenae
  • Rhodotorula aurantiaca or Rhodotorula glutinis is preferable. The reason is that these microorganisms produce higher amounts of fatty acids, steroids, or carotenoids than other microorganisms.
  • the microorganisms described above are available from the following institutions. That is, (1) PYCC (Portuguese Yeast Culture Collection), (2) NBRC NITE Biological Resource Center, (3) CBS CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre (An institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and SBC) Bioresource Collection and Research Center, (5) DBVPG (Industrial Yeasts Collection), (6) DSM DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (7) JCM (Japan Collection of Microorganisms), (8) KCture (s) ), (9) MUCL ((Agro) industrial fungi & yeasts collection), (10) NRRL (ARS Culture Collection), (11) CCTCC (China for Type Culture Collection), (12) ATCC (American Type Culture Collection) , (13) CECT (Spanish Type Culture Collection), (14) RIFY Research Institute of er Fermentation, (15) VKM All-Russian Collection of Micr oorganisms, (16) IGC Center of Biology, Gulbenki
  • the transformant of the present embodiment expresses an enzyme that biosynthesizes a terpenoid or an enzyme that uses a terpenoid as a substrate, derived from a biological species different from the host microorganism. That is, the transformant of the present embodiment expresses an enzyme that biosynthesizes terpenoids or an enzyme that uses terpenoids as a substrate, which is derived from a microorganism that does not belong to the genus Rhodotorula.
  • the enzyme is preferably one that catalyzes a reaction in which the enzyme originally present in the host did not catalyze.
  • a desired terpenoid for example, novel terpenoid
  • an enzyme having the same enzyme activity as an enzyme present in the host and derived from a species different from the host microorganism for example, an enzyme that biosynthesizes a terpenoid or an enzyme that uses a terpenoid as a substrate
  • the species different from the host microorganism is not particularly limited, and may be bacteria, yeast, filamentous fungi, algae, insects, plants, or animals.
  • Monoterpenoid as a substrate is not particularly limited, and examples thereof include myrcene, linalool, nerol, limonene, carvone, ⁇ -pinene, menthane, menthol, geraniol, citronellol, citronellal, citral, citronellyl acetate, geranyl acetate, linalyl. Mention may be made of acetate and camphor.
  • the sesquiterpenoid used as a substrate is not particularly limited, and examples thereof include amorphadiene, germacren, elemen, eudesmen, guayen, himacaren, eudesmol, farnesol, kazinene, humulene, nootkaton, cedrol, guaiazulene, vernorepine, ptacroside, periplanone, Mention may be made of abscisic acid and gossypol.
  • the diterpenoid used as a substrate is not particularly limited, and examples thereof include retinol, retinal, ⁇ -tocophenol, phytol, abietic acid, gibberellin, ingenol, abietadiene, taxadiene, and momilactone.
  • the triterpenoid used as a substrate is not particularly limited and includes steroids. Examples thereof include squalene, umbrain, ergosterol, lanosterol, cholesterol, 7-dehydrocholesterol, cholecalciferol, oleanol, boswellic acid, ⁇ -sitosterol, campester. Mention may be made of sterol, stigmasterol, brassicasterol, ⁇ -amylin, ⁇ -amylin, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid, lupeol and ganoderic acid.
  • the carotenoid used as a substrate is not particularly limited, and examples thereof include carotenes (for example, ⁇ -carotene, ⁇ -carotene, ⁇ -carotene, and ⁇ -carotene), lycopene, tolylene, and xanthophylls (for example, lutein, zeaxanthin, canthaxanthin). , Fucoxanthin, astaxanthin, anthaxanthin, and violaxanthin).
  • the enzyme that biosynthesizes the terpenoid or the enzyme that uses the terpenoid as a substrate are not particularly limited, and examples thereof include carotenoid ketolase (crtW or crtO), carotenoid cyclase, mono Mention may be made of terpenoid synthase, sesquiterpenoid synthase, diterpenoid synthase and triterpenoid synthase.
  • carotenoid ketolase crtW or crtO
  • carotenoid cyclase carotenoid cyclase
  • an enzyme that biosynthesizes the terpenoid or an enzyme that uses a terpenoid as a substrate carotenoid dioxygenase, carotenoid hydroxylase, carotenoid oxygenase, carotenoid desaturase, carotenoid methyltransferase, carotenoid hydratase, carotenoid oxidoreductase, Carotenoid isomerase, carotenoid glycosyltransferase, carotenoid epoxidase, carotenoid deepoxidase, carotenoid dehydrogenase, monoterpenoid dioxygenase, monoterpenoid hydroxylase, monoterpenoid oxygenase, monoterpenoid desaturase, monoterpenoid methyltransferase, monoterpenoid hydratase Monoterpenoid oxidoreductase, monoterpenoid isomerase, monoter
  • the carotenoid ketolase includes, for example, a protein comprising the protein shown in any of the following (a) to (c), or a protein shown in any of the following (a) to (c) It may be a protein containing: (A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; or (B) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having carotenoid ketolase activity. (C) an amino acid having 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A protein comprising a sequence and having carotenoid ketolase activity.
  • a protein has carotenoid ketolase activity can be confirmed by a known method. For example, after contacting a desired protein with a substrate, the infrared spectrum or nuclear magnetic resonance spectrum of the substrate is analyzed, and if it is confirmed that “—CO—” is introduced into the substrate, the protein is carotenoid ketone. It can be determined that it has tolase activity. Alternatively, after contacting a desired protein and a substrate, the substrate and a control substance (a substance in which “-CO-” is introduced into the substrate) are separated by chromatography, and in the separation process, the substrate is separated. Can be determined to have carotenoid ketolase activity if the control substance and the control substance behave the same (for example, are eluted in the same eluate).
  • the carotenoid cyclase includes, for example, a protein comprising any of the following proteins (d) to (f) or a protein represented by any of the following (d) to (f): It may be a protein containing: (D) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7; or (E) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and having carotenoid cyclase activity.
  • a protein comprising a sequence and having carotenoid cyclase activity.
  • the monoterpenoid synthase includes, for example, a protein comprising a protein shown in any of the following (g) to (i) or a protein shown in any of the following (g) to (i) It may be a protein containing: (G) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9; or (H) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and having monoterpenoid synthase activity.
  • the sesquiterpenoid synthase includes, for example, a protein consisting of a protein shown in any one of the following (j) to (l) or a protein shown in any one of the following (j) to (l) It may be a protein containing: (J) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11; or (K) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and having sesquiterpenoid synthase activity.
  • a protein comprising a sequence and having sesquiterpenoid synthase activity.
  • the diterpenoid synthase includes, for example, a protein consisting of a protein shown in any of the following (m) to (o) or a protein shown in any of the following (m) to (o) as at least a part. It may be a protein: (M) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13; or (N) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, and having diterpenoid synthase activity.
  • amino acid having 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • a protein comprising a sequence and having diterpenoid synthase activity.
  • the triterpenoid synthase includes, for example, a protein comprising a protein shown in any of the following (p) to (r) or a protein shown in any of the following (p) to (r) as at least a part thereof It may be a protein: (P) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15; or (Q) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, and having triterpenoid synthase activity.
  • a protein comprising a sequence and having triterpenoid synthase activity.
  • Whether a protein has carotenoid cyclase activity, monoterpenoid synthase activity, sesquiterpenoid synthase activity, diterpenoid synthase activity, or triterpenoid synthase activity can be confirmed by a known method. For example, after contacting a desired protein with a substrate, an infrared spectrum or a nuclear magnetic resonance spectrum of the substrate is obtained, and these spectra are compared with an infrared spectrum or a nuclear magnetic resonance spectrum of a control substance. Can be confirmed.
  • the substrate and a control substance are separated by chromatography, and in the separation process, the substrate is separated.
  • the control substance behave the same (eg, eluted in the same eluate), the protein is carotenoid cyclase activity, monoterpenoid synthase activity, sesquiterpenoid synthase activity, diterpenoid synthase activity, or triterpenoid synthase activity. It can be determined that the
  • amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted or added the position where the deletion, substitution or addition occurs is not particularly limited.
  • the number of amino acids intended by “one or several amino acids” is not particularly limited, but is within 20 pieces, within 19 pieces, within 18 pieces, within 17 pieces, within 16 pieces, within 15 pieces, within 14 pieces, Less than 13, Less than 12, Less than 11, Less than 10, Less than 9, Less than 8, Less than 7, Less than 6, Less than 5, Less than 4, Less than 3, Less than 2, or It can be a single amino acid.
  • the amino acid substitution is preferably a conservative substitution.
  • the conservative substitution means that a specific amino acid is substituted with another amino acid having the same chemical properties and / or structure as the amino acid.
  • Chemical properties include, for example, hydrophobicity (hydrophobic and hydrophilic), charge (neutral, acidic and basic).
  • Examples of the structure include an aromatic ring, an aliphatic hydrocarbon group, and a carboxyl group that exist as a side chain or a functional group of the side chain.
  • conservative substitutions include, for example, substitution of serine and threonine, substitution of lysine and arginine, and substitution of phenylalanine and tryptophanamino.
  • substitutions include, for example, substitution of serine and threonine, substitution of lysine and arginine, and substitution of phenylalanine and tryptophanamino.
  • the present invention is not limited to these substitutions.
  • the homology of amino acid sequences can be determined using BLASTN (nucleic acid level) and BLASTX (amino acid level) programs (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). it can.
  • the program is based on the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul. Yes.
  • the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).
  • the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known.
  • addition or deletion for example, a gap may be allowed.
  • the carotenoid ketolase is, for example, a protein comprising a protein encoded by a gene comprising the following polynucleotide (A) or (B), or the following poly (A) or (B) It may be a protein containing at least a part of a protein encoded by a gene consisting of nucleotides: (A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2; or (B) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and encodes a protein having carotenoid ketolase activity .
  • the carotenoid cyclase is, for example, a protein consisting of a protein encoded by a gene consisting of the following polynucleotide (C) or (D), or a gene consisting of the following polynucleotide (C) or (D): It may be a protein comprising at least part of the encoded protein: (C) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 8; or (D) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 and which encodes a protein having carotenoid cyclase activity .
  • the monoterpenoid synthase is, for example, a protein consisting of a protein encoded by a gene consisting of the following polynucleotide (E) or (F), or a gene consisting of the following polynucleotide (E) or (F): It may be a protein comprising at least part of the encoded protein: (E) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 10; or (F) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 and encodes a protein having monoterpenoid synthase activity .
  • the sesquiterpenoid synthase is, for example, a protein consisting of a protein encoded by a gene consisting of the following polynucleotide (G) or (H), or a gene consisting of the following (G) or (H) polynucleotide: It may be a protein comprising at least part of the encoded protein: (G) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 12; or (H) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 and encodes a protein having sesquiterpenoid synthase activity .
  • the diterpenoid synthase is encoded by, for example, a protein consisting of a protein encoded by a gene consisting of the following polynucleotide (I) or (J), or a gene consisting of the following polynucleotide (I) or (J): It may be a protein comprising at least a portion of a protein to be: (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 14; or (J) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 and encodes a protein having diterpenoid synthase activity.
  • the triterpenoid synthase is encoded by, for example, a protein consisting of a protein encoded by a gene consisting of the following (K) or (L) polynucleotide, or a gene consisting of the following (K) or (L) polynucleotide: It may be a protein comprising at least a portion of a protein to be: (K) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 16; or (L) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and encodes a protein having triterpenoid synthase activity.
  • stringent conditions refers to conditions under which double-stranded polynucleotides specific to so-called base sequences are formed and non-specific double-stranded polynucleotides are not formed.
  • Tm value melting temperature
  • the temperature is 60 to 68 ° C., preferably 65 ° C., more preferably in a buffer solution consisting of 0.25 M Na 2 HPO 4 , pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA, 1 ⁇ Denhardt's solution. Is hybridized at 68 ° C. for 16 to 24 hours, and further in a buffer solution comprising 20 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2, 1% SDS, 1 mM EDTA at a temperature of 60 to 68 ° C., preferably 65 ° C. More preferably, there may be mentioned conditions in which washing is performed twice for 15 minutes under the condition of 68 ° C.
  • Other examples include 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4 ⁇ SSC (sodium chloride / sodium citrate), 50 mM Hepes pH 7.0, 10 ⁇ Denhardt's solution, 20 ⁇ g / mL denatured salmon sperm DNA After prehybridization is performed overnight in a hybridization solution at 42 ° C, a labeled probe is added, and hybridization is performed by incubating at 42 ° C overnight.
  • the cleaning solution and temperature conditions in the subsequent cleaning are about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”, and more severe conditions are about “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”.
  • the transformant of the present embodiment introduces a gene encoding an enzyme that biosynthesizes a terpenoid or an enzyme that uses a terpenoid as a substrate, derived from a species different from the microorganism into a specific microorganism. Can be made.
  • vectors for transforming microorganisms belonging to the genus Rhodotorula have not been known.
  • an operon obtained by linking a promoter gene, a gene encoding an enzyme, and a terminator gene is inserted into a pUC118 vector (manufactured by Takara Bio Inc.), and then only the operon is amplified by the PCR method. .
  • a desired transformant can be obtained by introducing the operon into a microorganism belonging to the genus Rhodotorula.
  • the present invention can also be configured as follows.
  • the transformant of the present invention is an enzyme that biosynthesizes a terpenoid derived from a species different from the microorganism, or a terpenoid, derived from a microorganism belonging to the genus Rhodotorula. It is characterized in that a gene encoding an enzyme having a substrate as a substrate is introduced.
  • the terpenoid is preferably a monoterpenoid, a sesquiterpenoid, a diterpenoid, a triterpenoid, or a carotenoid.
  • the enzyme is preferably carotenoid ketolase, carotenoid cyclase, monoterpenoid synthase, sesquiterpenoid synthase, diterpenoid synthase, or triterpenoid synthase.
  • the terpenoid production method of the present embodiment includes a culture step for culturing the transformant of the present invention and a recovery step for recovering the terpenoid from the transformant obtained in the culture step. Since the transformant of the present invention has already been described, the description thereof is omitted here.
  • the transformant may be cultured using a solid medium (solid culture) or may be cultured using a liquid medium (liquid culture).
  • solid culture solid culture
  • liquid medium liquid culture
  • cultivation using a liquid medium the production amount of a terpenoid can be raised dramatically by culturing a transformant continuously.
  • the medium used for the culture step, the culture temperature, and the culture time can be appropriately selected depending on the host.
  • Examples of the medium include F medium and YPD medium, but the present invention is not limited to these mediums.
  • Examples of the culture temperature include 15 to 48 ° C. or 26 to 37 ° C., but the present invention is not limited to these culture temperatures.
  • Examples of the culture time include 12 to 120 hours, 72 to 96 hours, or 96 hours or more, but the present invention is not limited to these culture times.
  • the terpenoid production method of the present embodiment has a recovery step of recovering the terpenoid from the transformant obtained in the culture step after the above-described culture step.
  • the recovery process may be a process including an extraction process and / or a purification process described below.
  • the terpenoid production method of the present embodiment may have an extraction step for extracting the terpenoid from the transformant after the above-described culture step. If it is the said structure, a highly purified terpenoid can be acquired.
  • the transformant is brought into contact with an organic solvent, and the terpenoid produced by the transformant is transferred into the organic solvent. And terpenoid can be collect
  • terpenoids can be supercritically extracted using carbon dioxide, methanol, water, and the like.
  • the medium containing the transformant and the organic solvent may be mixed, or the medium containing the transformant is centrifuged to recover the transformant. After suspending the transformant in water, the water and an organic solvent may be mixed. From the viewpoint of obtaining a terpenoid with higher purity, the medium containing the transformant is centrifuged to collect the transformant, and the transformant is suspended in water. It is preferable to mix.
