EA004060B1 - Очищенные аминоциклопропан-1-карбоксилат-синтаза и аминоциклопропан-1-карбоксилат-оксидаза растения кофе, кодирующие их нуклеиновые кислоты, способы трансформации клеток растения кофе и трансформированные клетки растения кофе - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к аминоциклопропан-1-карбоксилат(АЦК)-синтазе и аминоциклопропан-1-карбоксилат(АЦК)-оксидазе растения кофе, кодирующим их нуклеиновым кислотам, способам трансформации клеток растения кофе с целью подавления экспрессии указанных выше ферментов и трансформированным клеткам растения кофе. АЦК-синтаза и АЦК-оксидаза являются ключевыми ферментами, участвующими в процессе биосинтеза этилена в растениях кофе. Согласно данному изобретению растения кофе трансформируют векторами, содержащими нуклеотидные последовательности АЦК-синтазы и/или АЦК-оксидазы, определяющие транскрипцию соответствующей РНК, которая является антисмысловой по отношению к мРНК для АЦК-синтазы и/или АЦК-оксидазы. Полученная антисмысловая мРНК связывается с мРНК, определяющей экспрессию АЦК-синтазы и/или АЦК-оксидазы, тем самым инактивируя мРНК, кодирующую один или более ферментов в процессе биосинтеза этилена. Указанные нуклеотидные последовательности также могут быть использованы для предотвращения синтеза АЦК-синтазы или АЦК-оксидазы путем косупрессии. Итогом любой реализации является то, что трансформированные растения становятся не способными синтезировать этилен, причем другие аспекты их метаболизма не затрагиваются.

Description

Данная заявка относится к аминоциклопропан-1-карбоксилат(АЦК)-синтазе и аминоциклопропан-1 -карбоксилат(АЦК)-оксидазе растения кофе, кодирующим их нуклеиновым кислотам, способам трансформации клеток растения кофе с целью подавления экспрессии указанных выше ферментов в плодах кофе и трансформированным клеткам растения кофе. Данная заявка относится также к растениям кофе, трансформированным указанными выше нуклеотидными последовательностями, в результате чего растения кофе оказываются не способными синтезировать этилен, необходимый для созревания плодов. Введение экзогенного этилена в растения, трансформированные способом по настоящему изобретению, дает возможность синхронизировать и управлять созреванием плодов растений кофе.

Предпосылки изобретения

Кофе готовят из обжаренных и перемолотых зерен растений рода Кофе (СоГГса). обычно из вида С. атаЫса. Зерна представляют собой семена растений кофе, которые получают путем обработки плодов, причем хорошо вызревших плодов, что позволяет установить наиболее выгодную цену благодаря их высокому качеству. Раньше кофе высокого качества для гурманов собирали вручную. Это было необходимо, так как плоды кофе созревают не одновременно, т. е. на одном дереве одновременно находятся плоды с различной степенью зрелости. Раньше это не являлось серьезной проблемой, т. к. основное количество кофе выращивали в местах, где рабочие руки имелись в большом количестве, а труд ценился дешево. Однако в последние годы нехватка дешевой рабочей силы существенно снизили эффективность производства кофе. Для повышения эффективности производства в некоторых районах мира, например, в такой крупнейшей стране-производителе кофе, как Бразилия, стали пользоваться таким способом сбора урожая, при котором рабочие снимают все плоды подряд, как созревшие, так и незрелые (зеленые).

Более того, неодновременное созревание плодов существенно уменьшает эффективность механизированного сбора урожая. Усилие, необходимое для отрыва созревшего (темнокрасного) плода от дерева, аналогично усилию, которое требуется для отрыва зеленого плода. Поэтому машины для сбора плодов не отличают зеленые плоды от темно-красных, в итоге большое количество незрелых плодов собирают вместе со зрелыми. Это сильно уменьшает выход зрелых плодов и эффективность производства. Если бы можно было управлять процессом созревания плодов таким образом, чтобы все плоды созревали одновременно, механизированная уборка урожая стала бы более эффективной, и собранные плоды были бы более высокого каче ства. Это увеличило бы доходность производства кофе.

Как и в случае со многими другими плодами (Уапд апб НоГГтап, Апп. Ису. Р1аи1 РйумоГ 35:155 (1984)), продуцируемый растениями этилен играет важную роль на завершающих стадиях созревания плодов кофе. Как только плод достиг определенной стадии развития, его созревание можно стимулировать путем введения экзогенного этилена (Спюйо, С.Н., Р.С. Таикепб, М.А. Иадао, ЬН. ЕисЫдат1 апб Т.Н.Н. Сйеп. 1. Нате. Рас. Адп. 3:13-17 (1991)). Данный факт демонстрирует важность этилена на завершающих стадиях созревания плодов кофе.

Этилен синтезируется в процессе двухстадийной реакции из 8-аденозилметионина (8АМ). Первая стадия заключается в синтезе аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (АЦК) из 8АМ с помощью АЦК-синтазы. В большинстве растений эта стадия лимитирует скорость реакции. Конечной стадией реакции является превращение АЦК в этилен, катализируемое АЦК-оксидазой (Уапд апб НоГГтап, см. выше).

Ингибирование биосинтеза этилена с помощью химических (например, ионами серебра или двуокисью углерода) или биотехнологических средств (Ое11ег е1. а1., 8с1епсе 254:437 (1991)) замедляет конечные стадии созревания кофе. Это ингибирование является обратимым благодаря введению этилена.

Следовательно, стратегия управления созреванием растений кофе заключается в предотвращении синтеза специфических ферментов в процессе биосинтеза этилена. В одной реализации настоящее изобретение относится к генетическому изменению растений кофе с целью ограничения синтеза АЦК-синтазы, в другой - к подавлению синтеза АЦК-оксидазы. В предпочтительных реализациях синтез одного или обоих ферментов подавляют путем трансформации растений кофе последовательностью ДНК, определяющей транскрипцию РНК, которая является антисмысловой по отношению к матричной РНК (мРНК), определяющей экспрессию фермента, синтез которого необходимо подавить. См. Ое11ег е1. а1., 8с1епсе 254:437 (1991), где сообщается об управлении созреванием томатов с использованием аналогичной стратегии.

Технологию рекомбинантной ДНК применяли для выделения нескольких генов АЦКсинтазы и АЦК-оксидазы. Однако до настоящего времени гены АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы растений кофе не были идентифицированы и секвенированы.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение дает очищенные аминоциклопропан-1-карбоксилат(АЦК)-синтазу и аминоциклопропан-1-карбоксилат(АЦК)оксидазу растения кофе, кодирующие их нуклеотидные последовательности для трансформации клеток растения кофе с целью подавле3 ния экспрессии указанных выше ферментов, необходимых для синтеза этилена. Растения кофе трансформируют с помощью векторов, содержащих нуклеотидные последовательности АЦК-синтазы и/или АЦК-оксидазы, которые вводят таким образом, что трансформирующие последовательности определяют транскрипцию соответствующих РНК, которые являются антисмысловыми по отношению к мРНК АЦКсинтазы и/или АЦК-оксидазы. Полученная антисмысловая РНК связывается с мРНК, определяющей экспрессию одного или более ферментов в процессе биосинтеза этилена, и таким образом инактивирует ее. Описанные нуклеотидные последовательности также можно применять для предотвращения синтеза АЦК-синтазы или АЦК-оксидазы, используя косупрессию. Итогом любой реализации является то, что трансформированные растения становятся не способными синтезировать этилен, при этом другие аспекты их метаболизма не затрагиваются.

Созревание трансформированных растений можно регулировать путем введения экзогенного этилена. При введении этилена в целое растение, его плоды будут созревать одновременно, что сделает механизированный сбор урожая более производительным.

Описание рисунков

Фиг. 1 представляет полноразмерную последовательность кДНК, определяющую экспрессию АЦК-синтазы в плодах кофе.

Фиг. 2 представляет аминокислотную последовательность АЦК-синтазы из плодов кофе, выведенную из последовательности кДНК, представленной на фиг. 1.

Фиг. 3 представляет последовательность кДНК, определяющую экспрессию АЦКоксидазы в плодах кофе.

Фиг. 4 представляет аминокислотную последовательность АЦК-оксидазы из плодов кофе, выведенную из последовательности кДНК, представленной на фиг. 3.

Подробное описание изобретения

Для лучшего понимания настоящего изобретения предлагается следующее подробное описание, в котором используются термины:

Нуклеотид - Мономерная единица ДНК или РНК, состоящая из углеводного остатка (пентозы), фосфата и азотистого гетероциклического основания. Основание связано с углеводным остатком через гликозидный атом углерода (1'-атом углерода пентозы), и эта комбинация основания и углевода называется нуклеозидом. Основание характеризует нуклеотид. Четыре основания ДНК - это аденин (А), гуанин (О), цитозин (С) и тимин (Т). Четыре основания РНК - это А, О, С и урацил (И).

Последовательность ДНК - Линейная цепь нуклеотидов, связанных друг с другом фосфодиэфирными связями между 3'- и 5'-атомами углерода соседних пентоз.

Кодон - Последовательность ДНК из трех нуклеотидов (триплет), которая кодирует через РНК аминокислоту, сигнал начала трансляции или сигнал окончания трансляции. Например, триплеты нуклеотидов ТТА, ТТО, СТТ, СТС, СТА и СТО кодируют аминокислоту лейцин (Ьеи), ТАО, ТАА и ТОА кодируют сигналы окончания трансляции, АТО кодирует сигнал начала трансляции и аминокислоту метионин (Ме1).

Полипептид - Линейная последовательность аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями между амино- и карбоксильными группами соседних аминокислот.

Геном - Суммарная ДНК клетки или вируса. Он включает среди прочего структурный ген, кодирующий полипептиды вещества, а также промотор, сайты начала и окончания транскрипции и трансляции.

Ген - Последовательность ДНК, кодирующая через ее матричную РНК (мРНК) последовательность аминокислот, характерную для специфического полипептида.

Транскрипция - Процесс получения мРНК из гена или последовательности ДНК.

Трансляция - Процесс получения полипептида из мРНК.

Экспрессия - Процесс получения полипептида под действием гена или последовательности ДНК. Комбинация транскрипции и трансляции.

Плазмида - внехромосомная двухцепочечная последовательность ДНК, включающая интактный репликон, обеспечивающий репликацию плазмиды в клетке-хозяине. При помещении плазмиды в одноклеточный организм, характеристики этого организма могут быть изменены или трансформированы благодаря ДНК плазмиды. Например, плазмида, несущая ген устойчивости к тетрациклину (ТЕТЯ), трансформирует клетку, ранее чувствительную к тетрациклину, в клетку, устойчивую к нему. Клетка, трансфомированная плазмидой, называется трансформантом.

