CN103421841B - 水稻Os74蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻Os74蛋白及其应用。如下任一物质在提高粳稻的抗病性中的应用：（1）SEQ ID No.2所示Os74蛋白；（2）SEQ ID No.2所示Os74蛋白的编码基因；（3）含有（2）所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述抗病性为抗水稻白叶枯病；所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第809-3190位核苷酸所示。Os74基因的表达与粳稻的稻瘟菌抗性相关，并且Os74基因的表达可以显著提高粳稻的白叶枯菌抗性。
Description
技术领域
本发明涉及水稻Os74蛋白及其应用。
背景技术
植物在生长过程中会受到多种病原菌及昆虫的侵害。为此，植物进化出许多防卫机制来抵抗这些病原菌的侵害。其中，抗病基因（Resistance gene）介导的防卫反应是一个重要的防卫机制。近年来，在一系列物种中克隆了许多抗病基因。大多数抗病基因编码的蛋白由核苷酸结合区域（nucleotide-binding region，NB）和C末端的亮氨酸重复区域（leucine-rich repeat，LRR）组成，这种蛋白被称为NB-LRR蛋白。当病原菌存在时，NB-LRR蛋白可以识别病原菌中对应的效应蛋白并激活防卫反应。通常情况下，这些防卫反应伴随着接种点处出现的过敏反应，如活性氧的迸发、病原相关基因（pathogenesis-related genes）的诱导表达以及系统获得抗性（systemicacquired resistance）的建立，这些反应使植物体抗病。因此，植物新抗病基因的发掘，对理解植物和病原菌的相互作用机制及作物的遗传改良具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供水稻Os74蛋白及其应用。
本发明提供的是如下任一物质在提高粳稻的抗病性中的应用：
（1）SEQ ID No.2所示Os74蛋白；
（2）SEQ ID No.2所示Os74蛋白的编码基因；
（3）含有（2）所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
上述应用中，所述抗病性为抗水稻白叶枯病。
上述应用中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第809-3190位核苷酸所示。
干扰载体在降低粳稻的抗病性中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述干扰载体按照如下方法制备：将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段插入出发载体pCDU-d40-IN的Kpn Ⅰ和PmaC Ⅰ位点间，得到中间载体；将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段的反向互补片段插入中间载体的Hind Ⅲ和Sma Ⅰ位点间，最终得到干扰载体。
上述应用中，所述pCDU-d40-IN载体按照如下方法制备：
（1）以中花17的基因组为模板，以OW40BKF和OW40SPmR为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
（2）将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18-T-W40-B；
（3）BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pMD18-T-W40-B，得到基因片段；BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pUC-Catin，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pUC-40-IN；
（4）BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pUC-40-IN，得到基因片段；BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-sk-Ubi载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pBS-W40-IN；
（5）以中花17的基因组为模板，以OW40SmF和OW40H3R为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
（6）将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18T-W40-H；
（7）Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pMD18T-W40-H，得到基因片段；Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pCoUbi:Flag-OsERF922载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pCDU-W40；
（8）用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-W40-IN，得到基因片段；EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pCDU-W40，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pCDU-d40-IN。
所述OW40BKF的序列为5’-ATGGATCCGGTACCATGGATCTGATGGGTGG-3’；
所述OW40SPmR的序列为5’-TTGTCGACACGTGGCCGGTGCGGTTCAG-3’；
所述OW40SmF的序列为5’-TACCCGGGATCTGATGGGTGGGTACG-3’；
所述和OW40H3R的序列为5’-GTAAGCTTCAGCATGGAGATCACCTTCTTG-3’；
上述应用中，所述pBS-sk-Ubi载体按照如下方法制备：
用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pCoU载体，得到基因片段；用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pBluescript SK，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pBS-sk-Ubi。
上述应用中，所述抗病性为抗水稻稻瘟病或水稻白叶枯病。
上述任一所述应用中，所述水稻稻瘟病是由水稻稻瘟病菌引起的。
上述任一所述应用中，所述水稻白叶枯病是由水稻白叶枯病菌引起的。
一种制备水稻白叶枯病的抗病性增强的转基因水稻的方法也属于本发明的保护范围。该方法包括如下步骤：将SEQ ID No.2所示Os74蛋白的编码基因导入出发粳稻中，得到转基因粳稻；与出发粳稻相比，转基因粳稻的水稻白叶枯病的抗病性增强。
上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体pCoUbi:Flag-OsERF922的多克隆位点得到的。
