JP2002543842A - 酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼと相互作用する新規なタンパク質をコードするヒマから単離された遺伝子 - Google Patents
酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼと相互作用する新規なタンパク質をコードするヒマから単離された遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
オレイン酸（１８：１Δ９）の分子にヒドロキシル基を導入して、リシノール酸（１２−ＯＨ，１８：１Δ９）に転換する反応に対して触媒作用を発揮する酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼと相互作用し得るタンパク質をコードするヒマ（Ricinus communis）から単離された遺伝子の単離及び特徴表示を開示する。
Description
【０００１】 本発明は、オレイン酸分子にヒドロキシル基を導入して、オレイン酸をリシノ
ール酸に変換する反応について触媒作用を示す酵素オレエート１２−ヒドロキシ
ラーゼと相互作用するタンパク質をコードするヒマ（Ricinus communis）の遺伝
子の同定及び特質表示に係る。
ール酸に変換する反応について触媒作用を示す酵素オレエート１２−ヒドロキシ
ラーゼと相互作用するタンパク質をコードするヒマ（Ricinus communis）の遺伝
子の同定及び特質表示に係る。
【０００２】 本発明は、脂肪酸の変性された組成を持つトランスジェニック植物を産生する
手段及び方法にも係る。
手段及び方法にも係る。
【０００３】 リシノール酸（１２−ヒドロキシ−９−オクタデセン酸）はモノヒドロキシル
化脂肪酸であり、その市販されている唯一の源は、ヒマの熟した実の内乳におい
て合成されるシードオイルであり、リシノール酸はヒドロキシル化脂肪酸の約９
０％を占める。
化脂肪酸であり、その市販されている唯一の源は、ヒマの熟した実の内乳におい
て合成されるシードオイルであり、リシノール酸はヒドロキシル化脂肪酸の約９
０％を占める。
【０００４】 放射性トレーサーによるインビボでの研究によれば、ヒマの未熟の内乳では、
オレイン酸の二重結合のヒドロキシル基による直接置換反応によってリシノール
酸（「リシノレート」としても知られている）が合成されることが示されている
（Morris, L.J., 1967, Biochem. Biophys. Res. Commun., 29, 311-315）。こ
の反応は、酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼ（その活性は小胞体と関連す
ると思われる）によって触媒作用を受ける。
オレイン酸の二重結合のヒドロキシル基による直接置換反応によってリシノール
酸（「リシノレート」としても知られている）が合成されることが示されている
（Morris, L.J., 1967, Biochem. Biophys. Res. Commun., 29, 311-315）。こ
の反応は、酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼ（その活性は小胞体と関連す
ると思われる）によって触媒作用を受ける。
【０００５】 酵素によるテストでは、オレエート１２−ヒドロキシラーゼ用の基質は、レシ
チンにより又は他のリン脂質によりエステル化されたオレイン酸であること；エ
ステル化リシノレートは、分子状酸素、NAD(P)H及びチトクロームｂ５の存在下
で酸素化された脂肪酸に特異的なホスホリパーゼＡの介入によって、脂質複合体
から放出されることが示されている。NAD(P)Hは、ヒドロキシラーゼ反応用の中
間電子供与体であるチトクロームｂ５を還元するために要求される（Bafor M.ら
, (1991), Biochem. J., 280, 507-514；Smith M.A.ら, (1992), Biochem. J.,
287, 141-144）。ついで、ヒドロキシル化脂肪酸は、Kennedy経路によって、ト
リアシルグリセロールの経路に移され、ここで蓄積する。
チンにより又は他のリン脂質によりエステル化されたオレイン酸であること；エ
ステル化リシノレートは、分子状酸素、NAD(P)H及びチトクロームｂ５の存在下
で酸素化された脂肪酸に特異的なホスホリパーゼＡの介入によって、脂質複合体
から放出されることが示されている。NAD(P)Hは、ヒドロキシラーゼ反応用の中
間電子供与体であるチトクロームｂ５を還元するために要求される（Bafor M.ら
, (1991), Biochem. J., 280, 507-514；Smith M.A.ら, (1992), Biochem. J.,
287, 141-144）。ついで、ヒドロキシル化脂肪酸は、Kennedy経路によって、ト
リアシルグリセロールの経路に移され、ここで蓄積する。
【０００６】 ヒドロキシル基が存在するため、リシノール酸は最も万能な天然産物の１つで
あり、多くの工業的用途及び食物としての用途を有する。特に、リシノール酸は
、塗料、ナイロン−１１の如き重合体、医薬品、潤滑剤、化粧品、樹脂及び他の
物質の製造において使用されている。
あり、多くの工業的用途及び食物としての用途を有する。特に、リシノール酸は
