CZ45099A3 - Čištěné proteiny, sekvence rekombinantní DNA a způsoby řízení zrání kávovníkových rostlin - Google Patents

Čištěné proteiny, sekvence rekombinantní DNA a způsoby řízení zrání kávovníkových rostlin Download PDF

Info

Publication number
CZ45099A3
CZ45099A3 CZ99450A CZ45099A CZ45099A3 CZ 45099 A3 CZ45099 A3 CZ 45099A3 CZ 99450 A CZ99450 A CZ 99450A CZ 45099 A CZ45099 A CZ 45099A CZ 45099 A3 CZ45099 A3 CZ 45099A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
acid sequence
nucleic acid
coffee
encodes
seq
Prior art date
Application number
CZ99450A
Other languages
English (en)
Inventor
John I. Stiles
Istefo Moisyadi
Kabi Raj Neupane
Original Assignee
University Of Hawaii
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Of Hawaii filed Critical University Of Hawaii
Publication of CZ45099A3 publication Critical patent/CZ45099A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8249—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving ethylene biosynthesis, senescence or fruit development, e.g. modified tomato ripening, cut flower shelf-life
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Tea And Coffee (AREA)

Description

Čištěné proteiny/ sekvence rekombinantní DNA a způsoby řízení zrání kávovníkových rostlin
Oblast techniky
Tato přihláška se týká čištěných proteinů, sekvencí rekombinantní DNA, jimi transformovaných hostitelů a způsobů řízení zrání kávovníkových rostlin. Zejména se tato přihláška vynálezu týká čištěných proteinů a sekvencí rekombinantní DNA, které mohou být použity k potlačení exprese pro kávovníkové plody specifické 1-aminocyklopropan-l-karboxylové kyseliny (ACC) synthasových a ACC oxidasových genů. Tato přihláška vynálezu se dále týká kávovníkových rostlin transformovaných takovýmito sekvencemi, čímž se učiní nezpůsobilými syntetizovat ethylen nutný pro zrání. Aplikace exogenního ethylenu do rostlin transformovaných podle tohoto vynálezu umožňuje synchronizovat a řídit zrání plodů kávovníkových rostin.
Dosavadní stav techniky
Káva se připravuje z pražených zrn z rostlin rodu Coffea, hlavně z druhů C. arabica. Zrna jsou semena kávovníku a získávají se zpracováním plodu nejideálněji zralého plodu, který si zaslouží nejlepší cenu vlivem jeho výborné kvality.
V minulosti vysoce kvalitní (gurmánská) káva byla sklízena ručně. To je nutné, poněvadž plody kávovníkového stromku nezrají stejnoměrně a tak jsou tam jak zralé, tak nezralé plody na stejném stromku. V minulosti to nebyl vážný problém, protože většina kávovníků se pěstovala v oblastech světa, kde je hojnost pracovní síly a ta není drahá. Avšak v současnosti ztráta hojné a laciné pracovní síly se stala hlavním přispěvatelem k snížené produktivitě při produkci kávy.
K zvýšení produktivity některé oblasti světa jako je největší produkční země Brazílie, se uchýlily k úplnému sklízení, kde pracovníci rychle odstraní všechny plody z větve, at jsou zralé nebo nezralé. To zvyšuje rychlost sklizně, ale snižuje výtěžek zrn nejvyšší kvality podle toho, jak je plod nezralý (zelený).
Navíc nedostatek rovnoměrného zrání značně omezil účinnost mechanického sklízení. Síla vyžadovaná pro odstranění zralých plodů (červených) ze stromu je podobná síle požadované k odstranění zelených plodů. Tak mechanické sklízeče nerozlišují dobře mezi zelenými a červenými plody a velké množství nezralých plodů se sklízí spolu se zralými plody. To značně snižuje výtěžek zralých plodů a omezuje produktivitu.
Kdyby zrání kávovníkových plodů mohlo být řízeno tak, aby všechny plody zrály najednou, jak česací způsob ručního sklízení, tak mehcanické sklízení by mohlo být účinnější a vyšší procentáž sklizených plodů by byla ve vyšší kvalitativní třídě.
To by zvýšilo výnosnost produkce kávy.
Jako v případě u mnoha jiných plodů [Yang a Hoffman, Ann.Rev.Plant Physiol.35:155 (1984)], rostlinou produkovaný ethylen hraje důležitou roli v konečných stadiích zrání plodů u kávovníku. Jak kávovníkový plod dosáhne určitého stadia zralosti, může být indukováno zrání exogenní aplikací ethylenu [crisosto, C.H., P.C. Tausend, M.A. Nagao, L.H. Fuchigami a T.H.H. Chen, J. Haw. Pac. Agri.3:13-17 (1991)]. To demonstruje důležitost ethylenu pro konečná stadia zrání plodů u kávy.
Ethylen se syntetizuje ve dvoustupňové reakci z
S-adenosilmethioninu (SAM). První stupeň je syntéza 1-aminocyklopropan-l-karboxylové kyseliny (ACC) z SAM pomocí ACC synthasy. U většiny rostlin je to rychlost omezující stupeň. Konečný stupeň je konverze ACC na ethylen, který se katalýzuje ACC oxidasou (Yang a Hoffman viz výše).
Inhibice biosyntézy ethylenu chemickými (například stříbrnými ionty nebo oxidem uhličitým) nebo biotechnologickými prostředky [oeller a j., Science 254:437 (1991)] inhibuje konečné stupně zrání. Tato inhibice je reversibilní aplikací ethylenu.
Tudíž strategie pro řízení zrání kávovníkových rostlin je zabránit syntéze specifických enzymů na linii biosyntézy ethylenu. V jednom provedení tohoto vynálezu se to týká genetické změny kávovníkových rostlin, aby se eliminovaly syntéza ACC synthasy, v dalším se potlačí syntéza ACC oxidasy.
V současně preferovaných provedeních se syntéza jednoho nebo obou těchto enzymů potlačí transformací kávovníkových rostlin DNA sekvencí, která kóduje na transkripci pro mediátorových RNA (mRNA), která je antimediátorová k mRNA, která kóduje na expresi pro enzym, jehož syntéza má být potlačena. Viz Oeller a j., Science 254: 437, 1991, kde se uvádí řízení zrání rajčat za použití podobné strategie.
Technologie rekombinantní DNA byla použita k izolaci určitého počtu ACC synthasových a ACC oxidasových genů. Avšak geny pro ACC synthasu a ACC oxidasu u kávovníku nebyly dosud identifikovány nebo sekvencovány.
Podstata vynálezu
Vynález se týká čištěných proteinů, sekvencí DNA, které kódují na expresi jejich a rekombinantních DNA molekul, včetně hostitelů jimi transformovaných pro transformaci kávovníkových rostlin pro potlačení exprese enzymů nutných pro syntézu ethylenu. Sekvence DNA a molekuly rekombinantní DNA jsou vyznačeny tím, že kódují na expresi pro enzymy ACC synthasy nebo ACC oxidasy, které jesou elementy linie pro biosyntézu ethylenu u kávovníkových rostlin.
Kávovníkové rostliny jsou transformovány vektory obsahujícími ACC synthasu a/nebo ACC oxidasovými DNA sekvencemi zařazenými tak, aby transformující sekvence kódovaly na expresi pro příslušnou antimediátorovou RNA vůči mRNA pro ACC synthasu a/nebo ACC oxidasu. Výsledná antimediátorová RNA se váže k mRNA, čímž se inaktivuje mRNA zakódování jednoho nebo více enzymů v linii pro syntézu ethylenu. Popsané DNA sekvence mohou být také použity k blokování syntézy ACC synthasy nebo ACC oxidasy za použití kosuprese. Výsledek v každém případě je takový, že transformované rostliny jsou neschopné syntetizovat ethylen, ačkoli jiné aspekty jejich metabolizmu nejsou ovlivněny.
Zrání transformovaných rostlin může být regulováno exogenním ethylenem. Aplikací ethylenu do celé rostliny, celá rostlina bude zrát najednou, což dělá mechanické sklízení kávy produktivně j š ím.
Stručný popis výkresů
Obr. 1 je úplná sekvence cDNA kódující kávovníkový plod expresovaný ACC synthasou, obr. 2 je aminokyselinová sekvence ACC synthesy kávovníkového plodu odvozené od cDNA sekvence znázorněné v obr. 1, obr. 3 je sekvence cDNA kódující kávovníkový plod expresovaný ACC oxidasou, obr. 4 je aminokyselinová sekvence ACC oxidasy kávovníkového plodu vyvozené z cDNA sekvence znázorněné v obr. 3.
Podrobný popis vynálezu
Aby zde popsaný vynález mohl být plně pochopen, je dále uveden detailní jeho popis. Při tomto popisu se používají následující výrazy.
Nukleotid - monomerní jednotka DNA nebo RNA sestávající z cukerné části (pentosy), fosfátu dusíkaté heterocyklické báze. Tato báze je vázána k cukerné části pomocí glykosidického uhlíku (1' uhlíku pentosy) a tato kombinace báze a cukru se nazývá nukleosid. Báze charakterizuje nukleotid. Čtyři DNA báze jsou adenin (A), guanin (G), cytosin (C) a thymin (T). Čtyři RNA báze jsou A, G, C a uráčil (U).
DNA sekvence - lineární uspořádání nukleotidů spojených jednoho s druhým fosfodiesterovými vazbami mezi 3' a 5' uhlíky přilehlých pentos.
Kodon - DNA sekvence tří nukleotidů (triplet), která kóduje skrz mRNA aminokyselinu, translační startovací signále nebo translační terminační signál. Například nukleotidové triplety TTA, TTG, CTT, CTC, CTA a CTG kódují aminokyselinu leucin (Leu)/ TAG, TAA a TGA jsou translační koncové signály a ATG je translační startovací signál, který také kóduje aminokyselinu methionin (MET).
Polypeptid - lineární uspořádání aminokyselin připojených jedna k druhé peptidovými vazbami mezi aminoskupinami a karboxyskupinami přilehlých aminokyselin.
Genom - celá DNA buňky nebo viru. Zahrnuje mimo jiné strukturální genové kódování polypeptidů látky stejně jako promotor, transkripční a translační iniciační a terminační místa.
Gen - DNA sekvence, která kóduje skrze její matrici nebo mediátorovou RNA (mRNA) sekvenci aminokyselin charakteristickou pro specifický polypeptid.
Transkripce - způsob tvorby mRNA z genu nebo DNA sekvence.
Translace - způsob tvorby polypeptidu z mRNA.
Exprese - způsob podstoupený genem nebo DNA sekvencí k produkci polypeptidu. Je to kombinace transkripce a translace.
Plasmid - nechromosomální dvouřetězcová DNA sekvence zahrnující intaktní replikon, takže plasmid je replikován v hostitelské buňce. Když je plasmid uložen v jednobuněčném organizmu, vlastnosti tohoto organizmu mohou být měněny nebo transformovány jako výsledek DNA tohoto plasmidů. Například plasmid nesoucí gen pro tetracyklinovou resistenci (TETR) transformuje buňku dříve citlivou na tetracyklin na buňku, která je vůči němu rezistentní. Buňka transformovaná plasmidem se nazývá transformant*.
Fág nebo bakteriofág - bakteriální viry, z nichž mnoho sestává z DNA sekvencí zapouzdřených v proteinovém obalu nebo povlaku (kapsy).
Klonovací přenašeč (vektor) - plasmid, fágová DNA, kosmid nebo jiná DNA sekvence, která se schopná replikovat v hostitelské buňce, vyznačená jedním nebo malým počtem endonukleasových rozpoznávacích míst, ve kterých takovéto DNA sekvence mohou být přerušeny v určitelné podobě bez doprovodné ztráty základní biologické funkce DNA, například replikace produkce obalových proteinů nebo ztráty promotorových nebo vazebních míst a které obsahují signální znak vhodný pro použití při identifikaci trans formovaných buněk, například tetracyklinovou nebo ampicilinovou rezistenci. Klonovací přenašeč je často nazýván vektorem.
Klonování - způsob získávání populace organizmů nebo DNA sekvencí odvozených z takovéhoto organizmu nebo sekvence asexuální reprodukcí.
Ί
Molekula rekombinantní DNA nebo hybrid DNA - molekula sestá vající ze segmentů DNA z různých genomů, které byly spojeny konec ke konci venku z žijících buněk a schopných udržování v žijících buňkách.
cDNA - DNA řetězec komplementární k mRNA, který kóduje příslušný polypeptid.
Strategie pro řízení ethylenové biosyntézy u kávovní kových rostlin podle předloženého vynálezu se týká v první řadě určení genů, které kódují expresi dvou enzymů v ethylenové linii: ACC synthasu a ACC oxidasu. Transformace planého typu kávovníkových rostlin s konstrukty obsahujícími buň jeden nebo oba geny v orientaci, že jsou antimediátorové vůči normálním genům je očekávána k blokaci syntézy příslušných enzymů. Mediátorová RNA transkribovaná ve směru od transformující sekvence se bude vázat k mRNA transkribované ve směru od normální sekvence, čímž se inaktivuje normální poslání a zabraňuje se syntéze enzymu.
K izolaci DNA sekvencí, které kódují expresi ACC synthasy a ACC oxidasy u kávovníku původci prověřili cDNA banku vytvořenou z tkáně kávovníkové rostliny při syntetických DNA zkouškách obsahujících nukleotidové sekvence, které jsou předpokládány. Tyto očekávané sekvence byly založeny na studiích nukleotidových sekvencí, které se vyskytují v genech, které kódují příslušné enzymy jiných přechodných rostlin a jiných rostlin.
V tomto vynálezu cDNA odpovídající genu kódujícímu ACC synthasu nebo ACC oxidasu se použije k transformování embrionálních kávovníkových rostlin. Plasmid pBI-121 se použije jako transformační vektor. Sekvence odpovídající DNA, která kóduje expresi ACC synthasy nebo ACC oxidasy se zavedou do plas midu v invertní orientaci přilehle k promotoru květákového mozaikového viru 35S.
RNA z toho transkribovaná bude komplementární k mRNA, která kóduje aminokyselinovou sekvenci příslušného enzymu.
Kompletní konstrukty jsou amplifikovány v bakteriálních hostitelích. Hostitelé jsou rozrušeni a amplifikovaný vektor je připojen k částicím koloidního zlata. Částice zlata s adherentními vektory se zavedou do tkáně kávovníkové rostliny vháněním částic vysokou rychlostí do buněk jak je popsáno v US patentu 5 107 065. Mladé rostliny úspěšně transformované jsou identifikovány antibiotickou rezistencí. Transformované rostliny neprodukují ACC synthasu nebo ACC oxidasu v závislosti na genu použitém k transformaci rostlin. Zrání transformovaných rostlin je iniciováno aplikací exogenního ethylenu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace pro kávovníkové plody specifické ACC synthasní cDNA
Aby se izolovaly ACC synthasní genové sekvence zapojené do zrání kávy, byla připravena cDNA banka ze směsi perikarpové a mezokarpové tkáně plodů kávy v různých stádiích zralosti. Tato banka byla tříděna pomocí PCR produktu syntetizovaného z prvořetězcové cDNA připravené ze stejné mRNA použité ke konstrukci banky a degeneraci oligonukleotidových primerů odpovídajících souhlasným sekvencím odvozeným z ACC synthasních genů z jiných organizmů. Tento příklad v základu zahrnuje izolBci mRNA, konstrukci cDNA banky a následující kroky zahrnuté v klonování příslušné cDNA.
a) Izolace mRNA
Celková RNA byla izolována z 66 g perikarpové a mezokarpové tkáně z několika různých vývojových stavů plodů kávovníku (C.arabica L. cv. Guatemalan) pomocí metody Leviho a j., [Hort Science 27(12):1316-1318 (1992)]. Zmrazená kávová perikarpová a mezokarpová tkáň byla upráškována drcením po do- ‘ bu asi 2 minut v domácím kávovém mlýnku (Salton Model GC-5, Salton Maxam Hausewares Group, MT Prospect, IL) s malými kousky suchého ledu. Upráškovaná plodová tkáň byla přidána do 200 mikrolitrů 200mM tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridu (tris-HCl) (pH 8,5), l,5%ního dodecylsulfatu sodného (SDS),
300 mM LiCl, 10 mM disodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny (Na2EDTA), 1,5 % deoxycholatu sodného (hm:obj), 1,5 % Nonidet P-40 (Sigma Chemical Company) (objsobj), 0,5 mM thiomočoviny, 1 mM aurintrikarboxylové kyseliny, 10 mM dithiothreitolu (DTT), 75 mM B-merkaptoethanolu, 2 % polyvinypyrrolidonu (PVP) a 2 % póly viny lpolypyrrolidino (PWP) a byla provedena homogenizace pomocí Polytron tkáňového homogenizátoru (Tekmar, Cincinnati, OH).
Po 2 minutách homogenizace bylo přidáno 200 1 chloroformu a homogenizace pokračovala po dobu dalších 3 minut. Homogenát byl převeden do 250 mikrolitrových odstředivkových lahviček (Nalgene) a centrifugován po dobu 15 minut při 2500.g.
Vrchní vodná fáze byla odstraněna a smíchána s 12 mikrolitry 5M NaCl stejnoměrně rozdělena do 2 odstředivkových lahviček a bylo přidáno do každé lahvičky 150 mikrolitrů ethanoiu.
Směs byla uskladněna při 20 °C přes noc.
RNA byla shromážděna odstředěním při 4000.g po dobu 15 minut při teplotě 4 °C. RNA byla rozpuštěna v 50 mikrolitrech TEl (50 mM tris-HCl (pH 8,0), 10 mM Na2EDTA) a vyčeřena odstřelováním při 12 000.g po dobu 10 minut při 4 °C.