上述方法中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第809-3190位核苷酸所示。
一种制备水稻白叶枯病的抗病性降低的转基因水稻的方法也属于本发明的保护范围。该方法包括如下步骤：将干涉载体导入出发粳稻中，得到转基因粳稻；与出发粳稻相比，转基因粳稻的水稻白叶枯病的抗病性降低。
上述方法中，所述干扰载体按照如下方法制备：将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段插入出发载体pCDU-d40-IN的Kpn Ⅰ和PmaC Ⅰ位点间，得到中间载体；将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段的反向互补片段插入中间载体的Hind Ⅲ和Sma Ⅰ位点间，最终得到干扰载体。
上述方法中，所述pCDU-d40-IN载体按照如下方法制备：
（1）以中花17的基因组为模板，以OW40BKF和OW40SPmR为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
（2）将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18-T-W40-B；
（3）BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pMD18-T-W40-B，得到基因片段；BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pUC-Catin，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pUC-40-IN；
（4）BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pUC-40-IN，得到基因片段；BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-sk-Ubi载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pBS-W40-IN；
（5）以中花17的基因组为模板，以OW40SmF和OW40H3R为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
（6）将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18T-W40-H；
（7）Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pMD18T-W40-H，得到基因片段；Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pCoUbi:Flag-OsERF922载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pCDU-W40；
（8）用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-W40-IN，得到基因片段；EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pCDU-W40，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pCDU-d40-IN。
所述OW40BKF的序列为5’-ATGGATCCGGTACCATGGATCTGATGGGTGG-3’；
所述OW40SPmR的序列为5’-TTGTCGACACGTGGCCGGTGCGGTTCAG-3’；
所述OW40SmF的序列为5’-TACCCGGGATCTGATGGGTGGGTACG-3’；
所述和OW40H3R的序列为5’-GTAAGCTTCAGCATGGAGATCACCTTCTTG-3’；
上述方法中，所述pBS-sk-Ubi载体按照如下方法制备：
用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pCoU载体，得到基因片段；用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pBluescript SK，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pBS-sk-Ubi。
一种制备水稻稻瘟病的抗病性降低的转基因水稻的方法也属于本发明的保护范围。该方法包括如下步骤：将干扰载体导入出发粳稻中，得到转基因粳稻；与出发粳稻相比，转基因粳稻的水稻稻瘟病的抗病性降低。
上述方法中，所述干扰载体按照如下方法制备：将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段插入出发载体pCDU-d40-IN的Kpn Ⅰ和PmaC Ⅰ位点间，得到中间载体；将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段的反向互补片段插入中间载体的Hind Ⅲ和Sma Ⅰ位点间，最终得到干扰载体。
上述方法中，所述pCDU-d40-IN载体按照如下方法制备：
（1）以中花17的基因组为模板，以OW40BKF和OW40SPmR为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
（2）将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18-T-W40-B；
（3）BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pMD18-T-W40-B，得到基因片段；BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pUC-Catin，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pUC-40-IN；
（4）BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pUC-40-IN，得到基因片段；BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-sk-Ubi载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pBS-W40-IN；
（5）以中花17的基因组为模板，以OW40SmF和OW40H3R为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
（6）将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18T-W40-H；
（7）Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pMD18T-W40-H，得到基因片段；Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pCoUbi:Flag-OsERF922载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pCDU-W40；
