CN115058436B - Ahl11基因在调控植物叶片衰老方面应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于拟南芥基因组工程技术领域，具体涉及两个拟南芥基因（AHL9，又名AT2G45850；AHL11，又名AT3G61310）在调控植物叶片衰老方面的应用。这两个基因与植物叶片的衰老相关，其所编码蛋白作为转录因子会影响衰老相关基因及光合作用相关基因的表达，进而通过调节乙烯积累和衰老信号途径来调控叶片衰老进程。所述衰老相关基因SAGs包括：SAG12、SAG13、SAG113；所述光合作用相关基因包括：CAB1、RBCS1。将两个基因进行超表达后，超表达株系材料表现出了典型的提前衰老表型。基于此结果，可为生长周期较短植物新品种、或者植物生长周期调控奠定一定技术基础。
Description
本申请是申请日为2020年04月10日、申请号为202010278119.0、发明名称为《AHL9和AHL11基因在调控植物叶片衰老方面应用》的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本申请属于拟南芥基因组工程技术领域，具体涉及两个拟南芥基因（AHL9，又名AT2G45850；AHL11，又名AT3G61310）在调控植物叶片衰老方面的应用。
背景技术
在植物整个生命周期中，衰老是植物叶片发育的最后一个阶段，是一个重要而独特的发育过程，主要涉及到大分子有序解体及营养物质从叶片转移到其他器官，许多内源和外源环境信号调控植物衰老的复杂过程。目前，虽然在理解衰老信号如何被感知和传递、有序退化过程如何被调控、衰老程序如何与环境信号相互作用方面，已经取得了令人瞩目的进展。但是，衰老调控过程尚不明确，因此进一步探究叶片衰老调控机制仍然具有重要意义。
前期研究表明，AT hook家族蛋白又被称为AT-hook motif nuclear localized(AHL)蛋白，包含一个AT hook DNA 结合基序和一个未知的PPC结构域(plants andprokaryotes conserved domain)，可调节染色体蛋白的结构并与其他转录调控因子共同调控靶基因的转录，主要参与调控植物生长发育的许多方面，包括下胚轴伸长、花发育、根生长、赤霉素生物合成等。鉴于此家族基因的重要作用，对于不同AHL蛋白在植物生长过程中的具体作用显然需要进一步研究和探讨。
发明内容
基于拟南芥基因工程，本申请目的在于提供拟南芥中两个AT hook家族蛋白（AHL9、AHL11）在植物叶片衰老调控方面的新应用，从而为植物生长周期调控、植物新品种培育等奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
AHL9和AHL11基因在调控植物叶片衰老方面应用，这两个基因与植物叶片的衰老相关，其所编码蛋白作为转录因子会影响衰老相关基因及光合作用相关基因的表达，进而通过调节乙烯积累和衰老信号途径来调控叶片衰老进程；
所述衰老相关基因SAGs包括：SAG12、SAG13、SAG113；
所述光合作用相关基因包括：CAB1、RBCS1；
具体而言：
将这两个基因（AHL9和AHL11基因）超表达后，与野生型相比，超表达株系（或者说基因超表达新品种）的叶片中光合作用相关基因的转录水平明显低于野生型，而衰老相关基因的转录水平明显高于野生型，叶片表型方面均提前衰老；
所述衰老，具体表型方面表现为：与野生型相比，植株生长到后期进入生长周期（生活史）的衰老阶段过程中，超表达植株叶片中叶绿素含量明显较低，黄化面积明显大于野生型。
所述AHL9和AHL11基因的制备方法，以拟南芥cDNA为模板，采用PCR扩增方法制备获得，PCR扩增时，引物序列设计如下：
AT2G45850-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGATCGAAGAGATGCAATGG-3’，
AT2G45850-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGACCGCGCATTAAATCAATATCA-3’，