Supernatant byl převeden do nové odstředivkové lahvič ky a byly přidány 3 mikrolitry 5 M NaCl a 30 mikrolitrů isopropanolu. Obsahy byly smíchány a uloženy při 20 °C přes noc.
RNA byla shromážděna odstředěním při 14 000.g po dobu 10 minut. RNA byla promyta 20 mikrolitry 70%ního ledově studeného ethanoiu a shromážděna odstředěním jako dříve. Po vysušení za vakua po dobu 10 minut byla RNA resuspendována v 50 mikrolitrech TEl pufru a bylo přidáno 10 mikrolitrů 12M LiCl.
Roztok byl inkubován při 4 °C po dobu 48 hodin a RNA byla shromážděna odstředěním při 14 000.g po dobu 10 minut a resuspendována ve 30 mikrolitrech TEl pufru. Po přídavku 15 mikrolitrů 5M octanu draselného byla RNA inkubována přes noc při 0 °C, získána odstředěním při 14 000.g po dobu 10 minut a suspendována v 50 mikrolitrech TEl pufru. Byly přidány 3 mikrolitry 5M NaCl a 110 mikrolitrů 95%ního ethanoiu a RNA byla inkubována při -20 °C přes noc.
RNA byla získána odstředěním při 14 000.g po dobu minut, promyta 20 mikrolitry 70%ního ledově studeného ethanoiu, získána odstředěním jak je výše uvedeno, vysušena za vakua během 10 minut a resuspendována v 600 mikrolitrech TEl pufru. RNA byla převedena do mikroodstředivkové zkumavky a odstředěna při 14 000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut při 4 °C po čemž bylo 300 mikrolitrů odebráno do každé ze 2 nových mikroodstředivkových zkumavek.
Původní odstředěná zkumavka byla propláchnuta dalšími 300 mikrolitry TEl pufru. Bylo přidáno 18 mikrolitrů 5M NaCl a 636 mikrolitrů 100%ního ethanolu do každé z těchto tří zkumavek. Po smíchání převracením byly zkumavky uloženy přes noc při -20 °C. RNA byla shromážděna odstředěním při 14 000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut a promyta 1 mikrolitrem 70%ního ledově studeného ethanolu. Po odstředění a vysušení jako výše, byla RNA resuspendována ve 400 mikrolitrech sterilní H20. Celkem bylo získáno 1,04 úplné RNA.
Mediátorová RNA (polyA+ RNA) byla izolována za použi tí PolyATtracf^ mRNA Isolation System IV (Promega Corporation, Madison, WI).
Celkem byly provedeny dvě izolace následujícím způsobem. Pro každou izolaci bylo 0,4 mg úplné RNA rozpuštěno v 800 mikrolitrech RNase-prosté vody. Po zahřívání při 65 °C po dobu 10 minut byly přidány 3 mikrolitry 50 pmol/ml biotinylovaného oligo(dT) a 20,7 mikrolitrů 20 X SSC (1 X SSC obsahuje 150 mM NaCl a 15 mM citranu sodného) a směs byla ponechána pomalu chladnout na teplotu místnosti po dobu asi 30 minut.
Alikvot streptavidinových paramagnetických částic vytvořených v PolyAtracl^^ mRNA Isolation System IV) byl promyt třikrát v 0,5 X SSC a resuspendován v 0,1 ml 0,5 X SSC.
RNA roztok obsahující biotinylovaný oligo (dT) byl přidán k promytým streptavidinovým paramagnetickým částicím. Po 10 minutách inkubace při teplotě místnosti byly paramagnetické části ce obsahující zachycenou mRNA shrnuty ke straně zkumavky pomocí magnetu.
Supernatant byl odstraněn a částice byly promyty čtyřikrát 0,3 ml 0,1 X SSC. mRNA byla odstraněna z biotinylovaných oligo(dT)částic supendováním v 200 mikrolitrech RNase-prosté vody.
Další eluce byla provedena přidáním 150 mikrolitrů vody postupně do každé ze dvou zkumavek. Eluční frakce (550 mikrolitrů) byly sdruženy a odstředěny při 14 000 otáčkách za minutu v mikroodstredivce po dobu 30 minut pri 4 C. Supernatant byl rozdělen do dvou mikroodstředivkových zkumavek a po přídavku 0,1 objemu 3M NaCl a 600 mikrolitrů ethanolu byla mRNA získána inkubací zkumavek při -20 °C přes noc, načež následovalo odstředění jak bylo výše uvedeno.
mRNA byla promyta jednou 1 ml ledově studeného 70%ního ethanolu, vysušena a resuspendována ve 20 mikrolitrech sterilní vody. 1 mikrolitr byl přidán do 1 ml vody a bylo získáno spektrum od 230 nm do 330 nm v Shimadzu UV 160U spektrofotometru. Bylo získáno 6 mikrogramů mRNA z 1,04 mg celkové RNA.
b) Konstrukce cDNA banky
První a druhý řetězec cDNA byl syntetizován za po- . užití ZAP-cDNA syntézního souboru (Strategene, La Jolla, CA).
mikroorganizmů mRNA ve 20 mikrolitrech vody bylo inkubováno při 65 °C po dobu 5 minut. 2 mikrolitry lOOmM methylrtuti byly přidány a inkubace pokračovala při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Byly přidány 4 mikrolitry 700mM B-merkaptoethanolu a inkubace pokračovala po dalších 5 minut. Do denaturované mRNA bylo přidáno 5 mikrolitrů 10 X prvořetězcového pufru (zajištěného v souboru), 5 mikrolitrů lOOmM DTT, 3 mikrolitry nukleotidové směsi (10 mM každého dATP, dGTP, dTTP a 5-methyldCTP), 2 mikrolitry 1,4 mikrogram/mikrolitr. spojovacího primerui 5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (sekv.id.č.l), mikrolitr RNase bloku a 5 mikrolitrů vody. Reakce byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 10 minut k teplotní hybridizaci primeru k mRNA a pak byly přidány 3 mikrolitry 20 j/mikrolitr M-MuLV reversní transkriptasy.
mikrolitrů této reakční směsi bylo odebráno do zkumavky obsahující 0,5 mikrolitrů (0,625 pmol) 800 Ci/mmol 3 2 [oC P] dATP. Obě reakce byly inkubovány při 37 °C po dobu 1 hodiny. Radioaktivně značená reakce byla zmrazená při -20°C pro pozdější gelovou analýzu.
Do 45 mikrolitrů hlavní reakce bylo přidáno 40 ml druhořetězcového pufru, 15 mikrolitrů lOOmM DTT, 6 mikrolitrů nukleotidové směsi (10 mM dATP, dGTP, dTTP a 26 mM dCTP),
268,3 mikrolitry vody a 2 mikrolitry (2,5 pmol) 800 Ci/mmol o O [oó Pj dATP. Po smíchání bylo přidáno 4,5 mikrolitrů 1 j/mikrolitr RNase H a 19,2 mikrolitrů 5,2 j/mikrolitr E. coli DNA polymerasy I a reakce byla inkubována při 16 °C po dobu
2,5 hodin. Reakce byla extrahována 400 mikrolitry fenol:chloroform (1:1). Fáze byly odděleny odstředěním v mikroodstředivce během 5 minut a vodná fáze odebrána a reextrahována chloroformem. Vodná fáze byla získána odstředěním jak bylo dříve uve děno.
Dvouřetězcová cDNA byla vysrážená přídavkem 33,3 mikrolitrů 3M octanu sodného (pH 5,2) a 867 mikrolitrů 100% ethanolu a inkubací přes noc při -20 °C. cDNA byla získána odstředěním při 14 000 . g v mikroodstředivce při 4 °C po dobu 60 minut. cDNA byla promyta 1 ml 80%ního ehanolu, získána odstředěnímpři teplotě místnosti v odstředivce při 14 000 . g, vysušena za vakua a rozpuštěna ve 45 mikrolitrech vody.
mikrolitry resuspendované dvojřetězcové cDNA byly odebrány a uskladněny při -20 °C pro pozdější analýzu gelovou elektroforézou.
Do zbývajících 42 ml dvojřetězcové cDNA bylo přidáno 5 mikrolitrů 10 X Klenow pufru (pufr č. 3, dodávaný firmou Stratagene), 2,5 mikrolitrů 2,5 mM nukleotidů (dCTP, dGTP, dATP a dTTP) a 0,5 mikrolitrů 5 j/mikrolitr E. coli DNA polymerasy I Klenow fragmentu. Po 30 minutách při 37 °C bylo přidáno 50 mikrolitrů vody a reakce byla extrahována stejným objemem fenol:chloroform (1:1) a pak chloroformem jak bylo popsáno výše.
Po přídavku 7 mikrolitrů 3M octanu sodného (pH 5,2) a 226 mikrolitrů 100%ního ethanolu byla zarovnaně zakončena dvojřetězcová cDNA inkubována na ledu po dobu 30 minut a získána odstředěním při 14 000 otáčkách za minutu při 4 °C během 60 minut v mikroodstředivce. cDNA byla promyta 30 mikrolitry 70%ního ehanolu, odstředěna a vysušena jako dříve. Bylo přidáno 7 mikrolitrů 0,4 mikrogram/mikrolitr E^coRI spojovníků k vysušené cDNA. Struktury E^_coRI spojovníků jsou:
5*-AATTCGGCACGAG-3' (sekv.id.č.2 )
3'-GCCGTGCTC-5'.
Po zvíření k resuspendaci cDNA byl přidán 1 mikrolitr 10 X ligačního pufru, 1 mikrolitr 10 mM ATP a 1 mikrolitr 4 Weiss j/mikrolitr T4 DNA ligasy a reakce byla inkubována přes noc při 8 °C. Ligasa byla inaktivována zahříváním při 70 °C po dobu 30 minut. 5' konce EcoRI spojovníků, které jsou nyní připojeny k cDNA, byly fosforylovány pomocí polynukleotidové kinasy. Byl přidán 1 mikrolitr 10 X pufru č. 3 ZAP-cDNA syntézního souboru (Stratagene, La Jolla, CA), 2 mikrolitry 10 mM ATP, 6 mikrolitrů vody a 1 mikrolitr 10 j/mikrolitr T4 polynukleoti dové kinasy do ligačního roztoku.
Po 30 minutách při 37 °C byla reakce kinasy zastavena zahříváním reakce při 70 °C po dobu 30 minut. Byly vytvořeny Xhol lepivé konce na konci cDNA odpovídajícímu 3'konci mRNA digescí Xhol místa ve spojovníku-primeru. 28 mikrolitrů Xhol pufru a 3 mikrolitrů 40 j/mikrolitr Xhol bylo přidáno do cDNA a reakce byla inkubována při 37 °C po dobu 1,5 hodin.
cDNA s EcoRI lepivými konci na 5' konci a Xhol lepivými konci na 3’ konci (ve vztahu k původní mRNA) byl rozměr frakcionován průchodem skrz Sephacryl S-400 otáčivý sloupec připravený následovně: 5 mikrolitrů 10 X STE[l00 mM Tris (pH 7,0), 5 mM EDTA a 100 mM NaCl] bylo přidáno do cDNA a cDNA byla nanesena na vrchol 1 mililitrové injekční stříkačky obsahující Sephacryl S-400 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
500 mikrolitrová mikroodstředivková zkumavka byla umístěna na spodku injekční stříkačky a sloupec byl umístěn v odstředivkové zkumavce a odstředěn při asi 400.g po dobu 2 minut. Bylo přidáno 60 mikrolitrů 1 X STE do vrcholu stříkačky, nová mikroodstředivková zkumavka byla uložena na spodek sloupce a sloupec byl znovu odstředěn jako dříve.
Tento postup byl opakován až bylo shromážděno 6 frakcí. Asi 10 % z každé frakce byla elektroforezováno na l%ním agarosovém gelu k určení rozdělení velikostí cDNA v každé frakci. Zbytek každé frakce byl extrahován stejný množstvím fenol/chloroform a pak chloroformem jak je popsáno výše a vysrážen přídavkem 2 objemů 100%ního ethanolu. Po inkubaci přes noc při -20 °C byla cDNA získána odstředěním v mikroodstředivce při 14 000 otáčkách za minutu po dobu 60 minut při 4 °C. Každá cDNA frakce byla promyta 200 nl 80%ního ethanolu a vysušena jak je uvedeno výše.
cDNA frakce 1 byla resuspendována ve 3 mikrolitrech sterilní vody a cDNA frakce 2 byla resuspendována v
10,5 mikrolitrech sterilní vody.
Jedna polovina mikrolitru každé ze dvou frakcí byla použita k určení kvantity DNA pomocí ethidiumbromidové plotnové detekční metody. Frakce 1 a 2 obsahující největší cDNA molekuly byly sloučeny. 12,5 1 sloučených frakcí obsahovalo přibližně 100 ng cDNA. Tato frakce byla redukována na 2,5 mikrolitrů ve Speed-Vac a uskladněna na ledu. cDNA frakce 3 byla resuspendována v 10,5 mikrolitru sterilní vody a zachována při -20 °C pro pozdější použití.
0,01 ng cDNA z frakce 1 a 2 byla vázána do 1 mikroTM gramu Uni-ZAP (Stratagene, La Jolla, CA), lambda ZAP vektoru, který byl digerován s EcoEI a Xhol. Frakce 1 a 2 cDNA (2,5 mikrolitru) byly přidány do 0,5 mikrolitru 10 X ligačního pufru, 0,5 mikrolitru 10 mM ATP, 1 mikrolitr 1 mikrogram/mikrolitr Uni-ZAP XR vektoru a 0,5 mikrolitru 4Weiss j/mikrolitr T4 DNA ligasy.
Reakce byla inkubována při 8 °C po dobu asi 44 h.
mikrolitr alikvotu ligační reakce byl přidán do 1 alikvotu mrazicího-rozmrazovacího” extraktu z Gigapack II Gold bakterio fágové lambda balicí soupravy (Stratagene, La Jolla, CA).
mikrolitrů Sonic extraktu bylo přidáno a obsah byl jemně smíchán. Nabalení bylo prováděno při teplotě místnosti. Po hodinách bylo přidáno 500 mikrolitrů SM pufru a 20 mikrolitrů chloroformu do každé nabalovací reakce a odpad byl odstrněn krátkým odstředěním v mikroodstředivce. Nabalené fágy byly převedeny do nové mikroodstředivkové zkumavky. Bylo přidáno mikrolitrů chloroformu a nabalené fágy byly uskladněny při 4 °C až do použití. Titr této primární banky indikoval přítomnost 0,7 . 10θ rekombinantního plaku.
c) Amplifikace primární banky
600 mikrolitrů E. coli XLl-Blue MRF* (Stratagene,
La Jolla, CA) vypěstovaných na hustotu 0,5 při Ο.ϋ.^θθ, a 32,5 mikrolitru primárního bankovního zásobního roztoku bylo přidáno do každé ze 16 zkumavek. Po inkubaci při 37 °C po dobu 15 minut bylo přidáno 6,0 ml 48°C agaru (5 g/1 NaCl, g/1 MgSO^ . 71^0, 5 g/1 kvasnicového extraktu, 10 g/1 NZ aminu (pH 7,5) a 0,7 % agarosy bylo přidáno do každé zkumavky a obsah byl potažen na 150 . 15 mm NZY plotny (5 g/1 NaCl, g/1 MgSO^ . 7 í^O, 5 g/1 kvasnicového extraktu, 10 g/1 NZ aminu (pH 7,5) a 15 g/1 Difco agaru). Plotny byly inkubovány přes noc při 37 Ca pak překryty 10 ml SM pufru a inkubovány po dalších 8 hodin při 4 °C za jemného třepání. SM pufr byl sebrán sterilní pipetou a uskladněn v sterilní 250 mililitrové odstředivkové lahvi.
Každá plotna byla omyta dalšími 10 ml SM pufru, kte rý byl sebrán a přidán k předcházejícími SM pufru. Byl přidán chloroform do konečné koncentrace 5 % a fágový roztok byl inkubován při teplotě místnosti po dobu 15 minut a pak odstředěn při 2000 . g po dobu 10 minut o odstranění buněčného odpadu. Supernatant byl získán do sterilní polypropylenové lahve a byl přidán chloroform do finální koncentrace 0,3 %. Amplifikovaná banka byla uložena při 4 °C.
d) Povlékání amplifikované banky pro třídění na specifické geny
Amplifikovaná banka byla titrována jak je popsáno výše. Přibližně 50 000 rekombínantního plaku bylo přidáno do 600 mikrolitrů E.coli XLl-Blue MRF', který byl vypěstován jak je popsáno výše. Po 15 minutách při 37 °C bylo přidáno 6,5 ml 48 °C teplého vrchního agaru a buňky byly naneseny na 150.15 mm NZY plotny. 4 plotny obsahující celkem 200 000 rekombinant nich plaků byly připraveny a inkubovány při 37 °C přes noc. Tyto plotny pak byly chlazeny po dobu 4 hodin při 4 °C, pak byly použity pro přípravu plakových výtažků jak je popsáno dále.
e) Identifikace a konstrukce oligonukleotidů homologních k kávovníkovým ACC synthasovým genům
V předcházejících studiích popsaných v US patentové přihlášce pořadového čísla 08/485107, jejíž popis je zde začle něn formou odkazu, původci identifikovali základní sekvence běžné k ACC synthase vyskytující se v různých rostlinách, které se zde označují jako souhlasné sekvence. Na základě těch to studií původci vyvinuli sestavu tří plně degenerovaných primerů pro PCR amplifikaci oblastí kávovníkové prvořetězcové cDNA odpovídajících souhlasným sekvencím. Sekvence použitých primerů je:
ACS167; 5'-GCCAAGCTTCCRTGRTARTCYTGRAA-3' (sekv.id.č.3)
ACS289: 5'-TTYCATRGAYTAYCAYGGHYT-3' (sekv.id.č.4)
ACS885: 5'-CCHGGDARNCCYAWRTCTTT-3' (sekv.id.č.5)
f) Reversní transkriptasová reakce k získání prvořetězcové kávovníkové cDNA
Reversní transkriptasová reakce k získání prvořetěz cové cDNA byla provedena v konečném objemu 20 mikrolitrů za použití GeneAmp RNA PCR Core Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA). Nejdříve bylo smícháno 0,9 mikrogramů mRNA kávovníkového plodu ve 3 mikrolitrech vody s 1 mikrolitrem 50 mikroM nahodilého hexameru a 6 mikrolitry sterilní vody v mikroodstředivkové zkumavce a inkubováno při 65 °C po dobu 5 minut.