（8）用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-W40-IN，得到基因片段；EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pCDU-W40，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pCDU-d40-IN。
所述OW40BKF的序列为5’-ATGGATCCGGTACCATGGATCTGATGGGTGG-3’；
所述OW40SPmR的序列为5’-TTGTCGACACGTGGCCGGTGCGGTTCAG-3’；
所述OW40SmF的序列为5’-TACCCGGGATCTGATGGGTGGGTACG-3’；
所述和OW40H3R的序列为5’-GTAAGCTTCAGCATGGAGATCACCTTCTTG-3’；
上述方法中，所述pBS-sk-Ubi载体按照如下方法制备：
用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pCoU载体，得到基因片段；用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pBluescript SK，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pBS-sk-Ubi。
上述任一所述方法中，所述水稻稻瘟病是由水稻稻瘟病菌引起的。
上述任一所述方法中，所述水稻白叶枯病是由水稻白叶枯病菌引起的。
SEQ ID No.2所示的Os74蛋白也属于本发明的保护范围。
SEQ ID No.2所示的Os74蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
含有SEQ ID No.2所示Os74蛋白的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
干扰载体也属于本发明的保护范围，该载体是将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段插入出发载体pCDU-d40-IN的Kpn Ⅰ和PmaC Ⅰ位点间，得到中间载体；将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段的反向互补片段插入中间载体的Hind Ⅲ和Sma Ⅰ位点间，最终得到干扰载体。
上述载体中，所述pCDU-d40-IN载体按照如下方法制备：
（1）以中花17的基因组为模板，以OW40BKF和OW40SPmR为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
（2）将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18-T-W40-B；
（3）BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pMD18-T-W40-B，得到基因片段；BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pUC-Catin，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pUC-40-IN；
（4）BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pUC-40-IN，得到基因片段；BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-sk-Ubi载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pBS-W40-IN；
（5）以中花17的基因组为模板，以OW40SmF和OW40H3R为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
（6）将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18T-W40-H；
（7）Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pMD18T-W40-H，得到基因片段；Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pCoUbi:Flag-OsERF922载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pCDU-W40；
（8）用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-W40-IN，得到基因片段；EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pCDU-W40，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pCDU-d40-IN。
所述OW40BKF的序列为5’-ATGGATCCGGTACCATGGATCTGATGGGTGG-3’；
所述OW40SPmR的序列为5’-TTGTCGACACGTGGCCGGTGCGGTTCAG-3’；
所述OW40SmF的序列为5’-TACCCGGGATCTGATGGGTGGGTACG-3’；
所述和OW40H3R的序列为5’-GTAAGCTTCAGCATGGAGATCACCTTCTTG-3’；
上述载体中，所述pBS-sk-Ubi载体按照如下方法制备：
用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pCoU载体，得到基因片段；用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pBluescript SK，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pBS-sk-Ubi。
Os74基因的表达可能与粳稻的稻瘟菌抗性相关，并且Os74基因的表达可以显著提高粳稻的白叶枯菌抗性。
附图说明
图1为pCoU-F74和pCDU-ds74示意图。
图2为Os74转基因植株（转化秀水11）对稻瘟菌97-220E3的抗性分析。
图3为Os74转基因植株（转化秀水11）对白叶枯菌PXO99的抗性分析。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，以下通过实施例予以进一步的说明，但并非对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
下述实施例中转基因水稻的获得方法如下：
一、将待转化的特定品种的水稻的孕穗期种子用70%的乙醇进行表面消毒5分钟后，用体积分数为50%的次氯酸钠消毒40分钟，无菌水冲洗5次后将种子于滤纸上吸干。
二、将幼胚拨出置于NBi培养基上培养（MS添加0.5g/L谷氨酰胺，0.5g/L脯氨酰胺，2.0mg/L2，4-D；pH5.8），10天左右诱导出愈伤组织。
三、将愈伤组织剥下，置于新的NBi培养基上培养4天，得到胚性愈伤组织。
四、将待转重组农杆菌的菌液涂在固体YEP平板上培养2天，无菌水冲洗得到的菌液。
五、将冲洗得到的菌液置于液体共培养培养基（含100μM乙酰丁香酮）中，调整待转重组农杆菌菌液浓度至OD600=0.5。
