SK13722000A3 - Kontrola génovej expresie - Google Patents

Kontrola génovej expresie Download PDF

Info

Publication number
SK13722000A3
SK13722000A3 SK1372-2000A SK13722000A SK13722000A3 SK 13722000 A3 SK13722000 A3 SK 13722000A3 SK 13722000 A SK13722000 A SK 13722000A SK 13722000 A3 SK13722000 A3 SK 13722000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
gene
sequence
plasmid
nucleic acid
tissue
Prior art date
Application number
SK1372-2000A
Other languages
English (en)
Other versions
SK287538B6 (sk
Inventor
Michael Graham
Robert Norman Rice
Original Assignee
Benitec Australia Ltd
State Of Queensland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25645735&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK13722000(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from AUPP2492A external-priority patent/AUPP249298A0/en
Priority claimed from AUPP2499A external-priority patent/AUPP249998A0/en
Application filed by Benitec Australia Ltd, State Of Queensland filed Critical Benitec Australia Ltd
Publication of SK13722000A3 publication Critical patent/SK13722000A3/sk
Publication of SK287538B6 publication Critical patent/SK287538B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/127—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/38—Vector systems having a special element relevant for transcription being a stuffer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Description

KONTROLA GÉNOVEJ EXPRESIE
Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka všeobecne spôsobu modifikácie génovej expresie a syntetických génov na modifikáciu endogénnej génovej expresie v bunke, tkanive alebo orgáne transgénneho organizmu, zvlášť transgénneho zvieraťa alebo rastliny. Predkladaný vynález využíva technológiu rekombinantnej DNA pre posttranskripčnú modifikáciu alebo moduláciu expresie cieľového génu v bunke, tkanive alebo orgáne alebo v celom organizme, čím sa vytvárajú nové fenotypy. Vynález tiež poskytuje nové syntetické gény a génové konštrukty, ktoré sú schopné potlačiť, oneskoriť alebo inak redukovať expresiu endogénneho génu alebo cieľového génu v organizme, do ktorého sú vnesené.
Doterajší stav techniky
Bibliografické údaje o publikáciách, ktoré predstavujú stav techniky relevantný pre predkladaný vynález, sú uvedené na konci opisu vynálezu.
Termín „odvodený,, znamená v predkladanom opise, že určitý špecifický celok môže byť získaný z konkrétne špecifikovaného zdroja alebo biologického druhu, i keď v žiadnom prípade nevyhnutne priamo z takto špecifikovaného zdroja alebo biologického druhu.
V celom opise vynálezu termíny „obsahuje,, a jeho modifikácie ako napr. „obsahujúci,, znamenajú, pokiaľ nevyplýva zo súvislosti niečo iného, zahrnutie daného kroku alebo prvku alebo celku alebo skupiny krokov, prvkov alebo celkov, a súčasne neznamená vylúčenie akýchkoľvek ďalších krokov, prvkov alebo celkov alebo skupín prvkov alebo celkov.
Odborník ocení, že vynález opísaný v predkladanej prihláške je prístupný
31543/H • · variáciám a modifikáciám toho, čo je tu špecificky opísané. To znamená, že tieto variácie a modifikácie sú tiež súčasťou predkladaného vynálezu. Vynález zahrňuje tiež všetky kroky, vlastnosti, prípravky a zlúčeniny, na ktoré sa odvoláva alebo tiež akúkolVek zo všetkých možných kombinácií alebo ktoréhokoľvek dvoch alebo viac krokov alebo vlastností.
Predkladaný vynález nie je v žiadnom prípade obmedzený len na špecifické uskutočnenia opísané tu len ako príklady. Funkčné ekvivalentné produkty, prípravky a spôsoby patria do predmetu predkladaného vynálezu, ako je tu opísaný.
Sekvencie označené identifikačnými číslami (ako napr. sekvencia id. č. 1), obsahujúca informácie o nukleotidových sekvenciách alebo aminokyselinových sekvenciách, sú uvedené na konci ako zoznam sekvencii a boli pripravené pomocou počítačového programu Patentln verzia 2.0. Každá nukleotidová alebo aminokyselinová sekvencia je identifikovaná v zozname sekvencii numerickým identifikátorom <210> nasledovaným identifikátorom sekvencie (teda napr. <210>1, <210>2 atď.) Dĺžka a typ sekvencie (DNA, proteín (=PRT) atď.) a zdrojový organizmus sú pre každú nukleotidovú alebo aminokyselinovú sekvenciu uvedené v informáciách v poliach označených indikátormi <211>, <212> a <213>. Každá nukleotidová alebo aminokyselinová sekvencia, na ktorú sa v opise odkazuje, je definovaná v poli s indikátorom <400>1, <400>2 atď.).
Označenie nukleotidov je podľa odporúčaní Biochemickej nomenklatúrnej komisie IUPAC-IUB, kde A znamená adenín, C znamená cytozín, G znamená guanín, T znamená tymín, Y znamená pyrimidínový zvyšok, R znamená purínový zvyšok, M znamená adenín alebo cytozín, K znamená guanín alebo tymín, S znamená guanín alebo cytozín, W znamená adenín alebo tymín, H znamená nukleotid iný ako guanín, B znamená nukleotid iný ako adenín, V znamená nukleotid iný ako tymín, D znamená nukleotid iný ako cytozín a N znamená akýkoľvek nukleotidový zvyšok.
Označenie aminokyselinových zvyškov podľa odporúčaní komisie pre
31543/H ·· · • ·· ·· ·· ·· · · · • · · • * · · • · · ··· ·· · biochemickú nomenklatúru UIPAC-IUB je uvedené v tabuľke 1 na nasledujúcej strane.
Riadenie metabolických dráh v eukaryotickom organizme je potrebné kvôli možnosti vytvárať v nich nové znaky alebo vnášať nové znaky do určitých buniek, tkaniva alebo orgánov týchto organizmov. I keď technológia rekombinantnej DNA významne pokročila v porozumení mechanizmu, akým je regulovaná eukaryotická génová expresia, omnoho menší pokrok bol urobený v skutočnom ovplyvňovaní génovej expresie, aby sa vytvárali nové znaky. Sú teda k dispozícii obmedzené prostriedky, ktorými človek môže modulovať hladinu génovej expresie u eukaryotov.
Jedna možnosť ako potlačiť (reprimovať), oneskoriť alebo inak redukovať génovú expresiu využíva molekulu mRNA, ktorá je transkribovaná z reťazca jadrového génu komplementárneho k tomu reťazcu, ktorý je normálne transkribovaný a je schopný translácie do peptidu. I keď presný mechanizmus, na ktorom je tento postup založený, nie je známy, bolo navrhnuté, že sa párovaním báz medzi komplementárnymi sekvenciami môže vytvárať dvojreťazcová mRNA a vytvára sa tak komplex, ktorý je translatovaný s nízkou účinnosťou a/alebo je degradovaný intracelulárnymi ribonukleázovými enzýmami ešte pred transláciou.
31543/H • · • · »· · ·
Tabuľka 1 - Označenie aminokyselinových zvyškov podľa odporúčaní Komisie pre biochemickú nomenklatúru IUPAC-IUB
Aminokyselina Trojpísmenný kód Jednopísmenný kód
Alanín Ala A
Arginín Arg R
Asparagín Asn N
Asparágová kyselina Asp D
Cysteín Cys C
Glutamín Gin Q
Glutámová kyselina Glu E
Glycín Gly G
Histidín His H
Izoleucín lle I
Leucín Leu L
Lyzín Lys K
Metionín Met M
Fenylalanín Phe F
Prolín Pro P
Serín Ser S
Treonín Thr T
Tryptofán Trp w
Tyrozín Tyr Y
Valín Val v
Asparágová k./Asparagin Baa B
Glutámová k./Glutamín Zaa Z
akákoľvek aminokyselina Xaa x
Alternatívne expresia endogénneho génu v bunke, tkanive alebo orgáne môže byť potlačená, keď sa do bunky vnesie jedna alebo viac kópii tohto génu alebo jedna alebo viac kópii v podstate podobného génu. Mechanizmus tohto
31543/H • · ··· • ·· ·· · · · • · · • · · · • · · ··· ·· · javu nebol doposiaľ objasnený a zdá sa, že zahrňuje z hľadiska mechanizmu heterogénne procesy. Tak napr. bolo navrhnuté, že zahŕňa transkripčnú represiu, keď sa vytvára somaticky dedičný reprimovaný stav chromatínu alebo alternatívne zahrňuje posttranskripčné umlčanie, kedy dochádza normálne k iniciácii transkripcie, ale RNA produkty takéhoto „kosuprimovaného,, génu sú následne eliminované.
Účinnosť obidvoch týchto prístupov v zameraní expresie špecifických génov je veľmi nízka a obvykle boli získané veľmi variabilné výsledky. Pri použití rôznych úsekov génu, napr. 5'-netranslatovaných úsekov, 3'netranslatovaných úsekov, kódujúcich sekvencií alebo intrónových sekvencií, na zameranie génovej expresie boli získané veľmi nekonzistentné výsledky. Teda doposiaľ neexistuje zhoda vtom, aké génové sekvencie poskytujú najúčinnejší prostriedok na represiu, oneskorenie alebo iné redukcie génovej expresie pri použití súčasných techník. Navyše existuje tak veľká variabilita medzi generáciami, že nie je vôbec možné predvídať mieru represie špecifického génu u potomstva organizmu, v ktorom bola expresia významne modifikovaná.
Nedávno Dorer‘ a Henikoff (1994) ukázali umlčanie tandemovo opakovaných kópii génu v genóme Drosophila a tiež transkripčnú represiu rozptýlených (disperzných) génov Adh Drosophila pomocou génov Polycomb (t. zn. systém Pc-G, Pal-Bhadra a kol., 1997). Avšak takéto umlčanie tandemovo opakovaných kópii génu je v podstate bez osohu pri snahe o manipuláciu génovej expresie v zvieracích bunkách metódami rekombinantnej DNA, kedy sekvencie schopné zacielenia expresie určitého génu sú vnesené do rôznych rozptýlených miest genómu, bez kombinácie tohto prístupu s technológiou zameriavania/cielenia génov. I keď je to teoreticky možné, dá sa očakávať, že takáto kombinácia by bola len veľmi málo účinná, vzhľadom ku známej nízkej účinnosti zameriavania génov, a okrem toho by vyžadovala veľmi zložitý vektorový systém. Navyše využitie transkripčnej represie, ako je napríklad systém Drosophila Pc-G, by vyžadovalo získať nejaké znalosti o regulačných mechanizmoch, ktoré by boli schopné modulovať expresiu akéhokoľvek
31543/H ·· • · · · • · · · ··· · · · • · · • ·· ·· ·· • ·· ·· · · · • · · • · · · • · · •·· ·· · cieľového génu, a teda by bolo ťažké túto metódu zaviesť do praxe ako všeobecnú metódu represie, oneskorenia alebo redukcie génovej expresie v zvieracích bunkách.
Nedostatočné poznanie mechanizmov, ktoré sú podstatou týchto javov, znamená, že v tejto oblasti, t. zn. v zlepšovaní techník pre moduláciu génovej expresie, zvlášť oneskorenia, represiu alebo inú redukciu expresie špecifického génu metódami rekombinantnej DNA, bol doposiaľ veľmi malý. Okrem toho, v dôsledku nepredvídateľnosti výsledkov týchto metód, neexistuje doposiaľ žiaden komerčne životaschopný prostriedok pre moduláciu hladiny génovej expresie špecifického génu v eukaryotickom alebo prokaryotickom organizme.
Existuje teda stála potreba zlepšovať metódy modulácie génovej expresie, zvlášť represie, oneskorenia alebo inej redukcie génovej expresie v zvieracích bunkách, ktoré by umožnili do nich vnášať nové znaky. Tieto metódy by poskytli všeobecné prostriedky pre fenotypovú modifikáciu, bez toho, že by bolo nutné používať súčasne metódu zameriavania génov.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález je s časti založený na prekvapivom objave pôvodcov, a síce, že bunky, ktoré vykazujú jeden alebo niekoľko požadovaných znakov, môžu byť pripravené alebo selektované z transformovaných buniek obsahujúcich molekulu nukleovej kyseliny operatívne spojenú s promótorom, keď transkripčný produkt molekuly nukleovej kyseliny obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je v podstate identická s nukleotidovou sekvenciou transkriptu endogénneho alebo ne-endogénneho cieľového génu, ktorého expresia má byť modulovaná. Z transformovaných buniek je regenerované celé tkanivo, orgány alebo organizmus, ktoré vykazujú nové znaky, zvlášť rezistenciu k vírusom a modifikovanú expresiu endogénnych génov.
Teda jeden aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob modulácie expresie cieľového génu v zvieracej bunke, tkanive alebo orgáne, pričom tento
31543/H • 9 ·· • · • · ··· · • ··
• · · · ·· · · ·· • · · · • · · · · • · · · ··· ·· ··· spôsob obsahuje aspoň krok, kedy sa do bunky, tkaniva alebo orgánu vnesie jedna alebo niekoľko rozptýlených molekúl nukleovej kyseliny alebo cudzorodých molekúl nukleovej kyseliny obsahujúcich niekoľko kópii nukleotidovej sekvencie, ktorá je v podstate identická s nukieotidovou sekvenciou cieľového génu alebo jeho úseku alebo je k nim komplementárna, a to na dobu a v podmienkach, ktoré sú dostatočné na to, aby translácia mRNA produktu cieľového génu bola modifikovaná a to za predpokladu, že nie je výhradne reprimovaná alebo redukovaná transkripcia mRNA produktu.
Vo zvlášť výhodnom uskutočnení vynálezu rozptýlené molekuly nukleovej kyseliny alebo cudzorodé molekuly nukleovej kyseliny obsahujú nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú niekoľko kópií molekuly mRNA, ktorá je v podstate identická s nukieotidovou sekvenciou mRNA produktu cieľového génu. Výhodnejšie niekoľko kópií cieľovej molekuly predstavuje sekvenciu tandemovej priamej repetície.
Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu rozptýlenej molekuly nukleovej kyseliny alebo cudzorodej molekuly nukleovej kyseliny sú v exprimovateľnej forme, aby boli schopné aspoň transkripcie a vytvorili mRNA produkt.
Cieľový gén môže byť gén, ktorý je endogénny pre zvieracie bunky, alebo je to cudzorodý gén ako je napr. vírusová alebo cudzorodá génová sekvencia. Výhodný je cieľový gén sekvencie vírusového génu.
Predkladaný vynález je zvlášť užitočný pre moduláciu eukaryotickej génové expresie, zvlášť moduláciu génovej expresie človeka a zvierat a zvlášť moduláciu génovej expresie génov pochádzajúcich zo stavovcov i bezstavovcov, ako je napr. hmyz, vodné živočíchy (napr. ryby, mäkkýše, mušle, kôrovce, ako napr. kraby, homáre, krevety, vtáky a tiež cicavce).
Celý rad znakov je selektovateľný použitím vhodných postupov a dostatočného množstva transformovaných buniek. K takýmto znakom patria, bez toho, aby bol výpočet akokoľvek obmedzujúci, viditeľné znaky, znaky súvisiace s odolnosťou proti chorobám a znaky súvisiace s odolnosťou voči patogénom. Modulačný účinok je možné aplikovať na rad génov exprimovaných
31543/H v rastlinách a zvieratách, ako sú napr. endogénne gény bunkového metabolizmu alebo bunkové transformácie, vrátane onkogénov, transkripčných faktorov a ďalších génov, ktoré kódujú polypeptidy zúčastňujúce sa bunkového metabolizmu.
Tak napr. je možné dosiahnuť zmeny v tvorbe pigmentu u myší tým, že sa v nej zameria génová expresia génu tyrozinázy. Tým vznikne nový fenotyp albinizmu u čiernej myši. Zameraním génov v rastlinných alebo živočíšnych bunkách, ktoré sú nevyhnutné na aplikáciu vírusu, je možné vniesť génový konštrukt obsahujúci niekoľko kópií nukleotidovej sekvencie kódujúcej vírusovú replikázu, polymerázu, obalový protein alebo gén na rozbaľovanie, alebo proteázu, do bunky, kde dôjde k expresii, a tým sa bunke poskytuje imunita voči vírusu.
V uskutočnení predkladaného vynálezu rozptýlená molekula nukleovej kyseliny alebo cudzorodá molekula nukleovej kyseliny všeobecne obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá má vyššiu ako 85 % identitu so sekvenciou cieľového génu, avšak vyššia homológia môže viesť k účinnejšej modulácii expresie cieľového génu. Podstatne vyššia homológia, vyššia ako 90 % je preto výhodná a ešte výhodnejšia je potrebná 95 % homológia až absolútna identita.
Vnesená rozptýlená molekula nukleovej kyseliny alebo cudzorodá molekula nukleovej kyseliny nemusí byť absolútne homológna a ani nemusí mať plnú dĺžku vzhľadom k primárnemu transkripčnému produktu alebo plne opracovanej mRNA cieľového génu. Vyššia homológia v úseku kratšom ako je plná dĺžka sekvencie kompenzuje dlhšiu sekvenciu s nižšou homológiou. Okrem toho vnesená sekvencia nemusí mať rovnaký vzorec intrónov alebo exónov, a homológia v nekódujúcich segmentoch je rovnako účinná. Typicky je používaná sekvencia dlhšia ako 20 až 100 nukleotidov, i keď výhodná je sekvencia dlhšia ako 200 až 300 nukleotidov, a zvlášť výhodná je sekvencia dlhšia ako 500 až 1000 nukleotidov, v závislosti na veľkosti cieľového génu.
Druhý aspekt predkladaného vynálezu poskytuje syntetický gén, ktorý je schopný modifikovať expresiu cieľového génu v bunke, tkanive alebo orgáne prokaryotického alebo eukaryotického organizmu, ktorý je týmto génom
31543/H • ·· ·· ·· · · · · • · · · · • ··· · · · • · · · ··· ·· ·· • ·· ·· · · • · · • · · · • · · ··· ·· ·· ··· transfekovaný alebo transformovaný, pričom syntetický gén obsahuje aspoň rozptýlenú molekulu nukleovej kyseliny alebo cudzorodú molekulu nukleovej kyseliny obsahujúcu niekoľko kópií nukleotidovej sekvencie, ktorá je v podstate identická s nukleotidovou sekvenciou cieľového génu alebo jej derivát alebo sekvenciu komplementárnu operatívne spojenú a riadenú promótorovou sekvenciou, ktorá je funkčná v danej bunke, tkanive alebo orgáne.
Tretí aspekt predkladaného vynálezu poskytuje syntetický gén, ktorý je schopný modifikovať expresiu cieľového génu v bunke, tkanive alebo orgáne prokaryotického alebo eukaryotického organizmu, ktorý je týmto génom transfekovaný alebo transformovaný, pričom syntetický gén obsahuje niekoľko sekvencii štruktúrnych génov, pričom každá zo sekvencii týchto štruktúrnych génov obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je v podstate identická s nukleotidovou sekvenciou cieľového génu alebo jej derivát alebo sekvenciou ku komplementárnej, pričom sekvencie štruktúrnych génov sú operatívne spojené a riadené jedinou promótorovou sekvenciou, ktorá je funkčná v danej bunke, tkanive alebo orgáne.
Štvrtý aspekt predkladaného vynálezu poskytuje syntetický gén, ktorý je schopný modifikovať expresiu cieľového génu v bunke, tkanive alebo orgáne prokaryotického alebo eukaryotického organizmu, ktorý je týmto génom transfekovaný alebo transformovaný, pričom syntetický gén obsahuje aspoň niekoľko sekvencii štruktúrnych génov, pričom každá zo sekvencii týchto štruktúrnych génov je operatívne spojená a riadená promótorovou sekvenciou, ktorá je funkčná v danej bunke, tkanive alebo orgáne, a každá zo sekvencii štruktúrnych génov obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je v podstate identická s nukleotidovou sekvenciou cieľového génu alebo jej derivát alebo sekvenciu k nej komplementárnu.
Piaty aspekt predkladaného vynálezu poskytuje génový konštrukt, ktorý je schopný modifikovať expresiu endogénneho génu alebo cieľového génu v transformovanej alebo transfekovanej bunke, pričom tento génový konštrukt obsahuje aspoň syntetický gén podľa predkladaného vynálezu a jeden alebo niekoľko replikačných začiatkov a/alebo sekvencii génov selekčných markerov.
31543/H
• ·· • · · • · · ·· • · • · • ·· • ·· • · • · • ·
• ··· · • · • • · ·
• · • · • • ·
·· ·· ·· ··· ·· • ·
Aby bolo možné pozorovať mnoho nových znakov u mnohobunkových organizmov ako sú rastliny alebo zvieratá, a zvlášť také, ktoré sú tkaninovo alebo orgánovo špecifické alebo vývojovo regulované, je potrebné vytvoriť transformované bunky nesúce syntetický gén alebo génový konštrukt podľa predkladaného vynálezu celý organizmus. Odborníkovi je zrejmé, že to vyžaduje regeneráciu celého organizmu z transformovaných rastlinných alebo živočíšnych buniek, skupiny týchto buniek alebo tkanív či orgánov. Pritom odborníkom sú známe štandardné metódy regenerácie niektorých rastlín a zvierat z izolovaných buniek a tkanív.
Teda šiesty aspekt predkladaného vynálezu poskytuje bunky, tkanivá alebo orgány, ktoré obsahujú syntetické gény alebo génové konštrukty podľa vynálezu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 schematicky znázorňuje plazmid pEGFP-N1 MCS. Obr. 2 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.cass.
Obr. 3 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.SV40L.cass. Obr. 4 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.SV40R.cass. Obr. 5 schematicky znázorňuje plazmid pCR.BglI-GFP-Bam. Obr. 6 schematicky znázorňuje plazmid pBSII(SK+).EGFP. Obr. 7 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.EGFP.
Obr. 8 schematicky znázorňuje plazmid pCR.SV40L.
Obr. 9 schematicky znázorňuje plazmid pCR.BEV.1.
Obr. 10 schematicky znázorňuje plazmid pCR.BEV.2.
Obr. 11 schematicky znázorňuje plazmid pCR.BEV.3.
Obr. 12 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.EGFP.BEV2.
31543/H • · ···
Obr. 13 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.2.
Obr. 14 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.3.
Obr. 15 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.VEB.
Obr. 16 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.GFP.
Obr. 17 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.SV40L-O.
Obr. 18 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.0SV40L.BEV.
Obr. 19 schematicky znázorňuje plazmid pCMVO.SV40L.VEB.
Obr.’20 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEVx2.EGFP-N1 MCS. Obr. 21 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEVx3.
Obr. 22 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEVx4.
Obr. 23 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.SV40L.BEV.
Obr. 24 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.SV40L.VEB.
Obr. 25 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.GFP.VEB.
Obr. 26 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.EGFP.BEV2.PFG.
Obr. 27 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.SV40LR.
Obr. 28 schematicky znázorňuje plazmid pcDNA3.Galt.
Obr. 29 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.
Obr. 30 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.EGFP.Galt.
Obr. 31 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.GFP.
Obr. 32 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.SV4OL.O.
Obr. 33 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.SV40L.tlaG.
Obr. 34 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.O.SV40L.Galt.
Obr. 35 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galtx2.
Obr. 36 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galtx4.
Obr. 37 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.SV40L.Galt.
31543/H ·· ·· • · · · • · · · ··· · · · • · · • · · ·· · · · • · · • · · · • · · ··· ·· ·
Obr. 38 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.SV40L.tlaG. Obr. 39 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.GFP.tlaG.
Obr. 40 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.EGFP.Galt.PFG.
Obr. 41 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.SV40LR.
Obr. 42 schematicky znázorňuje plazmid pART7.
Obr. 43 schematicky znázorňuje plazmid pART7.35S.SCBV.cass. Obr. 44 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVY.
Obr.'45 schematicky znázorňuje plazmid pSP72.PVY.
Obr. 46 schematicky znázorňuje plazmid pClapBC.PVY.
Obr. 47 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVYx2.
Obr. 48 schematicky znázorňuje plazmid pSP72.PVYx2.
Obr. 49 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVYx3.
Obr. 50 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVYx4.
Obr. 51 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVY.LNYV.
Obr. 52 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVY.LNYV.PVY.
Obr. 53 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVY.LNYV.YVPA Obr. 54 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVY.LNYV.YVP.
Obr. 55 schematicky znázorňuje plazmid pART27.PVY.
Obr. 56 schematicky znázorňuje plazmid pART27.35S.PVY.SCBV.O. Obr. 57 schematicky znázorňuje plazmid pART27.35S.O.SCBV.PVY. Obr. 58 schematicky znázorňuje plazmid pART27.35S.O.SCBV.YVP. Obr. 59 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVYx2.
Obr. 60 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVYx3.
Obr. 61 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVYx4.
Obr. 62 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVY.LNYV.PVY.
31543/H
Obr. 63 schematicky znázorňuje plazmid pARTľ.PVY.LNYV.YVPA Obr. 64 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVY.LNW.YVP.
Obr. 65 schematicky znázorňuje plazmid pART7.35S.PVY.SCBV.WP.
Obr. 66 schematicky znázorňuje plazmid pART7.35S.PVYx3.SCBV.WPx3. Obr. 67 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVYx3.LNW.WPx3.
Obr. 68 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVYMULTI.
Predkladaný vynález poskytuje spôsob modulácie génovej expresie cieľového génu v bunke, tkanive alebo orgáne, pričom spôsob obsahuje aspoň jeden krok, keď sa do bunky, tkaniva alebo orgánu vnesie jedna alebo niekoľko rozptýlených alebo cudzorodých molekúl nukleovej kyseliny obsahujúcich niekoľko kópií nukieotidovej sekvencie, ktorá je v podstate zhodná s nukleotidovou sekvenciou cieľového génu alebo jej úsekom alebo k nej komplementárnou sekvenciou, a to na dobu a v podmienkach dostačujúcich na transláciu mRNA produktu cieľového génu, ktorý má byť modifikovaný, za predpokladu, že transkripcia mRNA produktu nie je výlučne reprimovaná alebo redukovaná.
Výrazom „niekoľko kópií,, sa rozumie to, že sú prítomné dve alebo viac kópií cieľového génu v tesnom fyzickom spojení alebo ležiace vedľa seba v rovnakej molekule nukleovej kyseliny, v zhodnej alebo odlišnej orientácii, prípadne oddelené „vloženým fragmentom,, alebo medzigénovým úsekom na uľahčenie vytvárania sekundárnej štruktúry medzi každou repetíciou, pokiaľ je to potrebné. Vložený fragment môže obsahovať akúkoľvek kombináciu nukleotidov alebo aminokyselinových zvyškov, alebo molekúl sacharidov alebo oligosacharidov alebo atómov uhlíka alebo ich homológov, analógov alebo derivátov, ktoré môžu byť kovalentne spojené s molekulou nukleovej kyseliny.
Vo výhodnom uskutočnení vložený fragment obsahuje nukleotidovú sekvenciu alebo jej homológ, analóg alebo derivát.
Výhodnejšie vložený úsek obsahuje nukleotidovú sekvenciu aspoň
31543/H veľkosti 10 až 50 nukleotidov, ešte výhodnejšie 50 až 100 nukleotidov a najvýhodnejšie aspoň 100 až 500 nukleotidov.
Keď rozptýlená alebo cudzorodá nukleová kyselina obsahuje sekvenciu zostrihového miesta intrón/exón, vložený fragment môže slúžiť ako intrónová sekvencia umiestnená medzi 3'-zostrihové miesto štruktúrneho génu v blízkosti 5'-konca génu a 5'-zostrihové miesto jeho nasledujúcej jednotky po smere transkripcie („downstream,,). Alternatívne, pokiaľ je potrebné, aby boli translatované viac ako dve susedné nukleotidové sekvenčné jednotky rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny, vložený fragment umiestnený medzi ne nesmie obsahovať stop-kodón translácie v súlade s čítacím rámcom, sekvenciu zostrihového miesta intrón/exón ani na jednom svojom konci, ani nesmie byť dodatočne iniciačný kodón translácie na 5'-konci každej jednotky, ako je odborníkom zrejmé.
Výhodné vložené fragmenty sú fragmenty, ktoré kódujú detekovateľné markerové proteíny alebo ich biologicky aktívne analógy alebo deriváty, ako je napríklad luciferáza, β-galakturonáza, β-galaktozidáza, chloramfenikolacetyltransferáza alebo zelený fluorescenčný proteín a ďalšie.
h
Ani iné vložené fragmenty nie sú vylúčené.
Podľa tohto uskutočnenia vynálezu detekovateľný marker alebo jeho analóg alebo derivát slúžia ako indikátor expresie syntetického génu podľa predkladaného vynálezu v bunke, tkanive alebo orgáne, tým, že poskytuje špecificky detekovateľný fenotyp, výhodne vizuálne detekovateľný fenotyp.
Termín „modulovať,, alebo podobný sa v opise používa vtom zmysle že expresia cieľového génu je redukovaná z hľadiska amplitúdy a/alebo načasovanie génovej expresie je oneskorené a/alebo vývojovo alebo tkanivovo špecifický vzorec expresie cieľového génu je zmenený v porovnaní s expresiou toho istého génu bez prítomnosti spôsobu podľa predkladaného vynálezu.
