CN113980996A - 蛋白gen1及其相关生物材料在调控玉米产量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蛋白GEN1及其相关生物材料在调控玉米产量中的应用。蛋白GEN1为如下任一所示蛋白质：(a1)氨基酸序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.6所示的蛋白质；(a2)将SEQ ID No.3或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。蛋白GEN1可用于调控植物产量、调控植物花粉育性或用于植物育种。

Description

蛋白GEN1及其相关生物材料在调控玉米产量中的应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其是涉及蛋白GEN1及其相关生物材料在调控玉米产量中的应用。

背景技术

玉米(Zea mays)是世界上三大主要粮食作物之一，同时也是重要的饲料来源，是农业生产中非常重要的禾本科作物。玉米是主要栽培作物中最独特的具有强大雄花序的作物，由于雌雄同株、风媒传粉等作物性状特点以及长期生存竞争的自然选择使玉米拥有远远超过正常授粉所需要的花粉量。玉米雄性生殖细胞发育最终形成的花粉是由光合初级产物转化而形成的“库”，在产生过程中需要大量的光合能量消耗，在光合能量消耗上会对后期形成籽粒所需的光合产物产生影响。多年来，育种家们一直注重于提高玉米的产量以及对其品质质量进行改良。但玉米中过量的花粉并不是必需的，雄穗作为光合产物的“库源”中的“库”，如果消耗太多光合产物，那么向同样是“库”的雌穗运送的光合产物就相对变少，最终会影响玉米的产量。

在花粉发育的这一系列过程中涉及到众多相关基因，只有它们按照一定的时空顺序正常表达，才能保证可育花粉的形成。在前人的研究中，关于花粉育性的研究基本都是以表现为完全败育的突变体为主，虽然其对挖掘和创制新型细胞核雄性不育系，并进一步将其应用于杂交育种中是十分有意义的，但都无法准确评估其对产量的影响。

发明内容

本发明的目的之一在于提供降低植物中蛋白GEN1的含量和/或活性或者抑制植物中编码蛋白GEN1的核酸分子表达的物质的应用。

本发明提供了降低植物中蛋白质的含量和/或活性或者抑制植物中编码所述蛋白质的核酸分子表达的物质的应用，所述应用为如下任一种应用：

B1)在提高植物产量中的应用；B2)在降低植物花粉育性中的应用；B3)在植物育种中的应用；

所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：

(a1)氨基酸序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.6所示的蛋白质；(a2)将SEQ IDNo.3或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

将所述蛋白质命名为蛋白GEN1。将编码蛋白GEN1的核酸分子命名为GEN1基因。

可选地，根据上述的应用，所述抑制植物中编码蛋白GEN1的核酸分子表达的物质为CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统如下任一种：

(b1)包括特异sgRNA，所述特异sgRNA的靶位点序列如SEQ ID No.1第812-830位和/或第860-878位所示，或者所述特异sgRNA的靶位点序列如SEQ ID No.4第735-753位和/或第770-788位所示；(b2)包括特异DNA分子，所述特异DNA分子转录得到所述特异sgRNA；(b3)包括具有所述特异DNA分子的质粒；(b4)包括特异重组质粒，所述特异重组质粒表达所述特异sgRNA。

所述特异DNA分子序列可为SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示。

本发明还提供了DNA分子，所述DNA分子的序列为SEQ ID No.1中的第828-862位缺失，其它核苷酸保持不变的序列；或所述DNA分子的序列为SEQ ID No.4中的第758-785位缺失，其它核苷酸保持不变的序列。

本发明还提供了植物育种的方法，所述方法为M1、M2或M3。

M1包括抑制出发植物中蛋白GEN1的编码基因的表达和/或抑制或降低蛋白GEN1的含量和/或活性，得到具有下述至少一种特性的目的植物：

1)与所述出发植物相比，所述目的植物产量增加；2)与所述出发植物相比，所述目的植物花粉育性降低。

M2包括采用蛋白GEN1的编码基因表达水平低于玉米自交系B104或W22的玉米自交系作为亲本，培育花粉育性降低和/或产量增加的玉米品种和/或品系。

M3包括采用上述的DNA分子替换玉米基因组DNA中的GEN1基因，得到花粉育性降低和/或产量增加的玉米。

所述蛋白GEN1的编码基因表达水平低于玉米自交系B104或W22的玉米自交系可为下述实施例所制备的GEN1A-UFMu-07233-aaBB、GEN1B-UFMu-03630-AAbb、crispr-genla-aa或crispr-gen1b-bb。

M3中，所述替换为纯合型替换，即同源染色体中发生相同的替换。例如，采用下述实施例中的a基因替换玉米基因组DNA中的GEN1A基因，得到花粉育性降低和/或产量增加的玉米。又例如，采用下述实施例中的b基因替换玉米基因组DNA中的GEN1B基因，得到花粉育性降低和/或产量增加的玉米。

本发明还提供了检测或辅助检测植物花粉育性的方法，包括检测待测植物GEN1基因是否为突变基因，含有所述突变基因的待测植物的花粉育性低于不含有所述突变基因的待测植物的花粉育性，或含有所述突变基因的待测植物的产量高于不含有所述突变基因的待测植物的产量。

所述GENl突变基因可为GEN1A野生型基因(序列如SEQ ID No.1所示)或GEN1B野生型基因(序列如SEQ ID No.4所示)发生突变获得的基因，所述突变为缺失突变和/或插入突变和/或能够导致基因功能缺失的其他突变。具体可为GEN1A野生型基因或GEN1B野生型基因外显子发生突变获得的基因，例如下述实施例中的a1基因基因或b1基因。

本发明还提供了检测SNP位点的多态性或基因型的物质的应用，所述应用为如下任一种：

(1)在鉴定或辅助鉴定玉米产量中的应用；(2)在制备鉴定或辅助鉴定玉米产量产品中的应用；(3)在鉴定或辅助鉴定玉米花粉育性中的应用；(4)在制备鉴定或辅助鉴定玉米花粉育性产品中的应用；(5)在玉米育种中的应用；

所述SNP位点是玉米基因组中的一个SNP位点，位于玉米第2号染色体上序列如SEQID No.1所示片段的第2057位核苷酸，其核苷酸种类为T或C。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定玉米花粉育性的方法，包括检测待测玉米SNP位点的基因型，根据待测玉米的基因型鉴定或辅助鉴定玉米花粉育性；所述基因型为TT基因型或CC基因型；所述TT基因型表示上述的SNP位点的核苷酸种类为T的纯合型；所述CC基因型表示上述的SNP位点的核苷酸种类为C的纯合型。

本发明还提供了含有上述检测SNP位点的多态性或基因型的物质的产品，为如下任一种产品：

C1)检测与玉米产量相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；C2)鉴定或辅助鉴定玉米产量的产品；C3)检测与玉米花粉育性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；C4)鉴定或辅助鉴定玉米花粉育性的产品；C5)用于玉米育种的产品。

所述检测SNP位点的多态性或基因型的物质可为MaizeSNP50 Beadchip(Illumina)。

所述检测SNP位点的多态性或基因型的物质也可为如下D1)、D2)或D3)：

D1)所述检测SNP位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述SNP位点在内的玉米基因组DNA片段的PCR引物，例如序列如SEQ ID No.9和/或SEQ ID No.10的PCR引物；D2)所述检测SNP位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。