六、将胚性愈伤组织放入浓度调整后的待转重组农杆菌液中浸没15min，期间不时轻轻摇动。倒掉菌液，将水稻胚性愈伤组织表面多余的菌液用无菌滤纸吸干，再将胚性愈伤组织置于共培养培养基上，28℃黑暗培养2天。
七、将培养2天的愈伤组织用无菌水洗3次，再用含有500mg/L的头孢霉素的水浸泡15min。将愈伤组织置于滤纸上吸干，转到不含潮霉素的预筛选培养基NBps上，26℃黑暗培养7天。
八、培养后的愈伤组织转入筛选培养基NBs上诱导抗性愈伤组织。
九、待抗性愈伤组织长到一定大小后，挑选色泽金黄、质地紧凑的抗性愈伤组织转入再生培养基NBr，26℃光照培养，直到组织出绿、分化出芽。
十、待长出的小苗到3-4cm后，将其移至生根培养基1/2MS的试管中，生根培养。
十一、生根培养2-3周后，待小苗长出粗壮的根系后移至温室培养，直到收种。
pBluescript SK载体购自Clontech公司。
pUC-catin载体在文献“秦学，2013.赤霉素20氧化酶基因OsGA20ox3调节水稻株高及抗病防卫反应”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
pCoU载体的制备方法见公开号为“CN102260339A”的发明专利的说明书的第8页第15段至第9页第3段。
限制性内切酶、T4DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司。
中花17在文献“Liu DF,Chen XJ,Liu JQ,Ye JC and Guo ZJ*.2012.The riceERF transcription factor OsERF922negatively regulates resistance toMagnaporthe oryzae and salt tolerance.Journal of Experimental Botany,63(10):3899-3912.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
下述实施例中pCDU-d40-IN载体的构建过程如下：
一、以中花17的基因组为模板，以OW40BKF和OW40SPmR为引物（见表1）扩增OsWRKY40基因的干涉片段。
二、将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18-T-W40-B。
三、BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pMD18-T-W40-B，得到基因片段；BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pUC-Catin，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pUC-40-IN。
四、BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pUC-40-IN，得到基因片段；BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-sk-Ubi载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pBS-W40-IN。
五、以中花17的基因组为模板，以OW40SmF和OW40H3R为引物（见表1）扩增OsWRKY40基因的干涉片段。
六、将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18T-W40-H。
七、Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pMD18T-W40-H，得到基因片段；Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pCoUbi:Flag-OsERF922载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pCDU-W40。
八、用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-W40-IN，得到基因片段；EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pCDU-W40，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pCDU-d40-IN。
上述pBS-sk-Ubi载体的构建过程如下：
用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pCoU载体，得到基因片段；用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pBluescript SK，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pBS-sk-Ubi。
根瘤农杆菌EHA105购自Clontech公司。
NBps培养基：NBi培养基加500mg/L头孢霉素。
NBs培养基：NBi培养基加500mg/L头孢霉素，30mg/L潮霉素。
NBr培养基：NBi培养基加3.0mg/L6-苄基腺嘌呤、0.5mg/L萘乙酸和30mg/L潮霉素。
秀水11在文献“Haihua Wang,Junjie Hao,Xujun Chen,Zhongna Hao,Xia Wang,Yonggen Lou,Youliang Peng,Zejian Guo*.2007.Overexpression of rice WRKY89enhances ultraviolet B tolerance and disease resistance in rice plants.PlantMol Biol,65:799–815.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
pCoUbi:Flag-OsERF922在文献“Liu DF,Chen XJ,Liu JQ,Ye JC and Guo ZJ*.2012.The rice ERF transcription factor OsERF922negatively regulates resistance toMagnaporthe oryzae and salt tolerance.Journal of Experimental Botany,63(10):3899-3912.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
秀水11的亲和稻瘟菌菌株97-220E3在文献“Haihua Wang,Junjie Hao,XujunChen,Zhongna Hao,Xia Wang,Yonggen Lou,Youliang Peng,Zejian Guo*.2007.Overexpression of rice WRKY89enhances ultraviolet B tolerance and diseaseresistance in rice plants.Plant Mol Biol,65:799–815.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