Bez toho, že by tým bol obmedzený predmet vynálezu, predkladaný vynález sa týka modulácie génovej expresie, ktorá obsahuje represiu, oneskorenie redukcie amplitúdy expresie cieľového génu v špecifickej bunke,
31543/H • · · · ·
..........
tkanive alebo orgáne eukaryotického organizmu, zvlášť rastline ako je jednoklíčnolistá alebo dvojklíčnolistá rastlina, alebo zvierati či človeku, a zvlášť potom u stavovcov či bezstavovcov, ako sú zvlášť hmyz, vodné živočíchy (napr. ryby, mušle, mäkkýše, kôrovce ako kraby, homáre a krevety), vtáky a cicavce a ďalšie.
Výhodne expresia cieľového génu je úplne inaktivovaná molekulami rozptýlenej nukleovej kyseliny alebo molekulami cudzorodej nukleovej kyseliny, ktoré boli vnesené do bunky, tkaniva alebo orgánu. Bez ohľadu na doterajšiu teóriu alebo známe mechanizmy účinku, znížená alebo celkom eliminovaná expresia cieľového génu, ktorá je výsledkom aplikácie predkladaného vynálezu, môže byť dôsledkom zníženej alebo oneskorenej translácie transkripčného produktu mRNA cieľového génu, alternatívne dôsledkom zabránenia translácie danej mRNA, a síce v dôsledku sekvenčno-špecifickej degradácie mRNA transkriptu cieľového génu endogénnym systémom hostiteľa.
Zvlášť výhodné je, na dosiahnutie optimálnych výsledkov keď k sekvenčno-špecifickej degradácii cieľového génu dochádza buď pred okamihom či obdobím, keď by bol transkript mRNA cieľového génu normálne h
translatovaný, a alebo priamo v tomto okamihu či v tomto štádiu. Teda selekcia vhodnej promótorovej sekvencie na riadenie expresie vnesenej molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny je dôležitým momentom pre optimálne vlastnosti vynálezu. Z tohto dôvodu sú pre reguláciu expresie vnesené molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleové kyseliny zvlášť vhodné silné konštitutívne promótory alebo indukovateľné promótorové systémy.
Predkladaný vynález sa tiež týka zníženej expresie cieľového génu, ku ktorej dôjde v dôsledku zníženia transkripcie, a síce za predpokladu, že znížená transkripcia nie je jediným mechanizmom, ktorý redukciu expresie spôsobuje, a redukcia transkripcie je aspoň sprevádzaná súčasnou redukciou translácie ustálenej „zásoby,, (pool) molekúl mRNA.
Cieľovým génom je génová sekvencia, ktorá je pre daný organizmus endogénna, lebo je cudzorodou sekvenciou, ako je napr. sekvencia získaná
31543/H z vírusu alebo iného patogénneho organizmu, ktorá je schopná vstúpiť do bunky a po infekcii využívať bunkový metabolizmus hostiteľskej bunky. Keď je cieľovým génom cudzorodá sekvencia (t. zn. iná ako endogénna), je treba, aby táto sekvencia kódovala funkciu, ktorá je nevyhnutná na replikáciu alebo reprodukciu vírusového alebo iného patogénu. Vtákom uskutočnení je predkladaný vynález zvlášť vhodný na profylaxiu a na liečenie vírusových infekcií u zvierat alebo na vnášanie rezistencie či stimulácie rezistencie proti danému patogénu.
Výhodne cieľový gén obsahuje jednu alebo niekoľko nukleotidových sekvencií vírusového patogénu rastlinné alebo zvieracie bunky, tkaniva alebo orgánu.
Tak napríklad v prípade človeka alebo zvierat vírusovým patogénom je retrovírus, lentivírus ako napríklad vírus imunodeficiencie, alebo vírus s jednoreťazcovou (+)RNA ako je bovinný enterovírus (BEV) alebo alfavírus Sinbis. Alternatívne cieľový gén obsahuje jednu alebo niekoľko nukleotidových sekvencií vírusového patogénu rastlinnej alebo zvieracej bunky, tkaniva alebo orgánu, ako je vírus obsahujúci dvojreťazcovú DNA, napríklad bovinný Herpes vírus alebo vírus Herpes simplex I (HSV I), pričom výpočet nie je v žiadnom prípade obmedzený.
V prípade rastlín je vírusovým patogénom výhodne potyvírus, caulimovírus, badnavírus, geminivírus, reovírus, rhabdovírus, bunyavírus, tospovírus, tenuivírus, tombusvírus, luteovírus, sobemovírus, bromovírus, cucomovírus, ilavírus, alfamovírus, tobamovírus, tobravírus, potexvírus a clostrovírus, ako sú napr. vírusy CaMV, SCSV, PVX, PVY, PLRV a TMV, pričom tento výpočet vynález v žiadnom prípade neobmedzuje.
Pokiaľ sa zvlášť netýka vírusových patogénov, odborníkovi je známe, že vírusom kódované funkcie môžu byť komplementované v trans polypeptidmi kódovanými hostiteľskou bunkou. Napríklad replikácia genómu bovinného Herpes vírusu v hostiteľskej bunke je umožnená DNA polymerázou hostiteľskej bunky, ktorá je schopná nahradiť inaktivovaný gén vírusovej DNA polymerázy.
31543/H • · · · « ·
Teda pokiaľ je cieľovým génom iná ako endogénna sekvencia zvieracej bunky, ďalšie uskutočnenie vynálezu sa týka cieľového génu kódujúceho vírusový alebo iný polypeptid, ktorý nemôže byť komplementovaný hostiteľskou bunkou, ako je napríklad vírusová špecifická génová sekvencia. K príkladom takýchto cieľových génov podľa predkladaného vynálezu patria gény, ktoré kódujú vírusové obalové proteíny, rozbaľovacie proteíny, RNA-dependentnú DNA polymerázu a RNA-dependentnú RNA polymerázu, pričom tento výpočet nie je obmedzujúci.
Vo zvlášť výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu cieľovým génom je gén RNA-dependentnej RNA polymerázy z BEV alebo jeho homológ, analóg či derivát, alebo sekvencia kódujúca Nia proteázu z PVY.
Bunky, v ktorých je modifikovaná expresia cieľového génu, môžu byť akékoľvek bunky pochádzajúce z mnohobunkových organizmov, rastlín a zvierat, vrátane ich bunkových a tkanivových kultúr. Výhodne živočíšne bunky pochádzajú z hmyzu, hadov, obojživelníkov, vtákov a cicavcov vrátane človeka. K príkladom vhodných buniek patria embryonálne kmeňové bunky, kultivované kožné fibroblasty, nervové bunky, somatické bunky, hematopoetické kmeňové bunky, T-bunky, a imortalizované bunkové línie ako sú bunky COS, VERO, HeLa, myšie bunky C127, bunky ovárií čínskeho škrečka CHO, bunky WI-38, bunky obličiek škrečkových mláďat BHK alebo bunky MDBK a ďalšie. Tieto bunky sú odborníkom v podstate kedykoľvek k dispozícii. Teda tkanivo alebo orgán, kde je expresia cieľového génu modifikovaná podľa vynálezu, môže byť ktorékoľvek tkanivo alebo orgán obsahujúci vyššie uvedené bunky.
Rastlinné bunky výhodne pochádzajú z druhov dvojklíčnolistých alebo jednoklíčnolistých rastlín alebo z bunkových línií z nich odvodených.
Termín „rozptýlená molekula nukleovej kyseliny,, v opise vynálezu označuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje jednu alebo viac viacpočetných kópií, výhodne priame tandemové repetície, nukleotidovej sekvencie, ktorá je v podstate identická alebo komplementárna s nukleotidovou sekvenciou génu, ktorý pochádza z bunky, tkaniva alebo orgánu, do ktorých je molekula nukleovej kyseliny vnesená, pričom táto molekula nukleovej kyseliny
31543/H • ·· ·· · • · · · · ·· • · · é · · • ····· · v • · · · · ··· ·· ·· ·· ·· nie je endogénna v tom zmysle, že je do bunky, tkaniva alebo orgánu vnesená rekombinantnými prostriedkami a všeobecne je potom prítomná vo forme extrachromozómovej nukleovej kyseliny, alternatívne ako integrovaná nukleová kyselina, ktorá však nie je geneticky spojená s daným génom. „Rozptýlená molekula nukleovej kyseliny,, podľa vynálezu zvlášť obsahuje chromozómovú alebo extrachromozómovú nukleovú kyselinu, ktorá nie je vo väzbe vo fýzikálnej mape, s cieľovým génom, oproti ktorému je namierená, a síce preto, že s ním nie je tandemovo spojená lebo obsahuje inú chromozómovú pozíciu na rovnakom chromozóme alebo je lokalizovaná na inom chromozóme alebo je prítomná v bunke ako epizóm, plazmid, kozmid alebo vírusová častica.
Termín „cudzorodá molekula nukleovej kyseliny,, v opise predkladaného vynálezu označuje izolovanú molekulu nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje jednu alebo viac viacpočetných kópií, výhodne prítomných tandemových repetícií, nukleotidovej sekvencie pochádzajúce z génovej sekvencie organizmu, ktorý je odlišný od organizmu, do ktorého bola molekula cudzorodej nukleovej kyseliny vnesená. Táto definícia zahrňuje molekuly nukleovej kyseliny pochádzajúce z odlišného jedinca rovnakého najnižšieho taxonomického zoskupenia (t.j. z rovnakej populácie) ako je taxonomické zoskupenie jedinca, do ktorého je daná molekula nukleovej kyseliny vnesená, rovnako tak ako molekulu nukleovej kyseliny pochádzajúcej z odlišného jedinca z odlišnej taxonomickej skupiny ako je taxonomická skupina jedinca, do ktorého je daná molekula nukleovej kyseliny vnesená, ako je napr. gén pochádzajúci z vírusového patogénu. Teda cieľovým génom, oproti ktorému pôsobí molekula cudzorodej nukleovej kyseliny pri uskutočnení vynálezu, môže byť molekula nukleovej kyseliny, ktorá bola prenesená z jedného organizmu do druhého pomocou transformácie alebo inou technikou prenosu génov. K príkladom cieľových génov podľa tohto uskutočnenia vynálezu patrí gén kódujúci zelený fluorescenčný protein z medúzy Aequoria victoría (Prasher a kol., 1992; medzinárodná patentová prihláška WO 95/07463), gén pre tyrozinázu, zvlášť myší gén pre tyrozinázu (Kwon a kol., 1988), a gén /acl z Escherichia coli kódujúci polypeptidový represor génu lacZ, prasačí gén pre a-1,3-galaktozyltransferázu (NCBI prístupové číslo L36535), uvedené tu ako príklady, a ďalej štruktúrne gény PVY
31543/H • ·· ·· · ·· ···· · · ·· ··· • ··· · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· · a BEV, uvedené tu ako príklady, alebo homológy, analógy a deriváty týchto génov, alebo k nim komplementárne sekvencie.
Predkladaný vynález je ďalej užitočný pre súčasné zameranie expresie niekoľkých cieľových génov, ktoré sú súčasne exprimované (ko-exprimované) v určitej bunke, napr. pomocou molekuly rozptýlenej nukleovej kyseliny alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujúcej nukleotidovú sekvenciu, ktorá je v podstate identická s každým z ko-exprimovaných cieľových génov.
Termínom „v podstate identický,, je myslené to, že vnesená molekula rozptýlenej nukleovej kyseliny alebo cudzorodej nukleovej kyseliny podľa vynálezu a sekvencie cieľového génu sú dostatočne identické na úrovni nukleotidovej sekvencie k tomu, aby došlo k párovaniu báz medzi nimi za štandardných intracelulárnych podmienok.
Výhodne nukleotidová sekvencia každej z repetícií v molekule rozptýlenej nukleovej kyseliny alebo cudzorodej nukleovej kyseliny podľa vynálezu a nukleotidovej sekvencie predstavujúcej časť cieľového génu sú aspoň 80 až 85 % identické na úrovni nukleotidovej sekvencie, výhodnejšie sú identické aspoň z 85 až 90 %, ešte výhodnejšie aspoň z 90 až 95 % a najvýhodnejšie je medzi nimi identita aspoň 95 až 99 % alebo do konca 100 % na úrovni nukleotidovej sekvencie.
I napriek tomu, predkladaný vynález nie je v žiadnom prípade obmedzený čo do počtu opakovaných sekvencií v molekule rozptýlenej nukleovej kyseliny alebo cudzorodej nukleovej kyseliny, je nutné rozumieť, že predkladaný vynález vyžaduje, aby aspoň dve kópie sekvencie cieľového génu boli v bunke exprimované. Výhodne sú prítomné nukleové kyseliny alebo cudzorodé nukleové kyseliny ako tandemové invertované repetície a/alebo tandemové priame repetície. Takéto usporiadania sú ukázané na príklade „testovacieho plazmidu,,, ktorý obsahuje úseky génov Galt, BEV alebo PVY.
Výhodne molekula rozptýlenej nukleovej kyseliny alebo cudzorodej nukleovej kyseliny podľa vynálezu ďalej obsahuje nukleotidovú sekvenciu, alebo je komplementárna k nukleotidovej sekvencii, ktorá kóduje
31543/H • »· · ·· · · · · • · · · · • ··· · · · • · · · ··· ·· ··
aminokyselinovú sekvenciu kódovanú cieľovým génom. Ešte výhodnejšie, molekula nukleovej kyseliny obsahuje jeden alebo viac kodónov začiatku translácie ATG alebo AUG.
Na vnesenie molekuly rozptýlenej nukleovej kyseliny alebo cudzorodej nukleovej kyseliny podľa vynálezu do bunky, tkaniva alebo orgánu za účelom modulácie expresie cieľového génu sa použijú štandardné metódy odborníkovi známe. Tak napríklad molekula nukleovej kyseliny môže byť vnesená vo forme „nahej,, DNA alebo RNA, prípadne zabalenej do lipozómu, alebo vo vírusovej častici ako oslabený vírus alebo v spojení s vírusovým obalom alebo vírusovým transportným proteínom alebo inertným nosičom ako je napr. zlato, a alebo vo forme rekombinantného vírusového alebo bakteriálneho vektora alebo ako génový konštrukt, okrem iného.
Podávanie znamená injekčné podávanie alebo perorálne podanie a strávenie (napr. vo forme potravy obohatenej liečivami) a ďalšie spôsoby podávania.
Potrebná nukleová kyselina môže byť podaná tiež pomocou živého prenosového systému, napr. použitím bakteriálneho expresného systému optimalizovaného pre expresiu v baktériách, ktoré môžu byť vnesené do črevnej flóry. Alternatívne je možné použiť vírusový expresný systém. Jednou z foriem vírusovej expresie môže byť podanie živého vektora, obvykle vo forme spreja, potravy alebo vody, ktorých prostredníctvom je účinné množstvo živých vektorov (t. zn. vírusov alebo baktérií) podané zvierati. Inou formou vírusového expresného systému je nereplikujúci sa vírusový vektor, ktorý je schopný infikovať bunku, ale nereplikuje sa v nej. Nereplikujúci sa vírusový vektor poskytuje prostriedok na vnesenie genetického materiálu do zvieraťa alebo človeka pre transietnú (prechodnú) expresiu. Spôsob podania takéhoto vektora je rovnaký ako u živého vírusového vektora.
Nosiče, excipienty a/alebo rozpúšťadlá sú pomocné látky, ktoré je treba použiť na prenos požadovaných nukleových kyselín do hostiteľskej bunky v prípade humánnej lekárskej alebo veterinárnej aplikácie predkladaného vynálezu. Takéto nosiče, excipienty a/alebo rozpúšťadlá sú odborníkom známe.
31543/H ·· ··· ···· ··· ······ · 1 • ··· · · · · · · · • · · · * · ·· ·» ·· ··· ·· ·
K nosičom a rozpúšťadlám vhodným na veterinárne použitie patria akékoľvek rozpúšťadlá, disperzné média, vodné roztoky, obalové médiá, antibakteriálne a protipiesňové činidlá, izotonizujúce činidlá a činidlá oneskorujúce absorpciu a pod. Pre prípravky podľa predkladaného vynálezu pripadajú do úvahy doposiaľ všetky obvyklé činidlá alebo média, okrem tých, ktoré sú nekompatibilné s účinnou látkou. Do prípravkov je možné pridať tiež dodatkové účinné látky.
Alternatívne uskutočnenie predkladaného vynálezu poskytuje spôsob modulácie expresie cieľového génu v bunke, tkanive alebo orgáne, pričom tento spôsob obsahuje kroky, kedy sa:
vyberie jedna alebo niekoľko molekúl rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujúcej viacpočetné kópie nukleotidovej sekvencie, ktorá je v podstate identická s nukleotidovou sekvenciou cieľového génu alebo jeho úseku alebo ktorá je s ňou komplementárna, a molekula rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny sa vnesie do bunky, tkaniva alebo orgánu na dobu a za podmienok, ktoré sú dostatočné na to, aby translácia mRNA produktu cieľového génu bola modifikovaná, za predpokladu, že nie je výlučne reprimovaná alebo redukovaná transkripcia mRNA produktu.
Aby bola vybraná vhodná nukleotidová sekvencia na zameranie expresie cieľového génu, je možné použiť niekoľko prístupov. V jednom uskutočnení vynálezu viacpočetné kópie špecifických úsekov charakterizovaného génu boli klonované do operatívneho spojenia s vhodným promótorom a potom bola testovaná ich účinnosť pri redukcii expresie cieľového génu. Alternatívne sa pripraví „shotgun,, génovej knižnice obsahujúci viacpočetné kópie génových sekvencii a testuje sa ich účinnosť pri redukcii expresie cieľového génu. Výhodou pri druhom z uvedených spôsobov je to, že nie je nutná žiadna predchádzajúca znalosť významu konkrétneho cieľového génu pre špecifikáciu nežiaduceho fenotypu v bunke. Napr. „shotgun,, knižnice obsahujúcej vírusové subgenómové fragmenty sa môžu použiť a priamo testovať ich schopnosť poskytovať imunitu voči vírusom na zvieracích bunkách, bez toho, že by bola nutná predchádzajúca vedomosť toho, ktorý z vírusových génov hrá akú úlohu
31543/H pri patogenéze v hostiteľskej bunke.
Termín „shotgun,, knihovňa označuje súbor rôznych nukleotidových sekvencií, kde každý člen tohto súboru je výhodne obsiahnutý vo vhodnom plazmidovom, kozmidovom, bakteriofágovom alebo vírusovom vektore, ktorý je vhodný na udržovanie a/alebo replikáciu v hostiteľskej bunke. Termín „shotgun knihovňa,, zahrňuje reprezentatívnu knihovňu, kde rozsah diverzity nukleotidových sekvencií je taký, že všetky sekvencie genómu organizmu, z ktorého uvedená nukleotidová sekvencia pochádza, sú v knižnici obsiahnuté, ale tiež limitovanú knihovňu, kde je menší stupeň diverzity sekvencií. Termín „shotgun knihovňa,, zahrňuje tiež náhodné nukleotidové sekvencie, pričom nukleotidové sekvencie sú tvorené fragmentmi vírusového alebo bunkového genómu, ktoré boli získané parciálnym štiepením genómovej DNA reštrikčnými endonukleázami. „Shotgun,, knihovňa tiež zahrňuje bunky, vírusové častice a bakteriofágy, obsahujúce jednotlivé nukleotidové sekvencie súboru.
Výhodné „shotgun,, knižnice podľa predkladaného vynálezu sú „reprezentatívne,, knižnice obsahujúce súbor tandemov opakujúcich sa nukleotidových sekvencií pochádzajúcich z vírusového patogénu rastlín alebo zvierat.
Vo zvlášť výhodnom uskutočnení „shotgun,, knihovňa obsahuje bunky, vírusové častice alebo bakteriofágy obsahujúce rôznorodý súbor tandemových opakujúcich sa nukleotidových sekvencií, ktoré kódujú rôznorodý súbor aminokyselinových sekvencií, pričom každý člen tohto súboru sekvencií je operatívne vložený pod kontrolu promótorovej sekvencie, ktorá je schopná riadiť expresiu uvedenej tandemovej opakovanej nukleotidovej sekvencie v bunke.
Teda nukleotidová sekvencia každej jednotky v tandemovej repetícii (tandemovo opakovanej nukleotidovej sekvencii) obsahuje aspoň 1 až 200 nukleotidov. Použitie ďalších fragmentov, zvlášť pri použití náhodne naštiepenej nukleovej kyseliny vírusu, rastliny alebo zvieraťa, pritom nie je vylúčené.
Vnesená nukleová kyselina je výhodne v exprimovateľnej forme.
31543/H
Termín „exprimovateľná forma,, znamená, že nukleová kyselina je prítomná vtákom usporiadaní, že môže byť exprimované v bunke, tkanive, orgáne alebo celom organizme, aspoň na úrovni transkripcie (t. zn. v živočíšnej bunke je exprimované tak, že vzniká aspoň mRNA produkt, ktorý je translatovateľný a prípadne je translatovaný do molekuly rekombinantného peptidu, oligopeptidu alebo polypeptidu.
Ako príklad, aby sa dosiahla expresia molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny v požadovanej bunke, tkanive alebo orgáne, bol pripravený syntetický gén alebo génový konštrukt obsahujúci syntetický gén, pričom syntetický gén obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ako bola opísaná vyššie, operatívne spojenú s promótorovou sekvenciou, ktorá je schopná regulovať jej expresiu. Takže uvedená molekula nukleovej kyseliny je operatívne spojená s jedným alebo niekoľkými regulačnými prvkami, ktoré sú dostatočné na to, aby došlo k eukaryotickej transkripcii.
Ďalšie alternatívne uskutočnenie predkladaného vynálezu poskytuje spôsob modulácie expresie cieľového génu v živočíšnej bunke, tkanive alebo orgáne, pričom tento spôsob obsahuje prinajmenšom kroky, kedy:
sa vyberie jedna alebo niekoľko molekúl rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny, obsahujúcej viacpočetné kópie, výhodne tandemovej repetície, nukleotidovej sekvencie, ktorá je v podstate identická s nukleotidovou sekvenciou cieľového génu alebo jeho úsek alebo je k nej komplementárna, pripraví sa syntetický gén obsahujúci molekulu rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny, syntetický gén sa vnesie do požadovanej bunky, tkaniva alebo orgánu, a syntetický gén sa exprimuje v požadovanej bunke, tkanive alebo orgáne po dobu a v podmienkach, ktoré sú dostatočné na to, aby translácia mRNA produktu cieľového génu bola modifikovaná, a to za predpokladu, že transkripcia uvedeného mRNA produktu nie je výlučne reprimovaná alebo redukovaná.
Termíny „gén,, a „gény,, je treba v predkladanom opise chápať
31543/H • · • ·· · ·· · · · · · • · · · · • ··· · · · • · · · a·· · · ·· * v najširšom význame a zahrňuje teda:
Klasické genómové gény tvorené sekvenciami pre reguláciu transkripcie a translácie a/alebo kódujúcim úsekom/sekvenciou a/alebo netranslatovanými sekvenciami (t. zn. intróny, 5'- a 3'-netranslatované sekvencie), a/alebo mRNA alebo cDNA zodpovedajúce kódujúcemu úseku (t. zn. exónom) génu a 5'- a 3'-netranslatovaným sekvenciám, a/alebo štruktúrny úsek zodpovedajúci kódujúcim úsekom (t. zn. exónom) prípadne ďalej obsahujúci netranslatované sekvencie a/alebo heterologné promótorove sekvencie, ktoré vytvárajú regulačné úseky transkripcie a/alebo translácie, ktoré rozhodujú o expresii štruktúrneho úseku.
Termín „gén,, tiež zahrňuje syntetické alebo fúzne molekuly kódujúce či už celý funkčný produkt alebo jeho časť, zvlášť „sense,, alebo „anti-sense„ mRNA produkt alebo peptid, oligopeptid alebo polypeptid alebo biologicky aktívny proteín.
Termín „syntetický gén,, označuje v predkladanom opise gén, v zmysle vyššie uvedenej definície, ktorý sa však nevyskytuje v prírode, ktorý výhodne obsahuje aspoň jednu sekvenciu na reguláciu transkripcie a/alebo translácie operatívne spojenú so štruktúrnou génovou sekvenciou.
Termín „štruktúrny gén,, alebo „štruktúrna sekvencia,, označuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je schopná produkovať mRNA a prípadne kóduje molekulu peptidu, oligopeptidu, polypeptidu alebo biologicky aktívneho proteínu. Odborníkovi je známe, že nie všetky mRNA môžu byť translatované do peptidov, oligopeptidov, polypeptidov alebo proteínov, napr. mRNA, ktorej chýba funkčný signál pre začiatok translácie, alebo mRNA ktorá je anti-sense mRNA. Predkladaný vynález zahrňuje i také syntetické gény, ktoré obsahujú nukleotidová sekvencie, ktoré nemôžu kódovať peptidy, oligopeptidy, polypeptidy alebo biologicky aktívny proteín. Pôvodcovia predkladaného vynálezu zistili, že takéto gény sú zvlášť výhodné na modifikáciu expresie cieľového génu v bunke, tkanive alebo orgáne prokaryotického alebo eukaryotického organizmu.
31543/H • · • · · ·· · • · ·· • · · • · · e · ·· ··« ·· t
• · ··
Termín „štruktúrny génový úsek,, označuje časť syntetického génu, ktorá obsahuje molekulu rozptýlenej alebo cudzorodej nukleotidovej sekvencie, ako bola opísaná vyššie, ktorá je exprimovaná v bunke, tkanive alebo orgáne, pod kontrolou promótorovej sekvencie, s ktorou je operatívne spojená. Štruktúrny génový úsek môže obsahovať jednu alebo niekoľko molekúl rozptýlenej alebo cudzorodej sekvencie nukleovej kyseliny operatívne pod kontrolou jedinej promótorovej sekvencie alebo niekoľkých promótorových sekvencií. Teda štruktúrny génový úsek syntetického génu môže obsahovať nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu alebo je k takej sekvencií komplementárna. Úsek štruktúrneho génu v uskutočnení predkladaného vynálezu môže tiež obsahovať nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu, avšak jej chýba funkčný iniciačný kodón translácie a/alebo funkčný stop-kodón translácie, a teda neobsahuje úplný otvorený čítací rámec. V tejto súvislosti teda termín „štruktúrny génový úsek,, zahrňuje také nekódujúce nukleotidové sekvencie, ako sú sekvencie 5'-upstream (na 5'-konci proti smeru transkripcie) a 3'-downstream (na 3'-konci po smere transkripcie) génu, ktoré by normálne neboli translatované v eukaryotickej bunke, ktorá exprimuje daný gén. Teda štruktúrny génový úsek obsahuje tiež fúziu dvoch alebo viacerých čítacích rámcov toho istého génu alebo rôznych génov. V takom uskutočnení je možné vynález použiť na moduláciu expresie jedného génu, zameraním jeho rôznych nesúvisiacich úsekov, alternatívne na simultánnu moduláciu expresie niekoľkých rôznych génov, vrátane rôznych génov multigénovej rodiny. V prípade fúznej molekuly nukleové kyseliny, ktorá nie je endogénna pre živočíšnu bunku, a zvlášť ktorá obsahuje dve alebo viac nukleotidových sekvencií pochádzajúcich z vírusového patogénu, fúzia poskytuje ďalšiu výhodu, a síce že udeľuje simultánne imunitu alebo ochranu proti niekoľkým patogénom, tým, že zameriava expresiu génov niekoľkých patogénov. Alternatívne, a alebo navyše, fúzia poskytuje účinnejšiu imunitu proti patogénu tým, že zameriava expresiu viac ako jedného génu určitého patogénu.
Zvlášť výhodný štruktúrny génový úsek podľa predkladaného vynálezu je
31543/H
• · ·· • · · : i • · ·· * úsek, ktorý obsahuje aspoň jeden translatovateľný otvorený čítací rámec, výhodnejšie vrátane iniciačného kodónu translácie na 5'-konci čítacieho rámca, avšak v žiadnom prípade nie nevyhnutne na 5'-konci štruktúrneho génového úseku. I keď štruktúrny génový úsek obsahuje aspoň jeden translatovateľný otvorený čítací rámec a/alebo AUG alebo ATG kodón začiatku translácie, vloženie týchto sekvencií v žiadnom prípade nepredpokladá, že by predkladaný vynález nevyhnutne vyžadoval transláciu vnesenej molekuly nukleovej kyseliny, aby došlo k modulácii expresie cieľového génu. Bez ohľadu na doterajšie teórie a známe spôsoby účinkov, vloženia aspoň jedného translatovateľného čítacieho rámca a/alebo translačného začiatku do molekuly nukleovej kyseliny podľa vynálezu slúži na zvýšenie stability jej transkripčného produktu, a tým sa zlepšuje účinnosť predkladaného vynálezu.