Фаги или Бактериофаги - бактериальные вирусы, многие из которых состоят из последовательностей ДНК, заключенных в белковую оболочку (капсид).

Клонирующий вектор - Плазмида, фаговая ДНК, космида или другая последовательность ДНК, способная реплицироваться в клеткехозяине, характеризующаяся одним или несколькими сайтами узнавания эндонуклеаз, в которых такие последовательности ДНК могут быть разрезаны поддающимся определению образом без потери необходимой биологической функции ДНК, например, репликации, продукции белков оболочки, или без потери промотора или сайтов связывания, и которые содержат маркер, подходящий для идентификации трансформированных клеток, например, ген устойчи5 вости к тетрациклину или ампициллину. Клонирующий вектор часто называют вектором.

Клонирование - Процесс получения популяции организмов или последовательностей ДНК, полученных от одного из таких организмов, или последовательность бесполой репродукции.

Рекомбинантная ДНК или гибридная ДНК молекула, состоящая из фрагментов ДНК из различных геномов, которые соединены непрерывно (конец-к-концу) вне живой клетки и способны поддерживаться в живых клетках.

кДНК - Цепь ДНК, комплементарная мРНК, кодирующая специфические полипептиды.

Согласно настоящему изобретению стратегия управления биосинтезом этилена в растениях кофе состоит в первую очередь в определении генов, определяющих экспрессию двух ферментов в процессе биосинтеза этилена: АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы. Полагают, что трансформация дикорастущих растений кофе конструкциями, содержащими один или оба гена в антисмысловой ориентации по отношению к нормальным генам, будет блокировать синтез соответствующих ферментов. Матричная РНК, транскрибированная с трансформирующей последовательности, будет связываться с мРНК, транскрибированной с нормальной последовательности, инактивируя таким образом нормальный транскрипт и предотвращая синтез фермента.

Для выделения последовательностей ДНК, определяющих экспрессию АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы в растениях кофе, проводили скрининг библиотеки кДНК, полученной из ткани растений кофе, с помощью синтетических ДНК-зондов, содержащих предполагаемые последовательности нуклеотидов. Эти предполагаемые последовательности были основаны на изучении нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих соответствующие ферменты других климактерических растений.

В настоящем изобретении для трансформации зародышей растений кофе использовали кДНК, соответствующую гену, кодирующему АЦК-синтазу или АЦК-оксидазу. В качестве трансформирующего вектора использовали плазмиду рВ1-121. Последовательности, соответствующие ДНК, определяющей экспрессию АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы, вводили в плазмиду в инвертированной ориентации рядом с 358 промотором вируса мозаики цветной капусты. РНК, транскрибированная с таких последовательностей, будет комплементарна мРНК, кодирующей аминокислотную последовательность соответствующего фермента. Целые конструкции амплифицировали в бактериальных клетках. Клетки-хозяева разрушали и амплифицированный вектор присоединяли к коллоидным частицам золота. Частицы золота с присоединенными векторами вводили в ткань растений кофе путем обстрела клеток этими частицами с большой скоростью, как описано в патенте И8 5107065. Успешно трансформированные молодые растения идентифицировали по их устойчивости к антибиотикам. Трансформированные растения не продуцировали АЦК-синтазу или АЦК-оксидазу, в зависимости от гена, который использовали для трансфомации растений. Созревание трансформированных растений индуцировали введением экзогенного этилена.

Пример 1. Выделение кДНК АЦК-синтазы плодов кофе.

Для выделения последовательностей генов АЦК-синтазы, влияющих на процесс созревания растений кофе, готовили библиотеку кДНК из смеси тканей перикарпия и мезокарпия плодов кофе на различных стадиях спелости. Проводили скрининг этой библиотеки с использованием ПЦР-продукта, синтезированного из однонитевой кДНК, полученной из той же мРНК, используемой для конструирования библиотеки и вырожденных олигонуклеотидных праймеров, соответствующих усредненным последовательностям, полученным из генов АЦК-синтазы других организмов. Этот пример, главным образом, включает выделение мРНК, конструирование библиотеки кДНК и последовательные стадии, включающие клонирование подходящей кДНК.

а) Выделение мРНК.

Общую РНК выделяли из 66 г ткани перикарпия и мезокарпия плодов кофе вида С. агаЫса Ь. су Сиа1ета1ап на различных стадиях спелости по методу Леви (Ъеу1 е1 а1., Ной 8с1епсе 27 (12): 1316-1318 (1992)). Замороженную ткань перикарпия и мезокарпия измельчали на бытовой кофемолке (8аЙоп тобе1 СС-5; 8аЙоп Махат Ноике^агек Сгоир, Μί. Ргокрес!, 1Ь) в течение 2 мин с небольшим кусочком сухого льда. К измельченной ткани плодов добавляли 200 мкл 200 мМ трис-НС1 (трис-гидроксиметиламинометана гидрохлорид) (рН 8,5), 1,5% додецилсульфата натрия (ДСН), 300 мМ ЫС1, 10 мМ двунатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (№1₂ЭДТА). 1,5% дезоксихолата натрия (в:об), 1,5% Ыошбе! Р-40 (81дта Сйет1са1 Со.) (об:об), 0,5 мМ тиомочевины, 1 мМ ауринтрикарбоновой кислоты, 10 мМ дитиотреитола (ДТТ), 75 мМ β-меркаптоэтанола, 2% поливинилпирролидона (РУР) и 2% поливинилполипирролидона (РУРР) и гомогенизировали в гомогенизаторе для тканей Ро1у1гоп (Тектаг, Сшсшиай, ОН). После 2 мин гомогенизации добавляли 200 мкл хлороформа и гомогенизацию продолжали еще 3 мин. Гомогенат переносили в центрифужные пробирки на 250 мкл (№11депе) и центрифугировали 15 мин при 2500 х д. Верхнюю водную фазу отбирали и смешивали с 12 мкл 5 М ЫаС1, разделяли на две равные части, которые помещали в две центрифужные пробирки, и в каждую пробирку прибавляли по 150 мкл этанола. Смесь выдерживали в течение ночи при -20°С. РНК собирали пу

Ί тем центрифугирования при 4000 х д в течение 15 мин при 4°С, затем растворяли в 50 мкл буфера ТЕ1 (50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 10 мМ №ьЭДТА) и осветляли путем центрифугирования при 12000 х д в течение 10 мин при 4°С. Супернатант переносили в новую центрифужную пробирку и добавляли 3 мкл 5 М ИаС1 и 30 мкл изопропанола. Содержимое перемешивали и выдерживали в течение ночи при -20°С. РНК собирали путем центрифугирования при 14000 х д в течение 10 мин, затем промывали 20 мкл 70% ледяного этанола и снова центрифугировали, как описано выше. После 10 мин сушки под вакуумом РНК ресуспендировали в 50 мкл буфера ТЕ1 и добавляли 10 мкл 12 М ЫС1. Раствор инкубировали при 4°С в течение 48 ч, РНК собирали путем центрифугирования при 14000 х д в течение 10 мин и ресуспендировали в 30 мкл буфера ТЕ1. После добавления 15 мкл 5 М ацетата калия РНК инкубировали в течение ночи при 0°С, снова центрифугировали при 14000 х д в течение 10 мин и суспендировали в 50 мкл буфера ТЕ1. Добавляли 3 мкл 5 М №1С1 и 110 мкл 95% этанола и инкубировали в течение ночи при -20°С. РНК центрифугировали при 14000 х д в течение 10 мин, промывали 20 мкл 70% ледяного этанола и центрифугировали, как описано выше, сушили 10 мин под вакуумом и ресуспендировали в 600 мкл буфера ТЕ1. РНК переносили в микроцентрифужную пробирку, центрифугировали при 14000 об./мин в течение 30 мин при 4°С, после чего 300 мкл суспензии переносили в две новых микроцентрифужных пробирки. Исходную пробирку дополнительно промывали 300 мкл буфера ТЕ1. В каждую из трех пробирок добавляли 18 мкл 5 М ИаС1 и 636 мкл 100% этанола. После перемешивания переворачиванием, пробирки выдерживали в течение ночи при -20°С. РНК собирали путем центрифугирования при 14000 об./мин в течение 30 мин и промывали 1 мкл 70% ледяного этанола. После центрифугирования и сушки, как описано выше, РНК ресуспендировали в 400 мкл стерильной воды. В результате получили 1,04 мг общей РНК.

Матричную РНК (полиА⁺-РНК) выделяли с использованием набора Ро1уАТ1гае1^К тКИА 18о1а1юи 8у51ет IV (Рготеда Согрогайои, Маркой, \У1). Два выделения проводили следующим образом. Для каждого выделения 0,48 мг общей РНК растворяли в 800 мкл воды, очищенной от РНКазы. После нагревания в течение 10 мин при 65°С добавляли 3 мкл 50 пкмоль/мл биотинилированного олиго-(бТ) и 20,7 мкл 20 х 88С (1 х 88С содержит 150 мМ ИаС1 и 15 мМ цитрата натрия), смесь медленно охлаждали до комнатной температуры в течение приблизительно 30 мин. Аликвоту парамагнитных частиц со стрептавидином (из Ро1уЛТ1гаек^К тКИА 1ко1айои 8у51ет IV) промывали трижды в 0,5 х 88С и суспендировали в 0,1 мл 0,5 х 88С. Раствор РНК, содержащий биотинилированный олиго (бТ), добавляли к промытым парамагнитным частицам со стрептавидином. После 10 мин инкубации при комнатной температуре парамагнитные частицы, содержащие захваченные мРНК, осаждали на стенках пробирки, используя магнит.

Супернатант удаляли, частицы промывали 4 раза по 0,3 мл 0,1 х 88С. РНК отделяли от биотинилированных олиго-(6Т) путем суспендирования в 200 мкл воды, очищенной от РНКазы. Дополнительную элюцию осуществляли путем последовательного добавления в каждую из двух пробирок 150 мкл воды. Промывки (550 мкл) объединяли и центрифугировали при 14000 об./мин в течение 30 мин при 4°С в микроцентрифуге. Супернатант разделяли на две микроцентрифужные пробирки и после добавления 1/10 объема 3 М ИаС1 и 600 мкл этанола, выделяли мРНК путем инкубации в течение ночи при -20°С и последующего центрифугирования, как описано выше. мРНК промывали 1 раз 1 мл ледяного 70% этанола, сушили и ресуспендировали в 20 мкл стерильной воды. Один мкл полученного раствора добавляли к 1 мл воды и проводили спектральный анализ в диапазоне от 230 нм до 330 нм на спектрофотометре 81ιίιηη6ζιι υν 160И. Из 1,04 мг общей РНК было получено около 6 мкг мРНК.

Ь) Конструирование библиотеки кДНК.