白叶枯菌PXO99在文献“Qin X,Liu JH,Zhao WS,Chen XJ,Guo ZJ*,PengYL*.2013.Gibberellin20-oxidase gene OsGA20ox3regulates plant stature anddisease development in rice.Mol Plant Microbe Interact,26（2）:227-239.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
免疫化学发光检测试剂盒购自康为世纪（CWBIO）公司，产品目录号为CW0049A。
实施例1、重组载体pMD18-T-74OV的构建
一、取正常光周期生长20天的秀水11（Oryza sativa subsp.japanica var.Xiushui11）的叶片，液氮研磨，Trizol法提取总RNA。
二、设计引物XS9B2F和XS9EvR（见表1），以步骤一得到的RNA为模板，用PrimerSTAR DNA聚合酶通过反转录PCR扩增出Os74基因的cDNA。
PCR程序：94℃预变性5分钟；94℃40秒，60℃30秒，72℃2分钟20秒，32个循环；72℃延伸10分钟。
三、将PCR产物连接到pMD-18T载体上，得到重组质粒，将其命名为pMD18-T-74OV。将重组质粒送去测序，测序结果正确。
Os74基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第809-3190位核苷酸所示DNA片段。
Os74基因编码的蛋白为Os74蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2、Os74超表达载体和干涉载体的制备
一、超表达载体pCoU-F74的构建
用Bgl Ⅱ和EcoR V双酶切实施例1得到的pMD18-T-74OV，得到Os74基因片段；用BamH Ⅰ和Sma Ⅰ双酶切pCoUbi:Flag-OsERF922，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pCoU-F74（图1A），即Os74基因的超表达载体。
二、干涉载体pCDU-ds74的构建
（一）取正常光周期生长20天的秀水11（Oryza sativa subsp.japanicavar.Xiushui11）的叶片，液氮研磨，用Trizol法提取RNA。
（二）设计引物XS9KpF和XS9PmaR（见表1），以步骤（一）得到的RNA为模板，用PrimerSTAR DNA聚合酶通过反转录PCR得到扩增产物，PCR产物如SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段。
PCR程序：94℃预变性5分钟；94℃40秒，60℃30秒，72℃2分钟20秒，32个循环；72℃延伸10分钟。
（三）将PCR产物连接到pMD-18T载体上，将重组载体命名为pMD18-T-74RNAi。
（四）用Kpn Ⅰ和PmaC Ⅰ双酶切pMD18-T-74RNAi，得到基因片段；用Kpn Ⅰ和PmaCⅠ双酶切pCDU-d40-IN，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pCDU-7440。
（五）用Hind Ⅲ和Sma Ⅰ双酶切pMD18-T-74RNAi，得到基因片段；Hind Ⅲ和Sma Ⅰ双酶切pCDU-7440，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pCDU-ds74（图1B），即Os74基因的干涉载体。
实施例3、转Os74基因水稻的获得
一、将pCoU-F74和pCDU-ds74分别导入根瘤农杆菌EHA105中,获得重组菌EHA105/pCoU-F74和EHA105/pCDU-ds74，经过测序验证正确。EHA105/pCoU-F74和EHA105/pCDU-ds74重组菌均构建成功。
二、以孕穗期秀水11的种子为材料，得到胚性愈伤组织。EHA105/pCDU-ds74和EHA105/pCoU-F74分别转化胚性愈伤组织，最终共获得35株T0代转pCDU-ds74水稻和42株T0代转pCoU-F74水稻。
T0代转基因植株自交所得种子和由该种子长成的植株为T1代。T1代转基因植株自交所得种子和由该种子长成的植株为T2代。
将从T0代转pCoU-F74水稻和T0代转pCDU-ds74水稻上收获的种子，分别播种后获得T1代转pCoU-F74水稻和T1代转pCDU-ds74水稻。再从T1代转pCoU-F74水稻和T1代转pCDU-ds74水稻上收获种子，分别播种后获得T2代转pCoU-F74水稻和T2代转pCDU-ds74水稻。
实施例4、Os74转基因植株（转化秀水11）对稻瘟菌和白叶枯菌的抗性分析
一、Os74转基因植株（转化秀水11）对稻瘟菌的抗性分析
（一）将秀水11、T2代转pCoU-F74水稻（编号为F9、F43、F55、F119和F136）和T2代转pCDU-ds74水稻（编号为d71、d86、d116、d141、d143和d147）的种子在37℃下浸泡催芽1天后，播种在营养土中，在温室28℃、光照16h/黑暗8h，培养21天，得到各组幼苗，用于稻瘟菌接菌实验。
（二）选用秀水11的亲和稻瘟菌菌株97-220E3进行培养和产孢。
（三）用0.02%的silwet水溶液配制亲和稻瘟菌菌株97-220E3的孢子悬浮液，调整孢子数目为5×105个/ml，对在自然光照条件下生长21天的秀水11、T2代转pCoU-F74水稻（编号为F9、F43、F55、F119和F136）和T2代转pCDU-ds74水稻（编号为d71、d86、d116、d141、d143和d147）的幼苗进行喷雾接种，26℃黑暗保湿培养24h后进行正常光照培养（16h光照，8h黑暗）。
（四）分别于处理后0和12h取各组的叶组织，液氮速冻后于-80℃保存。
（五）将保存的各组各时间点的样品用Trizol法提取总RNA，反转录反应后，用实时定量PCR分析Os74基因的表达情况，以Ubiqutin基因（Ubq）作为内参基因。用2－△Ct方法计算各样品中Os74基因的相对表达水平，每个样品进行三个平行反应，结果取平均值。
Os74基因实时定量PCR引物为74F4和74-4qR（见表1）。
Ubiqutin基因实时定量PCR引物为UbqF和UbqR（见表1）。
图2中，XS11为秀水11。
图2A表明，接种0h时，与秀水11相比，编号为F9、F43、F55、F119和F136的五个Os74基因超表达植株中Os74基因的表达量明显增强，证明超表达植株构建成功。编号为d71、d86、d116、d141、d143和d147的六个Os74基因干涉植株中Os74基因表达量降低到野生型秀水11中Os74基因表达量的1/5，表明干涉植株中Os74基因表达受到抑制。
与0h表达相比，接种12h后，各植株中Os74基因表达都有提高。接种12h后，与秀水11相比，编号为d71、d86、d116、d141、d143和d147的六个Os74基因干涉植株中Os74基因的表达量低，编号为F9、F43、F55、F119和F136五个Os74基因超表达植株中Os74基因的表达很高，说明功能载体的转化发挥了作用。
（六）Western blot检测超表达植株中Os74蛋白的表达
pCoU-F74超表达载体在构建时加上了flag标签，因此可用Western blot的方法检测超表达植株中Os74蛋白的表达情况。
1、将编号为F9、F43、F55、F119和F136的五个Os74基因超表达植株以及秀水11的幼苗的叶片在液氮中研磨，加入200μl蛋白提取缓冲液，冰上放置30min，4℃12000rpm离心10min，吸取上清于新管中，得到蛋白液，将其液氮速冻-80℃保存。