  • the type of the organic solvent described above may be appropriately selected according to the type of terpenoid.
  • the organic solvent include n-pentane, n-hexane, ethyl acetate, benzene, toluene, diethyl ether, diisopropyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, ethyl methyl ketone, acetone, methanol, ethanol, propanol, butanol, dimethyl sulfoxide.
  • Chloroform, dichloromethane, carbon tetrachloride, acetonitrile, or pyridine may be used alone, or at least two of these solvents may be used in combination.
  • the terpenoid production method of the present embodiment may have a purification step of purifying the terpenoid contained in the extract by chromatography after the above-described extraction step. If it is the said structure, terpenoid with still higher purity can be acquired.
  • Examples of the carrier used for separation include silica gel, silver nitrate-added silica gel, octadecyldimethylsilyl-modified silica gel, dimethylsilyl-modified silica gel, octyldimethylsilyl-modified silica gel, propylamino-modified silica gel, cyanopropyl-modified silica gel, and phenyl-modified silica gel.
  • Examples include, but are not limited to, various chemically modified silica gels such as alumina, activated carbon and the like.
  • the present invention can also be configured as follows.
  • the method for producing a terpenoid of the present invention includes a culture step for culturing the transformant of the present invention and a recovery for recovering the terpenoid from the transformant obtained in the culture step in order to solve the above-mentioned problems. And a process.
  • the transformant is preferably subjected to liquid culture in the culture step.
  • microorganisms that produce large amounts of fatty acids, steroids, and carotenoids> Various microorganisms (for example, microorganisms belonging to the genus Rhodotorula (specifically Rhodotorula Aurantica, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula achenioram), Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Rhodospori) Rhodosporidium toruloides and Cryptococcus albidas) were each cultured in F medium for 120 hours at 25 ° C.
  • Rhodotorula specifically Rhodotorula Aurantica, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula achenioram
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Yarrowia lipolytica Rhodospori
  • Rhodospori Rhodosporidium to
  • Rhodotorula Aurantia is purchased from NBRC (NITE Biological Resource Center)
  • Rhodotorula Gurchinis is purchased from NBRC (NITE Biological Resource Center)
  • Rhodotorula Akeniola is from NBRC (NITE Rhodos was purchased from Biological Resource Center
  • Saccharomyces Servisia was purchased from NBRC (NITE Biological Resource Center)
  • Yarovia Ripolitica was purchased from NBRC (NITE Biological Resource Center).
  • Polydium toluroides was purchased from NBRC (NITE Biological Resource Center)
  • Cryptococcus alvidus was purchased from NBRC (NITE Biological Resource Center).
  • each bacterial cell was collected by centrifugation, and the collected bacterial cells were dried. Thereafter, the amounts of fatty acids, steroids and carotenoids contained in 1 g of dried cells are determined by a well-known method (for example, the Japan Biochemical Society: New Chemistry Experiment Course 4, Lipid II Phospholipid, Tokyo Kagaku Dojin (1991), and The Biochemical Society of Japan: Basic Biochemical Experiments, Volume 5, Lipids, carbohydrates, complex carbohydrates, see Tokyo Kagaku Dojin (2000)). The measurement results are shown in Table 1 below.
  • the specific base sequence of the carotenoid ketolase gene derived from a microorganism belonging to the genus Brevandimonas is represented by SEQ ID NO: 2, and the specific amino acid sequence of the carotenoid ketolase encoded by the gene is represented by SEQ ID NO: 1. Show.
  • FIG. 4 shows a reaction catalyzed by a carotenoid ketolase derived from a microorganism belonging to the genus Brevundimonas.
  • carotenoid ketolase (crtW) derived from a microorganism belonging to the genus Brevandimonas is considered to introduce a keto group into ⁇ -carotene which is a substrate.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the hygromycin resistance gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the hygromycin resistance gene.
  • the expression of the hygromycin resistance gene is controlled by the GPD promoter.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the carotenoid ketolase gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the carotenoid ketolase gene.
  • the expression of the carotenoid ketolase gene is controlled by the GPD promoter.
  • the vector 1 described above was introduced into a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum).
  • Rhodotorula a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum). The introduction method will be described below.
  • the microorganism was cultured for 2 to 3 days in 50 mL of YPD liquid medium (composition: 20 g of Bacto peptone, 10 g of Yeast extract, and 50 mL of 40% glucose solution per liter of YPD liquid medium). .
  • a part of the cultured microorganism was added to 50 mL of fresh YPD liquid medium and cultured at 20 to 28 ° C. for 24 hours. After culturing, the grown microorganisms were collected by centrifugation. The collected microorganisms were suspended in sterilized distilled water and washed, and then the microorganisms were collected by centrifugation.
  • the collected microorganisms were suspended in 1 mL of 0.1 M LiAc solution. 50 ⁇ L of a LiAc solution containing microorganisms was collected, and 171 ⁇ L of 70% PEG # 4000 solution, 69 ⁇ L of sterilized distilled water, 15 ⁇ L of 2M LiAc solution, Carrier DNA solution (2 mg-Carrier DMA / mL) ) A mixture of 15 ⁇ L and 110 ⁇ g of vector was added.
  • the mixed solution was allowed to stand at 20 to 28 ° C. for several hours, and then heat shock was applied to the mixed solution at 30 to 40 ° C. for 5 minutes.
  • Microorganisms were collected from the mixed solution after applying heat shock by centrifugation, and the microorganisms were cultured in a YPD liquid medium for several hours. The cultured microorganism was recovered by centrifugation, and the microorganism was cultured on a YPD solid medium containing hygromycin.
  • FIG. 1 shows the results of colony PCR.
  • the left photograph shows the detection result of the carotenoid ketolase gene
  • the right photograph shows the detection result of the hygromycin resistance gene.
  • M corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” corresponds to a positive control
  • “2” to “8” correspond to each transformant.
  • the transformants “2” to “8” are also referred to as “Whyg1” to “Whyg7”.
  • Each of the transformants corresponding to “2” to “8” described above was added to 100 mL of F medium (composition: 40 g glucose, 1 g F medium, 0.5 g (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O to 0.5g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O and 0.1 g, the NaCl 0.1 g, and comprising 1.5g of Yeast the Extract, was inoculated into pH 5.5) .
  • F medium composition: 40 g glucose, 1 g F medium, 0.5 g (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O to 0.5g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O and 0.1 g, the NaCl 0.1 g, and comprising 1.5g of Yeast the Extract, was inoculated into pH 5.5
  • the transformant was cultured at 25 ° C. and 180 rpm for 3 days, and then the transformant was recovered by centrifugation.
  • RNA extraction kit ISOGEN II manufactured by Nippon Gene
  • PCR was performed using the above cDNA as a template, and it was confirmed whether mRNA was expressed from the hygromycin resistance gene and the carotenoid ketolase gene introduced into each transformant.
  • the primer set 1 or the primer set 2 described above was used as a primer, and the same reaction conditions as those employed in the colony PCR method were used as reaction conditions.
  • Figure 2 shows the test results.
  • the left photograph shows the detection result of mRNA expressed from the carotenoid ketolase gene
  • the right photograph shows the detection result of mRNA expressed from the hygromycin resistance gene.
  • M corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” to “7” correspond to transformants “Whyg1” to “Whyg7”, and “8” denotes a positive control.
  • “9” corresponds to a carotenoid ketolase gene and a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum) into which a hygromycin resistance gene has not been introduced.
  • F medium specifically, liquid F medium (in other words, liquid medium) or solid F medium (in other words, solid medium)
  • F medium specifically, liquid F medium (in other words, liquid medium) or solid F medium (in other words, solid medium)
  • Each grown microorganism was recovered by centrifugation.
  • To 1 g (wet weight) of the collected microorganisms (a) 1 mL of distilled water or an organic solvent is added, and (b) 5 mL of 3% Pyrogallol-MeOH solution and (c) 1 mL of 60% KOH solution Then, the mixed solution was heated to 70 ° C. for 30 minutes. To the mixed solution after heating, (d) 11 mL of 1% NaCl solution was further added.
  • F medium specifically, liquid F medium (in other words, liquid medium) or solid F medium (in other words, solid medium)
  • the organic solvent was added to the mixed solution and stirred, and then allowed to stand, and the organic solvent layer separated from the water layer was recovered. Furthermore, the organic solvent was added again to the remaining water layer and stirred, and then allowed to stand, and the organic solvent layer separated from the water layer was recovered.
  • the collected two organic solvent layers were combined into one, and the organic solvent was evaporated under reduced pressure to collect the residue.
  • the residue was dissolved in 2 mL of an organic solvent (a mixed solution of 1 mL of benzene and 1 mL of 3% Pyrogallol-MeOH solution).
  • the cells of the transformant had a deeper red color than the cells of the microorganism belonging to the genus Rhodotorula. Further, when a solution obtained by dissolving the residue obtained in the extraction operation in an organic solvent was confirmed, the solution derived from the transformant had a deeper red color than the solution derived from the microorganism belonging to the genus Rhodotorula of the wild type. Was presenting. These phenomena were confirmed both when a liquid medium was used and when a solid medium was used. These facts suggest that the transformant produced carotenoids among terpenoids.
  • an elution solvent As an elution solvent, an elution solvent containing solvent A, solvent B, and solvent C in a desired ratio was used, and the elution operation was performed while changing the ratio of each solvent contained in the elution solvent over time.
  • solvent A water
  • Solvent B methanol
  • Solvent C acetone
  • Table 2 shows the change over time (gradient elution program) of the ratio (%) of solvent A to solvent C contained in the elution solvent.
  • FIG. 3 the analysis result by HPLC regarding the component contained in the residue is shown. Further, based on the detected 450 nm (VIS), the following A value to F value were calculated as ⁇ -carotene equivalent amounts. The results are shown in Table 3.
  • a value total amount of all carotenoids contained per 1 g of wet cells [mg / g-FW]
  • B value the total amount of all carotenoids contained per 1 g of dry cells [mg / g-DCW]
  • C value the total amount of all carotenoids contained per liter of medium [mg / L]
  • D value amount of ⁇ -carotene and ⁇ -carotene isomer contained in 1 g of wet cells [mg / g-FW]
  • E value the amount [mg / g-FW] of the target carotenoid (“oxide” in FIG.
  • F value conversion rate [%] from ⁇ -carotene and isomers of ⁇ -carotene to the desired carotenoid (“canthaxanthin” and “oxide” in FIG. 3).
  • the peak corresponding to carotenoid detected when analyzing residues derived from transformants cultured in a liquid medium is detected when analyzing residues derived from transformants cultured in a solid medium. It was higher than the peak corresponding to. This indicates that a transformant cultured in a liquid medium can produce more carotenoids than a transformant cultured in a solid medium.
  • the peaks considered to correspond to the isomers of ⁇ -carotene and ⁇ -carotene detected when analyzing residues derived from transformants cultured in a liquid medium are derived from wild strains cultured under the same conditions. It was higher compared to the peaks thought to correspond to the ⁇ -carotene and ⁇ -carotene isomers detected when the residue was analyzed. This means that a transformant cultured in a liquid medium can produce more ⁇ -carotene and ⁇ -carotene isomers compared to a wild strain cultured under the same conditions (in other words, It is possible to activate the synthetic pathway of terpenoids).
  • the specific nucleotide sequence of the carotenoid cyclase gene derived from Pantoea ananatis is represented by SEQ ID NO: 8, and the specific amino acid sequence of the carotenoid cyclase encoded by the gene is represented by SEQ ID NO: 7. Show.
  • FIG. 4 shows a reaction catalyzed by a carotenoid cyclase derived from Pantoea ananatis.
  • carotenoid cyclase (crtY) derived from Pantoea ananatis is thought to cyclize lycopene as a substrate.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the hygromycin resistance gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the hygromycin resistance gene.
  • the expression of the hygromycin resistance gene is controlled by the GPD promoter.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the carotenoid cyclase gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the carotenoid cyclase gene.
  • the expression of the carotenoid cyclase gene is controlled by the GPD promoter.
  • the vector 2 described above was introduced into a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum).
  • Rhodotorula a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum). The introduction method will be described below.
  • the microorganism was cultured for 2 to 3 days in 50 mL of YPD liquid medium (composition: 20 g of Bacto peptone, 10 g of Yeast extract, and 50 mL of 40% glucose solution per liter of YPD liquid medium). .
  • a part of the cultured microorganism was added to 50 mL of fresh YPD liquid medium and cultured at 20 to 28 ° C. for 24 hours. After culturing, the grown microorganisms were collected by centrifugation. The collected microorganisms were suspended in sterilized distilled water and washed, and then the microorganisms were collected by centrifugation.
  • the collected microorganisms were suspended in 1 mL of 0.1 M LiAc solution. 50 ⁇ L of a LiAc solution containing microorganisms was collected, and 171 ⁇ L of 70% PEG # 4000 solution, 69 ⁇ L of sterilized distilled water, 15 ⁇ L of 2M LiAc solution, Carrier DNA solution (2 mg-Carrier DMA / mL) ) A mixture of 15 ⁇ L and 110 ⁇ g of vector was added.
  • the mixed solution was allowed to stand at 20 to 28 ° C. for several hours, and then heat shock was applied to the mixed solution at 30 to 40 ° C. for 5 minutes.
  • Microorganisms were collected from the mixed solution after applying heat shock by centrifugation, and the microorganisms were cultured in a YPD liquid medium for several hours. The cultured microorganism was recovered by centrifugation, and the microorganism was cultured on a YPD solid medium containing hygromycin.
  • FIG. 5 shows the results of colony PCR.
  • the left photograph shows the detection result of the carotenoid cyclase gene
  • the right photograph shows the detection result of the hygromycin resistance gene.
  • M corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” corresponds to a positive control
  • “2” to “4” correspond to each transformant.
  • each of the transformants “2” to “4” is also referred to as “Yhyg1” to “Yhyg3”.
  • Each of the transformants corresponding to “2” to “4” described above was added to 100 mL of F medium (composition: 40 g of glucose, 1 g of F medium, 0.5 g of (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O to 0.5g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O and 0.1 g, the NaCl 0.1 g, and comprising 1.5g of Yeast the Extract, was inoculated into pH 5.5) .
  • F medium composition: 40 g of glucose, 1 g of F medium, 0.5 g of (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O to 0.5g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O and 0.1 g, the NaCl 0.1 g, and comprising 1.5g of Yeast the Extract, was inoculated into pH 5.5
  • the transformant was cultured at 25 ° C. and 180 rpm for 3 days, and then the transformant was recovered by centrifugation.
  • RNA extraction kit ISOGEN II manufactured by Nippon Gene
  • PCR was performed using the above cDNA as a template, and it was confirmed whether mRNA was expressed from the hygromycin resistance gene and carotenoid cyclase gene introduced into each transformant.
  • the primer set 1 or the primer set 3 described above was used as a primer, and the same reaction conditions as those employed in the colony PCR method were used as reaction conditions.
  • Figure 6 shows the test results.
  • the left photograph shows the detection result of mRNA expressed from the carotenoid cyclase gene
  • the right photograph shows the detection result of mRNA expressed from the hygromycin resistance gene.
  • M corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” represents a carotenoid cyclase gene and a microorganism belonging to the genus Rhodotorula that does not have a hygromycin resistance gene (specifically, , Rhodotorula ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ acheniorum)
  • “2” corresponds to the positive control
  • “3” to “5” correspond to the transformants “Yhyg1” to “Yhyg3”.
  • an elution solvent As an elution solvent, an elution solvent containing solvent A and solvent B at a desired ratio was used, and the elution operation was performed while changing the ratio of each solvent contained in the elution solvent over time.
  • Table 4 shows the change over time (gradient elution program) of the ratio (%) of solvent A and solvent B contained in the elution solvent.