Směs byla ponechána při teplotě místnosti po dobu minut a kapalina byla získána u dna zkumavky krátkým odstře děním. Do této směsi byly přidány 2 mikrolitry PCR pufru II (z výše zmíněného kitu), 4 mikrolitry 25 mM MgCl2, 10 mM dNTP, mikrolitr RNAsin (20 j/mikrolitr) a 10 raikrolitrů reversní transkriptasy (50 j/mikrolitr). Reakce byla inkubována při 42 °C po dobu 1 hodiny, načež byla reversní transkriptasa tepelní inaktivována v 95 °C vodní lázni po dobu 5 minut.
g) Reakce polymerasového řetězce k amplifikaci kávovníkového ACC-synthasního genu
Reakce polymerasního řetězce (PCR) (Saiki a j.,
1988) byla provedena za použití GeneAmp Kitu popsaného výše v 50 mikrolitrové reakci obsahující 10 mikrolitrů prvořetězcové cDNA směsi, 4 mikrolitry PCR pufru II, 1 mikrolitr 25 mM MgCl2, 2,5 mikrolitrů 20 mikroM AC 5167 primeru (sekv.id.č.3)
2.5 mikrolitrů 20 mikroM AC 5885 primeru (sekv.id.č.5),
29.5 mikrolitrů sterilní vody a 0,5 mikrolitrů Tag DNA polymerasy (5 g/mikrolitr). PCR podmínky byly 35 cyklů 94 °C po dobu 1 minuty, 44 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut.
Porodukt PCR reakce byl analyzován agarosogelovou elektroforézou za použití l,5%ní SeaPlaque agarosy (FMC Bio Products, Rockland, ME) a Hae III digerované 0X174 DNA (Promega Corporation, Madison, WI) jako markérů velikosti. Byl získán 1 PCR produkt o velikosti přibližně 650 párů bází.
h) Amplifikače PCR produktu s různými primery
650 bp fragment získaný výše byl excisován z gelu a uložen do 1,5 ml mikroodstředivkové zkumavky. Po přídavku 200 mikrolitrů sterilní vody byl 650 bp fragment zahříván na 90 °C po dobu 5 minut, ochlazen na teplotu místnosti a odstředěn při 14 000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut v mikroodstředivce. Superňatant obsahující amplifikovanou DNA byl odstraněn a uložen do nové sterilní 1,5 ml mikroodstředivkové zkumavky.
mikrolitrová PCR reakce byla provedena za použití 0,4 mikrolitrů dříve amplifikované DNA jako matrice,
2,5 mikrolitrů 10 X PCR pufru (10 mikroM tris-HCl pH 9,0,
0,1 % triton X-100), 2 mikrolitry 25 mM MgCl2, 5 mikrolitrů 1 mM dNTPs, 1 mikrolitr 20 mikroM ACS289 primeru (sekv.id.č.5), mikrolitr 20 mikroM ACS885 primeru (tabulka 2), 12,8 mikrolitrů
H2O a 0,3 mikrolitry Tag DNA polymerasy (5 j/mikrolitr) (Promega Corporation, Madison, WI).
PCR byla provedena pomocí 35 cyklů 94 °C po dobu 1 minuty, 45 °C opo dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut.
mikrolitrů této reakce byla elektroforezováno v l,5%ním agarosovém gelu, jak je výše popsáno. Byl získán jediný produkt přibližně 603 bp. Ke zbytku reakce bylo přidáno 80 mikrolitrů sterilní vody, 10 mikrolitrů 3M octanu sodného (pH 5,2), a 220 mikrolitrů 100%ního ethanolu. Po inkubaci při 20 °C přes noc byla odstředěním získána DNA při 4 °C po dobu 30 minut při 14 000 otáčkách za minutu. DNA byla promyta 400 mikrolitry ledově studeného 75%ního ethanolu a resuspandována ve 25 mikrolitrech sterilní vody. DNA koncentrace byla určena, že je 10 ng/mikrolitr pomocí ethidiumbromidové plotnové zkoušky.
i) Značení kávovému plodu specifické ACC synthasní DNA
Nahodilý základní zkušební vzorek byl připraven za použití PCR-vytvořené ACC synthasní DNA a Prime-a-Gene Kit (Promega Corporation, Madison, WI). 2,5 mikrolitrů DNA (25 ng) bylo přidáno do 27,5 mikrolitrů sterilní vody a DNA byla denaturována vařením po dobu 5 minut. 10 mikrolitrů 5 X značícího pufru, 2 mikrolitry neznačeného dNTP (20 mikromol každého, dCTP, dGTP, dTTP), 2 mikrolitry 1 mg/ml acetylované BSA, 1 mikrolitr 5 j/mikrolitr E.coli DNA polymerasového I Klenow fragmentu a 5 mikrolitrů (50 mikroCi) [p(, -^2P] dATP (3000 Ci/mmol) (Dupont-NEN) bylo přidáno, čímž se získal konečný objem 50 mikrolitrů.
Po 1 hodině při teplotě místnosti byla reakce terminována přídavkem 2 mikrolitrů 0,5 M Na2 EDTA a vařena po dobu 2 min.
j) Třídění amplifikované banky ACC synthasně specifickou zkouškou
Byly připraveny platkové lifty čtyř 150.15 mm NZY ploten, obsahující každý 50 000 rekombinantních klonů.
Čtyři 132 mm Magna nylonové transferové membrány (Micron Separations, Incorporate, Westborough, MA) byly smočeny jejich uložením na chromatografický papír nasycený 5 X SSC pufrem na přibližně 10 sekund. Tyto membrány byly uloženy na plotny obsahující rekombinantní plak po dobu 5 minut, odstraněny a inkubovány, fágy obsahující horní strana byla po dobu 2 minut sycena na chromatografickém papíru 0,5 M NaOH a 1,5 M NaCl. Membrány pak byly neutralizovány převedením na chromatografický papír, nasyceny 0,5 M tris-HCl (pH 8,0) a 1,5 M NaCl, po dobu 5 minut. Po krátkém 20 sekundovém zpracování na chromatografických listech nasycených 2 X SCC, které obsahovaly 0,2 M tris-HCl (pH 7,5), byly filtry vysáty do sucha. Po 1 hodině sušení na vzduchu byla DNA zesítěna do membrán zpracováním pomocí 12 000 mikroJoulů 260 nm UV záření v UV Stratlinker 1800 (Stratagene, La Jolla, CA).
membrány byly předhybridizovány při 65 °C po dobu 2 hodin ve 100 ml 6 X SSPE (52,2 g/1 NaCl, 8,3 g/1 NaH2PO4~ •H2O, 2,2 g/1 Na2EDTA, (pH 7,4)), 5 X Denhardtova roztoku (1 g/1 Ficoll, 1 g/1 pólyvinylpyrrolidonu, 1 g/1 BSA (pentaxová frakce V)), 0,5%ní SDS a 100 mg/ml nasycené sledové spermatové DNA v Hybaid Mark II hybridizační sušárně (National Labnet Company, Wood Bridge, NJ) za použití HB-OV-BL lahví.
Hybridizace byla prováděna při 65 °C po dobu 12 hodin v 10 ml 6 X SSPE obsahujícím 0,5 % SDS 100 mikrog/ml denaturované sledové spermatové DNA a 52 mikrol nahodile primovaného vzorku popsaného výše.
Na konci hybridizační periody byl hybridizační roztok odstraněn a membrány byly rychle promyty 100 ml 2 X SSC obsahujícího 0/5 % SDS při 65 °C. Pak byly promyty po dobu dalších 30 min. stejným množství čerstvého pufru znovu při 65 °C. Membrány byly promyty ještě 2x po dobu 30 minut při 65 °C 100 ml 0/2 X SSC obsahujícího 0/5 % SDS/ zabaleny do celofánového obalu a vystaveny předexponovanému Fuji RXGCU rentgenovému filmu při -70 °C po dobu 24 hodin. Bylo získáno 10 pozitivních klonů.
Oblast původních ploten odpovídající identifikovanému plaku byla odstraněna a uložena v 1 ml SM pufru obsahujícího 20 mikrol chloroformu. Z těchto 10 bylo 5 znovu uloženo na plotny v nízkých hustotách a roztříděno jak je výše uvedeno k získání jednotlivého tlaku.
k) Charakterizace kávových ACC synthasních cDNA klonů
Velikost předpokládaných kávových ACC synthasních cDNA klonů byla určena polymerasní řetězcovou reakcí pomocí primerů homologních k části T3 a T7 promotorů přítomných v klonovacím vektoru a lemováním cDNA inserčního místa. Sekvence primerů jsou:
T3: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (sekv. id. č. 6)
T7: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' (sekv. id. č. 7).
Podmínky pro PCR byly takové jaké jsou popsány výše s výjimkou, že teplotní cyklus byl 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Analýza byla provedena agarosovou gelovou elektroforézou jako dříve.
Tři nejrozsáhlejší klony byly získány jako famegidy excisí in vivo. 200 mikrolitrů fágového zásobního roztoku z 1 plaku bylo smícháno s 200 mikrolitry E. coli XLl-blue MRF#* vypěstovanými do hustoty Ο.ϋ.θθθ 1,0. Byl přidán 1 mikrolitr ExAssist (Stratagene, La Jolla, CA) pomocného fágu ( > 1 X 10θ pfu/mikrol) a zkumavky byly inkubovány při 37 °C po dobu minut.
Byly přidány 3 ml sterilního LB bujónu a byly inkubovány po dobu 3 hodin při 37 °C za třepání. Po zahřívání při 70 °C po dobu 20 minut a odstředění při 100O.g po dobu 15 minut byl 1 ml supernatantu obsahujícího excisované pBluescriptové fagemidy uložené jako vláknité fágové částice, byl převeden do sterilní 1,5 ml mikroodstředivkové zkumavky a uskladněn při 4 °C. Fagemidy byly získány přídavkem 25 ml zásobního roztoku do 200 mikrolitrů E.coli Solar buněk (Stratagene, La Jolla, CA) vypěstovaných do hustoty 1, když byly měřeny při Ο.ϋ.ρθθ.
Po inkubaci při 37 °C po dobu 15 minut bylo 200 mikrolitrů buněčné směsi uloženo na 100.15 mm NZY agarových plotnách obsahujících 50 mikrog/ml ampiciíinu. Plotny byly inkubovány přes noc při 37 °C. Jednotlivé kolonie byly sebrány do 10 ml LB bujónu obsahujícího 50 mikrog/ml ampiciíinu a pěstovány přes noc při 37 °C v třepacím inkubátoru. Buňky byly koncentrovány v 1,5 ml sterilní mikroodstředivkové zkumavce opakovaným odstředěním a plasmid DNA byl vyčištěn za použití plasmidové minisoupravy od QIAGEN.
Bakteriální pelety byly promyty vodou a resuspendovány v 0,3 ml pufru Pl. Pak bylo přidáno 0,3 ml alkalického lýzního pufru P2 jemně smícháno a inkubováno po méně než 5 minut při teplotě místnosti. Pak následoval přídavek 0,3 ml studeného pufru P3 a míchání obracením zkumavek 6 x, extrakty byly inkubóvány na ledu po dobu 10 minut a odstředěny při 14 000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut v mikroodstředivce. Supernatanty byly odstraněny a aplikovány do QIAGEN-typ 20 sloup ců, které byly předem vyváženy 1 mm QDT pufru.
Extrakty byly ponechány vstoupit do pryskyřice sloupců gravitačním tokem. Jakmile proud ustal, sloupce byly promyty 4x 1 ml pufru QC. DNA byly eluovány promytím QIAGENtyp 20 sloupci s 0,8 ml pufru QF, který byl jímán do 0,5 ml mikroodstředivkových zkumavek.
DNA byla vysrážena přídavkem 0,7 objemů (560 mikrolitrů) isopropanolu. Zkumavky byly ihned odstředěny při 14 000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut a supernatant byl pečlivě odebrán. Pelety obsahující DNA byly promyty 20x 1 ml ledově studeného 70%ního ethanolu, odstředěny jak je výše uvedeno a vysušeny na vzduchu po dobu 5 minut. DNA byly resuspendovány v 50 mikrolitrech sterilní vody. Koncentrace DNA z jedné plasmidové izolace byla 0,1 mikrog/mikrol fluorometrickou analýzou.
Sekvenční reakce byly provedeny smísením 8 mikrol fagmidu DNA (0,8 mikrog) se 4 mikrol bučí. T3 nebo T7 sekvenčních primerů (0,8 pmol/mikrol). Automatizované DNA sekvencování bylo provedeno u těchto vzorků v University of Hawaii, Biotechnology Service Center.
Bylo získáno asi 350 párů bází sekvence z jak 5', tak 3' konce cDNA. Nové sekvenční primery byly syntetizovány na základě sekvencí u konce předcházejících sekvencí a použity stejným způsobem ke kompletaci sekvence obou řetězců cDNA. Úplná sekvence kávové expresované ACC synthasní cDNA je uvedena v obr. 1. Odvozená aminokyselinová sekvence kávové expresované ACC synthasy je uvedena v obr. 2.
Sekvence kávového ACC synthasního cDNA klonu a odvozeného proteinu byla porovnána s jinými ACC synthasními geny uloženými v GenBank. cDNA izolovaná z kávovníkového plodu vykázala 68,3%ní až 58,l%ní identitu s jinými ACC synthasami přítomnými v GenBank. A proteinová sekvence odvozená z této cDNA vykazuje 67,9%ní až 50,5%ní identitu vůči jiným ACC synthasám. Avšak tato cDNA je unikátní v tom, že žádné jiné sekvence větší než 1500 párů bází nevykazovaly větší než 68,3%ní identitu s ní.
Příklad 2
Izolace kávovníkovému pecifické ACC oxidasy
a) Syntéza ACC oxidasových specifických oligonukleotidových primerů
Izolace úplné RNA# mRNA a syntéza kávovníkovému plodu specifické cDNA byla popsána výše.
ACC oxidasových sekvencí získaných z GenBank bylo seřazeno za použití Pileup programu GCG (Genetics Computer Group# Madison# WI). Oblast přibližně 1000 párů bází z translačního startovacího kodonu byla zjištěna# že má být konzervována a byl syntetizován degenerační oligonukleotidový primer
5'-TCATIGCKKCRAKIGGTTC-3' (sekv. id. č. 8) odpovídající této oblasti.
Inosin (I) byl uložen v pozicích nevykazujících sek venční konzervaci, protože tato pozice by mohla být jakýkoli A# T# G nebo C. Pozice vykazující dvojitou nejednoznačnost byly připraveny se smíchanými zbytky (T/G nebo A/G).
Původci také připravili druhý primer homologní k oblasti papajové expresované ACC oxidasové cDNA# která byla dříve klonována v laboratoři původců a situována přibližně s 372 párů bází od translačního startovacího kodonu:
5'-GACACTGTGGAGAGGCTGAC-3' (sekv. id. č. 9) .
Tyto dva primery byly použity v PCR reakci k amplifikaci části kávovníkovým plodem expresované ACC oxidasy.
PCR obsahovala 0#2 mikrolitry (10 ng) cDNA frakce 3 (popsáno v příkladu 1), 5 mikrolitrů 10 X PCR pufru# 3 mikrolitry 25 mM MgCl2# 1 mikrolitr každého ze 4 lOmM dNTPs# 1 mikrolitr 20 mM roztoku každého primeru# 0#3 mikrolitry Taq DNA polymerasy (Promega Corporation# Madison# WI) a 38#5 mikrolitrů vody
PCR podmínky byly 35 cyklů při 94 °C po dobu 1 minuty, °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 1 minuty.
5minutová inkubace při 72 °C byla provedena po posledním cyklu. 20 mikrolitrů alikvotu produktu bylo elektroforezováno v l,5%ním agarosovém gelu jak bylo dříve popsáno a vykázalo přibližně 800 párů bází produktu. DNA byla excisována z gelu a smíchána s 200 mikrolitry sterilní vody v 1,5 ml mikroodstředivkové zkumavce. Po zahřívání po dobu 5 minut byly 2 mikrolitry použity jako matrice v 50 mikrolitrech PCR reakce jako výše za použití týchž primerů. Gelová elektroforéza jak byla výše popsána za použití 20 mikrolitrů PCR reakce indikovala přítomnost jediného produktu o 800 párů bází.
Do zbývajících 30 mikrolitrů PCR reakce bylo přidáno 20 mikrolitrů chloroformu a 100 mikrolitrů vody. Obsah byl smíchán a odstřelován po dobu 2 minut při 14 000 otáčkách za minutu v mikroodstředivce. Vrchní vodná fáze obsahující DNA byla odstraněna do čisté mikroodstředivkové zkumavky. Část této DNA byla radioaktivně značena při nahodilé primerové syntéze jak bylo výše popsáno.
b) Třídění amplifikované banky nahodile přiravenou nukleotidovou sondou
Amplifikovaná cDNA kávového plodu popsaná v příkladu 1 byla použita k přípravě 4 150.10 mm NZY ploten jak bylo dříve popsáno. Předhybridizace, hybridizace a získávání klonů byly prováděny jak bylo dříve popsáno s výjimkou, že ACC oxidasová sekvence získaná PCR byla použita jako nukleotidová sonda
c) Charakterizace kávových ACC oxidasových cDNA klonů
Velikost kávových ACC oxidasových cDNA klonů byla určena polymerasovou řetězcovou reakcí za použití primerů homologních k T3 a T7 promotorů jak je popsáno v příkladu 1.