2、取15μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，Anti-flag鼠源一抗按体积比1:3000稀释，羊抗鼠二抗按体积比1:10000稀释，进行免疫化学发光检测（参考康为世纪的说明书）。结果如图2B所示，图2B中Ponceau S staining为丽春红染色，表示蛋白上样量基本一致。
图2B表明，在编号为F9、F43、F55、F119和F136五个Os74基因超表达植株中都检测到Os74蛋白的表达。
（七）接种6天后进行病情统计，用Photoshop7.0软件统计相同叶位的病斑面积比率，并拍照。病斑面积比率为病斑面积/叶片总面积。
病斑情况如图2C所示。
病斑面积比率如图2D所示。
图2D表明，编号为F9、F43、F55、F119和F136的五个Os74基因超表达植株的病斑面积比率分别为4.1%、5.8%、4.9%、4.3%和3.8%；编号为d71、d86、d116、d141、d143和d147的六个Os74基因干涉植株中的病斑面积比率分别为13.5%、11.4%、11%、13.3%、11.9%和9.6%；而秀水11的病斑面积比率为4.9%。经显著性分析证明，Os74基因干涉后转基因植株的发病情况要比野生型秀水11严重，而Os74基因超表达植株的发病情况与秀水11相近。
转入pCoUbi:Flag-OsERF922的植株以及转入pCDU-d40-IN的植株进行上述实验，结果与野生型秀水11的相同。
结果表明，Os74基因的表达与粳稻的稻瘟菌抗性相关。
二、Os74转基因植株（转化秀水11）对白叶枯菌的抗性分析
（一）将白叶枯菌PXO99在NA培养基中28℃培养3-4天。
（二）用玻璃棒将白叶枯菌PXO99刮下来，用10mM MgCl2配制菌的悬浮液至OD600约为1.0。
（三）选取T2代转pCoU-F74水稻（编号为F9和F119）的两个Os74基因超表达植株，T2代转pCDU-ds74水稻（编号为d86和d116）的两个Os74基因干涉植株以及秀水11的6周龄的幼苗。
（四）将各种植株6周龄的苗用来剪叶法接种白叶枯菌PXO99。
选取完全展开的上部叶片，剪刀平置，刀尖稍向上，剪去约叶片长度的1/5，每叶接种30μl体积菌液，，每个株系接种约24片叶。26℃黑暗光照培养（16h光照，8h黑暗）。
（五）接种14天后统计病斑长度，每个株系至少统计接种的12片叶。
图3中，XS11为秀水11。
病斑情况如图3A所示。
病斑平均长度如图3B所示。
图3B表明，编号为F9和F119的两个Os74基因超表达植株的平均病斑长度分别为3.21cm和3.36cm；编号为d86和d116的两个Os74基因干涉植株的平均病斑长度分别为6.15cm和5.96cm；而秀水11（XS11）的平均病斑长度为4.1cm。
经显著性分析证明，Os74基因干涉植株的病斑长度要比秀水11长，而Os74基因超表达植株的病斑长度要比秀水11短。
（六）白叶枯菌在植物体内的繁殖情况
1、将接种白叶枯菌PXO99后14天的F9和F119两个Os74基因超表达植株，d86和d116两个Os74基因干涉植株以及秀水11，分别选取接种的3片叶。
2、剪取接种时剪口处下约5cm的叶片，切成小碎片，在5ml无菌水中摇1h，按不同的稀释浓度涂于NA培养基上，28℃培养三天。
3、统计菌落生长数目，如图3C所示。
图3C表明，编号为F9和F119的两个Os74基因超表达植株中，白叶枯菌病菌量分别为10^2.95和10^2.88；编号为d86和d116的两个Os74基因干涉植株中，白叶枯菌病菌量分别为10^3.07和10^3.10；而秀水11的白叶枯菌病菌量为10^3.03。
经显著性分析证明，Os74基因干涉植株的白叶枯菌PXO99要比野生型秀水11中的白叶枯菌PXO99多，而Os74基因超表达植株中的白叶枯菌PXO99比野生型秀水11中的白叶枯菌PXO99量要少。
实验重复三次，获得一致性结果。
转入pCoUbi:Flag-OsERF922的植株以及转入pCDU-d40-IN的植株进行上述实验，结果与野生型秀水11的相同。
上述结果表明Os74基因的表达可以提高粳稻的白叶枯菌抗性。
表1载体构建及Real time PCR所用引物
表中的斜体序列为括号中的限制性内切酶识别位点。
Claims (8)
1.如下任一物质在提高粳稻的抗病性中的应用：
(1)SEQ ID No.2所示Os74蛋白；
(2)SEQ ID No.2所示Os74蛋白的编码基因；
(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述抗病性为抗水稻白叶枯病；
所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第809-3190位核苷酸所示。
2.干扰载体在降低粳稻的抗病性中的应用；
所述干扰载体按照如下方法制备：将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段插入出发载体pCDU-d40-IN的Kpn Ⅰ和PmaC Ⅰ位点间，得到中间载体；将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段的反向互补片段插入中间载体的Hind Ⅲ和Sma Ⅰ位点间，最终得到干扰载体；
所述pCDU-d40-IN载体按照如下方法制备：
(1)以中花17的基因组为模板，以OW40BKF和OW40SPmR为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
(2)将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18-T-W40-B；
(3)BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pMD18-T-W40-B，得到基因片段；BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pUC-Catin，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pUC-40-IN；
(4)BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pUC-40-IN，得到基因片段；BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-sk-Ubi载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pBS-W40-IN；
(5)以中花17的基因组为模板，以OW40SmF和OW40H3R为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
(6)将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18T-W40-H；
(7)Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pMD18T-W40-H，得到基因片段；Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pCoUbi:Flag-OsERF922载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pCDU-W40；