本发明还提供了蛋白GEN1或其相关生物材料、上述的DNA分子的应用，所述应用为如下任一种应用，

A1)在调控植物籽粒产量中的应用；A2)在调控植物花粉育性中的应用；A3)在植物育种中的应用；

所述相关生物材料为所述生物材料为下述任一种：

c1)编码蛋白GEN1的核酸分子；c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官。

可选地，根据上述的应用，所述编码蛋白GEN1的核酸分子为如下d1)或d2)或d3)或d4)所示的DNA分子：

d1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的DNA分子；d2)编码序列是序列表中SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5所示的DNA分子；d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于玉米且编码蛋白GEN1的DNA分子；d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码蛋白GEN1的DNA分子。

上文中，所述产量可为籽粒粒重。

上文中，所述降低植物中蛋白GEN1含量和/或活性的物质可为敲除中蛋白GEN1的编码基因的物质和/或调控蛋白GEN1的编码基因表达的物质。

所述调控蛋白GEN1的编码基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

所述调控蛋白GEN1的编码基因表达可为抑制蛋白GEN1的编码基因表达，所述抑制蛋白GEN1的编码基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

所述基因敲除(gene knockout)是指通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

上文中，所述抑制植物中编码蛋白GEN1的核酸分子表达的物质可为抑制或降低所述核酸分子表达的试剂。所述抑制或降低所述核酸分子表达的试剂可为敲除所述核酸分子的试剂，如通过同源重组敲除所述核酸分子的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述核酸分子的试剂。所述抑制或降低所述核酸分子表达的试剂可以包含靶向所述核酸分子的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

上文中，术语“同一性”指与天然序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述生物材料中，所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

上文中，植物可为单子叶植物、禾本科植物或玉米。

本发明实施例利用玉米花粉育性的自然变异，在玉米关联群体中对花粉育性进行了测定，发现玉米在花粉育性上具有广泛的自然变异。利用MLM模型对花粉育性性状进行GWAS分析，挖掘到一个与玉米花粉育性呈现极显著相关的候选基因，即本发明中所涉及的一种参与有丝分裂中DNA损伤修复途径蛋白GEN1，并对其进行了基因的验证和功能解析。

本发明实施例中的UnifromMu插入突变体及转基因敲除突变体表型统计结果表明：编码蛋白GEN1的GEN1A基因和GEN1B基因在调控花粉育性中起重要作用，GEN1A基因和GEN1B基因具有调控玉米花粉育性以及玉米产量的功能，并且在杂交种选育的生产实践中可以显著提高杂交种产量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

采用EXCEL统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值表示，采用T-test检验。

本发明中所涉及W22突变体在玉米基因组公共数据库中(www.maizeGDB.org)可获得。

pBUE411载体记载于如下文献中：Xing，H.L.，Dong，L.，Wang，Z.P.，Zhang，H.Y.，Han，C.Y.，Liu，B.，Wang，X.C.，and Chen，Q.J.(2014).A CRISPR/Cas9 toolkit formultiplex genome editing in plants.BMC plant biology 14，327.

玉米B104记载于如下文献中：Char，S.N.，Neelakandan，A.K.，Nahampun，H.，Frame，B.，Main，M.，Spalding，M.H.，Becraft，P.W.，Meyers，B.C.，Walbot，V.，Wang，K.，Yang，B.(2016).An Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9system for high-frequencytargeted mutagenesis in maize.Plant biotechnology joumal，15(2)，257-268.

玉米W22记载于如下文献中：Huang C，Chen Q，Xu G，Xu D，Tian J，TianF.Identification and fine mapping of quantitative trait loci for the numberof vascular bundle in maize stem.J Integr Plant Biol.2016Jan；58(1)：81-90.doi：10.1111/jipb.12358.Epub 2015Jul 16.PMID：25845500；PMCID：PMC5034846。

实施例1、GEN1A的SNP位点挖掘

利用324份具有广泛变异的玉米自交系组成的关联群体，2015年于海南播种，每行播种10粒，三个地块重复，在玉米雄穗抽雄之后到开始散粉之前，在同一家系的单行中选取三株长势较为均匀一致的单株，在每个单株主轴雄穗二分之一处取2对小花穗，每个家系共取6对小花穗，保存在装有FAA固定液的2ml离心管中。

混取上述采用FAA固定液固定的小花穗中来自同一家系不同植株的10个花药，将其放入含有0.9ml纯水和一个小玻璃珠的2ml离心管中，经过打样机的震荡破碎(1200rpm，2分钟)，花药壁破裂，花粉粒充分进入溶液中，加入预热的1ml 0.2％的琼脂糖溶液和0.1ml的碘-碘化钾溶液(I2-KI)染色，充分摇匀。试验优化结果表明，花粉粒经过摇匀，可以均匀分布在0.1％的琼脂糖溶液中。利用移液器随机吸取20ul溶液滴定至载玻片，在体视镜下进行观察以及可育花粉和败育花粉的计数。采用公式：花粉育性＝(可育花粉数/(可育花粉数+败育花粉数))计算出花粉育性。每次观察至少包括三次技术重复和三次生物重复。

利用混合线性模型(MLM)对上述324份的花粉育性表型的值进行GWAS分析，挖掘到一个与玉米花粉育性呈现显著相关的SNP位点，这个SNP位于基因Zm00001d006168(GEN1A)上。该SNP位点位于GEN1A的基因区域，具体位于玉米第2号染色体的第200359295位(参考的玉米基因组网址：www.maizeGDB.org及v4版本)，对应于SEQ ID No.1中第2057位，该处核苷酸类型为C或T，该位点基因型为CC的自交系花粉育性显著低于基因型为TT的自交系(P＝3.21×10^-8)。该SNP位点命名为SNP_2057。SEQ ID No.1中，y为c或T。

GEN1A基因编码一种皮瓣内切酶蛋白，参与DNA修复途径。结果表明，DNA修复途径中的遗传变异可能在很大程度上导致了花粉生存能力的自然变异。

玉米基因组中有两个GEN1基因，分别称为GEN1A(ZmZ00001d006168)和GEN1B(Zm00001d021204)。GEN1A和GEN1B之间的完整蛋白质序列具有93％的相似性。实时定量RT-PCR的表达分析显示，尽管GEN1A和GEN1B的表达模式相似，但GEN1A的表达水平均高于GEN1B。

GEN1A(Zm00001d006168)基因位于2号染色体上，全长4713bp，共有8个外显子，编码636个氨基酸。GEN1A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，该蛋白的CDS如SEQ ID No.2所示。序列如SEQ ID No.1所示的GEN1A基因在下述实施例中被称为GEN1A野生型基因。

GEN1B(Zm00001d021204)基因位于7号染色体上，全长4979bp，共有8个外显子，编码638个氨基酸。GEN1B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，GEN1B基因表达的蛋白的CDS如SEQ ID No.5所示，其表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。序列如SEQ ID No.4所示的GEN1B基因在下述实施例中被称为GEN1B野生型基因。

另外，对关联群体中110份玉米自交系进行了重测序分析，并没有鉴定到任何能导致GEN1基因缺失突变的自然变异，说明在自然群体中不存在该基因的缺失突变体。

实施例2、SNP_2057在检测花粉育性中的应用

按照实施例1中的检测方法对表1中的自交系材料(表1中的自交系材料记载于Yang X，Gao S，Xu S，Zhang Z，Prasanna BM，Lin L，Li J，Yan J(2011)Characterizationof aglobal germplasm collection and its potential utilization for analysis ofcomplex quantitative traits in maize.Molecular Breeding 28：511-526)进行花粉育性检测，表l中的自交系材料SNP_2057位点的基因型通过MaizeSNP50 Beadchip(Illumina)进行检测。