Первая и вторая нити кДНК были синтезированы с использованием набора для синтеза ΖΑΡ-εΌΝΑ (81га1адеие, Ьа 1о11а, СА). 6 мкг мРНК инкубировали в 20 мкл воды при 65°С в течение 5 мин. Добавляли 2 мкл 100 мМ метилртути и продолжали инкубировать при комнатной температуре 10 мин. Добавляли 4 мкл 700 мМ β-меркаптоэтанола и инкубировали еще 5 мин. К денатурированной мРНК добавляли 5 мкл 10 х буфера для синтеза первой нити (из набора), 5 мкл 100 мМ ДТТ, 3 мкл смеси нуклеотидов (по 10 мМ 6АТР, бСТР, 6ТТР и 5метил-бСТР), 2 мкл 1,4 мкг/мкл линкерпраймера

5'-еА<ЗАСАСА6АСАОАеАеАОААСТАСТСТСОАС I I I I I I I I I I I I I I I I I I -3' (5Е0. Ю ΝΟ, 1) мкл блокирующей РНКазы и 5 мкл воды. Смесь инкубировали при комнатной температуре 10 мин для отжига праймера с мРНК, затем добавляли 3 мкл 20 ед./мкл обратной транскриптазы Μ-ΜΗΕν. 5 мкл этой реакционной смеси переносили в пробирку, содержащую 0,5 мкл (0,625 пкмоль) 800 Ки/ммоль [а-³²Р]-бАТР. Обе реакции инкубировали при 37°С 1 ч. Реакционную смесь с радиоактивной меткой замораживали при -20°С для дальнейшего анализа в геле. К 45 мкл основной реакционной смеси добавляли 40 мкл буфера для синтеза второй нити, 15 мкл 100 мМ ДТТ, 6 мкл смеси нуклеотидов (по 10 мМ бАТР, бСТР, бТТР и 26 мМ бСТР), 268,3 мкл воды и 2 мкл (2,5 пкмоль) 800 Ки/ммоль [а-³²Р]-бАТР. После перемешивания к реакционной смеси добавляли 4,5 мкл 1 ед./мкл

РНКазы Н и 19,2 мкл 5,2 ед./мкл ДНКполимеразы I Е. со11 и инкубировали при 16°С в течение 2,5 ч. Затем реакционную смесь экстрагировали 400 мкл смеси фенол:хлороформ (1:1). Фазы разделяли центрифугированием в микроцентрифуге в течение 5 мин, водную фазу удаляли и снова экстрагировали хлороформом. Водную фазу получали центрифугированием, как описано выше.

Двунитевую кДНК осаждали добавлением 33,3 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 867 мкп 100% этанола и инкубировали при -20°С в течение ночи. кДНК выделяли центрифугированием при 14000 х д в микроцентрифуге при 4°С в течение 60 мин. кДНК промывали 1 мл 80% этанола и выделяли центрифугированием при 14000 х д в микроцентрифуге при комнатной температуре, сушили под вакуумом и растворяли в 45 мкл воды. 3 мкл ресуспендированной двунитевой кДНК отбирали и хранили при -20°С для дальнейшего анализа с помощью гель-электрофореза.

К оставшимся 42 мкл двунитевой кДНК добавляли 5 мкл 10 х буфера Кленова (буфер #3; из набора 81га1адепе), 2,5 мкл 2,5 мМ смеси нуклеотидов (6СТР, 6ΆΤΡ, 6СТР, 6ТТР) и 0,5 мкл 5 ед./мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. со11. После 30 мин инкубации при 37°С добавляли 50 мкл воды, реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол:хлороформ (1:1) и затем хлороформом, как описано выше. После добавления 7 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 226 мкл 100% этанола двунитевую кДНК с тупыми концами инкубировали на льду 30 мин и центрифугировали при 14000 х д при 4°С в течение 60 мин в микроцентрифуге. кДНК промывали 300 мкл 70% этанола, центрифугировали и сушили, как описано выше. К высушенной кДНК добавляли 7 мкл 0,4 мкг/мкл ЕсоК1-линкеров. Структура ЕсоР1линкеров следующая:

5’-ААТТССССАС6А6-3' (ЗЕО. Ю ΝΟ. 2) 3’-6СС6ТеСТС-5'

После перемешивания к ресуспендированной кДНК добавляли 1 мкл 10 х лигирующего буфера, 1 мл 10 мМ АТР и 1 мкл 4 \Уек5 ед./мкл ДНК-лигазы фага Т4, смесь инкубировали в течение ночи при 8°С. Лигазу инактивировали нагреванием при 70°С в течение 30 мин. 5'концы ЕсоВЕлинкеров, присоединенных к кДНК, фосфорилировали с помощью полинуклеотидкиназы. К реакционной смеси добавляли 1 мкл 10 х буфера #3 из набора для синтеза ΖΑΡ<ΌΝΑ (81га1адепе, Ьа 1о11а, СА), 2 мкл 10 мМ АТР, 6 мкл воды и 1 мкл 10 ед./мкл полинуклеотидкиназы фага Т4. Через 30 мин при 37°С реакцию останавливали нагреванием до 70°С в течение 30 мин. Хйо1-Липкие концы получали на конце кДНК, соответствующем 3'концу мРНК, путем расщепления Хпо1-сайта в линкер-праймере. 28 мкл Хпо1-буфера и 3 мкл ед./мл рестриктазы Х1ю1 смешивали с кДНК, и смесь инкубировали при 37°С 1,5 ч.

кДНК с липкими концами, образованными рестриктазой ЕсоР1 на 5'-конце, и с липкими концами, образованными рестриктазой Хпо1 на 3'-конце (относительно природной мРНК), фракционировали по размеру на вращающейся колонке 8ерйасгу1 8-400, как описано ниже. К кДНК добавляли 5 мкл 10 х буфера 8ТЕ (100 мМ трис (рН 7,0), 5 мМ ЭДТА и 100 мМ Ν;·ιί.Ί). и кДНК наносили на верхнюю часть 1 мл шприца, содержащего 8ерйасгу1 8-400 (Рйагтас1а Вю1ес11, Ркса1атау, N1). Микроцентрифужную пробирку на 500 мкл помещали в основании шприца, шприц помещали в центрифужную пробирку и центрифугировали 2 мин при 400 х д. Затем добавляли 60 мкл 1 х 8ТЕ буфера в верхнюю часть шприца, новую микроцентрифужную пробирку помещали в основании шприца и снова центрифугировали, как описано выше. Эту процедуру повторяли, пока не было собрано 6 фракций. Приблизительно 10% каждой фракции анализировали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле для определения распределения кДНК по размерам в каждой фракции. Остаток каждой фракции экстрагировали равным объемом смеси фенол: хлороформ, затем хлороформом, как описано выше, и осаждали путем добавления 2 объемов 100% этанола. После инкубации в течение ночи при -20°С выделяли кДНК центрифугированием при 14 000 об./мин при 4°С в течение 60 мин в микроцентрифуге. Каждую фракцию кДНК промывали 200 нл 80% этанола и сушили, как описано выше. Затем фракцию 1 кДНК ресуспендировали в 3 мкл стерильной воды, а фракцию 2 кДНК ресуспендировали в 10,5 мкл стерильной воды. Отбирали по 0,5 мкл каждой из двух фракций для определения количества ДНК с помощью бромистого этидия. Фракции 1 и 2, содержащие самые большие молекулы кДНК, объединяли. 12,5 мл объединенных фракций содержали около 100 нг кДНК. Эту фракцию уменьшали до 2,5 мкл в 8рее!-Уас и хранили на льду. Фракцию 3 кДНК ресуспендировали в 10,5 мкл стерильной воды и хранили при -20°С для дальнейшего использования.

100 нг кДНК из фракций 1 и 2 лигировали в 1 мкг υπί-Ζ3ρ'™ (81га1адепе, Ьа 1о11а, СА), вектор лямбдаΖАР, который был расщеплен рестриктазами ЕсоК1 и Х1юЕ Фракции 1 и 2 кДНК (2,5 мкл) добавляли к 0,5 мкл 10 х лигирующего буфера, 0,5 мкл 10 мМ АТР, 1 мкл 1 мкг/мкл вектора Иш^ар ХВ и 0,5 мкл 4 \Уек5 ед./мкл ДНК-лигазы фага Т4. Реакционную смесь инкубировали при 8°С в течение 44 ч. Затем аликвоту 1 мкл реакционной смеси прибавляли к одной аликвоте экстракта Егеехе-Т11а\у из набора 01дараск II Со1! для упаковки бактериофага λ (81га1адепе, Ьа 1о11а, СА). Добавляли 15 мкл озвученного экстракта и осторожно перемешивали. Упаковку проводили при комнатной темпе11 ратуре. Через 2 ч к каждой реакционной смеси прибавляли по 500 мкл буфера 8М и 20 мкл хлороформа, дебрис удаляли коротким центрифугированием в микроцентрифуге. Упакованные фаги переносили в новую микроцентрифужную пробирку. Прибавляли 10 мкл хлороформа и хранили при 4°С до использования. Титр этой первичной библиотеки показал присутствие 0,7 х 10⁶ рекомбинантных колоний.

с) Амплификация первичной библиотеки.

600 мкл клеток Е. сой ХЬ1-В1ие МКЕ' (81га1адепе, Ьа 1о11а, СА), выращенных до плотности ΘΌ₆₀₀=0,5, и 32,5 мкл исходного раствора первичной библиотеки добавляли в каждую из 16 пробирок. После инкубации при 37°С в течение 15 мин в каждую пробирку прибавляли по 6 мл фракции агара, разогретой до 48°С (5 г/л №С1. 2 г/л Мд8О₄-7Н₂О, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л ΝΖ амина (рН 7,5) и 0,7% агарозы), содержимое высевали на чашки размером 100 х 15 мм со средой ΝΖΥ (5 г/л №С1, 2 г/л Мд8О₄-7Н₂О, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л ΝΖ амина (рН 7,5), 15 г/л агара фирмы Э|Гсо). Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С, затем в каждую чашку наслаивали по 10 мл буфера 8М и инкубировали при 4°С еще 8 ч при осторожном перемешивании. Затем стерильной пипеткой отбирали 8М буфер и хранили в стерильной центрифужной пробирке на 250 мл. Каждую чашку промывали 10 мл свежего 8М буфера, который затем собирали и объединяли с ранее отобранным 8М буфером. К раствору фага добавляли хлороформ до конечной концентрации 5%, и полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин и затем центрифугировали 10 мин при 2000 х д для удаления клеточного дебриса. Супернатант переносили в стерильную полипропиленовую пробирку и добавляли хлороформ до конечной концентрации 0,3%. Амплифицированную библиотеку хранили при 4°С.

ά) Высев амплифицированной библиотеки для скрининга определенных генов.