Optimálny počet sekvencií štruktúrnych génov, ktoré môžu byť súčasťou syntetického génu podľa predkladaného vynálezu je značne premenlivý, závisí totiž od dĺžky každej zo sekvencií štruktúrnych génov, ich orientácii a stupňa vzájomnej identity. Napríklad odborník si je vedomý vnútornej nestability palindromických nukleotidových sekvencií in vivo a tiež problémov spojených s konštrukciou dlhých syntetických génov obsahujúcich invertované opakované nukleotidové sekvencie (invertované repetície) vzhľadom k tendencii týchto sekvencií rekombinovať in vivo. Bez ohľadu na tieto problémy optimálny počet sekvencií štruktúrnych génov, ktoré sú súčasťou syntetického génu podľa predkladaného vynálezu, môže byť odborníkom stanovený empiricky, bez toho, že by bola potreba nadmerného experimentovania použitím štandardných postupov ako je napr. konštrukcia syntetického génu podľa predkladaného vynálezu použitím bunkových línií deficitných na rekombinázu, zníženie počtu repetícií (opakovaných sekvencií) na úroveň, ktorá eliminuje alebo aspoň minimalizuje rekombinančné udalosti, a udržanie celkovej dĺžky sekvencie viacpočetného syntetického génu v prijateľnom limite, to zn. výhodne nie dlhšie ako 5 až 10 kb, výhodnejšie nie dlhšie ako 2 až 5 kb, a ešte výhodnejšie v limite dĺžky najvyššie 0,5 až 2 kb.
Keď úsek štruktúrneho génu obsahuje viac ako jednu rozptýlenú
31543/H i · · I ··* · * « • I ·· ·· • · · • · • · · · • · · • ·· ··· molekulu nukleovej kyseliny alebo molekulu cudzorodej nukleovej kyseliny, je v tejto prihláške označovaný ako „viacpočetný úsek štruktúrneho génu,, alebo podobnými termínmi.
Predkladaný vynález jasne zahrňuje použitie viacpočetných úsekov štruktúrneho génu, ktoré výhodne obsahuje priame repetície, invertované repetície alebo prerušené palindrómy konkrétneho štruktúrneho génu, rozptýlenú molekulu nukleovej kyseliny alebo molekulu cudzorodej nukleovej kyseliny alebo jej fragment.
Každá rozptýlená alebo cudzorodá molekula nukleovej kyseliny obsiahnutá vo viacpočetnej jednotke štruktúrneho génu syntetického génu podľa predkladaného vynálezu obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je v podstate identická s iným cieľovým génom rovnakého organizmu. Takéto usporiadanie je zvlášť výhodné, keď je zámerom tvorby syntetického génu poskytnúť ochranu proti patogénu v bunke, tkanive alebo orgáne, zvlášť proti vírusovému patogénu, a síce tým, že sa modifikuje expresia vírusových cieľových génov. Tak napr. viacpočetný štruktúrny gén môže obsahovať nukleotidové sekvencie (to zn. dve alebo viac molekúl rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny), ktoré sú v podstate identické s dvoma alebo viac cieľovými génmi, vybranými zo skupiny, ktorá obsahuje DNA polymerázu, RNA polymerázu, Nia proteázu, obalový protein alebo iný cieľový gén, ktorý je nevyhnutný pre infekčnosť vírusu alebo jeho replikáciu a reprodukciu. Avšak je výhodné pri tomto usporiadaní, keď jednotky štruktúrneho génu sú vybrané tak, že cieľové gény, s ktorými sú v podstate identické, sú normálne exprimované približne v rovnakú dobu (alebo neskôr) v infikovanej bunke, tkanive alebo orgáne, ako viacpočetný štruktúrny gén v syntetickom géne podľa predkladaného vynálezu riadený promótorovou sekvenciou. To znamená, že promótor riadiaci expresiu viacpočetného štruktúrneho génu je obvykle vybraný tak, aby umožnil expresiu v bunke, tkanive alebo orgáne počas celého životného cyklu vírusu, keď sú vírusové cieľové gény exprimované v rôznych štádiách infekcie.
Rovnako ako jednotlivé jednotky molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej
31543/H ·· • · · • ·· ·· · ·« · · · · ·· • ··· · · · i • · · · · ··· · · · · ·· · • · ·· · nukleovej kyseliny, tiež jednotlivé jednotky viacpočetného štruktúrneho génu môžu byť priestorovo spojené vzájomne v akejkoľvek orientácii, teda napr. systém „hlava k hlave,,, „hlava k chvostu,, alebo „chvost k chvostu,,, a všetky takéto konfigurácie sú obsiahnuté v predkladanom vynáleze.
Pre expresiu v eukaryotických bunkách, syntetický gén všeobecne obsahuje, okrem molekuly nukleovej kyseliny podľa predkladaného vynálezu, promótor a prípadne ešte ďalšie regulačné sekvencie, ktoré umožňujú expresiu rozptýlenej alebo cudzorodej molekuly nukleovej kyseliny.
Termín „promótor,, je v tomto texte chápaný v najširšom význame a označuje regulačnú sekvenciu transkripcie klasického genómového génu, vrátane TATA boxu, ktorý je potrebný na presnú orientáciu transkripcie, či už s alebo bez CCAAT boxu, a ďalšie regulačné prvky (aktivačné sekvencie ležiace v polohe „upstream,,, to zn. proti smeru transkripcie, „enhancery,, alebo zosiľovacia sekvencia a „silencery,, alebo umlčovacie sekvencie), ktorá mení expresiu génov v odpoveď na vývojové a/alebo vonkajšie podnety a alebo tkanivovo špecifickým spôsobom. Promótor obvykle, i keď nie celkom nutne, leží „upstream,, alebo na 5'-konci úseku štruktúrneho génu, ktorého expresiu riadi. Okrem toho regulačné prvky obsahujúce promótor sú obvykle umiestnené do vzdialenosti 2 kb od transkripčného začiatku génu.
V texte predkladaného opisu sa termín „promótor,, používa tiež na označenie syntetickej alebo fúznej molekuly, alebo jej derivátu, ktorá poskytuje, aktivuje alebo zvyšuje expresiu molekuly nukleovej kyseliny v bunke.
Výhodné promótory môžu obsahovať ďalšie kópie jedného alebo niekoľkých špecifických regulačných prvkov, aby ešte viac zvýšili expresiu významnej molekuly a/alebo zmenili priestorový a/alebo časový vzorec expresie požadovanej významnej molekuly. Tak napr. regulačné prvky poskytujúce indukovateľnosť medi môžu byť umiestnené do susedstva heterolognej promótorovej sekvencie, ktorá riadi expresiu významnej molekuly, čím sa udelí tejto významnej molekuly indukovateľnosť medi.
Umiestnenie molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny
31543/H ·· • 1 · • •4 · · pod regulačnú kontrolu promótorovej sekvencie znamená umiestnenie tejto molekuly takým spôsobom, že jej expresia je riadená uvedeným promótorom. Promótory sú všeobecne umiestnené na 5'-konci (to zn. „upstream,, teda proti smeru transkripcie) od sekvencie génu, ktorého expresiu riadi. Pri konštrukcii kombinácie heterologný promótor/štruktúrny gén je všeobecne výhodné umiestniť promótor do určitej vzdialenosti od transkripčného začiatku génu, ktorá je približne rovnaká, ako je vzdialenosť medzi promótorom a génom v prirodzenej zostave, to zn. v géne, z ktorého je promótor získaný. Ako je odborníkom známe, v istých medziach je možné vzdialenosť prispôsobiť bez straty funkcie promótora. Podobne výhodné umiestnenie prvkov regulačných sekvencií vzhľadom k heterolognému génu, ktorý má byť nimi riadený, je určené prirodzeným rozmiestnením týchto prvkov, to zn. polohou v génoch, z ktorých pochádzajú. A rovnako tak je v odbore známe, že istá variabilita v tejto vzdialenosti je možná.
K príkladom promótorov vhodných pre syntetické gény podľa predkladaného vynálezu patria promótory vírusových, plesňových, bakteriálnych, zvieracích a rastlinných génov, ktoré sú schopné fungovať v rastlinných, zvieracích, hmyzových a plesňových bunkách alebo v kvasinkách a baktériách. Promótor môže regulovať expresiu zložky štruktúrneho génu konštitutívne alebo diferenciálne vzhľadom k bunke, tkanivu alebo orgánu, kde k expresii dochádza, alebo vzhľadom k vývojovému štádiu, v ktorom k expresii dochádza, alebo v odpovedi na vonkajší podnet ako sú fýziologické stresy, patogény alebo kovové ióny a ďalšie.
Výhodne je promótor schopný riadiť expresiu molekuly nukleovej kyseliny v eukaryotickej bunke, tkanive alebo orgáne, aspoň po dobu, po ktorú je tiež exprimovaný cieľový gén, výhodnejšie ešte bezprostredne pred tým, ako dôjde k detegovateľnej expresii cieľového génu v bunke, tkanive alebo orgáne.
Teda silné konštitutívne promótory sú zvlášť výhodné pre účely predkladaného vynálezu alebo promótory, ktoré sú indukované vírusovou infekciou alebo začatím expresie cieľového génu.
Zvlášť výhodné pre predkladaný vynález sú promótory funkčné
31543/H
• ·· • · · ·· • ·· ·· • ·
• • • •
• ··· · • • • • · •
• · ·· ·· • ·· • • ·· · • • ·· ··
v rastlinnom alebo zvieracom organizme. K príkladom výhodných promótorov patri promótor bakteriofága ΊΓ7, promótor bakteriofága T3, promótor SP6, operátor lac, promótor tac, promótor oneskorených génov SV40, promótor skorých génov SV40, promótor LTR z RSV, IE promótor z CMV, promótor 35S z CaMV, promótor SCSV, promótor SCBV a ďalšie.
Vzhľadom k výhodnej požiadavke vysokej hladiny expresie, ktorá je v časovej zhode s epxresiou cieľového génu alebo jej predchádza, je žiaduce, aby promótor bol silný konštitutívny promótor ako je napr. IE promótor z CMV, promótor včasných génov SV40, promótor oneskorených génov SV40, promótor 35S z CaMV alebo promótor SCBV a ďalšie. Odborníkom sú známe ďalšie vhodné promótorové sekvencie okrem tých, ktoré tu boli špecificky uvedené.
V predkladanom opise termíny „v operatívnom spojení,, alebo „operatívne pod kontrolou,, alebo podobne znamenajú, že expresia úseku štruktúrneho génu alebo viacpočetného úseku štruktúrneho génu je riadená (je P°d kontrolou) promótorovou sekvenciou, s ktorou je priestorovo spojená, v bunke, tkanive, orgáne alebo celom organizme.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu úsek štruktúrneho génu (molekula rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny) alebo viacpočetný úsek štruktúrneho génu je umiestnený operatívne do spojenia s promótorom v takej vzájomnej orientácii, že keď je transkribovaný, dochádza k syntéze mRNA produktu, ktorý, keď je translatovaný, kóduje polypeptidový produkt cieľového génu alebo jeho fragment.
Avšak predkladaný vynález nie je obmedzený na použitie len takého usporiadania a vynález zahrňuje použitie takých syntetických génov a génových konštruktov, kde úsek štruktúrneho génu alebo úsek viacpočetného štruktúrneho génu je umiestnený v „anti-sense„ orientácii (to zn. orientácii opačnej ku smeru transkripcie) vzhľadom k promótorovej sekvencii, takže aspoň časť transkripčného produktu mRNA je komplementárna k mRNA kódovanej cieľovým génom alebo jeho fragmentom.
31543/H a ·· β· · ·· aaaa aa·· ··· ··· ··· ·· a aaa a a a aaaa a a a · · · · aaa aa aa aaa aa a
Vzhľadom k tomu, že molekula rozptýlenej nukleovej kyseliny alebo cudzorodej nukleovej kyseliny alebo úsek viacpočetného štruktúrneho génu obsahuje tandemovo priame a/aíebo nepriame repetície (opakované sekvencie) cieľového génu, všetky kombinácie vyššie uvedených konfigurácií sú tiež zahrnuté vo vynáleze.
V alternatívnom uskutočnení vynálezu je úsek štruktúrneho génu alebo úsek viacpočetného štruktúrneho génu operatívne spojený ako s prvou promótorovou sekvenciou tak i s druhou promótorovou sekvenciou, pričom promótory sú lokalizované na distálnom a proximálnom konci úseku, takže aspoň jedna jednotka úseku štruktúrneho génu alebo úseku viacpočetného štruktúrneho génu je vzhľadom k sekvencií prvého promótora v „sense,, orientácii a vzhľadom k sekvencií druhého promótora v „anti-sense„ orientácii.
V takomto uskutočnení vynálezu je výhodné, keď prvý a druhý promótor sa navzájom líšia, aby sa zabránilo kompetícii medzi bunkovými faktormi, ktoré sa na tieto promótory viažu. Výhodou takéhoto usporiadania je to, že účinky transkripcie z prvého a druhého promótra na zníženie expresie cieľového génu v bunke je možné porovnať, aby sa stanovila optimálna orientácia pre každú testovanú nukleotidovú sekvenciu.
Syntetické gény výhodne obsahujú ďalšie regulačné prvky pre účinný transkripciu, napr. sekvenciu na termináciu transkripcie.
Termín „terminátor,, označuje sekvenciu DNA na konci transkripčnej jednotky, ktorá signalizuje termináciu (ukončenie) transkripcie. Terminátory sú netranslatované sekvencie DNA na 3'-konci génu, ktoré obsahujú polyadenylačný signál, ktorý umožňuje pripojenie polyadenylátovej sekvencie na 3'-koniec primárneho transkriptu. Terminátory aktívne v rastlinných bunkách sú známe a boli opísané v odbornej literatúre. Môžu byť izolované z baktérií, plesní, vírusov, zvierat a/alebo rastlín a alebo tiež syntetizované de novo.
Rovnako ako promótorove sekvencie i terminátory môžu byť akékoľvek terminátorové sekvencie, ktoré sú funkčné v bunkách, tkanivách alebo orgánoch, kde sa majú použiť.
31543/H
• 99 ·· • 99 ·
• 99 • • ·· • · 9 9
• · · • 9 • • ·
• ··· · • • • · • 9
• · • • • • ·
99 ·· ·· 99 · • 9 99
K príkladom terminátorov zvlášť vhodných na použitie podľa predkladaného vynálezu patrí polyadenylačný signál SV40, polyadenylačný signál HSV TK, terminátor CYC1, terminátor ADH, terminátor SPA, terminátor génu nopalinsyntázy (NOS) z Agrobacerium tumefaciens, terminátor génu 35S z vírusu mozaiky karfiolu (CaMV), terminátor génu zeinu zo Zea mays, terminátorová sekvencia malej podjednotky (SSU) Rubisco, terminátory vírusu zakrpatenia ďateliny (SCSV), akékoľvek terminátory z E. coli nezávislé na faktore rho, terminátor lacZ alfa a ďalšie.
Vo zvlášť výhodnom uskutočnení vynálezu je terminátor polyadenylačný signál SV40 alebo polyadenylačný signál HSV TK, ktorý je aktívny v živočíšnych bunkách, tkanivách a orgánoch, terminátor oktopinsyntázy (OCS) alebo nopalinsyntázy (NOS), ktorý je aktívny v rastlinných bunkách, tkanivách a orgánoch, alebo terminátor lacZ alfa, ktorý je aktívny v prokaryotických bunkách.
Odborníkovi sú známe ďalšie terminačné sekvencie, ktoré je možné použiť na uskutočnenie predkladaného vynálezu. Takéto sekvencie je možné okamžite využiť bez neprimeraného nadmerného experimentovania.
Prostriedky pre vnášanie (to zn. transfekciu alebo transformáciu) syntetických génov do buniek opísané v predkladanej prihláške vynálezu alebo génové konštrukty, ktoré môžu obsahovať syntetické gény, sú odborníkom známe.
V ďalšom alternatívnom uskutočnení predkladaného vynálezu je použitý génový konštrukt, ktorý obsahuje dva alebo viac úsekov štruktúrnych génov alebo viacpočetných štruktúrnych génov, kde každý úsek štruktúrneho génu je umiestnený operatívne pod kontrolu vlastnej promótorovej sekvencie. Tak ako v iných uskutočneniach vynálezu tu opísaných, orientácia každého úseku štruktúrneho génu sa môže meniť, aby sa dosiahol maximálny modulačný účinok na expresiu cieľového génu.
Podľa tohto uskutočnenia vynálezu promótory riadiace expresiu jednotky štruktúrneho génu sú výhodne odlišné promótorové sekvencie, aby sa znížila
31543/H ·· ·· · · · · • · · · · • ··· · · · • · · · ··· ·· ·· • · ··· ·· ·· • · · • · • · • · ·· · kompetícia medzi nimi o bunkové transkripčné faktory a RNA polymerázy. Výhodné promótory sú vybrané z promótorov už uvedených vyššie.
Odborníkovi je známe, ako modifikovať usporiadanie alebo konfiguráciu jednotlivých štruktúrnych génov opísaných vyššie, aby bola ich expresia riadená oddelenými promótorovými sekvenciami.
Syntetické gény opísané vyššie sú schopné ďalších modifikácií, napr. tým, že sa do nich vložia markerové nukleotidové sekvencie kódujúce detekovateľný markerový enzým alebo jeho funkčný analóg alebo derivát, aby sa umožnila detekcia syntetického génu v bunke, tkanive alebo orgáne, kde je syntetický gén exprimovaný. Podľa tohto uskutočnenia vynálezu, markerové nukleotidové sekvencie sú prítomné v translatovateľnej podobe a sú exprimované, napr. ako fúzny peptid s translačným produktom ktoréhokoľvek štruktúrneho génu alebo niekoľkých štruktúrnych génov alebo alternatívne ako polypeptid, ktorý nie je fúzovaný.
Odborníkovi je známe, ako vytvárať syntetické gény podľa predkladaného vynálezu, a aké sú nutné požiadavky, aby bola dosiahnutá ich expresia, pokiaľ je to potreba, v špecifických bunkách alebo bunkách špecifického typu za požadovaných podmienok. Zvlášť je odborníkom známe, že génové manipulácie, ktoré sú potrebné na uskutočnenie predkladaného vynálezu, vyžadujú namnoženie génového konštruktu podľa predkladaného vynálezu alebo jeho derivátu v prokaryotických bunkách ako je napr. E. coli alebo v rastlinných či živočíšnych bunkách.
Syntetické gény podľa predkladaného vynálezu môžu byť vnesené do vhodných buniek, tkanív alebo orgánov, bez akejkoľvek modifikácie ako lineárna DNA, výhodne vložené do vhodného nosiča, ako je napr. bunka, vírusová častica alebo lipozóm a ďalšie. Na vytvorenie génového konštruktu je syntetický gén podľa predkladaného vynálezu vložený do vhodného vektora alebo epizómovej molekuly, ako je napr. bakteriofágový vektor, vírusový vektor alebo plazmid, kozmid alebo umelý chromozóm, ktoré sa môžu udržovať a/alebo replikovať a/alebo exprimovať v hostiteľskej bunke, tkanive alebo orgáne, do ktorého sú potom vnesené.
31543/H • e • · • · ··· · ·· ·· • · ·
• · • · • ·· ·· · · · • · · • · · · • · · ··· ·· ·
Teda ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje génový konštrukt, ktorý obsahuje aspoň syntetický gén podľa predkladaného vynálezu a jeden alebo niekoľko replikačných začiatkov a/alebo sekvencií génu selekčného markeru.
Génové konštrukty sú zvlášť vhodné na transformáciu eukaryotických buniek, aby sa do nich vniesol nový genetický znak, okrem vlastnosti rezistencie k vírusovým patogénom. Takéto dodatočné nové znaky môžu byť vnesené pomocou oddelených génových konštruktov alebo alternatívne v rovnakom génovom konštrukte, ktorý obsahuje syntetický gén podľa predkladaného vynálezu. Odborníkovi sú jasné významné výhody toho, keď sekvencie kódujúce dodatočné znaky a syntetické gény podľa predkladaného vynálezu sú prítomné spoločne v jedinom konštrukte, zvlášť v zmysle redukcie génových manipulácií a požiadaviek na tkanivové kultúry, a teda zvýšenej finančnej efektivite.
Obvykle sú replikačný začiatok a gén selekčného markera vhodné na použitie v baktériách fyzicky oddelené od tých génových sekvencií obsiahnutých v konštrukte, ktoré majú byť exprimované alebo prenesené do eukaryotickej bunky alebo integrované do genómu eukaryotickej bunky.
Vo zvlášť výhodnom uskutočnení je replikačný začiatok funkčný v bakteriálnych bunkách a obsahuje začiatok pUC alebo ColE1, alternatívne je replikačný začiatok aktívny v eukaryotických bunkách a tkanivách a výhodnejšie obsahuje replikačný začiatok 2μ alebo SV40.
Termín „selekčný marker,, používaný v tomto opise označuje akýkoľvek gén, ktorý svojou expresiou poskytuje bunke fenotyp, ktorý umožňuje identifikáciu a/alebo selekciu buniek, ktoré boli transformované alebo do ktorých bola prenesený génový konštrukt podľa predkladaného vynálezu alebo jeho derivát.
K selekčným markerom vhodným na použitie v predkladanom vynáleze patrí gén rezistencie k ampicilinu (AMPr), gén rezistencie k tetracyklínu (Tcr), bakteriálny gén rezistencie ku kanamycínu (Kanr), gén rezistencie kzeocínu
31543/H ··· (Zeocín chránené označenie zlúčeniny z rodiny bleomycínov, resp. ochranná známka firmy InVitrogen Corporation), gén AURI-C poskytujúci rezistenciu k antibiotiku aureobasidinu A, gén rezistencie k fosfinotricínu, gén neomycínfosfotransferázy (npŕll), gén rezistencie k hygromycínu, gén βglukoronidázy (GUS), gén chloramfenikolacetyltransferázy (CAT), gén kódujúci zelený fluorescenčný proteín, gén kódujúci luciferázu a ďalšie.
Výhodne je selekčným markerom gén npt//, Kanr alebo gén kódujúci zelený fluorescenčný proteín (GFP).
Odborník pozná rad ďalších selekčných markerov, ktoré by bolo možné použiť na realizáciu predkladaného vynálezu. Navyše predmet vynálezu nie je v žiadnom prípade obmedzený povahou génu selekčného markeru.
Predkladaný vynález zahrňuje všetky génové konštrukty ako tu boli v podstate opísané, ktoré obsahujú ďalšie génové sekvencie určené na udržiavanie a/alebo replikáciu génového konštruktu v prokaryotickej alebo eukaryotickej bunke a/alebo na integráciu génového konštruktu alebo jeho časti do genómu eukaryotickej bunky alebo organizmu.
Tak ako pre rozptýlenú alebo cudzorodú molekulu nukleovej kyseliny je možné štandardné metódy opísané vyššie použiť na vnesenie syntetických génov alebo génových konštruktov do buniek, tkaniva alebo orgánov, s cieľom modulovať expresiu cieľového génu. K takýmto metódam patria napr. lipozómami sprostredkovaná transfekcia alebo transformácia, transformácia buniek pomocou atenuovaného vírusu alebo baktérie, fúzia buniek alebo ďalšie v odbore známe metódy transformácie alebo transfekcie a metódy opísané v publikácii Ausubel a kol. (1992).
K ďalším prostriedkom na vnesenie rekombinantnej DNA do rastlinného pletiva alebo buniek patrí, bez toho, že by bol vynález akokoľvek obmedzený, transformácia pomocou CaCb a jej rôzne varianty, zvlášť spôsob, ktorý opísal Hanahan (1983), priamy príjem protoplastami (Krens a kol., 1982, Paszkowski a kol., 1984), príjem do protoplastov sprostredkovaný PEG (Armstrong a kol., 1990), ostreľovanie mikročasticami, elektroporácia (Fromm a kol., 1985),
31543/H • · ··· • · ··· ·· • · · ·· ··· • · ·· · mikroinjekcia DNA (Crossway a kol., 1986) ostreľovanie tkanív/pletív explantátov alebo buniek mikročasticami (Christov a kol., 1988, Sanford, 1988), vákuová infiltrácia tkanív nukleovou kyselinou a špecificky v prípade rastlín prenosom do rastlinného pletiva sprostredkovaným Agrobacterium tumefaciens, ako bolo opísané napr. v An a kol., 1985, Herrera-Estrela a kol., 1983a, 1983b, 1985).
Pri ostreľovaní mikročasticami je mikročastica vháňaná (vstrelená) do bunky a vzniká tak transformovaná bunka. Je možné použiť v podstate akúkoľvek metódu balistickej transformácie a taktiež akékoľvek vhodné zariadenie na realizáciu predkladaného vynálezu. Príklad vhodného postupu i zariadenia opísali napr. Stomp a kol. (Patent USA č. 5 122 466) a Sanford a Wolf (Patent USA č. 4 945 050). Pri použití balistickej metódy transformácie génový konštrukt môže obsahovať plazmid schopný replikácie v bunke, ktorá má byť transformovaná.
K príkladom vhodných mikročastíc pre vyššie opísaný systém patria zlaté guľovité častice 1 až 5 μ. DNA konštrukty sú nanesené na mikročastice akoukoľvek vhodnou technikou, napr. precipitáciou.
V ďalšom uskutočnení predkladaného vynálezu sú syntetické gény a génové konštrukty tu opísané adaptované pre integráciu do genómu buniek, kde sú potom exprimované.
Odborník si je vedomý toho že, aby sa dosiahla integrácia génovej sekvencie alebo génového konštruktu do genómu hostiteľskej bunky, môžu byť potrebné ešte ďalšie génové sekvencie. V prípade rastlín sú napr. všeobecne potrebné sekvencie ľavej a pravej hranice T-DNA z Ti plazmidu Agrobacterium tumefaciens.
Predkladaný vynález ďalej zahrňuje izolované bunky, tkanivá alebo orgány, ktoré obsahujú syntetické gény podľa predkladaného vynálezu alebo génové konštrukty obsahujúce syntetické gény podľa vynálezu. Predkladaný vynález ďalej zahrňuje i tkanivo/pletivo, orgány alebo celé organizmy, regenerované z týchto buniek, tkanív a orgánov a tiež ich rozmnožovací
31543/H • I ··· • ·· • · ·· · • · · • · • ·· · materiál a potomstvo.
Tak napr. rastliny je možné regenerovať z transformovaných rastlinných buniek alebo tkanív alebo orgánov na médiu obsahujúcom hormóny a regenerované rastliny môžu byť v mnohých rôznych podobách, ako chiméry transformovaných a netransformovaných buniek, klonálne transformanty (napr. všetky bunky sú transformované a obsahujú expresnú kazetu), štepy transformovaného a netransformovaného pletiva (napr. transformovaná podnož štepená netransformovaným štepom u citrusov). Transformované rastliny je možné množiť mnohými spôsobmi, klonálnym množením alebo klasickými šľachtiteľskými metódami. Napr. prvá generácia (T1) transformovaných rastlín môže byť samosprášená, aby poskytla homozygotnú druhú generáciu (T2) transformovaných rastlín a rastliny z generácie T2 sa už ďalej množia klasickými šľachtiteľskými metódami.
Predkladaný vynález je ďalej opísaný a podrobnejšie vysvetlený formou príkladov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Genetické konštrukty obsahujúce sekvenciu génu BEV polymerázy spojenú so sekvenciou CMV promótora a/alebo SV40L promótora
1. Komerčne dostupné plazmidy
Plazmid pBluescriptII (Sk+)
Plazmid pBluescriptII (SK+), komerčne dostupný od firmy Stratagene, obsahuje sekvenciu LacZ promótora a transkripčný terminátor /acZ-alfa, spoločne s viacpočetným klonovacím miestom pre vloženie sekvencie
31543/H • · • · • · ··· · · · • · · ·· ·· štruktúrneho génu. Plazmid ďalej obsahuje replikačné začiatky ColE1 a fl a gén rezistencie k ampicilínu.
Plazmid pSVL
Plazmid pSVL, komerčne dostupný od firmy Pharmacia, slúži ako zdroj neskorého promótora SV40. Nukleotidová sekvencia pSVL je verejnosti prístupná v databáze GenBank pod prístupovým číslom U13868.
Plazmid pCR2.1
Plazmid pCR2.1, komerčne dostupný od firmy Stratagene, obsahuje sekvenciu LacZ promótora a transkripčný terminátor lacz-alfa, spoločne s viacpočetným klonovacím miestom pre vloženie sekvencie štruktúrneho génu. Plazmid bol navrhnutý na klónovanie fragmentov nukleovej kyseliny pomocou A-presahujúcich koncov, ktoré často vznikajú pri syntéze za použitia Taq polymerázy pri polymerázovej reťazovej reakcii (PCR). PCR fragmenty klonované týmto spôsobom sú obklopené dvoma reštrikčnými miestami EcoRI. Plazmid ďalej obsahuje* replikačné začiatky ColEI a fl a gény rezistencie ku kanamycínu a k ampicilínu.