SNP_2057位点也可采用PCR扩增和测序检测自交系SNP基因型。检测方法如下。

SNP基因型鉴定引物：

GEN1A-SNP-F：GTGCAGTTATTTGATGAGGATG(SEQ ID No.9)；

GEN1A-SNP-R：CTGGTGTTACTACTAACCTAC(SEQ ID No.10)。

采用左引物GEN1A-SNP-F、右引物GEN1A-SNP-R鉴定自交系材料SNP位点基因型。以自交系基因组DNA为模板，用GEN1A-SNP-F与GEN1A-SNP-R扩增出1560bp长度的条带，然后进行sanger测序。若测序结果在扩增片段第367bp处碱基为T，则该自交系的SNP_2057位点的核苷酸种类为T的纯合型，用TT基因型表示；若测序结果在扩增片段第367bp处碱基为C，则该自交系的SNP_2057位点的核苷酸种类为C的纯合型，用CC基因型表示；若某些自交系没有检测出此位点基因型，则用NN基因型表示此自交系的这个SNP位点没有数据。

检测结果见表1，其中，TT基因型表示SNP_2057位点的核苷酸种类为T的纯合型，CC基因型表示SNP_2057位点的核苷酸种类为C的纯合型，NN基因型表示此自交系的这个SNP位点没有数据。结果显示，该位点基因型为CC的自交系花粉育性低于基因型为TT的自交系。因此，检测SNP_2057位点基因型可用于检测或辅助检测花粉育性。

表1花粉育性与基因型信息

实施例3、采用W22背景的突变体验证GEN1基因功能

UFMu-07233纯合突变体和UFMu-03630纯合突变体均由玉米基因组公共数据库中(www.maizeGDB.org)提供，UFMu-07233为以玉米W22近交系为背景的位于GEN1A基因第二外显子的Unifrom Mu插入突变体，UFMu-03630为以玉米W22近交系为背景的位于GEN1B基因第一外显子的Unifrom Mu插入突变体。

以野生型W22材料为轮回亲本，将从玉米基因组公共数据库中获得的UFMu-07233纯合突变体和UFMu-03630纯合突变体作为供体亲本，在授粉期取W22的雄穗花粉，人工给获得的UFMu-07233纯合突变体和UFMu-03630纯合突变体雌穗分别授粉，得到BC1F1材料；再将BC1F1材料播种，在授粉期取W22的雄穗花粉，人工给BC1F1材料雌穗授粉，得到BC2F1材料；再将BC2F1材料播种，在授粉期取W22的雄穗花粉，人工给BC2F1材料雌穗授粉，得到BC3F1材料，以UFMu-07233纯合突变体为供体亲本获得的BC3F1材料为BC3F1-GEN1A，以UFMu-03630纯合突变体为供体亲本获得的BC3F1材料为BC3F1-GEN1B；再将BC3F1材料播种，授粉期取BC3F1-GEN1B的雄穗花粉，人工给BC3F1-GEN1A材料的雌穗授粉，得到UFMu-07233-BC3F1-GEN1A×UFMu-03630-BC3F1-GEN1B杂交材料；再将杂交材料播种，授粉期人工套袋自交授粉，最终得到(UFMu-07233-BC3F1-GEN1A×UFMu-03630-BC3F1-GEN1B)-F2突变体材料。通过以下基因型鉴定方法，选择具有纯合突变基因型的突变体材料用于表型分析。

鉴定(UFMu-07233-BC3F1-GEN1A×UFMu-03630-BC3F1-GEN1B)-F2突变体材料的基因型。材料的基因组DNA分别使用如下四种引物组合进行PCR扩增：MuTIR、GEN1A-UFMu-07233-F和GEN1A-UFMu-07233-R；GEN1A-UFMu-07233-F和GEN1A-UFMu-07233-R；MuTIR、GEN1B-UFMu-03630-F和GEN1B-UFMu-03630-R；GEN1B-UFMu-03630-F和GEN1B-UFMu-03630-R。其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

基因型鉴定引物分别为：

左引物GEN1A-UFMu-07233-F：TCCCTGTGTTCGTGGTGGAC

右引物GEN1A-UFMu-07233-R：CTTGCAATTCGATCTGAGGA

左引物GEN1B-UFMu-03630-F：AGAAACGGAGAGAAAGAG

右引物GEN1B-UFMu-03630-R：CACCACGAACACAGGGAACA

MuTIR：AGAGAAGCCAACGCCAWCGCCTCYATTTCGTC。

将玉米W22 GEN1A野生型基因(SEQ ID No.1中第2057位为C)简称为A。将UFMu-07233中的GEN1A突变基因命名为a1，即该GEN1A突变基因为GEN1A野生型基因第2外显子的“GTGCGT”碱基处(即SEQ ID No.1所示序列的第906位后)插入了转座子(序列如SEQ IDNo.11所示)，该突变导致GEN1A基因mRNA相应于SEQ ID No.2自5’末端起第392位开始停止转录，从而引起了提前终止，造成GEN1A蛋白功能缺失。将玉米W22 GEN1B野生型基因简称为B。将UFMu-03630中的GEN1B突变基因命名为b1，即该GEN1B突变基因为GEN1B野生型基因第1外显子的“ACCTCT”碱基处(即SEQ ID No.4所示序列的第239位后)插入了转座子，该突变导致GEN1B基因mRNA相应于SEQ ID No.5自5’末端起第91位开始停止转录，从而引起了提前终止，造成GEN1B蛋白功能缺失。

引物组合MuTIR、GEN1A-UFMu-07233-F和GEN1A-UFMu-07233-R扩增出条带，引物组合MuTIR、GEN1B-UFMu-03630-F和GEN1B-UFMu-03630-R扩增出条带，引物组合GEN1A-UFMu-07233-F和GEN1A-UFMu-07233-R没有扩增出条带，引物组合GEN1B-UFMu-03630-F和GEN1B-UFMu-03630-R没有扩增出条带，则该子代植株的基因型为a1a1b1b1，该基因型表示该植株基因组中2条同源染色体中的GEN1A基因均为a1基因，GEN1B基因均为b1基因。该子代植株命名为GEN1A-UFMu-07233×GEN1B-UFMu-03630-aabb突变体。

引物组合MuTIR、GEN1A-UFMu-07233-F和GEN1A-UFMu-07233-R没有扩增出条带，引物组合MuTIR、GEN1B-UFMu-03630-F和GEN1B-UFMu-03630-R没有扩增出条带，引物组合GEN1A-UFMu-07233-F和GEN1A-UFMu-07233-R扩增出727bp条带，引物组合GEN1B-UFMu-03630-F和GEN1B-UFMu-03630-R扩增出538bp条带，则该子代植株的基因型为AABB，该基因型表示该植株基因组中2条同源染色体中的GEN1A基因均为A基因，GEN1B基因均为B基因。该子代植株命名为GEN1A-UFMu-07233×GEN1B-UFMu-03630-AABB。

引物组合MuTIR、GEN1A-UFMu-07233-F和GEN1A-UFMu-07233-R没有扩增出条带，引物组合MuTIR、GEN1B-UFMu-03630-F和GEN1B-UFMu-03630-R扩增出条带，引物组合GEN1A-UFMu-07233-F和GEN1A-UFMu-07233-R扩增出727bp条带，引物组合GEN1B-UFMu-03630-F和GEN1B-UFMu-03630-R没有扩增出条带，则该子代植株的基因型为AAb1b1，该基因型表示该植株基因组中2条同源染色体中的GEN1A基因均为A基因，GEN1B基因均为b1基因。该子代植株命名为GEN1B-UFMu-03630-AAbb突变体。