、塗料、ナイロン−１１の如き重合体、医薬品、潤滑剤、化粧品、樹脂及び他の
物質の製造において使用されている。
【０００７】 しかしながら、リシノール酸の産生は、植物ヒマの栽培が気候の変化に影響さ
れ易いこと及びヒマの実に存在するアレルゲンであるレシチンの毒性のため制限
される。
れ易いこと及びヒマの実に存在するアレルゲンであるレシチンの毒性のため制限
される。
【０００８】 気候の変化に対してより耐性であり、毒物質を含有しない植物においてリシノ
ール酸を生産することができれば、より大規模にかつ簡単に生産でき、この酸自
体の用途が拡大される。
ール酸を生産することができれば、より大規模にかつ簡単に生産でき、この酸自
体の用途が拡大される。
【０００９】 この目的のため、最近になって、酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼをコ
ードする遺伝子が単離され、ニコチアナ・タバキュウム（Nicotiana tabacum）
、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）、リヌム・ウジタチシミ
ウム（Linum usitatissimum）及びブラッシカ・ナプス（Brassica napus）の如
き植物を形質転換するために使用されている。
ードする遺伝子が単離され、ニコチアナ・タバキュウム（Nicotiana tabacum）
、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）、リヌム・ウジタチシミ
ウム（Linum usitatissimum）及びブラッシカ・ナプス（Brassica napus）の如
き植物を形質転換するために使用されている。
【００１０】 しかしながら、いずれの場合にも、脂肪酸の含量が変化されていることが観察
されるものの、リシノール酸の量の増大は、ゼロではないが、低いものである（
Broun P. 及びSomerville C., 1997, Plant Physiol, 113, 933-942）。
されるものの、リシノール酸の量の増大は、ゼロではないが、低いものである（
Broun P. 及びSomerville C., 1997, Plant Physiol, 113, 933-942）。
【００１１】 複製、転写又は代謝の如き多くの生物学的プロセスでは、酵素複合体（その作
用は、各種のタンパク質サブユニットの協力作用と相関する）が介在することが
知られている。
用は、各種のタンパク質サブユニットの協力作用と相関する）が介在することが
知られている。
【００１２】 例えば、細菌ブルコールデリア・セパチア（Burkholderia cepacia）から単離
された酵素トルエン２−モノオキシゲナーゼの活性に関する研究によれば、脱飽
和プロセスにおいて、各種のタンパク質が可及的に介在するとの証拠が観察され
ている（Newman L.M.ら, 1995, Biochemistry, 34, 14066-14076）。
された酵素トルエン２−モノオキシゲナーゼの活性に関する研究によれば、脱飽
和プロセスにおいて、各種のタンパク質が可及的に介在するとの証拠が観察され
ている（Newman L.M.ら, 1995, Biochemistry, 34, 14066-14076）。
【００１３】 従って、植物性脂肪酸のヒドロキシラーゼは多成分系の一部を形成でき、また
、ヒマの酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性は、他
の補助因子又はタンパク質の介在を必要とすると考えられている。
、ヒマの酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性は、他
の補助因子又はタンパク質の介在を必要とすると考えられている。
【００１４】 新たに、酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼと相互作用し得る新規なタン
パク質をコードするヒマの遺伝子が同定、特質表示された。この遺伝子は、リシ
ノール酸の生成を促進するため、酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼを含有
する植物の形質転換プログラムにおいて使用される。
パク質をコードするヒマの遺伝子が同定、特質表示された。この遺伝子は、リシ
ノール酸の生成を促進するため、酵素オレエート１２−ヒドロキシラーゼを含有
する植物の形質転換プログラムにおいて使用される。
【００１５】 これによれば、本発明の目的は、オレエート１２−ヒドロキシラーゼと相互作
用するタンパク質をコードするクローン化及び配列決定された遺伝子を提供する
ことにある。
用するタンパク質をコードするクローン化及び配列決定された遺伝子を提供する
ことにある。
【００１６】 本発明の第２の目的は、宿主細胞における発現用の前記遺伝子を含む組換ベク
ターを提供することにある。
ターを提供することにある。
【００１７】 本発明の他の目的は、前記ベクターによって形質転換した宿主微生物を提供す
ることにある。
ることにある。
【００１８】 本発明のさらに他の目的は、前記ベクターで形質転換したトランスジェニック
植物に関する。
植物に関する。
【００１９】 本発明の他の目的は、下記の記載及び実施例から明白になるであろう。
【００２０】 ここで、添付図面について簡単に説明する。