AT3G61310-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGATCGAAGAGACGCAATG-3’，
AT3G61310-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTCCACGCATTAGATCAATGTCC-3’。
基于上述基因作用效果，可培育一种生长周期较短的植物新品种，也即，通过利用基因工程技术，将AHL9和AHL11基因进行超表达后，从而可以缩短新品种的生长周期；所述植物新品种，具体例如为拟南芥新品种。
现有技术中，尽管对AT hook家族蛋白的具体功能做了系列研究，但是由于该家族蛋白数量众多，不同蛋白功能有所差异，因此对不同蛋白具体功能的深入研究仍然具有十分重要的现实意义。本申请中，通过对特定AHL9和AHL11基因的深入研究，发现并证明了这两个基因通过影响衰老相关基因的表达进而影响衰老信号途径（通过影响植物衰老相关激素的积累，即通过调控乙烯介导衰老信号途径）来实现对植物叶片衰老进程的调节，尤其是将两个基因进行超表达后，超表达株系材料表现出了典型的提前衰老表型。基于此结果，可为生长周期较短植物新品种、或者植物生长周期调控奠定一定技术基础。
附图说明
图1为AHL9和AHL11亚细胞定位；其中：
（A）AHL9和AHL11在拟南芥原生质体中的亚细胞定位；
（B）AHL9和AHL11在烟草叶片中的亚细胞定位；
图2为AHL9和AHL11超表达植株的构建与鉴定；其中：
（A）生长四周以及五周左右的WT和ahl9表型观察，比例尺 = 1 cm；
（B）AHL9和AHL11超表达载体的构建模式图；
（C）AHL9和AHL11超表达植株阳性苗的筛选，卡那霉素的工作浓度是50 μg/mL；
（D）和（E）AHL9和AHL11超表达植株PCR鉴定的电泳检测结果；
图3为AHL9和AHL11超表达转基因株系的定量分析。其中：（A）和（B）检测萌发12天的WT、AHL9和AHL11多个超表达转基因株系的相对表达量，其中OE10-1、OE11-5、OE5-2、OE6-4分别命名为AHL9-OE10、AHL9-OE11、AHL11-OE5和AHL11-OE6；
图4为AHL9和AHL11超表达转基因植株的表型分析；其中：
（A）生长32天左右的WT、AHL9-OE10和AHL9-OE11叶片表型分析；
（B）生长35天左右的WT、AHL9-OE10、AHL9-OE11植株的衰老表型，离体叶片按照年龄顺序进行排列；
（C）生长32天左右的WT、AHL11-OE5和AHL11-OE6叶片表型分析；
（D）生长35天左右的WT、AHL11-OE5和AHL11-OE6植株的衰老表型，离体叶片按照年龄顺序进行排列。莲座叶是自下而上编号，第1片叶子最老，第15片叶子最幼；
图5为AHL11超表达植株的叶片衰老分析；其中：
（A）WT、AHL11-OE5和AHL11-OE6植株第四、五片莲座叶在不同生长时期的衰老表型；（B）图（A）所示叶片的叶绿素含量；
（C）qRT-PCR分析生长26天WT、AHL11-OE5和AHL11-OE6植物叶片中AHL11的转录水平；
（D-H）生长26天WT、AHL11-OE5和AHL11-OE6植物叶片中SAG12（D）、SAG13（E）、SAG113（F）和光合相关基因CAB1（G）、RBCS1（H）的qRT-PCR转录水平分析；
图6为AHL9超表达植株的叶片衰老分析；其中：
（A）WT、AHL9-OE10和AHL9-OE11植株第四、五片莲座叶在不同生长时期的衰老表型；（B）图（A）所示叶片的叶绿素含量；
（C）qRT-PCR分析生长26天WT、AHL9-OE10和AHL9-OE11植物叶片中AHL9的转录水平；
（D-H）生长26天WT、AHL9-OE10和AHL9-OE11植物叶片中SAG12（D）、SAG13（E）、SAG113（F）和光合相关基因CAB1（G）、RBCS1（H）的qRT-PCR转录水平分析；
图7为AHL9和AHL11调控黑暗诱导的叶片衰老；其中：
（A）和（C）AHL9/AHL11超表达植株和野生型三周左右离体叶片在黑暗诱导下的衰老表型，比例尺 = 1 cm；