引物组合MuTIR、GEN1A-UFMu-07233-F和GEN1A-UFMu-07233-R扩增出条带，引物组合MuTIR、GEN1B-UFMu-03630-F和GEN1B-UFMu-03630-R没有扩增出条带，引物组合GEN1A-UFMu-07233-F和GEN1A-UFMu-07233-R没有扩增出条带，引物组合GEN1B-UFMu-03630-F和GEN1B-UFMu-03630-R扩增出538bp条带，则该子代植株的基因型为a1alBB，该基因型表示该植株基因组中2条同源染色体中的GEN1A基因均为a1基因，GEN1B基因均为B基因。该子代植株命名为GEN1A-UFMu-07233-aaBB突变体。

分别分离出GEN1A-UFMu-07233-aaBB突变体、GEN1B-UFMu-03630-AAbb突变体、GEN1A-UFMu-07233×GEN1B-UFMu-03630-aabb突变体和GEN1A-UFMu-07233×GEN1B-UFMu-03630-AABB，对其进行表型分析。

GEN1A-UFMu-07233×GEN1B-UFMu-03630-aabb突变体于幼苗期致死。

表型分析如表2和表3。

表2花粉育性统计

表3粒重统计

结果显示，与GEN1A-UFMu-07233×GEN1B-UFMu-03630-AABB的花粉育性相比，GEN1A-UFMu-07233-aaBB的花粉育性降低14.41％左右，GEN1B-UFMu-03630-AAbb花粉育性降低7.5％左右，而雌穗育性没有显著变化，GEN1A突变基因和GEN1B突变基因均会导致花粉育性降低。且在果穗穗粒数基本无显著差异的情况下，与GEN1A-UFMu-07233×GEN1B-UFMu-03630-AABB的百粒重相比，GEN1A-UFMu-07233-aaBB百粒重产量大约提高了6.1％，GEN1B-UFMu-03630-AAbb百粒重产量大约提高了5.4％，GEN1A突变基因和GEN1B突变基因提升了果穗产量。

实施例4、基因敲除实验

1、GEN1A基因的缺失突变体(crispr-gen1a-aa)的获得

通过CRISPR-Cas9基因敲除技术，结合玉米基因遗传转化方法，创制了一个玉米GEN1A基因的缺失突变体(crispr-gen1a-aa)，突变位点位于GEN1A基因第二个外显子的118bp处，是由35个碱基的缺失引起的蛋白编码错义突变。

具体步骤如下：

1)sgRNA序列的选择

在玉米GEN1A基因上设计靶位点序列，长度为19bp。

靶位点1位于GEN1A基因序列自5’末端起第812-830位，靶位点1序列如下：

5'-GCCGCGTTGCCGGTCACTG-3’。

靶位点2位于GEN1A基因序列自5’末端起第860-878位，靶位点2序列如下：

5'-GTCAAAAAGAGGAATGCTG-3’。

2)CRISPR/Cas9载体的构建

以pCBC-MT1T2载体为模板进行四引物PCR扩增，得到PCR产物，其为带有双靶位点结合区的DNA片段，该DNA片段的序列如SEQ ID No.7所示，其中，自5’末端第17-35位为靶位点1结合区序列，第36-111位为cas9蛋白结合区域序列，第112-402位为OsU3t蛋白编码序列，第403-926位为TaU3p蛋白编码序列，第927-945位为靶位点2结合区序列。

引物序列如下：

GEN1A-MT1T2-F：5'-AATAATGGTCTCAGGCGGCCGCGTTGCCGGTCACTG-3’

GEN1A-MT1T2-F0：5'-GGCCGCGTTGCCGGTCACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’

GEN1A-MT1T2-R0：5'-CAGCATTCCTCTTTTTGACCGCTTCTTGGTGCC-3’

GEN1A-MT1T2-R：5'-ATTATTGGTCTCTAAACCAGCATTCCTCTTTTTGAC-3’。

将上述带有双靶位点结合区的DNA片段插入pBUE411载体中，得到CRISPR/Cas9-GEN1A载体。CRISPR/Cas9载体-GEN1A是在pBUE411载体的限制性内切酶BsaI识别位点GGTCTC(GAGACC)之后插入上述带有双靶位点结合区的DNA片段，保持pBUE411载体的其它核苷酸序列不变的载体。CRISPR/Cas9-GEN1A载体表达带有上述双靶位点结合区的sgRNA。

3)转基因玉米植株的获得

将CRISPR/Cas9-GEN1A载体通过液氮冷冻法转至农杆菌感受态细胞EHA105(购自北京奥森鼎信生物技术有限公司)，得到重组菌EHA105/CRISPR/Cas9-GEN1A。将重组菌EHA105/CRISPR/Cas9-GEN1A在28℃条件下扩繁，扩繁得到的菌液采用农杆菌侵染法侵染玉米B104幼胚，经过筛选、分化和生根后，获得T0代转基因玉米植株。

4)转基因玉米植株的鉴定

采集T0代转基因玉米植株叶片，并提取基因组DNA作为模板，用左引物GEN1A-CAS9-F和右引物GEN1A-CAS9-R引物进行PCR扩增，得到不同株系的PCR扩增产物。引物序列如下：

左引物GEN1A-CAS9-F：CTGCATTCTGCACTTGTC；

右引物GEN1A-CAS9-R：GAACTCACCACGCACTCCTCA。

将不同株系的PCR扩增产物进行Sanger测序，并将测序结果与野生型玉米GEN1A基因进行比对，鉴定T0代转基因玉米不同株系中GEN1A基因是否发生突变。

鉴定结果表明：1株T0代转基因玉米植株的GEN1A基因发生突变。GEN1A基因发生突变的植株即为阳性T0代转基因玉米，并将GEN1A基因发生缺失突变的植株记作GEN1A基因的缺失突变体(crispr-genla)。

GEN1A基因的缺失突变体(crispr-genla)的突变位点位于GEN1A基因第二个外显子的1 18bp处(即SEQ IDNo.1的第827位处)，是由35个碱基的缺失引起的蛋白编码错义突变。和野生型玉米B104相比，缺失突变体(crispr-genla)的GEN1A突变基因(以下简称a基因)是将野生型玉米B104基因组中的GEN1A野生型基因序列(SEQ ID No.1中第2057位为C)第828-862位缺失，且保持其他序列不变后得到的。

缺失序列为：CTGAGGCAGAGTCCAGTGCGGCCGCGGCACCGGTC。

将上述获得的阳性T0代转基因玉米crispr-genla自交获得子代植株，采用PCR扩增并结合琼脂糖凝胶电泳的方法鉴定子代植株的基因型。

鉴定方法具体如下：

采集子代植株叶片，并提取基因组DNA作为模板，用左引物GEN1A-CAS9-F和右引物GEN1A-CAS9-R引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

扩增产物条带大小为329bp的植株为野生型，即该植株两条同源染色体中的GEN1A基因均为GEN1A野生型基因。扩增产物条带大小为294bp的植株为突变体，即该植株两条同源染色体中的GEN1A基因均为a基因，该植株下述简称crispr-genla-aa。扩增产物同时存在329bp和294bp两条带的植株为杂合体，即该植株一条同源染色体中的GEN1A基因为GEN1A野生型基因，一条同源染色体中的GEN1A基因为a基因。