Sekvence největšího kávového ACC oxidasového cDNA klonu byla získána tak, jak je popsáno v příkladu 1 a srovnána s ACC oxidasovými geny přítomnými v GenBank. Obr. 3 uvádí sekvenci kávové specifické ACC oxidasy. Obr. 4 uvádí předpokládanou aminokyselinovou sekvenci tohoto proteinu.
cDNA byla určena ke kódování ACC oxidasy, poněvadž je od
50,4 % do 82,5 % identická jako jiné ACC synthasové nukleokyselinové sekvence přítomné v GenBank. Také předpokládaná protei nová sekvence je od 32,5 % do 86,5 % identická s jinými ACC oxidasami.
Předcházející příklady provedení jsou určeny pouze pro ilustrativní účely a neměly by být nahlíženy jako omezení rozsahu předloženého vynálezu, který je shrnut v připojených patentových nárocích.
Obr. ls Odvozena aminokyselinová sekvence ACC synthasy z
Coffea arabica (sekv. id. č. 10)
Met Glu Phe Ser Leu Lys Asn Glu Gin Gin Gin Leu Leu Ser Lys
10 15
Met Ala Thr Asn Asp Gly His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp Gly 20 25 30
Trp Lys Ala Tyr Asp Ser Asp Pro Tyr His Pro Thr Arg Asn Pro Asn 35 40 45
Gly Val Ile Gin Met Gly Leu Ala Glu Asn Gin Leu Cys Phe Asp Leu 50 55 60
Ile Glu Glu Trp Val Leu Asn Asn Pro Glu Ala Ser Ile Cys Thr Ala 65 70 75
Glu Gly Ala Asn Lys Phe Met Glu Val Ala Ile Tyr Gin Asp Tyr His 80 85 90 95
Gly Leu Pro Glu Phe Arg Asn Ala Val Ala Arg Phe Met Glu Lys Val 100 105 110
Arg Gly Asp Arg Val Lys Phe Asp Pro Asn Arg Ile Val Met Ser Gly
115
120
125
Gly Ala Thr Gly Ala His Glu
130
Glu Asp Ala Phe Leu Val Pro 145 150
Asp Leu Arg Trp Arg Thr Gly 160 165 i Ser Ser Asn Asp Phe Lys Val
180
Gin Lys Ala Gin Glu Ala Asn
195
Asn Pro Ser Asn Pro Leu Gly 210
Asp Ile Val Thr Phe Ile Asn 225 230
Glu Ile Tyr Ser Ala Thr Val 240 245
Ser Glu Ile Ile Glu His Asp
260
Thr Leu Ala Phe Cys Leu Ala Asp Pro l
135 140 \
Thr Pro Tyr Tyr Pro Gly Phe Asp Arg 155
Met Gin Leu Leu Pro Ile Val Cys Arg 170 175
Thr Lys Glu Ser Met Glu Ala Ala Tyr
185 190
Ile Arg Val Lys Gly Phe Leu Leu Asn
200 205
Thr Val Leu Asp Arg Glu Thr Leu Ile 215 . 220
Asp Lys Asn Ile His Leu Ile Cys Asp 235
Phe Ser Gin Pro Glu Phe Ile Ser Ile
250 255
Val Gin Cys Asn Arg Asp Leu Ile His
265
270
Leu Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Leu Gly Phe Pro Gly Phe; Arg Val 275 280 285Gly Ile Leu Tyr Ser Tyr Asn Asp Ala Val Val Ser Cys Ala Arg Lys 290 295 300
Met Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr Gin Thr Gin His Leu Ile Ala 305 310 315
Ser Met Leu Ser Asp Glu Ala Phe Met Asp Lys Ile Ile Ser Thr Ser
320 325 330 335
Ser Glu Arg Leu Ala Ala Arg His Gly Leu Phe Thr Arg Gly Leu Ala
340 345 350
Gin Val Gly Ile Gly Thr Leu Lys Ser Ser Ala Gly Leu Tyr Phe Trp 355 360 365
Met Asp Leu Arg Arg Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Glu Ala Glu Met 370 375 380
Glu Leu Trp Arg Ile Ile Ile His Glu Val Lys Leu Asn Val Ser Pro 385 390 395
Gly Leu Ser Phe His Cys Ser Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe
400
405
410
415
Ala Asn Met Asp Asp Glu Ser Val Arg Val Ala Leu Arg Arg Ile His 420 425 4'30
Lys Phe Val Leu Val Gin Gly Lys Ala Thr Glu Pro Thr Thr Pro Lys
435 440 445
Ser Arg Cys Gly Ser Ser Lys Leu Gin Leu Ser Leu Ser Phe Arg Arg
450 455 460
Leu Asp Glu Arg Val Met Gly Ser His Met Met Ser Pro His Ser Pro . 465 470 475
Met Ala Ser Pro Leu Val Arg Ala Thr
480 485
Obr. 2: Kávovníkovým plodem expresovaná ACC synthasová · sekvence (sekv. id. č. 11) ύ
GTAATCTCTT CTAAAATCAA CCATTCTCTT CATTCTTCAC TTGACAAGGC CACTGCATTC 60
TTCATTCTTT CTTGATATAT AGCCATnTT TTCATTCTTT CTTGATATAT AGCCATTTTT 120
TTCATTCTTT CTTCATTCAT TGTCTGGAGA AGTTGGTTGA GTTTTCTTGA AAATTCAAGC 180
AAAACA ATG GAG TTC AGT TTG AAA AAC GAA CAA CAA CAA CTC TTG TCG AAG 231
ATG GCA ACC AAC GAT GGA CAT GGC GAA AAC TCG CCT TAT TTT GAT GGT 279
TGG AAG GCA TAT GAT AGT GAT CCT TAC CAT CCC ACC AGA AAT CCT AAT 327
GGT GTT ATA CAG ATG GGA CTC GCA GAA AAT CAG TTA TGC TTT GAT TTG 375 v
ATC GAG GAA TGG GTT CTG AAC AAT CCA GAG GCT TCC ATT TGC ACA GCA 423
GAA GGA GCG AAC AAA TTC ATG GAA GTT GCT ATC TAT CAA GAT TAT CAT 471 i,
GGC TTG CCA GAG TTC AGA AAT GCT GTA GCA AGG TTC ATG GAG AAG GTG 519
AGA GGT GAC AGA GTC AAG TTC GAT CCC AAC CGC ATT GTG ATG AGT GGT 567
GGG GCA ACC GGA GCT CAT GAA ACT CTG GCC TTC TGT TTA GCT GAC CCT 615
GAA GAT GCG TTT TTG GTA CCC ACA CCA TAT TAT CCA GGA TTT GAT CGG 663
GAT TTG AGG TGG CGA ACA GGG ATG CAA CTT CTT CCA ATT GTT TGT CGC 711
AGC TCC AAT GAT TTT AAG GTC ACT AAA GAA TCC ATG GAA GCT GCT TAT 759
CAG AAA GCT CAA GAA GCC AAC ATC AGA GTA AAG GGG TTC CTC TTA AAT 807
AAT CCA TCA AAT CCA TTG GGA ACT GTT CTT GAC AGG GAA ACT TTG ATT 1 8S5
GST ATA GTC ACA TTC ATC AAT GAC AAA AAT ATC CAC TTG ATT TGT GAT 903
GAG ATA TAT TCT GCC ACC GTC TTC AGC CAG CCC GAA TTC ATC AGC ATC 951
TCT GAA ATA ATT GAG CAT GAT GTT CAA TGC AAC CGT GAT CTC ATA CAT 999
CTT GTG TAT AGC CTG TCC AAG GAC TTG GGC TTC CCT GGA TTC AGA GTT 1047
GGC ATT TTG TAT TCA TAT AAT GAC GCT GTT GTC AGC TGT GCT AGA AAA 1095
ATG TCG AGT TTC GGC CTT GTT TCA ACA CAA ACT CAG CAT CTG ATT GCA 1143
TCA ATG TTA TCG GAC GAA GCA TTT ATG GAC AAA ATC ATT TCC ACG AGC Z 1191
TCA GAG AGA TTA GCT GCA AGG CAT GGT CTT TTC ACA AGA GGA CTT GCT 1239
CAA GTA GGC ATT GGC ACC TTA AAA AGC AGT GCG GGC CTT TAT TTC TGG 1287
ATG GAC TTA AGG AGA CTC CTC AGG GAG TCC ACA TTT GAG GCA GAA ATG 1335
GAA CTT TGG AGG ATC ATA ATA CAT GAA GTC AAG CTC AAT GTT TCA CCA 1383
GGC TTA TCT TTC CAT TGC TCA GAA CCA GGA TGG TTC AGA GTT TGC TTT 1431
GCC AAC ATG GAC GAC GAA AGT GTG AGA GTT GCT CTC AGA AGA ATC CAC 1479
AAA TTT GTG CTT GTT CAG GGC AAG GCA ACA GAG CCA ACA ACT CCA AAG 1527
AGT CGC TGC GGA AGC AGC AAA CTT CAA CTC AGC TTA TCT TTC CGC AGA 1575
TTG GAC GAA AGG GTG ATG GGA TCG CAT ATG ATG TCC CCT CAC TCC CCG 1623
ATG GCT TCA CCT TTG GTT CGG GCT ACA TAAATCATTT CTTGATCAGA TCATATAGCA 1680
AAGATTCCTG AGTAAATACT
CTTTGCTGTA TCATACAAAC
GCATCAAATG CTTTTATTAT
AGTCCTCCTT GTTTTTTGTT
GGAAGCTCAA TTGTTTCAAG
GATTCTGAAA TGAAAGTTTA
CGAAACCCTT TCTGGATAAC
ACGTTACAGG CATTTTTTGG
TGTCATATTC ATTTGTGTAC
TCTXTGTTAT TATTTTCTTC
CTATTAGTAA CAGATCATTT
TCATTTTTCC ATCATTTTAA
TGAAAAGAGA GTTGTTGATT
CCATCTGATG CGTGCAftATT
CTTGGTTTTC CTTGCCCTTC
CAGTTGATCA GTTAAACGAA
TGTAATAGCA ATAGTTTCAG
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
1740
1800
1860
1320
1380
2040 * Pozn
Kódovací část této sekvence je znázorněna seskupeními bází jako kodonů
Obr. 3: Dedukovaná proteinová sekvence kávovníkovým plodem expresovaná ACC oxidasové cDNA (sekv. id* č. 12)
Met Ala Thr Phe
Pro Leu Ile Asp Met Glu Lys Leu Asp Gly 5 io
Met Gly Val Ile Lys Asp Ala Cys Glu Ser .25 30
Leu Asn His Gly Ile Ser Asn Glu Leu Met 40 45
Thr Lys Glu His Tyr Lys Lys Cys Met Glu 55 60
Val Glu Ser Lys Glu Leu Glu Ala Val Gin 70 75
Asp Trp Glu Ser Thr Phe Phe Leu Arg His 85 90
Ser Glu Val Pro Asp Leu Asp Asp Glu Tyr
Glu Glu Arg Ala Ala Thr
20
Trp Gly Phe Phe Glu Val
Asp Thr Val Glu Arg Leu
Leu Lys Phe Lys Glu Met \
Thr Glu Ile Asn Asp Leu
Leu Pro Val Ser Asn Ile
100
Arg Lys Val Met Lys Glu
105
110
115
Phe Ala Leu Gin Leu Glu Lys Leu Ala Glu Leu Leu Leu Asd Leu Leu 120 125 130 :
Cys Glu Asn Leu Gly Leu Glu Lys Gly Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Tyr 135 140 145
Gly Thr Lys Gly Pro Thr Phe Gly Thr Lys Val Ser Asn Tyr Pro Pro 150 155 160
Cys Pro Arg Pro Glu Leu Ile Lys Gly Leu Arg Ala His Thr Asp Ala
165 170 175 180
Gly Gly Ile Ile Leu Leu Phe Gin Asp Asp Lys Val Ser Gly Leu Gin
135 190 195
Leu Leu Lys Asp Gly Glu Trp Val Asp Val Pro Pro Met Arg His Ser 200 205 210
Ile Val Ile· Asn Ile Gly Asp Gin Leu Glu Val Ile Thr Asn Gly Lys 215 220 225
Tyr Lys Ser Val Met His Arg Val Ile Ala Gin Pro Asp Gly Asn Arg 230 235 240
Met Ser Leu Ala Ser Phe Tyr Asn Pro Gly Ser Asp Ala Val Ile Tyr
245
250
255
260
Obr. 4: DNA sekvence v kávovníkovém plodu expresované ACC oxidasové cDNA (sekv.id.č.13) i
TGTAAACGAA GCATAAGCAC AAGCAAACAC AAACTAGAAA GAGAG ATG GCT ACA TTC 57
CCC CTA ATC GAC ATG GAG AAG CTT GAC GGT GAA GAG AGG GCT GCC ACT 105
ATG GGA GTC ATA AAA GAT GCT TGT GAA AGC TGG GGC TTC TTT GAG GTG 153
TTG AAT CAT GGG ATA TCT AAT GAG CTC ATG GAC ACA GTG GAG AGG CTA 201
ACA AAG GAG CAT TAC AAG AAA TGT ATG GAA CTA AAG TTC AAG GAA ATG 249
GTG GAG AGC AAG GÁA TTG GAA GCT GIT CAG ACT GAG ATC AAT GAT TTG 297
GAC TGG GAA AGT ACC TTC TTC TTG CGC CAT CTT CCT GTT TCC AAC ATC 345
TCA GAA GTC CCT GAT CTT GAT GAT GAA TAC AGA AAG GTT ATG AAG GAA 393
TTT GCG TTG CAA CTT GAG AAA CTA GCA GAG CTC CTG TTG GAC TTG CTA 441
TGC GAG AAC CTT GGC· CTA GAG AAA GGC TAT CTG AAG AAA GCC TTC TAT 4 89
GGC ACC AAA GGA CCA ACC TTT GGC ACC AAA GTC AGC AAT TAC CCT CCA 537
TGC CCT CGT CCA GAA CTG ATC AAG GGC CTC CGG GCA CAC ACC GAT GCC 585
GGC GGC ATC ATC CTG CTG TTC CAG GAT GAC AAG GTC AGC GGT CTC CAG 633
CTC CTC AAG GAT GGT GAA TGG GTG GAT GTT CCG CCT ATG CGC CAC TCC 681
ATT GTA ATC AAC ATC GGC GAC CAA CTT GAG GTA ATC ACA AAT GGA AAA 729
TAC AAG AGT GTG ATG CAC CGG GTG ATA GCT CAA CCA GAT GGG AAC AGA 777
ATG TCA CTA GCA TCA TTC TAC AAT CCA GGA AGT GAT GCA GTG ATC TAT 825
CCA GCA CCG GCA TTG GTT GAG AAA GAG GCA GAG GAC AAG CAG ATA TAT 873
CCC AAG TTT GTG TTC GAG GAC TAC ATG AAG CTC TAT GCT GGC CTT AAG 921
TTC CAA GCT AAA GAG CCC AGG TTT GAA GCC ATG AAG GCC GTG GAA AGC 9S9
ACC GTA AAC TTG GGT CCA ATC GCA ACT GTT TGAGATAATA CACGCTTTGA 1019
TCTGCTGCTG TCTTATAATG CGCGTTTGCG TAATCATATC CTAGCATAGT ATATCTGAGA 1079
TCTGAGTCTG TATTGTGGTG TGAGTTTGGT TTAGCCCCTT GTTAATGCTT GGATTGGACT 1139
AGTTAAATGT GGAGCTGGTT TGTTAGATAA GATAGTCTTG CCAGGATCTT TGAGTAAATA 1199
TGATTCTGCG GAAGTCTGCG GTGAATGATA ACGTGTAAAG CAATCCGAAA GTTACCTTTC 1259
TGGGGCTTTG TCATATGCAA TGGAGAAGGA ATCTTCCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1319
A 1320
Pozn.: Kódovací část této sekvence je znázorněna seskupením bází jako kodonů
Seznam sekvencí (1) Obecná informace:
(i) Přihlašovatel: Stiles, John I.
Moisyady, Istefo Nelupane, Kabi R.
(ii) Název vynálezu: Čištěné proteiny, rekombinantní DNA sek vence a způsoby řízení zrání kávy (iii) Počet sekvencí: 13 (iv) Korespondenční adresa:
(A) adresát: Jones, Day, Reavis and Pogue (B) ulice: North Point, 901, Lakeside Avenue (C) město: Cleveland (D) stát: Ohio (E) země: USA (F) ZIP: 44114 (v) Počítačově čitelná forma:
(A) druh média: disketa, 3,5 inch, 1,44 Mb kapacita (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: MS-DOS v. 5.1 (D) software: Word Perfect v.6.1 (vi) Současné údaje přihlášky:
(A) číslo přihlášky: 08/695 412 (B) datum podání: 12. srpen 1996 (C) třídění: 435 (vii) Prioritní údaje:
(A) číslo přihlášky: US 08/485 107 (B) datum podání: 7. červen 1995 (viii) Zástupce/zmocněnec-informace:
(A) jméno: Griffith, Calvin P.