Титр аплифицированной библиотеки определяли, как описано выше. Приблизительно 50000 рекомбинантных колоний прибавляли к 600 мкл клеток Е. сой ХЬ1-В1ие МНЕ', выращенных, как описано выше. После 15 мин инкубации при 37°С добавляли 6,5 мл фракции агара, разогретой до 48°С, и высевали на чашки размером 100 х 15 мм со средой ΝΖΥ. Получали 4 чашки, содержащие суммарно 200000 рекомбинантных колоний, которые инкубировали в течение ночи при 37°С. Затем чашки охлаждали 4 ч при 4°С и использовали для приготовления образцов колоний, как описано ниже.

е) Идентификация и конструирование олигонуклеотидов, гомологичных генам АЦКсинтазы растений кофе.

В предыдущих исследованиях, описанных в заявке на патент И8 08/485107, которые приводятся здесь в качестве ссылки, авторы данного изобретения идентифицировали нуклеотидные последовательности, общие для АЦКсинтаз ряда растений, которые упоминаются здесь как усредненные последовательности. На основании этих исследований авторы разработали набор из трех (3) полностью вырожденных праймеров для ПЦР-амплификации участков первой нити кДНК растений кофе, соответствующей этим усредненным последовательностям. Последовательности этих праймеров следующие:

АС8167: б'-СССААОСТТССНТСКТАКТСУТОКАА-З' (ЗЕО. Ю ΝΟ. 3)

АС5289: 5'-ΤΤΥΟΑΚ<3ΑΥΤΑΥΟΑΥβΟΗΥΤ-3' (ЗЕО. Ю ΝΟ. 4) АС3885: 5'-ССНС30АКМССУА\«НТСТТТ-3' (ЗЕО. ΙΟ ΝΟ. 5)

Г) Реакция с обратной транскриптазой для получения первой нити кДНК растений кофе.

Реакцию с обратной транскриптазой для получения первой нити кДНК проводили в объеме 20 мкл, используя набор СепеАшр ΚΝΑ РСК. Соге Кй (Регкш Е1тег, Еоз1ег Сйу, СА). Сначала 0,9 мкг мРНК плодов кофе в 3 мкл воды смешивали с 1 мкл 50 мкМ произвольного гексамера и 6 мкл стерильной воды в микроцентрифужной пробирке и инкубировали 5 мин при 65°С. Затем смесь оставляли на 2 мин при комнатной температуре и отделяли водный слой с помощью короткого центрифугирования. К этой смеси добавляли 2 мкл ПЦР-буфера II (из указанного набора), 4 мкл 25 мМ МдС1₂, 2 мкл 10 мМ смеси нуклеотидов άΝΤΡ, 1 мкл ΚΝΑδίη (20 ед./мкл) и 1 мкл (50 ед./мкл) обратной транскриптазы. Реакцию инкубировали при 42°С в течение 1 ч, после чего обратную транскриптазу инактивировали нагреванием на водяной бане при 95°С в течение 5 мин.

д) Полимеразная цепная реакция для амплификации гена АЦК-синтазы растений кофе.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (8а1к1 е1. а1., 1988) проводили с использованием набора СепеАтр Кй (см. выше) в объеме 50 мкл, содержащем 10 мкл смеси первых нитей кДНК, 4 мкл ПЦР-буфера II, 1 мкл 25 мМ МдС1₂, 2,5 мкл 20 мкМ праймера АС5167 (8Ер. ГО. NО. 3), 2,5 мкл 20 мкМ праймера АС5885 (8Ер. ГО. NО. 5), 29,5 мкл стерильной воды и 0,5 мкл Тад ДНК-полимеразы (5 ед./мкл). Условия для ПЦР были следующие: 35 циклов при 94°С - 1 мин, 44°С -1 мин, 72°С - 2 мин. Продукт ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле из 1,5% агарозы 8еаР1ас.|ие (ЕМС ВюРгобис15, Коск1апб, МЕ), в качестве маркеров размеров использовали ДНК фага фХ174, расщепленную рестриктазой НаеШ (Рготеда Согрогайоп, МаФзоп, XVI). Был получен единственный ПЦР-продукт, имеющий около 650 пар оснований.

11) Амплификация ПЦР-продукта с помощью различных праймеров.

Участок геля с ПЦР-продуктом, имеющим 650 пар оснований, вырезали и помещали в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл. После добавления 200 мкл стерильной воды этот фрагмент нагревали при 90°С 5 мин, охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали 5 мин при 14000 об./мин в микроцентрифуге. Супернатант, содержащий амплифицированную ДНК, отбирали и помещали в новую стерильную микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл. Реакцию ПЦР проводили в объеме 25 мкл с использованием 0,4 мкл ранее амплифицированной ДНК в качестве матрицы, 2,5 мкл 10 х буфера ПЦР (10 мМ трис-НС1, рН 9,0, 0,1% тритон Х-100), 2 мкл 25 мМ МдС1₂, 5 мкл 1 мМ άΝΤΡδ, 1 мкл 20 мкМ праймера АС8289 (8Ер. ΙΌ. ΝΟ. 5), 1 мкл 20 мкМ праймера АС8885 (табл. 2), 12,8 мкл воды и 0,3 мкл Тад ДНК-полимеразы (5 ед./мкл) (Рготеда СогрогаНои, Мабщоп, XVI). Условия для ПЦР были следующие: 35 циклов при 94°С - 1 мин, 45°С - 1 мин, 72°С - 2 мин. 5 мкл этой реакционной смеси анализировали в 1,5% агарозном геле, как описано выше. Был получен единственный продукт, имеющий приблизительно 603 п.о. К оставшемуся количеству реакционной смеси добавляли 80 мкл стерильной воды, 10 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 220 мкл 100% этанола. После инкубации в течение ночи при 20°С выделяли ДНК путем центрифугирования при 4°С в течение 30 мин при 14000 об./мин. ДНК промывали 400 мкл 75% ледяного этанола и ресуспендировали в 25 мкл стерильной воды. Путем анализа на пластинах с бромистым этидием опредилили, что концентрация ДНК составляет 10 нг/мкл.

ί) Введение метки в ДНК АЦК-синтазы плодов кофе.

С использованием ДНК АЦК-синтазы, полученной с помощью ПЦР, и набора Рпте-адепе Κίΐ (Рготеда Согрогабои, МабЕоп, VI) синтезировали произвольно примированный зонд. 2,5 мкл ДНК (25 нг) добавляли к 27,5 мкл стерильной воды и денатурировали кипячением в течение 5 мин. Затем добавляли 10 мкл 5 х буфера для мечения, 2 мкл немеченных 6ΝΤΡ (по 20 мкМ бСТР, бСТР, бТТР), 2 мкл 1 мг/мл ацетилированного БСА (бычьего сывороточного альбумина), 1 мкл 5 ед./мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е.еой и 5 мкл (50 мкКи) [α³²Р] бАТР (3000 Ки/ммоль) (Пироп1-№№) до получения конечного объема 50 мкл. После 1 ч инкубации при комнатной температуре реакцию прекращали добавлением 2 мкл 0,5 М №ьЭДТА и кипятили 2 мин.

_)) Скрининг амплифицированной библиотеки с помощью зонда, специфичного к АЦКсинтазе.

Приготавливали четыре чашки 150 х 15 мм со средой ΝΖΥ, каждая из которых содержала

50000 рекомбинантных клонов. Четыре нейлоновых мембраны Мадпа по 132 мм (М1егоп 8ерага1юи5, 1пеогрога1еб, Vе8ΐЬо^оидй, МА) увлажняли, помещая их на хроматографическую бумагу, насыщенную 5 х 88С приблизительно на 10 с. Затем мембраны помещали на чашки с рекомбинантными колониями на 5 мин, вынимали и инкубировали их 2 мин на хроматографической бумаге, насыщенной раствором, содержащим 0,5 М ΝιΟΗ и 1,5 М №С1, помещая вверх сторону, содержащую фаги. Затем мембраны нейтрализовали, помещая их на 5 мин на хроматографическую бумагу, насыщенную 0,5 М трис-НС1 (рН 8,0) и 1,5 М №С1. После короткой обработки (20 с) на хроматографической бумаге, насыщенной 2 х 88С буфером, содержащим 0,2 М трис-НС1 (рН 7,5), фильтры сушили. После 1 ч сушки на воздухе ДНК пришивали к мембранам путем обработки ультрафиолетовым облучением 12000 мкДж с длиной волны 260 нм с помощью установки ИУ 81га1а11пкег 1800 (81га1адеие, Ьа 1о11а, СА).

Четыре мембраны предварительно гибридизовали при 65°С в течение 2 ч в 100 мл 6 х 88РЕ буфера (52,2 г/л №С1, 8,3 г/л

NаН₂ΡΟ₄·Н₂Ο, 2,2 г/л №₂ЭДТА, [рН 7,4]), 5 х растворе Дэнхардта (1 г/л фиколла, 1 г/л поливинилпирролидона, 1 г/л БСА (фракция V)), 0,5% ДСН и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы сельди в термостате для гибридизации НуЬпб Магк II (№Шопа1 БаЬпе! Сотрапу, VообЬпбде, N1) в пробирках НВ-ОУ-ВЬ.

Гибридизацию проводили при 65°С в течение 12 ч в 10 мл 6 х 88РЕ буфера, содержащего 0,5% ДСН, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы сельди и 52 мкл произвольно примированного зонда, описанного выше. После окончания гибридизации раствор для гибридизации удаляли, а мембраны быстро промывали 100 мл 2 х 88С буфера, содержащего 0,5% ДСН, при 65°С. Затем мембраны еще 30 мин промывали тем же количеством свежего буфера при 65°С. После этого мембраны промывали еще 2 раза по 30 мин при 65°С 100 мл 0,2 х 88С буфера, содержащего 0,5% ДСН, упаковывали в целлофановый пакет и экспонировали 24 ч при -70°С с предварительно облученной рентгеновской пленкой Риц КХ_ОСи. Было получено 10 положительных клонов. Участки на исходных чашках, соответствующие идентифицированным колониям, удаляли и помещали в 1 мл буфера 8М, содержащего 20 мкл хлороформа. Из полученных десяти клонов пять снова высевали на чашки с низкой плотностью и подвергали повторному скринингу, как описано выше, для получения индивидуальных колоний.

к) Характеристика кДНК-клонов АЦКсинтазы плодов кофе.

Размеры предполагаемых кДНК-клонов АЦК-синтазы растений кофе определяли с помощью ПЦР с использованием праймеров, гомологичных участкам Т3 и Т7 промоторов, присутствующих в клонирующем векторе и примы15 кающих к сайту вставки кДНК. Последовательности этих праймеров следующие:

ТЗ: 5’-ТААТАС6АСТСАСТАТА66С-3’ (8ЕО. Ю N0. 6)

Т7: 5’-ААТТААСССТСАСТАААССС-3’ (ЗЕО. Ю N0. 7)

Условия для проведения ПЦР были аналогичны описанным выше, за исключением того, что температурный цикл продолжался 1 мин при 95°С, 1 мин при 50°С и 2 мин при 72°С. Анализ в агарозном геле проводили, как описано выше.

Три самых больших клона были получены в виде фагмид путем эксцизии ίη νίνο. 200 мкл исходного раствора фага из индивидуальной колонии смешивали с 200 мкл клеток Е. сой ХЕ1-В1ие МКР', выращенных до плотности Θϋ₆₀₀=1,0. К этой смеси прибавляли 1 мкл фагахелпера ΕχΆδδίδί (81га1адепе Ба 1о11а, СА) (>1х10⁶ р!и/мкл), и пробирки инкубировали при 37°С 15 мин. Затем добавляли 3 мл стерильной среды БВ и инкубировали еще 3 ч при 37°С при перемешивании. После нагревания в течение 20 мин при 70°С и центрифугирования при 1000 х д в течение 15 мин, 1 мл супернатанта, содержащего вырезанную фагмиду рВ1иезспрр упакованную в виде нитевидных фаговых частиц, переносили в стерильную микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и хранили при 4°С. Фагмиды выделяли добавлением 25 мкл этого исходного раствора к 200 мкл клеток Е. сой 8о1аг (81га1адепе Ба 1о11а, СА), выращенных до плотности Θϋ₆₀₀=1. После инкубации при 37°С в течение 15 мин 200 мкл клеточной суспензии высевали на чашки размером 100 х 15 мм со средой ΝΖΥ, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С. Индивидуальные колонии переносили в 10 мл среды БВ, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, и выращивали в течение ночи в инкубаторе при 37°С при встряхивании. Клетки концентрировали в стерильной микроцентрифужной пробирке на 1,5 мл путем повторного центрифугирования, фагмидную ДНК очищали с использованием мининабора ΟΙΑ6ΡΝ для очистки плазмид. Бактериальные осадки промывали водой и ресуспендировали в 0,3 мл буфера Р1. Далее, добавляли 0,3 мл щелочного буфера Р2 для лизиса, осторожно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре менее 5 мин. Затем добавляли 0,3 мл охлажденного буфера Р3, перемешивали переворачиванием пробирок 6 раз, экстракты инкубировали на льду 10 мин и центрифугировали 15 мин при 14000 об./мин в микроцентрифуге. Супернатанты переносили на колонки ^IАСΕN-йр 20, предварительно уравновешенные 1 мл буфера ^^Τ. Экстракты пропускали через колонки самотеком. После прекращения протока, колонки промывали 4 раза 1 мл буфера ^С. ДНК элюировали, промывая колонки ^IАСΕN-йр 20 0,8 мл буфера рр, элюат собирали в микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл. ДНК осаждали добавлением 0,7 объемов (560 мкл) изопропанола. Пробирки немедленно центрифугировали при 14000 об./мин в течение 30 мин и супернатант осторожно удаляли. Осадки, содержащие ДНК, промывали 1 мл 70% ледяного этанола, центрифугировали, как описано выше, и сушили на воздухе 5 мин. ДНК ресуспендировали в 50 мкл стерильной воды. Концентрация ДНК после одного выделения плазмиды, по данным флюорометрического анализа, составляла 0,1 мкг/мкл.

Секвенирование ДНК проводили путем смешивания 8 мкл фагмидной ДНК (0,8 мкг) с 4 мкл Т3 либо Т7 праймеров (0,8 пкмоль/мкл). Автоматическое секвенирование ДНК этих образцов проводили в Биотехнологическом центре Гавайского университета. Было получено приблизительно 350 п.о. последовательности как от 5'-, так и от 3'-конца кДНК. Новые секвенирующие праймеры были синтезированы на основе последовательностей, примыкающих к концу предыдущих последовательностей, и использовались таким же образом для завершения последовательности обеих нитей кДНК. Полноразмерная последовательность кДНК АЦКсинтазы, экспрессирующейся в плодах кофе, представлена на фиг. 1. Выведенная аминокислотная последовательность АЦК-синтазы, экспрессирующейся в плодах кофе, представлена на фиг. 2.

Последовательность клонированной кДНК АЦК-синтазы плодов кофе и выведенную последовательность белка сравнивали с генами других АЦК-синтаз, имеющимися в СепЬапк. Выделенная из плодов кофе кДНК показала от 68,3 до 58,1% идентичности другим АЦКсинтазам из СепЬапк. А последовательность белка, выведенная на основе этой кДНК, показала от 67,9 до 50,5% идентичности другим АЦК-синтазам. Однако эта кДНК представляет собой уникальную последовательность, так как не существует других последовательностей, имеющих более 1500 п.о., которые показали бы идентичность более 68,3%.

Пример 2. Выделение АЦК-оксидазы плодов кофе.

а) Синтез олигонуклеотидных праймеров, специфичных к АЦК-оксидазе.

Выделение общей РНК, мРНК из плодов кофе и синтез специфической кДНК проводили, как описано выше.

С помощью программы Рйеир (Сепейсз Сошри1ег Сгоир, Мабщоп, ΑΙ) производили выравнивание 12 последовательностей АЦКоксидазы, полученных из СепЬапк. Было обнаружено, что участок длиной приблизительно 1000 п.о. от стартового кодона для трансляции является консервативным, и был синтезирован вырожденный олигонуклеотидный праймер б’-ТСАТЮСККСКАКЮСТТС-З’ (ЗЕО. Ю ΝΟ. 8), соответствующий этому участку. Инозин (Ι) помещали в позиции, демонстрирующие отсутствие консервативности последовательности, поскольку любой из нуклеотидов А, Т, О или С мог занимать данную позицию. Позиции, проявляющие двоякую неопределенность, готовили со смешанными остатками (Т/О или А/О). Также получали второй праймер, гомологичный участку кДНК АЦК-оксидазы, экспрессирующейся в плодах папайи, которую предварительно клонировали в лаборатории авторов данного изобретения, и расположенному на расстоянии приблизительно 372 п.о. от стартового кодона для трансляции:

5’-САСАСТСТ6СА6АС(ЗСТСАС-3’ (ЗЕО. Ю N0. 9)

Эти два праймера использовали в ПЦР для амплификации АЦК-оксидазы, экспрессирующейся в плодах кофе. Реакционная смесь для ПЦР содержала 0,2 мкл (10 нг) фракции 3 кДНК (описанной в примере 1), 5 мкл 10 х буфера ПЦР, 3 мкл 25 мМ МдС1₂, по 1 мкл каждого из четырех 10 мМ 6ΝΤΡ, 1 мкл 20 мкМ раствора каждого праймера, 0,3 мкл Тад ДНКполимеразы (Рготеда Согрогайоп, Мабщоп, ^1) и 38,5 мкл воды. Условия ПЦР: 35 циклов по 1 мин при 94°С, 1 мин при 50°С, 1 мин при 72°С. Инкубацию в течение 5 мин при 72°С проводили после последнего цикла. Аликвоту 20 мкл продукта реакции анализировали в 1,5% агарозном геле, как описано выше, и обнаружили, что продукт содержит около 800 пар оснований. Участок с ДНК вырезали из геля и смешивали с 200 мкл стерильной воды в микроцентрифужной пробирке на 1,5 мл. После кипячения в течение 5 мин, 2 мкл смеси использовали в качестве матрицы в 50 мкл реакционной смеси для ПЦР, как описано выше, с применением тех же праймеров. Гель-электрофорез, проведенный, как описано выше, с использованием 20 мкл реакционной смеси ПЦР, показал присутствие единственного продукта длиной 800 п.о. К оставшимся 30 мкл реакционной смеси ПЦР добавляли 20 мкл хлороформа и 100 мкл воды. Содержимое перемешивали и центрифугировали 2 мин при 14000 об./мин в микроцентрифуге. Верхний водный слой, содержащий ДНК, переносили в чистую микроцентрифужную пробирку. Часть этой ДНК радиоактивно метили с помощью произвольно примированного синтеза, как описано выше.

b) Скрининг амплифицированной библиотеки с помощью произвольно примированного зонда.

Амплифицированную кДНК плодов кофе, описанную в примере 1, использовали для приготовления четырех чашек размером 150 х 10 мм со средой ΝΖΥ, как описано выше. Прегибридизацию, гибридизацию и выделение клонов проводили, как описано выше, за исключением того, что в качестве зонда использовали последовательность АЦК-оксидазы, полученную в результате ПЦР.

c) Характеристика кДНК-клонов АЦКоксидазы плодов кофе.

Размеры кДНК-клонов АЦК-оксидазы, экспрессирующейся в плодах кофе, определяли с помощью ПЦР с использованием праймеров, гомологичных Т3 и Т7 промоторам, как описано в примере 1.

Была получена последовательность самого большего кДНК-клона АЦК-оксидазы плодов кофе, как описано в примере 1. Ее сравнивали с генами других АЦК-оксидаз, имеющимися в ОепЪапк. Последовательность АЦК-оксидазы плодов кофе представлена на фиг. 3. Выведенная аминокислотная последовательность этого белка представлена на фиг. 4. Было определено, что указанная кДНК кодирует АЦК-оксидазу, поскольку она была идентична на 50,4-82,5% нуклеотидным последовательностям других АЦК-синтаз из ОепЪапк. Выведенная последовательность белка также показала идентичность от 32,5 до 86,5% другим АЦК-оксидазам из ОепЪапк.

Описанные примеры служат только для иллюстрации, и их не следует рассматривать в качестве примеров, ограничивающих объем охраны изобретения, который обозначен в формуле изобретения, приведенной далее.

Список последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ:

(ί) Заявитель: Стайлз, Джон И.

Мойсьяди, Истефо Неупейн, Каби Р.

(ίί) Название изобретения: Очищенные белки, последовательности рекомбинантной ДНК и способы управления созреванием кофе (ϋί) Количество последовательностей: 13 (ίν) Адрес для переписки:

(A) Адресат: Джонс, Дэй, Ривис и Пог (B) Улица: Норт Пойнт, 901 Лэйксайд Авеню (C) Город: Кливлэнд (О) Штат: Огайо (Е) Страна: США (Г) Индекс: 44114 (ί) Компьютерная форма:

(A) Тип: 3,5 дюймовая дискета, 1.44 МБ (B) Компьютер: ΙΒΜ РС совместимый (C) Оперативная система: Μδ-ϋΟ5, 5.1 (ϋ) Программное обеспечение: \Л/огСРег1ес1 для ννίηάον/5, 6.1 (ί) Данные по заявке:

(A) Номер заявки: 08/695 412 (B) Дата подачи: 12.08.1996 (С) Класс: 435 (νίϊ) Приоритет:

(A) Номер заявки: и808/486 107 (B) Дата подачи: 07.06.1995 (νίϊϊ) Поверенный:

(A) Имя: Гриффит, Кальвин П.

(B) Рег. №: 34 831 (С) Телефон: 265036600003 (ϊχ) Контактные телефоны:

(A) Телефон: (216) 5867050 (B) Факс: (216) 5790212 (1) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 8ЕО Ю N0:1:

(ί) Характеристика последовательности:

(А) Длина: 15 аминокислотных остатков (B) Тип: аминокислотная (C) Концы цепочки: Ν/Α (ϋ) Топология: линейная (й)Тип молекулы:

(А) Пептид (1х)Особенности:

(A) Название/обозначение: Фрагмент А (B) Положение: 17...1480 (χί) Описание последовательности 8Е0 ГО N0:1:

Не Авп Туг А1а Зег <31у А1а Зег <31у Не Ьеи Авр С1п Хаа С1у 15 10 15 (2) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 8Е0 Ю N0:2:

(ί) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 14 аминокислотных остатков (B) Тип: аминокислотная (β) Топология: линейная (й) Тип молекулы: Пептид (χί) Описание последовательности 8ЕО Ю N0:2:

Не Авп Туг А1а 8ег <3!у А1а 8ег О1у Не Ьеи Азр С1п ТЛг

5 10 14 (2) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЗЕО ГО N0:3:

(ί) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 20 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочка: одиночная (β) Топология: линейная (ϊ) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание: Праймер (ν) Тип фрагмента: внутренний фрагмент (ϊχ) Особенности:

(А) Другая информация: N - инозин (χί) Описание последовательности 8ЕО ГО N0:3:

ΑΤΝΑΑΥΤΑΥ6 ΟΝΑΟΥΟΟΝΟΟ 20 (2) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЗЕО ГО N0:4:

(ί) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 20 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочка: одиночная (ϋ) Топология: линейная («) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Праймер (ν) Тип фрагмента: внутренний фрагмент (1Х)Особенности:

(А) Другая информация: N - инозин (хПОписание последовательности ЗЕО ГО N0:4:

ΑΤΝΑΑΥΤΑΥ6 ΟΝΑΟΥΟΟΝΟΟ 20 (2) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЗЕО ГО N0:5:

(ί) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 20 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочка: одиночная (ϋ) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Праймер (ν) Тип фрагмента: внутренний фрагмент (ϊχ) Особенности:

(А) Другая информация: N - инозин (χί) Описание последовательности ЗЕО ГО N0:5:

ΟΟΝΟΟΑΟΝΟΟ ΝΥΤΑΥΤΤΝΑΤ 20 (2) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЗЕО ГО N0:6:

(ΐ) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 20 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочка: одиночная (О) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: ДНК (геномная) (А) Праймер (ν) Тип фрагмента: внутренний фрагмент

Особенности:

(А) Другая информация: N - инозин

Описание последовательности ЗЕО Ю N0:6:

ΟΟΝΟΟΥΟΤΥΟ ΟΥΤΑΥΤΤΝΑΤ 20 (2) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЗЕО 10 N0:7:

(ΐ) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 14 аминокислотных остатков (B) Тип: аминокислотная (C) Цепочка: одиночная (О) Топология: линейная (ϊ) Тип молекулы: Пептид (ν) Тип фрагмента: внутренний фрагмент (ϊ) Особенности:

(О) Другая информация: Хаа означает либо ТЬг, либо Азр (χί) Описание последовательности ЗЕО Ю N0:7:

ΟΙη Туг Уа1 Рго Суз Туг РЬе ХааРЬе Не Азр Азр ΟΙη Азр ю 14 (2) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЗЕО Ю N0:8:

(ϊ) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 20 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочка: одиночная (О) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Праймер (ν) Тип фрагмента: внутренний фрагмент (ίχ) Особенности:

(А) Другая информация: N - инозин (χί) Описание последовательности ЗЕО Ю N0:8:

ΟΑννΤΑΤΟΤΝΟ ΟΝΤΟΤΤΑΤΤΤ 20 (2) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЗЕО Ю N0:9:

(ί) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 20 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочка: одиночная (ϋ) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Праймер (ν) Тип фрагмента: внутренний фрагмент (ίχ) Особенности:

(ϋ) Другая информация: N - инозин (χί) Описание последовательности ЗЕО Ю N0:9:

ААУЛАУ/САНО ΟΝΑΟΥ/ΤΑΤΤΟ 20 (2) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЗЕО Ю N0:10:

(ί) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 488 аминокислотных остатков (B) Тип: аминокислотная (C) Цепочка: единичная (ϋ) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: Белок (ίχ) Особенности:

(A) Название/обозначение: СОЗ (B) Положение: 178...1653 (χί) Описание последовательности ЗЕО Ю N0:10:

МеС С1и РЬе 5ег Ьеи Ьуз Азп С1и С1п С1п СХп Ьеи Ьеи Зег Ьуз
1 5		10	. 15
МеС АХа ТЫ Азп Азр 20	(31у	Нхз	СХу	С1и	Азп 25	зег	Рго Туг РЬе Азр 30
СХу Тгр Ьуз А1а Туг 35	Азр	Зет	Азр	Рго	Тут 40	Нхз	Рго ТЫ Агд Азп 45
Рго Азп С1у Уа1 Не 50	СХп	мес	С1у	Ьеи	А1а 55	С1и	Азп СХп Ьеи Суз 60
РЬе Азр Ьеи 11е С1и 65	С1и	Тгр	Уа1	Ьеи	Азп 70	Азп	Рго С1и АХа Зег 75
11е Суз ТЬг А1а С1и 80	С1у	АХа	Азп	Ьуз	РЬе 85	МеС	С1и Уа1 АХа Не
Туг СХп Азр Тут ΗΪ3 95	С1у	Ьеи	Рго	о Хи	РЬе 100	Агд	Азп АХа УаХ А1а 105
Ахд РЬе МеС С1и Ьуз но	ν»1	Агд	С1у	Авр	Агд 115	Уа1	Ьуз РЬе Азр Рго 120
Азп Агд 1Хе Уа1 МеС 125	Зег	СХу	СХу	АХа	ТЫ 130	СХу	АХа Нхз СХи ТЫ 135
Ьеи А1а РЬе Суз Ьеи 140	АХа	Азр	Рго	С1и	Азо 145	АХа	РЬе Ьеи УаХ Рго 150
ТЬг Рго Тут Тут Рго 155	СХу	РЬе	Азр	Агд	Азр 160	Ьеи	Агд Тгр Агд ТЬг 165
С1у МеС С1п Ьеи Ьеи 170	Рго	11е	УаХ	суз	Агд 175	Зег	Зег Азп Азр РЬе * 180
Ьуз УаХ ТЬг Ьуз СХи 185	Зег	МеС	СХи	А1а	АХа 190	Тут	СХп Ьуз АХа СХп 195
С1и А1а Азп Не Агд 200	УаХ	Ьуз	СХу	РЬе	Ьеи 205	Ьеи	Азп Азп Рго Зег 210
Азп Рго Ьеи С1у ТЬг 215	УаХ	Ьеи	Азр	Агд	СХи 220	ТЬг.	Ьеи Не Азр Не 225
УаХ ТЬг РЬе 1Хе Азп 230	Азр	Ьуз	Азп	Не	Н13 235	Ьеи	Не Суз Азр С1и 240
11е Туг Зег А1а ТЬг 245	УаХ	РЬе	Зег	СХп	Рго 250	СХи	РЬе Не Зег Не 255
Зег СХи Не Не С1и 260	ΗΪ3	Азр	УаХ	С1л	Суз 265	Азп	Агд Азр Ьеи 11е 270
Нхз Ьеи УаХ Тут Зет 275	Ьеи	Зег	Ьуз	АЗр	Ьеи 280	СХу	РЬе Рго СХу РЬе 285
Агд УаХ С1у Не Ьеи 290	Туг	Зег	Тут	Азп	Азр 295	АХа	УаХ Уа1 Зег Суз 300
АХа Агд Ьуз Мес Зет 305	Зет	РЬе	СХу	Ьеи	νβΐ 310	Зет	ТЬг СХп ТЬг СХп 315
Нхз Ьеи Не А1а Зег 320	МеС	Ьеи	Зег	Азр	СХи 325	АХа	РЬе МеС Азр Ьуз 330
Не Не Зет ТЬг Зет 335	Зет	СХи	Агд	Ьеи	АХа 340	АХа	Агд Нхз СХу Ьеи 345
РЬе ТЬг Агд С1у Ьеи 350	А1а	СХп	УаХ	СХу	Не 355	СХу	ТЫ Ьеи Ьуз 5ег 360
Зег А1а СХу Ьеи Туг 355	РЬе	Тгр	МеС	Азр	Ьеи 370	Агд	Агд Ьеи Ьеи Агд 375
СХи Зег ТЬг РЬе СХи 380	АХа	СХи	Мес	СХи	Ьеи 385	Тгр	Агд Не Не Не 390
Нхз С1и Уа1 Ьуз Ьеи 395	Азл	УаХ	Зег	Рго	С1у 400	Ьеи	Зет РЬе Нхз Суз 405

Зег

С1и

РГО

С1у

Тгр 410

РЬе

Агд Уа1 Суз

РЬе 415

А1а Азп

Мее Агр

Азп 420

СХи

Зег

УаХ

Агд

Уа1

А1а

Ьеи

Агд

Агд

Не

ΗΪ3

Ьуз

РЬе

УаХ

Ьеи

425

430

435

УаХ

СХп

С1у

Ьуз

АХа

ТЫ

С1и

Рго

ТЫ

ТЫ

Рго

Ьуз

Зег

Агд

суз

440

445

450

С1у

Зег

Зег

Ьуз

Ьеи

С1П

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

РЬе

Агд

Агд

Ьеи

Азр

455

460

465

С1и

Агд

УаХ

Мее

С1у

Зег

Нхз

Мее

Мее

Зег

Рго

ΗΪ5

Зег

Рго

Мее

470

475

480

АХа

Зег

Рго

Ьеи

Уа1

Агд

АХа

ты

485 (2) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 8ЕО Ю ΝΟ: 11:

(ί) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 2040 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочка: единичная (О) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: «ДНК, комплиментарная мРНК (ίχ) Особенности:

(A) Название/обозначение: СОВ (B) Положение: 178...1653 (χί) Описание последовательности ВЕО Ю ΝΟ: 11

СТААТСТСТТ СТААААТСАА ССАТТСТСТТ САТТСТТСАС ТТСАСААССС	50
САСТССАТТС ТТСАТТСТТТ СТТСАТАТАТ АСССАТТТТТ ТТСАТТСТТТ	100
СТТСАТАТАТ АСССАТТТТТ ТТСАТТСТТТ СТТСАТТСАТ ТСТСТССАСА	150
АСТТССТТСА СТТТТСТТСА АААТТСААСС ААААСА АТС САС ТТС АСТ	198

Мее СХи РЬе Зег

СТТ ТСТ ССС АСС

ТСС ААТ САТ ТТТ ААС СТС АСТ ААА САА ТСС

744 786

Уа1 Суз Агд 175 АТС САА ССТ

Зег ССТ АХа 190

Зег ТАТ Тут

Азп САС СХп

Азр РЬе Ьуз УаХ ТЫ Ьуз

С1и 185 АТС Не

Зег АСА Агд 200

ААА Ьуз

180

ССТ АХа

САА САА ССС ААС

Мее

С1и

А1а

СХп 195

С1и

АХа

Азп

СТА

ААС

ССС

ТТС

СТС

ТТА

ААТ

ААТ

ССА

ТСА

ААТ

ССА

ТТС

ССА

828

Уа1

ьуз

СХу

РЬе

Ьеи 205

Ьеи

Азп

Азп

Рго

Зег 210

Азп

Рго

Ьеи

СХу

АСТ

СТТ

СТТ

САС

АСС

САА

АСТ

ТТС

АТТ

САТ

АТА

СТС

АСА

ТТС

870

ТЫ 215

УаХ

Ьеи

Азр

Агд

С1и 220

ТЫ

Ьеи

Не

Азр

Не 225

УаХ

ТЫ

РЬе

АТС

ААТ

САС

ААА

ААТ

АТС

САС

ТТС

АТТ

ТСТ

САТ

САС

АТА

ТАТ

912

Не

Азп 230

Азр

Ьуз

Азп

Не

Нхз 235

Ьеи

Не

суз

Азр

СХи 240

Не

Тут

ТСТ

ССС

АСС

СТС

ТТС

АСС

САС

ССС

САА

ТТС

АТС

АСС

АТС

ТСТ

954

Зег

АХа

ТЫ 245

Уа1

РЬе

Зег

СХп

Рго 250

СХи

РЬе

Не

Зег

Не 255

Зег

САА

АТА

АТТ

САС

САТ

САТ

СТТ

САА

ТСС

ААС

ССТ

САТ

СТС

АТА

996

СХи

11е

Не

СХи 260

Нхз

Азр

УаХ

С1П

суз 265

Азп

Агд

Азр

Ьеи

Не 270

САТ

СТТ

СТС

ТАТ

АСС

СТС

ТСС

ААС

САС

ТТС

ССС

ТТС

ССТ

ССА

1038

Нхз

Ьеи

УаХ

Туг

Зег 275

Ьеи

Зег

Ьуз

Азр

Ьеи 280

СХу

РЬе

Рго

С1у

ТТС

АСА

СТТ

ССС

АТТ

ТТС

ТАТ

ТСА

ТАТ

ААТ

САС

ССТ

СТТ

СТС

1080

РЬе 285

Агд

УаХ

С1у

Не

Ьеи 290

Тут

Зег

Тут

Азп

Азр 295

А1а

УаХ

УаХ

АСС

ТСТ

ССТ

АСА

ААА

АТС

ТСС

АСТ

ТТС

ССС

СТТ

СТТ

ТСА

АСА

1122

Зег

суз 300

А1а

Агд

Ьуз

Мее

Зег 305

Зег

РЬе

С1у

Ьеи

УаХ 310

Зег

ТЫ

САА

АСТ

САС

САТ

СТС

АТТ

ССА

ТСА

АТС

ТТА

ТСС

САС

САА

ССА

1164

СХп

ТЫ

СХп 315

ΗΪ3

Ьеи

11е

АХа

зег 320

Мее

Ьеи

Зег

Азр

схи 325

АХа

ТТТ АТС САС ААА АТС АТТ ТСС АСС АСС ТСА САС АСА ТТА ССТ 1206

ТТС ААА ААС САА САА САА САА СТС ТТС ТСС ААС АТС ССА АСС 240

Ьеи Ьуз Азп С1и СХп СХп С1п Ьеи Ьеи Зег Ьуз Мес АХа ты

10 15

ААС САТ ССА

САТ ΗΪ3

ССС САА ААС ТСС ССТ ТАТ ТТТ

САТ ССТ ТСС

252

АЗП Азр

С1у

С1у СХи Азп 25

Зег

Рго

Туг

РЬе

Азп 30

С1у

Тгр

20

ААС

ССА

ТАТ

САТ

АСТ

САТ

ССТ

•ТАС

САТ

ССС

АСС

АСА

ААТ

ССТ

324

Ьуз

АХа

Туг

Азр

Зег

Азр

Рго

Туг

ΗΪ3

Рго

ты

Агд

Азп

Рго

35

40

45

ААТ

ССТ

СТТ

АТА

САС

АТС

ССА

СТС

ССА

САА

ААТ

САС

ТТА

ТСС

366

Азп

СХу

УаХ

Не

СХП

Мее

СХу

Ьеи

А1а

СХи

Азп

С1п

Ьеи

Суз

50

55

60

ТТТ

САТ

ТТС

АТС

САС

САА

ТСС

СТТ

СТС

ААС

ААТ

ССА

САС

ССТ

408

РЬе

Азр

Ьеи

Не

СХи

СХи

Тгр

УаХ

Ьеи

Азп

Азп

Рго

СХи

А1а

65

70

ТСС

АТТ

ТСС

АСА

ССА

САА

ССА

ссс

ААС

ААА

ТТС

АТС

САА

СТТ

450

Зег

ХХе

Суз

ТЫ

А1а

С1и

С1у

АХа

Азп

Ьуз

РЬе

Мее

СХи

УаХ

75

80

85

ССТ

АТС

ТАТ

САА

САТ

ТАТ

САТ

ССС

ТТС

ССА

САС

ТТС

АСА

ААТ

492

АХа

Не

Тут

С1п

Азр

Туг

НХЗ

СХу

Ьеи

РГО

СХи

РЬе

Агд

Азп

90

95

100

ССТ

СТА

ССА

АСС

ТТС

АТС

САС

ААС

СТС

АСА

СОТ

САС

АСА

СТС

534

АХа

Уа1

АХа

Агд

РЬе

Мее

СХи

Ьуз

Уа1

Агд

С1у

Азр

Агд

Уа1

105

110

115

ААС

ТТС

САТ

ССС

ААС

ССС

АТТ

СТС

АТС

АСТ

ССТ

ССС

ССА

АСС

576

Ьуз

РЬе

Азр

Рго

А5П

Агд

ХХе

Уа1

Мее

Зег

СХу

С1у

АХа

ТЫ

120

125

13 0

ССА

ССТ

САТ

САА

АСТ

СТС

ССС

ТТС

ТСТ

ТТА

ССТ

САС

ССТ

САА

618

С1у

АХа

Ηίδ

СХи

ТЫ

Ьеи

АХа

РЬе

Суз

Ьеи

АХа

Азр

Рго

С Хи

135

140

САТ

ссс

ТТТ

ТТС

СТА

ССС

АСА

ССА

ТАТ

ТАТ

ССА

ССА

ТТТ

САТ

660

Азп

АХа

РЬе

Ьеи

УаХ

Рго

ТЫ

Рго

туг

Туг

Рго

С1у

РЬе

Азр

145

150

155

азе

САТ

ТТС

АСС

ТСС

ССА

АСА

ссс

АТС

САА

СТТ

СТТ

ССА

АТТ

702

Агд

Азр

Ьеи

Агд

Тгр

Агд

ТЫ

СХу

Мее

С1п

Ьеи

Ьеи

Рго

Не

160

165

170

РЬе Мее Азр Ьуз Не 11е Зег ТЫ Зег Зег С1и Агд Ьеи А1а

330 335 340

ССА АСС САТ СОТ СТТ ТТС АСА АСА ССА СТТ ССТ САА СТА ССС 1248

АХа Агд Нхз СХу Ьеи РЬе ТЫ Агд С1у Ьеи АХа СХп Уа1 С1у

345 350

АТТ 11е 355

САС Азр

АТС Мее ссс СХу

АСС ТЫ

ТТА Ьеи

ААА Ьуз

АСС Зег 360

АСТ ССС Зег АХа ссс С1у

СТТ Ьеи

ТТС РЬе

ТСС АТС Тгр Мее

1290

ТТА Ьеи 370

САА

С1и

АСС Агд

АСА Агд

СТС Ьеи

СТС

Ьеи

АСС САС

Агд С1и

375

ТСС

Зег

АСА ТЫ

ТТТ РЬе

САС С Хи

380

ССА САА

А1а СХи

1332

СТТ Ьеи 385 тсс тгр

АСС Агд

АТС ХХе

АТА АТА ХХе Не

390

САТ ΗΪ3

САА СХи

СТС УаХ

ААС Ьуз

СТС ААТ Ьеи Азп 395

1374

1416

405

410

400

1458

СТТ ν31

425

ССТ А1а

СТС Ьеи

АСА Агд

АСА Агд

АТС ХХе 430

САС ААА

Н13 Ьуз

ТТТ РЬе

СТС V»!

СТТ Ьеи

435

СТТ УаХ

САС ССС СХП СХу

1500

ААС Ьуз

ССА АХа 440

АСА ТЫ

САС

С1и

ССА РГО

АСА ТЫ

АСТ ССА ТЫ РГО

445

ААС Ьуз

АСТ

Зег

ССС Агд

ТСС суз 450

ССА АСС

С1у Зег

1542

АСС Зег

АСС Агд

ААА

Ьуз

СТС Уа1

СТТ

Ьеи

455

АТС Мее

САА С1П

ССА

С1у

470

СТС Ьеи

ТСС зег

АСС Зег

САТ НХЗ

ТТА ТСТ Ьеи Зег

460

АТС АТС Мее Мее

ТТС РЬе

ТСС Зег 475

ССС Агд

АСА Агд

ТТС Ьеи

САС САА Азр СХи 465

1584

ССТ Рго

САС НХз

ТСС Зег

ССС АТС

Рго Мее

480

1626

ССТ ТСА ССТ ТТС СТТ ССС ССТ АСА ТАААТСАТТТ СТТСАТСАСА 1670 АХа Зег Рго Ьеи Уа1 Агд А1а ТЫ

485

ТСАТАТАССА	ААСАТТССТС	АСТАААТАСТ	ССАААСССТТ	ТСТССАТААС	1720
ТСААААСАСА	СТТСТТСАТТ	СТТТССТСТА	ТСАТАСАААС	АССТТАСАСС	1770
САТТТТТТСС	ССАТСТСАТС	ССТССАААТТ	ССАТСАААТС	СТТ7ТАТТАТ	1820
ТСТСАТАТТС	АТТТСТСТАС	сттссттттс	СТТССССТТС	АСТССТССТТ	1870
сттттттстт	ТСТТТСТТАТ	ТАТТТТСТТС	САСТТСАТСА	СТТАААССАА	1920
ССААССТСАА	ТТСТТГСААС	СТАТТАСТАА	САСАТСАТТТ	ТСТААТАССА	1970
АТАСТТТСАС	САТТСТСААА	ТСАААСТТТА	ТСАТТТТТСС	АТСАТТТТАА	2020
АААААААААА	АААААААААА				2040

(2) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 8Е0 Ю N0:12:

(ί) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 318 аминокислотных остатков (B) Тип: аминокислотная (C) Цепочка: единичная (ϋ) Топология: линейная (и) Тип молекулы: Белок (ΐχ) Особенности:

(A) Название/обозначение: С08 (B) Положение: 46...1003 (χί) Описание последовательности ЗЕО Ю N0:12:

Мей

АХа

ТЫ

РЬе

Рго

Ьеи

Не

Азр

Мей

С1и

Ьуз

Ьеи

Азр

С1у

СХи

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

А1а

ТЫ

Мей

С1у

УаХ

Не

Ьуз

Азр

АХа

суз

СХи

бет

20

25

30

Тгр

С1у

РЬе

РЬе

С1и

УаХ

Ьеи

АЗП

ΗΪ3

СХу

Не

Зег

Азп

СХи

Ьеи

35

40

45

Мей

Азр

ТЫ

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

ТЫ

Ьуз

СХи

Нхз

Тут

Ьуз

Ьуз

Суз

Мей

С1и

50

55 С1и 70

Зет

Ьуз

СХи

Ьеи

60 С1и 75

Ьеи Ьуз РЬе 65

Ьуз СХи

Мей

УаХ

АХа

УаХ

С1п

ТЬг

СХи 80

1Хе

Азп

Азр

Ьеи

Азо 85

Тгр

СХи

Зег

ТЫ

РЬе 90

РЬе

Ьеи

Агд

Нхз

Ьеи 95

Рго

УаХ

Зег

Азп

Не 100

Зег

СХи

УаХ

Рго

Азр 105

Ьеи

Азр

Азр

СХи

Тут 110

Агд

Ьуз

ν»χ

Мей

Ьуз 115

С1и

РЬе

АХа

Ьеи

СХп 120

Ьеи

СХи

Ьуз

Ьеи

АХа 125

СХи

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Азр 13*0

Ьеи

Ьеи

суз

СХи

Азп 135

Ьеи

С1у

Ьеи

СХи

Ьуз 140

СХу

Туг

Ьеи

Ьуз

Ьуз 145

АХа

РЬе

Туг

С1у

ТЫ 150

Ьуз

СХу

Рго

ТЫ

РЬе 155

СХу

ТЫ

ьуз

УаХ

Зет 160

Азп

Тут

Рго

Рго

Суз 165

Рго

Агд

РГО

СХи

Ьеи 170

ХХе

ьуз

сху

Ьеи

Агд 175

АХа

Нхз

ТЫ

Азр

АХа 180

С Ху

С1у

Не

Не

Ьеи 185

Ьеи

РЬе

С1п

Азр

Азр 190

Ьуз

Уа1

Зег

СХу

Ьеи 195

С1п

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Азр 200

СХу

С1и

Тгр

УаХ

Азр 205

Уа1

Рго

Рго

Мей

Агд 210

Нхз

Зег

Не

Уа1

Не 215

АЗП

1Хе

С1у

Азр

С1П 220

Ьеи

С1и

Уа1

Не

ТЬг 225

Азп

С1у

Ьуз

Туг

Ьуз 230

Зег

УаХ

Мей

Нхз

Агд 235

Уа1

Не

АХа

СХп

Рго 240

Азр

СХу

Азп

Агд

Мей 245

Зет

Ьеи

АХа

Зег

РЬе 250

Тут

Азп

Рго

С1у

Зег 255

Азр

А1а

Уа1

Не

Туг 260

Рго

АХа

РГО

А1а

Ьеи 265

Уа1

СХи

Ьуз

СХи

АХа 270

СХи

Азр

Ьуз

С1п

Не 275

туг

Рго

Ьуз

РЬе

Уа1 280

РЬе

СХи

Азр

Туг

Мей 285

Ьуз

Ьеи

Тут

АХа

С1у 290

Ьеи

Ьуз

РЬе

С1п

А1а 295

Ьуз

С1и

Рго

Агд

РЬе 300

СХи

АХа

Мей

Ьуз

АХа 305

УаХ

СХи

Зег

ты

Уа! 310

Азп

Ьеи

СХу

Рго

ХХе 315

АХа ТЫ УаХ

318 ^ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЗЕО Ю N0:13:

(ί) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 1320 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочка: единичная (О)Топология: линейная (Н) Тип молекулы:

(А) ДНК комплиментарная мРНК (ίχ) Особенности:

(A) Название/обозначение: СОЗ (B) Положение: 46...1003 (хООписание последовательности ЗЕО Ю N0:13:

ТСТАААССАА ССАТААССАС ААССАААСАС АААСТАСААА САСАС АТС 48

Мей

ССТ АСА А1а ТЫ

ТТС ссс РЬе Рго 5

СТА АТС

САС Азр

АТС САС ААС СТТ САС ССТ САА

90

Ьеи

Не

Мей СХи 10

Ьуз

Ьеи

Азр С1у

С1и 15

САС

АСС

ССТ

ССС

АСТ

АТС

ССА

СТС

АТА

ААА

САТ

ССТ

ТСТ

САА

132

С1и

Агд

А1а

А1а

ТЬг

Мей

С1у

УаХ

Не

Ьуз

Азр

А1а

Суз

С1и

20

25

АСС

ТСС

ССС

ТТС

ТТТ

САС

СТС

ТТС

ААТ

САТ

ССС

АТА

ТСТ

ААТ

174

Зет

Тгр

С1у

РЬе

РЬе

СХи

УаХ

Ьеи

Азп

Нхз

С1у

Не

Зег

Азп

30

35

40

САС

СТС

АТС

САС

АСА

СТС

САС

АСС

СТА

АСА

ААС

САС

САТ

ТАС

216

СХи

Ьеи

Мей

Азр

ТЫ

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

ТЫ

Ьуз

С1и

Нхз

Туг

45

50

55

ААС

ААА

ТСТ

АТС

САА

СТА

ААС

ТТС

ААС

САА

АТС

СТС

САС

АСС

258

Ьуз

Ьуз

Суз

Мей

СХи

Ьеи

Ьуз

РЬе

Ьуз

С1и

Мей

Уа1

СХи

Зег

60

65

70

ААС

САА

ТТС

САА

ССТ

СТТ

САС

АСТ

САС

АТС

ААТ

САТ

ТТС

САС

300

Ьуз

СХи

Ьеи

С1и

АХа

Уа1

СХп

ТЫ

СХи

Не

Азп

Азр

Ьеи

Азр

75

80

85

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (24)

1. Очищенная аминоциклопропан-1карбоксилат(АЦК)-синтаза из растения кофе Сойеа агаЫса с выведенной аминокислотной последовательностью 8Е0. ГО N0.10, приведенной на фиг. 1.

2. Выделенная последовательность кДНК, определяющая экспрессию АЦК-синтазы по п.1, имеющая нуклеотидную последовательность 8Е0. ГО NО.11, приведенную на фиг. 2, а также варианты указанной кДНК, полученные на основе вырожденности генетического кода.

3. Очищенная аминоциклопропан-1карбоксилат(АЦК)-оксидаза из растения кофе Сойеа агаЫса с выведенной аминокислотной последовательностью 8Е0. ГО N0.12, приведенной на фиг. 3.

4. Выделенная последовательность кДНК, определяющая экспрессию АЦК-оксидазы по п.3, имеющая нуклеотидную последовательность 8Е0. ГО N0.13, приведенную на фиг. 4, а также варианты указанной кДНК, полученные на основе вырожденности генетического кода.

5. Трансформирующий вектор, включающий промотор, обеспечивающий процесс транскрипции в клетках растения кофе, связанный с последовательностью кДНК по п.2.

6. Трансформирующий вектор по п.5, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в смысловой ориентации.

7. Трансформирующий вектор по п.5, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в антисмысловой ориентации.

8. Трансформирующий вектор, включающий промотор, обеспечивающий процесс транскрипции в клетках растения кофе, связанный с последовательностью кДНК по п.4.

9. Трансформирующий вектор по п.8, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в смысловой ориентации.

10. Трансформирующий вектор по п.8, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в антисмысловой ориентации.

11. Трансформированная клетка растения кофе, полученная путем введения в нее трансформирующего вектора по любому из пп.5-7.

12. Трансформированная клетка растения кофе по п.11, где вектор представляет собой вектор по п.6.

13. Трансформированная клетка растения кофе по п.11, где вектор представляет собой вектор по п.7.

14. Трансформированная клетка растения кофе, полученная путем введения в нее трансформирующего вектора по любому из пп.8-10.

15. Трансформированная клетка растения кофе по п.11, где вектор представляет собой вектор по п.9.

16. Трансформированная клетка растения кофе по п.11, где вектор представляет собой вектор по п.10.

17. Клетка растения кофе, трансформированная последовательностью кДНК по п.2 и последовательностью кДНК по п.4 путем введения трансформирующего вектора по п.5 и трансформирующего вектора по п.8 в клетку растения кофе.

18. Трансформированная клетка растения кофе по п.17, где по меньшей мере одна из последовательностей кДНК связана с промотором транскрипции в антисмысловой ориентации.

19. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.2, включающий получение трансформирующего вектора по п.7, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в антисмысловой ориентации; и введение полученного трансформирующего вектора в клетку растения кофе.

20. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.4, включающий получение трансформирующего вектора по п.10, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в антисмысловой ориентации; и введение полученного трансформирующего вектора в клетку растения кофе.

21. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.2 и последовательностью кДНК по п.4, включающий получение первого трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.5, получение второго трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.8, причем по крайней мере одна из вышеуказанных кДНК связана со своим промотором транскрипции в антисмысловой ориентации; и введение каждого из трансформирующих векторов в клетку растения кофе.

22. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.2, включающий получение трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.6, и введение полученного трансформирующего вектора в клетку растения кофе.

23. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.4, включающий получение трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.9, и введение полученного трансформирующего вектора в клетку растения кофе.

24. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.2 и последовательностью кДНК по п.4, включающий получение первого трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.5, получение второго трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.8, причем по крайней мере одна из вышеуказанных кДНК связана со своим промотором транскрипции в смысловой ориентации; и введение каждого из трансформирующих векторов в клетку растения кофе.