2、GEN1B基因的缺失突变体(crispr-gen1b-bb)的获得

通过CRISPR-Cas9基因敲除技术，结合玉米基因遗传转化方法，创制了一个玉米GEN1A基因的缺失突变体(crispr-gen1b-bb)，突变位点位于第二个外显子的125bp处，是由28个碱基的缺失引起的蛋白编码错义突变。具体步骤如下：

1)sgRNA序列的选择

在玉米GEN1B基因上设计靶位点序列，长度为19bp。

靶位点1位于GEN1B基因序列自5’末端起第735-753位，靶位点1序列如下：

5'-GCCGCGTTCCCGAGCACAG-3’。

靶位点2位于GEN1B基因序列自5’末端起第770-788位，靶位点2序列如下：

5'-GACCGCTGCACCGGTCAAA-3’。

2)CRISPR/Cas9载体的构建

以pCBC-MT1T2载体为模板进行四引物PCR扩增，得到PCR产物，其为带有双靶位点结合区的DNA片段，该DNA片段的序列如SEQ ID No.7所示，其中，自5’末端第17-35位为靶位点1结合区序列，第36-111位为cas9蛋白结合区域序列，第112-402位为OsU3t蛋白编码序列，第402-926位为TaU3p蛋白编码序列，第927-945位为靶位点2结合区序列。

引物序列如下：

GEN1B-MT1T2-F：5'-AATAATGGTCTCAGGCGGCCGCGTTCCCGAGCACAG-3’

GEN1 B-MT1T2-F0：5'-GGCCGCGTTCCCGAGCACAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’

GEN1 B-MT1T2-R0：5’-TTTGACCGGTGCAGCGGTCCGCTTCTTGGTGCC-3’

GEN1 B-MT1T2-R：5'-ATTATTGGTCTCTAAACTTTGACCGGTGCAGCGGTC-3’。

将上述带有双靶位点结合区的DNA片段插入pBUE411载体中，得到CRISPR/Cas9-GEN1B载体。CRISPR/Cas9载体-GEN1B是在pBUE411载体的限制性内切酶BsaI识别位点GGTCTC(GAGACC)之后插入上述带有双靶位点结合区的DNA片段，保持pBUE411载体的其它核苷酸序列不变的载体。CRISPR/Cas9-GEN1B载体表达带有上述双靶位点结合区的sgRNA。

3)转基因玉米植株的获得

将CRISPR/Cas9-GEN1B载体通过液氮冷冻法转至农杆菌感受态细胞EHA105(购自北京奥森鼎信生物技术有限公司)，得到重组菌EHA105/CRISPR/Cas9-GEN1B。将重组菌EHA105/CRISPR/Cas9-GEN1B在28℃条件下扩繁，扩繁得到的菌液采用农杆菌侵染法侵染玉米B104幼胚，经过筛选、分化和生根后，获得T0代转基因玉米植株。

4)转基因玉米植株的鉴定

采集T0代转基因玉米植株叶片，并提取基因组DNA作为模板，用左引物GEN1B-CAS9-F和右引物GEN1B-CAS9-R引物进行PCR扩增，得到不同株系的PCR扩增产物。引物序列如下：

左引物GEN1B-CAS9-F：TGTCTGCGATTCCTGCAGA

右引物GEN1B-CAS9-R：TCCCAGCATTGCCAAGACA。

将不同株系的PCR扩增产物进行Sanger测序，并将测序结果与野生型玉米GEN1B基因进行比对，鉴定T0代转基因玉米不同株系中GEN1B基因是否发生突变。

鉴定结果表明：10株T0代转基因玉米植株中，5株T0代转基因玉米植株的GEN1B基因发生突变。GEN1B基因发生突变的植株即为阳性T0代转基因玉米，并将GEN1B基因发生缺失突变的植株记作GEN1B基因的缺失突变体(crispr-gen1b)。

GEN1B基因的缺失突变体(crispr-genlb)的突变位点位于第二个外显子的125bp处(即SEQ ID No.4的第757位处)，是由28个碱基的缺失引起的蛋白编码错义突变。和野生型玉米B104相比，缺失突变体(crispr-genlb)GEN1B突变基因(以下简称b基因)是将野生型玉米B104基因组中的GEN1B野生型基因序列(SEQ ID No.4)第758-785位缺失，且保持其他序列不变后得到的。

缺失序列为：GGAGTCCAGTGTGACCGCTGCACCGGTC。

将上述获得的阳性T0代转基因玉米crispr-gen1b自交获得子代植株，采用PCR扩增并结合琼脂糖凝胶电泳的方法鉴定子代植株的基因型。

鉴定方法具体如下：

采集子代植株叶片，并提取基因组DNA作为模板，用左引物GEN1B-CAS9-F和右引物GEN1B-CAs9-R引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

扩增产物条带大小为243bp的植株为野生型，即该植株两条同源染色体中的GEN1A基因均为GEN1B野生型基因。扩增产物条带大小为215bp的植株为突变体，即该植株两条同源染色体中的GEN1B基因均为b基因，该植株下述简称crispr-gen1b-bb。扩增产物同时存在243bp和215bp两条带的植株为杂合体，即该植株一条同源染色体中的GEN1B基因为GEN1B野生型基因，一条同源染色体中的GEN1B基因为b基因。

3、性状分析

对crispr-gen1a-aa、crispr-gen1b-bb及未经过基因敲除的野生型B104(GEN1A/GEN1B-CAS9-AABB)进行花粉育性和粒重的表型统计，检测方法与实施例1的花粉育性检测方法相同。

检测结果如表4和表5所示。与野生型(GEN1A/GEN1B-CAS9-AABB)相比，crispr-genla-aa的花粉育性降低13.3％左右，crispr-gen1b-bb花粉育性降低7.83％左右，而雌穗育性没有显著变化。且在果穗穗粒数基本无显著差异的情况下，与GEN1A/GEN1B-CAS9-AABB的百粒重相比，crispr-gen1a-aa百粒重产量大约提高了14.6％，crispr-gen1b-bb百粒重产量大约提高了6.7％，GEN1A突变基因和GEN1B突变基因显著提高了果穗产量。

表4花粉育性统计

表5粒重统计

实施例5、杂交种性状分析

1、GEN1A突变体构建杂交种

利用以自交系W22为背景的GEN1A-UFMu-07233-aa(即实施例3制备的GEN1A-UFMu-07233-aaBB)和以玉米B104为背景crispr-gen1a-aa(即实施例4制备的crispr-gen1a-aa)构建了杂交种，且对其产量性状进行调查。