（B）和（D）暗处理后AHL9和AHL11超表达植株与野生型的叶绿素含量分析。n = 3。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请做进一步的解释说明。
实施例1
基于现有AHL家族蛋白研究基础，发明人首先克隆获得了AHL9和AHL11这两个基因序列。具体而言，发明人首先采用TRIZol法提取获得了拟南芥RNA，然后参考拟南芥cDNA数据库设计了PCR扩增引物，最后采用PCR扩增方式制备获得了AHL9和AHL11这两个基因的PCR扩增产物。
AHL9和AHL11基因的编码框碱基序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，具体如下：
AHL9 (即，AT2G45850，1047bp)
ATGGATCGAAGAGATGCAATGGGATTATCCGGGTCAGGTTCTTACTATATCCATAGAGGATTATCCGGGTCGGGTCCTCCAACGTTTCATGGATCACCACAGCAACAGCAAGGTCTTCGTCACTTACCTAATCAAAACTCTCCATTCGGGTCAGGCTCCACTGGTTTCGGATCTCCTTCTTTACACGGTGATCCTTCTCTGGCAACAGCAGCCGGAGGAGCCGGAGCTCTTCCTCATCATATCGGCGTTAATATGATTGCTCCTCCTCCACCTCCCAGTGAAACTCCGATGAAACGAAAGAGAGGACGGCCTAGAAAATACGGTCAAGACGGCTCTGTTTCTTTGGCTCTGTCGTCTTCCTCTGTTTCGACCATTACTCCCAACAACTCTAACAAACGCGGCCGTGGTCGACCTCCGGGCTCCGGCAAGAAACAGAGAATGGCTTCCGTTGGTGAACTGATGCCTTCATCTTCTGGAATGAGCTTCACGCCACATGTTATCGCGGTTTCAATAGGAGAAGATATTGCATCAAAGGTTATAGCTTTCTCTCAACAAGGTCCGAGAGCCATTTGCGTTTTATCTGCAAGTGGTGCAGTCTCTACTGCAACACTTATTCAACCATCAGCATCTCCCGGAGCCATTAAATACGAGGGCCGGTTTGAAATCCTAGCGTTATCAACATCTTATATAGTGGCAACTGATGGAAGCTTCCGTAACCGAACTGGAAACTTATCGGTTTCGCTTGCTAGCCCCGATGGGCGTGTGATTGGCGGTGCCATTGGTGGGCCTTTAATAGCTGCAAGTCCTGTTCAGGTTATTGTAGGGAGCTTTATATGGGCAGCTCCAAAGATCAAGAGCAAGAAACGAGAAGAAGAAGCTTCTGAAGTTGTTCAAGAAACTGATGATCACCACGTTCTGGACAATAATAACAACACGATTTCGCCTGTCCCTCAGCAGCAGCCAAACCAAAACCTGATTTGGTCAACAGGTTCAAGGCAAATGGATATGCGTCATGCTCATGCTGATATTGATTTAATGCGCGGTTGA
AHL11 (即，AT3G61310，1065bp)
ATGGATCGAAGAGACGCAATGGCGTTATCCGGGTCGGGTTCTTACTATATCCAAAGAGGAATCCCCGGTTCTGGTCCTCCTCCTCCTCAAACTCAACCAACGTTTCACGGATCACAAGGATTTCATCATTTCACCAATTCCATCTCTCCTTTTGGGTCAAACCCAAACCCAAATCCAAACCCTGGAGGTGTCTCTACTGGATTCGTGTCTCCTCCTTTACCCGTTGACTCTTCTCCGGCTGATTCGTCAGCGGCGGCGGCGGGAGCTTTGGTTGCTCCTCCTTCAGGTGACACGTCTGTGAAGCGGAAGAGAGGACGGCCTAGAAAATATGGACAAGATGGTGGTTCTGTTTCGTTGGCATTGTCTCCTTCTATCTCCAACGTTTCCCCGAACTCTAACAAACGTGGCCGTGGAAGACCTCCTGGCTCCGGCAAGAAGCAACGGCTATCTTCCATTGGTGAAATGATGCCTTCATCAACTGGGATGAGCTTCACACCGCATGTAATCGTAGTTTCCATTGGTGAAGACATTGCTTCAAAGGTTATATCGTTCTCGCATCAAGGTCCACGAGCGATATGTGTCTTATCCGCAAGTGGTGCTGTCTCTACTGCAACTCTTCTTCAGCCAGCACCTTCTCATGGAACTATTATATACGAGGGTCTATTCGAGCTCATATCTCTCTCAACTTCTTATCTGAACACAACTGACAATGACTACCCAAACCGCACTGGAAGTCTAGCGGTCTCACTTGCTAGCCCCGATGGTCGTGTCATTGGTGGTGGAATTGGAGGTCCTCTAATAGCAGCAAGCCAAGTCCAGGTCATTGTTGGCAGCTTCATTTGGGCAATTCCGAAAGGGAAGATTAAAAAACGTGAAGAAACTTCTGAAGATGTCCAAGATACTGATGCTTTGGAAAACAACAACGATAACACAGCAGCAACGTCACCTCCTGTTCCTCAGCAAAGTCAGAACATTGTTCAGACTCCTGTAGGCATTTGGTCAACTGGTTCAAGGTCAATGGATATGCATCACCCCCATATGGACATTGATCTAATGCGTGGATGA。
具体PCR扩增时，引物序列设计如下：
AT2G45850-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGATCGAAGAGATGCAATGG-3’，
AT2G45850-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGACCGCGCATTAAATCAATATCA-3’，
AT3G61310-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGATCGAAGAGACGCAATG-3’，
AT3G61310-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTCCACGCATTAGATCAATGTCC-3’。
基于PCR扩增产物，对其进一步提纯后测序后，分析可知AHL9和AHL11这两个基因所分别编码的AHL9和AHL11蛋白都含有两个AT-hook基序和一个PPC/DUF296结构域，而基于已有其他AHL家族蛋白的研究，可知：AT-hook DNA结合基序和PPC/DUF296结构域对于AHL蛋白在细胞核内定位是非常重要的。
为进一步确定AHL9和AHL11亚细胞定位情况，参考现有技术操作，发明人采用PEG介导的拟南芥原生质体瞬时转化技术将融合GFP表达载体的质粒（pGWB405）瞬时转入到拟南芥原生质体细胞中进行表达，随后利用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光检测。
结果如图1（A）所示。分析可以看出，AHL9和AHL11均定位于细胞核。进一步利用农杆菌介导的烟草瞬时转化技术，将融合GFP表达载体的质粒（pGWB405）转化到农杆菌后，注射入烟草叶片中，进行荧光显微镜观察。结果如图1（B）所示。可以看出，进一步证明了AHL9和AHL11在亚细胞层面均定位在细胞核上，这为其具体功能发挥奠定了基础。
实施例2
在实施例1基础上，发明人进一步构建了AHL9和AHL11基因的超表达株系，以对这两个基因功能进行进一步研究。具体超表达株系构建情况简介如下。
（一）构建35S启动子驱动的超表达载体35S::AHL9/AHL11-GFP（即：35S::AHL9-GFP和35S::AHL11-GFP）
参考示意图2（B）和如下步骤构建（具体操作参考现有技术即可）：