  • the total amount of all carotenoids contained in 1 g of the wet cells in the transformant was 2.4 times that of the wild-type microorganism belonging to the genus Rhodotorula cultured under the same conditions. This indicates that the transformant can produce more carotenoids than the microorganism belonging to the genus Rhodotorula of the wild type.
  • the specific nucleotide sequence of the carotenoid cyclase gene derived from Pantoea ananatis is represented by SEQ ID NO: 8, and the specific amino acid sequence of the carotenoid cyclase encoded by the gene is represented by SEQ ID NO: 7.
  • SEQ ID NO: 8 The specific nucleotide sequence of the carotenoid cyclase gene derived from Pantoea ananatis is represented by SEQ ID NO: 8
  • the specific amino acid sequence of the carotenoid cyclase encoded by the gene is represented by SEQ ID NO: 7.
  • a specific base sequence of a carotenoid ketolase gene derived from a microorganism belonging to the genus Brevandimonas is represented by SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 1 A specific amino acid sequence of the carotenoid ketolase encoded by the gene is represented by SEQ ID NO: 1. Is shown.
  • FIG. 4 shows a reaction catalyzed by a carotenoid cyclase derived from Pantoea ananatis and a carotenoid ketolase derived from a microorganism belonging to the genus Brebandimonas.
  • carotenoid cyclase crtY
  • crtW carotenoid ketolase
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the hygromycin resistance gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the hygromycin resistance gene.
  • the expression of the hygromycin resistance gene is controlled by the GPD promoter.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the carotenoid cyclase gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the carotenoid cyclase gene.
  • the expression of the carotenoid cyclase gene is controlled by the GPD promoter.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the carotenoid ketolase gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the carotenoid ketolase gene.
  • the expression of the carotenoid ketolase gene is controlled by the GPD promoter.
  • Rhodotorula a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum). The introduction method will be described below.
  • the microorganism was cultured for 2 to 3 days in 50 mL of YPD liquid medium (composition: 20 g of Bacto peptone, 10 g of Yeast extract, and 50 mL of 40% glucose solution per liter of YPD liquid medium). .
  • a part of the cultured microorganism was added to 50 mL of fresh YPD liquid medium and cultured at 20 to 28 ° C. for 24 hours. After culturing, the grown microorganisms were collected by centrifugation. The collected microorganisms were suspended in sterilized distilled water and washed, and then the microorganisms were collected by centrifugation.
  • the collected microorganisms were suspended in 1 mL of 0.1 M LiAc solution. 50 ⁇ L of a LiAc solution containing microorganisms was collected, and 171 ⁇ L of 70% PEG # 4000 solution, 69 ⁇ L of sterilized distilled water, 15 ⁇ L of 2M LiAc solution, Carrier DNA solution (2 mg-Carrier DMA / mL) ) A mixture of 15 ⁇ L and 110 ⁇ g of vector was added.
  • the mixed solution was allowed to stand at 20 to 28 ° C. for several hours, and then heat shock was applied to the mixed solution at 30 to 40 ° C. for 5 minutes.
  • Microorganisms were collected from the mixed solution after applying heat shock by centrifugation, and the microorganisms were cultured in a YPD liquid medium for several hours. The cultured microorganism was recovered by centrifugation, and the microorganism was cultured on a YPD solid medium containing hygromycin.
  • FIG. 8 shows the results of colony PCR.
  • the left photograph shows the detection result of the carotenoid ketolase gene
  • the middle photograph shows the detection result of the carotenoid cyclase gene
  • the right photograph shows the detection result of the hygromycin resistance gene.
  • M corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” corresponds to a positive control
  • “2” to “4” correspond to each transformant.
  • the transformants “2” to “4” are also referred to as “WYhyg1” to “WYhyg3”.
  • Each of the transformants corresponding to “2” to “4” described above was added to 100 mL of F medium (composition: 40 g of glucose, 1 g of F medium, 0.5 g of (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O to 0.5g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O and 0.1 g, the NaCl 0.1 g, and comprising 1.5g of Yeast the Extract, was inoculated into pH 5.5) .
  • F medium composition: 40 g of glucose, 1 g of F medium, 0.5 g of (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O to 0.5g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O and 0.1 g, the NaCl 0.1 g, and comprising 1.5g of Yeast the Extract, was inoculated into pH 5.5
  • the transformant was cultured at 25 ° C. and 180 rpm for 3 days, and then the transformant was recovered by centrifugation.
  • RNA extraction kit ISOGEN II manufactured by Nippon Gene
  • PCR was performed using the above cDNA as a template, and it was confirmed whether mRNA was expressed from the hygromycin resistance gene, carotenoid ketolase gene, and carotenoid cyclase gene introduced into each transformant.
  • the primer set 1, the primer set 2, or the primer set 3 described above was used as a primer, and the same reaction conditions as those employed in the colony PCR method were used as reaction conditions.
  • Figure 9 shows the test results.
  • the left photograph shows the detection result of mRNA expressed from the carotenoid ketolase gene
  • the middle photograph shows the detection result of mRNA expressed from the carotenoid cyclase gene
  • the right photograph shows the high-gloss
  • the detection result of mRNA expressed from a mycin resistance gene is shown.
  • “M” corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” belongs to the wild-type Rhodotorula genus into which the carotenoid ketolase gene, carotenoid cyclase gene, and hygromycin resistance gene have not been introduced.
  • an elution solvent As an elution solvent, an elution solvent containing solvent A and solvent B at a desired ratio was used, and the elution operation was performed while changing the ratio of each solvent contained in the elution solvent over time.
  • Table 6 shows changes with time in the ratio (%) of the solvent A and the solvent B contained in the elution solvent (gradient elution program).
  • the total amount of all carotenoids in the transformant was 1.27 times that of the wild-type microorganism belonging to the genus Rhodotorula cultured under the same conditions. This indicates that the transformant can produce carotenoids even when a plurality of carotenoid biosynthesis genes are expressed.
  • a vector 4 in which a hygromycin resistance gene (Hygr) and an amorphadiene synthase gene (ADS) derived from Artemisia annua was inserted was prepared.
  • pUC118 vector manufactured by Takara Bio Inc.
  • ADS amorphadiene synthase gene derived from Artemisia annua
  • SEQ ID NO: 12 The specific base sequence of the amorphadiene synthase gene (ADS) derived from Artemisia annua is shown in SEQ ID NO: 12, and the specific amino acid sequence of the amorphadiene synthase encoded by the gene is This is shown in SEQ ID NO: 11.
  • FIG. 11 shows a reaction catalyzed by an amorphadiene synthase derived from Artemisia annua. As shown in FIG. 11, an amorphadiene synthase derived from Artemisia annua is thought to cyclize FPP as a substrate.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the hygromycin resistance gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the hygromycin resistance gene.
  • the expression of the hygromycin resistance gene is controlled by the GPD promoter.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the amorphadiene synthase gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the amorphadiene synthase gene.
  • the expression of the amorphadiene synthase gene is controlled by the GPD promoter.
  • the vector 4 described above was introduced into a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum).
  • Rhodotorula a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum). The introduction method will be described below.
  • the microorganism was cultured for 2 to 3 days in 50 mL of YPD liquid medium (composition: 20 g of Bacto peptone, 10 g of Yeast extract, and 50 mL of 40% glucose solution per liter of YPD liquid medium). .
  • a part of the cultured microorganism was added to 50 mL of fresh YPD liquid medium and cultured at 20 to 28 ° C. for 24 hours. After culturing, the grown microorganisms were collected by centrifugation. The collected microorganisms were suspended in sterilized distilled water and washed, and then the microorganisms were collected by centrifugation.
  • the collected microorganisms were suspended in 1 mL of 0.1 M LiAc solution. 50 ⁇ L of a LiAc solution containing microorganisms was collected, and 171 ⁇ L of 70% PEG # 4000 solution, 69 ⁇ L of sterilized distilled water, 15 ⁇ L of 2M LiAc solution, Carrier DNA solution (2 mg-Carrier DMA / mL) ) A mixture of 15 ⁇ L and 110 ⁇ g of vector was added.
  • the mixed solution was allowed to stand at 20 to 28 ° C. for several hours, and then heat shock was applied to the mixed solution at 30 to 40 ° C. for 5 minutes.
  • Microorganisms were collected from the mixed solution after applying heat shock by centrifugation, and the microorganisms were cultured in a YPD liquid medium for several hours. The cultured microorganism was recovered by centrifugation, and the microorganism was cultured on a YPD solid medium containing hygromycin.
  • the primer set 1 used for detecting the hygromycin resistance gene, the primer set 4 used for detecting the amorphadiene synthase gene, and the PCR reaction conditions are shown below.
  • FIG. 12 shows the results of colony PCR.
  • the left photograph shows the detection result of the amorphadiene synthase gene
  • the right photograph shows the detection result of the hygromycin resistance gene.
  • M corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” corresponds to a positive control
  • “2” to “3” correspond to each transformant.
  • each of the transformants “2” to “3” is also referred to as “ADSShig1” to “ADSShig2”.
  • Each of the transformants corresponding to “2” to “3” described above was added to 100 mL of F medium (composition: 40 g of glucose, 0.5 g of (NH 4 ) 2 SO 4 per 1 L of F medium, KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O to 0.5g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O and 0.1 g, the NaCl 0.1 g, and comprising 1.5g of Yeast the Extract, was inoculated into pH 5.5) .
  • the transformant was cultured at 25 ° C. and 180 rpm for 3 days, and then the transformant was recovered by centrifugation.
  • RNA extraction kit ISOGEN II manufactured by Nippon Gene
  • PCR was performed using the above cDNA as a template, and it was confirmed whether mRNA was expressed from the hygromycin resistance gene and the amorphadiene synthase gene introduced into each transformant.
  • the primer set 1 or the primer set 4 described above was used as a primer, and the same reaction conditions as those employed in the colony PCR method were used as reaction conditions.
  • Fig. 13 shows the test results.
  • the left photograph shows the detection result of mRNA expressed from the amorphadiene synthase gene
  • the right photograph shows the detection result of mRNA expressed from the hygromycin resistance gene.
  • M corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” represents an amorphadiene synthase gene and a microorganism belonging to the genus Rhodotorula that does not have a hygromycin resistance gene introduced (specifically, Specifically, “2” corresponds to the positive control, and “3” to “4” correspond to the transformants “ADSShig1” to “ADSShig2”.
  • each microorganism was grown after being cultured using an F medium (specifically, a liquid F medium (in other words, a liquid medium) or a solid F medium (in other words, a solid medium)). Each microorganism was recovered by centrifugation. To 1 g (wet weight) of the collected microorganisms, (a) 1 mL of distilled water or an organic solvent was added and extracted for 30 minutes, and (b) 10 mL of distilled water was further added.
  • F medium specifically, a liquid F medium (in other words, a liquid medium) or a solid F medium (in other words, a solid medium)
  • the organic solvent was added to the mixed solution and stirred, and then allowed to stand, and the organic solvent layer separated from the water layer was recovered. Furthermore, the organic solvent was added again to the remaining water layer and stirred, and then allowed to stand, and the organic solvent layer separated from the water layer was recovered. Furthermore, the same operation was performed twice, and extraction operation was performed 3 times in total. As an organic solvent, 3 mL of EtOAc was used.
  • the recovered three organic solvent layers were combined into one, and the organic solvent was volatilized under a nitrogen stream to recover the residue.
  • the residue was dissolved in 1 mL EtOAc.
  • the EtOAc solution obtained by the extraction operation was subjected to GC-MS (Gas Chromatography-mass spectrometry) to analyze sesquiterpenoids contained in the residue.
  • FIG. 14 shows the results of GC-MS analysis regarding the components contained in the residue. Further, the following A value to D value were calculated as the amount of amorpha-4,11-diene based on the detected peak area. The results are shown in Table 8.
  • a value amount of sesquiterpenoid contained per gram of wet cells [ ⁇ g / g-FW]
  • B value Total amount of amorpha-4,11-diene contained per gram of dry cells [ ⁇ g / g-DCW]
  • C value total amount [mg / L] of the amount of amorpha-4,11-diene contained per liter of the medium
  • D value Amorpha-4,11-diene content per gram of wet cells [ ⁇ g / g-FW].
  • ⁇ -amylin synthase gene derived from Glycyrrhiza uralensis is shown in SEQ ID NO: 16, and the specific amino acid sequence of ⁇ -amylin synthase encoded by the gene Is represented by SEQ ID NO: 15.
  • FIG. 15 shows a reaction catalyzed by ⁇ -amylin synthase derived from the glycyliner uralensis. As shown in FIG. 15, it is considered that ⁇ -amylin synthase derived from glycyrrhiz uralensis cyclizes 2,3-oxidesqualene, which is a substrate.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the hygromycin resistance gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the hygromycin resistance gene.
  • the expression of the hygromycin resistance gene is controlled by the GPD promoter.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the ⁇ -amylin synthase gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the ⁇ -amylin synthase gene.
  • the expression of ⁇ -amylin synthase gene is controlled by the GPD promoter.
  • the vector 5 described above was introduced into a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum).
  • Rhodotorula a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum). The introduction method will be described below.
  • the microorganism was cultured for 2 to 3 days in 50 mL of YPD liquid medium (composition: 20 g of Bacto peptone, 10 g of Yeast extract, and 50 mL of 40% glucose solution per liter of YPD liquid medium). .
  • a part of the cultured microorganism was added to 50 mL of fresh YPD liquid medium and cultured at 20 to 28 ° C. for 24 hours. After culturing, the grown microorganisms were collected by centrifugation. The collected microorganisms were suspended in sterilized distilled water and washed, and then the microorganisms were collected by centrifugation.
  • the collected microorganisms were suspended in 1 mL of 0.1 M LiAc solution. 50 ⁇ L of a LiAc solution containing microorganisms was collected, and 171 ⁇ L of 70% PEG # 4000 solution, 69 ⁇ L of sterilized distilled water, 15 ⁇ L of 2M LiAc solution, Carrier DNA solution (2 mg-Carrier DMA / mL) ) A mixture of 15 ⁇ L and 110 ⁇ g of vector was added.
  • the mixed solution was allowed to stand at 20 to 28 ° C. for several hours, and then heat shock was applied to the mixed solution at 30 to 40 ° C. for 5 minutes.
  • Microorganisms were collected from the mixed solution after applying heat shock by centrifugation, and the microorganisms were cultured in a YPD liquid medium for several hours. The cultured microorganism was recovered by centrifugation, and the microorganism was cultured on a YPD solid medium containing hygromycin.
  • FIG. 16 shows the results of colony PCR.
  • the left photograph shows the detection result of the ⁇ -amylin synthase gene
  • the right photograph shows the detection result of the hygromycin resistance gene.
  • M corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” corresponds to a positive control
  • “2” to “5” correspond to each transformant.
  • the transformants “2” to “5” are also referred to as “bAShyg1” to “bAShyg4”.
  • Each of the transformants corresponding to “2” to “5” described above was added to 100 mL of F medium (composition: 40 g of glucose, 1 g of F medium, 0.5 g of (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O to 0.5g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O and 0.1 g, the NaCl 0.1 g, and comprising 1.5g of Yeast the Extract, was inoculated into pH 5.5) .
  • F medium composition: 40 g of glucose, 1 g of F medium, 0.5 g of (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O to 0.5g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O and 0.1 g, the NaCl 0.1 g, and comprising 1.5g of Yeast the Extract, was inoculated into pH 5.5
  • the transformant was cultured at 25 ° C. and 180 rpm for 3 days, and then the transformant was recovered by centrifugation.
  • RNA extraction kit ISOGEN II manufactured by Nippon Gene
  • PCR was performed using the above cDNA as a template, and it was confirmed whether mRNA was expressed from the hygromycin resistance gene and ⁇ -amylin synthase gene introduced into each transformant.