上述杂交种材料的具体制备方法如下：

利用实施例3中的GEN1A-UFMu-07233-aaBB纯合突变体作为供体亲本，在授粉期取实施例4中的crispr-gen1a-aa纯合突变体的雄穗花粉，人工给GEN1A-UFMu-07233-aaBB纯合突变体雌穗授粉，得到(GEN1A-UFMu-07233-aaBB×crispr-gen1a-aa)杂交种突变体，再将(GEN1A-UFMu-07233-aaBB×crispr-gen1a-aa)杂交种突变体播种，开放授粉获得(GEN1A-UFMu-07233-aaBB×crispr-gen1a-aa)-F2，对所结实的玉米棒子进行百粒重等产量性状调查。同时，利用实施例3中的GEN1A-UFMu-AABB纯合野生型(即实施例3制备的GEN1A-UFMu-07233×GEN1B-UFMu-03630-AABB)作为供体亲本，在授粉期取实施例4中的GEN1A/GEN1B-CAS9-AABB纯合野生型(即野生型B104)的雄穗花粉，人工给GEN1A-UFMu-AABB纯合野生型雌穗授粉，得到(GEN1A-UFMu-AABB×GEN1A/GEN1B-CAS9-AABB)杂交种野生型，再将(GEN1A-UFMu-AABB×GEN1A/GEN1B-CAS9-AABB)杂交种野生型播种，开放授粉获得(GEN1A-UFMu-AABB×GEN1A/GEN1B-CAS9-AABB)-F2，对所结实的玉米棒子进行百粒重等产量性状调查。

结果如表5所示，表明在杂交种GEN1A突变体的平均百粒重相比较于野生型杂交种提高了12.1％左右。

2、GEN1B突变体构建杂交种

利用以自交系W22为背景的GEN1B-UFMu-03630-bb(即实施例3制备的GEN1B-UFMu-03630-AAbb)和以玉米B104为背景crispr-gen1b-bb(即实施例4制备的crispr-gen1b-bb)构建了杂交种，且对其产量性状进行调查。

上述杂交种材料的具体制备方法如下：

利用实施例3中的GEN1B-UFMu-03630-AAbb纯合突变体作为供体亲本，在授粉期取实施例4中的crispr-gen1b-bb纯合突变体的雄穗花粉，人工给GEN1B-UFMu-03630-AAbb纯合突变体雌穗授粉，得到(GEN1B-UFMu-03630-AAbb×crispr-gen1b-bb)杂交种突变体，再将(GEN1B-UFMu-03630-AAbbxcrispr-gen1b-bb)杂交种突变体播种，开放授粉获得(GEN1B-UFMu-03630-AAbbxcrispr-gen1b-bb)-F2，对所结实的玉米棒子进行百粒重等产量性状调查。同时，利用实施例3中的GEN1A-UFMu-AABB纯合野生型(即实施例3制备的GEN1A-UFMu-07233×GEN1B-UFMu-03630-AABB)作为供体亲本，在授粉期取实施例4中的GEN1A/GEN1B-CAS9-AABB纯合野生型的雄穗花粉，人工给GEN1A-UFMu-AABB纯合野生型雌穗授粉，得到(GEN1A-UFMu-AABB×GEN1A/GEN1B-CAS9-AABB)杂交种野生型，再将(GEN1A-UFMu-AABB×GEN1A/GEN1B-CAS9-AABB)杂交种野生型播种，开放授粉获得(GEN1A-UFMu-AABB×GEN1A/GEN1B-CAS9-AABB)-F2，对所结实的玉米棒子进行百粒重等产量性状调查。

结果如表6所示，表明杂交种GEN1B突变体的平均百粒重相比较于野生型杂交种提高了6.5％。

表6百粒重统计

转基因敲除及Mutator突变体表型统计结果表明Zm00001d006168和Zm00001d021204调控了玉米花粉育性，且显著影响了玉米果穗产量。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 蛋白GEN1及其相关生物材料在调控玉米产量中的应用