首先，以拟南芥cDNA作为模板，根据基因序列设计引物，使用高保真DNA聚合酶进行目的基因PCR扩增；
随后，运用Gateway载体构建技术进行载体构建，即：
第一步进行BP反应，利用所设计的含有attB1和attB2位点序列的目的基因扩增引物，利用高保真聚合酶进行PCR扩增，电泳检测并回收纯化产物；随后利用Proteinase K进行大肠杆菌感受态转化；
第二步进行LR反应，在确保含有目的基因片段的BP融合载体pENTR构建正确基础上，加入表达载体pGWB405，25°C反应1 h，再进行大肠杆菌感受态转化和筛选。
（二）转化农杆菌
将步骤（一）中所构建的超表达载体质粒载体进行质粒PCR鉴定、酶切鉴定和测序验证，确保其重组构建正确后，转化至农杆菌GV3101；具体而言：
在100 μL的农杆菌感受态GV3101加入1-2 μL测序成功的重组大肠杆菌质粒，冰上静置5分钟，接着液氮5分钟，37℃反应5分钟，之后再在冰上静置5分钟后放置28℃摇床上220 rpm培养2-3小时，最后将培养完成的农杆菌涂布在相应的抗性平板上，倒置于28℃培养箱中培养36-48小时。
（三）转化
采用花序侵染转化法，将拟南芥花序浸没于步骤（二）的农杆菌液中，进一步抗性筛选获得AHL9/AHL11超表达转基因植株，具体转化操作参考如下：
将培养过夜的农杆菌保菌之后4000 rpm、5 min离心集菌，倒掉上清后加入重悬液（100 ml超纯水中加入0.023 g MS，5 g蔗糖）调OD值至1.0左右，加适量表面活性剂后摇晃均匀，接着将拟南芥花序浸没一定时间后黑暗处理24h。
对纯合的ahl9单突变体植株进行繁种并观察表型结果发现，与野生型相比，ahl9单突并无明显表型差异（如图2A）。
对于抗性筛选阳性植株（部分筛选结果如图2（C）所示），待植株叶片稍大时，剪取幼苗叶片分别提取基因组DNA，进行PCR鉴定，以确保获得的超表达材料是转基因成功的。部分鉴定结果如图2（D）、图2（E）所示。可以看出，抗性筛选获得的超表达转基因植株均是阳性目的植株。
进一步地，对转基因阳性纯合体材料进行qRT-PCR检测，以评价AHL9、AHL11基因表达水平。
qRT-PCR检测时，引物序列设计如下：
AHL9-1-qRT-F：5’-TCCGTAACCGAACTGGAAAC-3’，
AHL9-1-qRT-R：5’-TGAACAGGACTTGCAGCTATTA-3’；
AHL9-2-qRT-F：5’-GATCACCACGTTCTGGACAA-3’，
AHL9-2-qRT-R：5’-GCATGAGCATGACGCATATC-3’；
AHL11-1-qRT-F： 5’-GGTCAAACCCAAACCCAAATC-3’，
AHL11-1-qRT-R：5’-GGAGAAGAGTCAACGGGTAAAG-3’；
AHL11-2-qRT-F：5’-GGTGGTTCTGTTTCGTTGGC-3’，
AHL11-2-qRT-R：5’-TCGAAAACACGCAGAAATTCCTAA-3’；
ACTIN-qRT-F：5’-GTAACATTGTGCTCAGTGGTGGTA-3’，
ACTIN-qRT-R：5’-GATAGAACCACCAATCCAGACACT-3’。
需要说明的是，检测分析时，两对不同引物（AHL9-1-qRT-F、AHL9-1-qRT-R，AHL9-2-qRT-F、AHL9-2-qRT-R；AHL11-1-qRT-F、AHL11-1-qRT-R，AHL11-2-qRT-F、AHL11-2-qRT-R）均适合用于AHL9、AHL11基因qRT-PCR检测，之所以采用不同引物，主要是为确保检测结果的准确性，从而便于较为准确地评价AHL9、AHL11基因表达水平情况。定量分析时以拟南芥ACTIN基因作为内参。
部分检测结果如图3（A）、图3（B）所示。可以看出，AHL9/AHL11在多个超表达株系中均呈现较高水平的表达。而为便于后续观察和研究，仅选取AHL9表达量较高的OE-10（需要说明的是，OE9的重复结果不太稳定，因此做了舍弃）和OE-11、AHL11表达量升高的OE-5和OE-6各两个株系进行后续研究。
实施例3
在实施例2基础上，对获得的T3代超表达株系纯合体的种子，发明人进一步进行了表型观察和其他实验，以确定AHL9和AHL11基因与植物衰老调控的关系，相关实验简介如下。