Plazmid pEGFP-N1 MCS
Plazmid pEGFP-N1 MCS (obr. 1, Clontech) obsahuje CMVIE promótor operatívne spojený s otvoreným čítacím rámcom, ktorý kóduje variant divokého typu zeleného fluorescenčného proteínu (GFP, Prasher a kol., 1992, Chalfie a kol., 1994, Inouye a Tsuji, 1994) s posunom k červenej, optimalizovaného pre jasnejšiu fluorescenciu. Špecifický variant GFP kódovaný pEGFP-N1 MCS bol objavený Cormackom a kol. (1996). Plazmid pEGFP-N1 MCS obsahuje viacpočetné klonovacie miesto obsahujúce reštrikčné miesta Bglll a BamHI a mnoho ďalších miest pre reštrikčné endonukleázy, lokalizované medzi CMV IE promótorom a čítacím rámcom GFP. Štruktúrny gén klonovaný do
31543/H ·· ·· · · · • · · • · · · • · · ··· ·· · • ·· ·· ·· · · · · • · · · · • ··· · · · • · · · ··· ·· ·· viacpočetného klonovacieho miesta, pokiaľ mu chýba funkčný začiatok translácie, bude exprimovaný na úrovni transkripcie, avšak nebude exprimovaný na úrovni proteínu (nebude translatovaný). Sekvencia štruktúrneho génu vložená do viacpočetného klonovacieho miesta, pokiaľ obsahuje funkčný začiatok translácie, bude exprimované ako fúzny polypeptid GFP, ak bola klonovaná v súhlase s čítacím rámcom sekvencie kódujúcej GFP. Plazmid ďalej obsahuje SV40 polyadenylačný signál „downstream,, od čítacieho rámca GFP, aby došlo ku správnemu opracovaniu 3'-konca mRNA transkribovanej z CMV-IE promótora. Plazmid ďalej obsahuje replikačný začiatok SV40 funkčný v zvieracích bunkách, gén rezistencie k neomycínu obsahujúci skorý SV40 promótor (SV40 EP na obr. 1) operatívne spojený s génom rezistencie k neomycínu/kanamycínu pochádzajúcemu zTn5 (Kan/neo na obr. 1) a polyadenylačný signál tymidínkinázového génu z HSV (HSV TK poly(A) na obr. 1) pre selekciu transformovaných buniek na kanamycíne, neomycine alebo G418, replikačný začiatok pUC funkčný v bakteriálnych bunkách (pUC Ori na obr. 1) a replikačný začiatok f1 pre replikáciu jednoreťazcovej DNA (f1 Ori na obr. 1).
2. Expresné kazety
Plazmid pCMV.cass
Plazmid pCMV.cass (obr. 2) je expresná kazeta pre expresiu sekvencie štruktúrneho génu riadenú promótorovou sekciou CM IE. Plazmid pCMV.cass bol odvodený zpEGFP-N1 CMS odstránením (deléciou) čítacieho rámca GFP nasledujúcim spôsobom: Plazmid pEGFP-N1 CMS bol naštiepený PinAl a Notl, zatupený pomocou Pful polymerázy a znovu spojený (ligovaný). Sekvencia štruktúrneho génu sa do pCMV.cass klonuje pomocou viacpočetného klonovacieho miesta, ktoré je identické s viacpočetným klonovacím miestom pEGFP-N1 CMS, až na to, že jej chýba miesto PinAl.
31543/H ·· ·· · ·· • · · ·· · · · • ··· · · · · · · · · • ···· · · · ··· ·· ·· ··· ·· ···
Plazmid pCMV.SV40L.cass
Plazmid pCMV.SV40L.cass (obr. 3) obsahuje syntetické polyA miesto a sekvenciu neskorého SV40 promótora z plazmidu pCR.SV40L (obr. 4), subklonovanej ako Sali fragment do Sali miesta plazmidu pCMV.cass (obr. 2)., takže sekvencia CM V IE promótora a neskorého SV40 promótora sú schopné riadiť transkripciu v rovnakom smere. Teda syntetické polyA na 5'-konci sekvencie SV40 promótora je použité ako transkripčný terminátor štruktúrneho génu exprimovaného z CMV IE promótora v tomto plazmide, čo tiež umožňuje inzerciu štruktúrneho génu prostredníctvom viacpočetného klonovacieho miesta ležiaceho medzi oneskoreným SV40 promótorom a syntetickým poly(A) miesto (obr. 5). Viacpočetné klonovacie miesto leží za CMV IE a SV40 promótormi, vrátane miest BamHI a Bglll.
Plazmid pCMV.SV40LR.cass
Plazmid pCMV.SV40LR.cass (obr. 4) obsahuje sekvenciu neskorého SV40 promótora z plazmidu pCR.SV40L subklonovanú ako Sali fragment do Sali miesta plazmidu pCMV.cass (obr. 2), takže CMV IE promótor alebo neskorý SV40 promótor sú schopné riadiť transkripciu štruktúrneho génu alebo viacpočetné štruktúrne génové jednotky v orientácii sense alebo anti-sense podľa požiadaviek. Viacpočetné klonovacie miesto leží medzi oproti sebe položenými promótormi CMV IE a SV40 promótormi, aby bolo umožnené vkladanie sekvencie štruktúrneho génu. Aby došlo k expresii štruktúrneho génu v tomto plazmide, musí byť táto sekvencia vložená so svojim vlastným transkripčným terminátorom umiestneným na 3’-konci, lebo v tomto plazmide, medzi oproti sebe položenými promótormi CMV IE a SV40 promótormi nie je žiadny transkripčný terminátor. Výhodne sekvencia štruktúrneho génu alebo jednotka viacpočetného štruktúrneho génu, ktorá sa má vložiť do pCMV.SV40LR.cass, obsahuje ako 5'- tak i 3'-polyadenylačné signály: I) keď má byť sekvencia štruktúrneho génu alebo jednotky viacpočetného štruktúrneho génu exprimované v orientácii sense z CMV IE promótora a/alebo
31543/H ··· · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· · v anti-sense orientácii z neskorého SV40 promótora, 5'-polyadenylačný signál by mal byť v anti-sense orientácii a 3'-polyadenylačný signál by mal byť v sense orientácii, a II) keď má byť sekvencia štruktúrneho génu alebo jednotky viacpočetného štruktúrneho génu exprimované v anti-sense orientácií z CMV IE promótora a/alebo v sense orientácii z neskorého SV40 promótora, 5'polyadenylačný signál by mal byť v sense orientácii a 3'-polyadenylačný signál by mal byť v anti-sense orientácii.
Alternatívne, a alebo navyše, vhodne orientované transkripčné terminátory môžu byť umiestnené na 5'-konci CMV a SV40L promótora, ako ukazuje obr. 4.
Alternatívne plazmid pCMV.SV40LR.cass je ďalej modifikovaný tak, že vznikne odvodený plazmid, ktorý obsahuje dva polyadenylačné signály umiestnené medzi sekvencie promótorov CMV IE a SV40, v orientácii vhodnej pre expresiu anti-sense orientácie či už z CMV IE promótora alebo SV40 promótora.
Alternatívne vhodne orientované transkripčné terminátory môžu byť vložené „upstream,, (proti smeru transkripcie) od CMV a SV40 promótorov, takže môže dôjsť kterminácii transkripcie po prečítaní každého z obidvoch promótorov v anti-sense orientácii.
3. Konštrukčné medziprodukty
Plazmid pCR.Bgl-GFP-Bam
Plazmid pCR.Bgl-GFP-Bam (obr. 5) obsahuje vnútorný úsek otvoreného čítacieho rámca GFP získaného z plazmidu pEGFP-N1 MCS (obr. 1) umiestneného operatívne pod kontrolu promótora lacZ. Na prípravu tohto plazmidu bol úsek otvoreného čítacieho rámci GFP amplifikovaný z pEGFP-N1 MCS pomocou PCR s primérmi Bgl-GFP a GFP-Bam a klonovaný do pCR2.1. Vnútornému kódujúcemu úseku GFP v plazmide pCR.Bgl-GFP-Bam chýbajú
31543/H ·· ·· · • · · · ·· • e · · · ··· · · · · • · · · • ·· ·· ··· ·· · funkčné kodóny na začiatok a koniec translácie.
Plazmid pBSII(SK+).EGFP
Plazmid pBSII(SK+).EGFP (obr. 6) obsahuje otvorený čítací rámec EGFP pochádzajúci z plazmidu pEGFP-N1 MCS (obr. 1) umiestnený operatívne pod kontrolu promótora lacZ. Na prípravu tohto plazmidu bol úsek kódujúci EGFP zpEGFP-N1 MCS vyštiepený ako fragment a klonovaný do klonovacieho miesta Notl/Xhol plazmidu pBluescriptll(SK+).
Plazmid pCMV.EGFP
Plazmid pCMV.EGFP (obr. 7) je schopný exprimovat’ štruktúrny gén EGFP pod kontrolou promótorovej sekvencie CMV IE. Na prípravu tohto plazmidu bola sekvencia EGFP vyštiepená z plazmidu pBSII(SK+).EGFP ako fragment BamHl-SacI a klonovaná do klonovacieho miesta Bglll/Sacl plazmidu pCMV.cass (obr. 2).
Plazmid pCR.SV40L
Plazmid pCR.SV40L (obr. 8) obsahuje neskorý promótor SV40 pochádzajúci z plazmidu pSVL (GeneBank č. U13868, Pharmacia), klonovaný do pCR2.1 (Strategene). Na prípravu tohto plazmidu bola sekvencia neskorého promótora SV40 amplifikovaná v PCR pomocou oligonukleotidových primérov SV40-1 a SV40-2, ktorý obsahuje klonovacie miesta Sali na subklonovanie amplifikovaného fragmentu do plazmidu pCMV.cass. Primér obsahuje tiež syntetické poly(A) miesto na 5'-konci, takže amplifikovaný produkt obsahuje syntetické poly(A) miesto na 5'-konci promótorovej sekvencie SV40.
Plazmid pCR.BEV.1
Kódujúci úsek BEV RNA-polymerázy bol amplifikovaný ako fragment
31543/H «·· ·· ♦ ·· · ·· * · · · ·· · · ·· ··· · · · · · · • (B····· ···· · • · · » · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ···
DNA veľkosti 1385 bp zklonu cDNA plnej dĺžky pre tento gén pomocou oligonukleotidových primérov označených BEV-1 a BEV-2 za štandardných podmienok amplifikácie. Amplifikovaná DNA obsahovala na 5'-konci reštrikčné miesto BglII vnesené sekvenciou priméru BEV-1 a na 3'-konci reštrikčné miesto BamHI vnesené sekvenciou priméru BEV-2. Navyše sekvencia BEV-1 obsahovala signál pre začiatok translácie 5'-ATG-3' vnesený do pozície 15 až 17, takže amplifikovaný štruktúrny gén BEV polymerázy obsahuje začiatočný kodón vo vhodnom čítacom rámci s kódujúcou sekvenciou BEV polymerázy. Teda amplifikovaný štruktúrny gén BEV polymerázy obsahuje ATG kodón bezprostredne „upstream,, (t. zn. pred, proti smeru transkripcie) k sekvencií kódujúcej BEV polymerázu. V amplifikovanej DNA nie je žiaden stop-kodón. Tento plazmid je znázornený na obr. 9.
Plazmid pCR.BEV.2
Úplný kódujúci úsek BEV polymerázy bol amplifikovaný z klonu cDNA plnej dĺžky pomocou priméru BEV-1 a BEV-3. Primér BEV-3 obsahuje reštrikčné miesto BamHI v pozícii 5 až 10 vrátane a komplementárnu sekvenciu ku stop-kodónu translácie v pozícií 11 až 13. V dôsledku toho otvorený čítací rámec obsahoval signál začiatku translácie a translačný stop-kodón medzi reštrikčnými miestami BglII a BamHI. Amplifikovaný fragment bol klonovaný do plazmidu pCR2.BEV.2 (obr. 10).
Plazmid pCR.BEV3
Nestranslatovateľný štruktúrny gén BEV polymerázy bol amplifikovaný z klonu cDNA plnej dĺžky pomocou priméru BEV-3 a BEV-4. Primér BEV-4 obsahuje reštrikčné miesto BglII v pozícii 5 až 10 a sekvencia ležiaca „downstream,, (po smere transkripcie) od BglII miesta je homológna s nukleotidovou sekvenciou génu BEV polymerázy. V produkte amplifikovanom pomocou priméru BEV-3 a BEV-4 nie je žiaden funkčný štartovací ATG kodón. BEV polymeráza je exprimovaná ako časť polypeptidu a teda v tomto géne nie
31543/H • ·· ·· · ·· ·· « · · · ·· · · • ·· · · · · · · • · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· je tiež začiatok translácie ATG. Amplifikovaná DNA bola klonovaná do plazmidu pCR.BEV.3 (obr. 11).
Plazmid pCMV.EGFP.BEV2
Plazmid pCMV.EGFP.BEV2 (obr. 12) bol pripravený klonovaním sekvencie BEV polymerázy z pCR.BEV.2 v podobe fragmentu Bglll/Bahl do BamHI miesta pCMV.EGFP.
4. Kontrolné plazmidy
Plazmid pCMV.BEV.2
Plazmid pCMV.BEV.2 (obr. 13) je schopný exprimovať celý otvorený čítací rámec BEV polymerázy pod kontrolou CMV IE promótorovej sekvencie. Na prípravu pCMV.BEV.2 bola sekvencia BEV polymerázy z pCR.BEV.2 subklonovaná vsense orientácii ako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.cass (obr. 2) naštiepeného BglII/BamHl.
Plazmid pCMV.BEV.3
Plazmid pCMV.BEV.3 (obr. 14) je schopný exprimovať celý netranslatovateľný štruktúrny gén BEV polymerázy pod kontrolou CMV IE promótorovej sekvencie. Na prípravu pCMV.BEV.nt bola sekvencia BEV polymerázy z pCR.BEV.3 subklonovaná v sense orientácii ako fragment BglIIBamHI do plazmidu pCMV.cass (obr. 2) naštiepeného BglII/BamHl.
Plazmid pCMV.VEB
Plazmid pCMV.VEB (obr. 15) exprimuje anti-sense mRNA BEV polymerázy pod kontrolou CMV IE promótorovej sekvencie. Na prípravu pCMV.VEB bola sekvencia BEV polymerázy z pCR.BEV.2 subklonovaná v anti31543/H ··· • 9 sense orientácii ako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.cass (obr. 2) naštiepeného BglII/BamHl.
Plazmid pCMV.BEV.GFP
Plazmid pCMV.BEV.GFP (obr. 16) bol skonštruovaný klonovaním fragmentu GFP z plazmidu pCR.Bgl-GFP-Bam ako fragmentu BglII/BamHl do plazmidu pCMV.BEV.2 naštiepeného BamHl. Tento plazmid slúžil ako kontrola v niektorých experimentoch a tiež je konštrukčný medziprodukt.
Plazmid pCMV.BEV.SV40-L
Plazmid pCMV.BEV.SV40-L (obr. 17) obsahuje translatovaný štruktúrny gén BEV polymerázy z plazmidu pCR.BEV.2 vložený v sense orientácii medzi CMV-IE promótor a SV40 neskorý promótor v plazmide pCMV.SV40L.cass. Na prípravu plazmidu pCMV.BEV.SV40L-O bol štruktúrny gén BEV polymerázy subklonovaný ako fragment BglII-BamHI do DNA plazmidu pCMV.SV40L.cass naštiepenej Bglll.
Plazmid pCMV.O.SV40L.BEV
Plazmid pCMV.O.SV40L.BEV (obr. 18) obsahuje translatovateľný štruktúrny gén BEV polymerázy získaný z plazmidu pCR.BEV.2 klonovaný downstream od tandemu CMV-IE promótora a SV40 neskorého promótora prítomného v plazmide pCMV.SV40L.cass. Na prípravu plazmidu pCMV.O.SV40L.BEV bol štruktúrny gén BEV polymerázy subklonovaný v sense orientácii ako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.SV40L.cass.
Plazmid pCMV.O.SV40L.VEB
Plazmid pCMV.O.SV40L.VEB (obr. 19) obsahuje anti-sense štruktúrny gén BEV polymerázy získaný z plazmidu pCR.BEV.2 klonovaný downstream od
31543/H ·· • · • · • · • · tandemu CMV-IE promótora a SV40 neskorého promótora prítomného v plazmide pCMV.SV40L.cass. Na prípravu plazmidu pCMV.O.SV40L.VEB bol štruktúrny gén BEV polymerázy subklonovaný v anti-sense orientácii ako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.SV40L.cass.
5. Testovacie plazmidy
Plazmid pCMV.BEVx2
Plazmid pCMV.BEVx2 (obr. 20) obsahuje priamu repetíciu úplného čítacieho rámca BEV polymerázy pod kontrolou CMV-IE promótorovej sekvencie. Prinajmenšom v eukaryotických bunkách je otvorený čítací rámec lokalizovaný v blízkosti CMV-IE promótora translatovateľný. Na prípravu plazmidu pCMV.BEVx2 bol štruktúrny gén BEV polymerázy z plazmidu pCR.BEV.2 subklonovaný vsense orientácii ako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.BEV.2, bezprostredne downstream od štruktúrneho génu BEV polymerázy už v plazmide prítomného.
Plazmid pCMV.BEVx3
Plazmid pCMV.BEVx3 (obr. 21) obsahuje prítomnú repetíciu úplného čítacieho rámca BEV polymerázy pod kontrolou CMV-IE promótorovej sekvencie. Na prípravu plazmidu pCMV.BEVx3 bol štruktúrny gén BEV polymerázy z plazmidu pCR.BEV.2 subklonovaný vsense orientácii ako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.BEVx2, bezprostredne downstream od štruktúrnych génov BEV polymerázy už v plazmide prítomných.
Plazmid pCMV.BEVx4
Plazmid pCMV.BEVx4 (obr. 22) obsahuje priamu repetíciu úplného čítacieho rámca BEV polymerázy pod kontrolou CMV-IE promótorovej sekvencie. Na prípravu plazmidu pCMV.BEVx4 bol štruktúrny gén BEV
31543/H
• ·♦ ·· · • · ·
• · · • · • · • · ··
• · · • · • • ·
• ··· · • · • • · ·
• · • · • • ·
• · ·· ·· ··· ·· • ·
polymerázy z plazmidu pCR.BEV.2 subklonovaný v sense orientácii ako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.BEVx3, bezprostredne downstream od štruktúrnych génov BEV polymerázy už v plazmide prítomných.
Plazmid pCMV.BEV.SV40L.BEV
Plazmid pCMV.BEV.SV40L.BEV (obr. 23) obsahuje jednotku viacpočetného štruktúrneho génu obsahujúceho 2 štruktúrne gény BEV polymerázy operatívne a samostatne pod kontrolou CMV-IE promótora a neskorého SV40 promótora. Na prípravu plazmidu pCMV.BEV.SV40.BEV bol translatovateľný štruktúrny gén BEV polymerázy z plazmidu pCR.BEV.2 subklonovaný v sense orientácii ako fragment BglII-BamHI za sekvenciu neskorého SV40 promótora do plazmidu pCMV.BEV.SV40L-O naštiepeného BamHI.
Plazmid pCMV.BEV.SV40L.VEB
Plazmid pCMV.BEV.SV40L.BEV (obr. 24) obsahuje jednotku viacpočetného štruktúrneho génu obsahujúceho 2 štruktúrne gény BEV polymerázy operatívne a samostatne pod kontrolou CMV-IE promótora a neskorého SV40 promótora. Na prípravu plazmidu pCMV.BEV.SV40L.VEB bol translatovateľný štruktúrny gén BEV polymerázy z plazmidu pCR.BEV.2 subklonovaný v anti-sense orientácii ako fragment BglII-BamHI za sekvenciou neskorého SV40 promótora do plazmidu pCMV.BEV.SV40L-O naštiepeného BamHI. V tomto plazmide je štruktúrny gén BEV polymerázy exprimovaný v sense orientácii pod kontrolou CMV-IE promótora, čím vzniká translatovateľná mRNA, pričom je štruktúrny gén BEV polymerázy exprimovaný pod kontrolou SV40 promótora, kde vzniká anti-sense mRNA.
Plazmid pCMV.BEV.GFP.VEB
Plazmid pCMV.BEV.GFP.VEB (obr. 25) obsahuje invertovanú repetíciu
31543/H ·· ·· · ·· • · · · ·· · · · • ··· · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· štruktúrneho génu BEV alebo palindróm, prerušený vložením otvoreného čítacieho rámca pre GFP (ako „vloženého fragmentu,,) medzi štruktúrnymi sekvenciami BEV v invertovanej repetícii. Na prípravu plazmidu pCMV.BEV.GFP.VEB bol vložený fragment GFP z plazmidu pCR.Bgl-GFP-Bam najskôr subklonovaný do v sense orientácii ako fragment BglII-BamHI do pCMV.BEV.2 naštiepeného BamHI, aby sa vytvoril medziprodukt pCMV.BEV.GFP, v ktorom sú obsiahnuté sekvencie kódujúce BEV polymerázu a GFP v jednom a tom istom fragmente ,,5'-Bglll-BamHI-3'„. Štruktúrny gén BEV polymerázy z pCMV.BEV.2 bol potom klonovaný vanti-sense orientácii ako fragment BglII-BamHI do pCMV.BEV.GFP naštiepeného BamHI. Štruktúrny gén BEV polymerázy v blízkosti CMV-IE promótorovej sekvencie vplazmide pCMV.BEV.GFP.VEB je schopný translácie, prinajmenšom v eukaryotických bunkách.
Plazmid pCMV.EGFP.BEV2.PFG
Plazmid pCMV.EGFP.BEV2.PFG (obr. 26) obsahuje GFP palindróm prerušený vložením sekvencie génu BEV polymerázy medzi každé dva štruktúrne gény GFP. Na prípravu tohto plazmidu bol vložený fragment GFP z plazmidu pCR.Bgl-GFP-Bam klonovaný ako fragment BglII-BamHI vantisense orientácii vzhľadom k CMV promótora do miesta Bam-HI v pCMV.EGFP.BEV2.
Plazmid pCMV.BEV.SV40LR
Plazmid pCMV.BEV.SV40LR (obr. 27) obsahuje štruktúrny gén obsahujúci celý otvorený čítací rámec BEV polymerázy umiestnený operatívne a separátne pod kontrolu opačne položeného CMV-IE promótora a sekvenciu neskorého SV40 promótora, teda potenciálne produkujúce transkripty BEV polymerázy aspoň z obidvoch reťazcov štruktúrneho génu BEV plnej dĺžky. Na prípravu plazmidu plazmid pCMV.BEV.SV40LR bol translatovateľný štruktúrny gén BEV polymerázy prítomný v pCR.BEV.2 subklonovaný ako BglII-BamHI
31543/H • · ··· ·· · ·· • · · ·· ··* ·· · fragment do jedinečného miesta Bglll plazmidu pCMV.SV40LR.cass, takže otvorený čítací rámec BEV je prítomný v sense orientácii vzhľadom k sekvencii CMV-IE promótora.
Odborníkovi je zrejmé, že použitím tej istej klonovacej stratégie je možné vytvoriť plazmid, kde fragment BEV polymerázy z pCR.BEV.2 je vložený v antisense orientácii vzhľadom k sekvencii CMV-IE promótora. Predkladaný vynález teda zahrňuje i takýto génový konštrukt.
Príklad 2
Génové konštrukty obsahujúce sekvenciu štruktúrneho génu prasačie a-1,3galaktozyltransferázy (Galt) alebo sekvencie operatívne spojenej so sekvenciou CMV promótor a/alebo SV40L promótora.
1. Komerčne dostupné plazmidy
Plazmid pcDNA3
Plazmid pcDNA3 je komerčne dostupný od firmy Invitrogen a obsahuje CMV-IE promótor a transkripčný terminátor BGHpA, s viacpočetným klonovacím miestom na vloženie sekvencie štruktúrneho génu medzi nimi. Plazmid ďalej obsahuje začiatky replikácie ColE1 a FI a gény rezistencie k neomycínu a ampicilínu.
2. Plazmidové medziprodukty
Plazmid pcDNA3.Galt
Plazmid pCDNA3.Galt (BresGen Limited, South Austrália, obr. 28) je plazmid pcDNA3 (Invitrogen) obsahujúci cDNA sekvenciu kódujúcu prasačí gén a-1,3-galaktozyltransferázy (Galt) operatívne pod kontrolou CMV-IE promótora,
31543/H ·· · • · · · ·· ··· ·· · takže je schopná expresie. Na prípravu plazmidu pcDNA3.Galt bola cDNA sekvencia prasačí gén a-1,3-galaktozyltransferázy klonovaná ako EcoRI fragment do EcoRI klonovacieho miesta plazmidu pcDNA3. Plazmid ďalej obsahuje replikačné začiatky ColE1 a Fl a gény rezistencie k neomycínu a ampicilinu.
3. Kontrolné plazmidy
Plazmid pCMV.Galt
Plazmid pCMV.Galt (obr. 29) je schopný exprimovať štruktúrny gén Galt riadený promótorom CMV-IE. Na prípravu plazmidu pCMV.Galt bola sekvencia Galt z plazmidu pcDNA3.Galt vyštiepená ako EcoRI fragment a klonovaná v sense orientácii do EcoRI miesta plazmidu pCMV.cass (viď obr. 2).
Plazmid pCMV.EGFP.Galt
Plazmid pCMV.EGFP.Galt (obr. 30) je schopný exprimovať štruktúrny gén Galt ako fúzny polypeptid riadený promótorom CMV-IE. Na prípravu plazmidu pCMV.EGFP.Galt bola sekvencia Galt z plazmidu pCMV.Galt (obr. 29) vyštiepená ako BglII-BamHI fragment a klonovaná do BamHI miesta plazmidu pCMV.EGFP.
Plazmid pCMV.Galt.GFP
Plazmid pCMV.Galt.GFP (obr. 31) bol pripravený klonovaním cGNA Galt v podobe EcoRI fragmentu z pcDNA3 do plazmidu pCMV.EGFP naštiepeného EcoRI v sense orientácii. Tento plazmid slúžil súčasne ako kontrolný plazmid i ako konštrukčný medziprodukt.
Plazmid pCMV.Galt.SV4OL.O
31543/H • ·· ·· · ·· ···· ···· ···
Plazmid pCMV.Galt.SV4OL.O (obr. 32) obsahuje štruktúrny gén Galt klonovaný downstream od CMV promótora prítomného v pCMV.SV40L.cass.
Na prípravu plazmidu pCMV.Galt.SV4OL.O bol fragment Galt cDNA zpCMV.Galt klonovaný ako BglII-BamHI fragment do pCMV.SV40L.cass naštiepeného Bglll v sense orientácii.
• ··· · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ·
Plazmid pCMVO.SV40L.tlaG
Plazmid pCMVO.SV40L.tlaG (obr. 33) obsahuje štruktúrny gén Galt klonovaný v anti-sense orientácii downstream od promótora SV40L prítomného v pCMV.SV40L.cass. Na prípravu tohto plazmidu bol fragment Galt cDNA zpCMV.Galt klonovaný ako BglII-BamHI fragment do pCMV.SV40L.cass naštiepeného BamHI v anti-sense orientácii.
Plazmid pCMVO.SV40L.Galt
Plazmid pCMVO.SV40L.Galt (obr. 34) obsahuje štruktúrny gén Galt klonovaný downstream od promótora SV40L prítomného v pCMV.SV40L.cass. Na prípravu tohto plazmidu bol fragment Galt cDNA z pCMV.Galt klonovaný ako BglII-BamHI fragment do pCMV.SV40L.cass naštiepeného BamHI v sense orientácii.
4. Testovacie plazmidy
Plazmid pCMV.Galtx2
Plazmid pCMV.Galtx2 (obr. 35) obsahuje priamu repetíciu otvoreného čítacieho rámca pod kontrolou promótorovej sekvencie CMV-IE. Prinajmenšom v eukaryotických bunkách je otvorený čítací rámec lokalizovaný v blízkosti promótora CMV-IE translatovateľný. Na prípravu plazmidu pCMV.Galtx2 bol štruktúrny gén Galt vyštiepený zpCMV.Galt ako BglII-BamHI fragment a klonovaný do BamHI klonovacieho miesta pCMV.Galt.
31543/H • ·· ·· ·· · · · · ·· • · · • ··· · · · • · · · ··· ·· ·· • ·· • · • · ·· ·
Plazmid pCMV.Galtx2
Plazmid pCMV.Galtx2 (obr. 36) obsahuje štvornásobnú priamu repetíciu otvoreného čítacieho rámca pod kontrolou promótorovej sekvencie CMV-IE. Prinajmenšom v eukaryotických bunkách je otvorený čítací rámec lokalizovaný v blízkosti promótora CMV-IE translatovateľný. Na prípravu plazmidu pCMV.Galtx4 bola sekvencia Galtx2 vyštiepená z pCMV.Galtx2 ako BglllBamHI fragment a klonovaná v sense orientácii do BamHI klonovacieho miesta pCMV.Galtx2.
Plazmid pCMV.Galt.SV40L.Galt
Plazmid pCMV.Galt.SV40L.Galt (obr. 37) bol pripravený tak, že exprimuje 2 sense transkripty Galt, pričom jeden je riadený promótorom CMV a druhý je riadený promótorom SV40L. Na prípravu plazmidu bol fragment Galt cDNA z pCMV.Galt klonovaný v sense orientácii ako BglII-BamHI fragment do pCMV.O.SV40.Galt naštiepeného Bglll.