  • the primer set 1 or the primer set 5 described above was used as a primer, and the same reaction conditions as those employed in the colony PCR method were used as reaction conditions.
  • Fig. 17 shows the test results.
  • the left photograph shows the detection result of mRNA expressed from the ⁇ -amylin synthase gene
  • the right photograph shows the detection result of mRNA expressed from the hygromycin resistance gene.
  • M corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” indicates a ⁇ -amylin synthase gene and a microorganism belonging to the genus Rhodotorula having no hygromycin resistance gene introduced
  • “2” corresponds to a positive control
  • “3” to “6” correspond to “bAShig1” to “bAShhyg4” which are transformants.
  • the mixed solution was stirred and allowed to stand, and the chloroform layer separated from the water / methanol layer was recovered.
  • the collected chloroform layer was evaporated under reduced pressure to recover the residue.
  • the trimethylsilylation solution obtained by the extraction operation was subjected to GC-MS (Gas-Chromatography-mass-spectrometry), and triterpenoids contained in the residue were analyzed.
  • GC-MS analysis conditions are shown below; Column: DB-1MS (30 m ⁇ 0.25 mm ⁇ 0.25 ⁇ m), Vaporization chamber temperature: 250 ° C Column temperature: 60 ° C (held for 1 minute) to (temperature rise: 20 ° C / min) to 300 ° C (Hold for 28 minutes) Gas: Helium linear velocity: 36.5 cm / sec, Injection method: Spiritless, Ion source temperature: 280 ° C Interface temperature: 300 ° C Solvent elution time: 4 min. Ionization method: EI, Scanning speed: 3scan / sec Scan range: m / z 50-800 External standard: ⁇ -amylin.
  • FIG. 18 shows the GC-MS analysis results for the components contained in the residue. Further, the following A value to D value were calculated as ⁇ -amylin amount based on the detected peak area. The results are shown in Table 9. A value: amount of triterpenoid contained per gram of wet cells [ ⁇ g / g-FW], B value: total amount of ⁇ -amylin contained per gram of dry cells [ ⁇ g / g-DCW], C value: total amount of ⁇ -amylin contained per liter of medium [mg / L], D value: The amount of ⁇ -amylin contained in 1 g of wet cells [ ⁇ g / g-FW].
  • the specific base sequence of the lupeol synthase gene (LUS) derived from Glycyrrhiza uralensis is represented by SEQ ID NO: 24, and the specific amino acid sequence of the lupeol synthase encoded by the gene is SEQ ID NO: 23. Is shown.
  • FIG. 19 shows a reaction catalyzed by lupeol synthase derived from the glycyliner uralensis (Glycyrrhiza uralensis). As shown in FIG. 19, it is considered that lupeol synthase derived from glycyrrhiz uralensis cyclizes 2,3-oxidesqualene, which is a substrate.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the hygromycin resistance gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the hygromycin resistance gene.
  • the expression of the hygromycin resistance gene is controlled by the GPD promoter.
  • a GPD promoter (UmP GPD ) is linked upstream of the lupeol synthase gene, and a Tcyc1 terminator is linked downstream of the lupeol synthase gene.
  • the expression of lupeol synthase gene is controlled by the GPD promoter.
  • Rhodotorula a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum). The introduction method will be described below.
  • the microorganism was cultured for 2 to 3 days in 50 mL of YPD liquid medium (composition: 20 g of Bacto peptone, 10 g of Yeast extract, and 50 mL of 40% glucose solution per liter of YPD liquid medium). .
  • a part of the cultured microorganism was added to 50 mL of fresh YPD liquid medium and cultured at 20 to 28 ° C. for 24 hours. After culturing, the grown microorganisms were collected by centrifugation. The collected microorganisms were suspended in sterilized distilled water and washed, and then the microorganisms were collected by centrifugation.
  • the collected microorganisms were suspended in 1 mL of 0.1 M LiAc solution. 50 ⁇ L of a LiAc solution containing microorganisms was collected, and 171 ⁇ L of 70% PEG # 4000 solution, 69 ⁇ L of sterilized distilled water, 15 ⁇ L of 2M LiAc solution, Carrier DNA solution (2 mg-Carrier DMA / mL) ) A mixture of 15 ⁇ L and 110 ⁇ g of vector was added.
  • the mixed solution was allowed to stand at 20 to 28 ° C. for several hours, and then heat shock was applied to the mixed solution at 30 to 40 ° C. for 5 minutes.
  • Microorganisms were collected from the mixed solution after applying heat shock by centrifugation, and the microorganisms were cultured in a YPD liquid medium for several hours. The cultured microorganism was recovered by centrifugation, and the microorganism was cultured on a YPD solid medium containing hygromycin.
  • FIG. 20 shows the results of colony PCR.
  • the left photograph shows the detection result of the lupeol synthase gene
  • the right photograph shows the detection result of the hygromycin resistance gene.
  • “M” corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” corresponds to a positive control
  • “2” to “5” correspond to each transformant.
  • the transformants “2” to “5” are also referred to as “LSHhyg1” to “LSHhyg4”.
  • Each of the transformants corresponding to “2” to “5” described above was added to 100 mL of F medium (composition: 40 g of glucose, 1 g of F medium, 0.5 g of (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O to 0.5g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O and 0.1 g, the NaCl 0.1 g, and comprising 1.5g of Yeast the Extract, was inoculated into pH 5.5) .
  • F medium composition: 40 g of glucose, 1 g of F medium, 0.5 g of (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O to 0.5g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O and 0.1 g, the NaCl 0.1 g, and comprising 1.5g of Yeast the Extract, was inoculated into pH 5.5
  • the transformant was cultured at 25 ° C. and 180 rpm for 3 days, and then the transformant was recovered by centrifugation.
  • RNA extraction kit ISOGEN II manufactured by Nippon Gene
  • PCR was performed using the above cDNA as a template, and it was confirmed whether mRNA was expressed from the hygromycin resistance gene and the lupeol synthase gene introduced into each transformant.
  • the primer set 1 or the primer set 6 described above was used as a primer, and the same reaction conditions as those employed in the colony PCR method were used as reaction conditions.
  • Fig. 21 shows the test results.
  • the photograph on the left shows the detection result of mRNA expressed from the lupeol synthase gene
  • the photograph on the right shows the detection result of mRNA expressed from the hygromycin resistance gene.
  • M corresponds to a 1 kb ladder marker
  • “1” corresponds to a positive control
  • “2” to “5” are transformants “LSHhyg1” to “LSHhyg4”.
  • “6” corresponds to a lupeol synthase gene and a microorganism belonging to the genus Rhodotorula (specifically, Rhodotorula acheniorum) into which a hygromycin resistance gene has not been introduced.
  • GC-MS analysis conditions are shown below; Column: DB-1MS (30 m ⁇ 0.25 mm ⁇ 0.25 ⁇ m), Vaporization chamber temperature: 250 ° C Column temperature: 60 ° C (held for 1 minute) to (temperature rise: 20 ° C / min) to 300 ° C (Hold for 28 minutes) Gas: Helium linear velocity: 36.5 cm / sec, Injection method: Spiritless, Ion source temperature: 280 ° C Interface temperature: 300 ° C Solvent elution time: 4 min. Ionization method: EI, Scanning speed: 3scan / sec Scan range: m / z 50-800 External standard: Lupeol.
  • FIG. 22 shows the results of GC-MS analysis regarding the components contained in the residue. Further, based on the detected peak area, the following A value to D value were calculated as lupeol amounts. The results are shown in Table 10.
  • a value amount of triterpenoid contained per gram of wet cells [ ⁇ g / g-FW]
  • B value total amount of lupeol contained per gram of dry cells [ ⁇ g / g-DCW]
  • C value total amount of lupeol contained per liter of medium [mg / L]
  • D value The amount of lupeol contained in 1 g of wet cells [ ⁇ g / g-FW].
  • the present invention can be used in various industries such as pharmaceuticals, feeds, food additives, functional foods, fragrances and biofuels.

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Abstract

所望のテルペノイドの生産を可能とする、新規な形質転換体、および、当該形質転換体を用いたテルペノイドの製造方法を提供するために、本発明の形質転換体は、ロドトルラ属に属する微生物に、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子が導入されたものである。

Description

形質転換体、およびテルペノイドの製造方法
　本発明は、形質転換体、および当該形質転換体を用いたテルペノイドの製造方法に関する。
　テルペノイド（テルペン又はイソプレノイドとも称する）は、これまでに植物や微生物等から約４万種類が単離されている化合物群であり、自然界で最も複雑かつ多様な化合物群である。テルペノイドとその誘導体とは、様々な生理活性を有していることが報告されており、医薬品、機能性食品、または香料等として広く市場に流通している。
　テルペノイドは、天然における存在量が少ないこと、および、構造が複雑な化合物が多いことなどから、テルペノイドの効率的な生産技術の開発が期待されてきた。
　近年、様々な宿主（例えば、大腸菌、酵母、または、植物）の代謝経路を改変することによって、テルペノイドを生産する技術の開発が試みられている（例えば、特許文献１～３、および非特許文献１～２参照）。
日本国公開特許公報「特開２００１－１９０２９４号公報」 日本国公開特許公報「特表２００６－５０００４６号公報」 日本国公開特許公報「特表２００６－５０００５５号公報」
Falk Matthaus et. al., Production of Lycopene in the Non-Carotenoid-Producing Yeast Yarrowia lipolytica, Appl Environ Microbiol, 2014 Mar, 80(5):1660-1669 Kiyotaka Y Hara et. al., Development of a multi-gene expression system in Xanthophyllomyces dendrorhous, Microbial Cell Factories, 2014 Dec 4, 13(1):175
　上述のようにテルペノイドを生産する技術の開発が進んでいるが、現在までに開発されてきた技術だけでは十分とはいえず、さらなるテルペノイドの生産技術の開発が要望されている。
　本発明は、上記の問題点を鑑みてなされたものであり、その目的は、所望のテルペノイドの生産を可能とする、新規な形質転換体、および当該形質転換体を用いたテルペノイドの製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、膨大な種類存在する微生物の中でも、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物中には、脂肪酸、ステロイド、または、カロテノイドを多量に生産する種が存在することを、新たに見出した。そして、本発明者らは、これらの種に、当該種とは異なる生物種に由来する酵素（具体的には、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を作製すれば、当該形質転換体によって、種々の構造のテルペノイド（例えば、これまでに知られていないような新規な構造のテルペノイド）を効率よく製造し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明の形質転換体は、上記課題を解決するために、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物に、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子が導入されているものであることを特徴としている。
　本発明のテルペノイドの製造方法は、上記課題を解決するために、本発明の形質転換体を培養する培養工程と、上記培養工程にて得られた形質転換体からテルペノイドを回収する回収工程とを有することを特徴としている。
　本発明に係る形質転換体によれば、種々の構造のテルペノイドを製造することができるという効果を奏する。
　本発明に係る形質転換体によれば、テルペノイドの生合成に関連する酵素をコードする遺伝子を導入することによって、テルペノイド生合成系を活性化することができる。
本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。 本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。 本願の実施例における、ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 本願の実施例における、ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼが触媒する反応を示す図である。 本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。 本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。 本願の実施例における、ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。 本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。 本願の実施例における、ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 本願の実施例における、アルテミシア・アヌア由来のアモルファジエン合成酵素が触媒する反応を示す図である。 本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。 本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。 本願の実施例における、ＧＣ－ＭＳによる分析結果を示す図である。 本願の実施例における、グリチライザ　ウラレンシス由来のβ－アミリン合成酵素が触媒する反応を示す図である。 本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。 本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。 本願の実施例における、ＧＣ－ＭＳによる分析結果を示す図である。 本願の実施例における、グリチライザ　ウラレンシス由来のルペオール合成酵素が触媒する反応を示す図である。 本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。 本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。 本願の実施例における、ＧＣ－ＭＳによる分析結果を示す図である。
　本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
　本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、または、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態であり得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は、化学的に合成されたものであってもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Codon usage）が変更されたものであってもよい。同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。また、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
　本明細書中において「テルペノイド」とは、テルペノイド生合成酵素の触媒活性により、基質としてゲラニル二リン酸（ＧＤＰ、ＧＰＰとも称する）（ＧＰＰの各種異性体を含む）、ファルネシル二リン酸（ＦＤＰ、ＦＰＰとも称する）（ＦＰＰの各種異性体を含む）、および／または、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰ、ＧＧＰＰとも称する）（ＧＧＰＰの各種異性体を含む）から生成されるＣｘＨｙＯｚ（ｘは１０、１５、２０、３０、または、４０であり、ｙは１４～５４であり、ｙは０～４である）の化学式を有する化合物、および、当該化合物に対して、炭素原子数の増加、炭素原子数の減少、または、酸化等の修飾を施した化合物、を意図する。テルペノイドの触媒活性による基質の環化、酸化、水酸化等の生体内の酵素反応、および付随する非酵素反応により脱水反応等が行われることがあるが、これらに限定されない。テルペノイドは、非環、単環または多環の任意の形態をとり得るが、共通して、テルペノイド基本骨格を有する。したがって、テルペノイド基本骨格を有する任意の化合物は、本明細書におけるテルペノイドの概念に包含される。
　〔１．本発明に関して〕