（1）对叶片衰老的影响
对获得的超表达植株进行表型分析，将完全干燥的T3代超表达纯合体种子与同一时期收取的野生型的种子种植在营养土中，放在长日照植物材料室中培养，定期进行观察表型。
部分表型情况汇总如图4所示。对比可以发现：
AHL9超表达植株叶片细长，向外卷曲（图4（A）），而AHL11超表达植株的叶片明显变皱，并发生卷曲现象（图4（C）），而与野生型相比，AHL9和AHL11超表达植株在生长32天后都出现了明显的叶黄化现象（图4（A）、图4（C））。
进一步地，发明人对5周龄野生型植株和超表达植株的叶片进行了叶黄化分析（图4（B）、图4（D）），以确定具体衰老表型差异。可以看出：与野生型植株相比，AHL9/AHL11超表达植株叶片的尖端最先变黄，而且AHL9超表达植株叶片的衰老程度要低于AHL11超表达植株。
综合这些表型结果，可以初步判定AHL9、AHL11基因与植株叶片形态（卷曲表型）、尤其与叶片早衰表型相关，也即，通过调控AHL9、AHL11基因表达水平变化可以调控植物生长周期（或者说，通过这两个基因的超表达，可以缩短植物生活史周期）。
（2）对具体衰老基因表达影响
在对超表达株系衰老表型观察过程中，发明人进一步对叶片不同生长时期的衰老相关基因表达情况进行了检测，以初步探讨AHL9、AHL11基因对于衰老过程的调控机制。具体实验简介如下。
首先，对第四、五片莲座叶在不同生长时期的衰老表型进行汇总，如图5（A）、图6（A），可以发现，随着叶龄的增加，AHL9/AHL11超表达植株叶片的尖端最先变黄，这与前述表型观察结果是一致的。
进一步地，发明人对于不同生长时期的成熟叶片衰老相关的生理参数（主要是叶绿素含量）进行了分析，对衰老相关基因SAGs（包括：SAG12、SAG13、SAG113）以及光合作用相关基因（CAB1和RBCS1）在叶片不同生长时期的转录水平进行了qRT-PCR检测。
进行qRT-PCR分析时，相关引物设计如下：
SAG12-qRT-F ：5’-ATCCAAAAGCAACTTCTATTACAGG-3’，
SAG12-qRT-R：5’-CCACTGCCTTCATCAGTGC-3’；
SAG13-qRT-F ：5’-AGGAAAACTCAACATCCTCGTC-3’，
SAG13-qRT-R：5’-GCTGACTCGAGATTTGTAGCC-3’；
SAG113-qRT-F：5’-CCATGGCTGTTCCCATGTA-3’，
SAG113-qRT-R：5’-AAGCTACGCGCCATTGAC-3’；
CAB1-qRT-F：5’-GCAAGGAACCGTGAACTAGAA-3’，
CAB1-qRT-R：5’-TCCGAACTTGACTCCGTTTC-3’；
RBCS-qRT-F：5’-CGCTCCTTTCAACGGACTTA-3’，
RBCS-qRT-R：5’-AGTAATGTCGTTGTTAGCCTTGC-3’；
ACTIN-qRT-F：5’-GTAACATTGTGCTCAGTGGTGGTA-3’，
ACTIN-qRT-R：5’-GATAGAACCACCAATCCAGACACT-3’。
测定拟南芥成熟叶片中叶绿素含量时，具体测定方法参考如下：
选取拟南芥的第四、五片莲座叶，称量其新鲜叶片的重量后，置于2 mL规格的EP管中，加入1 mL叶绿素提取液（95%乙醇），黑暗中室温孵育24 h（期间吹打混匀4-5次，以确保孵育效果）；
离心后，取200μL上清液加入酶标板中，分别测量溶液在665 nm和649 nm处的吸光值，以叶绿素提取液为阴性对照；
叶绿素含量的计算公式为：
ChlorophyⅡ a（μg/mL） = 13.95 × A665 - 6.88 × A649；
ChlorophyⅡ b（μg/mL） = 24.96 × A649 - 7.32 × A665；
Total Chlorophyll（mg/g FW）= Ca + Cb）× V/W；
式中：V，提取液体积，在此方法中为1 mL；W：新鲜叶片的重量。
检测结果如图5、图6所示。具体而言：AHL9、AHL11基因表达水平均明显高于野生型（图5（C）、图6（C）），也即，转基因植株的遗传稳定性是较为稳定的；进一步表型观察表明，与野生型相比，相同生长时期，超表达植株叶片中叶绿素含量明显低于野生型（图5（A）、图5（B）、图6（A）、图6（B）），也即，超表达植株的转基因新品种的叶绿素降低速率是明显高于野生型的；而光合作用相关基因CAB1和RBCS1的转录水平检测结果表明，转基因植株中的光合作用相关基因的转录水平明显低于野生型（图5（G）、图5（H）、图6（G）、图6（H））；进一步衰老相关基因SAG12、SAG13以及SAG113的转录水平检测结果表明，转基因株系中衰老相关基因的转录水平明显高于野生型（图5（D）、图5（E）、图5（F）、图6（D）、图6（E）、图6（F））。
有研究显示叶片衰老可以通过黑暗环境胁迫的诱导，为了探讨AHL9和AHL11在黑暗诱导叶片衰老过程中的作用，发明人分析了野生型和超表达植株在黑暗诱导下的衰老表型，将WT、AHL9和AHL11超表达植株的第四、五片莲座叶放在MES buffer中进行黑暗处理。
实验过程中，对于拟南芥离体叶片的黑暗处理，参考如下操作：
选取生长三周左右相同位置的成熟叶片（通常选择第四片莲座叶），暗处理前进行拍照记录，并测定其叶绿素含量；
在22℃连续黑暗环境下，将叶片放入MES buffer中进行孵育，每天进行观察拍照记录；
暗处理3天后，观察叶片的叶黄化现象并拍照记录，再将叶片用双蒸水清洗2-3遍后，测定其叶绿素含量。
检测结果如图7所示。可以看出：黑暗诱导3天后，通过处理叶片的颜色变化可以发现，相较于野生型，超表达植株在黑暗诱导下的叶黄化现象较为明显，并且叶片衰老得更快（图7（A）、（C））。除此之外，我们还检测了黑暗处理后叶片的叶绿素含量，分析发现超表达植株叶片的叶绿素含量也明显比野生型下降得快（图7（B）、（D））。这一结果表明AHL9和AHL11可以调控黑暗诱导的叶片衰老。
综合上述结果可以看出：超表达植株叶片衰老过程中叶绿素含量的下降、光合作用相关基因转录水平的降低以及衰老相关基因表达量升高，与叶片提前变黄的衰老表型是一致的，这表明AHL9和AHL11基因在调节叶片衰老中起着重要作用，尤其是当其超表达时，可以明显促进叶片的衰老进程。
Claims (3)
1.拟南芥AHL11基因在调控拟南芥叶片衰老方面应用，其特征在于，所述拟南芥AHL11基因与拟南芥叶片的衰老相关，其所编码蛋白作为转录因子会影响衰老相关基因及光合作用相关基因的表达，进而通过调节乙烯积累和衰老信号途径来调控叶片衰老进程；
所述衰老相关基因SAGs包括：SAG12、SAG13、SAG113；
所述光合作用相关基因包括：CAB1、RBCS1；
所述调控是将AHL11基因超表达后，与野生型相比，超表达株系的叶片中光合作用相关基因的转录水平明显低于野生型，而衰老相关基因的转录水平明显高于野生型，叶片表型方面均提前衰老；
所述衰老，具体表型方面表现为：与野生型相比，植株生长到后期进入生长周期的衰老阶段过程中，超表达植株叶片中叶绿素含量明显较低，黄化面积明显大于野生型。
2.如权利要求1所述拟南芥AHL11基因在调控拟南芥叶片衰老方面应用，其特征在于，超表达过程中，制备AHL11基因时，以拟南芥cDNA为模板，采用PCR扩增方法制备获得，PCR扩增时，引物序列设计如下：
AT3G61310-F：
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGATCGAAGAGACGCAATG-3’，
AT3G61310-R：
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTCCACGCATTAGATCAATGTCC-3’。
3.如权利要求1所述拟南芥AHL11基因在调控拟南芥叶片衰老方面应用，其特征在于，利用基因工程技术，将AHL11基因进行超表达后，制备获得短生长周期的拟南芥品种。
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| GR01 | Patent grant | ||
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