Plazmid pCMV.Galt.SV40L.tlaG
Plazmid pCMV.Galt.SV40L.tlaG (obr. 38) bol pripravený tak, že exprimuje sense transkript Galt riadený promótorom CMV a anti-sense transkript Galt riadený promótorom SV40L. Na prípravu tohto plazmidu bo fragment Galt cDNA z pCMV.Galt klonovaný v sense orientácii ako BglII-BamHI fragment do pCMVO.SV40.talG naštiepeného Bglll.
Plazmid pCMV.Galt.GFP.tlaG
Plazmid pCMV.Galt.GFP.tlaG (obr. 39) obsahuje palindróm Galt, prerušený vloženou sekvenciou GFP medzi dvoma štruktúrnymi génmi tvoriacimi invertovanú repetíciu. Na prípravu tohto plazmidu bol fragment Galt cDNA z pCMV.Galt klonovaný v anti-sense orientácii vzhľadom k promótoru
31543/H ·· ·· · ·· • · · · ·· · ··· · · · · · · · • · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ·
CMV ako BglII-BamHI fragment do pCMV.Galt.GFP naštiepeného BamHl.
Plazmid pCMV.EGFP.Galt.PFG
Plazmid pCMV.EGFP.Galt.PFG (obr. 40) obsahuje palindróm GFP, prerušený vloženou sekvenciou Galt medzi dvoma štruktúrnymi génmi GFP tvoriacimi invertovanú repetíciu, ktorých expresia je riadená promótorom CMV. Na prípravu tohto plazmidu bola sekvencia Galt z CMV.Galt klonovaná v sense orientácii ako BglII-BamHI fragment do pCMV.EGFP.Galt (nie je znázornený), a potom ďalšie GFP sekvencie z pCR-Bgl-pCMV.EGFP.Galt v anti-sense orientácii.
Plazmid pCMV.Galt.SV40LR
Plazmid pCMV.Galt.SV40LR (obr. 41) bol pripravený pre expresiu Galt cDNA sekvencii klonovaných medzi opačne orientované CMV a SV40L promótory v expresnej kazete pCMV.SV40LR.cass. Na prípravu tohto plazmidu bola sekvencia Galt z pCMV.Galt klonovaná v sense orientácii vzhľadom k promótoru 35S ako BglII-BamHI fragment do pCMV.SV40LR naštiepeného BamHl.
Príklad 3
Génové konštrukty obsahujúce PVY Nia sekvencie operatívne spojené s promótorom 35S a/alebo SCBV
Binárne vektory
Plazmid pART27
Plazmid pART27 je binárny vektor špecificky navrhnutý tak, aby bol
31543/H • ·· ·· ·· · · · · • ··· · · · • · · · ··· ·· ·· • · • · ·· · kompatibilný s expresnou kazetou pART7. Obsahuje bakteriálny začiatok replikácie ako pre E. coli tak i pre Agrobacterium tumefaciens, gén rezistencie ku spektimycínu pre bakteriálnu selekciu, ľavú a pravú hraničnú DNA na prenos DNA z Agrobacterium tumefaciens do rastlinnej bunky a kazetu rezistentnú ku kanamycínu, aby bola možná selekcia transformovaných rastlinných buniek. Kazeta rezistencie ku kanamycínu je lokalizovaná medzi dvoma hraničnými sekvenciami T-DNA, a pART27 obsahuje tiež jedinečné reštrikčné miesto Nôti, ktoré dovoľuje klonovanie konštruktu pripraveného vo vektore ako je pART7 medzi hraničné sekvencie T-DNA. Konštrukcia pART27 bola podrobne opísaná v práci Gleave, A.P. (1992).
Pri klonovaní Nôti inzertov do tohto vektora môže byť inzert v dvoch orientáciách. Vo všetkých ďalších príkladoch bola vybraná rovnaká orientácia inzertu, vzhľadom ku smeru promótora 35S v opísanom pART7, a to preto, aby sa minimalizovali experimentálne artefakty, ktoré môžu vznikať porovnávaním rôznych konštruktov s rôznou orientáciou inzertov.
2. Komerčne dostupné plazmidy
Plazmid pBC(KS-)
Plazmid pBC(KS-), komerčne dostupný od firmy Stratagene, obsahuje sekvenciu LacZ promótora a transkripčný terminátor lacZ-alfa, spoločne s viacpočetným klonovacím miestom na vloženie sekvencie štruktúrneho génu. Plazmid ďalej obsahuje replikačné začiatky ColE1 a Fl a gén rezistencie k chloramfenikolu.
Plazmid SP72
Plazmid SP72 je komerčne dostupný od firmy Promega a obsahuje viacpočetné klonovacie miesto na vloženie sekvencie štruktúrneho génu. Plazmid ďalej obsahuje replikačný začiatok ColE1 a gén rezistencie
31543/H
• ·· ·· • ··
·· · · • · ·· • • ·
• ··· · • · ··· ·· • · • · ·· • • ··· • · • ·· • • •
k ampicilínu.
Expresné kazety
Plazmid pART7
Plazmid pART7 je expresná kazeta navrhnutá pre expresiu sekvencii klonovaných za promótor 35S. Obsahuje polylinker (viacpočetné klonovacie miesto) pre uľahčenie klonovania a úsek terminátora oktopinsyntázy. Klonovacia kazeta 35S je obklopená dvoma reštrikčnými miestami Notl, ktoré dovoľujú klónovanie do expresného binárneho vektora ako je napr. pART27, ktorý obsahuje jedinečné miesto Notl. Opis konštrukcie bol uvedený v práci Gleave, A.P. (1992) a mapa plazmidu je uvedená na obr. 43.
Plazmid pART7.35S.SCBV.cass
Plazmid pART7.35S.SCBV.cass bol navrhnutý pre expresiu dvoch oddelených sekvencii klonovaných do toho istého plazmidu. Na prípravu tohto plazmidu boli sekvencie zodpovedajúce terminátorovi NOS a SCBV promótoru amplifikované v PCR a potom klonované do polylinkera pART7 medzi promótor 35S a OCS. Výsledný plazmid mal nasledujúce usporiadanie prvkov:
„35S promótor - polylinker 1 - NOS terminátor - SCBV promótor - polylinker 2 OCS terminátor,,.
Expresia sekvencie klonovanej do polylinkera 1 je riadená promótorom 35S, expresia sekvencie klonovanej do polylinkera 2 je riadená promótorom SCBV.
Sekvencie terminátora NOS boli amplifikované z plazmidu pAHC27 (Christiansen a Quail, 1996) použitím dvoch oligonukleotidových primérov:
NOS 5' (sekvencia id. č.):
5'-GGATTCCCGGGACGTCGCGAATTTCCCCCGATCGTTC-3';a
31543/H ·· ·· · ·· • · 9 9 99 · · 9 • · · · · · · ··· · 9 · 9 · · ·
9 9 9 · · ··· 99 ·· 9·· ·· ·
NOS 3' (sekvencia id. č.):
5’-CCATGGCCATATAGGCCCATCTAGTAACATAG-3'
Nukleotidy 1 až 17 v NOS 5' a 1 až 15 v NOS 3' predstavujú dodatočné nukleotidy pridané, aby vytvorili reštrikčné miesta na uľahčenie klonovania.
V prípade NOS 5' sú to BamHI, Aatll a prvé 4 báza z miesta Nrul, pre NOS 3' sú to miesta Ncol a Sfil. Zostávajúca časť sekvencie každého oligonukleotidu je homológna k 5' a 3' koncu sekvencie NOS v pAHC27.
Promótorové sekvencie SCBV boli amplifikované z plazmidu pScBV-20 (Tzafir a kol., 1998) použitím dvoch oligonukleotidových primérov;
SCBV 5': 5'-CCATGGCCTATATGGCCATTCCCCACATTCAAG-3'; a
SCBV 3': 5'-AACGTTAACTTCTACCCAGTTCCAGAG-3'
Nukleotidy 1 až 17 v SCBV 5' kódujú Ncol a Sfil reštrikčné miesta na uľahčenie klonovania konštruktu, zostávajúca sekvencia je homológna s „upstream,, sekvenciami promótorového úseku SCMV. Nukleotidy 1 až 9 SCBV 3' kódujú reštrikčné miesta Psp10461 a Hpal na uľahčenie klonovania konštruktu, zostávajúca sekvencia je homológna s reverznou a komplementárnou sekvenciou v blízkosti miesta iniciácie transkripcie v SCBV.
Sekvencie boli amplifikované z pScBV-20 použitím PCR a klonované do pCR2.1 (Invitrogen), čím boli pripravené pCR.NOS a pCR.SCBV. pCR.NOS naštiepený Smal a Sfil a pCR.SCBV naštiepený Sfil a Hpal boli ligované do pART7 naštiepeného Smal. Plazmid s vhodnou orientáciou bol vybraný a pomenovaný pART7.35S.SCBV.cass, jeho mapa je uvedená na obr. 43.
Konštrukčné medziprodukty
Plazmid pBC.PVY
Úsek PVY genómu bol amplifikovaný pomocou štandardnej PCR, v ktorej bola použitá ako templát reverzne transkribovaná RNA izolovaná
31543/H
• ·· ·· ·· · · · · • · · · · • ··· · · · • · · · ··· ·· ·· z tabaku infikovaného PVY, a klonovaný do plazmidu pGEM3 (Stratagene), aby sa vytvoril pGEM.PVY. Sall/Hindlll fragment zpGEM.PVY zodpovedajúci fragmentu Sall/Hindlll v pozícii- 1536 až 2270 sekvencie PVY kmeňa O (GenBank č. D12539) bol potom subklonovaný do plazmidu pBC (Stratagene), aby sa vytvoril plazmid pBC.PVY (obr. 44).
Plazmid pSP72.PVY
Plazmid pSP72.PVY bol pripravený vložením EcoRI-Sall fragmentu z pBC.PVY do pSP72 (Promega) naštiepeného EcoRI/Sall. Tento konštrukt obsahuje dodatočné reštrikčné miesta obklopujúce inzert PVY, ktoré boli vložené na uľahčenie ďalších manipulácií. Mapa tohto konštruktu je uvedená na obr. 45.
Plazmid ClapBC.PVY
Plazmid ClapBC.PVY bol pripravený vložením Clal-Sall fragmentu zpSP72.PVY do pBC (Stratagene) naštiepeného Clal/Sall. Tento konštrukt obsahuje dodatočné reštrikčné miesta obklopujúce PVY inzert, ktoré boli použité na uľahčenie ďalších manipulácií. Mapa tohto konštruktu je uvedená na obr. 46.
Plazmid pBC.PVYx2
Plazmid pBC.PVYx2 obsahuje dve priame (tzv. hlava ku chvostu) repetície PVY sekvencie pochádzajúce z pBC.PVY. Plazmid bol pripravený klonovaním Accl-Clal PVY fragmentu z pSP72.PVY do pBC.PVY naštiepeného Accl a je znázornený na obr. 47.
Plazmid pSP72.PVYx2
Plazmid pSP72.PVYx2 obsahuje dve priame (tzv. hlava ku chvostu)
31543/H • ·· ·· · ·· ···· ···· ··· repetície PVY sekvencii pochádzajúcich z pBC.PVY. Plazmid bol pripravený klonovaním Accl-Clal PVY fragmentu z pBC.PVY do pSP72.PVY naštiepeného
Accl a je znázornený na obr. 48.
• ··· · · · · · · · • · · · · · · ····· ·· ··· ··
Plazmid pBC.PVYx3
Plazmid pBC.PVYx3 obsahuje tri priame (tzv. hlava ku chvostu) repetície PVY sekvencii pochádzajúcich z pBC.PVY. Plazmid bol pripravený klonovaním Accl-Clal PVY fragmentu z pSP72.PVY do pBC.PVYx2 naštiepeného Accl a je znázornený na obr. 49.
Plazmid pBC.PVYx4
Plazmid pBC.PVYx4 obsahuje štyri priame (tzv. hlava k chvostu) repetície PVY sekvencii pochádzajúcich z pBC.PVY. Plazmid bol pripravený klonovaním Accl-Clal PVY fragmentu z pSP72.PVY do pBC.PVYx2 naštiepeného Accl a je znázornený na obr. 50.
Plazmid pBC.PVY.LNYV
Všetky pokusy vytvoriť priame palindrómy sekvencii PVY zlyhali, pravdepodobne preto, že takéto usporiadanie sekvencii je nestabilné vo všeobecne používanom hostiteľovi na klonovanie, a síce E. coli. Prerušené palindrómy sa však ukázali ako stabilné.
Na vytvorenie prerušených palindrómov PVY sekvencii bol „vložený,, fragment veľkosti 360 bp vložený do ClapBV.PVY do polohy „downstream,, od PVY sekvencie. „Vložený,, fragment bol pripravený nasledujúcim spôsobom:
Kloň získaný pôvodne z cDNA knižnice pripravenej z genómovej RNA vírusu žltej nekrózy šalátu (LNYV) (Deitzgen a kol., 1989), obsahujúci gén 4b vírusu, bol amplifikovaný PCR použitím nasledujúcich oligonukleotidových primérov:
31543/H • ·· ·· · ·· ···· ···· · · · ··· · · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ···
LNYV 1; 5'-ATGGGATCCGTTATGCCAAGAAGAAGGA-3'; a
LNYV 2: 5'-TGTGGATCCCTAACGGACCCGATG-3'
Prvých 9 nukleotidov kóduje miesto BamHI, zostávajúce nukleotidy sú homológne so sekvenciou génu LNYV 4b.
Po amplifikácii bol vzniknutý fragment klonovaný do EcoRI miesta plazmidu pCR2.1 (Stratagene). Tento EcoRI fragment bol klonovaný do EcoRI miesta ClapBC.PVY, čím bol vytvorený medziprodukt pBC.PVY.LNYV, ktorý je znázornený na obr. 51.
Plazmid pBC.PVY.LNYV.PVY
Plazmid pBC.PVY.LNYV.PVY obsahuje prerušenú priamu repetíciu PVY sekvencii. Na prípravu tohto plazmidu bol Hpal-Hincll fragment zpSP72 klonovaný do pBC.PVY.LNYV naštiepeného Smal a plazmid obsahujúci konštrukt v sense orientácii, znázornený na obr. 52., bol izolovaný.
Plazmid pBC.PVY.LNYV.YVPA
Plazmid pBC.PVY.LNYV.PVYA obsahuje čiastočne prerušený palindróm PVY sekvencii. Jedno rameno palindrómu obsahuje všetky PVY sekvencie zpBC.PVY, druhé rameno obsahuje časť sekvencie PVY, zodpovedajúce úseku medzi reštrikčnými miestami EcoRV a Hincll v pSP72.PVY. Na prípravu tohto plazmidu bol EcoRV-Hincll fragment zpSP72 klonovaný do pBC.PVY.LNYV naštiepeného Smal a plazmid obsahujúci konštrukt v požadovanej orientácii bol izolovaný. Mapa tohto konštruktu je znázornená na obr. 53.
Plazmid pBC.PVY.LNYV.YVP
Plazmid pBC.PVY.LNYV.PVY obsahuje prerušený palindróm PVY sekvencii. Na prípravu tohto plazmidu bol Hpal-Hincll fragment zpSP72
31543/H • · · · · • ··· · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· klonovaný do pBC.PVY.LNYV naštiepeného Smal a plazmid obsahujúci konštrukt vanti-sense orientácii bol izolovaný. Mapa tohto konštruktu je znázornená na obr. 54.
Kontrolné plazmidy
Plazmidy pARTľ.PVY a pART27.PVY
Plazmid pARTľ.PVY (obr. 55) bol pripravený pre expresiu PVY sekvenciami riadenými promótorom 35S. Plazmid slúžil v experimentoch ako kontrolný konštrukt, voči ktorému boli porovnávané všetky ostatné konštrukty.
Na vytvorenie tohto plazmidu bol Clal-Accl fragment z ClapBC.PVY klonovaný do pARTľ naštiepeného Clal a bol selektovaný plazmid s očakávanou expresiou PVY sekvencie v sense orientácii. Sekvencia pozostávajúca z promótora 35S, sekvencia PVY a terminátora OCS boli vyštiepené ako Notl fragment a klonované do pART27 naštiepeného Notl, bol selektovaný plazmid s požadovanou orientáciou inzertu a pomenovaný pART27.PVY.
Plazmidy pART7.35S.PVY.SCBV.O a pART27.35S.PVY.SCBV.O
Plazmid pART7.35S.PVY.SCBV.O (obr. 56) bol pripravený ako kontrolný konštrukt pre súčasnú expresiu viacpočetných konštruktov z jediného plazmidu v transgénnych rastlinách. Promótorom 35S bol určený na expresiu PVY sekvencii v sense orientácii, zatiaľ čo SCBV promótor zostal nevyužitý. Na vytvorenie tohto plazmidu PVY fragment z ClapBC.PVY klonovaný ako XholEcoRI fragment do pART7.35S.SCBV.cass naštiepeného Xhol a EcoRI, čím vznikol p35S.PVY.SCBV>0. Sekvencia tvorená promótorom 35S riadiacim PVY sekvencie, terminátor NOS, promótor SCBV a terminátor OCS boli vyštiepená ako Notl fragment a klonovaná do pART27. Plazmid s požadovanou orientáciou inzertu bol selektovaný a pomenovaný pART27.35S.PVY.SCBV.O.
31543/H ·· ·♦ · ·· • · · ·· · · · • ··· ··· · · · · · • ···· ··· ··· ·· ·· ··· ·· ···
Plazmidy pART7.35S.O.SCBV.PVY a pART27.35S.O.SCBV.PVY
Plazmid pART7.35S.O.SCBV.PVY (obr. 57) bol pripravený ako dodatočný kontrolný konštrukt pre súčasnú expresiu viacpočetných konštruktov z jediného plazmidu v transgénnych rastlinách. Za promótorom 35S nebola klonovaná žiadna exprimovateľná sekvencia, zatiaľ čo SCBV promótor riadil expresiu PVY so v sense orientácii. Na prípravu tohto plazmidu PVY fragment zClapBC.PVY klonovaný ako Clal fragment do pART7.35S.SCBV.cass naštiepeného Clal, bol izolovaný plazmid obsahujúci PVY sekvenciu v sense orientácii a pomenovaný p35S.O.SCBV.PVY. Sekvencia, tvorená promótorom 35S a terminátorom NOS, bola vyštiepená ako Notl fragment a klonovaná do pART27. Plazmid s požadovanou orientáciou inzertu bol selektovaný a pomenovaný pART27.35S.O.SCBV.PVY.
Plazmidy pART7.35S.O.SCBV.YVP a pART27.35S.O.SCBV.YVP
Plazmid pART7.35S.O.SCBV.YVP (obr. 58) bol pripravený ako dodatočný kontrolný konštrukt pre súčasnú expresiu viacpočetných konštruktov z jediného plazmidu v transgénnych rastlinách. Za promótorom 35S nebola klonovaná žiadna exprimovateľná sekvencia, zatiaľ čo SCBV promótor riadil expresiu PVY sekvencie v anti-sense orientácii. Na prípravu tohto plazmidu PVY fragment z ClapBC.PVY klonovaný ako Clal fragment do p35S.SCBV.cass naštiepeného Clal, bol izolovaný plazmid obsahujúci PVY sekvenciu v antisense orientácii a pomenovaný p35S.O.SCBV.YVP. Sekvencia, tvorená promótorom 35S a terminátorom NOS, promótorom SCBV riadiacom sense PVY sekvencie a terminátorom OCS, bola vyštiepená ako Notl fragment a klonovaná do pART27. Plazmid s požadovanou orientáciou inzertu bol selektovaný a pomenovaný pART27.35S.O.SCBV.YVP.
3. Testovacie plazmidy
Plazmidy pART7.PVYx2 a pART27.PVYx2
31543/H
Plazmid pART7.PVYx2 (obr. 59) bol pripravený pre expresiu priamej repetície PVY sekvencií riadených promótorom 35S v transgénnych rastlinách. Na prípravu tohto plazmidu bola priama repetícia z pBC.PVYx2 klonovaná ako Xhol-BamHI fragment do pART7 naštiepeného Xhol/BamHl. Sekvencia zložená z promótora 35S, priamych repetícií sekvencií PVY a terminátora OCS bola vyštiepená ako Nôti fragment zpART7.PVYx2 a klonovaná do pART27 naštiepeného Nôti naštiepeného Notl, bol selektovaný plazmid s požadovanou orientáciou inzertu a pomenovaný pART27.PVYx2.
Plazmidy pART7.PVYx3 a pART27.PVYx3
Plazmid pART7.PVYx3 (obr. 60) bol pripravený pre expresiu priamej repetície troch PVY sekvencií riadenú promótorom 35S v transgénnych rastlinách. Na prípravu tohto plazmidu bola priama repetícia zpBC.PVYx3 klonovaná ako Xhol-BamHI fragment do pART7 naštiepeného Xhol/BamHl. Sekvencia zložená s promótora 35S, priamych repetícií sekvencií PVY a terminátora OCS bola vyštiepená ako Notl fragment zpART7.PVYx3 a klonovaná do pART27 naštiepeného Notl, bol selektovaný plazmid s požadovanou orientáciou inzertu a pomenovaný pART27.PVYx3.
Plazmidy pART7.PVYx4 a pART27.PVYx4
Plazmid pART7.PVYx4 (obr. 61) bol pripravený do expresie priamej repetície štyroch PVY sekvencií riadenou promótorom 35S v transgénnych rastlinách. Na prípravu tohto plazmidu bola priama repetícia zpBC.PVYx4 klonovaná ako Xhol-BamHI fragment do pART7 naštiepeného Xhol/BamHl. Sekvencia zložená z promótora 35S, priamych repetícií sekvencií PVY a terminátora OCS bola vyštiepená ako Notl fragment zpART7.PVYx4 a klonovaná do pART27 naštiepeného Notl, bol selektovaný plazmid s požadovanou orientáciou inzertu a pomenovaný pART27.PVYx4.
Plazmidy pART7.PVY.LNYV.PVY a pART27.PVY.LNYV.PVY
31543/H ··· · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ··
Plazmid pART7.PVY.LNYV.PVY (obr. 62) bol pripravený pre expresiu prerušenej priamej repetície PVY sekvencií riadenou promótorom 35S v transgénnych rastlinách. Tento konštrukt bol pripravený klonovaním prerušenej priamej repetície PVY sekvencií z pBC.PVY.LNYV.PVY ako HholXbal fragment do pART27 naštiepeného Hhol/Xbal. Sekvencia zložená z promótora 35S, prerušenej priamej repetície sekvencií PVY a terminátora OCS bola vyštiepená ako Notl fragment z pART7.PVY.LNYV.PVY a klonovaná do pART27 naštiepeného Notl, bol selektovaný plazmid s požadovanou orientáciou inzertu a pomenovaný pART27.PVY.LNYV.PVY.
Plazmidy pART7.PVY.LNYV.YVPA a pART27.PVY.LNYV.YVPA
Plazmid pART7.PVY.LNYV.PVYA (obr. 63) bol pripravený pre expresiu čiastočne prerušeného palindrómu PVY sekvencií riadenou promótorom 35S v transgénnych rastlinách. Tento konštrukt bol pripravený klonovaním čiastočného prerušeného palindrómu PVY sekvencií z pBC.PVY.LNYV.PVYA ako Hhol-Xbal fragment do pART27 naštiepeného Hhol/Xbal. Sekvencia zložená s promótora 35S, čiastočného prerušeného palindrómu sekvencií PVY a terminátora OCS bola vyštiepená ako Notl fragment z pART7.PVY.LNYV.PVYA a bola klonovaná do pART27 naštiepeného Notl, potom bol selektovaný plazmid s požadovanou orientáciou inzertu a pomenovaný pART27.PVY.LNYV.YVPA.
Plazmidy pART7.PVY.LNYV.YVP a pART27.PVY.LNYV.YVP
Plazmid pART7.PVY.LNYV.YVP (obr. 64) bol pripravený pre expresiu prerušeného palindrómu PVY sekvencií riadenou promótorom 35S v transgénnych rastlinách. Tento konštrukt bol pripravený klonovaním prerušeného palindrómu PVY sekvencií z pBC.PVY.LNYV.YVPA ako Xhol-Xbal fragment do pART27 naštiepeného Xhol/Xbal. Sekvencia zložená z promótora 35S, čiastočného prerušeného palindrómu sekvencií PVY a terminátora OCS bola vyštiepená ako Notl fragment z pART7.PVY.LNYV.YVP a bola klonovaná
31543/H ··· · · « • ·· ·· do pART27 naštiepeného Notl, potom bol selektovaný plazmid s požadovanou orientáciou inzertu a pomenovaný pART27.PVY.LNW.YVP.
Plazmidy pART7.35S.PVY.SCBV.WP a pART27.35S.PVY.SCBV.WP
Plazmid pART7.35S.PVY.SCBV.WP (obr. 65) bol pripravený pre súčasnú expresiu sense a anti-sense konštruktov v transgénnych rastlinách. Na prípravu tohto plazmidu bol PVY fragment z ClapBC.PVY klonovaný ako XholEcoRI fragment do p35S.SCBV.O.SCBV.WP naštiepeného Xhol/EcoRI. Sekvencia, tvorená promótorom 35S riadiacim sense PVY sekvencie a terminátorom OCS bola vyštiepená ako Notl fragment a klonovaná do pART27. Plazmid s požadovanou orientáciou inzertu bol izolovaný a pomenovaný pART27.35S.PVY.SCBV.WP.
Plazmidy pART7.35S.PVYx3.SCBV.WPx3 a pART27.35S.PVYx3.SCBV.WPx3
Plazmid pART7.35S.PVYx3.SCBV.WPx3 (obr. 66) bol pripravený pre súčasnú expresiu sense a anti-sense repetície PVY sekvencií v transgénnych rastlinách. Na prípravu tohto plazmidu bol najskôr pripravený medziprodukt pART7.35S.O.SCBV.WPx3 tak, že WPx3 fragment z ClapBC.PVYx3 bol klonovaný ako Clal-Accl fragment do p35S.PVYx3.SCBV.cass naštiepeného Clal a bol izolovaný plazmid s anti-sense orientáciou. Na prípravu p35S.PVYx3.SCBV.WPx3 bola trojitá priama repetícia PVY z ClapBC.PVYx3 klonovaná ako Kpnl-Smal fragment do p35S.O.SCBV.WPx3, čím bol vytvorený p35S.PVYx3.SCBV.WPx3. Sekvencia tvorená obidvoma promótormi, priamou repetíciou PVY a terminátormi bola vyštiepená ako Notl fragment a klonovaná do pART27. Plazmid s požadovanou orientáciou bol izolovaný a pomenovaný pART27.35S.PVYx3.SCBV.
Plazmidy pART7.PVYx3.LNW.WPx3 a pART27.PVYx3.LNW.WPx3
31543/H ··· · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ·
Plazmid pART7.PVYx3.LNYV.YVPx3 (obr. 67) bol pripravený pre expresiu trojitej repetície PVY sekvencií ako prerušeného palindrómu. Pre konštrukciu tohto plazmidu bol pripravený najskôr medziprodukt pART7.PVYx3.LNYV.YVP klonovaním Accl-Clal fragmentu PVY.LNYV.YVP z pBC.PVY.LNYV.YVP do plazmidu pART7.PVYx2. Plazmid pART7.PVYx3.LNYV.YVPx3 bol pripravený klonovaním ďalšej priamej repetície PVY z pBC.PVYx2 ako Accl-Clal fragmentu do pART7.PVYx3.LNYV.YVP naštiepeného Clal. Sekvencia z pART7.35S.PVYx3.LNYV.YVPx3, obsahujúca 35S promótor, všetky PVY sekvencie a terminátor OCS, bola vyštiepená ako Notl fragment a bola klonovaná do pART27 naštiepeného Nôti, potom bol selektovaný plazmid s požadovanou orientáciou inzertu a pomenovaný pART27.35S.PVYx3.LNYV.
Plazmidy pART7.PVYmulti a pART27.PVYmulti
Plazmid pART7.PVYmulti (obr. 68) bol pripravený pre expresiu priamych repetícií vyššieho rádu úsekov PVY sekvencií v transgénnych rastlinách. Priame repetície vyššieho rádu úseku Nia PVY veľkosti 72 bp boli pripravené spojením dvoch čiastočne komplementárnych oligonukleotidov nasledujúcich sekvencií:
PVY1:
5'-TAATGAGGATGATGTCCCTACCTTTAATTGGCAGAAATTTCTGTGGAAA GACAGGGAAATCTTTCGGCATTT-3'; a
PVY2:
5'-TTCTGCCAATTAAAGGTAGGGACATCATCCTCATTAAAATGCCGAAAGA TTTCCCTGTCTTTCCACAGAAAT-3'
Tieto oligonukleotidy boli fosforylované T4 polynukleotidylkinázou, zahriate a ponechané pomaly chladnúť, aby došlo k samovoľnému napojeniu (ammealing), potom boli ligované T4 DNA ligázou, konce boli doplnené Klenowovým fragmentom DNA polymerázy a celý fragment bol klonovaný do pCR2.1 (Invitrogen). Plazmidy obsahujúce viacpočetné repetície boli izolované
31543/H • · · a sekvencie boli klonované ako EcoRI fragmenty v sense orientácii do pART7 naštiepeného EcoRI, čím bol vytvorený medziprodukt pARTľ.PVYmulti. Na prípravu pART27multi bola sekvencia obsahujúca 35S promótor, PVY sekvencia a terminátor OCS vyštiepená ako Notl fragment a bola klonovaná do pART27 naštiepeného Notl. Plazmid s požadovanou orientáciou inzertu potom bol izolovaný a pomenovaný pART27.PVYmulti.