(B) registrační číslo: 34 831 <C) referenční/spisové číslo: 265036600002 (ix) Telekomunikační informace:
(A) telefon: (216) 586-7050 (B) telefax: (216) 579-0212 (2) Informace pro sekv. id. č. 1 (1) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 15 aminokyselinových zbytků (B) typ: aminokyselina (C) řetězovitost: N/A (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: peptid (ix) Rys:
(A) jméno/klíč: fragment A (B) lokace: 17..1480 (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 1:
Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gin Xaa Gly 15 10 15 (2) Informace pro sekv. id. č. 2:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 14 aminokyselinových zbytků (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: peptid (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 2:
Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gin Thr 1 5 10 14 (2) Informace pro sekv. id.č.3:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovitost: jednoduchá (D) topologie: lineární :(ii) Molekulový typ: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer (v) Typ fragmentu: vnitřní (ix) Rys:
(A) jiná informace: N je inosin (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 3:
ATNAAYTAYG CNAGYGGNGC 20 (2) Informace pro sekv. id. č. 4:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovitost: jednoduchá (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: jiná nukleová kyselina (A) Popis: primer (v) Fragmentální typ: vnitřní (ix) Rys (A) jiná informace: N je inosin (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 4: ATNAAYTAYG CNAGYGGNGC 20 (2) Informace pro sekv. id. č. 5:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovitost: jednoduchá (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer (v) Fragmentální typ: vnitřní (ix) Rys (A) jiná informace: N je inosin (xi) Sekvenční popis: sekv. id. č. 5: CGNCCAGNCG NYTAYTTNAT 20 (2) Informace pro sekv. id. č. 6:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovitost: jednoduchá (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: DNA (genomická) (A) popis: primer (v) Fragmentální typ: vnitřní (ix) Rys (A) jiná informace: N je inosin (xi) Sekvenční popis: sekv. id. č. 6:
CGNCCYCTYG CYTAYTTNAT 20 (2) Informace pro sekv. id. č. 7:
(1) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 14 aminokyselinových zbytků (B) typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jednoduchá (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: peptid (v) Fragmentální typ: vnitřní (ix) Rys (D) jiná informace: Xaa je buá Thr nebo Asp (xi) Sekvenční popis: sekv. id. č. 7:
Gin Tyr Val Pro Cys Tyr Phe Xaa Phe Ile Asp Asp Gin Asp 15 10 14 (2) Informace pro sekv. id. č. 8:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovitost: jednoduchá (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer (v) Fragmentální typ: vnitřní (ix) Rys (A) jiná informace: N je inosin (xi) Sekvenční popis: sekv. id. č. 8: CAWTATGTNC CNTGTTATTT 20 (2) Informace pro sekv. id. č. 9:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovitost: jednoduchá (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer (v) Fragmentální typ: vnitřní (ix) Rys (A) jiná informace: N je inosin (xi) Sekvenční popis: sekv. id. č. 9: AAWTAWCAHG GNACWTATTG 20 (2) Informace pro sekv. id. č. 10:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(Λ) délka: 488 aminokyselinových zbytků (B) typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jednoduchá (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: protein (ix) Rys:
(A) název/klíč: CDS (B) lokace: 178 .. 1653
(xi) Sekvenční popis: sekv. id. č. 10:
Met Glu Phe Ser 1 Leu Lys 5 Asn Glu Gin Gin Gin Leu Leu Ser Lys 10 15
Met Ala Thr Asn Asp Gly 20 His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp 25 30
Gly Trp Lys Ala Tyr Asp 35 Ser Asp Pro Tyr His Pro Thr Arg Asn 40 45
Pro Asn Gly Val Ile Gin 50 Met Gly Leu Ala Glu Asn Gin Leu Cys 55 60
Phe Asp Leu Ile Glu Glu 65 Trp Val Leu Asn Asn Pro Glu Ala Ser 70 75
Ile Cys Thr Ala Glu Gly 80 Ala Asn Lys Phe Met Glu Val Ala Ile 85 90
Tyr Gin Asp Tyr His Gly 95 Leu Pro Glu Phe Arg Asn Ala Val Ala 100 105
Arg Phe Met Glu Lys Val 110 Arg Gly Asp Arg Val Lys Phe Asp Pro 115 120
Asn Arg Ile Val Met Ser 125 Gly Gly Ala Thr Gly Ala His Glu Thr 130 135
Leu Ala Phe Cys Leu 140 Ala Asp Pro Glu Asp 145 Ala Phe Leu Val Pro 150
Thr Pro Tyr Tyr Pro 155 Gly Phe Asp Arg Asp 160 Leu Arg Trp Arg Thr 165
Gly Met Gin Leu Leu 170 Pro Ile Val Cys- Arg 175 Ser Ser Asn Asp Phe 180
Lys Val Thr Lys Glu 185 Ser Met Glu Ala Ala 190 Tyr Gin Lys Ala Gin 195
Glu Ala Asn Ile Arg 200 Val Lys Gly Phe Leu 205 Leu Asn Asn Pro Ser 210
Asn Pro Leu Gly Thr 215 Val Leu Asp Arg Glu 220 Thr Leu Ile Asp Ile 225
Val Thr Phe Ile Asn 230 Asp Lys Asn Ile His 235 Leu Ile Cys Asp Glu 240
Ile Tyr Ser Ala Thr 245 Val Phe Ser Gin Pro 250 Glu Phe Ile Ser Ile 255
Ser Glu Ile Ile Glu 260 His Asp Val Gin Cys 265 Asn Arg Asp Leu Ile 270
His Leu Val Tyr Ser 275 Leu Ser Lys Asp Leu 280 Gly Phe Pro Gly Phe 285
Arg Val Gly Ile Leu 290 Tyr Ser Tyr Asn Asp 295 Ala Val Val Ser Cys 300
Ala Arg Lys Met Ser 305 Ser Phe Gly Leu Val 310 Ser Thr Gin Thr Gin 315
His Leu Ile Ala Ser 320 Met Leu Ser Asp Glu 325 Ala Phe Met Asp Lys 330
Ile Ile Ser Thr· Ser 335 Ser Glu Arg Leu Ala 340 Ala Arg His Gly Leu 345
Phe Thr Arg Gly Leu 350 Ala Gin Val Gly Ile 355 Gly Thr Leu Lys Ser 360
Ser Ala Gly Leu Tyr 365 Phe Trp Met Asp Leu 370 Arg Arg Leu Leu Arg 375
Glu Ser Thr Phe Glu 380 Ala Glu Met Glu Leu 385 Trp Arg Ile Ile Ile 390
His Glu Val Lys Leu Asn Val Ser Pro Gly Leu Ser Phe His Cys
395 400 405
Ser Glu Pro Gly Trp 410 Phe Arg Val Cys Phe 415 Ala Asn Met Asp Asp 420
Glu Ser Val Arg Val 425 Ala Leu Arg Arg Ile 430 His Lys Phe Val Leu 435
Val Gin Gly Lys Ala 440 Thr Glu Pro Thr Thr 445 Pro Lys Ser Arg Cys 450
Gly Ser Ser Lys Leu 455 Gin Leu Ser Leu Ser 460 Phe Arg Arg Leu Asp 465
Glu Arg Val Met Gly 470 Ser His Met Met Ser 475 Pro His Ser Pro Met 480
Ala Ser Pro Leu Val Arg Ala Thr
485 (2) Informace pro sekv. id. č. 11:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(Λ) délka: 2040 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovitost: jednoduchá (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: cDNA k mRNA (ix) Rys:
(A) název/klíč: CDS (B) lokace: 178 .. 1653 (xi) Sekvenční popis: sekv. id. č. 11:
GTAATCTCTT CTAAAATCAA CCATTCTCTT CATTCTTCAC TTGACAAGGC 50
CACTGCATTC TTCATTCTTT CTTGATATAT AGCCATTTTT TTCATTCTTT 100
CTTGATATAT AGCCATTTTT TTCATTCTTT CTTCATTCAT TGTCTGGAGA 150
AGTTGGTTGA GTTTTCTTGA AAATTCAAGC AAAACA ATG GAG TTC AGT 198
Met Glu Phe Ser
TTG AAA AAC GAA CAA CAA CAA CTC TTG TCG AAG ATG GCA ACC 24 0
Leu Lys Asn Glu Gin Gin Gin Leu L.eu Ser Lys Met Ala Thr
10 15
- 49 --
AAC GAT GGA CAT GGC GAA AAC TCG
Asn Asp 20 Gly His Gly Glu Asn 25 Ser
AAG GCA TAT GAT AGT GAT CCT TAC
Lys Ala Tyr 35 Asp Ser Asp Pro Tyr 40
AAT GGT GTT ATA CAG ATG GGA CTC
Asn Gly Val Ile 50 Gin Met Gly Leu
TTT GAT TTG ATC GAG GAA TGG GTT
Phe Asp Leu Ile GlU 65 Glu Trp Val
TCC ATT TGC ACA GCA GAA GGA GCG
Ser 75 Ile Cys Thr Ala GlU 80 Gly Ala
GCT ATC TAT CAA GAT TAT CAT GGC
Ala Ile 90 Tyr Gin Asp Tyr His 95 Gly
GCT GTA GCA AGG TTC ATG GAG AAG
Ala Val Ala 105 Arg Phe Met Glu Lys 110
AAG TTC GAT CCC AAC CGC ATT GTG
Lys Phe Asp Pro 120 Asn Arg Ile Val
GGA GCT CAT GAA ACT CTG GCC TTC
Gly Ala His Glu Thr 135 Leu Ala Phe
GAT GCG TTT TTG GTA CCC ACA CCA
Asp 145 Ala Phe Leu Val Pro 150 Tňr • Pro
CGG GAT TTG AGG TGG CGA ACA GGG
Arg Asp 160 Leu Arg Trp Arg Thr 165 Gly
CCT TAT TTT GAT GGT TGG 282 Pro Tyr Phe Asp Gly Trp
CAT CCC ACC AGA AAT CCT 324 His Pro· Thr Arg Asn Pro
GCA GAA AAT CAG TTA TGC 366 Ala Glu Asn Gin Leu cys
60
CTG AAC AAT CCA GAG GCT 408 Leu Asn Asn Pro Glu Ala
AAC AAA TTC ATG GAA GTT 450 Asn Lys Phe Met Glu Val
TTG CCA GAG TTC AGA AAT 492 Leu Pro Glu Phe Arg Asn
100
GTG AGA GGT GAC AGA GTC 534 Val Arg Gly Asp Arg Val
115
ATG AGT GGT GGG GCA ACC 576 Met Ser Gly Gly Ala Thr 125 130
TGT TTA GCT GAC CCT GAA 618 Cys Leu Ala Asp Pro Glu
140
TAT TAT CCA GGA TTT GAT 660 Tyr Tyr Pro Gly Phe Asp
155
ATG CAA CTT CTT CCA ATT 702 Met Gin Leu Leu Pro Ile
170
- 50 -- ......
GTT TGT CGC AGC TCC AAT GAT TTT AAG GTC ACT AAA GAA TCC 744
Val Cys Arg Ser Ser Asn Asp Phe Lys Val Thr Lys Glu Ser
175 180 185
ATG GAA GCT GCT TAT CAG AAA GCT CAA GAA GCC AAC ATC AGA 786
Met Glu Ala Ala Tyr Gin Lys Ala Gin Glu Ala Asn Ile Arg
190 195 200
GTA AAG GGG TTC CTC TTA AAT AAT CCA TCA AAT CCA TTG GGA 828
Val Lys Gly Phe Leu Leu Asn Asn Pro Ser Asn Pro Leu Gly
205 210
ACT GTT CTT GAC AGG GAA ACT TTG ATT GAT ATA GTC ACA TTC 870
Thr Val Leu Asp Arg Glu Thr Leu Ile Asp Ile Val Thr Phe
215 220 225
ATC AAT GAC AAA AAT ATC CAC TTG ATT TGT GAT GAG ATA TAT 912
Ile Asn Asp Lys Asn Ile His Leu Ile Cys Asp Glu Ile Tyr
230 235 240
TCT GCC ACC GTC TTC AGC CAG CCC GAA TTC ATC AGC ATC TCT 954
Ser Ala Thr Val Phe Ser Gin Pro Glu Phe Ile Ser Ile Ser
245 250 255
GAA ATA ATT GAG CAT GAT GTT CAA TGC AAC CGT GAT CTC ATA 996
Glu Ile Ile Glu His Asp Val Gin Cys Asn Arg Asp Leu Ile
260 265 270
CAT CTT GTG TAT AGC CTG TCC AAG GAC TTG GGC TTC CCT GGA 103 8
His Leu Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Leu Gly Phe Pro Gly
275 280
TTC AGA GTT GGC ATT TTG TAT TCA TAT AAT GAC GCT GTT GTC 108 0
Phe Arg Val Gly Ile Leu Tyr Ser Tyr Asn Asp Ala Val Val
285 290 295
AGC TGT GCT AGA AAA ATG TCG AGT TTC GGC CTT GTT TCA ACA 1122
Ser Cys Ala Arg Lys Met Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr
CAA ACT CAG CAT CTG ATT GCA TCA ATG TTA TCG GAC GAA GCA 1164
Gin Thr Gin His Leu Ile Ala Ser Met Leu Ser Asp Glu Ala
315 320 325
TTT ATG GAC AAA Lys 330 ATC Ile ATT TCC ACG AGC TCA GAG AGA TTA GCT 1206
Phe Met Asp Ile Ser Thr Ser 335 Ser Glu Arg Leu Ala 340
GCA AGG CAT GGT CTT TTC ACA AGA GGA CTT GCT CAA GTA GGC 1248
Ala Arg His Gly Leu Phe Thr Arg Gly Leu Ala Gin Val Gly
345 • 350
ATT GGC ACC TTA AAA AGC AGT GCG GGC CTT TAT TTC TGG ATG 1290
Ile Gly Thr Leu Lys Ser Ser Ala Gly Leu Tyr Phe Trp Met
355 360 365
GAC TTA AGG AGA CTC CTC AGG GAG TCC ACA TTT GAG GCA GAA 1332
Asp Leu Arg Arg Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Glu Ala Glu
370 375 380
ATG GAA CTT TGG AGG ATC ATA ATA CAT GAA GTC AAG CTC AAT 1374
Met Glu Leu Trp Arg Ile Ile Ile His Glu Val Lys Leu Asn
385 390 395
GTT TCA CCA GGC TTA TCT TTC CAT TGC TCA GAA CCA GGA TGG 1416
Val Ser Pro Gly Leu Ser Phe His Cys Ser Glu Pro Gly Trp
400 405 410
TTC AGA GTT TGC TTT GCC AAC ATG GAC GAC GAA AGT GTG AGA 1458
Phe Arg Val Cys Phe Ala Asn Met Asp Asp Glu Ser Val Arg
415 420
GTT GCT CTC AGA AGA ATC CAC AAA TTT GTG CTT GTT CAG GGC 1500
Val Ala Leu Arg Arg Ile His Lys Phe Val Leu Val Gin Gly
425 430 435
AAG GCA ACA GAG CCA ACA ACT CCA AAG AGT CGC TGC GGA AGC 1542
Lys Ala Thr Glu Pro Thr Thr Pro Lys Ser Arg Cys Gly Ser
440 445 450
AGC AAA CTT CAA CTC AGC TTA TCT TTC CGC AGA TTG GAC GAA 1584
Ser Lys Leu Gin Leu Ser Leu Ser Phe Arg Arg Leu Asp Glu
455 460 465
AGG GTG ATG GGA TCG CAT ATG ATG TCC CCT CAC TCC CCG ATG 1626
Arg Val Met Gly Ser His Met Met Ser Pro His Ser Pro Met
470 475 480
GCT TCA CCT TTG GTT CGG GCT ACA TAAATCATTT CTTGATCAGA 1670
Ala Ser Pro Leu Val Arg Ala Thr
485
TCATATAGCA AAGATTCCTG AGTAAATACT CGAAACCCTT TCTGGATAAC 1720
TGAAAAGAGA GTTGTTGATT CTTTGCTGTA TCATACAAAC ACGTTACAGG 1770
CATTTTTTGG CCATCTGATG CGTGCAAATT GCATCAAATG CTTTTATTAT 1820
TGTCATATTC ATTTGTGTAC CTTGGTTTTC CTTGCCCTTC AGTCCTCCTT 1870
GTTTTTTGTT TCTTTGTTAT TATTTTCTTC CAGTTGATCA GTTAAACGAA 1920
GGAAGCTCAA TTGTTTCAAG CTATTAGTAA CAGATCATTT TGTAATAGCA 1970
ATAGTTTCAG GATTCTGAAA TGAAAGTTTA TCATTTTTCC ATCATTTTAA 2020
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2040
(2) Informace pro sekv. id. č. 12:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 318 aminokyselinových zbytků (B) typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jednoduchá (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: protein (ix) Typ:
(Δ) název/klíč: CDS (13) lokace: 46..1003 (xi) Sekvenční popis: sekv. id. č. 12
Met 1 Ala Thr Phe Pro 5 Leu Ile Asp Met Glu 10 Lys Leu Asp Gly Glu 15
Glu Arg Ala Ala Thr 20 Met Gly Val Ile Lys 25 Asp Ala Cys Glu Ser 30
Trp Gly Phe Phe Glu 35 Val Leu Asn His Gly 40 Ile Ser Asn Glu Leu 45
Met Asp Thr Val Glu 50 Arg Leu Thr Lys Glu 55 His Tyr Lys Lys Cys 60
Met Glu
Ala Val
Phe Leu
Leu Asp
Leu Glu
Leu Gly
Lys Gly
Pro Arg
Gly Gly
Gin Leu
His Ser
Asn Gly
Asp Gly
Asp Ala
Glu Asp
Lys Leu
Glu Ala
Leu Lys
Gin Thr
Arg His
Asp Glu
Lys Leu
Leu Glu
Pro Thr
Pro Glu lle lle
Leu Lys lle Val
Lys Tyr
Asn Arg
Val lle
Lys Gin
Tyr Ala
Met Lys
Phe 65 Lys
Glu 80 lle
Leu 95 Pro
Tyr 110 Arg
Ala 125 Glu
Lys 140 Gly
Phe 155 Gly
Leu 170 lle
Leu 185 Leu
Asp 200 Gly
lle 215 Asn
Lys 230 Ser
Met 245 Ser
Tyr 260 Pro
lle 275 Tyr
Gly 290 Leu
Ala 305 Val
Glu Met
Asn Asp