(8)用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-W40-IN，得到基因片段；EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pCDU-W40，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pCDU-d40-IN；
所述OW40BKF的序列为5’-ATGGATCCGGTACCATGGATCTGATGGGTGG-3’；
所述OW40SPmR的序列为5’-TTGTCGACACGTGGCCGGTGCGGTTCAG-3’；
所述OW40SmF的序列为5’-TACCCGGGATCTGATGGGTGGGTACG-3’；
所述和OW40H3R的序列为5’-GTAAGCTTCAGCATGGAGATCACCTTCTTG-3’；
所述pBS-sk-Ubi载体按照如下方法制备：
用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pCoU载体，得到基因片段；用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pBluescript SK，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pBS-sk-Ubi；
所述抗病性为抗水稻稻瘟病或水稻白叶枯病。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述水稻稻瘟病是由水稻稻瘟病菌引起的；所述水稻白叶枯病是由水稻白叶枯病菌引起的。
4.一种制备水稻白叶枯病的抗病性增强的转基因水稻的方法，包括如下步骤：将SEQ ID No.2所示Os74蛋白的编码基因导入出发粳稻中，得到转基因粳稻；与出发粳稻相比，转基因粳稻的水稻白叶枯病的抗病性增强；
所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体pCoUbi:Flag-OsERF922的多克隆位点得到的；
所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第809-3190位核苷酸所示。
5.一种制备水稻白叶枯病的抗病性降低的转基因水稻的方法，包括如下步骤：将干扰载体导入出发粳稻中，得到转基因粳稻；与出发粳稻相比，转基因粳稻的水稻白叶枯病的抗病性降低；
所述干扰载体按照如下方法制备：将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段插入出发载体pCDU-d40-IN的KpnⅠ和PmaCⅠ位点间，得到中间载体；将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段的反向互补片段插入中间载体的HindⅢ和SmaⅠ位点间，最终得到干扰载体；
所述pCDU-d40-IN载体按照如下方法制备：
(1)以中花17的基因组为模板，以OW40BKF和OW40SPmR为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
(2)将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18-T-W40-B；
(3)BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pMD18-T-W40-B，得到基因片段；BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pUC-Catin，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pUC-40-IN；
(4)BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pUC-40-IN，得到基因片段；BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-sk-Ubi载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pBS-W40-IN；
(5)以中花17的基因组为模板，以OW40SmF和OW40H3R为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
(6)将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18T-W40-H；
(7)Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pMD18T-W40-H，得到基因片段；Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pCoUbi:Flag-OsERF922载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pCDU-W40；
(8)用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-W40-IN，得到基因片段；EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pCDU-W40，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pCDU-d40-IN；
所述OW40BKF的序列为5’-ATGGATCCGGTACCATGGATCTGATGGGTGG-3’；
所述OW40SPmR的序列为5’-TTGTCGACACGTGGCCGGTGCGGTTCAG-3’；
所述OW40SmF的序列为5’-TACCCGGGATCTGATGGGTGGGTACG-3’；
所述和OW40H3R的序列为5’-GTAAGCTTCAGCATGGAGATCACCTTCTTG-3’；
所述pBS-sk-Ubi载体按照如下方法制备：
用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pCoU载体，得到基因片段；用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pBluescript SK，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pBS-sk-Ubi。
6.一种制备水稻稻瘟病的抗病性降低的转基因水稻的方法，包括如下步骤：将干扰载体导入出发粳稻中，得到转基因粳稻；与出发粳稻相比，转基因粳稻的水稻稻瘟病的抗病性降低；
所述干扰载体按照如下方法制备：将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段插入出发载体pCDU-d40-IN的Kpn Ⅰ和PmaC Ⅰ位点间，得到中间载体；将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段的反向互补片段插入中间载体的Hind Ⅲ和Sma Ⅰ位点间，最终得到干扰载体；
所述pCDU-d40-IN载体按照如下方法制备：
(1)以中花17的基因组为模板，以OW40BKF和OW40SPmR为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