<130> 211609

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4713

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

ccataggccc accacgaggg gcccgcgcgc taacgggaga ccgagagaac ccacaggcca 60

caacggcatc ggcaacgagg cagcccagcc ccagaagccg ccccgagccc cgcagattac 120

cggcggtcgg cgcaagtctg aactccccca cccaatctcc gccacggccg acgggagagg 180

gcagggacgg agagaaagag atgggcgtgg ggggcagctt ctgggacctg ctgaagccct 240

gcgcgcggca cgagggcgcg gggtacctac gcgggcgccg cgtcgccgtc gacctctcct 300

tctgggtcgt ctcccacacc accgccatcc gggcgcgctt gccgcgggca cggagcccgc 360

acctccggac caccttcttc cgcaccctct ccctcttcgc caaggtccgg tgccactggc 420

ggtgtccccc cccccccccc cccccccccc ccccgctttc ccacctctcc tctctctccg 480

cctccttcgc tcggctctcg ttcttcccct ctattgtctc tgccttccgc tcgtttcttg 540

atctcaccga ctaatgcgct gacctgcgtt tgggcgattc tgcaatctgc attctgcact 600

tgtcttttgg tttccaagat ttaatcttgc tggggctaat gactgcattg ctcgattttt 660

tggttcccgg attcacctgt ttccgctggg attgtctctg caattcctgc agatgggcgc 720

gttccctgtg ttcgtggtgg acggcgagcc gtcgccgctc aagtcgcagg cgagggcggc 780

ccgcttcttc cgaggctccg ggatggacct ggccgcgttg ccggtcactg aggcagagtc 840

cagtgcggcc gcggcaccgg tcaaaaagag gaatgctgca ttcacgcgag ccgttgagga 900

gtgcgtggtg agttcccggg tcttgccaat gtttgtgatc cttcattcaa tctagggttt 960

aattagggct tgcagagccg tccgcaatgt tcaacttttt tttgacgaat ctggaggggc 1020

cgaggcccct acagctttgc attaaaaagg aataaaagga tacataagtt taagacacaa 1080

tgtttaactg ttcatcacga gattgagcga ttcccaaccg ctgtagtgaa gatttctcat 1140

ctaacaccac aacatcttta cactagcttc ttgcttctta aatggtcggc aacaataatg 1200

ctgccgatga tacccactca tgtaattata tcatatatgc attgtttcaa atgctaattg 1260

atattctgta atttttagga actgcttgaa tatcttggaa tgcctgtatt gagggcaaac 1320

ggtgaagctg aagccctttg cgctcagctg aatagtgaag gtcatgtaga tgcttgcatc 1380

actgcagaca gtgatgcttt cctctatggg gctaagaccg tcgtaaaggt cctcagatcg 1440

aattgcaagg taaggactcc tctgtagttc tatgtccaca gcaggtgatt tgttttgttt 1500

tccatgtgca atagtttcaa gaccatgaac ttttcttcag gaaccatttg agtgctacca 1560

catagcagac attgagtctg gtcttggatt aaagaggaag caaatggtgg ccatggcgct 1620

ccttattggc agtgatcatg atttgcatgg ggtgcctggt tttggcctgg agactgcact 1680

tcgttttgtg cagttatttg atgaggatga aattttagat aagtatgtgt tgtacttgtt 1740

tttttcccta cagaataatc tcccccaatg ctgcattcat ggagctagtc atcttatatt 1800

tatacctctc caggttacat gaaattggta gaggggtgta tccattcgta gaaggatttg 1860

acaatgcaca tattgatgat ctcccatcat cgtccacaaa aagcccagtt gttaaattgc 1920

cgcactgctc acaatgtggc cacccaggca gcaagaaaaa tcatagcaag gatggctgca 1980

attattgttt ggtggattca ttagagaatt gcatggaaaa accaactgga ttcaaatgtg 2040

aatgtcctag ttgtgaygag gttggattta tattcattta attatccaaa tcctgttgat 2100

tctgatgcct tacagtatgt ttcaccttct cttttttcct tgaatggttt gtgatgaata 2160

attaccgcca cattaactgc acctttgtta tgactgttag gcacgtgagc taaaggaaca 2220

aagacgacat gaaaattggc aaatcaaggt ctgcaagaga atagctgctg agacaaattt 2280

tcctaacgac gagatcatta aattgtatct aagtgataac aatctggttg aaggtaagga 2340

aaaaagtatg gcccaattca ttagaaaaca tcattatgat tttttaagtg tttattgagt 2400

tgtagttttt ctttgatcaa ggttccaaat aagcatttgt ttatagtaaa aactcaaatt 2460

cgaacctgtt tgcagaaaag ggtgttccct tgcttacttg gaataaacct gatgttgaag 2520

ctttggtaga cttattaagt tacaagcaga attgggagcc atcttatatt cgccaaagca 2580

tgctccctat gttatcaacc atatacttaa gagaggttgc atcatctcca tctacaccat 2640

tgctcctttg tgaccaatat gaatttgatt caattcaacg gattaagata aagcacggtc 2700

acccgtatta cttggtaaaa tggaagagag ctacccgtgg tatgaattct attatgtcta 2760

gcaacaagcc agtaatggag ggagagacaa gtagcgaggt agtgttgttg gatgaagacg 2820

acgatttgga tgcagtggtt tgcgagtctc ctgagttatt agacgaacct gatgttccac 2880

aagtgcttat tgatgatggc tgctgctttg tattgacgga tgaagacatt caacttgttg 2940

gtgctgcttt tcctaaggaa acagcaaggt ttcaggaaga acaggtgtgc actggttgct 3000

ttcttcctat gatagtttga aatatgcatg actcttagtc acttacagga caactttaag 3060

actcttcgtg ctagcaatat ttcctcgctg catttagttt atcagaaaac atagaaccaa 3120

gtttcagttc aatctttgtg catttacttt tgtagatgat tatattcgat agctggattc 3180

gccacgttta tgttatgtgg cacaacttta cttctttgcc atatcggtag gttagtagta 3240

acaccagaca aacaaaatgg aagagcgcat ttatttagtt aatgcatgct tctattttag 3300

gctctgagtt gttttttttt gtgtagcatg gtgtttcatc gtttatttgt ggctgtttaa 3360

ttgaagaaac atccactggg gtgaattttg ttcactctag ctcacacatc cgcataactg 3420

ttgcagaggc tgaaagaagc acgatcaaga tcacggaaat ccaaatcaag cttagcagac 3480

agtgcgtgca agacacctga aggcccgaga cctagcgggg tgcagcttag catcacagag 3540

ttctaccgct cgaagaaagc gcagaacgta gaatctggga agaagccggc gggagaaggg 3600

cacgccgcga ggggaggctc gagaaaatcg tccgacaggg acctcgacaa gagcctgccg 3660

aagtctgttc ggcgccgcct cctcttcgat tgctgaggac taggtagcct ggcttttttt 3720

tggtgagcac tgcactgtaa tcttggtgcc actgctgtag atgacctagg gaatgcctta 3780

acctatttta gccggtgtag attgcgcgcg gcccattttg tacagggaac agagcatcgt 3840

ctttgtctaa gaggaaatga agcaggtctt agttcggaat ggtcatctga acctcatctt 3900

tgtctaagtg cttgggaact cagcttcgat tctaggaatg ggatgcgtgc cgctgctaga 3960

gcaatagctt ttttgtttta tgtctgcttt tgtgccggac aatagctgac agaattgatg 4020

tgatactaca gtatgcacaa cttttactcc cttagttcca aatttagttt caaaaattat 4080

gagatggtct ggttgttttg attttttttt aatctctaga tacattttgc ttatcacttt 4140

ttgtaatgat cttttttcat ggacacgttg gctcaacctt tgccccgctg cgacatgatc 4200

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cggagaccgt gagtcatcta atccttggta catcaagatg atttgatctt gtgtccaata 4620

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Gly His Val Gly Ala Cys Ile Thr Ala Asp Ser Asp Ala Phe Leu Phe

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580 585 590

Asp Met Glu Ser Gly Lys Lys Lys Gln Ala Gly Glu Gly His Ala Ala

595 600 605

Ala Arg Asp Gly Ser Arg Lys Ser Ser Asp Arg Asp Leu Asn Asn Lys

610 615 620

Ser Leu Pro Lys Ser Val Arg Arg Arg Leu Leu Phe Asp Cys

625 630 635

<210> 7

<211> 962

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atatatggtc tctggcgccg cgttgccggt cactggtttt agagctagaa atagcaagtt 60

aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttttt 120

tcgttttgca ttgagttttc tccgtcgcat gtttgcagtt ttattttccg ttttgcattg 180

aaatttctcc gtctcatgtt tgcagcgtgt tcaaaaagta cgcagctgta tttcacttat 240

ttacggcgcc acattttcat gccgtttgtg ccaactatcc cgagctagtg aatacagctt 300

ggcttcacac aacactggtg acccgctgac ctgctcgtac ctcgtaccgt cgtacggcac 360

agcatttgga attaaagggt gtgatcgata ctgcttgctg ctcatgaatc caaaccacac 420

ggagttcaaa ttcccacaga ttaaggctcg tccgtcgcac aaggtaatgt gtgaatatta 480

tatctgtcgt gcaaaattgc ctggcctgca caattgctgt tatagttggc ggcagggaga 540

gttttaacat tgactagcgt gctgataatt tgtgagaaat aataattgac aagtagatac 600

tgacatttga gaagagcttc tgaactgtta ttagtaacaa aaatggaaag ctgatgcacg 660

gaaaaaggaa agaaaaagcc atactttttt ttaggtagga aaagaaaaag ccatacgaga 720

ctgatgtctc tcagatgggc cgggatctgt ctatctagca ggcagcagcc caccaacctc 780

acgggccagc aattacgagt ccttctaaaa gctcccgccg aggggcgctg gcgctgctgt 840

gcagcagcac gtctaacatt agtcccacct cgccagttta cagggagcag aaccagctta 900

taagcggagg cgcggcacca agaagcgtca aaaagaggaa tgctggttta gagaccaata 960

at 994

<210> 8

<211> 962

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atatatggtc tctggcgccg cgttcccgag cacaggtttt agagctagaa atagcaagtt 60

aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttttt 120

tcgttttgca ttgagttttc tccgtcgcat gtttgcagtt ttattttccg ttttgcattg 180

aaatttctcc gtctcatgtt tgcagcgtgt tcaaaaagta cgcagctgta tttcacttat 240

ttacggcgcc acattttcat gccgtttgtg ccaactatcc cgagctagtg aatacagctt 300

ggcttcacac aacactggtg acccgctgac ctgctcgtac ctcgtaccgt cgtacggcac 360

agcatttgga attaaagggt gtgatcgata ctgcttgctg ctcatgaatc caaaccacac 420

ggagttcaaa ttcccacaga ttaaggctcg tccgtcgcac aaggtaatgt gtgaatatta 480

tatctgtcgt gcaaaattgc ctggcctgca caattgctgt tatagttggc ggcagggaga 540

gttttaacat tgactagcgt gctgataatt tgtgagaaat aataattgac aagtagatac 600

tgacatttga gaagagcttc tgaactgtta ttagtaacaa aaatggaaag ctgatgcacg 660

gaaaaaggaa agaaaaagcc atactttttt ttaggtagga aaagaaaaag ccatacgaga 720

ctgatgtctc tcagatgggc cgggatctgt ctatctagca ggcagcagcc caccaacctc 780

acgggccagc aattacgagt ccttctaaaa gctcccgccg aggggcgctg gcgctgctgt 840

gcagcagcac gtctaacatt agtcccacct cgccagttta cagggagcag aaccagctta 900

taagcggagg cgcggcacca agaagcgacc gctgcaccgg tcaaagttta gagaccaata 960

at 994

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgcagttat ttgatgagga tg 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctggtgttac tactaaccta c 21