Val Ser
Lys Val
Leu Leu
Tyr Leu
Thr Lys
Lys Gly
Phe Gin
Glu Trp lle Gly
Val Met
Leu Ala
Ala Pro
Pro Lys
Lys Phe
Glu Ser
Val Glu 70
Leu Asp 85
Asn lle 100
Met Lys 115
Leu Asp 130
Lys Lys 145
Val Ser 160
Leu Arg 175
Asp Asp 190
Val Asp 205
Asp Gin 220
His Arg 235
Ser Phe 250
Ala Leu 265
Phe Val 280
Gin Ala 295
Thr Val 310
Ser Lys
Trp Glu
Ser Glu
Glu Phe
Leu Leu
Ala Phe
Asn Tyr
Ala His
Lys Val
Val Pro
Leu Glu
Val lle
Tyr Asn
Val Glu
Phe Glu
Lys Glu
Asn Leu
Glu Leu
Ser Thr
Val Pro
Ala Leu
Cys Glu
Tyr Gly
Pro Pro
Thr Asp
Ser Gly
Pro Met
Val lle
Ala Gin
Pro Gly
Lys Glu
Asp Tyr
Pro Arg
Gly Pro
Glu
Phe
Asp
105
Gin
120
Asn
135
Thr
150
Cys
165
Ala
180
Leu
195
Arg
210
Thr
225
Pro
240
Ser
255 '
Ala
270
Met
285
Phe
300 lle
315
Ala Thr Val 318 (2) Informace pro sekv. id. č. 13:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 1320 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovítost: jednoduchá (D) topologie: lineární (ii) Molekulový typ: cDNA k mRNA (ix) Rys:
(A) název/klíč: CDS (B) lokace: 46..1003 (xi) Sekvenční popis: sekv. id. č. 13:
TGTAAACGAA GCATAAGCAC AAGCAAACAC AAACTAGAAA GAGAG ATG 48
Met
GCT Ala ACA TTC Thr Phe CCC Pro 5 CTA Leu ATC Ile GAC ATG GAG AAG Glu Lys 10 CTT Leu GAC Asp GGT Gly GAA Glu 15 90
Asp Met
GAG AGG GCT GCC ACT ATG GGA GTC ATA AAA GAT GCT TGT GAA 132
GlU Arg Ala Ala Thr Met Gly Val Ile Lys Asp Ala Cys Glu
20 25
AGC TGG GGC TTC TTT GAG GTG TTG AAT CAT GGG ATA TCT AAT 174
Ser Trp Gly Phe Phe Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ser Asn
30 35 40
GAG CTC ATG GAC ACA GTG GAG AGG CTA ACA AAG GAG CAT TAC 216
GlU Leu Met Asp Thr Val Glu Arg Leu Thr Lys Glu His Tyr
45 50 55
AAG AAA TGT ATG GAA CTA AAG TTC AAG GAA ATG GTG GAG AGC 258
Lys Lys Cys Met GlU Leu Lys Phe Lys Glu Met Val Glu Ser
60 65 70
AAG GAA TTG GAA GCT GTT CAG ACT GAG ATC AAT GAT TTG GAC 300
Lys Glu Leu Glu Ala Val Gin Thr Glu Ile Asn Asp Leu Asp
75 80 85
TGG GAA AGT ACC TTC TTC TTG CGC CAT CTT CCT GTT TCC AAC Asn 342
Trp Glu Ser Thr Phe Phe Leu Arg His Leu Pro Val Ser
90 95
ATC TCA GAA GTC CCT GAT CTT GAT GAT GAA TAC AGA AAG GTT 384
Ile Ser Glu Val Pro Asp Leu Asp Asp Glu Tyr Arg Lys Val
100 105 • 110
ATG AAG GAA TTT GCG TTG CAA CTT GAG AAA CTA GCA GAG CTC 426
Met Lys Glu Phe Ala Leu Gin Leu Glu Lys Leu Ala Glu Leu
115 120 125
CTG TTG GAC TTG CTA TGC GAG AAC CTT GGC CTA GAG AAA GGC 468
Leu Leu Asp Leu Leu Cys Glu Asn Leu Gly Leu Glu Lys Gly
130 135 140
TAT CTG AAG AAA GCC TTC TAT GGC ACC AAA GGA CCA ACC TTT 510
Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Tyr Gly Thr Lys Gly Pro Thr Phe
145 150 155
GGC ACC AAA GTC AGC AAT TAC CCT CCA TGC CCT CGT CCA GAA 552
Gly Thr Lys Val Ser Asn Tyr Pro Pro Cys Pro Arg Pro Glu
160 165
CTG ATC AAG GGC CTC CGG GCA CAC ACC GAT GCC GGC GGC ATC 594
Leu Ile Lys Gly Leu Arg Ala His Thr Asp Ala Gly Gly Ile
170 175 180
ATC CTG CTG TTC CAG GAT GAC AAG GTC AGC GGT CTC CAG CTC 636
Ile Leu Leu Phe Gin Asp Asp Lys Val Ser Gly Leu Gin Leu
185 19 0 195
CTC AAG GAT GGT GAA TGG GTG GAT GTT CCG CCT ATG CGC CAC 678
Leu Lys Asp Gly Glu Trp Val Asp Val Pro Pro Met Arg His
200 205 210
TCC ATT GTA ATC AAC ATC GGC GAC CAA CTT GAG GTA ATC ACA 720
Ser Ile Val Ile Asn Ile Gly Asp Gin Leu Glu Val Ile Thr
215 220 225
AAT GGA AAA TAC AAG AGT GTG ATG CAC CGG GTG ATA GCT CAA 762
Asn Gly Lys Tyr Lys Ser Val Met His Arg Val Ile Ala Gin
230 235
“56
CCA GAT GGG AAC AGA ATG TCA Pro Asp Gly Asn Arg Met Ser 240 245
GGA AGT GAT GCA GTG ATC TAT Gly Ser Asp Ala Val Ile Tyr
255 260
AAA GAG GCA GAG GAC AAG CAG Lys Glu Ala Glu Asp Lys Gin
270
GAG GAC TAC ATG AAG CTC TAT Glu Asp Tyr Met Lys Leu Tyr 285
AAA GAG CCC AGG TTT GAA GCC Lys Glu Pro Arg Phe Glu Ala
300
GTA AAC TTG GGT CCA ATC GCA Val Asn Leu Gly Pro Ile Ala 310 315
CTA GCA TCA TTC TAC AAT CCA Leu Ala Ser Phe Tyr Asn Pro 250
CCA GCA CCG GCA TTG GTT GAG Pro Ala Pro Ala Leu Val Glu
265
ATA TAT CCC AAG TTT GTG TTC Ile Tyr Pro Lys Phe Val Phe 275 280
GCT GGC CTT AAG TTC CAA GCT Ala Gly Leu Lys Phe Gin Ala
290 295
ATG AAG GCC GTG GAA AGC ACC Met Lys Ala Val Glu Ser Thr
305
ACT GTT TGAGATAATA CACGCTTTGA Thr Val
TCTGCTGCTG TCTTATAATG CGCGTTTGCG TAATCATATC CTAGCATAGT
ATATCTGAGA TCTGAGTCTG TATTGTGGTG TGAGTTTGGT TTAGCCCCTT
GTTAATGCTT GGATTGGACT AGTTAAATGT GGAGCTGGTT TGTTAGATAA
GATAGTCTTG CCAGGATCTT TGAGTAAATA TGATTCTGCG GAAGTCTGCG
GTGAATGATA ACGTGTAAAG CAATCCGAAA GTTACCTTTC TGGGGCTTTG
TCATATGCAA TGGAGAAGGA ATCTTCCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
A
804
846
888
930
972
1019
1069
1119
1169
1219
1269
1319
1320
Příklad A
a) Konstrukce vektorů pro expresi pozitivních ACC synthasových a ACC oxidasových transkriptů
ACC synthasové a ACC oxidasové cDNA mohou být použity k modifikaci obsahu ethylenu v kávě, například pozitivní expresí nebo kosupresí. Je popsán příklad tohoto použití s vektorem pKRl. Je to jen příklad a mnoho jiných rostlinných transformačních vektorů by mohlo být použito ve spojení s ACC synthasovými a ACC oxidasovými cDNA. pKRl byl vytvořen modifikací pBI-121 (Clontech Laboratories) jak je dále uvedeno.
Dvě synthetické sekvence o 38 párech bází obsahujících lox rozpoznávacích míst pro cre místně specifickou rekombinasu byly inzertovány, aby obklopovaly neomycinfosfotransferasový II (NPT II) selektovatelný značkovací gen pBI-121.
Tato lox místa umožňují odstranění NPT II genu z konstruktu po tom, co je začleněn do rostlinného genomu (Dále a Ow, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 10558 (1991)), ale nesouvisí s funkcí ACC synthasové a ACC oxidasové cDNA v pozitivním smyslu.
Tři syntetické oligonukleotidy byly syntetizovány na základě loxP sekvencí definovaných Dalem a Owem (viz výše).· Sekvence těchto oligonukleotidů jsou:
loxA: 5'-AGCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3', loxB: 5'-AGCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3' a loxC: 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGCT-3'.
loxB je komplementární řetězec jak k loxA tak k loxC. Když loxA a loxB byly tepelně hybridizovány, vytvořily dvojřetězcovou molekulu se 4bázovými přesahy komplementárními k HindlII přesahům, které umožňují inzerci dvojřetězcové sekvence do HindlII místa, takže se nalézají po NOS transkripční terminační sekvenci přilehlé k NPT II genu v pBI-121.
Teplotní hybridizaee loxC s loxB vytváří zarovnaně zakončenou dvojřetězcovou DNA obsahující lox rozpoznávací místo.
Syntetická lox místa byla inzertována tak, že obklopují NPT II gen pBI-121 následovně: pBI-121 byl digerován s Pmel (New England Biolabs, Beverly, MA) při 37 °C po dobu 2 hodin v reakčním pufru dodaném výrobcem. pBI-121 má jedno Pmel místo právě v blízkosti NOS promotoru, který řídí expresi NPT II genu. Syntetické lox místo bylo vytvořeno teplotní hybridizací ekvinmolárních množství loxB a loxC zahříváním při 95 °C, pomalým ochlazením na teplotu místnosti a ligací do Pmel-digerovaného pBI-121.
mikrolitrů ligační reakce obsahovalo ligační pufr (New England Biolabs, Beverly, MA), 60 nmolů Pmel-digerovaného pBI-121, 3 mikrolitry 1 mikromolu zásobního roztoku tepelně hybridizovaného loxB/loxC, 4 jednotky Pmel a 4000 jednotek vysoko koncentrované T4 DNA ligasy (New England Biolabs, Beverly, MA). Ligace byla provedena při 16 °C přes noc. Jeden ke čtyřem mikrolitrům ligační reakce byly elektroporovány do E.coli XLl Blue cells (Stratagene) a uloženy na LB plotny obsahující 50 mikrogramů/ml kanamycinu, 50 mikrolitrů 20 mg/ml X-gal a 10 mikrolitrů 100 mM IPTG. Bílé kolonie byly sebrány do čerstvých LB-kanamycinových základních ploten.
Kolonie obsahující lox místo byly identifikovány hybridizací kolonií. Základní plotny byly pěstovány po dobu 4 hodin při 37 °C, zabaleny do nylonových membrán (MSI). yMembrány byly uloženy na čerstvé kanamycinové plotny a kultivovány při 37 °C přes noc. Membrány byly plaveny na 0,5 molárním NaOH po dobu 10 minut, neutralizovány plavením na 0,5 M tris-HCl (pH 8,0) obsahující 0,5 M NaCl po dobu 2 minut a omyty v 2 X SSC.
Membrány byly předhybridizovány ve 20 ml 6 X SSPE 5 X Denhardtově roztoku, 0,5%ním SDS a 100 mikrog/ml fragmentované sledové spermatové DNA při 55 °C po dobu 3 hodin. Předhybridizační roztok byl nahražen 10 ml čerstvého roztoku obsahujícího 8,4.10° cpm loxC značeného na 5* konci [ zp] za použití T4 polynukleotidové kinasy. 50 mikrolitrová značkovací reakce obsahovala 50 pmol loxC, polynukleotidový kinasní reakčni pufr (Promega), 15 mikrolitrů 3 000 Ci/mmol ATP (Du Pont-NEN) a 20 jednotek T4 polynukleotidové kinasy (Promega) Reakce byla inkubována při 37 °C po dobu 10 minut a produkt byl oddělen od nezačleněné ATP pomocí Sephadex G-25 otáčivé kolony. Hybridizace byla provedena při 55 °C přes noc.
Filtry byly promyty při 55 °C dvakrát ve 100 ml 2 X SSC obsahujícího 0,5 % SDS, 1 ml 1 X SSC obsahujícího 0,5 % SDS a radioznačeny jak je dříve popsáno. Několik kolonií jak bylo zjištěno, hybridizovalo intenzívně a byly vybrány pro další charakterizaci. Plasmid DNA byl extrahován pomocí Magie Minipreps DNA Purification System® (Promega) a digerován Pmel jak je popsáno výše.
Plasmidy obsahující lox místo nadále nemají Pmel místo. Plasmidy, které byly rezistentní vůči digesci pomocí Pmel byly nadále analyzovány automatizovaným DNA sekvencováním na University of Hawaii Biotechnology Service Center, aby se potvrdila inzerce lox místa.
Plasmid obsahující lox místo v požadované orientaci byl digerován s HindllL smíšeným s loxA/loxB heteroduplexem, který obsahuje HindlII kohesní konce, ale ne u plné HindlII restrikční místo, tepelně hybridizovány jak je výše popsáno a podrobeny ligaci. Ligační reakce obsahovala 2,5 mikrog HindlII digerovaného plasmidu, 1,25 pmol loxA/loxB, ligační pufr (Promega), 6 jednotek T4 DNA ligasy (Promega), 1,25 jednotek HindlII (Promega) v konečném objemu 30 mikrolitrů.
Reakce byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hod., zahřívána při 80 °C po dobu 10 minut a zavedena do E.coli XLl-Blue Cells elektroporací (Štratagene). Náhodné plasmidy byly roztříděny podle ztráty HindlII místa pomocí digesce s HindlII jak je uvedeno výše. Konečné potvrzení plasmidové struktury označené pKRl bylo získáno DNA sekvencováním, jak je popsáno výše.
Digerace pKRl byla provedena s Sací. 173 mikrolitrů reakce obsahovalo 10 mikogramů pKRl, multijaderný pufr (Promega) a 20 jednotek Sací (Promega). Po 1 hodině při 37 °C bylo přidáno 0,7 mikrolitrů 25 mM zásoby dATP, dCTP, dGTP a dTTP a 10 jednotek T4 DNA polymerasy (Promega). Tato reakce, která vytvoří Sací digesční produkty se zarovnanými konci, byla inkubována při 15 °C po dobu 30 minut. Po inaktivaci T4 DNA polymerasy inkubací při 75 °C po dobu 15 minut bylo přidáno 24 jednotek Smál a reakce byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 2 hodin.
Reakce byla zastavena zahříváním při 80 °C po dobu 15 minut. DNA byla vysrážena přídavkem 17 mikrolitrů 3M octanu sodného a 375 mikrolitry 100%ního ethanolu. Po 1 hodině při -70 °C byla DNA získána odstředěním v mikroodstředivce při plné rychlosti po dobu 20 minut při 4 °C. DNA byla promyLa 70%ním ethanolem, vysušena za vakua a rozpuštěna v 88 mikro litrech vody. Bylo přidáno 10 mikrolitrů 10 X telecího intestinálního alkalického fosfatasového pufru (Promega) a 20 jednotek telecí intestinální alkalické fosfatasy a reakce byla inkubována při 37 °C po dobu 2 hodin.
Reakce byla zastavena přídavkem 4 mikrolitrů 0,5M EDTA a zahříváním při 75 °C po dobu 10 hodin. Vzorek byl extrahován stejnýjm objemem vodou nasyceného fenolu, pak stejným objemem fenol:chloroform (1:1) a nakonec chloroformem.
DNA byla získána vysrážením po přídavku 0,1 objemu 3M octanu sodného a 0,5 objemů 100%ního ethanolu.
Kávové ACC synthasové a ACC oxidasové cDNA inzerty byly uvolněny z původních plasmidů, pACS a pACO, za použití restrikčních enzymů následovně. 10 mikrogramů pACS plasmidů bylo digerováno ve 100 ml obsahujících 10 mikrolitrů 10 X Multicore Buffer (Promega), a 40 jednotek Smál.
Po inkubaci při 25 °C přes noc bylo přidáno 40 jednotek BsrSI a reakce pokračovala při 67 °C. Po 2 hodinách při 67 °C byla reakční zkumavka ochlazena v ledu po dobu 10 minut, načež násle dovala inkubace při 37 °C.
Reakční směs byla doplněna jedním mikrolitrem 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP a dTTP), 1 mikrolitrem 1 mg/ml acetylované BSA a 15 jednotkami T4 DNA polymerasy (Promega). Reakce byla inkubována při 37 °C po dobu 5 minut, aby se vytvořila DNA se zarovnanými konci. Po inaktivaci T4 DNA polymera sy inkubací při 75 °C po dobu 30 minut byl objem redukován na 50 mikrolitrů ve Speed-Vac®. Digesční produkty byly odděleny elektroforézou na l%ním SeaPlague agarosovém gelu.
1,6 kb kávové ACC synthasové cDNA bylo excisováno z agarosového gelu a cDNA inzert získán digescí agarosy s 1,12 jednotkami Agar ace (Promega).