(2)将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18-T-W40-B；
(3)BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pMD18-T-W40-B，得到基因片段；BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pUC-Catin，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pUC-40-IN；
(4)BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pUC-40-IN，得到基因片段；BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-sk-Ubi载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pBS-W40-IN；
(5)以中花17的基因组为模板，以OW40SmF和OW40H3R为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
(6)将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18T-W40-H；
(7)Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pMD18T-W40-H，得到基因片段；Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pCoUbi:Flag-OsERF922载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pCDU-W40；
(8)用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-W40-IN，得到基因片段；EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pCDU-W40，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pCDU-d40-IN；
所述OW40BKF的序列为5’-ATGGATCCGGTACCATGGATCTGATGGGTGG-3’；
所述OW40SPmR的序列为5’-TTGTCGACACGTGGCCGGTGCGGTTCAG-3’；
所述OW40SmF的序列为5’-TACCCGGGATCTGATGGGTGGGTACG-3’；
所述和OW40H3R的序列为5’-GTAAGCTTCAGCATGGAGATCACCTTCTTG-3’；
所述pBS-sk-Ubi载体按照如下方法制备：
用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pCoU载体，得到基因片段；用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pBluescript SK，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pBS-sk-Ubi。
7.根据权利要求4-6任一所述的方法，所述水稻稻瘟病是由水稻稻瘟病菌引起的；所述水稻白叶枯病是由水稻白叶枯病菌引起的。
8.干扰载体，该载体是将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段插入出发载体pCDU-d40-IN的Kpn Ⅰ和PmaC Ⅰ位点间，得到中间载体；将SEQ ID No.1中自5’末端起第557-1023位核苷酸所示DNA片段的反向互补片段插入中间载体的Hind Ⅲ和Sma Ⅰ位点间，最终得到干扰载体；
所述pCDU-d40-IN载体按照如下方法制备：
(1)以中花17的基因组为模板，以OW40BKF和OW40SPmR为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
(2)将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18-T-W40-B；
(3)BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pMD18-T-W40-B，得到基因片段；BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pUC-Catin，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pUC-40-IN；
(4)BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pUC-40-IN，得到基因片段；BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-sk-Ubi载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pBS-W40-IN；
(5)以中花17的基因组为模板，以OW40SmF和OW40H3R为引物扩增OsWRKY40基因的干涉片段；
(6)将扩增得到的OsWRKY40基因的干涉片段连接pMD-18T，得到pMD18T-W40-H；
(7)Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pMD18T-W40-H，得到基因片段；Sma Ⅰ和HindⅢ双酶切pCoUbi:Flag-OsERF922载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pCDU-W40；
(8)用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pBS-W40-IN，得到基因片段；EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pCDU-W40，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒pCDU-d40-IN；
所述OW40BKF的序列为5’-ATGGATCCGGTACCATGGATCTGATGGGTGG-3’；
所述OW40SPmR的序列为5’-TTGTCGACACGTGGCCGGTGCGGTTCAG-3’；
所述OW40SmF的序列为5’-TACCCGGGATCTGATGGGTGGGTACG-3’；
所述和OW40H3R的序列为5’-GTAAGCTTCAGCATGGAGATCACCTTCTTG-3’；
所述pBS-sk-Ubi载体按照如下方法制备：
用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pCoU载体，得到基因片段；用Pvu Ⅱ和Sac Ⅰ双酶切pBluescript SK，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将其命名为pBS-sk-Ubi。
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