<210> 11

<211> 1426

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 11

tcggcaggcg agataattgt cattatagac gaagagcgga cgggattcga cgaaatggag 60

gcgatggcgt tggcttctct gttctggaaa cgcagacgac agccaaacgc caaaacggaa 120

aggagacagc gcttggagct gtgtaaacag gtattagtct cctgtccccg tttaccgttc 180

gcctgcgcag acgccgtctg gcatactcct ctctacgccg tctcttcttg cggctgctct 240

cggggtcggc ctgctcgcaa tacctgtttt gacacaagca gcgccggagc gggccgcgca 300

ggttggcctc gaacagcccc gtgatcttgc gctcgcgttg aacgcgccac ggtgcgcagg 360

ttggccacgg ctcgcccgcg atctgcgtgg ccctggcgtg cgcggcctcc aggtcccccg 420

agaagccctt catgaacatc ttctgcagca cggtggcgcc cacgacgagc gggaacacgg 480

cgaggagcac gagcgcgagg cgcactggag gacgaacccc gcggtgtcag gccaccagca 540

tcagcgccga gttctggacg atgacggaga tgcggtcccc gatggcggac ggcacgttct 600

gggcgtccag cgcgagcctg gcgccacgcg cgcgctggcg ttctcgtccg tgtcgaacca 660

ggcgatctcg ttgcggagca cggcgtcgaa catcttctcg cgcacccgct tggtcaggtt 720

ctcgcccacc gtgtcccagm cactgctgca ccgtgttgaa cagcagcgcg cgaggacatg 780

ccgatgagca ggtagcagta tttggcgatc tcgcgcttca tgtaccgcgg gtccggcgcg 840

tagtacacgc tgagcacggc gctgaggatg taggcgaaga tggcgctgaa ggagccgcgg 900

accatggagc cggcgagcgc gtaggcccac tcgggcgagt tcatcctggc gaggcgcagg 960

aaggagctgg cgccggcgcg gaacgccagc tgcttgtcgg ccatggtccg gtggtggtgg 1020

tgcgggtcgt ggatggagag ggtgaagtcg gaggtggaga agtcggagag gcggcgggag 1080

tagggggagc ggccgtagag gagttgcgcg tcatgatggg cgagctgacg gagttgcggg 1140

cgctggaggg cctggcgctg cgccgtgctg gtgcaatgtc gaccccgaga gcatgaacac 1200

gagagcatga acacgaaacg gcggctaggg cagcgtctgc gcagacgaac ggtaaacggg 1260

gacaggagac taatacctgt ttacgcagct ccaagcgctg tcttctttcc gttttggcgt 1320

ttggctgtcg cctgcgtctc cagaacagag aagccaacgc catcgcctcc atttcgtcga 1380

atcccgtccg ctcttcgtct ataatggcaa ttatctctcg gcaggc 1426

Claims (10)

1.降低植物中蛋白质的含量和/或活性或者抑制植物中编码所述蛋白质的核酸分子表达的物质的应用，所述应用为如下任一种应用：

B1)在提高植物产量中的应用；

B2)在降低植物花粉育性中的应用；

B3)在植物育种中的应用；

所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：

(a1)氨基酸序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.6所示的蛋白质；

(a2)将SEQ ID No.3或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制植物中编码所述蛋白质的核酸分子表达的物质为CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统如下任一种：

(b1)包括特异sgRNA，所述特异sgRNA的靶位点序列如SEQ ID No.l第812-830位和/或第860-878位所示，或者所述特异sgRNA的靶位点序列如SEQ ID No.4第735-753位和/或第770-788位所示；

(b2)包括特异DNA分子，所述特异DNA分子转录得到所述特异sgRNA

(b3)包括具有所述特异DNA分子的质粒；

(b4)包括特异重组质粒，所述特异重组质粒表达所述特异sgRNA。

3.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的序列为SEQ ID No.1中的第828-862位缺失，其它核苷酸保持不变的序列；或所述DNA分子的序列为SEQ ID No.4中的第758-785位缺失，其它核苷酸保持不变的序列。

4.植物育种的方法，其特征在于：所述方法为M1、M2或M3，

M1包括抑制出发植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达和/或抑制或降低权利要求1中所述蛋白质的含量和/或活性，得到具有下述至少一种特性的目的植物：

1)与所述出发植物相比，所述目的植物产量增加；

2)与所述出发植物相比，所述目的植物花粉育性降低；

M2包括采用权利要求1中编码所述蛋白质的基因表达水平低于玉米自交系B104或W22的玉米自交系作为亲本，培育花粉育性降低和/或产量增加的玉米品种和/或品系；

M3包括采用权利要求3所述的DNA分子替换玉米基因组DNA中的GEN1基因，得到花粉育性降低和/或产量增加的玉米。

5.检测或辅助检测植物花粉育性的方法，其特征在于：包括检测待测植物GEN1基因是否为突变基因，含有所述突变基因的待测植物的花粉育性低于不含有所述突变基因的待测植物的花粉育性，或含有所述突变基因的待测植物的产量高于不含有所述突变基因的待测植物的产量。

6.检测SNP位点的多态性或基因型的物质的应用，其特征在于：所述应用为如下任一种：

(1)在鉴定或辅助鉴定玉米产量中的应用；

(2)在制备鉴定或辅助鉴定玉米产量产品中的应用；

(3)在鉴定或辅助鉴定玉米花粉育性中的应用；

(4)在制备鉴定或辅助鉴定玉米花粉育性产品中的应用；

(5)在玉米育种中的应用；

所述SNP位点是玉米基因组中的一个SNP位点，位于玉米第2号染色体上序列如SEQ IDNo.1所示片段的第2057位核苷酸，其核苷酸种类为T或C。

7.鉴定或辅助鉴定玉米花粉育性的方法，其特征在于：包括检测待测玉米权利要求6所述的SNP位点的基因型，根据待测玉米的基因型鉴定或辅助鉴定玉米花粉育性；所述基因型为TT基因型、CC基因型；所述TT基因型表示权利要求6所述的SNP位点的核苷酸种类为T的纯合型；所述CC基因型表示权利要求6所述的SNP位点的核苷酸种类为C的纯合型。

8.含有权利要求6中所述检测SNP位点的多态性或基因型的物质的产品，为如下任一种产品：

C1)检测与玉米产量相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

C2)鉴定或辅助鉴定玉米产量的产品；

C3)检测与玉米花粉育性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

C4)鉴定或辅助鉴定玉米花粉育性的产品；

C5)用于玉米育种的产品。

9.权利要求1中所述蛋白质或其相关生物材料、权利要求3所述的DNA分子的应用，其特征在于：所述应用为如下任一种应用，

A1)在调控植物籽粒产量中的应用；

A2)在调控植物花粉育性中的应用；

A3)在植物育种中的应用；

所述相关生物材料为所述生物材料为下述任一种：

c1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；

c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；

c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官。

10.根据权利要求1或9所述的应用，其特征在于：

所述编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子为如下d1)或d2)或d3)或d4)所示的DNA分子：d1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的DNA分子；

d2)编码序列是序列表中SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5所示的DNA分子；

d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于玉米且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；

d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。