Po inkubaci při 45 °C po dobu 30 minut byla vysrážena cDNA přídavkem 24 mikrolitrů 3M octanu sodného (pH 5,2) a 600 mikrolitrů 95%ního ethanolu. Ethanolem vysrážená cDNA byla odstředěna po dobu 30 minut při teplotě místnosti, supernatant odstraněn a pelety byly promyty ledově studeným 70%ním ethanolem a odstředěny jak je výše uvedeno. Pelety byly rozpuštěny ve 100 mikrolitrech vody a následně použity k zarovnaně koncové ligaci do pKRl vektorů.
ACC oxidasový cDNA inzert byl připraven podobným způsobem popsaným pro pACS cDNA výše. 10 mikrogramů pACO plasmidu bylo digerováno v 10 mikrolitrech obsahujících 10 mikrolitrů 10 X pufru C (Promega), 1 mikrolitr 1 mg/ml acetylované BSA, 30 jednotek Balí a 30 jednotek bamboo.
Po inkubaci při 37 °C po dobu 2 hodin byla reakční směs doplněna 1 mikrol lOmM dNTP (dATP,dCTP,dGTP a dTTP) a 15 jednotkami T4 DNA polymerasy (Promega). Reakce byla inkubována při 37 °C po dobu 5 minut k vyvolání zarovnaných konců.
Po inaktivaci T4 DNA polymerasy inkubací při 75 °C po dobu 30 minut byl objem redukován na 50 mikrolitrů ve Speed-Wac®.
Digesční produkty byly odděleny elelktroforézou na l%ní SeaPlaque agarosovém gelu. 1 kb kávové ACC oxidasové cDNA byl excisován z agarosového gelu a cDNA insert získán digescí agarosy s 1,12 jednotkami Agar Ace (Promega). Vyčištění cDNA insertu z agarosy bylo takové, jak je popsáno pro ACC synthasový insert. Pelety byly rozpuštěny v 50 ml vody a následně použity při zarovnané ligaci do pKRl vektoru.
Vyčištěné ACC synthasové a ACC oxidasové inserty byly vázány do pKRl vektoru mícháním 500 ng pKRl vektoru Smal/SacI fragmentu zarovnaně zakončeného a fosfatasovaného) a 150 ng bud ACC synthasového nebo ACC oxidasového insertu v oddělených zkumavkách. Objem každé vektor/insertové směsi byl redukován na 8 mikrolitrů za použití Speed-Vac Do každé z vektor/insertových zkumavek byl přidán 1 mikrolitr 10 X ligasového pufru (Promega) a 1 mikrolitr T4 DNA ligasy (10 jednotek) Obsahy byly inkubovány při 8 °C po dobu 48 hodin.
mikrolitr každého ligačního produktu byl smíchán se 40 mikrolitry XL-1 Blue cells (dříve připravenými pro elektroporaci a uskladněnými při -70 °C) a elektroporován za použití Electro Cell Manipulátor 600 (ECM 600, BTX lne., CA) při 2,35 kV po dobu 5 msec. Bezprostředně po elektroporací by1 přidán do každé zkumavky 1 ml LB pufru a inkubace byla provedena v rotační třepačce po dobu 1 hodiny při 250 otáčkách/min. Po inkubaci byly bakterie vysráženy odstředěním při 1400 otáčkách za minutu po dobu 2 minut a objem byl redukován na 100 mikrolitrů.
mikrolitrů směsi bylo uloženo do LB ploten obsahujících 40 mikrog/ml kanamycinu a inkubováno přes noc při 37 °C. Kolonie rostoupcí v kanamycinových plotnách byly dále tříděny k identifikaci klonů, které zahrnují ACC synthasové nebo ACC oxidasové inserty. Individuální klony byly sklizeny za použití sterilních zubních párátek a uloženy na čerstvé LBkanamycinové plotny v mřížovém vzoru. Existovaly 3 plotny pro každý cDNA insert (ACC synthasu a ACC oxidasu). Po růstu přes noc v mřížce byly bakterie replikovatelně uloženy v Magna nylonových membránách (MSI, MA). Membrány byly postupně zpracovány v 10%ním SDS po dobu 5 minut, 0,5M NaOH a 1,5M NaCl po dobu 15 minut, 0,5M tris-HCl a 1,5M NaCl po dobu 15 minut a 2 X SSC a 0,2M tris-HCl po dobu 5 minut. Membrány byly ponechány na vzduchu sušit a usušeny při 80 °C po dobu 20 minut, a zesítěny 120 000 mikrojouly UV záření (Strata Linker UV crosslinker 1800, Stratagene, CA).
Membrány byly předhybridizovány po dobu 2 hodin v 6 X SSPE, 5X Denhardtova roztoku, 0,5 % SDS a 100 mikrog/ml sledové spermatové DNA při 65 °C. Nukleotidové sondy pro ACC synthasu a ACC oxidasu byly syntetizovány za použití Ready-to Go DNA značících kuliček (Pharmacia). 50 ng každého cDNA insertu bylo denaturováno varem ve 45 mikrolitrech vody a zchlazeno v ledu. 45 mikrol denturované DNA bylo smícháno s ReadyO o to Go DNA značících kuliček a 5 mikrol [ pj dCTP (3000Ci/mmol) a inkubováno při 37 °C po dobu 30 minut. Po syntéze nukleotidové sondy byly zkumavky zahřátý ve vodě po dobu 4 minut a zchlazeny v ledu. Předhybridizační pufr byl odstraněn a 10 ml předehřátého hybridizačního pufru (6 X SSPE, 0,5 % SDS a 100 mikrog/ml sledové spermatové DNA) bylo uloženo do každé hybridizační láhve, načež následoval přídavek denaturované nukleotidové sondy. Hybridizace byla provedena přes noc při 65 °C.
Membrány byly promyty krátce 2 X SSC a 0,5%ním SDS. Druhé promytí týmž pufrem bylo provedeno po dobu 30 minut. Membrány byly promyty dvakrát 0,2 X SSC a 0,5 X SDS. Každé promytí trvalo 30 minut. Membrány pak byly autoradiografovány.
pKRl klonů s ACC synthasou a 24 klonů s ACC oxidasou bylo identifikováno po vyvolání autoradiogramu. Orientace genů v každém klonu byla identifikována pomocí PCR, restrikční digesce a sekvencování vektor/insertového spoje.
Špetka bakteriální kolonie z každého z 29 klonů (5 ACC synthasy a 24' ACC oxidasy) byla sebrána pomocí zubních párátek a suspendována ve 20 mikrolitrech sterilní Milli-Q vody (buněčné ředidlo). 25 mikrolitrů PCR reakcí obsahovalo 2 mikrolitry výše uvedených zředěných buněk, 0,5 mikrolitrů lOmM zásoby každého dATP, dCTP, dGTP a dTTP, 1,5 mikrolitrů 25mM MgCl2 a 2,5 mikrolitrů 10 X pufru (Promega), 1 mikrolitr každého ze tří 20 mikroM primerů uvedených dále, 0,3 mikrol 5 jednotek/mikrolitr Taq DNA polymerasy (Promega) a 16,2 mikrolitrů sterilní Milli-Q vody.
Primery použité pro ACC synthasové klony byly:
35S primer (5'-CCA CTA TCC TTC GCA AGA CC-3'), ACSR? (5'-TTG CCA TCT TCG ACA AGA CT-3') a ACSL4 (5'-CTG TTG TCA GCT GTG CTA3').
Podobně přimery použité pro ACC oxidasové klony byly: 35S primer, AC0R4 (5'-GGA CTT CTG AGA TGT TGG AA-3') a ACOLX 5'-TGG TGG AGA GCA AGG AAT TG-3').
Tepelné cyklovací podmínky byly 10 minut při 94 °C, cyklů 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 50 °C, 1 minutu při 72 °C a 5 minut při 72 °C. Očekávané rozměry PCR produktů pro pKRl/ACC synthasový konstrukt byly 320 párů bází (35S a ACSRy) pro negativní orientaci a 850 párů bází (35S a ACSl^) pro pozitivní orientaci. Podobně očekávané produkty pro pKRl/ACC oxidasový konstrukt byly 400 párů bází (35S a ACOR^) pro negativní orientaci a 800 párů bází (35S a ACOL..
ť 1) pro pozitivní orientaci.
Pro jak ACC synthasu tak ACC oxidasu 1 plasmid každý s cDNA v negativním a v pozitivním směru byly dále analýzovány DĚNA sekvencováním spojení mezi plasmidem a cDNA k potvrzení orientace. DNA sekvencování bylo provedeno jak je dříve popsáno. Binární vektory s ACC synthasovým genem v pozitivní orientaci (označeným pKRCACS-A), ACC synthasou v negativ ní orientaci (pKRCACS-S), ACC oxidasou v pozitivní orientaci (pKRCACO-A) a ACC oxidasou v negativní orientaci (pKRCACO-S) jsou znázorněny v obr. 1 až 4, které jsou zde připojeny.
b) Elektroporace Agrobacteria s pKRl plasmidem obsahujícím ACC synthasový (pKRCACS-S a pKRCACS-A) a ACC oxidasový (pKRCACO-S a pKRCACO-A) cDNA gen v negativní a pozitivní orien tací
Agrobacterium kmen LBA 4404 byl vypěstován z jedné kolonie na Οϋρθθ v 100 ml YM kapalném mediu (0,4 g/l kvasnicový extrakt, 10 g/l mannitol, 0,1 g/l NaCl, 0,2 g/l MgSO4.7H2O, 0,5 g/l K2HPO4, pH 7,5) v rotační třepačce při 29 °C po dobu 48 hodin. Buňky byly koncentrovány odstředěním při 4000.g na 5.10^ buněk/ml. Elektroporace byla provedena za použití Electro Cell Manipulátor 600 (ECM 600, BTX lne., CA).
3,5 mikrolitrový alikvot buč pKRCACS-A, pKRCACO-A, pKRCACS-S nebo pKRCACO-S plasmidového roztoku obsahujícího 200 ng DNA byl smíchán s 50 mikrolitry koncentrovaných Agrobacteria buněk a převeden do předem ochlazené 2mm mezerové kyvety (BTX lne., CA) a byl aplikován 5 msec puls při 2,35 kV.
Byl přidán 1 ml YM kapalného media obsahujícího 50 mikrog/ml kanamycinu do elektroporovaných buněk a ty byly ponechány k odebrání po dobu 1 hodiny při 29 °C v třepačce při 250 otáčkách za minutu. Buňky byly odstředěny při 4000.g a resuspendovány v 1000 mikrol čerstvého YM kapalného media. Transformované bakterie byly vytříděny na YM-agarových plotnách (YM kapalné medium obsahující 15 g/1 Bacto-agaru) doplněných 50 mikrogram/ml kanamycinu.
Potvrzení Agrobacterium transformace po inkubaci při 29 °C po dobu 48 hodin bylo získáno sebráním 10 kolonií z každé transformace do čerstvých YM-agar/kanamycínových ploten na vyznačené mřížce. Přítomnost a orientace ACC synthasových a ACC oxidasových genaových insertů byla určena PCR za použití 35S primeru ve spojení s jedním z vnitřních genově specifických primerů. Malé množství každé kolonie bylo převedeno do 20 mikro litrové sterilní Milli-Q vody za použití sterilního zubního párátka.
PCR reakce byly provedeny jak je výše popsáno za použití 2 mikrolitrů těchto buněčných suspenzí jako matriční DNA. Pro ACC synthasovou negativní orientaci byly použity 35S a ACSRy primery a vytvořily produkt očekávané velikosti, 320 párů bází. ACC synthasové pozitivní primery 35S a ACSL^ poskytly očekávaný produkt 850 párů bází. Podobně pro ACC oxidasovou negativní orientaci 35S a ACOR^ primery byly použity a produkovaly produkt očekávané velikosti, 400 párů bází.
ACC oxidasové pozitivní primery 35S a ACOL1 poskytly očekávaný produkt 800 párů bází. Byla vyselektována jedna kolonie každé orientace pro transformaci kávovníkové listové tkáně.
ξ>Ί
c) Infekce kávovníkové listové tkáně Agrobakteriemi obsahujícími pKRCACS-S, pKRCACO-S, pKRCACS-A a pKRCACO-A plasmidy
Vyvinuté mladé kávovníkové listy z plagiotropních výhonů byly sterilizovány v 30%ním Cloroxu po dobu 30 minut a omyty 3x v sterilizované destilované vodě. Přibližně 7 mm kousky z lístku mezi středním žebrem a okrajem byly vyříznuty a uloženy v MS kapalné mediu (Murishige a Skoog, 1962) s Agro. x 9 bakteriovou suspenzi 10 bunek/ml a kokultivovány po dobu 3 hodin. Listová tkáň byla odsáta do sucha sterilizovanými papi rovými ubrousky a kokultivovány zbývajícími Agrobakteriemi po dobu 3 dní na MS mediu ztuženém přídavkem 2,0 g/1 Phytagelu.
Listová tkáň byla znovu vysáta sterilními papírovými ubrousky, čímž se odstranily zbývající Agrobakterie a pak převedena do media vytvářejícího zával (MS medium obsahující 2,4-D a kinetin, Sondahl a Sharp, 1977) obsahujícího 500 mikrog/ml karbenicilinu a buá 100 až 300 mikrog/ml kanamycinmonosulfatu nebo 10 až 20 mikrogr/ml geneticinu (G418). Po 13 dnech kultivace při 25 °C v tmě se začal objevovat primární kalus.
d) Subkultivace kávovníkové listové závalové tkáně obsahující pKRCACS-S, pKRCACO-S, pKRCACS-A nebo pKRCACO-A plasmidy
Antibioticky rezistentní závaly byly subkultivovány měsíčně za použití embryonálního indukčního media Μ II (bazální soli, polokoncentrované MS soli, 10 mg thiamin.HCl, 40 mg cystein.HCI, 100 mg myoinositolu, 40 g sacharosy, 20 mg BA,.
mg pyridoxinu, 100 mg nikotinové kyseliny, 2,0 g fytagelu, pH 5,65, Yasuda a Fujii, 1985) obsahujícího 300 mikrog/ml karbenicilinu a 150 až 200 mikrog/ml kanamycinu po dobu 3 měsíců. Tyto závaly byly pak subkultivovány po dobu 30 dnů v Μ II mediu obsahujícím 100 mikrog/ml kanamycinu a po dalších 30 dnů v Μ II mediu obsahujícím 50 mikrogr/ml kanamycinu. Somatická embrya se vytvořila v tomto posledním mediu. Somatická embrya vyvinutá do rostlinek na germinačním mediu Μ III bez růstových regulátorů (bazální soli, plnokoncentrované MS soli 10 mg thiamin.HCl, 40 mg cystein.HCl, 100 mg myoinositolu, 40 g sacharosy, 2 g fytagelu, pH 5,65, Sondahl a Sharp, 1977) pod fluorescenčním ozářením.

Claims (54)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. V podstatě čistá ACC synthasa z kávovníkové rostliny zahrnující aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10.
  2. 2. ACC synthasa podle nároku 1, kde kávovníkem je Coffea arabica.
  3. 3. V podstatě čistá nukleokyselinová sekvence, která kóduje expresy ACC synthasy vytvořené kávovníkem a obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekv.id.č.ll.
  4. 4. V podstatě čistá nukleokyselinová sekvence, která kóduje expresy ACC synthasy vytvořené kávovníkem, kde ACC synthasa má aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10.
  5. 5. V podstatě čistá ACC oxidasa z kávovníku obsahujícího aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  6. 6. ACCoxidasa podle nároku 5, kde kávovníkem je Coffea arabica.
  7. 7. V podstatě čistá nukleokyselinová sekvence, která kóduje expresi ACC oxidasy tvořené kávovníkem a obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekv.id.č.13.
  8. 8. V podstatě čistá nukleokyselinová sekvence, která kóduje expresi ACC oxidasy vytvořené kávovníkem, kde ACC oxidasa má aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  9. 9. Nukleokyselinová sekvence podle kteréhokoli z nároků 3, 4, 7 nebo 8, kde kávovníkem je Coffea arabica.
  10. 10. Kávovník transformovaný nukleokyselinovou sekvencí izolovanou z kávovníku, kde nukleokyselinová sekvence kóduje transkripci NRA, která je antimediátorová k mRNA, která kóduje expresi ACC synthasy mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id. č.10, kde RNA má délku dostatečnou interferenci s expresí ACC synthasy.
  11. 11· Kávovník transformovaný nukleokyselinovou sekvencí izolovanou z kávovníku, kde nukleokyselinová sekvence kóduje transkripci NRA, která je antimediátorová k mRNA, která kóduje expresi ACC oxidasy mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12, kde RNA má délku dostatečnou k interferenci s expresí ACC oxidasy.
  12. 12. Kávovník transformovaný (I) nukleokyselinovou sekven cí podle nároku 7 a (ii) nukleokyselinovou sekvencí podle nároku 8.
  13. 13. Kávovník transformovaný nukleokyselinovou sekvencí izolovanou z kávovníku, kde nukleokyselinová sekvence kóduje transkripci NRA a je antimediátorová k mRNA, která kóduje expre si ACC synthasy mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10, kde RNA má délku dostatečnou k interferenci s expresí ACC synthasy.
  14. 14. Kávovník transformovaný nukleokyselinovou sekvencí izolovanou z kávovníku, kde nukleokyselinová sekvence kóduje transkripci NRA, která je antimediátorová k mRNA, která kóduje expresi ACC oxidasy mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12, přičemž RNA má délku dostatečnou k interferenci s expresí ACC oxidasy.
  15. 15. Kávovník transformovaný (I) nukleokyselinovou sekvencí podle nároku 13 a (ii) nukleokyselinovou sekvencí podle nároku 14.