Príklad 6
Inaktivácia expresie vírusových génov u cicavcov
Bunkové línie odolné voči vírusom boli pripravené tak, že vírusové sekvencie boli exprimované v bunkách stabilne transformovaných línií.
V tomto prípade boli použité zvlášť lytické vírusy, lebo lýza poskytuje možnosť jednoduchého skríningu a tiež ponúka možnosť priamej selekcie na potenciálne veľmi vzácnu udalosť, ktorou môže vzniknúť imunita voči vírusu. Subgenómové fragmenty odvodené z vírusu (bovinný enterovírus, BEV) s jednovláknovým RNA genómom alebo komplexného vírusu (Herpes simplex I, HSV I) s dvojreťazcovou DNA boli klonované do vhodného vektora a exprimované v transformovaných bunkách. Cicavčie bunkové línie boli transformované génovými konštruktmi, ktoré boli pripravené na expresiu vírusových sekvencií riadenú silným promótorom cytomegalovírusu (CMV-IE). Použité sekvencie zahrňovali gén vírusovej špecifickej replikázy. Tiež náhodné knižnice pripravené tzv. „shotgun,, metódou obsahujúcou reprezentatívne vírusové sekvencie môžu byť tiež použité ako vnesená molekula rozptýlenej molekulovej kyseliny pre zacielenie na expresiu vírusových sekvencii.
K príkladom génových konštruktov použitých v tomto pokuse patrí nukleotidová sekvencia odvodená z génu RNA-dependentnej RNA polymerázy vírusu BEV, ktoré sú tu uvedené formou príkladu.
Pre konštrukty vírusovej polymerázy bolo pripravené veľké množstvo transformovaných bunkových línií (asi 100) a boli infikované príslušným vírusom. Pre bunky transformované pomocou „shotgun,, knižnice bolo
31543/H • · ·· · · ·· • · · • · · · · • · · · ··· ·· ··· • ·· ·· ·· · · · · • · · · · • ··· · · · • · · · ··· ·· ·· pripravené zvlášť veľké množstvo (stovky) transformovaných línií a boli ako celok podrobené skríningu na vírusovú imunitu. Po provokačnej infekcii vírusom boli selektované k vírusu rezistentné línie a boli ďalej analyzované, aby sa určili sekvencie určujúce imunitu.
Rezistentné bunkové línie podporujú skutočnosť, že vnesené nukleotidové sekvencie sú schopné inaktivovať expresiu vírusových génov v cicavčom systéme.
Okrem toho rezistentné línie získané v tomto pokuse boli použité na podrobnejšie určenie molekulárnych a biochemických charakteristík modulácie, ktorá bola v pokuse pozorovaná.
Príklad 8
Indukcia rezistencie voči vírusom u rastlín
Kmeň LBA4404 Agrobacterium tumefaciens bol v nezávislých pokusoch transformovaný nasledujúcimi konštruktmi:
PART27.PVY, pART27.PVYx2, pART27.PVYx3, pART27.PVYx4, pART27.PVY. LNYV. PVY, pART27. PVY. LNYV.YVPA, pART27.PVY.LNYV.YVP, pART27.35S.PVY.SCBV.O, pART27.35S.O.SCBV.PVY, pART27.35S.O.SCBV.YVP, pART27.35S.PVY.SCBV.YVP, pART27.35S.PVYx3.SCBV.YVPx3, pART27.PVYx3.LNYV.YVPx3 a pART27.PVYx10, a síce metódou triparentálnej konjugácie. Z týchto kmeňov bola minipreparáciou pripravená DNA a reštrikciou enzýmom Notl bolo overené, že obsahujú zodpovedajúce binárne vektory.
Rastliny tabaku Nicotiana tabaccum (kultivar W38) boli transformované vyššie uvedenými kmeňmi Agrobacterium tumefaciens štandardným postupom transformácie. Výhonky z pravdepodobných transformantov boli odrezané a zakorenené v médiu obsahujúcom kanamycín. Bolo pozorované, že len transformované výhonky zakoreňovali v médiu s kanamycínom. Zakorenené
31543/H • ·· • · · · · ·· ··· ·· · rastlinky boli prenesené do pôdy a aklimatizované. Po dvoch až troch týždňoch boli vybrané dobre rastúce silné rastliny, ktoré mali aspoň tri sady listov a boli infikované PVY.
Vírusové inokulum bolo pripravené z rastlín tabaku W38 predtým infikovaných vírusom, ktoré prejavovali zreteľné symptómy vírusovej infekcie: Asi 2 g listového materiálu boli rozdrvené karborundom v 10 mi 100 mM Nafosfátového pufra (pH 7,5). Inokulum potom bolo nariedené do 200 ml ďalším Na-fosfátovým pufrom. Dva listy každej transgénnej rastliny boli poprášené karborundovým práškom, potom sa na každý list nanieslo 0,4 ml inokula a votrené do listu silným stlačením prstov. Použitím tohto postupu bolo 100 % kontrolných netransgénnych rastlín infikovaných vírusom PVY.
Na testovanie transgénnych rastlín na vírusovú rezistenciu a imunitu boli rastliny sledované z hľadiska rozvoja symptómov. U použitého kmeňa PVY (PVCY-D, Austrálsky izolát PVY) sú na tabaku W38 zreteľné symptómy, vyjasnenie žilnatiny, sú ihneď pozorovateľné na dvoch listoch nad inokulovanými listami, a u ďalších listov sa prejavujú chlorotické lézie. Rozvoj symptómov bol pozorovaný počas šiestich týždňov.
Transgénne línie boli uznané za rezistentné, keď sa u nich prejavovali redukované symptómy, teda menší počet listov s chlorotickými léziami. Rezistencia sa prejavovala od veľmi silnej rezistencie, keď sa dalo pozorovať len niekoľko málo lézii, až po slabú rezistenciu, ktorá sa prejavovala redukovanými symptómami, ktoré sa prejavili na listoch, ktoré sa vyvinuli v neskorších fázach rastu.
Transgénne rastliny, ktoré neprejavovali vôbec žiadne príznaky, boli hodnotené ako imúnne. Na overenie imunity boli tieto rastliny znovu inokulované vírusom, pričom väčšina rastlín zostala imúnna a niekoľko rastlín, u ktorých sa prejavili symptómy, bolo hodnotenie ako rezistentné.
Na vytvorenie línie rastlín boli vykonané Southernove hybridizácie a bola sledovaná rezistencia v nasledujúcej generácii, aby sa overilo, či sa rezistencia/imunita prenáša. Okrem toho šírenie vírusovej rezistencie bolo
31543/H
• ·· • · · ·· • · • ·· ·· • · ··
• ··· · • · • • · ·
• · • · • • ·
·· ·· ·· ··· ·· ··
monitorované provokačnou infekčnou líniou iným kmeňom PVY, aby sa zistilo, či nedošlo k modifikácii rozsahu vnímavosti hostiteľa.
Výsledky z týchto pokusov sú zhrnuté v tabuľke 2. Tieto údaje ukazujú, že konštrukty obsahujúce tandemové repetície cieľovej génovej sekvencie, či už v konfigurácii ako palindrómy, prerušené palindrómy alebo priame repetície, poskytujú transgénnym rastlinám vírusovú rezistenciu a/alebo imunitu.
Teda takéto invertované a/alebo priame repetície modulujú expresiu vírusových cieľových génov v transgénnych rastlinách. Konštrukty kombinujúce použitie priamej a invertovanej repetície, zvlášť pART27.35S.PVYx3.SCBV.WPx3 a pART27.PVYx3.LNYV.WPx3 boli užitočné pri modulácii génovej expresie.
Príklad 9
Inaktivácia génu Galt v živočíšnych bunkách
Na otestovanie inaktivácie Galt boli prasačie bunky PK2 transformované zodpovedajúcimi konštruktmi. Bunky PK2 konštitutívne exprimujú enzým Galt, ktorého aktivita vedie k adícii rôznych a-1,3-galaktozylových skupín na rad proteínov exprimovaných na povrchu týchto buniek. Bunky boli transformované použitím prípravku Lipofectin a stabilne transformované línie boli selektované pomocou genetecínu.
V začiatkoch testu boli bunkové línie skúmané na prítomnosť Galt epitopu, t. zn. a-1,3-galaktozylových skupín na proteínoch bunkového povrchu, použitím lektínu IB4. Väzba IB4 bola sledovaná či už in situ alebo pomocou triedenia buniek prietokovou cytometriou, FACS.
Pre väzbu in situ boli bunky fixované k pevnej podložke chladným metanolom 5 minút, potom boli opláchnuté PBS (soľný roztok pufrovaný fosfátom) a nešpecifická väzba IB4 bola blokovaná 1 % BSA v PBS 10 minút.
31543/H
• ··
Fixované bunky boli testované s 20 pg/ml konfugáta IB4-biotín (Sigma) v 1 % BSA v PBS, 30 minút pri teplote miestnosti, bunky boli opláchnuté PBS a potom testované s Extravidin-FITC (Sigma) v riedení 1:200 v PBS 30 minút a potom opäť opláchnuté PBS. Bunky potom boli vyšetrené fluorescenčným mikroskopom, pričom za týchto podmienok bol vonkajší povrch kontrolných buniek PK2 uniformovo zeleno sfarbený.
Pre analýzu FACS boli bunky na ošetrenie resuspendované s trypsínom, opláchnuté v roztoku HBSS/Hepes (Hanksov pufrovaný roztok s 20 mM Hepes, pH 7,4) a potom inkubované s 10 pg/ml konjugátu IB4-biotín (Sigma) v HBSS/Hepes 45 minút pri 4 °C. Potom boli bunky opláchnuté HBSS/Hepes a inkubované Extravidin-FITC (Sigma) v riedení 1:200 HBSS/Hepes 45 minút pri teplote 4 °C a bunky boli opláchnuté HBSS/Hepes pred FACS analýzou.
Týmto postupom boli transformované bunkové línie otestované na aktiváciu Galt a kvantitatívne bola vyhodnotená účinnosť použitých konštruktov. Navyše bunkové línie, ktoré prejavovali inaktiváciu Galt, boli izolované a podrobnejšie ďalej analyzované ku stanoveniu molekulárneho mechanizmu génovej inaktivácie.
31543/H • t • · ·
31543/H
Tabuľka 2
Percento rastlín vykazujúcich špecifický fenotyp Rezistentné CN O) 1^- •n- co co o
Imúnne - m r^- o o o CO CN o -
Vnímavé CO m CN m CO 00 CO CO CO r-
Počet rastlín v teste σ> co CN CN 25 22 CO T“ 26 20 OO
Plazmidový konštrukt pART27.PVY pART27.PVYx2 pART27.PVYx3 pART27.PVYx4 pART27.35S.PVY.SCBC.O pART27.35S.O.SCBV.PVY pART27.35S.O.SCBV.YVP pART27.35S. PVY. SCBV. YVP pART27. PVY. LN YV. PVY pART27.PVY.LNYV.YVP pART27. PVY. LNYV.YVPA
• · ···
Zoznam sekvencii (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 38 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 1:
CGGCAGATCT AACAATGGCA GGACAAATCG AGTACATC 38 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 31 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 2:
CCCGGGATCC TCGAAAGAAT CGTACCACTT C 31
31543/H • · · ·· • · • · • · • · ·· ··· (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 29 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 3:
GGGCGGATCC TTAGAAAGAA TCGTACCAC 29 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 28 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 4:
CGGCAGATCT GGACAAATCG AGTACATC 28 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 5:
31543/H (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 26 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 5:
AGATCTGTAA ACGGCCACAA GTTCAG 26 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 26 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 6:
GGATCCTTGT ACAGCTCGTC CATGCC 26 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
31543/H ·· ·· • · · · • · · · • · · · · · • · · • ·· ··
··· (A) DĹŽKA: 74 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 7:
• GTCGACAATA TTGGTTTTTT
AAATATCTTT
GTGTGATTTT
ATTTTCATTA CATCTGTGTG TGCAAAAGCC TAGG 60 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina b
(C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 8:
GTCGACGTTT AGAGCAGAAG TAACACTTCC G 31 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 30 párov báz
31543/H ·· • · · • · • · • · ·· · (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝ ČÍSLOM 9:
CCCGGGGCTT AGTGTAAAAC AGGCTGAGAG 30 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 31 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna b
(ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 10:
CCCGGGCAAA TCCCAGTCAT TTCTTAGAAA C 31 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 38 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché
31543/H ··· • · *
• ·· (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 11:
CGGCAGATCT AACAATGGCA GGACAAATCG AGTACATC 38 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 31 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 12:
CCCGGGATCC TCGAAAGAAT CGTACCACTT C 31 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 29 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna
31543/H
• ·· • · · • · • · • ·· • e • · ··
• · · • · • • ·
• ··· • · · • • · ·
• · • · • • ·
·· ·· ·· ··· ·· • ·
(ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 13:
GGGCGGATCC TTAGAAAGAA TCGTACCAC 29 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 14:
• (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DÍŽKA: 28 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 14:
CGGCAGATCT GGACAAATCG AGTACATC 28 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA
31543/H ·· • · • · ··· ·· • · • · • · • · ·· • ·· ·· · · • · · • · · · • · · ··· ·· ··· (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 15:
CCCGGGGCTT AGTGTAAAAC AGGCTGAGAG 30 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 31 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 16:
CCCGGGCAAA TCCCAGTCAT TTCTTAGAAA C 31
31543/H
Citovaná literatúra
1. An et al. (1985) EMBO J 4:277-284.
2. Armstrong, et al. Plánt Celí Reports 9: 335-339,1990
3. Ausubel, F.M.et al. (1987) In: Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (ISBN 047140338)..
4. Chalfie, M. et al (1994) Science 263: 802-805.
5. Christensen, A.H. and Quail, P.H. (1996) Transgenic Research 5: 213-218.
6. Christou, P., et al. Plánt Physiol 87: 671-674, 1988.
7. Cormack, B. et al (1996) Gene 173: 33-38.
8. Crossway et al., Mol. Gen. Genet. 202: 179-185, 1986.
9. Dorer, D.R., and Henikoff, S. (1994) Celí 7: 993-1002.
10. Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 5824-5828, 1985.
11. Gleave, A.P. (1992) Plánt Molecular Biology 20:1203-1207.
12. Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166: 557-560.
13. Herrera-Estella et al., Náture 303: 209-213,1983a.
14. Herrera-Estella et al., EMBO J. 2: 987-995, 1983b.
15. Herrera-Estella et al., In: Plánt Genetic Engineering, Cambridge University Press, N.Y., pp 63-93, 1985.
16. Inouye, S. and Tsuji, F.l. (1994) FEBS Letts. 341: 277-280.
17. Jackson, I.J. (1995) Ann. Rev. Genet. 28: 189-217.
18. Krens, F.A., et al., Náture 296: 72-74, 1982.
19. Kwon, B.S. et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 153: 1301-1309.
20. Pal-Bhadra, M. et al. (1997) Celí 90: 479-490.
21. Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722, 1984.
22. Prasher, D.C. et al. (1992) Gene 111: 229-233.
23. Sanford, J.C. et al., Particulate Science and Technology 5: 27-37, 1987.

Claims (43)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob represie, oneskorenia alebo inej redukcie expresie cieľového génu v živočíšnej bunke, tkanive alebo orgáne, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky, keď sa do živočíšnej bunky, tkaniva alebo orgánu vnesie jedna alebo viac molekúl rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujúcej tandemové kópie nukleotidovej sekvencie, ktorá je v podstate identická s nukleotidovou sekvenciou cieľového génu alebo jeho úseku alebo komplementárnou sekvenciou, a to na takú dobu a za takých podmienok, ktoré sú dostatočné na modifikáciu translácie mRNA produktu cieľového génu, a síce s výhradou, že nie je výlučne potlačená alebo redukovaná transkripcia mRNA produktu.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujú invertované repetície sekvencie cieľového génu alebo jeho úseku alebo sekvencie komplementárne.
  3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujú priame repetície sekvencie cieľového génu alebo jeho úseku alebo sekvencie komplementárne.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujú ako priame tak i invertované repetície sekvencie cieľového génu alebo jeho úseku alebo sekvencie komplementárne.
  5. 5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že počet kópií sekvencie cieľového génu alebo jeho úsek alebo sekvencia k nej komplementárna v molekule rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny sa rovná dvom.
  6. 6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že počet kópií sekvencie cieľového génu alebo jeho úsek alebo sekvencia k nej komplementárna v molekule rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny sa
    31543/H • 9
    999 9 ·
    9 ··
    9 ·
    9 ·
    999 99 náhrädnä Strana' rovná trom.
  7. 7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že počet kópií sekvencie cieľového génu alebo jeho úsek alebo sekvencia k nej komplementárna v molekule rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny sa rovná štyrom.
  8. 8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že počet kópií sekvencie cieľového génu alebo jeho úsek alebo sekvencia k nej komplementárna v molekule rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny sa rovná šiestim.
  9. 9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že počet kópií sekvencie cieľového génu alebo jeho úsek alebo sekvencia k nej komplementárna v molekule rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny sa rovná desiatim.
  10. 10. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že molekula rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahuje tandemové repetície sekvencie cieľového génu, pričom jedna alebo viac z opakovaných jednotiek v tandemovej repetícii je oddelená od druhej jednotky vloženým fragmentom nukleovej kyseliny.
  11. 11. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že živočích je myš.
  12. 12. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, vyznačujúci sa tým, že cieľový gén je gén, ktorý je obsiahnutý v genóme živočíšnej bunky, tkanive alebo orgáne.
  13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že cieľový gén je a1,3-galaktozyltransferáza.
  14. 14. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že cieľový gén pochádza z genómu patogénu živočíšnej bunky, tkaniva alebo orgánu alebo organizmu obsahujúceho tieto bunky, tkanivá alebo orgány.
  15. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že patogén je vírus.
  16. 16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že vírus je BEV.
    31543/H ·· - a * * ϊ ϊ • · i Ϊ •*J * Ϊ ·
    .............. s •: :
    ·· rana
  17. 17. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje krok, keď sa vyberie molekula (alebo molekuly) rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny podľa jej schopnosti účinne modulovať expresiu cieľového génu.
  18. 18. Spôsob represie, oneskorenia alebo inej redukcie expresie cieľového génu v živočíšnej bunke, tkanive alebo orgáne, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky, keď:
    (I) vyberie sa jedna alebo viac molekúl rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujúcej tandemové repetície nukleotidovej sekvencie, ktorá je v podstate identická s nukleotidovou sekvenciou cieľového génu alebo jeho úseku alebo sekvenciou k nej komplementárnou, (II) pripraví sa syntetický gén obsahujúci molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny operatívne spojenej s promótorovou sekvenciou funkčnou v živočíšnej bunke, tkanive alebo orgáne, (III) syntetický gén sa vnesie do živočíšnej bunky, tkaniva alebo orgánu, a (IV) syntetický gén je exprimovaný v živočíšnej bunke, tkanive alebo orgáne po takú dobu a za takých podmienok, ktoré sú dostatočné na modifikáciu translácie mRNA produktu cieľového génu, a síce s výhradou, že nie je výlučne potlačená alebo redukovaná transkripcia mRNA produktu.
  19. 19. Spôsob prenesenia rezistencie alebo imunity k vírusovému patogénu do živočíšnej bunky, tkaniva, orgánu alebo celého organizmu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky, keď sa vnesie jedna alebo viac molekúl rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujúcej tandemové kópie nukleotidovej sekvencie, ktorá pochádza z vírusového patogénu alebo je k nej komplementárna, a to na takú dobu a za takých podmienok, ktoré sú dostatočné na to, aby translácia mRNA produktu vírusového génu bola oneskorená alebo inak redukovaná, a síce s výhradou, že nie je výlučne potlačená alebo redukovaná transkripcia mRNA produktu.
  20. 20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že vírus je
    31543/H ·· • · ·· náhra*dná*št*rana patogénom živočícha.
  21. 21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že vírus je BEV.
  22. 22. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 19 až 21, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje krok, keď sa vyberie molekula (alebo molekuly) rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny podľa jej schopnosti účinne preniesť rezistenciu alebo imunitu do živočíšnej bunky, tkaniva, orgánu alebo celého organizmu.
  23. 23. Spôsob vytvorenia rezistencie alebo imunity živočíšnej bunky, tkaniva, orgánu alebo celého organizmu k vírusovému patogénu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky:
    (I) vyberie sa jedna alebo viac molekúl rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujúcej tandemové repetície nukleotidovej sekvencie, ktorá pochádza z vírusového patogénu alebo je k nej komplementárna, (II) pripraví sa syntetický gén obsahujúci molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny operatívne spojenej s promótorovou sekvenciou funkčnou v živočíšnej bunke, tkanive, orgáne alebo organizme, t
    (III) syntetický gén sa vnesie do živočíšnej bunky, tkaniva, orgánu alebo organizmu, a (IV) syntetický gén je exprimovaný v živočíšnej bunke, tkanive alebo orgáne po takú dobu a za takých podmienok, ktoré sú dostatočne na modifikáciu translácie mRNA produktu cieľového génu, a síce s výhradou, že nie je výlučne potlačená alebo redukovaná transkripcia mRNA produktu.
  24. 24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 19 až 23, vyznačujúci sa tým, že molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujú tandemové kópie nukleotidovej sekvencie kódujúce vírusovú replikázu, polymerázu, obalový proteín alebo rozbaľovací gén.
  25. 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujú tandemové kópie sekvencie kódujúcej vírusovú polymerázu.
    31543/H • · ··· ·
    8ď náhrädná Strana
  26. 26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že molekuly rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujú tandemové kópie sekvencie kódujúcej vírusový obalový protein.
  27. 27. Syntetický gén na použitie v spôsobe podľa nároku 1 na represiu, oneskorenie alebo inú redukciu expresie cieľového génu v živočíšnej bunke, tkanive, orgáne alebo celom organizme, pričom syntetický gén obsahuje molekulu rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujúcej tandemové kópie nukleotidovej sekvencie, ktorá je v podstate identická s nukleotidovou sekvenciou cieľového génu alebo jeho úseku alebo komplementárnou sekvenciou, umiestnenou pod kontrolu promótorovej sekvencie, ktorá je funkčná v živočíšnej bunke, tkanive, orgáne alebo celom organizme.
  28. 28. Syntetický gén podľa nároku 27, kde molekula rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahujúca tandemové invertované a/alebo priame repetície génovej sekvencie, ktorá je endogénna vzhľadom ku genómu živočíšnej bunky, tkaniva, orgánu alebo celého organizmu alebo ktorá pochádza z iného ako endogénneho génu.
  29. 29. Syntetický gén podľa nároku 28, kde iný ako endogénny gén pochádza z vírusového patogénu živočíšnej bunky, tkaniva, orgánu alebo celého organizmu.
  30. 30. Syntetický gén podľa nároku 28, kde iný ako endogénny gén pochádza zo živočíšneho vírusu.
  31. 31. Syntetický gén podľa nároku 30, kde živočíšny vírus je BEV.
  32. 32. Syntetický gén podľa nároku 30, kde iný ako endogénny gén pochádza z génu polymerázy BEV.
  33. 33. Syntetický gén podľa nároku 32, kde promótor je CMV-IE alebo SV40 promótor.
  34. 34. Syntetický gén podľa nároku 27 alebo 28, kde molekula rozptýlenej alebo cudzorodej nukleovej kyseliny obsahuje tandemové invertované a/alebo
    31543/H • · · • ·· · ·
    8€ náhradná slnana priame repetície prasačieho génu a-1,3-galaktozyltransferázy.
  35. 35. Syntetický gén podľa nároku 24, kde prasačí gén a-1,3galaktozyltransferázy je operatívne spojený so sekvenciou CMV promótora.
  36. 36. Syntetický gén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 35, kde tandemové kópie nukleotidovej sekvencie cieľového génu sú operatívne spojené s dvoma alebo viacerými promótorovými sekvenciami.
  37. 37. Syntetický gén podľa nároku 36, kde tandemové kópie nukleotidovej sekvencie cieľového génu sú operatívne spojené s promótorovými sekvenciami priestorovo oddelenými.
  38. 38. Génový konštrukt, ktorý obsahuje syntetický gén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 37.
  39. 39. Génový konštrukt podľa nároku 38 vybraný zo skupiny obsahujúcej plazmidy pCMV.BEVx2, pCMV.BEV.GFP.VEB, pCMV.BEV.SV40L.BEV a pCMV.BEV.SV40L.VEB.
  40. 40. Génový konštrukt podľa nároku 38 vybraný zo skupiny obsahujúcej plazmidy pCMV.Galtx2 a pCMV.Galtx4.
  41. 41. Použitie génového konštruktu podľa nároku 39 na vytvorenie imunity alebo rezistencie živočíšnej bunky, tkaniva, orgánu alebo celého organizmu proti BEV.
  42. 42. Použitie génového konštruktu podľa nároku 40 na oneskorenie, represiu alebo inú redukciu expresie a-1,3-galaktozyltransferázy v živočíšnej bunke, tkanive, orgáne alebo celom organizme, kde by inak bola exprimovaná.
  43. 43. Živočíšna bunka, tkanivo, orgán alebo celý organizmus obsahujúci syntetický gén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 37 alebo génový konštrukt podľa ktoréhokoľvek z nárokov 38 až 40.
SK1372-2000A 1998-03-20 1999-03-19 Syntetický gén obsahujúci dispergovanú alebo cudzorodú deoxyribonukleovú molekulu, génový konštrukt obsahujúci tento syntetický gén a prípravok obsahujúci tento syntetický gén SK287538B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPP2492A AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-03-20 Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
AUPP2499A AUPP249998A0 (en) 1998-03-20 1998-03-20 Gene expression I
PCT/AU1999/000195 WO1999049029A1 (en) 1998-03-20 1999-03-19 Control of gene expression

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK13722000A3 true SK13722000A3 (sk) 2001-05-10
SK287538B6 SK287538B6 (sk) 2011-01-04

Family

ID=25645735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1372-2000A SK287538B6 (sk) 1998-03-20 1999-03-19 Syntetický gén obsahujúci dispergovanú alebo cudzorodú deoxyribonukleovú molekulu, génový konštrukt obsahujúci tento syntetický gén a prípravok obsahujúci tento syntetický gén

Country Status (21)

Country Link
US (6) US20030074684A1 (sk)
EP (5) EP2302057B1 (sk)
JP (4) JP4187413B2 (sk)
KR (3) KR101085210B1 (sk)
CN (3) CN101818145A (sk)
AT (2) ATE526406T1 (sk)
AU (6) AU743316C (sk)
BR (1) BRPI9908967B1 (sk)
CA (3) CA2323726C (sk)
CZ (1) CZ295108B6 (sk)
DK (1) DK1624060T3 (sk)
ES (2) ES2374290T3 (sk)
GB (1) GB2353282C (sk)
HK (1) HK1035742A1 (sk)
HU (1) HU230353B1 (sk)
NZ (2) NZ547283A (sk)
PL (1) PL343064A1 (sk)
SG (2) SG115493A1 (sk)
SK (1) SK287538B6 (sk)
WO (1) WO1999049029A1 (sk)
ZA (1) ZA200004507B (sk)

Families Citing this family (280)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
KR101085210B1 (ko) 1998-03-20 2011-11-21 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 유전자 발현 조절방법
JP5015373B2 (ja) * 1998-04-08 2012-08-29 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション 改良表現型を得るための方法及び手段
US8598332B1 (en) 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
US6939712B1 (en) * 1998-12-29 2005-09-06 Impedagen, Llc Muting gene activity using a transgenic nucleic acid
AU776150B2 (en) 1999-01-28 2004-08-26 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for (in vivo) and (in vitro) attenuation of gene expression using double stranded RNA
AU2008202208C1 (en) * 1999-01-30 2014-04-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a defined gene
DE19956568A1 (de) * 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
WO2000063364A2 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
TR200103088T2 (tr) * 1999-05-10 2002-05-21 Syngenta Participations Ag Viral gen ekspresyonunun düzenlenmesi.
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
BR0013607A (pt) 1999-08-26 2002-04-30 Calgene Llc Sequências de ácidos nucléicos e processos de uso para a produção de plantas com ácidos graxos poliinsaturados modificados
US7531718B2 (en) 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
GB9927444D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
WO2003070918A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US8202846B2 (en) 2000-03-16 2012-06-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for RNA interference
JP2003526367A (ja) 2000-03-16 2003-09-09 ジェネティカ インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉の方法とｒｎａ干渉組成物
AU2001240375A1 (en) * 2000-03-17 2001-10-03 Benitec Australia Limited Genetic silencing
CA2404890C (en) 2000-03-30 2013-11-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US20080032942A1 (en) 2000-08-30 2008-02-07 Mcswiggen James RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (siNA)
CA2427347C (en) 2000-10-31 2011-01-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method and means for producing barley yellow dwarf virus resistant cereal plants
BRPI0115814B8 (pt) 2000-12-01 2021-05-25 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie Embl moléculas de rna de filamento duplo, seu método de preparação e composição farmacêutica compreendendo as mesmas
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
CA2429397C (en) 2001-01-26 2014-06-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning
EP1229134A3 (en) 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
US20050159378A1 (en) 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050256068A1 (en) 2001-05-18 2005-11-17 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of stearoyl-CoA desaturase (SCD) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
WO2003070972A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20050014172A1 (en) 2002-02-20 2005-01-20 Ivan Richards RNA interference mediated inhibition of muscarinic cholinergic receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030175950A1 (en) * 2001-05-29 2003-09-18 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of HIV gene expression using short interfering RNA
US8008472B2 (en) 2001-05-29 2011-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of human immunodeficiency virus (HIV) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
BR0211111A (pt) 2001-07-12 2004-06-22 Univ Massachusetts Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, transgene, precursor de rna engenheirado, animal transgênico não humano, e, método de induzir a interferência de ácido ribonucleico de um gene alvo em uma célula
EP1409506B1 (en) 2001-07-23 2012-05-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for rnai mediated inhibition of gene expression in mammals
US10590418B2 (en) 2001-07-23 2020-03-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for RNAi mediated inhibition of gene expression in mammals
US7612194B2 (en) 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
US20050037989A1 (en) * 2001-08-27 2005-02-17 Lewis David L. Inhibition of gene function by delivery of polynucleotide-based gene expression inhibitors to mammalian cells in vivo
EP3415625A1 (en) 2002-02-01 2018-12-19 Life Technologies Corporation Double-stranded oligonucleotides
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7893248B2 (en) 2002-02-20 2011-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7928218B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of polycomb group protein EZH2 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090192105A1 (en) 2002-02-20 2009-07-30 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE (ICAM) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCELIC ACID (siNA)
AU2003207708A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US7700760B2 (en) 2002-02-20 2010-04-20 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular cell adhesion molecule (VCAM) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7795422B2 (en) 2002-02-20 2010-09-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hypoxia inducible factor 1 (HIF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7897752B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of telomerase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7667029B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7910724B2 (en) 2002-02-20 2011-03-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Fos gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090253774A1 (en) 2002-02-20 2009-10-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PLATELET DERIVED GROWTH FACTOR (PDGF) AND PLATELET DERIVED GROWTH FACTOR RECEPTOR (PDGFR) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7667030B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of matrix metalloproteinase 13 (MMP13) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7662952B2 (en) 2002-02-20 2010-02-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of GRB2 associated binding protein (GAB2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
ATE519774T1 (de) 2002-02-20 2011-08-15 Sirna Therapeutics Inc Durch eine störung der rna vermittelte inhibierung der genexpression des hepatitis c virus (hcv) mit kurzer, störender nukleinsäure (short interfering nucleic acid, sina)
WO2003070966A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc RNA INTERFERENCE MEDIATED TARGET DISCOVERY AND TARGET VALIDATION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20090099117A1 (en) 2002-02-20 2009-04-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MYOSTATIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7691999B2 (en) 2002-02-20 2010-04-06 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of NOGO and NOGO receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8013143B2 (en) 2002-02-20 2011-09-06 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of CXCR4 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090253773A1 (en) 2002-02-20 2009-10-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TNF AND TNF RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US8067575B2 (en) 2002-02-20 2011-11-29 Merck, Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of cyclin D1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7683165B2 (en) 2002-02-20 2010-03-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8258288B2 (en) 2002-02-20 2012-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of respiratory syncytial virus (RSV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7897753B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of XIAP gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7935812B2 (en) 2002-02-20 2011-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of hepatitis C virus (HCV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7678897B2 (en) 2002-02-20 2010-03-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of platelet-derived endothelial cell growth factor (ECGF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7928219B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of placental growth factor gene expression using short interfering nucleic acid (SINA)
US7683166B2 (en) 2002-02-20 2010-03-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7928220B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7897757B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
ES2346645T3 (es) * 2002-03-14 2010-10-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Procedimientos y medios de supervision y modulacion del silenciamiento genico.
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
EP1484959A4 (en) 2002-03-21 2005-08-31 Monsanto Technology Llc NUCLEIC ACID CONSTRUCTS AND METHODS FOR PRODUCING MODIFIED SEED OIL COMPOSITIONS
US7166771B2 (en) 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
CA2524569C (en) 2002-05-03 2013-10-22 Duke University A method of regulating gene expression
SI3222724T1 (sl) 2002-08-05 2019-03-29 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
US20050042646A1 (en) 2002-08-05 2005-02-24 Davidson Beverly L. RNA interference suppresion of neurodegenerative diseases and methods of use thereof
US20080274989A1 (en) 2002-08-05 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna Interference Suppression of Neurodegenerative Diseases and Methods of Use Thereof
US20040241854A1 (en) 2002-08-05 2004-12-02 Davidson Beverly L. siRNA-mediated gene silencing
EP1552018B1 (en) 2002-08-12 2009-07-01 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions relating to gene silencing
CA2899360A1 (en) 2002-08-21 2004-04-08 Revivicor, Inc. Porcine animals lacking any expression of functional alpha 1,3 galactosyltransferase
US7956176B2 (en) 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US20040242518A1 (en) * 2002-09-28 2004-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Influenza therapeutic
US20040152651A1 (en) * 2002-11-01 2004-08-05 Rana Tariq M. Regulation of transcription elongation factors
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
CN1836045B (zh) 2003-03-28 2012-05-09 孟山都技术有限公司 用于早期种子发育的新型植物启动子
WO2004106517A1 (en) * 2003-06-03 2004-12-09 Benitec Australia Limited Double-stranded nucleic acid
NZ544391A (en) 2003-06-06 2009-06-26 Arborgen Llc Plant transformation and selection
EP1636385A4 (en) * 2003-06-24 2010-06-02 Mirus Bio Corp INHIBITION OF GENE FUNCTION BY IN VIVO DISTRIBUTION OF GENE EXPRESSION INHIBITORS BASED ON POLYNUCLEOTIDES IN MAMMALIAN CELLS
BRPI0412282A (pt) * 2003-07-02 2006-09-19 Musc Found For Res Dev imunidade especìfica e não-especìfica induzida de dsrna em crustáceos e outros invertebrados, e veìculos de bioliberação para uso nestes
CA2533259C (en) 2003-07-21 2014-01-28 Lifecell Corporation Acellular tissue matrices made from galactose .alpha.-1,3-galactose-deficient tissue
CA2536112A1 (en) 2003-08-20 2005-03-03 Northern Sydney And Central Coast Area Health Service Methods for enhancing embryo viability
IL157538A0 (en) 2003-08-21 2004-03-28 Bar Ilan Res & Dev Company Ltd Plant resistant to cytoplasm-feeding parasites
CA2568603A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Modified gene-silencing nucleic acid molecules and uses thereof
AU2004290006A1 (en) 2003-11-05 2005-05-26 University Of Pittsburgh Porcine isogloboside 3 synthase protein, cDNA, genomic organization, and regulatory region
WO2005081714A2 (en) 2003-11-21 2005-09-09 Revivicor, Inc. Use of interfering rna in the production of transgenic animals
EP1697534B1 (en) 2003-12-01 2010-06-02 Life Technologies Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
AU2004304665B2 (en) 2003-12-24 2009-03-12 Novo Nordisk A/S Transgenic non-human mammal comprising a polynucleotide encoding human or humanized C5aR
US7683237B2 (en) 2004-02-10 2010-03-23 Monsanto Technology Llc Maize seed with synergistically enhanced lysine content
AR047598A1 (es) 2004-02-10 2006-01-25 Monsanto Technology Llc Semilla de maiz transgenica con mayor contenido de aminoacidos
US7855323B2 (en) 2004-02-10 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA for gene suppression
US20060075515A1 (en) 2004-08-11 2006-04-06 Luethy Michael H Enhanced zein reduction in transgenic corn seed
CA2554212A1 (en) 2004-02-10 2005-08-25 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional sina)
JP4763681B2 (ja) 2004-03-05 2011-08-31 ベニテック インコーポレイテッド ＲＮＡｉ作用媒介物の同時デリバリーのためのマルチプロモーター発現カセット
CA2857051A1 (en) 2004-03-17 2005-09-29 David Ayares Tissue products derived from animals lacking any expression of functional alpha 1,3 galactosyltransferase
US20060041961A1 (en) 2004-03-25 2006-02-23 Abad Mark S Genes and uses for pant improvement
US8049069B2 (en) 2004-03-31 2011-11-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genes involved in plant fibre development
US20060021087A1 (en) 2004-04-09 2006-01-26 Baum James A Compositions and methods for control of insect infestations in plants
CA2884237C (en) 2004-04-22 2020-09-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CA2557532A1 (en) 2004-04-23 2005-11-10 Angela M. Christiano Inhibition of hairless protein mrna
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
US7576261B2 (en) 2004-10-13 2009-08-18 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Nematode resistant transgenic plants
WO2006046148A2 (en) 2004-10-25 2006-05-04 Devgen Nv Rna constructs
EP1809720B1 (en) * 2004-10-29 2012-05-02 Life Technologies Corporation Functionalized fluorescent nanocrystals, and methods for their preparation and use
US8404927B2 (en) * 2004-12-21 2013-03-26 Monsanto Technology Llc Double-stranded RNA stabilized in planta
EP1831376A1 (en) 2004-12-28 2007-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Improved grain quality through altered expression of seed proteins
EP2489726A3 (en) 2005-01-12 2012-11-28 Monsanto Technology LLC Genes and uses for plant improvement
AU2006236453B2 (en) * 2005-01-25 2012-02-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Delivery of siRNA by neutral lipid compositions
EP1851317B1 (en) 2005-02-23 2011-10-26 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
WO2006113743A2 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for rna interference with sialidase expression and uses thereof
ATE552343T1 (de) 2005-04-19 2012-04-15 Basf Plant Science Gmbh Endosperm-spezifische expression und/oder expression in keimenden embryos monokotyledoner pflanzen
US20060272057A1 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving crop plant architecture and yield
CA2622660C (en) 2005-09-16 2017-11-07 Devgen Nv Transgenic plant-based methods for plant pests using rnai
PL2431473T3 (pl) 2005-09-16 2017-05-31 Monsanto Technology Llc Sposoby genetycznej kontroli inwazji owadów u roślin i kompozycje do tego przeznaczone
CA2620387C (en) 2005-09-20 2018-09-18 Basf Plant Science Gmbh Methods for controlling gene expression using ta-sirna
US8093369B2 (en) 2005-10-11 2012-01-10 Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Ltd. Compositions for silencing the expression of VDAC1 and uses thereof
CA2626304C (en) 2005-10-20 2015-07-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Cereals with altered dormancy
CA2637254A1 (en) 2006-01-17 2007-07-26 Biolex Therapeutics, Inc. Compositions and methods for humanization and optimization of n-glycans in plants
EP1991568A2 (en) 2006-02-09 2008-11-19 Pioneer Hi-Bred International Inc. Genes for enhancing nitrogen utilization efficiency in crop plants
BRPI0707626A2 (pt) 2006-02-10 2011-05-10 Monsanto Technology Llc identificaÇço e uso de genes alvos para o controle de nematàides parasitas de plantas
CN101421406B (zh) 2006-02-13 2016-08-31 孟山都技术有限公司 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法
CA2836368C (en) 2006-02-13 2020-04-07 Monsanto Technology Llc Method for managing crop pest resistance
FR2898908A1 (fr) 2006-03-24 2007-09-28 Agronomique Inst Nat Rech Procede de preparation de cellules aviaires differenciees et genes impliques dans le maintien de la pluripotence
EP2007799A2 (en) 2006-04-19 2008-12-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Isolated polynucleotide molecules corresponding to mutant and wild-type alleles of the maize d9 gene and methods of use
US8536429B2 (en) 2006-07-12 2013-09-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Polynucleotides encoding a NAX2 polypeptide and methods for enhancing salinity tolerance in plants
CN101600798A (zh) 2006-08-31 2009-12-09 孟山都技术有限公司 相位型小rna
CN101195821A (zh) 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
MY152893A (en) 2007-01-10 2014-11-28 Sanofi Aventis Method for determining the stability of organic methyleneamines in the presence of semicarbazide-sensitive amine oxidase
CN101686641B (zh) 2007-02-05 2014-05-07 新加坡国立大学 推定的细胞激动素受体和其应用方法
US8067390B2 (en) * 2007-03-02 2011-11-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Therapeutic targeting of interleukins using siRNA in neutral liposomes
DK2129680T3 (en) 2007-03-21 2015-08-10 Brookhaven Science Ass Llc COMBINED hairpin ANTISENSE COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING EXPRESSION OF
CA2682047A1 (en) 2007-03-26 2008-10-02 University Of Massachusetts Medical School Compositions and methods for increasing immunogenicity of glycoprotein vaccines
US20100240597A1 (en) 2007-06-15 2010-09-23 Arkansas State University Methods of delivery of molecules to cells using a ricin subunit and compositions relating to same
CN101821375B (zh) 2007-08-13 2013-07-10 联邦科学技术研究组织 具有低水平大麦醇溶蛋白的大麦
AU2008286701B2 (en) 2007-08-14 2015-02-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved gene silencing methods
JP2010536388A (ja) 2007-08-30 2010-12-02 ザ ウォルター アンド エリザ ホール インスティテュート オブ メディカル リサーチ 樹状細胞マーカーおよびその使用法
US8129586B2 (en) 2007-11-20 2012-03-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize ethylene signaling genes and modulation of same for improved stress tolerance in plants
UA113829C2 (uk) 2007-11-27 2017-03-27 Коммонвелс Сайнтіфік Енд Індастріал Рісерч Організейшн Генетично модифікована рослина зі збільшеним потенціалом продуктивності
US8809626B2 (en) 2007-12-21 2014-08-19 Keygene N.V. Trichome specific promoters
EP2268278A4 (en) * 2008-04-04 2011-11-09 Shorr Robert PHARMACEUTICAL COMPOSITION
JP5722765B2 (ja) 2008-04-24 2015-05-27 ニューサウス イノベイションズ ピーティーワイ リミテッド 藍藻類サキシトキシン遺伝子クラスタおよびシアノトキシンを有する生物の検出
WO2009132351A2 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Anti-sense microrna expression vectors
US8093043B2 (en) 2008-06-04 2012-01-10 New York University β-TrCP1, β-TrCP2 and RSK1 or RSK2 inhibitors and methods for sensitizing target cells to apoptosis
CA2729303A1 (en) 2008-06-30 2010-01-14 Angioblast Systems, Inc. Treatment of eye diseases and excessive neovascularization using a combined therapy
ES2603530T3 (es) 2008-07-21 2017-02-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Aceite de semilla de algodón mejorado y usos
US8329989B2 (en) 2008-09-29 2012-12-11 Monsanto Technology Llc Soybean transgenic event MON87705 and methods for detection thereof
CN102197137A (zh) 2008-10-30 2011-09-21 先锋国际良种公司 对谷氨酰胺合成酶(gs)进行操作以改善高等植物中的氮利用效率和籽粒产量
CN102272157B (zh) 2008-11-07 2015-11-25 研究发展基金会 用于抑制cripto/grp78复合物形成和信号的组合物和方法
US8734853B2 (en) 2008-11-17 2014-05-27 University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth HDL particles for delivery of nucleic acids
EP2370092A1 (en) 2008-12-03 2011-10-05 Research Development Foundation Modulation of olfml-3 mediated angiogenesis
CA2743707A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for enhanced yield by targeted expression of knotted1
US8497075B2 (en) 2008-12-09 2013-07-30 Novartis Ag Methods of identifying a modulator that inhibits the binding between Epstein-Barr virus induced receptor 2 and cholesterol derived ligands
WO2010101818A1 (en) 2009-03-02 2010-09-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nac transcriptional activators involved in abiotic stress tolerance
AU2010225469B2 (en) 2009-03-20 2016-05-05 Mesoblast, Inc. Production of reprogrammed pluripotent cells
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
EP2419510B1 (en) 2009-04-14 2015-09-16 Pioneer Hi-Bred International Inc. Modulation of acc synthase improves plant yield under low nitrogen conditions
CA2758824A1 (en) 2009-04-17 2010-10-21 Basf Plant Science Company Gmbh Plant promoter operable in endosperm and uses thereof
MX2011011076A (es) 2009-04-20 2011-11-18 Monsanto Technology Llc Resistencia a multiples virus en plantas.
ES2644055T3 (es) 2009-06-05 2017-11-27 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Moléculas terapéuticas y de diagnóstico
EP2440664B1 (en) 2009-06-08 2021-04-21 Nunhems B.V. Drought tolerant plants
CA2768571A1 (en) 2009-07-24 2011-01-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. The use of dimerization domain component stacks to modulate plant architecture
CN101760555B (zh) * 2009-09-30 2012-06-27 西南大学 一种基于pcr技术鉴定单拷贝转基因烟草的方法
BR112012007516A2 (pt) 2009-10-02 2015-09-15 Pioneer Hi Bred Int ácido nucléico isolado, plantas , células vegetais, métodos de redução de produção de etileno em uma planta, de aumento de produtividade em uma planta e de aumento de tolerância à aridez, cassete de expressão e semente
US8293718B2 (en) 2009-12-18 2012-10-23 Novartis Ag Organic compositions to treat HSF1-related diseases
MX2012007855A (es) 2010-01-06 2013-06-05 Du Pont Identificacion de ritmos diurnos en tejidos fotosinteticos del zea mays y uso en el mejoramiento de plantas de cultivo.
CN102770767A (zh) 2010-02-10 2012-11-07 诺瓦提斯公司 用于肌肉生长的方法和组合物
CN107090453A (zh) * 2010-05-10 2017-08-25 德克萨斯A&M大学系统 用在植物中表达基因产物的组合物、生物体、体系和方法
CN107974457A (zh) 2010-05-28 2018-05-01 纽海姆有限公司 果实大小增大的植物
US9512188B2 (en) 2010-07-12 2016-12-06 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Isolated polynucleotides and methods and plants using same for regulating plant acidity
EP4050109A1 (en) 2010-08-18 2022-08-31 Fred Hutchinson Cancer Center Agents for use in treating facioscapulohumeral dystrophy (fshd)
US9233997B2 (en) * 2010-08-26 2016-01-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of prolyl hydroxylase domain 2 (PHD2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20120107355A1 (en) 2010-10-27 2012-05-03 Harrisvaccines, Inc. Method of rapidly producing improved vaccines for animals
DK3124610T3 (da) 2010-10-28 2019-06-11 Benitec Biopharma Ltd Hbv-behandling
US9260471B2 (en) 2010-10-29 2016-02-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acids (siNA)
US9585413B2 (en) 2010-11-04 2017-03-07 Arista Cereal Technology Pty Limited Food ingredients produced from high amylose wheat
US20130224116A1 (en) 2010-11-05 2013-08-29 TransBio Ltd. Markers of Endothelial Progenitor Cells and Uses Thereof
AU2012217792A1 (en) 2011-02-14 2013-08-29 Revivicor, Inc. Genetically modified pigs for xenotransplantation of vascularized xenografts and derivatives thereof
CN103842511A (zh) 2011-03-23 2014-06-04 先锋国际良种公司 产生复合转基因性状基因座的方法
US9677084B2 (en) 2011-04-29 2017-06-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Down-regulation of a homeodomain-leucine zipper I-class homeobox gene for improved plant performance
WO2012174139A2 (en) 2011-06-14 2012-12-20 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for making and b ioc ont aining auxotrophic transgenic plants
US9574208B2 (en) 2011-06-21 2017-02-21 Ei Du Pont De Nemours And Company Methods and compositions for producing male sterile plants
US20150159166A1 (en) 2011-10-31 2015-06-11 Pioneer Hi Bred International Inc Plant drought tolerance and nitrogen use efficiency by reducing plant sensitivity to ethylene
EP2773183A4 (en) 2011-11-04 2015-04-15 Arista Cereal Technologies Pty Ltd WHEAT WITH HIGH AMYLOSE CONTENT - II
UA116097C2 (uk) 2011-12-11 2018-02-12 Зе Стейт Оф Ізраел, Міністрі Оф Агрікалче Енд Руерал Девелопмент, Агрікалчерал Рісьоч Організейшн, (А.Р.О.), Волкані Сентре Спосіб модуляції провідності устячка рослини
EP2798065B1 (en) 2011-12-27 2019-06-05 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Simultaneous gene silencing and supressing gene silencing in the same cell
JP6461604B2 (ja) 2011-12-27 2019-01-30 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 脂質製造のための工程
AU2012327162A1 (en) 2011-12-27 2013-07-11 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of dihydrosterculic acid and derivatives thereof
CN104302768A (zh) 2012-01-09 2015-01-21 诺华股份有限公司 治疗β-联蛋白相关疾病的有机组合物
US20150353949A1 (en) 2012-01-11 2015-12-10 The Australian National University Method for modulating plant root architecture
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
CN104703998B (zh) 2012-03-13 2020-08-21 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
KR102208924B1 (ko) 2012-04-25 2021-01-29 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 고 올레산 오일
CN102719454B (zh) * 2012-06-15 2014-07-30 华南农业大学 一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因及其表达载体
WO2014027021A1 (en) 2012-08-16 2014-02-20 Vib Vzw Means and methods for altering the lignin pathway in plants
WO2014045126A2 (en) 2012-09-18 2014-03-27 Uti Limited Partnership Treatment of pain by inhibition of usp5 de-ubiquitinase
AU2014211570A1 (en) 2013-01-29 2015-07-23 The University Court Of The University Of Glasgow Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants
CN105143470B (zh) 2013-02-28 2020-06-09 德克萨斯大学系统董事会 用于将癌症分类为易感于tmepai定向疗法以及治疗所述癌症的方法
US20160002648A1 (en) 2013-03-11 2016-01-07 Mei Guo Genes for improving nutrient uptake and abiotic stress tolerance in plants
WO2014164074A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Enhanced nitrate uptake and nitrate translocation by over-expressing maize functional low-affinity nitrate transporters in transgenic maize
US20160017360A1 (en) 2013-03-13 2016-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Functional expression of bacterial major facilitator superfamily mfs gene in maize to improve agronomic traits and grain yield
BR112015023304A2 (pt) 2013-03-14 2017-07-18 Pioneer Hi Bred Int método para melhorar a tolerância ao estresse abiótico de uma planta, planta e semente
US20160017350A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides
AU2014234265B2 (en) 2013-03-21 2020-01-30 Universiteit Gent Means and methods for the reduction of photorespiration in crops
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
CA2911185C (en) 2013-06-11 2023-09-05 Syngenta Participations Ag Methods for generating transgenic plants
CN105492591B (zh) 2013-06-13 2019-09-13 联邦科学技术研究组织 具有极低水平的大麦醇溶蛋白的大麦
EP3013329B1 (en) 2013-06-25 2020-08-05 The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research Smac mimetics for the treatment of persistent intracellular hbv infection
US10428336B2 (en) 2013-10-16 2019-10-01 The Australian National University Method for modulating plant growth
US10307510B2 (en) 2013-11-04 2019-06-04 Lifecell Corporation Methods of removing alpha-galactose
US10203327B2 (en) 2013-11-05 2019-02-12 Novartis Ag Organic compounds
DK3074038T3 (en) 2013-11-28 2019-03-11 Csl Ltd METHOD OF TREATING DIABETIC NEPHROPATHY
WO2015089338A2 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Glucocorticoid inhibitors for treatment of prostate cancer
KR20160096194A (ko) 2013-12-18 2016-08-12 씨에스엘 리미티드 상처 치료 방법
US20170166920A1 (en) 2014-01-30 2017-06-15 Two Blades Foundation Plants with enhanced resistance to phytophthora
WO2015171723A1 (en) 2014-05-06 2015-11-12 Research Development Foundation Methods for treating insulin resistance and for sensitizing patients to glp1 agonist therapy
WO2015171603A1 (en) 2014-05-06 2015-11-12 Two Blades Foundation Methods for producing plants with enhanced resistance to oomycete pathogens
BR112016030971B1 (pt) 2014-07-07 2022-09-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processo para produzir um produto de óleo e processo para produzir um produto de óleo a partir do óleo da planta
EP3166964A1 (en) 2014-07-08 2017-05-17 Vib Vzw Means and methods to increase plant yield
WO2016079527A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Tetralogic Birinapant Uk Ltd Combination therapy
CA2970177C (en) 2014-12-08 2023-09-19 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Lipocationic polymers and uses thereof
WO2016097773A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Children's Cancer Institute Therapeutic iap antagonists for treating proliferative disorders
US10750690B2 (en) 2015-05-29 2020-08-25 Arcadia Biosciences, Inc. Reduced gluten grains and compositions thereof
US10000766B2 (en) * 2015-07-17 2018-06-19 National Chung Hsing University Recombinant construct, recombinant microorganism, recombinant plant cell and method of providing plant with resistance against DNA virus and RNA virus
EP3344774A1 (en) 2015-09-04 2018-07-11 Keygene N.V. Diplospory gene
CN108271360B (zh) 2015-09-14 2023-01-24 得克萨斯州大学系统董事会 亲脂阳离子树枝状聚合物及其用途
WO2017062790A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Two Blades Foundation Cold shock protein receptors and methods of use
SG11201804169QA (en) 2015-11-18 2018-06-28 Commw Scient Ind Res Org Rice grain with thickened aleurone
EP3375445A4 (en) 2015-11-30 2019-08-07 Xie, Yanhui USE OF AKT2 IN THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF A TUMOR
MX2018011298A (es) 2016-03-18 2019-03-07 Pioneer Hi Bred Int Metodos y composiciones para producir gametos clonados, sin reducir, sin recombinar.
WO2017162265A1 (en) * 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Trans-replicating rna
AU2017267634C1 (en) 2016-05-16 2022-05-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Cationic sulfonamide amino lipids and amphiphilic zwitterionic amino lipids
EP3500279A4 (en) * 2016-08-19 2020-04-22 Calimmune, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANINE CONDITIONS USING A RECOMBINANT SELF-COMPLEMENTARY ADENO-ASSOCIATED VIRUS.
CA3073137A1 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Jeffrey S. Bartlett Methods and compositions for treating conditions using recombinant self-complementary adeno-associated virus
CN107841510B (zh) * 2016-09-20 2021-02-09 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的方法
MX2019006614A (es) 2016-12-07 2019-10-15 Univ Florida Adnc del antagonista del receptor de interleucina-1.
CA3133899A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 University Of Geneva Micro rna expression constructs and uses thereof
JP2022512706A (ja) 2018-10-16 2022-02-07 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 眼科におけるＡｋｔ阻害剤の使用
US20220091137A1 (en) 2019-01-17 2022-03-24 Hoffmann-La Roche Inc. E3 ubiquitin ligase (ube3a) protein targets
EP3920889A4 (en) 2019-02-08 2022-12-07 Board of Regents, The University of Texas System TELOMERASE-CONTAINING EXOSOMES FOR THE TREATMENT OF DISEASES RELATED TO AGE-RELATED ORGANDYS FUNCTION
WO2021019536A1 (en) 2019-07-30 2021-02-04 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Methods of controlling cannabinoid synthesis in plants or cells and plants and cells produced thereby
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
JP2023522103A (ja) 2020-04-20 2023-05-26 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 生物学的に活性な乾燥粉末組成物ならびにその製造および使用の方法
EP4157864A1 (en) 2020-05-27 2023-04-05 Antion Biosciences SA Adapter molecules to re-direct car t cells to an antigen of interest
US20230266325A1 (en) 2020-06-30 2023-08-24 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting lung cancer
EP4284513A1 (en) 2021-01-26 2023-12-06 Universite Brest Bretagne Occidentale Novel stim1 splicing variants and uses thereof
AU2022324708A1 (en) 2021-08-06 2024-02-15 Kws Vegetables B.V. Durable downy mildew resistance in spinach
WO2023020980A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 F. Hoffmann-La Roche Ag E3 ubiquitin ligase (ube3a) protein targets
GB202206507D0 (en) 2022-05-04 2022-06-15 Antion Biosciences Sa Expression construct
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2024028794A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Temple Therapeutics BV Methods for treating endometrial and ovarian hyperproliferative disorders

Family Cites Families (229)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US266005A (en) * 1882-10-17 William allen
US27783A (en) * 1860-04-10 Improvement in apparatus for evaporating sugar-juices
US74684A (en) * 1868-02-18 of wallingford
US56235A (en) * 1866-07-10 Improvement in paring-knives
US114784A (en) * 1871-05-16 Improvement in compounds for cure of chills and fever
US36197A (en) * 1862-08-12 Improvement in compound bullets for small-arms
US86356A (en) * 1869-02-02 Improvement in the construction of fire-proof safes
US165894A (en) * 1875-07-20 Improvement in vessels for removing foul water from docks
US3931397A (en) 1971-11-05 1976-01-06 Beecham Group Limited Biologically active material
US4024222A (en) 1973-10-30 1977-05-17 The Johns Hopkins University Nucleic acid complexes
US4034323A (en) * 1975-03-24 1977-07-05 Oki Electric Industry Company, Ltd. Magnetic relay
US4283393A (en) 1979-03-13 1981-08-11 Merck & Co., Inc. Topical application of interferon inducers
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4605394A (en) 1982-12-03 1986-08-12 Simon V. Skurkovich Methods for the treatment of pathological conditions by removing interferon from the organism
DE3208247A1 (de) 1982-03-08 1983-09-22 Philips Patentverwaltung Gmbh, 2000 Hamburg Cuvette fuer die atom-absorptions-spektrometrie
JPS5936698A (ja) 1982-08-20 1984-02-28 Science & Tech Agency Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞
NZ209840A (en) 1983-10-17 1988-11-29 Kaji Akira A method of inhibiting viral propagation by hybridising dna with the viral rna thus blocking its action
US5272065A (en) * 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5190931A (en) 1983-10-20 1993-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5208149A (en) 1983-10-20 1993-05-04 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acid constructs containing stable stem and loop structures
ATE198350T1 (de) 1983-10-20 2001-01-15 Univ New York State Res Found Regulierung der genexpression durch translationshemmung unter verwendung einer m-rns behindernden komplementären rns
US5173410A (en) 1984-02-15 1992-12-22 Lubrizol Genetics Inc. Transfer vector
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4766072A (en) 1985-07-17 1988-08-23 Promega Corporation Vectors for in vitro production of RNA copies of either strand of a cloned DNA sequence
GB8521646D0 (en) 1985-08-30 1985-10-02 English Clays Lovering Pochin Inorganic fillers
CA1326450C (en) 1985-08-26 1994-01-25 William A. Carter Modulation of aids virus-related events by double stranded rnas (dsrnas)
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
GB8601680D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Agricultural Genetics Co Modification of plant viruses
NZ219472A (en) 1986-03-28 1990-08-28 Calgene Inc Regulation of phenotype in plant cells using dsdna constructs
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5017488A (en) 1986-04-01 1991-05-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Highly efficient dual T7/T3 promoter vector PJKF16 and dual SP6/T3 promoter vector PJFK15
DE3850683T2 (de) * 1987-02-09 1994-10-27 Lubrizol Genetics Inc Hybrides RNS-Virus.