　ロドトルラ属に属する微生物には、脂肪酸、ステロイド、または、カロテノイドを多量に生産する種が存在することを本願発明者らは独自に見出した。つまり、これらの種には、脂肪酸、ステロイド、カロテノイド、および、これらの代謝物（例えば、これらの前駆体となる化合物、および／または、これらから合成される化合物）が、大量に含まれている。本発明では、これらの微生物内で、当該微生物とは異なる生物種に由来する所望の酵素を発現させるので、当該酵素が多量の基質と接触することになる。その結果、本発明は、所望のテルペノイド（例えば、新規な構造を有するテルペノイド）を大量に生産することができる。
　ロドトルラ属に属する微生物に、所望の遺伝子を導入する技術についてはこれまでのところ報告されていない。そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、ロドトルラ属に属する微生物に対して、容易に外来遺伝子を導入する技術を確立した。それ故に、本発明は、これらの微生物に所望の遺伝子を導入することによって、所望のテルペノイドを容易に生産することができる。
　なお、後述する実施例に示すように、本発明の形質転換体は、固体培地を用いて培養した場合よりも、液体培地を用いて培養した方が、菌体１ｇに含まれるテルペノイドの量が多い。それ故に、本発明は、形質転換体の培養スケール（換言すれば、テルペノイドの生産スケール）を、容易に所望のスケールに調節できる。例えば、液体培養であれば、固体培養と比較して、単位スペース中で培養できる微生物の量が多いので、形質転換体の培養スケールを容易に大きくすることができる。更に、液体培養であれば、形質転換体を連続培養することができるので、テルペノイドを、連続的かつ大量に生産することができる。
　本発明の形質転換体は、固体培地を用いて培養した場合よりも、液体培地を用いて培養した場合の方が、菌体１ｇに含まれるテルペノイドの量が多い。このことは、本発明の形質転換体が、自身の生育やテルペノイド生産において過剰な量の酸素を要求しないことを示している。本発明は、形質転換体の培養時に過剰な量の酸素を供給する必要が無いので、形質転換体の培養装置を安価にできる（換言すれば、安価にテルペノイドを生産できる）。
　以下、本発明について詳説する。
　〔２．形質転換体〕
　本実施の形態の形質転換体は、特定の微生物に対して、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子が導入されたものである。本発明であれば、元々微生物中に存在しなかった代謝経路（例えば、テルペノイドを合成する代謝経路、テルペノイドに修飾（例えば、官能基）を加える代謝経路、または、テルペノイドを他の化合物へ変換する代謝経路など）を微生物中に人工的に構築することによって、または、元々微生物中に存在する代謝経路にさらに改良することによって、所望のテルペノイドを大量に製造することができる微生物を実現することができる。
　遺伝子が導入される微生物（換言すれば、宿主）は、脂肪酸、ステロイド、および、カロテノイドからなる群より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または、３つの生産能力が高い微生物であってもよい。より具体的に、遺伝子が導入される微生物は、脂肪酸およびステロイドの生産能力が高い微生物であってもよいし、カロテノイドの生産能力が高い微生物であってもよい。
　なお、脂肪酸の生産能力が高い微生物とは、本願の実施例の＜１＞に記載の方法にて測定した時に、１ｇの乾燥菌体に含まれる脂肪酸の量が、１００ｍｇ以上、好ましくは１１０ｍｇ以上、より好ましくは１２０ｍｇ以上、より好ましくは１３０ｍｇ以上、より好ましくは１４０ｍｇ以上、より好ましくは１５０ｍｇ以上、より好ましくは１６０ｍｇ以上、最も好ましくは１７０ｍｇ以上である微生物を意図する。なお、１ｇの乾燥菌体に含まれる脂肪酸の量の上限値は、特に限定されないが、例えば、５００ｍｇ、３００ｍｇ、または２００ｍｇであってもよい。
　また、ステロイドの生産能力が高い微生物とは、本願の実施例の＜１＞に記載の方法にて測定した時に、１ｇの乾燥菌体に含まれるステロイドの量が、５０ｍｇ以上、より好ましくは６０ｍｇ以上、より好ましくは７０ｍｇ以上、より好ましくは８０ｍｇ以上、最も好ましくは９０ｍｇ以上である微生物を意図する。なお、１ｇの乾燥菌体に含まれるステロイドの量の上限値は、特に限定されないが、例えば、５００ｍｇ、３００ｍｇ、２００ｍｇ、または１００ｍｇであってもよい。
　また、カロテノイドの生産能力が高い微生物とは、本願の実施例の＜１＞に記載の方法にて測定した時に、１ｇの乾燥菌体に含まれるカロテノイドの量が、５ｍｇ以上、好ましくは６ｍｇ以上、より好ましくは７ｍｇ以上、より好ましくは８ｍｇ以上、より好ましくは９ｍｇ以上、最も好ましくは１０ｍｇ以上である微生物を意図する。なお、１ｇの乾燥菌体に含まれるカロテノイドの量の上限値は、特に限定されないが、例えば、５００ｍｇ、３００ｍｇ、２００ｍｇ、１００ｍｇ、または５０ｍｇであってもよい。
　遺伝子が導入される微生物のより具体的な例としては、ロドトルラ属に属する微生物を挙げることができる。
　更に具体的に、ロドトルラ属に属する微生物としては、ロドトルラ・アウランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・アクタ（Rhodotorula acuta）、ロドトルラ・アラウカリアエ（Rhodotorula araucariae）、ロドトルラ・アルメニアカ（Rhodotorula armeniaca）、ロドトルラ・オーランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）、ロドトルラ・アウリクラリアエ（Rhodotorula auriculariae）、ロドトルラ・バカラム（Rhodotorula bacarum）、ロドトルラ・ベンチカ（Rhodotorula benthica）、ロドトルラ・ビオルゲイ（Rhodotorula biourgei）、ロドトルラ・ボゴリエンシス（Rhodotorula bogoriensis）、ロドトルラ・ブロンキアリス（Rhodotorula bronchialis）、ロドトルラ・ブッフォニ（Rhodotorula buffonii）、ロドトルラ・カリプトジニア（Rhodotorula calyptogenae）、ロドトルラ・グラディエンシス（Rhodotorula cladiensis）、ロドトルラ・クレゾリカ（Rhodotorula cresolica）、ロドトルラ・クロセア（Rhodotorula crocea）、ロドトルラ・シクロクラスティカ（Rhodotorula cycloclastica）、ロドトルラ・エベルグラディエンシス（Rhodotorula evergladiensis）、ロドトルラ・フェルリカ（Rhodotorula ferulica）、ロドトルラ・フォリオルム（Rhodotorula foliorum）、ロドトルラ・フラガリア（Rhodotorula fragaria）、ロドトルラ・フジサネンシス（Rhodotorula fujisanensis）、ロドトルラ・フトロネンシス（Rhodotorula futronensis）、ロドトルラ・ゲラティノーサ（Rhodotorula gelatinosa）、ロドトルラ・グラシアリス（Rhodotorula glacialis）、ロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis）、ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula graminis）、ロドトルラ・グリンベルグシ（Rhodotorula grinbergsii）、ロドトルラ・ヒマラエンシス（Rhodotorula himalayensis）、ロドトルラ・ヒヌレア（Rhodotorula hinnulea）、ロドトルラ・ヒストリティカ（Rhodotorula histolytica）、ロドトルラ・ヒロフィラ（Rhodotorula hylophila）、ロドトルラ・インカルナタ（Rhodotorula incarnata）、ロドトルラ・インゲニオサ（Rhodotorula ingeniosa）、ロドトルラ・ジャワニカ（Rhodotorula javanica）、ロドトルラ・コイシカウエンシス（Rhodotorula koishikawensis）、ロドトルラ・ラクトーサ（Rhodotorula lactosa）、ロドトルラ・ラメリブラキア（Rhodotorula lamellibrachiae）、ロドトルラ・ラリニギス（Rhodotorula laryngis）、ロドトルラ・リグノフィラ（Rhodotorula lignophila）、ロドトルラ・リニ（Rhodotorula lini）、ロドトルラ・ロンジシマ（Rhodotorula longissima）、ロドトルラ・ラドウィギー（Rhodotorula ludwigii）、ロドトルラ・リシノフィラ（Rhodotorula lysinophila）、ロドトルラ・マリナ（Rhodotorula marina）、ロドトルラ・マトリテンシス（Rhodotorula matritensis）、ロドトルラ・メリ（Rhodotorula meli）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）、ロドトルラ・ムシラジノーサ（Rhodotorula mucilaginosa）、ロドトルラ・ニテンス（Rhodotorula nitens）、ロドトルラ・ノトファギ（Rhodotorula nothofagi）、ロドトルラ・オリーゼ（Rhodotorula oryzae）、ロドトルラ・パシフィカ（Rhodotorula pacifica）、ロドトルラ・パリダ（Rhodotorula pallida）、ロドトルラ・フィリア（Rhodotorula philyla）、ロドトルラ・ピリマナ（Rhodotorula pilimanae）、ロドトルラ・ピニコラ（Rhodotorula pinicola）、ロドトルラ・プシクロフェノリカ（Rhodotorula psychrophenolica）、ロドトルラ・プシクロフィラ（Rhodotorula psychrophila）、ロドトルラ・パスツーラ（Rhodotorula pustula）、ロドトルラ・レチノフィラ（Rhodotorula retinophila）、ロドトルラ・ロスラタ（Rhodotorula rosulata）、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、ロドトルラ・ルブロルゴサ（Rhodotorula rubrorugosa）、ロドトルラ・シルベストリス（Rhodotorula silvestris）、ロドトルラ・シネンシス（Rhodotorula sinensis）、ロドトルラ・スルーフィエ（Rhodotorula slooffiae）、ロドトルラ・ソンキー（Rhodotorula sonckii）、ロドトルラ・ストラミニア（Rhodotorula straminea）、ロドトルラ・スベリコラ（Rhodotorula subericola）、ロドトルラ・テルペノイダリス（Rhodotorula terpenoidalis）、ロドトルラ・テリア（Rhodotorula terrea）、ロドトルラ・トキオエンシス（Rhodotorula tokyoensis）、ロドトルラ・ウルザマエ（Rhodotorula ulzamae）、ロドトルラ・バニリカ（Rhodotorula vanillica）、ロドトルラ・ブイレミニ（Rhodotorula vuilleminii）、ロドトルラ・ヤロウィ（Rhodotorula yarrowii）、ロドトルラ・ユンナネンシス（Rhodotorula yunnanensis）、および、ロドトルラ・ゾルティー（Rhodotorula zsoltii）を挙げることができる。
　これらの微生物の中では、ロドトルラ・アウランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）、または、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）が好ましい。その理由は、これらの微生物は、他の微生物を比較して、脂肪酸、ステロイド、または、カロテノイドの生産量が高いからである。
　上述した微生物は、以下の機関から入手可能である。つまり、（１）PYCC（Portuguese Yeast Culture Collection）、（２）NBRC NITE Biological Resource Center、（３）CBS CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre（An institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences）、（４）BCRC Bioresource Collection and Research Center、（５）DBVPG（Industrial Yeasts Collection）、（６）DSM DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（７）JCM（Japan Collection of Microorganisms）、（８）KCTC（Korean Collection for Type Cultures）、（９）MUCL（（Agro）industrial fungi & yeasts collection）、（１０）NRRL（ARS Culture Collection）、（１１）CCTCC（China Center for Type Culture Collection）、（１２）ATCC（American Type Culture Collection）、（１３）CECT（Spanish Type Culture Collection）、（１４）RIFY Research Institute of Fermentation、（１５）VKM All-Russian Collection of Microorganisms、（１６）IGC Center of Biology, Gulbenkian Institute of Science、（１７）CCY Culture Collection of Yeasts, Institute of Chemistry, Slovak Academy of Sciences、（１８）NCYC National Collection of Yeast Cultures、（１９）NCIM National Collection of Industrial Microorganisms, National Chemical Laboratory、（２０）CGMCC China General Microbiological Culture Collection Center, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences、（２１）NCAIM National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms、（２２）VTT VTT Culture Collection, VTT Technical Research Center of Finland、または、（２３）FMJ Faculty of Medicine, Juntendo University、にて、上述した微生物を入手可能である。
　本実施の形態の形質転換体は、宿主の微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素を発現している。つまり、本実施の形態の形質転換体は、ロドトルラ属に属していない微生物に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素を発現している。当該酵素は、宿主に元々存在する酵素が触媒作用を及ぼすことが無かった反応に対して触媒作用を及ぼすものであることが好ましい。上記構成であれば、宿主内に元々存在しなかった新たな代謝経路を形質転換体内に形成することができるので、所望のテルペノイド（例えば、新規なテルペノイド）を効率よく生産することができる。また、宿主内に存在する酵素と同じ酵素活性を有する酵素であって、宿主の微生物とは異なる生物種に由来する酵素（例えば、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素）を発現させることで、所望のテルペノイド（例えば、新規なテルペノイド）を効率よく生産することができる。宿主の微生物とは異なる生物種は、特に限定されず、細菌、酵母、糸状菌、藻類、昆虫、植物、または動物であってもよい。
　上記テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素は、特に限定されないが、その一例として、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、または、カロテノイドを生合成する酵素、または、基質とする酵素を挙げることができる。更に具体的に、上記酵素は、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、または、カロテノイドに、様々な官能基（例えば、－ＣＯ－、－ＯＨ、－Ｏ－、－ＣＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＳＨ、－Ｃ＝Ｃ－、－Ｃ＝Ｃ＝Ｃ－、－Ｏ－Ｏ－、－ＮＨ２、または、－Ｃ≡Ｃ－）を導入する酵素であってもよい。
　基質となるモノテルペノイドは、特に限定されず、その一例として、ミルセン、リナロール、ネロール、リモネン、カルボン、α－ピネン、メンタン、メントール、ゲラニオール、シトロネロール、シトロネラール、シトラール、シトロネリルアセテート、ゲラニルアセテート、リナリルアセテート、およびカンファーを挙げることができる。
　基質となるセスキテルペノイドは、特に限定されず、その一例として、アモルファジエン、ゲルマクレン、エレメン、オイデスメン、グアイエン、ヒマカレン、オイデスモール、ファルネソール、カジネン、フムレン、ヌートカトン、セドロール、グアイアズレン、バーノレピン、プタキロシド、ペリプラノン、アブシシン酸、およびゴシポールを挙げることができる。
　基質となるジテルペノイドは、特に限定されず、その一例として、レチノール、レチナール、α－トコフェノール、フィトール、アビエチン酸、ジベレリン、インゲノール、アビエタジエン、タキサジエン、およびモミラクトンを挙げることができる。
　基質となるトリテルペノイドは、特に限定されず、ステロイド類も含みその一例として、スクアレン、アンブレイン、エルゴステロール、ラノステロール、コレステロール、７－デヒドロコレステロール、コレカルシフェロール、オレアノール、ボスウェリン酸、β－シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、β－アミリン、α－アミリン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、ルペオールおよびガノデリン酸を挙げることができる。
　基質となるカロテノイドは、特に限定されず、その一例として、カロテン類（例えば、αカロテン、βカロテン、γカロテン、およびδカロテン）、リコペン、トルレン、およびキサントフィル類（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アスタキサンチン、アンテラキサンチン、およびビオラキサンチン）を挙げることができる。
　上記テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素の更に具体的な例としては、特に限定されないが、その一例として、カロテノイドケトラーゼ（ｃｒｔＷ、または、ｃｒｔＯ）、カロテノイドサイクラーゼ、モノテルペノイドシンターゼ、セスキテルペノイドシンターゼ、ジテルペノイドシンターゼ、および、トリテルペノイドシンターゼを挙げることができる。
　また、上記テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素の別の例として、カロテノイドジオキシゲナーゼ、カロテノイドヒドロキシラーゼ、カロテノイドオキシゲナーゼ、カロテノイドデサチュラーゼ、カロテノイドメチルトランスフェラーゼ、カロテノイドヒドラターゼ、カロテノイドオキシドレダクターゼ、カロテノイドイソメラーゼ、カロテノイドグリコシルトランスフェラーゼ、カロテノイドエポキシダーゼ、カロテノイドデエポキシダーゼ、カロテノイドデヒドロゲナーゼ、モノテルペノイドジオキシゲナーゼ、モノテルペノイドヒドロキシラーゼ、モノテルペノイドオキシゲナーゼ、モノテルペノイドデサチュラーゼ、モノテルペノイドメチルトランスフェラーゼ、モノテルペノイドヒドラターゼ、モノテルペノイドオキシドレダクターゼ、モノテルペノイドイソメラーゼ、モノテルペノイドグリコシルトランスフェラーゼ、モノテルペノイドエポキシダーゼ、モノテルペノイドデエポキシダーゼ、モノテルペノイドデヒドロゲナーゼ、セスキテルペノイドジオキシゲナーゼ、セスキテルペノイドヒドロキシラーゼ、セスキテルペノイドオキシゲナーゼ、セスキテルペノイドデサチュラーゼ、セスキテルペノイドメチルトランスフェラーゼ、セスキテルペノイドヒドラターゼ、セスキテルペノイドオキシドレダクターゼ、セスキテルペノイドイソメラーゼ、セスキテルペノイドグリコシルトランスフェラーゼ、セスキテルペノイドエポキシダーゼ、セスキテルペノイドデエポキシダーゼ、セスキテルペノイドデヒドロゲナーゼ、ジテルペノイドジオキシゲナーゼ、ジテルペノイドヒドロキシラーゼ、ジテルペノイドオキシゲナーゼ、ジテルペノイドデサチュラーゼ、ジテルペノイドメチルトランスフェラーゼ、ジテルペノイドヒドラターゼ、ジテルペノイドオキシドレダクターゼ、ジテルペノイドイソメラーゼ、ジテルペノイドグリコシルトランスフェラーゼ、ジテルペノイドエポキシダーゼ、ジテルペノイドデエポキシダーゼ、ジテルペノイドデヒドロゲナーゼ、トリテルペノイドジオキシゲナーゼ、トリテルペノイドヒドロキシラーゼ、トリテルペノイドオキシゲナーゼ、トリテルペノイドデサチュラーゼ、トリテルペノイドメチルトランスフェラーゼ、トリテルペノイドヒドラターゼ、トリテルペノイドオキシドレダクターゼ、トリテルペノイドイソメラーゼ、トリテルペノイドグリコシルトランスフェラーゼ、トリテルペノイドエポキシダーゼ、トリテルペノイドデエポキシダーゼ、および、トリテルペノイドデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
　上記カロテノイドケトラーゼは、例えば、以下の（ａ）～（ｃ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ａ）～（ｃ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カロテノイドケトラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カロテノイドケトラーゼ活性を有するタンパク質。
　なお、タンパク質がカロテノイドケトラーゼ活性を有するか否かは、周知の方法によって確認することができる。例えば、所望のタンパク質と基質とを接触させた後、当該基質の赤外線スペクトル、または核磁気共鳴スペクトルを解析し、基質に「－ＣＯ－」が導入されていることが確認できれば、タンパク質がカロテノイドケトラーゼ活性を有していると判定することができる。あるいは、所望のタンパク質と基質とを接触させた後、当該基質と対照物質（基質に「－ＣＯ－」が導入されている物質）とをクロマトグラフィーにて分離し、当該分離の過程において、基質と対照物質とが同じ挙動（例えば、同じ溶出液にて溶出される）をとれば、タンパク質がカロテノイドケトラーゼ活性を有していると判定することができる。
　上記カロテノイドサイクラーゼは、例えば、以下の（ｄ）～（ｆ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ｄ）～（ｆ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ｄ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カロテノイドサイクラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｆ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カロテノイドサイクラーゼ活性を有するタンパク質。
　上記モノテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（ｇ）～（ｉ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ｇ）～（ｉ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ｇ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｈ）配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、モノテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
（ｉ）配列番号９で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、モノテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
　上記セスキテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（ｊ）～（ｌ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ｊ）～（ｌ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ｊ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｋ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セスキテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
（ｌ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セスキテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
　上記ジテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（ｍ）～（ｏ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ｍ）～（ｏ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ｍ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｎ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ジテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
（ｏ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ジテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
　上記トリテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（ｐ）～（ｒ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ｐ）～（ｒ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ｐ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｑ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トリテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
（ｒ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、トリテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
　なお、タンパク質が、カロテノイドサイクラーゼ活性、モノテルペノイドシンターゼ活性、セスキテルペノイドシンターゼ活性、ジテルペノイドシンターゼ活性、または、トリテルペノイドシンターゼ活性を有するか否かは、周知の方法によって確認することができる。例えば、所望のタンパク質と基質とを接触させた後、当該基質の赤外線スペクトル、または核磁気共鳴スペクトルを取得し、これらのスペクトルを、対照物質の赤外線スペクトル、または核磁気共鳴スペクトルと比較することによって確認することができる。あるいは、所望のタンパク質と基質とを接触させた後、当該基質と対照物質（基質に「－ＣＯ－」が導入されている物質）とをクロマトグラフィーにて分離し、当該分離の過程において、基質と対照物質とが同じ挙動（例えば、同じ溶出液にて溶出される）をとれば、タンパク質が、カロテノイドサイクラーゼ活性、モノテルペノイドシンターゼ活性、セスキテルペノイドシンターゼ活性、ジテルペノイドシンターゼ活性、または、トリテルペノイドシンターゼ活性を有していると判定することができる。
　本明細書における「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」では、欠失、置換若しくは付加が生じる位置は特に限定されない。
　また、「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、２個以内、または、１個のアミノ酸であり得る。
　アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。なお、保存的置換とは、特定のアミノ酸から、当該アミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、または、側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。
　保存的置換の例としては、例えば、セリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換、が挙げられる。勿論、本発明は、これらの置換に限定されない。
　なお、アミノ酸配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990) を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore ＝１００、wordlength ＝１２とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore ＝５０、wordlength ＝３とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
　更に具体的に、上記カロテノイドケトラーゼは、例えば、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、カロテノイドケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　上記カロテノイドサイクラーゼは、例えば、以下の（Ｃ）または（Ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ｃ）または（Ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ｃ）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、カロテノイドサイクラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　上記モノテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（Ｅ）または（Ｆ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ｅ）または（Ｆ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ｅ）配列番号１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｆ）配列番号１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、モノテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　上記セスキテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（Ｇ）または（Ｈ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ｇ）または（Ｈ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ｇ）配列番号１２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｈ）配列番号１２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、セスキテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　上記ジテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（Ｉ）または（Ｊ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ｉ）または（Ｊ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ｉ）配列番号１４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｊ）配列番号１４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　上記トリテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（Ｋ）または（Ｌ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ｋ）または（Ｌ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ｋ）配列番号１６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｌ）配列番号１６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、トリテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。
　例えば、一例を示すと、０．２５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６～２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。
　他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このことは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）等に記載されている。
　本実施の形態の形質転換体は、特定の微生物に対して、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子を導入することによって作製され得る。
　ロドトルラ属に属する微生物を形質転換するためのベクターは、これまで、未知であった。後述する実施例に示すように、プロモーター遺伝子、酵素をコードする遺伝子、および、ターミネーター遺伝子を連結してなるオペロンをｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ社製）へ挿入した後、オペロンのみをＰＣＲ法によって増幅する。増幅されたオペロンを精製した後、当該オペロンをロドトルラ属に属する微生物に導入することによって、所望の形質転換体を取得することができる。
　本発明は、以下のように構成することもできる。
　＜１＞本発明の形質転換体は、上記課題を解決するために、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物に、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子が導入されているものであることを特徴としている。
　＜２＞本発明の形質転換体では、上記テルペノイドは、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、または、カロテノイドであることが好ましい。
　＜３＞本発明の形質転換体では、上記酵素は、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドサイクラーゼ、モノテルペノイドシンターゼ、セスキテルペノイドシンターゼ、ジテルペノイドシンターゼ、または、トリテルペノイドシンターゼであることが好ましい。
　〔３．テルペノイドの製造方法〕
　本実施の形態のテルペノイドの製造方法は、本発明の形質転換体を培養する培養工程と、培養工程にて得られた形質転換体からテルペノイドを回収する回収工程と、を有している。本発明の形質転換体については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
　上記培養工程では、形質転換体を、固体培地を用いて培養（固体培養）してもよいし、液体培地を用いて培養（液体培養）してもよいが、形質転換体の培養スケール（換言すれば、テルペノイドの生産スケール）の調節の容易性、および、テルペノイド生産の低コスト化の観点からは、液体培地を用いて培養することが好ましい。また、液体培地を用いた培養であれば、形質転換体を連続培養することによって、テルペノイドの生産量を飛躍的に上げることができる。
　上記培養工程に用いる培地、培養温度、および、培養時間は、宿主に応じて適宜選択することができる。培地としては、Ｆ培地、またはＹＰＤ培地を挙げることができるが、本発明は、これらの培地に限定されない。培養温度としては、１５～４８℃、または２６～３７℃を挙げることができるが、本発明は、これらの培養温度に限定されない。培養時間としては、１２～１２０時間、７２～９６時間、または９６時間以上を挙げることができるが、本発明は、これらの培養時間に限定されない。
　本実施の形態のテルペノイドの製造方法は、上述した培養工程の後に、培養工程にて得られた形質転換体からテルペノイドを回収する回収工程を有している。回収工程の具体的な構成は特に限定されないが、回収工程は、以下に説明する抽出工程、および／または、精製工程を包含する工程であってもよい。
　本実施の形態のテルペノイドの製造方法は、上述した培養工程の後に、形質転換体からテルペノイドを抽出するための抽出工程を有していてもよい。当該構成であれば、純度の高いテルペノイドを取得することができる。
　抽出工程では、形質転換体と有機溶媒とを接触させ、形質転換体によって生産されたテルペノイドを有機溶媒中に移行させる。そして、当該有機溶媒を回収することによって、テルペノイドを回収することができる。また、抽出工程では、炭酸ガス、メタノール、および水等を用いて、テルペノイドを超臨界抽出することもできる。
　形質転換体と有機溶媒とを接触させる場合には、形質転換体を含む培地と有機溶媒とを混合してもよいし、形質転換体を含む培地を遠心分離して形質転換体を回収し、当該形質転換体を水に懸濁した後、当該水と有機溶媒とを混合してもよい。より純度の高いテルペノイドを取得するという観点からは、形質転換体を含む培地を遠心分離して形質転換体を回収し、当該形質転換体を水に懸濁した後、当該水と有機溶媒とを混合する方が好ましい。
　上述した有機溶媒の種類は、テルペノイドの種類に応じて、適宜選択すればよい。有機溶媒としては、例えば、ｎ－ペンタン、ｎ－ヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチルメチルケトン、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルフォキシド、クロロフォルム、ジクロロメタン、四塩化炭素、アセトニトリル、または、ピリジンを単独で使用してもよいし、これらの溶媒の少なくとも２つを混合して使用してもよい。
　本実施の形態のテルペノイドの製造方法は、上述した抽出工程の後に、抽出物に含まれるテルペノイドをクロマトグラフィーで精製する精製工程を有していてもよい。当該構成であれば、更に純度の高いテルペノイドを取得することができる。
　この際使用される分離用の担体としては、例えば、シリカゲル、硝酸銀添加シリカゲル、オクタデシルジメチルシリル修飾シリカゲル、ジメチルシリル修飾シリカゲル、オクチルジメチルシリル修飾シリカゲル、プロピルアミノ修飾シリカゲル、シアノプロピル修飾シリカゲル、フェニル修飾シリカゲル等の各種化学修飾シリカゲル、アルミナ、活性炭等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明は、以下のように構成することもできる。
　＜４＞本発明のテルペノイドの製造方法は、上記課題を解決するために、本発明の形質転換体を培養する培養工程と、上記培養工程にて得られた形質転換体からテルペノイドを回収する回収工程とを有することを特徴としている。
　＜５＞本発明のテルペノイドの製造方法では、上記培養工程にて、上記形質転換体を液体培養することが好ましい。
　＜１．脂肪酸、ステロイド、およびカロテノイドを多量に生産する微生物の探索＞
　様々な微生物（例えば、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アウランティアカ、ロドトルラ・グルチニス、ロドトルラ・アケニオラム）、サッカロマイセス・セルビシア（Saccharomyces cerevisiae）、ヤロビア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidas））を、各々、Ｆ培地中で、２５℃の条件下で１２０時間培養した。
　なお、ロドトルラ・アウランティアカは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、ロドトルラ・グルチニスは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、ロドトルラ・アケニオラムは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、サッカロマイセス・セルビシアは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、ヤロビア・リポリチカは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、ロドスポリジウム・トルロイデスは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、クリプトコッカス・アルビダスは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用いた。
　培養の後、遠心分離によって各菌体を回収し、回収した菌体を乾燥させた。その後、１ｇの乾燥菌体に含まれる、脂肪酸、ステロイドおよびカロテノイドの量を、周知の方法（例えば、日本生化学会編：新生化学実験講座４　脂質ＩＩ　リン脂質、東京化学同人（1991）、および、日本生化学会編：基礎生化学実験法　第５巻　脂質・糖質・複合糖質、東京化学同人（2000）参照）にしたがって測定した。測定結果を、下記の表１に示す。
　表１に示すように、ロドトルラ属に属する株は、カロテノイドの生産能力が高いことが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　＜２．テルペノイドを基質とする酵素（ｃｒｔＷ）をコードする遺伝子の導入＞
　まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）とブレバンディモナス属（Brevundimonas sp.）に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ遺伝子（ｃｒｔＷ）が挿入されたベクター１を作製した。なお、ベクター１の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
　ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ遺伝子の具体的な塩基配列を配列番号２にて示し、当該遺伝子にコードされているカロテノイドケトラーゼの具体的なアミノ酸配列を配列番号１にて示す。
　また、ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼが触媒する反応を図４に示す。図４に示すように、ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ（ｃｒｔＷ）は、基質であるβ－カロテンにケト基を導入すると考えられる。
　ベクター１では、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。
　次いで、上述したベクター１を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。
　まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２～３日間培養した。
　培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０～２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。
　回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％　ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ　ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＮＡ溶液（２ｍｇ－Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。
　上記混合溶液を２０～２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０～４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。
　数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子とカロテノイドケトラーゼ遺伝子とが導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の検出に用いたプライマーセット２、および、ＰＣＲの反応条件を示す。
　＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー　：５’－atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg－３’（配列番号３）
リバースプライマー　　：５’－gttagcctcccccatctcccgatccccacg－３’（配列番号４）
　＜プライマーセット２＞
フォワードプライマー　：５’－atgaccgccgccgtcgccgagccccgcatc－３’（配列番号５）
リバースプライマー　　：５’－agactcgccgcgccacaaacgccaccaggg－３’（配列番号６）
　＜ＰＣＲの反応条件＞
　６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。
　図１に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図１において、左側の写真は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図１において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」～「８」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」～「８」の形質転換体の各々を、「Ｗｈｙｇ１」～「Ｗｈｙｇ７」とも呼ぶ。
　図１に示すように、ピックアップされた７個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、カロテノイドケトラーゼ遺伝子も導入されていることが明らかになった。
　次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびカロテノイドケトラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。
　上述した「２」～「８」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。
　上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。
　市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット　ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。
　上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびカロテノイドケトラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プラーマーとして、上述したプライマーセット１またはプライマーセット２を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。
　図２に試験結果を示す。図２において、左側の写真は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図２において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」～「７」は、形質転換体である「Ｗｈｙｇ１」～「Ｗｈｙｇ７」に対応し、「８」は、ポジティブコントロールに対応し、「９」は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応している。
　図２に示すように、ピックアップされた７個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずカロテノイドケトラーゼ遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
　＜３．形質転換体からのカロテノイドの抽出＞
　取得された形質転換体、および、野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）の各々から、テルペノイドを精製した。以下に、精製方法について説明する。
　まず、各微生物をＦ培地（具体的には、液体状のＦ培地（換言すれば、液体培地）、または、固体状のＦ培地（換言すれば、固体培地））を用いて培養した後、増殖した各微生物を遠心分離によって回収した。回収した１ｇ（湿重量）の微生物に対して、（ａ）１ｍＬの蒸留水または有機溶媒を加え、更に（ｂ）５ｍＬの３％　Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ－ＭｅＯＨ溶液、および、（ｃ）１ｍＬの６０％　ＫＯＨ溶液を加えた後、当該混合溶液を３０分間、７０℃に加熱した。加熱後の混合溶液に対して、更に（ｄ）１１ｍＬの１％　ＮａＣｌ溶液を加えた。
　当該混合溶液に有機溶媒を加えて撹拌した後、静置し、水の層から分離した有機溶媒の層を回収した。更に、残った水の層に対して、再び有機溶媒を加えて撹拌した後、静置し、水の層から分離した有機溶媒の層を回収した。有機溶媒としては、２ｍＬのｎ－Ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ溶液（ｎ－Ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝９：１）と、２ｍＬのＥｔ２Ｏとの混合物を用いた。
　回収した２つの有機溶媒の層を合わせて１つとし、減圧下で有機溶媒を蒸発させて、残渣を回収した。当該残渣を２ｍＬの有機溶媒（１ｍＬのベンゼンと、１ｍＬの３％　Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ－ＭｅＯＨ溶液との混合溶液）に溶解した。
　抽出操作の過程で水の層に残った菌体を回収したところ、野生型のロドトルラ属に属する微生物の菌体と比較して、形質転換体の菌体は、より深い赤色を呈していた。また、抽出操作で得られた残渣を有機溶媒に溶解した溶液を確認したところ、野生型のロドトルラ属に属する微生物に由来する溶液と比較して、形質転換体に由来する溶液は、より深い赤色を呈していた。なお、これらの現象は、液体培地を用いた場合も、固体培地を用いた場合も、確認された。これらのことは、形質転換体が、テルペノイドの中でも特にカロテノイドを生産したことを示唆している。
　＜４．形質転換体が生産するカロテノイドの分析＞
　抽出操作で得られた残渣をＨＰＬＣ（high-performance liquid chromatography）に供し、残渣に含まれるカロテノイドを分析した。
　以下に、ＨＰＣＬの分析条件を示す；
カラム　　　　：ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３（４．６×２５０ｍｍ）、
カラム温度　　：３０℃、
溶出溶媒の流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、
検出方法　　　：４５０ｎｍ（ＶＩＳ）、
外部標準　　　：β－カロテン。
　溶出溶媒としては、溶媒Ａ、溶媒Ｂおよび溶媒Ｃを所望の比率で含有する溶出溶媒を用い、経時的に溶出溶媒中に含まれる各溶媒の比率を変化させながら、溶出操作を行った。
　以下に、溶媒Ａ～溶媒Ｃの成分を示す；
溶媒Ａ：水、
溶媒Ｂ：メタノール、
溶媒Ｃ：アセトン。
　以下の表２に、溶出溶媒中に含まれる溶媒Ａ～溶媒Ｃの比率（％）の経時的な変化（グラジエント溶出のプログラム）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　図３に、残渣に含まれている成分に関する、ＨＰＬＣによる分析結果を示す。更に、検出された４５０ｎｍ（ＶＩＳ）に基づいて、以下のＡ値～Ｆ値をβ-カロテン相当量として算出した。その結果を、表３に示す。
Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ－ＦＷ］、
Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ－ＤＣＷ］、
Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／Ｌ］、
Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるβ－カロテンおよびβ－カロテンの異性体の量［ｍｇ／ｇ－ＦＷ］、
Ｅ値：湿菌体１ｇあたりに含まれる目的のカロテノイド（図３中の「酸化物」）の量［ｍｇ／ｇ－ＦＷ］、
Ｆ値：β－カロテンおよびβ－カロテンの異性体から、目的のカロテノイド（図３中の「カンタキサンチン」および「酸化物」）への変換率［％］。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　形質転換体に由来する残渣を分析した場合には、カロテノイド（図３中の「カンタキサンチン」および「酸化物」）に対応するピークが検出されたのに対し、野生型のロドトルラ属に属する微生物に由来する残渣を分析した場合には、カロテノイドに対応するピークが検出されなかった（Ｎ．Ｄ．）。このことは、形質転換体が、野生型のロドトルラ属に属する微生物では生産されないカロテノイドを生産し得ることを示している。
　また、液体培地で培養した形質転換体に由来する残渣を分析した時に検出される、カロテノイドに対応するピークは、固体培地で培養した形質転換体に由来する残渣を分析した時に検出される、カロテノイドに対応するピークと比較して、高かった。このことは、液体培地で培養した形質転換体が、固体培地で培養した形質転換体と比較して、より多くのカロテノイドを生産し得ることを示している。
　また、液体培地で培養した形質転換体に由来する残渣を分析した時に検出される、β－カロテンおよびβ－カロテンの異性体に対応すると考えられるピークは、同条件下で培養した野生株に由来する残渣を分析した時に検出される、β－カロテンおよびβ－カロテンの異性体に対応すると考えられるピークと比較して、高かった。このことは、液体培地で培養した形質転換体が、同条件下で培養した野生株と比較して、より多くのβ－カロテンおよびβ－カロテンの異性体を生産し得ること（換言すれば、テルペノイドの合成経路をより活性化し得ること）を示している。
　＜５．テルペノイドを基質とする酵素（ｃｒｔＹ）をコードする遺伝子の導入＞
　まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）とパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ遺伝子（ｃｒｔＹ）が挿入されたベクター２を作製した。なお、ベクター２の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
　パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ遺伝子の具体的な塩基配列を配列番号８にて示し、当該遺伝子にコードされているカロテノイドサイクラーゼの具体的なアミノ酸配列を配列番号７にて示す。
　また、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼが触媒する反応を図４に示す。図４に示すように、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ（ｃｒｔＹ）は、基質であるリコペンを環状化すると考えられる。
　ベクター２では、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。
　次いで、上述したベクター２を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。
　まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２～３日間培養した。
　培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０～２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。
　回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％　ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ　ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＮＡ溶液（２ｍｇ－Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。
　上記混合溶液を２０～２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０～４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。
　数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子とカロテノイドサイクラーゼ遺伝子とが導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の検出に用いたプライマーセット３、および、ＰＣＲの反応条件を示す。
　＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー　：５’－atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg－３’（配列番号３）
リバースプライマー　　：５’－gttagcctcccccatctcccgatccccacg－３’（配列番号４）
　＜プライマーセット３＞
フォワードプライマー　：５’－atgcaaccgcattatgatctgattctcgtg－３’（配列番号１７）
リバースプライマー　　：５’－acgatgagtcgtcataatggcttgcaatgc－３’（配列番号１８）
　＜ＰＣＲの反応条件＞
　６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。
　図５に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図５おいて、左側の写真は、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図５において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」～「４」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」～「４」の形質転換体の各々を、「Ｙｈｙｇ１」～「Ｙｈｙｇ３」とも呼ぶ。
　図５に示すように、ピックアップされた３個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子も導入されていることが明らかになった。
　次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。
　上述した「２」～「４」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。
　上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。
　市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット　ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。
　上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プライマーとして、上述したプライマーセット１またはプライマーセット３を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。
　図６に試験結果を示す。図６において、左側の写真は、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図６において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」は、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応し、「２」は、ポジティブコントロールに対応し、「３」～「５」は、形質転換体である「Ｙｈｙｇ１」～「Ｙｈｙｇ３」に対応している。
　図６に示すように、ピックアップされた３個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
　＜６．形質転換体が生産するカロテノイドの分析＞
　＜３．形質転換体からのカロテノイドの抽出＞にて説明した抽出操作と同様の抽出操作で得られた残渣をＨＰＬＣ（high-performance liquid chromatography）に供し、残渣に含まれるカロテノイドを分析した。
　以下に、ＨＰＣＬの分析条件を示す；
カラム　　　　：ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３（４．６×２５０ｍｍ）、
カラム温度　　：３０℃、
溶出溶媒の流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、
検出方法　　　：４５０ｎｍ（ＶＩＳ）、
外部標準　　　：β－カロテン。
　溶出溶媒としては、溶媒Ａおよび溶媒Ｂを所望の比率で含有する溶出溶媒を用い、経時的に溶出溶媒中に含まれる各溶媒の比率を変化させながら、溶出操作を行った。
　以下に、溶媒Ａおよび溶媒Ｂの成分を示す；
溶媒Ａ：水／メタノール＝１０／９０、
溶媒Ｂ：メタノール／アセトン＝５０／５０。
　以下の表４に、溶出溶媒中に含まれる溶媒Ａおよび溶媒Ｂの比率（％）の経時的な変化（グラジエント溶出のプログラム）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　図７に、残渣に含まれている成分に関する、ＨＰＬＣによる分析結果を示す。更に、検出された４５０ｎｍ（ＶＩＳ）に基づいて、以下のＡ値～Ｄ値をβ-カロテン相当量として算出した。その結果を、表５に示す。
Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ－ＦＷ］、
Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ－ＤＣＷ］、
Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／Ｌ］、
Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるβ－カロテンの量［ｍｇ／ｇ－ＦＷ］。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　残渣を分析した結果、形質転換体では、同条件で培養した野生型のロドトルラ属に属する微生物に比べて、湿菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量が２．４倍になっていた。このことは、形質転換体が、野生型のロドトルラ属に属する微生物と比較して、多くのカロテノイドを生産し得ることを示している。
　＜７．テルペノイドを基質とする酵素（ｃｒｔＹ、およびｃｒｔＷ）をコードする遺伝子の導入＞
　まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ遺伝子（ｃｒｔＹ）、および、ブレバンディモナス属（Brevundimonas sp.）に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ遺伝子（ｃｒｔＷ）が挿入されたベクター３を作製した。なお、ベクター３の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
　パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ遺伝子の具体的な塩基配列を配列番号８にて示し、当該遺伝子にコードされているカロテノイドサイクラーゼの具体的なアミノ酸配列を配列番号７にて示す。また、ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ遺伝子の具体的な塩基配列を配列番号２にて示し、当該遺伝子にコードされているカロテノイドケトラーゼの具体的なアミノ酸配列を配列番号１にて示す。
　また、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ、およびブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼが触媒する反応を図４に示す。図４に示すように、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ（ｃｒｔＹ）は、基質であるリコペンを環状化すると考えられる。一方、ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ（ｃｒｔＷ）は、基質であるβ－カロテンにケト基を導入すると考えられる。
　ベクター３では、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。
　次いで、上述したベクター３を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。
　まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２～３日間培養した。
　培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０～２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。
　回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％　ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ　ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＮＡ溶液（２ｍｇ－Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。
　上記混合溶液を２０～２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０～４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。
　数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子が導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の検出に用いたプライマーセット２、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の検出に用いたプライマーセット３、および、ＰＣＲの反応条件を示す。
　＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー　：５’－atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg－３’（配列番号３）
リバースプライマー　　：５’－gttagcctcccccatctcccgatccccacg－３’（配列番号４）
　＜プライマーセット２＞
フォワードプライマー　：５’－atgaccgccgccgtcgccgagccccgcatc－３’（配列番号５）
リバースプライマー　　：５’－agactcgccgcgccacaaacgccaccaggg－３’（配列番号６）
　＜プライマーセット３＞
フォワードプライマー　：５’－atgcaaccgcattatgatctgattctcgtg－３’（配列番号１７）
リバースプライマー　　：５’－acgatgagtcgtcataatggcttgcaatgc－３’（配列番号１８）
　＜ＰＣＲの反応条件＞
　６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。
　図８に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図８において、左側の写真は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の検出結果を示し、中央の写真は、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図８において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」～「４」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」～「４」の形質転換体の各々を、「ＷＹｈｙｇ１」～「ＷＹｈｙｇ３」とも呼ぶ。
　図８に示すように、ピックアップされた３個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子も導入されていることが明らかになった。
　次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。
　上述した「２」～「４」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。
　上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。
　市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット　ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。
　上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プライマーとして、上述したプライマーセット１、プライマーセット２、または、プライマーセット３を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。
　図９に試験結果を示す。図９において、左側の写真は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、中央の写真は、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図９において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子、およびハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応し、「２」は、ポジティブコントロールに対応し、「３」～「５」は、形質転換体である「ＷＹｈｙｇ１」～「ＷＹｈｙｇ３」に対応している。
　図９に示すように、ピックアップされた３個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずカロテノイドケトラーゼ遺伝、およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
　＜８．形質転換体が生産するカロテノイドの分析＞
　＜３．形質転換体からのカロテノイドの抽出＞にて説明した抽出操作と同様の抽出操作で得られた残渣をＨＰＬＣ（high-performance liquid chromatography）に供し、残渣に含まれるカロテノイドを分析した。
　以下に、ＨＰＣＬの分析条件を示す；
カラム　　　　：ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３（４．６×２５０ｍｍ）、
カラム温度　　：３０℃、
溶出溶媒の流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、
検出方法　　　：４５０ｎｍ（ＶＩＳ）、
外部標準　　　：β－カロテン。
　溶出溶媒としては、溶媒Ａおよび溶媒Ｂを所望の比率で含有する溶出溶媒を用い、経時的に溶出溶媒中に含まれる各溶媒の比率を変化させながら、溶出操作を行った。
　以下に、溶媒Ａおよび溶媒Ｂの成分を示す；
　溶媒Ａ：水／メタノール＝１０／９０、
　溶媒Ｂ：メタノール／アセトン＝５０／５０。
　以下の表６に、溶出溶媒中に含まれる溶媒Ａおよび溶媒Ｂの比率（％）の経時的な変化（グラジエント溶出のプログラム）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　図１０に、残渣に含まれている成分に関する、ＨＰＬＣによる分析結果を示す。更に、検出された４５０ｎｍ（ＶＩＳ）に基づいて、以下のＡ値～Ｄ値をβ-カロテン相当量として算出した。その結果を、表７に示す。
Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ－ＦＷ］、
Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ－ＤＣＷ］、
Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／Ｌ］、
Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるカンタキサンチンの量［ｍｇ／ｇ－ＦＷ］。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　残渣を分析した結果、形質転換体では、同条件で培養した野生型のロドトルラ属に属する微生物に比べて、全カロテノイドの総量が１．２７倍になっていた。このことは、形質転換体が、複数のカロテノイド生合成遺伝子を発現させてもカロテノイドを生産し得ることを示している。
　＜９．アモルファジエン合成酵素（ＡＤＳ）をコードする遺伝子の導入＞
　まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）とアルテミシア・アヌア(Artemisia annua)に由来するアモルファジエン合成酵素遺伝子（ＡＤＳ）が挿入されたベクター４を作製した。なお、ベクター４の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
　アルテミシア・アヌア(Artemisia annua)に由来するアモルファジエン合成酵素遺伝子（ＡＤＳ）の具体的な塩基配列を配列番号１２にて示し、当該遺伝子にコードされているアモルファジエン合成酵素の具体的なアミノ酸配列を配列番号１１にて示す。
　また、アルテミシア・アヌア(Artemisia annua)に由来するアモルファジエン合成酵素が触媒する反応を図１１に示す。図１１に示すように、アルテミシア・アヌア(Artemisia annua)に由来するアモルファジエン合成酵素は、基質であるＦＰＰを環状化すると考えられる。
　ベクター４は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、アモルファジエン合成酵素遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、アモルファジエン合成酵素遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、アモルファジエン合成酵素遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。
　次いで、上述したベクター４を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。
　まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２～３日間培養した。
　培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０～２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。
　回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％　ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ　ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＮＡ溶液（２ｍｇ－Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。
　上記混合溶液を２０～２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０～４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。
　数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子とアモルファジエン合成酵素遺伝子とが導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、アモルファジエン合成酵素遺伝子の検出に用いたプライマーセット４、および、ＰＣＲの反応条件を示す。
　＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー　：５’－atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg－３’（配列番号３）
リバースプライマー　　：５’－gttagcctcccccatctcccgatccccacg－３’（配列番号４）
　＜プライマーセット４＞
フォワードプライマー　：５’－atgtcacttacagaagaaaaacctattcgc－３’（配列番号１９）
リバースプライマー　　：５’－tatactcataggataaacgagtagagactttatg－３’（配列番号２０）
　＜ＰＣＲの反応条件＞
　６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。
　図１２に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図１２において、左側の写真は、アモルファジエン合成酵素遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図１２において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」～「３」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」～「３」の形質転換体の各々を、「ＡＤＳｈｙｇ１」～「ＡＤＳｈｙｇ２」とも呼ぶ。
　図１２に示すように、ピックアップされた２個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、アモルファジエン合成酵素遺伝子も導入されていることが明らかになった。
　次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびアモルファジエン合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。
　上述した「２」～「３」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。
　上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。
　市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット　ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。