  16. 16. Kávovník transformovaný izolovanou nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje expresi aminokyselinové sekvence sekv. id.č.10.
  17. 17. Kávovník podle nároku 16, kde nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v pozitivní orientaci.
  18. 18. Kávovník podle nároku 16, kde nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v negativní orientaci.
  19. 19. Kávovník transformovaný izolovanou nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje expresi pro aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  20. 20. Kávovník podle nároku 19, kde nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v pozitivní orientaci.
  21. 21. Kávovník podle nároku 19, kde nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v negativní orientaci.
  22. 22. Kávovník transformovaný první izolovanou nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje expresi pro aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10 a druhou izolovanou nukleovou kyselinou obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje expresi pro aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  23. 23. Kávovník podle nároku 22, kde alespoň jedna z první nebo druhé nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v pozitivní orientaci.
  24. 24. Transformovaný kávovník vytvořený způsobem inzerce do rostlinného genomu nukleokyselinové sekvence izolované z kávovníku, které kóduje transkripci na RNA, která je . pozitivní k mRNA, která kóduje expresi na ACC synthasu mající amino kyselinovou sekvenci sekv.id.č.10.
  25. 25. Transformovaný kávovník vytvořený způsobem inzerce do rostlinného genomu nukleokyselinové sekvence izolované z kávovníku, která kóduje transkripci na RNA, která je pozitivní k mRNA, která kóduje expresi na ACC oxidasu mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12 .
  26. 26. Transformovaný kávovník vytvořený způsobem inzerce do rostlinného genomu (i) nukleokyselinové sekvence izolované z kávovníku, která kóduje transkripci na RNA, která je pozitivní k mRNA, která kóduje expresi pro ACC synthasu mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10 a (ii) nukleokyselinové sekvence izolované z kávovníku, která kóduje transkripci na RNA, která je antimediátorová k mRNA, která kóduje expresi na ACC oxidasu mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  27. 27. Transformovaný kávovník vytvořený způsobem inzerce do rostlinného genomu nukleokyselinové sekvence izolované z kávovníku, která kóduje transkripci na RNA, která je negativní k mRNA, která kóduje expresi pro ACC synthasu mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10.
    20. Transformovaný kávovník vytvořený způsobem inzerce do rostlinného genomu nukleokyselinové sekvence izolované z kávovníku, která kóduje transkripci pro NRA, která je negativní k mRNA, která kóduje expresi pro ACC oxidasu mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  28. 29. Transformovaný kávovník vytvořený způsobem inzerce do rostlinného genomu (i) nukleokyselinové sekvence izolované z kávovníku, která kóduje transkripci pro RNA, která je negativní k mRNA, která kóduje expresi pro ACC synthasu mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10 a (ii) nukleokyselinové sekvence izolované z kávovníku, která kóduje transkripci na RNA, která je negativní k mRNA, která kóduje na expresi pro ACC oxidasu mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  29. 30. Kávové zrno z kávovníku podle kteréhokoli z nároků 19 až 29.
  30. 31. Transformační vektor zahrnující transkripční promotor operabilně vázaný k (a) nukleokyselinové sekvenci sekv.id.č.ll, nebo (b) nukleokyselinovou sekvenci, která kóduje expresi pro aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10, nebo (c) nukleokyselinovou sekvenci sekv.id.č.13, nebo (d) nukleokyselinovou sekvenci, která kóduje expresi na aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  31. 32. Transformační vektor podle nároku 31, kde nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v negativní orientaci.
  32. 33. Transformační vektor podle nároku 31, kde nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v pozitivní orientaci.
  33. 34. Kávovníková buňka transformovaná izolovanou nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje expersi pro aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10.
  34. 35. Kávovníková buňka podle nároku 34, kde nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v pozitivní orientaci.
  35. 36. Kávovníková buňka podle nároku 34, kde nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v negativní orientaci.
  36. 37. Kávovníková buňka transformovaná izolovanou nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje expresi na aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  37. 38. Kávovníková buňka podle nároku 37, kde nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v pozitivní orientaci.
  38. 39. Kávovníková rostlina podle nároku 37, kde je nukleokyselinová sekvence operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v negativní orientaci.
  39. 40. Kávovníková buňka transformovaná (i) izolovanou nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje expresi pro aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10 a (ii) izolovanou nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje expersi na aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  40. 41. Kávovníková buňka podle nároku 40, kde alespoň jedna z nukleokyselinových sekvencí je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v pozitivní orientaci.
  41. 42. Kávovníková buňka podle nároku 40, kde alespoň jedna z nukleokyselinových sekvencí je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v negativní orientaci.
  42. 43. Transformovaná kávovníková buňka vytvořená způsobfem inzerce transformačního vektoru do kávovníkové buňky, přičemž transformační vektor zahrnuje transkripční promotor operabilně vázaný k (i) izolované nukleokyselinové sekvenci, která kóduje expresi na aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10, nebo (ii) k izolované nukleokyselionové sekvenci, která kóduje expresi pro aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  43. 44. Transformovaná kávovníková buňka podle nároku 43, kde nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkrip čnímu promotoru v negativní orientaci.
  44. 45. Transformovaná kávovníková buňka podle nároku 43, kde nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkrip čnímu promotoru v pozitivní orientaci.
  45. 46. Transformovaná kávovníková buňka vytvořená způsobem inzerce prvního transformačního vektoru a druhého transformačního vektoru do kávovníkové buňky, přičemž první transformační vektor zahrnuje transkripční promotor operabilně vázaný k izolované nukleokyselinová sekvenci, která kóduje expresi na aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10 a druhý transformační vektor zahrnuje transkripční promotor operabilně vázaný k izolované nukleokyselinová sekvenci, která kóduje expresi na aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12.
  46. 47. Transformovaná kávovníková buňka podle nároku 46, kde alespoň jedna z nukleokyselinových sekvencí je operabilně vázána k jejímu transkripčnímu promotoru v pozitivní orientaci
  47. 48. Kávovník regenerovaný z transformované kávovníkové buňky podle kteréhokoli z nároků 34 až 47.
  48. 49. Kávové zrno z kteréhokoli kávovníku z nároku 48.
  49. 50. Způsob transformování kávovníkové buňky nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje transkripci na RNA, která je pozitivní k mRNA, která kóduje na ACC synthasu z kávovníku, vyznačený tím, že se vytvoří transformační vektor zahrnující nukleokyselinovou sekvenci izolovanou z kávovníku, která kóduje transkripci na RNA, která má délku dostatečnou k interferenci s expresí ACC synthasy mající aminokyselihovou sekvenci sekv.id.č.10, přičemž nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v pozitivní orientaci, a transformační vektor se zavede do kávovníkové buňky, kde nukleokyselinová sekvence se pak začlení do genomu kávovníkové buňky.
  50. 51. Způsob transformace kávovníkové buňky nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje transkripci na RNA, která je pozitivní k mRNA, která kóduje na ACC oxidasu z kávovníku, vyznačený tím, že se vytvoří transformační vektor zahrnující nukleokyselinovou sekvenci izolovanou z kávovníku, která kóduje transkripci na RNA, která má délku dostatečnou k iterferenci s expresí ACC oxidasy mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12, přičemž nukleokyselinová sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v pozitivní orientaci, a transformační vektor se zavede do kávovníkové buňky, přičemž nukleokyselinová sekvence se pak stane začleněnou do genomu kávovníkové buňky.
  51. 52. Způsob transformace kávovníkové buňky (i) nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje transkripci na RNA, která je pozitivní k mRNA, která kóduje na ACC synthasu z kávovníku, a (ii) nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje transkripci na RNA, která je pozitivní k mRNA, která kóduje a ACC oxidasu z kávovníku vyznačený tím, že se vytvoří první transformační vektor zahrnující první transkripční promotor operabilně vázaný k první nukleokyselinové sekvenci izolované z kávovníku, která kóduje transkripci na RNA, která má délku dostatečnou k interferenci s expresí ACC synthasy mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10, vytvoří se druhý transformační vektor zahrnující druhý transkripční promotor operabilně vázaný k druhé nukleokyselinové sekvenci izolované z kávovníku, která kóduje transkripci na RNA, která má dostatečnou délku i interferenci s expresí s ACC oxidasy mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12, přičemž alespoň jedna z první nebo druhé nukleokyselinové sekvence je operabilně vázána k jejímu transkripčnímu promotoru v pozitivní orientaci, a každý z transformačních vektorů se zavede do kávovníkové buňky, přičemž každá z nukleokyselinových sekvencí se pak stane začleněnou do genomu kávovníkové buňky.
  52. 53. Způsob transformace kávovníkové buňky nukleokyselinovou sekvencí, terá kóduje transkripci na RNA, která je negativní orientace vůči mRNA, která kóduje na ACC synthasu z kávovníkové rostliny, vyznačený tím, že se vytvoří transformační vektor zahrnující transkripční promotor operabilně vázaný k nukleokyselinové sekvenci izolované z kávovníku, která kóduje transkripci pro RNA, která má dostatečnou délku k interferenci s expresí ACC synthasy mající aminokyselinovou sekvenci sekv. id.č.10, přičemž nukleokyselinové sekvence je operabilně vázána k promotoru v negativní orientaci a transformační vektor se zavede do kávovníkové buňky, přičemž nukleokyselinové sekvence se pak začlení do genomu kávovníkové buňky.
  53. 54. Způsob transformace kávovníkové buňky nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje na transkripci pro RNA, která je negativní orientace k mRNA, která kóduje ACC oxidasu z kávovníku, vyznačený tím, že se vytvoří transformační vektor zahrnující transkripční kpromotor operabilně vázaný k nukleokyselinové sekvenci z kávovníku, která kóduje na RNA, která má délku dostatečnou k interferenci s expresí ACC oxidasy mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12, přičemž nukleokyselinové sekvence je operabilně vázána k transkripčnímu promotoru v negativní orientaci, a transformační vektor se zavede do kávovníkové buňky, přičemž nukleokyselinová sekvence se pak stane začleněnou do genomu kávovníkové buňky.
  54. 55. Způsob transformace kávovníkové buňky (i) nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje transkripci na RNA, která je negativní orientace vůči mRNA, která kóduje ACC synthasu z kávovníku, a (ii) nukleokyselinovou sekvencí, která kóduje transkripci na RNA, která je negativní orientace k mRNA, která kóduje ACC oxidasu z kávovníku, vyznačený tím, že se vytvoří první transformační vektor zahrnující první transkripční promotor operabilně vázaný k první nukleokyselinové sekvenci izolované z kávovníku, která kóduje transkripci na RNA, která má dostatečnou délku k interferenci s expresí ACC synthasy mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.10, vytvoří se druhý transformační vektor zahrnující druhý transkripční promotor operabilně vázaný k druhé nukleokyselinové sekvenci izolované z kávovníku, která kóduje transkripci na RNA, která má délku dostatečnou k interferenci s expresí ACC oxidasy mající aminokyselinovou sekvenci sekv.id.č.12, přičemž alespoň jedna z nukleokyselinových sekvencí je operabilně vázána k jejímu transkripčnímu promotoru v negativní orientaci, a každý z transformačních vektorů se zavede do kávovníkové buňky, přičemž každá z nukleokyselinových sekvencí se pak stává začleněnou do genomu kávovníkové buňky.
CZ99450A 1996-08-12 1997-08-11 Čištěné proteiny, sekvence rekombinantní DNA a způsoby řízení zrání kávovníkových rostlin CZ45099A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/695,412 US5874269A (en) 1995-06-07 1996-08-12 Purified proteins, recombinant DNA sequences and processes for controlling the ripening of coffee plant

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ45099A3 true CZ45099A3 (cs) 1999-07-14

Family

ID=24792877

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ99450A CZ45099A3 (cs) 1996-08-12 1997-08-11 Čištěné proteiny, sekvence rekombinantní DNA a způsoby řízení zrání kávovníkových rostlin

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5874269A (cs)
EP (1) EP0918869A1 (cs)
JP (3) JP2000500663A (cs)
KR (2) KR20060035579A (cs)
CN (1) CN1227606A (cs)
AP (1) AP9901461A0 (cs)
AU (1) AU735202B2 (cs)
BR (1) BR9710888A (cs)
CA (1) CA2260765C (cs)
CZ (1) CZ45099A3 (cs)
EA (1) EA004060B1 (cs)
HU (1) HUP9904413A3 (cs)
IS (1) IS4957A (cs)
NO (1) NO990508L (cs)
NZ (1) NZ334117A (cs)
OA (1) OA11021A (cs)
TR (1) TR199900588T2 (cs)
WO (1) WO1998006852A1 (cs)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6448474B1 (en) 1995-06-07 2002-09-10 University Of Hawaii Purified proteins, recombinant DNA sequences and processes for controlling the ripening of coffee plants
AUPP557298A0 (en) * 1998-08-31 1998-09-17 University Of Queensland, The A novel plant promoter and uses therefor
EP1131446A1 (fr) * 1998-11-11 2001-09-12 Societe Des Produits Nestle S.A. Mannanase de coffea arabica
US6441273B1 (en) 2000-02-25 2002-08-27 Cornell Research Foundation, Inc. Constitutive and inducible promoters from coffee plants
US6903247B2 (en) * 2000-02-08 2005-06-07 Cornell Research Foundation, Inc. Constitutive α-Tubulin promoter from coffee plants and uses thereof
EP1138771A1 (fr) * 2000-03-30 2001-10-04 Societe Des Produits Nestle S.A. Endo-Mannanase de café
US7678556B2 (en) 2006-11-21 2010-03-16 Cornell Research Foundation, Inc. Beta-mannanase from coffee berry borer, Hypothenemus hampei, and uses thereof
EP2363408A3 (en) * 2008-06-23 2012-07-11 Nestec S.A. Genes for modulating coffee maturation and methods for their use
BR102012008162B1 (pt) * 2012-04-09 2018-08-14 Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária - Embrapa composições e métodos para modificar a expressão de genes de interesse
KR101661253B1 (ko) * 2013-12-16 2016-09-30 세종대학교산학협력단 ＬＨＴ1 유전자의 ＡＣＣ(1-Ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ-1-Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ) 수송체로서의 신규한 용도

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5453566A (en) * 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US5356799A (en) * 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
US5436395A (en) * 1988-11-07 1995-07-25 Kraft Foods, Inc. Induction and selection of somaclonal variation in coffee
KR920701453A (ko) * 1989-03-17 1992-08-11 미리엄 디. 멕코나헤이 유전자발현의 외부조절
US5334529A (en) * 1989-06-27 1994-08-02 Escagenetics Corporation Stably transformed coffee plant cells and plantlets
GB8916213D0 (en) * 1989-07-14 1989-08-31 Ici Plc Dna constructs,cells and plants derived therefrom
US5416250A (en) * 1989-12-12 1995-05-16 Agritope, Inc. Genetic control of ethylene biosynthesis in plants using S-adenosylmethionine hydrolase
GB9018612D0 (en) * 1990-08-24 1990-10-10 Ici Plc Dna,constructs,cells and plants derived therefrom
MX9100993A (es) * 1990-09-10 1992-05-04 Us Agriculture Secuencia de adn aislado y enzima acido 1-aminociclopropan-1-carboxilico sintasa,recombinante
GB9027616D0 (en) * 1990-12-20 1991-02-13 Ici Plc Dna,dna constructs,cells and plants derived therefrom
GB9109063D0 (en) * 1991-04-26 1991-06-12 Ici Plc Modification of lignin synthesis in plants
US5367065A (en) * 1992-08-10 1994-11-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Constitutive triple response gene and mutations
US5457041A (en) * 1994-03-25 1995-10-10 Science Applications International Corporation Needle array and method of introducing biological substances into living cells using the needle array
US5518988A (en) * 1994-06-03 1996-05-21 North Carolina State University Method of counteracting an ethylene response in plants
CA2198708A1 (en) * 1994-09-02 1996-03-14 Maury L. Boeshore Transgenic plants expressing acc oxidase genes
US5633440A (en) * 1994-12-20 1997-05-27 Dna Plant Technology Corporation P119 promoters and their uses
AU709862B2 (en) * 1994-12-30 1999-09-09 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Transgenic plants expressing ACC synthase gene

Also Published As

Publication number Publication date
OA11021A (en) 2002-02-21
HUP9904413A3 (en) 2002-01-28
IS4957A (is) 1999-01-26
CA2260765A1 (en) 1998-02-19
EA199900101A1 (ru) 1999-08-26
AU4062997A (en) 1998-03-06
BR9710888A (pt) 1999-08-17
NZ334117A (en) 2000-08-25
TR199900588T2 (xx) 1999-07-21
CA2260765C (en) 2008-01-15
EA004060B1 (ru) 2003-12-25
EP0918869A1 (en) 1999-06-02
AP9901461A0 (en) 1999-03-31
KR20060035579A (ko) 2006-04-26
NO990508D0 (no) 1999-02-04
US5874269A (en) 1999-02-23
WO1998006852A1 (en) 1998-02-19
JP2000500663A (ja) 2000-01-25
CN1227606A (zh) 1999-09-01
JP2005323613A (ja) 2005-11-24
KR20000029923A (ko) 2000-05-25
JP2003070368A (ja) 2003-03-11
AU735202B2 (en) 2001-07-05
HUP9904413A2 (hu) 2000-05-28
NO990508L (no) 1999-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7795509B2 (en) Tobacco products with reduced nicotine
KR100245488B1 (ko) 신규 식물 유전자
JP2005323613A (ja) コーヒー植物の成熟を制御するための、精製されたタンパク質、組換えｄｎａ配列、および手順
KR19980702463A (ko) 저온유도성 프로모터 배열
US6348641B1 (en) Purified proteins, recombinant DNA sequences and processes for producing caffeine-free beverages
US6727406B2 (en) Purified proteins, recombinant DNA sequences and processes for controlling the ripening of coffee plants
MXPA99011625A (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
AU2004203879A1 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic