CN1227606A - 经纯化的蛋白质、重组dna序列以及控制咖啡植物成熟的方法 - Google Patents

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Abstract

纯化的蛋白质，编码表达该蛋白质的DNA序列，以及重组DNA分子，包括已被该分子转化以用来转化咖啡植物从而抑制乙烯合成中所必需的诸酶的表达的宿主。该DNA序列和重组DNA分子的特征在于它们编码表达ACC合成酶或ACC氧化酶，这两种酶是咖啡植物内乙烯生物合成途径中的要素。用含有编码表达相应mRNA的ACC合成酶和/或ACC氧化酶DNA序列的载体转化咖啡植物，所述mRNA与编码表达ACC合成酶和/或ACC氧化酶的mRNA反义。所产生的反义mRNA结合到XMI mRNA上，由此使编码乙烯合成途径中的一种或多种酶的mRNA失活。所述DNA序列也可用来通过共抑制而阻遏ACC合成酶或ACC氧化酶的合成。每一事件的结果均是被转化植物不能合成乙烯，尽管未影响到这些植物的代谢的其它方面。

Description

经纯化的蛋白质、重组DNA序列以及控制咖啡植物成熟的方法
发明领域
本发明涉及经纯化的蛋白质、重组DNA序列、转化了该序列的宿主，以及控制咖啡植物成熟的方法。更具体地说，本发明涉及纯化蛋白质和可用于抑制咖啡果特异性1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶和ACC氧化酶基因表达的重组DNA序列。本申请进一步涉及用这样的序列转化从而不能合成出成熟所需的乙烯的咖啡植物。将外源乙烯施用于按照本发明转化的植物有可能同步化和控制咖啡植物的果实成熟。
发明背景
咖啡是从咖啡属植物，通常是小果咖啡种的烘焙咖啡豆中制备的。咖啡豆是咖啡植物的种子，可通过加工果实，最理想的是成熟果实而得到，成熟咖啡果由于其高质量而可获得最好的价格。过去是通过手工挑选出高质量的“gourmet”咖啡。由于咖啡树上的果实不是同时成熟，因而同一棵树上既有成熟咖啡果，也有未成熟的咖啡果；所以这一项工作是必需的。过去，这并不是一个严重问题，因为大多数咖啡生长于世界上劳动力比较丰富且不昂贵的地区。然而，近年来，缺乏大量且廉价的劳动力已是造成咖啡产业中生产能力萎缩的一个主要因素。为了提高生产能力，世界上有些地区，比如最大的咖啡生产国巴西，已开始求助于露天采摘收获，其中工人们从一根树枝上快速摘下所有果实，不管它已经成熟还是尚未成熟。这提高了收获的速度，但由于好大一部分果实尚未成熟(青果)，因而降低了最高质量咖啡豆的产率。
此外，果实成熟的不同步大大限制了机械性收获的有效性。从树上采摘成熟果实(浆果)所需的力与采摘青果的力相似，因此，机械收获员们不能很好区分青果和浆果，大量的未成熟果实就与成熟果实一道被摘了下来。这大大降低了成熟果实的产率，并限制了生产能力。若能控制咖啡果的成熟，使所有果实均在同一时间成熟，则手工收获的采摘方法和机械性收获的效率均可大大提高，并且，已收获的果实中更高质量级别的果实百分比将更高一些。这可提高咖啡生产的效益。
与其它许多果实一样[Yang和Hoffman，植物生理学年鉴，35:155(1984)]，植物产生的乙烯在咖啡果成熟的最后阶段具有重要的作用。一旦咖啡果发育到成熟的某一阶段，则通过外源施用乙烯可诱导它们成熟[Crisosto,C.H.,P.C.Tausend,M.A.Nagao,L.H.Fuchigami和T.H.H.Chen,J.Haw.Pac.Agri.3:13-17(1991)]。这证实了乙烯在咖啡果成熟最后阶段的重要性。
乙烯是从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)经两步反应而合成的。第一步是通过ACC合成酶从SAM合成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)。在大多数植物中，这正是限速步骤。最后一步是被ACC氧化酶催化的由ACC转变为乙烯(Yang和Hoffman，出处同前)。通过化学(如银离子或二氧化碳)或生物技术途径[Oeller等，科学，254:437(1991)]抑制乙烯生物合成可抑制成熟的最后阶段。通过加入乙烯，这一抑制可被逆转。
相应地，控制咖啡植物成熟的一个策略是阻止乙烯生物合成途径中特异性酶的合成。本发明一个实施方案涉及咖啡植物的基因改变以消除ACC合成酶的合成；在另一个实施方案中，ACC氧化酶的合成受到了抑制。在优选的实施方案中，抑制这两种酶之一或二者的合成是通过用一种DNA序列转化咖啡植物而达到的，所说的DNA序列可编码一种信使RNA(mRNA)的转录，该mRNA是编码表达待抑制其合成的酶类的mRNA之反义物。参见Oeller等，科学，254:437(1991)，其中报道了利用相似策略控制西红柿的成熟。
已有一些人利用重组DNA技术分离了一些ACC合成酶和ACC氧化酶基因。然而，迄今仍未鉴定出咖啡内ACC合成酶和ACC氧化酶基因或测出它们的序列。
发明简述
已纯化的蛋白质，编码其表达的DNA序列，重组DNA分子，包括用其转化的宿主，用来转化咖啡植物以抑制乙烯合成所需酶类的表达。所说的DNA序列和重组DNA分子的特征在于它们编码表达ACC合成酶或ACC氧化酶，这两种酶是咖啡植物中乙烯生物合成途径的要素。
用含有ACC合成酶和/或ACC氧化酶DNA序列的载体转化咖啡植物，所说的DNA序列在载体中的插入方式使其编码表达的相应RNA是ACC合成酶和/或ACC氧化酶的mRNA的反义物。所产生的反义RNA与mRNA结合，从而使编码乙烯合成途径中一种或多种酶的mRNA失活。也可利用所叙述的DNA序列通过共抑制(co-suppression)阻断ACC合成酶或ACC氧化酶的合成。任一事件的结果均是已转化的植物不能合成乙烯，尽管它们的代谢的其它方面并未受到影响。
通过外源乙烯可调控转化植物的成熟。将乙烯施用于整株植物，则整株植物立刻成熟，由此使咖啡的机械性收获更加高产。
附图简述
图1是编码咖啡果表达的ACC合成酶的cDNA的整个序列。
图2是由图1所示cDNA序列推断出的咖啡果ACC合成酶的氨基酸序列。
图3是编码咖啡果表达的ACC氧化酶的cDNA的序列。
图4是由图3所示的cDNA序列推断出的咖啡果ACC氧化酶的氨基酸序列。
发明详述
为便于更完全理解此处所记载的发明，我们给出了下面更详细的说明书。在说明书中，使用了下列术语：
核苷酸--DNA或RNA的单体单位，由一个糖基元(戊糖)、一个磷酸盐以及一个氮杂环碱所组成。所说的碱通过糖苷碳(戊糖的1′碳)而与所说的糖基元连接，碱和糖的那种组合就被称为核苷。碱的类型成为核苷的特征。四种DNA碱是腺嘌呤(“A”)、鸟嘌呤(“G”)、胞嘧啶(“C”)和胸腺嘧啶(“T”)。四种RNA碱基是A、G、C和尿嘧啶(“U”)。
DNA序列--核苷酸的线性排列，它们通过相邻戊糖的3′和5′碳间的磷酸二酯键而一个接一个地连接起来。
密码子--通过mRNA编码氨基酸、翻译起始信号或翻译终止信号的三个核苷酸(三联体)的DNA序列。例如，核苷酸三联体TTA、TTG、CTT、CTC、CTA和CTG编码亮氨酸(“Leu”),TAG、TGA和TAA是翻译终止信号，ATG是翻译起始信号，它也编码甲硫氨酸(“MET”)。
多肽--氨基酸的线性排列，它们通过相邻氨基酸的氨基和羧基间的肽键而一个接一个地连接起来。
基因组--细胞或病毒的整个DNA。它包括编码多肽物质的自身结构基因，以及启动子、转录和翻译起始和终止位点。
基因--由其模板或“信使”RNA(“mRNA)编码一个特定多肽的特征性氨基酸序列的DNA序列。
转录--由基因或DNA序列生产mRNA的过程。
翻译--由mRNA生产多肽的过程。
表达--通过基因或DNA序列生产多肽的过程。它是转录和翻译的合并。
质粒--一段非染色体的双链DNA序列，它包括一个完整的“复制子”以使该质粒可在宿主细胞内复制。若将质粒置于单细胞生物体内，则可由于该质粒的DNA而改变或转化该生物体的特征。例如，用携有四环素抗性(TETR)基因的质粒可将一个原先对四环素敏感的细胞转化为可抗四环素的细胞。被质粒转化了的细胞称为“转化体”。
噬菌体--细菌病毒，这种病毒中许多是由包裹在蛋白质包膜或包被(“衣壳”)内的DNA序列所组成。
克隆载体--能在宿主细胞内复制的质粒、噬菌体DNA、粘粒或其它DNA序列，其特征在于其内有一个或少量内切酶识别位点，可在这个(些)位点处以特定形式切割这类DNA序列，而不会附带着使该DNA丧失基本的生物学功能(比如复制，包被蛋白的产生)，或者丧失启动子或结合位点，并且其中包含一个适于鉴定已转化细胞的标志，如四环素抗性或氨苄青霉素抗性。克隆载体常称为载体。
克隆--通过无性繁殖由一个生物体或序列获得这样的生物体或DNA序列群体的过程。
重组DNA分子或杂合DNA--由来源于不同基因组的DNA区段所组成的分子，这些DNA区段已在活细胞外尾-尾连接，并能在活细胞内维持。
cDNA--与编码特定多肽的mRNA互补的DNA链。
根据本发明用于控制咖啡植物中乙烯生物合成的策略首先涉及鉴定编码表达乙烯途径中两种酶--ACC合成酶和ACC氧化酶的基因。用含有方向与正常基因反义的上述两个基因之一或二者的构建体转化野生型咖啡植物预期能阻断相应酶的合成。由该转化序列指导转录出的信使RNA将会与由正常序列指导转录出的mRNA结合，由此使正常信使失活并消除酶合成。
为分离咖啡中编码表达ACC合成酶和ACC氧化酶的DNA序列，我们用合成DNA探针对从咖啡植物组织构建的cDNA文库进行筛选，所述合成DNA探针中含有预期存在的核苷酸序列。这些预期的序列是基于对其它重要植物和其它植物内编码相应酶类的基因中存在的核苷酸序列的研究。
利用相应于编码ACC合成酶或ACC氧化酶的基因的cDNA转化胚性咖啡植物。利用质粒pBⅠ-121作为转化载体。将相应于编码表达ACC氧化酶或ACC合成酶的DNA的序列以相反方向插入质粒中花椰菜花叶病毒35S启动子的相邻处。由此转录的RNA将与编码相应酶的氨基酸序列的mRNA互补。在细菌宿主中扩增整个构建体。破坏宿主，将扩增的载体附着于胶体金颗粒上。按照美国专利5,107,065所述，通过将颗粒高速推进细胞而将附着了载体的金颗粒插入咖啡植物组织中。通过抗生素抗性鉴定出已成功转化了的幼植物。该转化植物不再产生ACC合成酶或ACC氧化酶，这取决于用来转化植物的基因。通过施用外源乙烯可起始该转化植物的成熟。
实施例1分离咖啡果特异性ACC合成酶cDNA
为分离参与咖啡成熟的ACC合成酶基因序列，利用不同成熟期的咖啡果囊果皮和中果皮组织混合物制备cDNA文库。由与构建文库相同的mRNA制得的第一链cDNA以及相应于其它生物的ACC合成酶基因之共有序列的简并性寡核苷酸引物合成PCR产物，利用该PCR产物对文库进行筛选。这一实施例主要涉及mRNA的分离、cDNA文库的构建，以及克隆适当cDNA中有关的后续步骤。a)分离mRNA
利用Levi等[Hort Science,27(12):1316-1318(1992)]的方法，从各种不同发育阶段的咖啡果(小果咖啡cv Guatemalan)的66g果囊果皮和中果皮组织中分离总RNA。在家用咖啡研磨机(Salton GC-5型，SaltonMaxam Houseware Group,Mt.Prospect,IL)中存在小块干冰的情况下，研磨经冷冻的咖啡果果囊果皮和中果皮组织大约2分钟。将粉碎的果实组织加入到200μl的200mM三[羟甲基]氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)(pH8.5),1.5％十二烷基硫酸钠(SDS),300mM LiCl,10mM乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA),1.5％脱氧胆酸钠(w∶v),1.5％NP40(Sigma化学公司)(v∶v),0.5mM硫脲，1mM金精三羧酸，10mM二硫苏糖醇(DTT),75mMβ-巯基乙醇，2％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和2％聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，并利用Polytron组织匀浆器(Tekmar,Cincinnati,OH)进行匀浆。匀浆2分钟后，加入200μl氯仿继续匀浆3分钟。将匀浆物转移到250μl离心管(Nalgene)中，于2500×g离心15分钟。取出上层水相并与12μl5M NaCl混合，等分至两个离心管中，在每个管中均加入150μl乙醇。将混合物于-20℃放置过夜。在4℃，于4000×g离心15分钟收集RNA。将RNA溶解于50μl TE1(50mM Tris-HCl[pH8.0],10mM Na2EDTA),4℃下于12000×g离心10分钟以澄清RNA。将上清液转移到新的离心管中，加入3μl5M NaCl及30μl异丙醇。混合各组分，并置于-20℃过夜。于14000×g离心10分钟收集RNA。用20μl70％冰冷乙醇洗涤RNA，并如前述一样通过离心收集。真空干燥10分钟后，将RNA重悬于50μl TE1缓冲液中，加入10μl12M LiCl。将溶液置于4℃保温48小时，通过14000×g离心10分钟收集RNA，并重悬于30μl TE1缓冲液中。加入15μl5M乙酸钾后，将RNA置于0℃过夜。于14000×g离心10分钟回收RNA并将其悬浮于50μl TE1缓冲液中。加入3μl5M NaCl和110μl95％乙醇，将RNA置于-20℃过夜。通过于14000×g离心10分钟收集RNA，用20μl70％冰冷乙醇洗涤，如上述通过离心回收，再真空下干燥10分钟，将RNA重悬于600μlTE1缓冲液中。将RNA转移到微量离心管中，4℃下于14000rpm离心30分钟，随后，各将300μl移入两个新微量离心管中。再用300μlTE1缓冲液冲洗原离心管一次。在三个离心管的每一个中均加入18μl5M NaCl和636μl100％乙醇。颠倒混匀后，将这些管贮于-20℃过夜。通过14000rpm离心30分钟收集RNA，并用1μl70％冰冷乙醇洗涤。如上述离心和干燥后，将RNA重悬于400μl无菌水中。总共获得1.04mg总RNA。
利用PolyATtractmRNA分离系统Ⅳ(Promega Corporation，Madison,WI)分离信使RNA(polyA+RNA)。按如下方法进行两次分离。为进行每次分离，将0.48mg总RNA溶于800μl无RNase的水中。于65℃加热10分钟后，加入3μl50pmole/ml生物素化的oligo(dT)和20.7μl20xSSC(1xSSC含有150mMNaCl和15mM柠檬酸钠)，使混合物经过大约30分钟缓慢冷却到室温。在0.5xSSC中洗涤链霉抗生物素蛋白顺磁颗粒等分样品(由PolyATtrackmRNA分离系统Ⅳ提供)三次，再重悬于0.1ml0.5×SSC中。将含有生物素化oligo(dT)的RNA溶液加入到洗涤过的链霉抗生物素蛋白顺磁颗粒中。于室温保温10分钟后，利用磁体将含有被捕获mRNA的顺磁颗粒捕捉到管边缘。
移去上清液，用0.3ml0.1xSSC洗涤颗粒4次。通过悬浮于200μl无RNase的水中而将mRNA从生物素化oligo(dT)颗粒中洗下来。在两管的每一管中依次加入150μl水进行再次洗脱。汇集各洗脱组分(550μl)并在微量离心机中于4℃、14000rpm离心30分钟。将上清液分装到两个微量离心管中，加入1/10体积的3MNaCl和600μl乙醇后，将管置于-20℃过夜回收mRNA，然后如上述离心。用1ml冰冷的70％乙醇洗涤mRNA，干燥mRNA，再重悬于20μl无菌水中。将1μl加到1ml水中，在Shimadzu UV160U分光仪中测定230nm到330nm之间的光谱。从1.04mg总RNA回收到大约6μgmRNA。b)构建cDNA文库
利用ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)合成第一链和第二链cDNA。将20μl水中的6μgmRNA置于65℃保温5分钟。加入2μl100mM甲基汞，继续于室温保温10分钟。加入4μl700mMβ-巯基乙醇，再继续保温5分钟。在变性mRNA中加入5μl10x第一链缓冲液(试剂盒中附有)、5μl100mM DTT、3μl核苷酸混合物(dATP、dGTP、dTTP和5-甲基-dCTP各10mM)、2μl1.4μg/μl接头引物：
5′-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′
                                                    (SEQ.ID NO.1)以及1μlRNase阻断剂和5μl水。将反应物置于室温10分钟以使引物与mRNA退火，然后加入3μl20U/μlM-MuLV递转录酶。将5μl反应混合物转移到含有0.5μl(0.625pmole)800Ci/mmole[α-32p]dATP的一个管中。两个反应均于37℃保温1小时。将放射性标记的反应物冷冻于-20℃以备后面凝胶分析之用。在45μl主要反应物中，加入40ml第二链缓冲液、15μl100mM DTT、6μl核苷酸混合物(10mM dATP、dGTP、dTTP，以及26mMdCTP),268.3μl水和2μl(2.5pmoles)800Ci/mmol[α-32P]dATP。混合后，加入4.5μl1U/μlRNaseH和19.2μl5.2U/μl大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，并将反应物于16℃保温2.5小时。用400μl苯酚∶氯仿(1∶1)抽提反应物。在微量离心机中离心5分钟以分离各相，移取水相并用氯仿再次抽提。通过如前述离心回收水相。
通过加入33.3μl3M乙酸钠(pH5.2)和867μl100％乙醇并于-20℃放置过夜而沉淀双链cDNA。在微量离心机内于4℃、14000xg离心60分钟从而回收cDNA。cDNA用1ml80％乙醇洗涤，在微量离心机内于室温、14000xg离心，真空干燥，并溶解于45μl水中。取出3μl重悬浮的双链cDNA，贮于-20℃以备后面通过凝胶电泳分析。
在剩下的42μl双链cDNA中加入5μl10xKlenow缓冲液(缓冲液#3；由Stratagene提供)，2.5μl2.5mM核苷酸(dCTP、dGTP、dATP和dTTP)，以及0.5μl5U/μl的大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段。置于37℃30分钟后，加入50μl水，如上述用等体积的苯酚∶氯仿(1∶1)抽提反应物，然后用氯仿再次抽提。加入7μl3M乙酸钠(pH5.2)和226μl100％乙醇后，将钝末端的双链cDNA于冰上保温30分钟，在微量离心机中于4℃、14000rpm离心60分钟进行回收。用300μl70％乙醇洗涤cDNA，如前述离心和干燥。将7μl0.4μg/μlEcoRⅠ接头加到已干燥的cDNA中。EcoRⅠ接头的结构如下：
5′-AATTCGGCACGAG-3′(SEQ.ID NO.2)
          3′-GCCGTGCTC-5′振摇以重悬cDNA后，加入1μl10x连接缓冲液，1μl10mMATP和1μl4WeissU/μlT4DNA连接酶，将反应物置于8℃保温过夜。通过在70℃加热30分钟而使连接酶失活。利用多核苷酸激酶对此刻连接到cDNA上的EcoRⅠ接头的5′末端进行磷酸化。将ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)中10x缓冲液#31μl、2μl10mMATP、6μl水和1μl10U/μlT4多核苷酸激酶加入连接反应物中。于37℃保温30分钟后，通过在70℃加热30分钟而使该激酶反应终止。对该接头引物内的XhoⅠ位点进行消化以在相应于mRNA3′末端的cDNA末端产生XhoⅠ“粘端”。将28μlXhoⅠ缓冲液和3μl40U/μlXhoⅠ加入到cDNA中，反应物置于37℃保温1.5小时。
通过按下述制备的Sephacryl S-400离心柱(spin column)，对在5′末端具有EcoRⅠ粘端、在3′末端具有XhoⅠ粘端的cDNA(相应于最初的mRNA)进行大小分级分离。将5μl10xSTE[100mM Tris(pH7.0),5mMEDTA和100mMNaCl]加入cDNA中，再将cDNA上样到含有SephacrylS-400(Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)的1ml注射器上部。在注射器底部放置一个500μl微量离心管，再将柱置于离心管中，在大约400xg离心2分钟。在注射器上部加入60μl1xSTE，再在柱底部放置一个新的微量离心管，如前述再次对柱离心。重复此过程直至收集到6个级分。在1％琼脂糖凝胶上对每一级分约10％进行电泳以确定每一级分中cDNA的大小分布。如上述用等体积的酚/氯仿抽提每一级分的剩余物，然后用氯仿抽提，再通过加入2体积的100％乙醇进行沉淀。-20℃放置过夜后，在微量离心机中于4℃、14000rpm离心60分钟收集cDNA。每一cDNA级分用200μl80％乙醇洗涤，并如前述干燥。将cDNA级分1重悬于3μl无菌水中，将cDNA级分2重悬于10.5μl无菌水中。取两级分各0.5μl通过溴乙锭平板检测方法测定DNA量。合并含有最大cDNA分子的级分1和2。合并的12.5μl级分中含有大约100ngcDNA。在Speed-Vac中浓缩该级分体积至2.5μl，贮于冰上。将cDNA级分3重悬于10.5μl无菌水中，贮于-20℃备用。
将来源于级分1和2的100ngcDNA连接到已用EcoRⅠ和XhoⅠ消化的一种λZAP载体Uni-ZAPTM(Stratagene,La Jolla,CA)中。将级分1和2cDNA(2.5μl)加入到含有0.5μl10x连接缓冲液，10mMATP0.5μl,1μg/μlUni-Zap XR载体1μl和4WeissU/μlT4DNA连接酶0.5μl的混合物中。将反应物于8℃保温约44小时。将连接反应物的1μl小份加入到GigapackⅡ Gold噬菌体λ包装试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)中的“冻融”提取物小份内。加入15μl声波提取物(Sonicextract)，轻轻混合各组分。在室温下进行包装。2小时后，向每一包装反应物中加入500μlSM缓冲液和20μl氯仿，在微量离心机中短暂离心去除碎片。将包装好的噬菌体移入一新的微量离心管中。加入10μl氯仿，在4℃保存已包装好的噬菌体备用。此原始文库的滴度表明其中存在0.7×106个重组噬斑。c)原始文库的扩增
向16个管的每管中加入已培养至密度为O.D.600=0.5的E.coli XL1-Blue MRF′(Stragene,La Jolla,CA)600μl和原始文库母液32.5μl。于37℃保温15分钟后，向每管加入6.0ml48℃的顶层琼脂(5g/LNaCl,2g/LMgSO4·7H2O,5g/L酵母提取物，10g/LNZ胺[pH7.5]，和0.7％琼脂糖)，将各组分铺板到150×15mmNZY平板上(5g/LNaCl,2g/LMgSO4·7H2O,5g/L酵母提取物，10g/LNZ胺[pH7.5]和15g/LDifco琼脂)。平板在37℃保温过夜，然后上面用10μlSM缓冲液覆盖，4℃继续保温8小时，同时温和晃动。用无菌移液器收集SM缓冲液，贮于无菌的250ml离心瓶中。再用10mlSM缓冲液润洗各板，收集这些缓冲液，并加入原始SM缓冲液中。加入氯仿至终浓度为5％，室温下放置此噬菌体溶液15分钟，然后在2000xg离心10分钟以除去细胞碎片。回收上清液到无菌聚丙烯瓶中，加入氯仿至终浓度为0.3％。将此已扩增的文库贮于4℃。d)对已扩增的文库铺板以筛选特定基因
如前述测定已扩增的文库的滴度。向600μl已如前述培养好的E.coli XL1-Blue MRF′中加入大约50000个重组噬菌斑。37℃放置15分钟后，加入6.5ml48℃的顶层琼脂，将细胞铺板于150×15mmNZY平板上。制备总共含有200000个重组噬菌斑的4个平板，37℃培养过夜。在4℃冷存平板4小时，再利用这些板如下述制备噬斑浸提物。e)鉴别并构建与咖啡ACC合成酶基因同源的寡核苷酸
在美国专利申请系列号08/485,107中所述的已有研究中，我们鉴定出了与多种植物的ACC合成酶共有的碱基序列，本文称之为共有序列，上述专利申请引入本文作为参考。基于这些研究，我们设计了三套完全简并性引物以用于PCR扩增对应于共有序列的咖啡第一链cDNA区域。所用引物序列如下：ACS167:5′-GCCAAGCTTCCRTGRTARTCYTGRAA-3′
                            (SEQ.ID NO.3)ACS289:5′-TTYCARGAYTAYCAYGGHYT-3′
                             (SEQ.ID NO.4)ACS885:5′-CCHGGDARNCCYAWRTCTTT-3′
                              (SEQ.ID NO.5)f)进行逆转录反应以得到第一链咖啡cDNA
利用GeneAmp RNA PCR Core试剂盒(Perkin Elmer,Foster City,CA)，在20μl的终体积中进行逆转录反应以得到第一链cDNA。首先，在微量离心管中混合溶于3μl水中的0.9μg咖啡果mRNA和1μl的50μM随机六聚体以及6μl无菌水，于65℃保温5分钟。将混合物置于室温2分钟，稍微离心以将液体甩至管底。向该混合物中加入2μlPCR缓冲液Ⅱ(上述试剂盒提供)，4μl25mMMgCl2,2μl10mMdNTP′s,1μlRNAsin(20U/μl)和1μl逆转录酶(50U/μl)。反应物在42℃保温1小时后，在95℃水浴中加热5分钟以便热失活逆转录酶。g)进行聚合酶链反应以扩增咖啡ACC合成酶基因
用上述GeneAmp试剂盒，在含有10μl第一链cDNA混合物，4μlPCR缓冲液Ⅱ,1μl25mMMgCl2,2.5μl20μMAC5167引物(SEQ ID NO:3),2.5μl20μMAC5885引物(SEQ ID NO:5),29.5μl无菌水和0.5μlTaq DNA聚合酶(5U/μl)的50μl反应物中进行聚合酶链反应(PCR)(Saiki等，1988)。PCR条件是35个循环，每一循环为94℃1分钟，44℃1分钟，72℃2分钟。用1.5％SeaPlaque琼脂糖(FMCBioProducts,Rockland,ME)，通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物，其中使用经HaeⅢ消化的φx174DNA(Promega Corporation,Madison,WI)作为分子量标准。得到了约650bp的单一PCR产物。b)用不同的引物扩增PCR产物
从凝胶中切出由上述得到的650bp片段，置于1.5ml微量离心管中。加入200μl无菌水后，将该650bp片段加热到90℃5分钟，冷却至室温，在微量离心机中于14000rpm离心5分钟。取出含有扩增DNA的上清液，置于一新的无菌1.5ml微量离心管中。利用0.4μl的前面扩增的DNA作模板，以及2.5μl10xPCR缓冲液(10mMTris-Hcl,pH9.0,0.1％tritonx-100),2μl25mMMgCl2,5μl1mMdNTPs,1μl20μMACS289引物(SEQ ID NO:5),1μl20μMACS885引物(表2)，12.8μlH2O和0.3μlTaq DNA聚合酶(5U/μl)(Promega公司，Madison,WI)，进行一个25μl的PCR反应。PCR进行35个循环，每一循环为94℃1分钟，45℃1分钟和72℃2分钟。取反应产物5μl在1.5％琼脂糖凝胶上如上述进行电泳。可肉眼观察到大约603bp的单一产物。向余下的反应产物中加入80μl无菌水，10μl3M乙酸钠(pH5.2)和220μl100％乙醇。在-20℃放置过夜后，通过在4℃于14000rpm离心30分钟回收DNA。用400μl冰冷的75％乙醇洗涤DNA，再重悬于25μl无菌水中。利用溴乙锭平板测定确定该DNA的浓度为10ng/μl。i)标记咖啡果特异性的ACC合成酶DNA
利用PCR中产生的ACC合成酶DNA和Prime-a-Gene试剂盒(Promega公司，Madison,WI)制备随机引发的探针。将2.5μl该DNA(25ng)加入到27.5μl无菌水中，煮沸5分钟以变性DNA。向其中加入10μl5X标记缓冲液，2μl未标记的dNTP′s[每种各20μM；dCTP,dGTP,dTTP],2μl1mg/ml乙酰化的BSA,1μl5U/μl大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段和5μl(50μCi)[α-32P]dATP(3,000Ci/mmole)(Dupont-NEN)，至终体积为50μl。室温1小时后，通过加入2μl0.5M Na2EDTA并煮沸2分钟而终止反应。j)用ACC合成酶特异性探针筛选已扩增的文库
制备该4块150×15mmNZY平板的噬斑浸提物，每块板各含有50,000个重组克隆。将四张132mmMagna尼龙转移膜(Micron Separations,Incorporated,Westborough,MA)置于已用5xSSC缓冲液浸透的层析纸上大约10秒钟以便润湿。将这些膜置于含有重组噬斑的诸平板上5分钟后，取出膜，含有噬菌体的一侧朝上地将它们置于已用0.5MNaoH和1.5MNaCl浸透的层析纸上2分钟。将膜转移到已用0.5MTris-Hcl(pH8.0)和1.5MNaCl浸透的层析纸上5分钟以中和这些膜。在用含有0.2MTris-Hcl(pH7.5)的2xSSC浸透了的层析纸上快速处理滤膜20秒后，吸干滤膜上的水分。风干1小时后，通过在UV Stratalinker1800(Stratagene,La Jolla,CA)中用12,000μJ的260nmUV光处理从而使DNA交联到诸膜上。
利用HB-OV-BL瓶，在Hybaid MarkⅡ杂交箱(National LabnetCompany,Woodbridge,NJ)中，于100ml6xSSPE(52.2g/LNaCl,8.3g/LNaH2PO4·H2O,2.2g/LNa2EDTA,[pH7.4]),5x Denhardt′s 溶液(1g/LFicoll,1g/L聚乙烯吡咯烷酮，1g/LBSA[组分Ⅴ]),0.5％SDS和100μg/ml已变性的鲱鱼精DNA内，65℃下对这4张膜预杂交2小时。
杂交在10ml含有0.5％SDS、100μg/ml已变性的鲱鱼精DNA和52μl上述随机引发的探针的6xSSPE中，65℃下进行12小时。杂交结束后，移去杂交溶液，用100ml含有0.5％SDS的2xSSC在65℃稍微洗涤一下各膜。然后，还是在65℃，用同样量的新鲜缓冲液再洗涤诸膜30分钟。诸膜用100ml含有0.5％SDS的0.2xSSC在65℃继续洗涤两遍(每遍30分钟)后，被包裹于玻璃纸封皮内，在-70℃对已预闪的FujiRXGCU X-射线胶片曝光24小时。得到10个阳性克隆。取出原始平板上对应于已鉴别出来的噬斑的区域，置于含有20μl氯仿的1mlSM缓冲液中。对这10个克隆中的5个以较低密度再次铺板，如上述一样重新筛选以获得单个噬斑。k)鉴定咖啡果ACC合成酶cDNA克隆
利用与克隆载体和cDNA插入位点旁侧存在的T3和T7启动子的一部分同源的引物，通过聚合酶链反应确定推断的咖啡ACC合成酶cDNA克隆的大小。诸引物的序列如下：
T3:5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′(SEQ.ID NO.6)
T7:5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′(SEQ.ID NO.7)PCR反应的条件如上所述，只是温度循环为95℃1分钟，50℃1小时和72℃2分钟。与前面一样地通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。
通过体内切割以噬菌粒形式回收三个最大的克隆。将来自单一噬斑的200μl噬菌体贮存液与培养至在O.D.600的密度为1.0的大肠杆菌XL1-Blue MRF′200μl混合在一起。加入1μlExAssist(Stratagene,LaJolla,CA)辅助噬菌体(＞1×106 pfu/μl)，将各管置于37℃保温15分钟。加入3ml无菌LB液体培养基，将它们置于37℃，振荡培养3小时。在70℃加热20分钟后，于1,000×g离心15分钟，将含有包装为丝状噬菌体颗粒的已切割的pBluescript噬菌粒的上清液1ml转移到一个无菌的1.5ml微量离心管中，贮于4℃。向200μl已培养至在O.D.600测得密度为1的E.coli Solar细胞(Stratagene,La Jolla,CA)中加入25μl该贮存液从而回收噬菌粒。在37℃保温15分钟后，将该细胞混合物200μl铺板到含有50μg/ml氨苄青霉素的100×15mmNZY琼脂板上。诸板在37℃培养过夜。挑出各个单独菌落，接种于10ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃摇床中培养过夜。在一个1.5ml无菌微量离心管中通过重复离心浓缩细胞，利用QIAGEN的质粒微型试剂盒纯化质粒DNA。用水洗涤细菌沉淀块，将它们重悬于0.3ml缓冲液P1中。接着，加入0.3ml碱性裂解缓冲液P2，轻轻混匀，室温下放置5分钟以下。加入0.3ml冰冷的缓冲液P3后，通过颠倒诸管6次以混匀，将提取物置于冰上10分钟，再在微量离心机中于14,000rpm离心15分钟。取出上清液，加到各个QIAGEN-tip20柱上，所述诸柱已预先用1mlQDT缓冲液平衡。使提取物通过引力流进入各柱的树脂内。一旦液流停止，用1ml缓冲液QC洗涤各柱4遍。通过用0.8ml缓冲液QF洗涤诸QZAGEN-tip20柱而洗脱DNA，洗脱出的DNA收集于多个1.5ml微量离心管中。加入0.7体积(560μl)异丙醇来沉淀DNA。立即在14,000rpm离心诸管30分钟，小心移去上清液。用1ml冰冷的70％乙醇洗涤含有DNA的诸沉淀块，如上一样地离心，并风干5分钟。将DNA重悬于50μl无菌水中。通过荧光测定分析确定来自一次质粒分离的DNA的浓度为0.1μg/μl。
测序反应是通过混合8μl质粒DNA(0.8μg)和4μlT3或T7测序引物(0.8pmol/μl)而进行的。在夏威夷大学生物技术服务中心对这些样品进行自动DNA测序。得到从cDNA 5′和3′末端开始大约350bp序列。基于前面序列的末端附近的序列合成新的测序引物，利用这些引物以同样的方式完成cDNA两条链的序列测定。图1中给出了咖啡果表达的ACC合成酶cDNA的完整序列。图2给出了咖啡果表达的ACC合成酶的推断的氨基酸序列。
将该咖啡ACC合成酶cDNA克隆和推断的蛋白质的序列与GenBank内现有的其它ACC合成酶基因进行比较。分离自咖啡果的cDNA与GenBank内现有的其它ACC合成酶的同一性为68.3％-58.1％。由该cDNA推断出的蛋白质序列与其它ACC合成酶的同一性为67.9％-50.5％。然而，该cDNA是独特的，因为没有大于1500bp的其它序列与它有68.3％以上相同。实施例2分离咖啡果特异性ACC氧化酶a)合成ACC氧化酶特异性寡核苷酸引物
与上述一样地分离总RNA,mRNA，并合成咖啡果特异性cDNA。
利用GCG(Genetics Computer Group,Madison,WI)的Pileup程序，对得自GenBank的12种ACC氧化酶序列进行排列。发现从翻译起始密码子开始大约1000bp的一个区域比较保守，合成一段对应于该区的简并性寡核苷酸引物
5′-TCATIGCKKCRAKIGGTTC-3′(SEQ.ID NO.8)由于序列不保守的位置上可以是A、T、G或C中任何一种，因此在这样的位置处掺入肌苷(I)。用混合残基(T/G或A/G)制备具有两种可能性的位置。我们还制备了与我们实验室以前克隆的番木瓜果表达的ACC氧化酶cDNA的一个区同源并位于翻译起始密码子下游大约372bp的另一个引物：
5′-GACACTGTGGAGAGGCTGAC-3′(SEQ.ID NO.9)在PCR反应中利用这两个引物扩增咖啡果表达的ACC氧化酶的一个部分。PCR反应物中含有0.2μl(10ng)cDNA组分3(实施例1中所述)，5μl10×PCR缓冲液，3μl25mMMgCl2，四种dNTP各10mM的混合液1μl，每一种引物的20μM贮存液各1μl,0.3μlTaq DNA聚合酶(Promega公司，Madison,WI)和38.5μl水。PCR条件为35个循环，每一循环是94℃1分钟，50℃1分钟和72℃1分钟。最后一个循环后，在72℃保温5分钟。如前所述，在1.5％琼脂糖凝胶上对20μl的产物进行电泳，结果表明其中有一种大约800bp的产物。从凝胶中切出该DNA，在一个1.5ml微量离心管中与200μl无菌水混合。煮沸5分钟后，在如上述的一个50μlPCR反应中，利用相同引物，用2μl产物作为模板进行PCR。利用20μlPCR反应产物与上述相同地进行凝胶电泳，结果表明其中存在一种800bp的单一产物。向剩下的30μlPCR反应产物中加入20μl氯仿和100μl水。混匀各组分，在微量离心机中于14,000rpm离心2分钟。取出含有该DNA的上层水相，置于一个干净的微量离心管中。如上述，通过随机引发合成法对该DNA的一部分进行放射活性标记。b)用随机引发的探针对已扩增的文库进行筛选
利用实施例1中所述的已扩增的咖啡果cDNA，如前述一样地制备4块150×10mmNZY平板。如前述一样地进行预杂交、杂交和诸克隆的回收，不同之处仅在于此处利用PCR中得到的ACC氧化酶序列作为探针。c)鉴定咖啡果ACC氧化酶cDNA克隆
利用实施例1中所述的与T3和T7启动子同源的引物，通过聚合酶链反应确定诸咖啡ACC氧化酶cDNA克隆的大小。
如实施例1中所述得到最大的咖啡ACC氧化酶cDNA克隆的序列，将该序列与GenBank中现有的ACC氧化酶基因进行比较。图3给出了咖啡果特异的ACC氧化酶的序列。图4给出了该蛋白质的推断的氨基酸序列。因为该cDNA与GenBank中现有的其它ACC氧化酶的核酸序列有50.4％-82.5％相同，所以它编码的是ACC氧化酶。同样，其推断的蛋白质序列与其它ACC氧化酶有32.5％-86.5％相同。
前述各实施例仅用于图解性目的，不应理解为用来限制本申请人的发明范围。申请人的发明范围列于所附的权利要求书中。
                       序列表(1)一般信息
(ⅰ)申请人：Stiles,John I.
              Moisyadi,Istefo
              Neupane,Kabi R.
(ⅱ)发明名称：经纯化的蛋白质，重组DNA序列以及控制咖啡成熟的方法
(ⅲ)序列数：13
(ⅳ)联系地址：
    (A)收信人：Jones,Day,Reavis和Pogue
    (B)街道：North Point,901 Lakeside Avenue
    (C)城市：Cleveland
    (D)州：Ohio
    (E)国家：美国
    (F)邮编：44114
(ⅴ)计算机可读形式：
    (A)介质类型：软盘，3.5英寸，1.44兆内存
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：MS-DOS v.5.1
    (D)软件：WordPerfect v.6.1
(ⅵ)当前申请信息：
    (A)申请号：08/695,412
    (B)申请日：1996年8月12日
    (C)分类号：435
(ⅶ)在先申请信息：
    (A)申请号：US08/485,107
    (B)申请日：1995年6月7日
(ⅷ)代理人/代理机构信息：
    (A)姓名：Griffith,Calvin P.
    (B)代理号：34,831
    (C)参考号/文档号：265036600002
(ⅸ)电信信息：
    (A)电话：(216)586-7050
    (B)电传：(216)579-0212(2)SEQ ID NO:1信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15个氨基酸残基
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：N/A
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅳ)性质：
    (A)名称/关键词：片段A
    (B)位置：17.1480
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gln Xaa Gly1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:2信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14个氨基酸残基
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gln Thr1               5                   10              14(2)SEQ ID NO:3信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
    (A)描述：引物
(ⅴ)片段类型：内部的
(ⅸ)性质：
    (A)其它信息：N是肌苷
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:ATNAAYTAYG CNAGYGGNGC                                   20(2)SEQ ID NO:4信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
    (A)描述：引物
(ⅴ)片段类型：内部的
(ⅸ)性质：
    (A)其它信息：N是肌苷
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:ATNAAYTAYG CNAGYGGNGC                                   20(2)SEQ ID NO:5信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
    (A)描述：引物
(ⅴ)片段类型：内部的
(ⅸ)性质：
    (A)其它信息：N是肌苷
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:CGNCCAGNCG NYTAYTTNAT                                   20(2)SEQ ID NO:6信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组的)
    (A)描述：引物
(ⅴ)片段类型：内部的
(ⅸ)性质：
    (A)其它信息：N是肌苷
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:CGNCCYCTYG CYTAYTTNAT                                   20(2)SEQ ID NO:7信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14个氨基酸残基
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部的(ⅸ)性质：
(D)其它信息：Xaa是Thr或Asp(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Gln Tyr Val Pro Cys Tyr Phe Xaa Phe Ile Asp Asp Gln Asp1               5                   10              14(2)SEQ ID NO:8信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
    (A)描述：引物
(ⅴ)片段类型：内部的
(ⅸ)性质：
(A)    其它信息：N是肌苷
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:CAWTATGTNC CNTGTTATTT                                     20(2)SEQ ID NO:9信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
    (A)描述：引物
(ⅴ)片段类型：内部的
(ⅸ)性质：
    (A)其它信息：N是肌苷
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:AAWTAWCAHG GNACWTATTG                                    20(2)SEQ ID NO:10信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：488个氨基酸残基
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅸ)性质：
    (A)名称/关键词：CDS
    (B)位置：178..1653
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:Met Glu Phe Ser Leu Lys Asn Glu Gln Gln Gln Leu Leu Ser Lys1               5                   10                  15Met Ala Thr Asn Asp Gly His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp
             20                  25                  30Gly Trp Lys Ala Tyr Asp Ser Asp Pro Tyr His Pro Thr Arg Asn
             35                  40                  45Pro Asn Gly Val Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Leu Cys
             50                  55                  60Phe Asp Leu Ile Glu Glu Trp Val Leu Asn Asn Pro Glu Ala Ser
             65                  70                  75Ile Cys Thr Ala Glu Gly Ala Asn Lys Phe Met Glu Val Ala Ile
             80                  85                  90Tyr Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro Glu Phe Arg Asn Ala Val Ala
             95                 100                 105Arg Phe Met Glu Lys Val Arg Gly Asp Arg Val Lys Phe Asp Pro
            110                 115                 120Asn Arg Ile Val Met Ser Gly Gly Ala Thr Gly Ala His Glu Thr
            125                 130                 135Leu Ala Phe Cys Leu Ala Asp Pro Glu Asp Ala Phe Leu Val Pro
            140                 145                 150Thr Pro Tyr Tyr Pro Gly Phe Asp Arg Asp Leu Arg Trp Arg Thr
            155                 160                 165Gly Met Gln Leu Leu Pro Ile Val Cys Arg Ser Ser Asn Asp Phe
            170                 175                 180Lys Val Thr Lys Glu Ser Met Glu Ala Ala Tyr Gln Lys Ala Gln
            185                 190                 195Glu Ala Asn Ile Arg Val Lys Gly Phe Leu Leu Asn Asn Pro Ser
            200                 205                 210Asn Pro Leu Gly Thr Val Leu Asp Arg Glu Thr Leu Ile Asp Ile
            215                 220                 225Val Thr Phe Ile Asn Asp Lys Asn Ile His Leu Ile Cys Asp Glu
            230                 235                 240Ile Tyr Ser Ala Thr Val Phe Ser Gln Pro Glu Phe Ile Ser Ile
            245                 250                 255Ser Glu Ile Ile Glu His Asp Val Gln Cys Asn Arg Asp Leu Ile
            260                 265                 270His Leu Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Leu Gly Phe Pro Gly Phe
            275                 280                 285Arg Val Gly Ile Leu Tyr Ser Tyr Asn Asp Ala Val Val Ser Cys
            290                 295                 300Ala Arg Lys Met Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr Gln Thr Gln
            305                 310                 315His Leu Ile Ala Ser Met Leu Ser Asp Glu Ala Phe Met Asp Lys
            320                 325                 330Ile Ile Ser Thr Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Arg His Gly Leu
            335                 340                 345Phe Thr Arg Gly Leu Ala Gln Val Gly Ile Gly Thr Leu Lys Ser
            350                 355                 360Ser Ala Gly Leu Tyr Phe Trp Met Asp Leu Arg Arg Leu Leu Arg
            365                 370                 375Glu Ser Thr Phe Glu Ala Glu Met Glu Leu Trp Arg Ile Ile Ile
            380                 385                 390His Glu Val Lys Leu Asn Val Ser Pro Gly Leu Ser Phe His Cys
            395                 400                 405Ser Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala Asn Met Asp Asp
            410                 415                 420Glu Ser Val Arg Val Ala Leu Arg Arg Ile His Lys Phe Val Leu
            425                 430                 435Val Gln Gly Lys Ala Thr Glu Pro Thr Thr Pro Lys Ser Arg Cys
            440                 445                 450Gly Ser Ser Lys Leu Gln Leu Ser Leu Ser Phe Arg Arg Leu Asp
            455                 460                 465Glu Arg Val Met Gly Ser His Met Met Ser Pro His Ser Pro Met
            470                 475                 480Ala Ser Pro Leu Val Arg Ala Thr
            485(2)SEQ ID NO:11信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：2040个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA至mRNA
(ⅸ)性质：
    (A)名词/关键词：CDS
    (B)位置：178..1653
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:GTAATCTCTT CTAAAATCAA CCATTCTCTT CATTCTTCAC TTGACAAGGC   50CACTGCATTC TTCATTCTTT CTTGATATAT AGCCATTTTT TTCATTCTTT  100CTTGATATAT AGCCATTTTT TTCATTCTTT CTTCATTCAT TGTCTGGAGA  150AGTTGGTTGA GTTTTCTTGA AAATTCAAGC AAAACA ATG GAG TTC AGT 198
                                    Met Glu Phe Ser
                                     1TTG AAA AAC GAA CAA CAA CAA CTC TTG TCG AAG ATG GCA ACC 240Leu Lys Asn Glu Gln Gln Gln Leu Leu Ser Lys Met Ala Thr5                   10                  15AAC GAT GGA CAT GGC GAA AAC TCG CCT TAT TTT GAT GGT TGG 282Asn Asp Gly His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp Gly Trp
 20                  25                  30AAG GCA TAT GAT AGT GAT CCT TAC CAT CCC ACC AGA AAT CCT 324Lys Ala Tyr Asp Ser Asp Pro Tyr His Pro Thr Arg Asn Pro
     35                  40                  45AAT GGT GTT ATA CAG ATG GGA CTC GCA GAA AAT CAG TTA TGC 366Asn Gly Val Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Leu Cys
         50                  55                  60TTT GAT TTG ATC GAG GAA TGG GTT CTG AAC AAT CCA GAG GCT 408Phe Asp Leu Ile Glu Glu Trp Val Leu Asn Asn Pro Glu Ala
             65                  70TCC ATT TGC ACA GCA GAA GGA GCG AAC AAA TTC ATG GAA GTT 450Ser Ile Cys Thr Ala Glu Gly Ala Asn Lys Phe Met Glu Val75                  80                  85GCT ATC TAT CAA GAT TAT CAT GGC TTG CCA GAG TTC AGA AAT 492Ala Ile Tyr Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro Glu Phe Arg Asn
 90                  95                 100GCT GTA GCA AGG TTC ATG GAG AAG GTG AGA GGT GAC AGA GTC 534Ala Val Ala Arg Phe Met Glu Lys Val Arg Gly Asp Arg Val
    105                 110                 115AAG TTC GAT CCC AAC CGC ATT GTG ATG AGT GGT GGG GCA ACC 576Lys Phe Asp Pro Asn Arg Ile Val Met Ser Gly Gly Ala Thr
        120                 125                 130GGA GCT CAT GAA ACT CTG GCC TTC TGT TTA GCT GAC CCT GAA 618Gly Ala His Glu Thr Leu Ala Phe Cys Leu Ala Asp Pro Glu
            135                 140GAT GCG TTT TTG GTA CCC ACA CCA TAT TAT CCA GGA TTT GAT 660Asp Ala Phe Leu Val Pro Thr Pro Tyr Tyr Pro Gly Phe Asp145                 150                 155CGG GAT TTG AGG TGG CGA ACA GGG ATG CAA CTT CTT CCA ATT 702Arg Asp Leu Arg Trp Arg Thr Gly Met Gln Leu Leu Pro Ile
160                 165                 170GTT TGT CGC AGC TCC AAT GAT TTT AAG GTC ACT AAA GAA TCC 744Val Cys Arg Ser Ser Asn Asp Phe Lys Val Thr Lys Glu Ser
    175                 180                 185ATG GAA GCT GCT TAT CAG AAA GCT CAA GAA GCC AAC ATC AGA 786Met Glu Ala Ala Tyr Gln Lys Ala Gln Glu Ala Asn Ile Arg
        190                 195                 200GTA AAG GGG TTC CTC TTA AAT AAT CCA TCA AAT CCA TTG GGA 828Val Lys Gly Phe Leu Leu Asn Asn Pro Ser Asn Pro Leu Gly
            205                 210ACT GTT CTT GAC AGG GAA ACT TTG ATT GAT ATA GTC ACA TTC 870Thr Val Leu Asp Arg Glu Thr Leu Ile Asp Ile Val Thr Phe215                 220                 225ATC AAT GAC AAA AAT ATC CAC TTG ATT TGT GAT GAG ATA TAT 912Ile Asn Asp Lys Asn Ile His Leu Ile Cys Asp Glu Ile Tyr
230                 235                 240TCT GCC ACC GTC TTC AGC CAG CCC GAA TTC ATC AGC ATC TCT 954Ser Ala Thr Val Phe Ser Gln Pro Glu Phe Ile Ser Ile Ser
    245                 250                 255GAA ATA ATT GAG CAT GAT GTT CAA TGC AAC CGT GAT CTC ATA 996Glu Ile Ile Glu His Asp Val Gln Cys Asn Arg Asp Leu Ile
        260                 265                 270CAT CTT GTG TAT AGC CTG TCC AAG GAC TTG GGC TTC CCT GGA 1038His Leu Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Leu Gly Phe Pro Gly
            275                 280TTC AGA GTT GGC ATT TTG TAT TCA TAT AAT GAC GCT GTT GTC 1080Phe Arg Val Gly Ile Leu Tyr Ser Tyr Asn Asp Ala Val Val285                 290                 295AGC TGT GCT AGA AAA ATG TCG AGT TTC GGC CTT GTT TCA ACA 1122Ser Cys Ala Arg Lys Met Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr
300                 305                 310CAA ACT CAG CAT CTG ATT GCA TCA ATG TTA TCG GAC GAA GCA 1164Gln Thr Gln His Leu Ile Ala Ser Met Leu Ser Asp Glu Ala
    315                 320                 325TTT ATG GAC AAA ATC ATT TCC ACG AGC TCA GAG AGA TTA GCT 1206Phe Met Asp Lys Ile Ile Ser Thr Ser Ser Glu Arg Leu Ala
        330                 335                 340GCA AGG CAT GGT CTT TTC ACA AGA GGA CTT GCT CAA GTA GGC 1248Ala Arg His Gly Leu Phe Thr Arg Gly Leu Ala Gln Val Gly
            345                 350ATT GGC ACC TTA AAA AGC AGT GCG GGC CTT TAT TTC TGG ATG 1290Ile Gly Thr Leu Lys Ser Ser Ala Gly Leu Tyr Phe Trp Met355                 360                 365GAC TTA AGG AGA CTC CTC AGG GAG TCC ACA TTT GAG GCA GAA 1332Asp Leu Arg Arg Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Glu Ala Glu
370                 375                 380ATG GAA CTT TGG AGG ATC ATA ATA CAT GAA GTC AAG CTC AAT 1374Met Glu Leu Trp Arg Ile Ile Ile His Glu Val Lys Leu Asn
    385                 390                 395GTT TCA CCA GGC TTA TCT TTC CAT TGC TCA GAA CCA GGA TGG 1416Val Ser Pro Gly Leu Ser Phe His Cys Ser Glu Pro Gly Trp
        400                 405                 410TTC AGA GTT TGC TTT GCC AAC ATG GAC GAC GAA AGT GTG AGA 1458Phe Arg Val Cys Phe Ala Asn Met Asp Asp Glu Ser Val Arg
            415                 420GTT GCT CTC AGA AGA ATC CAC AAA TTT GTG CTT GTT CAG GGC 1500Val Ala Leu Arg Arg Ile His Lys Phe Val Leu Val Gln Gly425                 430                 435AAG GCA ACA GAG CCA ACA ACT CCA AAG AGT CGC TGC GGA AGC 1542Lys Ala Thr Glu Pro Thr Thr Pro Lys Ser Arg Cys Gly Ser
440                 445                 450AGC AAA CTT CAA CTC AGC TTA TCT TTC CGC AGA TTG GAC GAA 1584Ser Lys Leu Gln Leu Ser Leu Ser Phe Arg Arg Leu Asp Glu
    455                 460                 465AGG GTG ATG GGA TCG CAT ATG ATG TCC CCT CAC TCC CCG ATG 1626Arg Val Met Gly Ser His Met Met Ser Pro His Ser Pro Met
        470                 475                 480GCT TCA CCT TTG GTT CGG GCT ACA TAAATCATTT CTTGATCAGA 1670Ala Ser Pro Leu Val Arg Ala Thr
            485TCATATAGCA   AAGATTCCTG   AGTAAATACT   CGAAACCCTT   TCTGGATAAC 1720TGAAAAGAGA   GTTGTTGATT   CTTTGCTGTA   TCATACAAAC   ACGTTACAGG 1770CATTTTTTGG   CCATCTGATG   CGTGCAAATT   GCATCAAATG   CTTTTATTAT 1820TGTCATATTC   ATTTGTGTAC   CTTGGTTTTC   CTTGCCCTTC   AGTCCTCCTT 1870GTTTTTTGTT   TCTTTGTTAT   TATTTTCTTC   CAGTTGATCA   GTTAAACGAA 1920GGAAGCTCAA   TTGTTTCAAG   CTATTAGTAA   CAGATCATTT   TGTAATAGCA 1970ATAGTTTCAG   GATTCTGAAA   TGAAAGTTTA   TCATTTTTCC   ATCATTTTAA 2020AAAAAAAAAA   AAAAAAAAAA                                        2040(2)SEQ ID NO:12信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：318个氨基酸残基
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅸ)性质：
    (A)名词/关键词：CDS
    (B)位置：46..1003
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:Met Ala Thr Phe Pro Leu Ile Asp Met Glu Lys Leu Asp Gly Glu1               5                   10                  15Glu Arg Ala Ala Thr Met Gly Val Ile Lys Asp Ala Cys Glu Ser
             20                  25                  30Trp Gly Phe Phe Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ser Asn Glu Leu
             35                  40                  45Met Asp Thr Val Glu Arg Leu Thr Lys Glu His Tyr Lys Lys Cys
             50                  55                  60Met Glu Leu Lys Phe Lys Glu Met Val Glu Ser Lys Glu Leu Glu
             65                  70                  75Ala Val Gln Thr Glu Ile Asn Asp Leu Asp Trp Glu Ser Thr Phe
             80                  85                  90Phe Leu Arg His Leu Pro Val Ser Asn Ile Ser Glu Val Pro Asp
             95                 100                 105Leu Asp Asp Glu Tyr Arg Lys Val Met Lys Glu Phe Ala Leu Gln
            110                 115                 120Leu Glu Lys Leu Ala Glu Leu Leu Leu Asp Leu Leu Cys Glu Asn
            125                 130                 135Leu Gly Leu Glu Lys Gly Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Tyr Gly Thr
            140                 145                 150Lys Gly Pro Thr Phe Gly Thr Lys Val Ser Asn Tyr Pro Pro Cys
            155                 160                 165Pro Arg Pro Glu Leu Ile Lys Gly Leu Arg Ala His Thr Asp Ala
            170                 175                 180Gly Gly Ile Ile Leu Leu Phe Gln Asp Asp Lys Val Ser Gly Leu
            185                 190                 195Gln Leu Leu Lys Asp Gly Glu Trp Val Asp Val Pro Pro Met Arg
            200                 205                 210His Ser Ile Val Ile Asn Ile Gly Asp Gln Leu Glu Val Ile Thr
            215                 220                 225Asn Gly Lys Tyr Lys Ser Val Met His Arg Val Ile Ala Gln Pro
            230                 235                 240Asp Gly Asn Arg Met Ser Leu Ala Ser Phe Tyr Asn Pro Gly Ser
            245                 250                 255Asp Ala Val Ile Tyr Pro Ala Pro Ala Leu Val Glu Lys Glu Ala
            260                 265                 270Glu Asp Lys Gln Ile Tyr Pro Lys Phe Val Phe Glu Asp Tyr Met
            275                 280                 285Lys Leu Tyr Ala Gly Leu Lys Phe Gln Ala Lys Glu Pro Arg Phe
            290                 295                 300Glu Ala Met Lys Ala Val Glu Ser Thr Val Asn Leu Gly Pro Ile
            305                 310                 315Ala Thr Val
    318(2)SEQ ID NO:13信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：1320个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA至mRNA
(ⅸ)性质：
    (A)名词/关键词：CDS
    (B)位置：46..1003(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:TGTAAACGAA   GCATAAGCAC   AAGCAAACAC   AAACTAGAAA   GAGAG   ATG 48
                                                        Met
                                                         1GCT ACA TTC CCC CTA ATC GAC ATG GAG AAG CTT GAC GGT GAA     90Ala Thr Phe Pro Leu Ile Asp Met Glu Lys Leu Asp Gly Glu
         5                   10                  15GAG AGG GCT GCC ACT ATG GGA GTC ATA AAA GAT GCT TGT GAA     132Glu Arg Ala Ala Thr Met Gly Val Ile Lys Asp Ala Cys Glu
             20                  25AGC TGG GGC TTC TTT GAG GTG TTG AAT CAT GGG ATA TCT AAT     174Ser Trp Gly Phe Phe Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ser Asn30                   35                  40GAG CTC ATG GAC ACA GTG GAG AGG CTA ACA AAG GAG CAT TAC     216Glu Leu Met Asp Thr Val Glu Arg Leu Thr Lys Glu His Tyr
 45                  50                  55AAG AAA TGT ATG GAA CTA AAG TTC AAG GAA ATG GTG GAG AGC     258Lys Lys Cys Met Glu Leu Lys Phe Lys Glu Met Val Glu Ser
     60                  65                  70AAG GAA TTG GAA GCT GTT CAG ACT GAG ATC AAT GAT TTG GAC     300Lys Glu Leu Glu Ala Val Gln Thr Glu Ile Asn Asp Leu Asp
         75                  80                  85TGG GAA AGT ACC TTC TTC TTG CGC CAT CTT CCT GTT TCC AAC 342Trp Glu Ser Thr Phe Phe Leu Arg His Leu Pro Val Ser Asn
             90                  95ATC TCA GAA GTC CCT GAT CTT GAT GAT GAA TAC AGA AAG GTT 384Ile Ser Glu Val Pro Asp Leu Asp Asp Glu Tyr Arg Lys Val100                 105                 110ATG AAG GAA TTT GCG TTG CAA CTT GAG AAA CTA GCA GAG CTC 426Met Lys Glu Phe Ala Leu Gln Leu Glu Lys Leu Ala Glu Leu
115                 120                 125CTG TTG GAC TTG CTA TGC GAG AAC CTT GGC CTA GAG AAA GGC 468Leu Leu Asp Leu Leu Cys Glu Asn Leu Gly Leu Glu Lys Gly
    130                 135                 140TAT CTG AAG AAA GCC TTC TAT GGC ACC AAA GGA CCA ACC TTT 510Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Tyr Gly Thr Lys Gly Pro Thr Phe
        145                 150                 155GGC ACC AAA GTC AGC AAT TAC CCT CCA TGC CCT CGT CCA GAA 552Gly Thr Lys Val Ser Asn Tyr Pro Pro Cys Pro Arg Pro Glu
            160                 165CTG ATC AAG GGC CTC CGG GCA CAC ACC GAT GCC GGC GGC ATC 594Leu Ile Lys Gly Leu Arg Ala His Thr Asp Ala Gly Gly Ile170                 175                 180ATC CTG CTG TTC CAG GAT GAC AAG GTC AGC GGT CTC CAG CTC 636Ile Leu Leu Phe Gln Asp Asp Lys Val Ser Gly Leu Gln Leu
185                 190                 195CTC AAG GAT GGT GAA TGG GTG GAT GTT CCG CCT ATG CGC CAC 678Leu Lys Asp Gly Glu Trp Val Asp Val Pro Pro Met Arg His
    200                 205                 210TCC ATT GTA ATC AAC ATC GGC GAC CAA CTT GAG GTA ATC ACA 720Ser Ile Val Ile Asn Ile Gly Asp Gln Leu Glu Val Ile Thr
        215                 220                 225AAT GGA AAA TAC AAG AGT GTG ATG CAC CGG GTG ATA GCT CAA 762Asn Gly Lys Tyr Lys Ser Val Met His Arg Val Ile Ala Gln
            230                 235CCA GAT GGG AAC AGA ATG TCA CTA GCA TCA TTC TAC AAT CCA   804Pro Asp Gly Asn Arg Met Ser Leu Ala Ser Phe Tyr Asn Pro240                 245                 250GGA AGT GAT GCA GTG ATC TAT CCA GCA CCG GCA TTG GTT GAG   846Gly Ser Asp Ala Val Ile Tyr Pro Ala Pro Ala Leu Val Glu
255                 260                 265AAA GAG GCA GAG GAC AAG CAG ATA TAT CCC AAG TTT GTG TTC   888Lys Glu Ala Glu Asp Lys Gln Ile Tyr Pro Lys Phe Val Phe
    270                 275                 280GAG GAC TAC ATG AAG CTC TAT GCT GGC CTT AAG TTC CAA GCT   930Glu Asp Tyr Met Lys Leu Tyr Ala Gly Leu Lys Phe Gln Ala
        285                 290                 295AAA GAG CCC AGG TTT GAA GCC ATG AAG GCC GTG GAA AGC ACC   972Lys Glu Pro Arg Phe Glu Ala Met Lys Ala Val Glu Ser Thr
            300                 305GTA AAC TTG GGT CCA ATC GCA ACT GTT TGAGATAATA CACGCTTTGA 1019Val Asn Leu Gly Pro Ile Ala Thr Val310                 315TCTGCTGCTG TCTTATAATG CGCGTTTGCG TAATCATATC CTAGCATAGT    1069ATATCTGAGA TCTGAGTCTG TATTGTGGTG TGAGTTTGGT TTAGCCCCTT    1119GTTAATGCTT GGATTGGACT AGTTAAATGT GGAGCTGGTT TGTTAGATAA    1169GATAGTCTTG CCAGGATCTT TGAGTAAATA TGATTCTGCG GAAGTCTGCG    1219GTGAATGATA ACGTGTAAAG CAATCCGAAA GTTACCTTTC TGGGGCTTTG    1269TCATATGCAA TGGAGAAGGA ATCTTCCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA    1319A                                                         1320

Claims (33)

1．一种来自小果咖啡的基本上纯的ACC合成酶，它基本上由氨基酸序列SEQ ID NO:10所组成。
2．基本上纯的、编码小果咖啡所产生的ACC合成酶表达的核酸序列，它含有SEQ.ID.NO:11的序列。
3．权利要求2的基本上纯的、编码小果咖啡所产生的ACC合成酶表达的核酸序列，其中所述核酸序列仅限于SEQ.ID.NO.11的诸编码区。
4．一种控制小果咖啡成熟的方法，包含：
a)用与DNA序列SEQ.ID.NO.11反义的一段DNA序列转化咖啡植物；
b)培养上述a)中已被DNA序列转化的植物；和
c)在咖啡果成熟后，将外源性乙烯施用到该已被转化的植物上。
5．权利要求4的用于控制小果咖啡成熟的方法，其中用于转化的所述DNA序列仅限于与SEQ.ID.NO.11的编码区反义的一段序列。
6．权利要求4或5的用于控制果实成熟的方法，其中将气态乙烯施用到整株植物上，以使基本上全部果实同时成熟。
7．一种来自小果咖啡的基本上纯的ACC氧化酶，它基本上由氨基酸序列SEQ.ID.NO.12所组成。
8．基本上纯的、编码小果咖啡ACC氧化酶表达的核酸序列，它含有SEQ.ID.NO.13的序列。
9．权利要求8的基本上纯的、编码小果咖啡所产生的ACC氧化酶表达的核酸序列，其中所述核酸序列仅限于SEQ.ID.NO.13的诸编码区。
10．一种控制小果咖啡成熟的方法，包括：
a)用与DNA序列SEQ.ID.NO.13反义的一段DNA序列转化咖啡植物；
b)培养上述a)中已被DNA序列转化的植物；和
c)在咖啡果成熟后，将外源性乙烯施用到该已被转化的植物上。
11．权利要求10的控制小果咖啡成熟的方法，其中用于转化的所述DNA序列仅限于与SEQ.ID.NO.13的编码区反义的一段序列。
12．权利要求9和10的控制果实成熟的方法，其中将气态乙烯施用到整株植物上，以使基本上全部果实同时成熟。
13．ACC合成酶表达有所抑制的咖啡植物。
14．ACC氧化酶表达有所抑制的咖啡植物。
15．ACC合成酶表达和ACC氧化酶表达均有所抑制的咖啡植物。
16．一种咖啡植物，它含有编码转录一种mRNA的一种DNA序列，该mRNA与编码表达ACC合成酶的mRNA反义。
17．来自权利要求16的咖啡植物的咖啡果。
18．来自权利要求16的咖啡植物的咖啡豆。
19．一种咖啡植物，它含有编码转录一种mRNA的一种DNA序列，该mRNA与编码表达ACC氧化酶的mRNA反义。
20．来自权利要求19的咖啡植物的咖啡果。
21．来自权利要求19的咖啡植物的咖啡豆。
22．一种咖啡植物，含有：
(ⅰ)第一种DNA序列，该DNA序列编码转录的mRNA与编码表达ACC合成酶的mRNA反义，以及
(ⅱ)第二种DNA序列，该DNA序列编码转录的mRNA与编码表达ACC氧化酶的mRNA反义。
23．来自权利要求22的咖啡植物的咖啡果。
24．来自权利要求22的咖啡植物的咖啡豆。
25．一种咖啡植物，它含有与SEQ ID NO:11所示DNA序列的全部或部分反义的一种DNA序列。
26．一种咖啡植物，它含有与SEQ ID NO:13所示DNA序列的全部或部分反义的一种DNA序列。
27．一种咖啡植物，含有：
(ⅰ)与SEQ ID NO:11所示DNA序列的全部或部分反义的第一种DNA序列，和
(ⅱ)与SEQ ID NO:13所示DNA序列的全部或部分反义的第二种DNA序列。
28．一种咖啡植物，它通过向该植物基因组中插入一种DNA序列的方法产生，该DNA序列所编码转录的mRNA与编码表达ACC合成酶的mRNA反义。
29．一种咖啡植物，它通过向该植物基因组中插入一种DNA序列的方法产生，该DNA序列所编码转录的mRNA与编码表达ACC氧化酶的mRNA反义。
30．一种咖啡植物，它通过向该植物基因组中插入下述DNA序列的方法产生：
(ⅰ)一种DNA序列，其编码转录的mRNA与编码表达ACC合成酶的mRNA反义，和
(ⅱ)另一种DNA序列，其编码转录的mRNA与编码表达ACC氧化酶的mRNA反义。
31．用于用编码转录一种mRNA的一种DNA序列转化咖啡植物的方法，该mRNA与编码表达ACC合成酶的mRNA反义，该方法包括以下诸步骤：
提供一种转化载体，该载体含有编码表达ACC合成酶的一种DNA序列，其中该DNA序列以相反方向插入到该转化载体中；和
将该转化载体插入到该咖啡植物的组织中，其中该反方向的DNA序列在此后即插入到该咖啡植物的基因组中。
32．用于用编码转录一种mRNA的一种DNA序列转化咖啡植物的方法，该mRNA与编码表达ACC氧化酶的mRNA反义，该方法包括以下诸步骤：
提供一种转化载体，该载体含有编码表达ACC氧化酶的一种DNA序列，其中该DNA序列以相反方向插入到该转化载体中；和
将该转化载体插入到该咖啡植物的组织中，其中该反方向的DNA序列在此后即插入到该咖啡植物的基因组中。
33．用于用下述DNA序列转化咖啡植物的方法：
(ⅰ)第一种DNA序列，它所编码转录的mRNA与编码表达ACC合成酶的mRNA反义，和
(ⅱ)第二种DNA序列，它所编码转录的mRNA与编码表达ACC氧化酶的mRNA反义，
该方法包括以下诸步骤：
提供第一种转化载体，该载体含有编码表达ACC合成酶的第一种DNA序列，其中所述第一种DNA序列以相反方向插入到所述第一种转化载体中；
提供第二种转化载体，该载体含有编码表达ACC氧化酶的第二种DNA序列，其中所述第二种DNA序列以相反方向插入到所述第二种转化载体中；和
将第一种转化载体插入到该咖啡植物的组织中，其中该反方向的第一种DNA序列在此后即插入到该咖啡植物的基因组中；和
将第二种转化载体插入到该咖啡植物的组织中，其中该反方向的第二种DNA序列在此后即插入到该咖啡植物的基因组中。
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