PH24467A (en) 1987-03-03 1990-07-18 Hem Res Inc Synergistics interplay of lymphokines and dsrnas
US4950652A (en) 1987-03-23 1990-08-21 Hem Research, Inc. dsRNAs for combination therapy in the treatment of viral diseases
AU1820588A (en) 1987-07-17 1989-01-19 Hem Research, Inc. Double-stranded rna correction of abnormalities in circulating immune complexes and monocyte function
IE72103B1 (en) 1987-08-12 1997-03-12 Hem Res Inc Promotion of host defense by systemic dsRNA treatment
IE66830B1 (en) 1987-08-12 1996-02-07 Hem Res Inc Topically active compositions of double-stranded RNAs
ATE122402T1 (de) 1987-09-04 1995-05-15 Hem Pharma Corp Diagnose von mangelzuständen doppelsträngiger rns.
US5874555A (en) 1987-10-30 1999-02-23 California Institute Of Technology Triple helices and processes for making same
US4963532A (en) 1987-11-25 1990-10-16 Hem Research, Inc. dsRNA-based prevention of viral escape
EP0640688A1 (en) 1987-12-15 1995-03-01 Gene Shears Pty. Limited Ribozymes
US5254678A (en) 1987-12-15 1993-10-19 Gene Shears Pty. Limited Ribozymes
PH25365A (en) 1987-12-23 1991-05-13 Hem Research Rhase l inhibitor as a marker for virus infections
US5922602A (en) 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
GB8810120D0 (en) 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
CA1320446C (en) 1988-06-20 1993-07-20 William A. Carter Modulation of lymphokine-resistant cellular states by dsrnas
EP0350151B1 (en) 1988-07-07 1994-03-30 Hem Pharmaceuticals Corp. Diagnosing and treating chronic fatigue syndrome
US5597718A (en) 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
US5198346A (en) * 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5405775A (en) 1989-02-24 1995-04-11 The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Retrons coding for hybrid DNA/RNA molecules
US5436141A (en) 1989-02-24 1995-07-25 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Method for synthesizing stable single-stranded CDNA in eukaryotes by means of a bacterial retron and products
US5780269A (en) 1989-02-24 1998-07-14 The University Of Medicine And Denistry Of New Jersey Hybrid molecules
US5434070A (en) 1989-02-24 1995-07-18 The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Reverse transcriptases from Escherichia coli and Myxococcus xanthus
ES2090049T3 (es) 1989-03-16 1996-10-16 Boehringer Ingelheim Int Unidades geneticas para la inhibicion de la funcion de arn.
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
AU5421090A (en) 1989-04-05 1990-11-05 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The A clone of double-stranded rna virus and applications thereof
WO1990012488A2 (en) 1989-04-05 1990-11-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce A clone of double-stranded rna virus applied to antibody production, study of retrovirus-like frameshifting and production of proteins in yeast
EP0473576A4 (en) 1989-05-19 1993-03-10 Hem Research, Inc. Short therapeutic dsrna of defined structure
US5122466A (en) 1989-06-13 1992-06-16 North Carolina State University Ballistic transformation of conifers
GB8916213D0 (en) 1989-07-14 1989-08-31 Ici Plc Dna constructs,cells and plants derived therefrom
DE69034268D1 (de) 1989-08-10 2011-03-03 Bayer Bioscience Nv Pflanzen mit modifizierten Blüten
US5747308A (en) 1989-10-25 1998-05-05 Celltech Therapeutics Limited Recombinant DNA method
US5939600A (en) 1989-11-03 1999-08-17 Goldbach; Robert Willem Nucleic acids encoding tospovirus genome and expression thereof
HUT57265A (en) * 1989-11-03 1991-11-28 Zaadunie Bv Process for producing plants of diminished infection-sensitivity
US5457189A (en) 1989-12-04 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
US5578718A (en) * 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
WO1991010453A1 (en) * 1990-01-18 1991-07-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Vector with multiple target response elements affecting gene expression
US6245560B1 (en) * 1990-01-18 2001-06-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vector with multiple target response elements affecting gene expression
US5168064A (en) 1990-04-20 1992-12-01 The Regents Of The University Of California Endo-1,4-β-glucanase gene and its use in plants
GB9009307D0 (en) 1990-04-25 1990-06-20 Ici Plc Dna,constructs,cells and plant derived therefrom
WO1991018088A1 (en) 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
AU8059891A (en) 1990-06-13 1992-01-07 Trustees Of Princeton University, The A (lac) repressor-hsv vp16 chimeric transcriptional activator protein system functioning in transfected mammalian cells
HUT69956A (en) 1990-08-14 1995-09-28 Isis Pharmaceuticals Inc Methode for inhibition of influenza virus by antiseuse oligonucleotides
DE4027616A1 (de) * 1990-08-31 1992-03-05 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung von polymerase-aktivitaet
MX9100993A (es) 1990-09-10 1992-05-04 Us Agriculture Secuencia de adn aislado y enzima acido 1-aminociclopropan-1-carboxilico sintasa,recombinante
US5306862A (en) 1990-10-12 1994-04-26 Amoco Corporation Method and composition for increasing sterol accumulation in higher plants
SE9004095L (sv) 1990-12-21 1992-06-01 Amylogene Hb Genetisk foeraendring av potatis foer bildning av staerkelse av amylostyp
SE467358B (sv) 1990-12-21 1992-07-06 Amylogene Hb Genteknisk foeraendring av potatis foer bildning av staerkelse av amylopektintyp
CA2100251A1 (en) 1991-01-25 1992-07-26 Robert L. Lechner Regulation of nucleic acid translation
GB9105383D0 (en) 1991-03-14 1991-05-01 Immunology Ltd An immunotherapeutic for cervical cancer
GB9106713D0 (en) 1991-03-28 1991-05-15 Ici Plc Dna,dna constructs,cells and plants derived therefrom
CZ214593A3 (en) 1991-04-16 1994-07-13 Mogen Int Plants exhibiting male sterility, process of obtaining thereof and recombinant dna for application of such process
EP0580754A1 (en) 1991-04-18 1994-02-02 The Salk Institute For Biological Studies Oligodeoxynucleotides and oligonucleotides useful as decoys for proteins which selectively bind to defined dna sequences
FR2675803B1 (fr) 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
GB9109063D0 (en) 1991-04-26 1991-06-12 Ici Plc Modification of lignin synthesis in plants
CA2110169A1 (en) 1991-05-30 1992-12-10 Walter Van Der Eycken Nematode-responsive plant promoters
AU2273392A (en) 1991-07-11 1993-02-11 International Flower Developments Pty Ltd Genetic sequences encoding flavonoid pathway enzymes and uses therefor
US6010908A (en) 1992-08-21 2000-01-04 The Regents Of The University Of California Gene therapy by small fragment homologous replacement
CA2073630C (en) 1991-08-30 2007-12-11 Atsushi Ohshima Method for synthesizing single-stranded stem-loop dnas, the products and uses therefor
US5714323A (en) 1991-08-30 1998-02-03 The University Of Medecine And Dentistry Of New Jersey Over expression of single-stranded molecules
RU2143000C1 (ru) 1991-11-20 1999-12-20 Моген Интернэшнл Н.В. Способ получения растения с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам (варианты), рекомбинантная днк (варианты), трансформирующий растение вектор, штамм agrobacterium и способ снижения ущерба урожаю
FR2685346B1 (fr) 1991-12-18 1994-02-11 Cis Bio International Procede de preparation d'arn double-brin, et ses applications.
JPH08500003A (ja) 1992-02-19 1996-01-09 オレゴン州 翻訳不能なプラスセンスウイルスｒｎａの導入による耐ウイルス性植物の生産
DE4208107A1 (de) 1992-03-13 1993-09-16 Bayer Ag Pseudorabies-virus (prv)-polynukleotide und ihre verwendung zur herstellung von virusresistenten eukaryotischen zellen
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
US5496698A (en) 1992-08-26 1996-03-05 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method of isolating ribozyme targets
GB9210273D0 (en) 1992-05-13 1992-07-01 Ici Plc Dna
US5693535A (en) 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
US6451603B1 (en) 1992-06-29 2002-09-17 Gene Shears Pty. Limited Ribozyme nucleic acids and methods of use thereof for controlling viral pathogens
NZ255028A (en) 1992-07-02 1997-03-24 Hybridon Inc Antisense oligonucleotides resistant to nucleolytic degradation
EP0606454A1 (en) 1992-07-30 1994-07-20 Keygene N.V. Dna constructs, cells and plants derived therefrom
CA2106260A1 (en) 1992-09-17 1994-03-18 Robert M. Kotin Human adeno-associated virus integration site dna and uses thereof
WO1994007367A1 (en) 1992-09-29 1994-04-14 Apollon, Inc. Anti-viral oligomers that bind polypurine tracts of single-stranded rna or rna-dna hybrids
EP0665891A1 (en) 1992-10-15 1995-08-09 Mogen International N.V. Genetic moderation or restoration of plant phenotypes
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
ZA939767B (en) 1993-01-21 1994-09-14 Univ North Carolina State Nematode-resistant transgenic plants
US6069298A (en) 1993-02-05 2000-05-30 Regents Of The University Of Minnesota Methods and an acetyl CoA carboxylase gene for conferring herbicide tolerance and an alteration in oil content of plants
CA2150133A1 (en) 1993-02-05 1994-08-18 Vincent Jean-Marie Armel Arondel Altered linolenic and linoleic acid content in plants
EP0620281A3 (en) 1993-03-31 1995-05-03 Mitsubishi Corp Oilseed plants producing valuable seeds with modified amino acid and fatty acid compositions.
WO1994029465A1 (en) 1993-06-08 1994-12-22 Nunhems Zaden B.V. Process for generating male sterile plants
US5739309A (en) 1993-07-19 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enhancement of oligonucleotide inhibition of protein production, cell proliferation and / or multiplication of infectious disease pathogens
WO1995003406A2 (en) 1993-07-19 1995-02-02 Gen-Probe Incorporated Enhancement of oligonucleotide inhibition of protein production, cell proliferation, and/or multiplication of infectious disease pathogens
US5808036A (en) 1993-09-01 1998-09-15 Research Corporation Technologies Inc. Stem-loop oligonucleotides containing parallel and antiparallel binding domains
CA2105364A1 (en) 1993-09-01 1995-03-02 Eric T. Kool Stem-loop oligonucleotides containing parallel and antiparallel binding domains
US6146826A (en) 1993-09-10 2000-11-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Green fluorescent protein
GB9318927D0 (en) 1993-09-13 1993-10-27 Zeneca Ltd Regulation of senescence
PT1584682E (pt) 1993-09-20 2009-08-03 Univ Pennsylvania Regulação da expressão do gene bcl-2
US5858981A (en) 1993-09-30 1999-01-12 University Of Pennsylvania Method of inhibiting phagocytosis
GB9320548D0 (en) 1993-10-06 1993-11-24 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5624803A (en) 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5908779A (en) 1993-12-01 1999-06-01 University Of Connecticut Targeted RNA degradation using nuclear antisense RNA
US5578716A (en) 1993-12-01 1996-11-26 Mcgill University DNA methyltransferase antisense oligonucleotides
FR2714383B1 (fr) 1993-12-29 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Contrôle de l'expression de gènes.
CA2180358A1 (en) 1994-01-05 1995-07-13 Geoffrey P. Symonds Ribozymes targeting the retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs
US5849991A (en) * 1994-01-27 1998-12-15 Bresatch Limited Mice homozygous for an inactivated α 1,3-galactosyl transferase gene
CA2183992A1 (en) 1994-02-23 1995-08-31 Dan T. Stinchcomb Method and reagent for inhibiting the expression of disease related genes
US5686649A (en) 1994-03-22 1997-11-11 The Rockefeller University Suppression of plant gene expression using processing-defective RNA constructs
US5631148A (en) * 1994-04-22 1997-05-20 Chiron Corporation Ribozymes with product ejection by strand displacement
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US6146886A (en) 1994-08-19 2000-11-14 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
WO1996008558A1 (en) 1994-09-12 1996-03-21 City Of Hope Modulation of drug radiation resistant genes
US5576716A (en) * 1994-12-07 1996-11-19 Sadler; Kermit M. Owner oriented system for locating lost or stolen property
WO1996035706A1 (en) 1995-05-11 1996-11-14 Hybridon, Inc. Pyrimidine targeting hairpin triplex-forming oligonucleotides
US5691140A (en) 1995-05-18 1997-11-25 New England Biolabs, Inc. Bidirectional in vitro transcription vectors utilizing a single RNA polymerase for both directions
US5693773A (en) 1995-06-07 1997-12-02 Hybridon Incorporated Triplex-forming antisense oligonucleotides having abasic linkers targeting nucleic acids comprising mixed sequences of purines and pyrimidines
CA2226088A1 (en) 1995-06-30 1997-01-23 Dna Plant Technology Corporation Delayed ripening tomato plants
FR2737501B1 (fr) 1995-07-31 1997-10-24 Transgene Sa Nouveaux virus auxiliaires pour la preparation de vecteurs viraux recombinants
WO1997010360A1 (en) 1995-09-13 1997-03-20 Chiron Corporation Method and construct for screening for inhibitors of transcriptional activation
CA2239976A1 (en) 1995-09-20 1997-03-27 Paul A. Zamecnik Antisense oligonucleotide chemotherapy for benign hyperplasia or cancer of the prostate
AU718082B2 (en) 1995-10-06 2000-04-06 Plant Genetic Systems N.V. Seed shattering
JPH09110894A (ja) 1995-10-17 1997-04-28 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk ハイブリッドｄｎａ／ｒｎａオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤
EP0771878A1 (en) 1995-10-31 1997-05-07 Plant Genetic Systems N.V. Plants with reduced glucosinolate content
US5773692A (en) 1995-12-12 1998-06-30 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By Agriculture And Agri-Food Canada Anti-sense RNA for CAB transcript to reduce chlorophyll content in plants
CA2279675A1 (en) 1995-12-15 1997-06-16 Enzo Therapeutics, Inc. Property effecting and/or property exhibiting constructs for localizing a nucleic acid construct within a cell for therapeutic and diagnostic uses
IT1283876B1 (it) 1996-01-12 1998-05-07 Univ Roma Molecole chimeriche ribozima-snrna ad attivita' catalitica per rna a localizzazione nucleare
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US5891855A (en) 1996-02-12 1999-04-06 The Scripps Research Institute Inhibitors of leaderless protein export
JP3847366B2 (ja) 1996-02-22 2006-11-22 アンジェスＭｇ株式会社 アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた固定性分裂終了細胞増殖剤
US5989864A (en) * 1996-10-29 1999-11-23 Smithkline Beecham Corporation DNA encoding spo-rel polypeptides
AU2089197A (en) 1996-03-13 1997-10-01 National Research Council Of Canada Process of raising squalene levels in plants and dna sequences used therefor
DE69727558T2 (de) 1996-03-15 2004-12-16 Munin Corporation, Chicago Humanes CYR61, ein Signalmolekül der extrazellularen Matrix
US6022863A (en) 1996-05-21 2000-02-08 Yale University Regulation of gene expression
DK0907735T5 (da) 1996-05-24 2010-06-14 Biogen Idec Inc Modulatorer af vævsregenerering
JP2000513217A (ja) 1996-06-21 2000-10-10 プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ 植物内での遺伝子発現
US5994526A (en) 1996-06-21 1999-11-30 Plant Genetic Systems Gene expression in plants
US5952546A (en) 1996-06-27 1999-09-14 Dna Plant Technology Corporation Delayed ripening tomato plants with T-DNA bearing a truncated ACC2 synthase gene
US5850026A (en) 1996-07-03 1998-12-15 Cargill, Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
AU727447B2 (en) 1996-07-03 2000-12-14 University Of Pittsburgh Emulsion formulations for hydrophilic active agents
NZ333802A (en) 1996-08-02 2001-09-28 Genesense Technologies Inc Antitumor antisense sequences directed against R1 and R2 components of ribonucleotide reductase
DE19631919C2 (de) 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
US5747338A (en) 1996-08-15 1998-05-05 Chiron Corporation Method and construct for screening for inhibitors of transcriptional activation
US6225290B1 (en) 1996-09-19 2001-05-01 The Regents Of The University Of California Systemic gene therapy by intestinal cell transformation
US5814500A (en) 1996-10-31 1998-09-29 The Johns Hopkins University School Of Medicine Delivery construct for antisense nucleic acids and methods of use
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
WO1998037213A1 (en) 1997-02-21 1998-08-27 Danisco A/S Antisense intron inhibition of starch branching enzyme expression
CN1226930A (zh) * 1997-03-10 1999-08-25 日本烟草产业株式会社 反义核苷酸序列
GB9706381D0 (en) 1997-03-27 1997-05-14 Cambridge Advanced Tech Improvements relating to the specificity of gene expression
US7589253B2 (en) 1997-04-15 2009-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism
US5942395A (en) 1997-05-09 1999-08-24 Universite De Montreal Hybrid ribozymes and methods of use
GB9710475D0 (en) * 1997-05-21 1997-07-16 Zeneca Ltd Gene silencing
WO1999009045A1 (en) * 1997-08-20 1999-02-25 Somagenics, Inc. Antisense and antigene therapeutics with improved binding properties and methods for their use
GB9720148D0 (en) 1997-09-22 1997-11-26 Innes John Centre Innov Ltd Gene silencing materials and methods
EP1032692A1 (en) 1997-11-18 2000-09-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted manipulation of herbicide-resistance genes in plants
DE19754622A1 (de) 1997-12-09 1999-06-10 Antje Von Dr Schaewen Pflanzliche GntI-Sequenzen und Verwendung derselben zur Gewinnung von Pflanzen mit verminderter oder fehlender N-Acetylglucosaminyltransferase I (GnTI)-Aktivität
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
KR101085210B1 (ko) 1998-03-20 2011-11-21 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 유전자 발현 조절방법
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
JP5015373B2 (ja) 1998-04-08 2012-08-29 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション 改良表現型を得るための方法及び手段
US8598332B1 (en) 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
EP0959133A1 (en) 1998-05-22 1999-11-24 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro-Dlo) A process for inhibiting expression of genes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
US6040908A (en) * 1998-07-28 2000-03-21 Litton Systems, Inc. Method for stress tuning fiber optic sensor coils
AU776150B2 (en) 1999-01-28 2004-08-26 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for (in vivo) and (in vitro) attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
WO2000063397A2 (en) 1999-04-20 2000-10-26 Aventis Cropscience N.V. Methods for delivering inhibitory rna to plants and applications thereof
WO2000063364A2 (en) 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US20040138168A1 (en) 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
CA2373628A1 (en) 1999-06-14 2000-12-21 Michael A. Costa Animal models and methods for analysis of lipid metabolism and screening of pharmaceutical and pesticidal agents that modulate lipid metabolism
MXPA01013462A (es) 1999-07-09 2002-07-02 Wyeth Corp Metodos y composiciones para prevenir la formacion de arn aberrante durante la transcripcion de una secuencia plasmidica.
US6423885B1 (en) * 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
WO2001019857A2 (en) 1999-09-16 2001-03-22 Genoptera, Llc Facilitative transporter (ft1 and ft2) from drosophila melanogaster and uses thereof
AU1086501A (en) 1999-10-15 2001-04-30 Carnegie Institution Of Washington Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6291504B1 (en) 1999-10-20 2001-09-18 Dupont Pharmaceuticals Company Acylsemicarbazides and their uses
GB9925459D0 (en) 1999-10-27 1999-12-29 Plant Bioscience Ltd Gene silencing
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
WO2001037654A2 (en) 1999-11-24 2001-05-31 Dna Plant Technology Corporation METHOD OF EXPRESSING dsRNA IN PLANTS TO INHIBIT INSECT PESTS
WO2001038359A2 (en) 1999-11-29 2001-05-31 Genoptera, Llc Drosophila nicotinic acetylcholine receptor
GB9930691D0 (en) 1999-12-24 2000-02-16 Devgen Nv Improvements relating to double-stranded RNA inhibition
AU2001240375A1 (en) 2000-03-17 2001-10-03 Benitec Australia Limited Genetic silencing
CA2404890C (en) 2000-03-30 2013-11-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
GB2362383B (en) 2000-05-19 2003-12-31 Devgen Nv Gene expression system
US6995258B1 (en) 2000-05-25 2006-02-07 City Of Hope Nucleolar targeting of therapeutics against HIV
JP2004512020A (ja) 2000-06-23 2004-04-22 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 組換え構築物ならびにこれを遺伝子発現を減少させる際に用いる方法
US7109393B2 (en) 2000-08-15 2006-09-19 Mendel Biotechnology, Inc. Methods of gene silencing using inverted repeat sequences
BRPI0115814B8 (pt) 2000-12-01 2021-05-25 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie Embl moléculas de rna de filamento duplo, seu método de preparação e composição farmacêutica compreendendo as mesmas
US20020150968A1 (en) * 2001-01-10 2002-10-17 Wang Peng G. Glycoconjugate and sugar nucleotide synthesis using solid supports
EP1229134A3 (en) 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
BR0211111A (pt) 2001-07-12 2004-06-22 Univ Massachusetts Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, transgene, precursor de rna engenheirado, animal transgênico não humano, e, método de induzir a interferência de ácido ribonucleico de um gene alvo em uma célula
WO2003023015A2 (en) 2001-09-13 2003-03-20 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral rna molecules within a cell
WO2003027298A1 (en) 2001-09-27 2003-04-03 Timothy Albert Holton Stem-loop vector system
US20030148519A1 (en) 2001-11-14 2003-08-07 Engelke David R. Intracellular expression and delivery of siRNAs in mammalian cells
GB0130955D0 (en) 2001-12-24 2002-02-13 Cancer Res Ventures Expression system
US20040022748A1 (en) 2002-03-12 2004-02-05 Unilever Home & Personal Care Usa, Division Of Conopco, Inc. Method of enhancing skin lightening
BR0308424A (pt) 2002-03-14 2005-02-22 Commw Scient Ind Res Org Métodos e meios para infra-regular eficientemente a expressão de qualquer gene de interesse em células e organismos eucarióticos
ITRM20020253A1 (it) 2002-05-08 2003-11-10 Univ Roma Molecole chimeriche di snrna con sequenze antisenso per le giunzioni di splicing del gene della distrofina e applicazioni terapeutiche.
US20040106566A1 (en) 2002-05-17 2004-06-03 Shi-Lung Lin RNA-splicing and processing-directed gene silencing and the relative applications thereof
AU2003297474A1 (en) 2002-12-18 2004-07-14 Salk Institute For Biological Studies Methods of inhibiting gene expression by rna interference
CN1750752A (zh) 2003-02-19 2006-03-22 联邦科学和工业研究组织 使用短dsRNA序列在植物中进行有效的基因沉默
CA2568603A1 (en) 2003-09-12 2005-03-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Modified gene-silencing nucleic acid molecules and uses thereof
WO2007128052A1 (en) 2006-05-03 2007-11-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved gene silencing methods
WO2009109937A1 (en) * 2008-03-05 2009-09-11 Nxp B.V. Dynamic mbsfn area configuration method in consideration of radio resource efficiency and system thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP1071762A4 (en) 2003-09-24
AU2008249157B2 (en) 2011-03-03
US20040237145A1 (en) 2004-11-25
KR101085210B1 (ko) 2011-11-21
KR20100039457A (ko) 2010-04-15
JP2005323615A (ja) 2005-11-24
SK287538B6 (sk) 2011-01-04
NZ547283A (en) 2008-06-30
CN101818145A (zh) 2010-09-01
AU743316C (en) 2005-09-15
KR20010042069A (ko) 2001-05-25
DK1624060T3 (da) 2012-04-10
JP2002507416A (ja) 2002-03-12
ATE526405T1 (de) 2011-10-15
EP1857549A3 (en) 2007-12-05
AU3564702A (en) 2002-06-13
ZA200004507B (en) 2001-12-24
BRPI9908967B1 (pt) 2017-05-30
CA2323726A1 (en) 1999-09-30
CZ20003346A3 (cs) 2001-03-14
HK1035742A1 (en) 2001-12-07
US20060014715A1 (en) 2006-01-19
JP2008073055A (ja) 2008-04-03
AU2008249157A1 (en) 2008-12-11
EP1624060B1 (en) 2011-09-28
JP4187737B2 (ja) 2008-11-26
US9963698B2 (en) 2018-05-08
GB2353282B (en) 2003-06-04
SG115493A1 (en) 2005-10-28
HUP0101225A1 (hu) 2001-08-28
AU2005209648B2 (en) 2008-08-21
US20030074684A1 (en) 2003-04-17
NZ506648A (en) 2003-08-29
EP1857549B1 (en) 2018-10-17
EP1624060A3 (en) 2006-04-26
EP1555317A1 (en) 2005-07-20
JP4460600B2 (ja) 2010-05-12
US20040064842A1 (en) 2004-04-01
GB2353282A (en) 2001-02-21
GB2353282A8 (en) 2008-06-23
AU2005209648A1 (en) 2005-10-06
AU2916399A (en) 1999-10-18
CN1294631A (zh) 2001-05-09
CA2513336A1 (en) 1999-09-30
HU230353B1 (hu) 2016-02-29
AU743316B2 (en) 2002-01-24
HUP0101225A3 (en) 2004-08-30
JP2009219504A (ja) 2009-10-01
EP1555317B1 (en) 2011-09-28
EP2302057B1 (en) 2019-02-20
EP1624060A2 (en) 2006-02-08
AU2005202658A1 (en) 2005-07-14
JP4981103B2 (ja) 2012-07-18
US20140193856A1 (en) 2014-07-10
JP4187413B2 (ja) 2008-11-26
KR20060030526A (ko) 2006-04-10
GB0024727D0 (en) 2000-11-22
KR101054060B1 (ko) 2011-08-04
US7754697B2 (en) 2010-07-13
AU2005211538B2 (en) 2008-07-24
SG141233A1 (en) 2008-04-28
US8168774B2 (en) 2012-05-01
EP1071762A1 (en) 2001-01-31
WO1999049029A1 (en) 1999-09-30
ES2374534T3 (es) 2012-02-17
BR9908967A (pt) 2000-12-19
AU2005211538A1 (en) 2005-10-13
CN1796556A (zh) 2006-07-05
ATE526406T1 (de) 2011-10-15
CA2487328A1 (en) 1999-09-30
PL343064A1 (en) 2001-07-30
GB2353282C (en) 2013-02-27
AU2005211538C1 (en) 2014-02-13
EP2302057A1 (en) 2011-03-30
AU2005202658B2 (en) 2008-08-21
CA2323726C (en) 2005-02-08
EP1857549A2 (en) 2007-11-21
CZ295108B6 (cs) 2005-05-18
ES2374290T3 (es) 2012-02-15
US20120277285A1 (en) 2012-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK13722000A3 (sk) Kontrola génovej expresie
MXPA00008631A (en) Control of gene expression

Legal Events

Date Code Title Description
TA4A Addition of inventor(s)
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20170319