　上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびアモルファジエン合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プライマーとして、上述したプライマーセット１またはプライマーセット４を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。
　図１３に試験結果を示す。図１３において、左側の写真は、アモルファジエン合成酵素遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図１３において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」は、アモルファジエン合成酵素遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応し、「２」は、ポジティブコントロールに対応し、「３」～「４」は、形質転換体である「ＡＤＳｈｙｇ１」～「ＡＤＳｈｙｇ２」に対応している。
　図１３に示すように、ピックアップされた２個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずアモルファジエン合成酵素遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
＜１０．形質転換体が生産するセスキテルペノイドの分析＞
　各微生物をＦ培地（具体的には、液体状のＦ培地（換言すれば、液体培地）、または、固体状のＦ培地（換言すれば、固体培地））を用いて培養した後、増殖した各微生物を遠心分離によって回収した。回収した１ｇ（湿重量）の微生物に対して、（ａ）１ｍＬの蒸留水または有機溶媒を加え３０分間抽出した後、更に（ｂ）１０ｍＬの蒸留水を加えた。
　当該混合溶液に有機溶媒を加えて撹拌した後、静置し、水の層から分離した有機溶媒の層を回収した。更に、残った水の層に対して、再び有機溶媒を加えて撹拌した後、静置し、水の層から分離した有機溶媒の層を回収した。さらに同操作を２回行い、計３回抽出操作をおこなった。有機溶媒としては、３ｍＬのＥｔＯＡｃを用いた。
　回収した３つの有機溶媒の層を合わせて１つとし、窒素気流下で有機溶媒を揮発させて、残渣を回収した。当該残渣を１ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解した。
抽出操作で得られたＥｔＯＡｃ溶液をＧＣ－ＭＳ（Gas Chromatography -　mass spectrometry）に供し、残渣に含まれるセスキテルペノイドを分析した。
　以下に、ＧＣ－ＭＳの分析条件を示す；
カラム　　　　：ＨＰ－５ＭＳ（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）、
気化室温度　　：２５０℃
　　　　　　　　　カラム温度　　：１００℃（２分間保持）～（昇温：１０℃／ｍｉｎ）～２８０℃
　　　　　　　　　　　　　　　　　（５分間保持）
ガス　　　　　：ヘリウム
線速度　　　　：３０．５ｃｍ／ｓｅｃ、
スピリット比　：１０、
イオン源温度　：２５０℃
インターフェース温度：２８０℃、
溶媒溶出時間　：３ｍｉｎ、
イオン化法　　：ＥＩ、
スキャン速度　：４ｓｃａｎ／ｓｅｃ
スキャン範囲　：ｍ／ｚ　４０～６００
外部標準　　　：アモルファ－４，１１－ジエン。
　図１４に、残渣に含まれている成分に関する、ＧＣ－ＭＳによる分析結果を示す。更に、検出されたピークエリア面積に基づいて、以下のＡ値～Ｄ値をアモルファ－４，１１－ジエン量として算出した。その結果を、表８に示す。
　Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるセスキテルペノイドの量［μｇ／ｇ－ＦＷ］、
　Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれるアモルファ－４，１１－ジエンの量の総量［μｇ／ｇ－ＤＣＷ］、
　Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれるアモルファ－４，１１－ジエンの量の総量［ｍｇ／Ｌ］、
　Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるアモルファ－４，１１－ジエンの量［μｇ／ｇ－ＦＷ］。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　残渣を分析した結果、野生型のロドトルラ属に属する微生物ではアモルファ－４，１１－ジエンを含むセスキテルペンが検出されないのに対して、形質転換体では、同条件で培養した、培地１Ｌあたりに含まれるアモルファ－４，１１－ジエンが０．１８０ｍｇ／Ｌ検出された。このことは、形質転換体が、野生型のロドトルラ属に属する微生物と比較して、セスキテルペノイドを生産し得ることを示している。
　＜１１．β―アミリン合成酵素（ｂＡＳ）をコードする遺伝子の導入＞
　まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）とグリチライザ　ウラレンシス(Glycyrrhiza　uralensis)に由来するβ―アミリン合成酵素遺伝子（ｂＡＳ）が挿入されたベクター５を作製した。なお、ベクター５の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
　グリチライザ　ウラレンシス(Glycyrrhiza　uralensis)に由来するβ―アミリン合成酵素遺伝子（ｂＡＳ）の具体的な塩基配列を配列番号１６にて示し、当該遺伝子にコードされているβ―アミリン合成酵素の具体的なアミノ酸配列を配列番号１５にて示す。
　また、グリチライザ　ウラレンシス(Glycyrrhiza　uralensis)に由来するβ―アミリン合成酵素が触媒する反応を図１５に示す。図１５に示すように、グリチライザ　ウラレンシス(Glycyrrhiza　uralensis)に由来するβ―アミリン合成酵素は、基質である2,3-オキシドスクアレンを環状化すると考えられる。
　ベクター５は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、β―アミリン合成酵素遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、β―アミリン合成酵素遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、β―アミリン合成酵素遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。
　次いで、上述したベクター５を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。
　まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２～３日間培養した。
　培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０～２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。
　回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％　ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ　ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＮＡ溶液（２ｍｇ－Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。
　上記混合溶液を２０～２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０～４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。
　数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子とβ―アミリン合成酵素遺伝子とが導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、β―アミリン合成酵素遺伝子の検出に用いたプライマーセット５、および、ＰＣＲの反応条件を示す。
　＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー　：５’－atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg－３’（配列番号３）
リバースプライマー　　：５’－gttagcctcccccatctcccgatccccacg－３’（配列番号４）
　＜プライマーセット５＞
フォワードプライマー　：５’－aaggacccatacatatacagcacaaacaac－３’（配列番号２１）
リバースプライマー　　：５’－caatggaacccgtctacgatactcagctag－３’（配列番号２２）
　＜ＰＣＲの反応条件＞
　６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。
　図１６に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図１６において、左側の写真は、β－アミリン合成酵素遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図１６において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」～「５」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」～「５」の形質転換体の各々を、「ｂＡＳｈｙｇ１」～「ｂＡＳｈｙｇ４」とも呼ぶ。
　図１６に示すように、ピックアップされた４個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、β―アミリン合成酵素遺伝子も導入されていることが明らかになった。
　次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ－アミリン合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。
　上述した「２」～「５」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。
　上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。
　市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット　ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。
　上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ―アミリン合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プライマーとして、上述したプライマーセット１またはプライマーセット５を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。
　図１７に試験結果を示す。図１７において、左側の写真は、β―アミリン合成酵素遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図１７において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」は、β―アミリン合成酵素遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応し、「２」は、ポジティブコントロールに対応し、「３」～「６」は、形質転換体である「ｂＡＳｈｙｇ１」～「ｂＡＳｈｙｇ４」に対応している。
　図１７に示すように、ピックアップされた４個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずβ―アミリン合成酵素遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
＜１２．形質転換体が生産するトリテルペノイドの分析＞
　各微生物をＦ培地（具体的には、液体状のＦ培地（換言すれば、液体培地）、または、固体状のＦ培地（換言すれば、固体培地））を用いて培養した後、増殖した各微生物を遠心分離によって回収した。回収した１ｇ（湿重量）の微生物に対して、（ａ）１ｍＬのクロロフォルム及び２ｍＬのメタノールを加え３０分間抽出した後、更に（ｂ）２ｍＬのクロロフォルム及び２ｍＬの蒸留水を加えた。
　当該混合溶液を撹拌した後、静置し、水/メタノールの層から分離したクロロフォルムの層を回収した。回収したクロロフォルムの層を減圧条件下で有機溶媒を揮発させて、残渣を回収した。
　回収した残渣に１ｍＬの２Ｎ水酸化カリウム・メタノール溶液を加え７０℃で３０分加熱した。１Ｎ塩酸を２．５ｍＬ及び加えた後、１ｍＬの有機溶媒を加えて撹拌した後、静置し、水の層から分離した有機溶媒の層を回収した。さらに同操作を１回行い、計２回抽出操作をおこなった。有機溶媒としては、ＥｔＯＡｃを用いた。
　回収した２つの有機溶媒の層を合わせて１つとし、減圧条件下で有機溶媒を揮発させて、残渣を回収した。当該残渣を０．５ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解した。
　当該溶解液から５０μＬを取り出し、窒素気流下で有機溶媒を揮発させた後、５０μＬのN-メチル-N-(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミドを加え７０℃で３０分加熱しトリメチルシリル化を行った。
　抽出操作で得られたトリメチルシリル化溶液をＧＣ－ＭＳ（Gas Chromatography -　mass spectrometry）に供し、残渣に含まれるトリテルペノイドを分析した。
　以下に、ＧＣ－ＭＳの分析条件を示す；
カラム　　　　：ＤＢ－１ＭＳ（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）、
気化室温度　　：２５０℃
　　　　　　　　　カラム温度　　：６０℃（１分間保持）～（昇温：２０℃／min）～３００℃
　　　　　　　　　　　　　　　　（２８分間保持）
ガス　　　　　：ヘリウム
線速度　　　　：３６．５ｃｍ／ｓｅｃ、
注入法　　　　：スピリットレス、
イオン源温度　：２８０℃
インターフェース温度：３００℃、
溶媒溶出時間　：４ｍｉｎ、
イオン化法　　：ＥＩ、
スキャン速度　：３ｓｃａｎ／ｓｅｃ
スキャン範囲　：ｍ／ｚ　５０～８００
外部標準　　　：β－アミリン。
　図１８に、残渣に含まれている成分に関する、ＧＣ－ＭＳによる分析結果を示す。更に、検出されたピークエリア面積に基づいて、以下のＡ値～Ｄ値をβ―アミリン量として算出した。その結果を、表９に示す。
Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるトリテルペノイドの量［μｇ／ｇ－ＦＷ］、
Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれるβ－アミリンの量の総量［μｇ／ｇ－ＤＣＷ］、
Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれるβ－アミリンの量の総量［ｍｇ／Ｌ］、
Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるβ－アミリンの量［μｇ／ｇ－ＦＷ］。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　残渣を分析した結果、野生型のロドトルラ属に属する微生物ではβ―アミリン等の植物ステロールを含むトリテルペンが検出されないのに対して、形質転換体では、同条件で培養した、培地１Ｌあたりに含まれるβ―アミリンが２．７５ｍｇ／Ｌ検出された。このことは、形質転換体が、野生型のロドトルラ属に属する微生物と比較して、他の生物種由来のトリテルペノイドを生産し得ることを示している。
　＜１３．ルペオール合成酵素（ＬＵＳ）をコードする遺伝子の導入＞
　まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）とグリチライザ　ウラレンシス(Glycyrrhiza　uralensis)に由来するルペオール合成酵素遺伝子（ＬＵＳ）が挿入されたベクター６を作製した。なお、ベクター６の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
　グリチライザ　ウラレンシス(Glycyrrhiza　uralensis)に由来するルペオール合成酵素遺伝子（ＬＵＳ）の具体的な塩基配列を配列番号２４にて示し、当該遺伝子にコードされているルペオール合成酵素の具体的なアミノ酸配列を配列番号２３にて示す。
　また、グリチライザ　ウラレンシス(Glycyrrhiza　uralensis)に由来するルペオール合成酵素が触媒する反応を図１９に示す。図１９に示すように、グリチライザ　ウラレンシス(Glycyrrhiza　uralensis)に由来するルペオール合成酵素は、基質である2,3-オキシドスクアレンを環状化すると考えられる。
　ベクター６は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、ルペオール合成酵素遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ルペオール合成酵素遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ルペオール合成酵素遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。
　次いで、上述したベクター６を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。
　まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２～３日間培養した。
　培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０～２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。
　回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％　ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ　ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＮＡ溶液（２ｍｇ－Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。
　上記混合溶液を２０～２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０～４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。
　数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子とルペオール合成酵素遺伝子とが導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、ルペオール合成酵素遺伝子の検出に用いたプライマーセット６、および、ＰＣＲの反応条件を示す。
　＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー　：５’－atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg－３’（配列番号３）
リバースプライマー　　：５’－gttagcctcccccatctcccgatccccacg－３’（配列番号４）
　＜プライマーセット６＞
フォワードプライマー　：５’－ggaagctgaagataggagaaggaggagcgg－３’（配列番号２５）
リバースプライマー　　：５’－gtgagcacacaagacttggcgacgatactc－３’（配列番号２６）
　＜ＰＣＲの反応条件＞
　６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。
　図２０に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図２０において、左側の写真は、ルペオール合成酵素遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図２０において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」～「５」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」～「５」の形質転換体の各々を、「ＬＵＳｈｙｇ１」～「ＬＵＳｈｙｇ４」とも呼ぶ。
　図２０に示すように、ピックアップされた４個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、ルペオール合成酵素遺伝子も導入されていることが明らかになった。
　次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびルペオール合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。
　上述した「２」～「５」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。
　上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。
　市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット　ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。
　上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびルペオール合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プライマーとして、上述したプライマーセット１またはプライマーセット６を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。
　図２１に試験結果を示す。図２１において、左側の写真は、ルペオール合成酵素遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図６において、「Ｍ」は、１ｋｂ　ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」～「５」は、形質転換体である「ＬＵＳｈｙｇ１」～「ＬＵＳｈｙｇ４」に対応し、「６」は、ルペオール合成酵素遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応している。
　図２１に示すように、ピックアップされた４個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずルペオール合成酵素遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
　＜１２．形質転換体が生産するトリテルペノイドの分析＞にて説明した抽出操作と同様の抽出操作で得られたトリメチルシリル化溶液をＧＣ－ＭＳ（Gas Chromatography -　mass spectrometry）に供し、残渣に含まれるカロテノイドを分析した。
　以下に、ＧＣ－ＭＳの分析条件を示す；
カラム　　　　：ＤＢ－１ＭＳ（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）、
気化室温度　　：２５０℃
　　　　　　　　　カラム温度　　：６０℃（１分間保持）～（昇温：２０℃／min）～３００℃
　　　　　　　　　　　　　　　　　（２８分間保持）
ガス　　　　　：ヘリウム
線速度　　　　：３６．５ｃｍ／ｓｅｃ、
注入法　　　　：スピリットレス、
イオン源温度　：２８０℃
インターフェース温度：３００℃、
溶媒溶出時間　：４ｍｉｎ、
イオン化法　　：ＥＩ、
スキャン速度　：３ｓｃａｎ／ｓｅｃ
スキャン範囲　：ｍ／ｚ　５０～８００
外部標準　　　：ルペオール。
　図２２に、残渣に含まれている成分に関する、ＧＣ－ＭＳによる分析結果を示す。更に、検出されたピークエリア面積に基づいて、以下のＡ値～Ｄ値をルペオール量として算出した。その結果を、表１０に示す。
　Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるトリテルペノイドの量［μｇ／ｇ－ＦＷ］、
　Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれるルペオールの量の総量［μｇ／ｇ－ＤＣＷ］、
　Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれるルペオールの量の総量［ｍｇ／Ｌ］、
　Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるルペオールの量［μｇ／ｇ－ＦＷ］。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 　残渣を分析した結果、野生型のロドトルラ属に属する微生物ではルペオール等の植物ステロールを含むトリテルペンが検出されないのに対して、形質転換体では、同条件で培養した、培地１Ｌあたりに含まれるルペオールが１．８５ｍｇ／Ｌ検出された。このことは、形質転換体が、野生型のロドトルラ属に属する微生物と比較して、他の生物種由来のトリテルペノイドを生産し得ることを示している。
　本発明は、医薬品、飼料、食品添加物、機能性食品、香料、バイオ燃料などの種々の産業において利用可能である。

Claims (5)

  1. 　ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物に、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。
  2. 　上記テルペノイドは、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、または、カロテノイドであることを特徴とする請求項１に記載の形質転換体。
  3. 　上記酵素は、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドサイクラーゼ、モノテルペノイドシンターゼ、セスキテルペノイドシンターゼ、ジテルペノイドシンターゼ、または、トリテルペノイドシンターゼであることを特徴とする請求項１または２に記載の形質転換体。
  4. 　請求項１～３の何れか１項に記載の形質転換体を培養する培養工程と、上記培養工程にて得られた形質転換体からテルペノイドを回収する回収工程と、を有することを特徴とするテルペノイドの製造方法。
  5. 　上記培養工程では、上記形質転換体を液体培養することを特徴とする請求項４に記載のテルペノイドの製造方法。
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