【００２１】 図１は、制限酵素EcoRIによって分解し、３２ＰでマークしたプラスミドpTarg
lの762bpフラグメントとハイブリダイズした各種の種のゲノムDNAのサザンブロ
ットの結果を示す図である。ハイブリッド形成のシグナルは、ヒマにおいてのみ
明白なシングルコピーの遺伝子に対応する。
lの762bpフラグメントとハイブリダイズした各種の種のゲノムDNAのサザンブロ
ットの結果を示す図である。ハイブリッド形成のシグナルは、ヒマにおいてのみ
明白なシングルコピーの遺伝子に対応する。
【００２２】 図２は、各種発育段階（受粉後、１０、２０、３０、３５及び４０日(受粉後
の日数：DAP)）のヒマの実、ヒマの葉、茎及び根から抽出されたメッセンジャー
RNAのノーザンブロットの結果を示す図である。フィルターを、３２Ｐでマーク
したプラスミドpTarglの762bpフラグメントとハイブリダイズさせた。分子量約
１.０Kbを持つmRANの存在が、１０DAP及び２０DAPにおける未熟の実及び葉に存
在するより大きなサイズを持つトランスクリプトにおいて観察される。
の日数：DAP)）のヒマの実、ヒマの葉、茎及び根から抽出されたメッセンジャー
RNAのノーザンブロットの結果を示す図である。フィルターを、３２Ｐでマーク
したプラスミドpTarglの762bpフラグメントとハイブリダイズさせた。分子量約
１.０Kbを持つmRANの存在が、１０DAP及び２０DAPにおける未熟の実及び葉に存
在するより大きなサイズを持つトランスクリプトにおいて観察される。
【００２３】 図３は、各種発育段階（１０、２０、３０、３５及び４０DAP）のヒマの実、
ヒマの葉、茎及び根から抽出されたメッセンジャーRNAのノーザンブロットの結
果を示す図である。フィルターを、３２Ｐでマークしたオレエート１２−ヒドロ
キシラーゼの1216bpフラグメントとハイブリダイズさせた。約１.６Kbのハイブ
リッド形成シグナルが、２０、３０、３５及び４０DAPにおける未熟の実に存在
する。
ヒマの葉、茎及び根から抽出されたメッセンジャーRNAのノーザンブロットの結
果を示す図である。フィルターを、３２Ｐでマークしたオレエート１２−ヒドロ
キシラーゼの1216bpフラグメントとハイブリダイズさせた。約１.６Kbのハイブ
リッド形成シグナルが、２０、３０、３５及び４０DAPにおける未熟の実に存在
する。
【００２４】 目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の単離は、公知の技術によっ
て実行される。
て実行される。
【００２５】 特に、未熟のヒマの実においてオレエート１２−ヒドロキシラーゼと相互作用
する新規なタンパク質を単離するために、既知のタンパク質と相互作用するタン
パク質をコードする新規な遺伝子の確認を可能にする真核生物システム（サッカ
ロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)(S. セレビシアエ)）であ
るStratageneの「HybridZap ２ ハイブリッドベクター」を使用した（Fields S.
ら, 1989, Nature, 340, 245-246）。このシステムは、S. セレビシアエの転写
活性因子GAL4（ガラクトースの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を
調節する）の特性を発揮する。
する新規なタンパク質を単離するために、既知のタンパク質と相互作用するタン
パク質をコードする新規な遺伝子の確認を可能にする真核生物システム（サッカ
ロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)(S. セレビシアエ)）であ
るStratageneの「HybridZap ２ ハイブリッドベクター」を使用した（Fields S.
ら, 1989, Nature, 340, 245-246）。このシステムは、S. セレビシアエの転写
活性因子GAL4（ガラクトースの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を
調節する）の特性を発揮する。
【００２６】 GAL4は、分離可能であり、かつその活性にとって機能的に必須である２つのド
メイン；DNAの特殊な配列（UAS：上流活性化配列）に連結するＮ−末端ドメイン
（結合ドメイン：ＢＤ）及び転写活性に必要である酸領域を含有するＣ−末端ド
メイン（活性化ドメイン：ＡＤ）からなる。
メイン；DNAの特殊な配列（UAS：上流活性化配列）に連結するＮ−末端ドメイン
（結合ドメイン：ＢＤ）及び転写活性に必要である酸領域を含有するＣ−末端ド
メイン（活性化ドメイン：ＡＤ）からなる。
【００２７】 使用したシステムにより、GAL4の機能性ドメイン、すなわち、ベイトとして作
用する既知タンパク質と融合した結合ドメイン及び発現ライブラリーからの未知
タンパク質（ターゲット）と融合した活性化ドメインを含有する２つのハイブリ
ッドタンパク質が生成される。
用する既知タンパク質と融合した結合ドメイン及び発現ライブラリーからの未知
タンパク質（ターゲット）と融合した活性化ドメインを含有する２つのハイブリ
ッドタンパク質が生成される。
【００２８】 既知タンパク質がターゲットタンパク質と相互作用して、タンパク質−タンパ
ク質複合体を形成する場合には、GAL4の２つの機能性ドメインは最適条件下に置
かれ、レポーター遺伝子lac-Zの転写を活性化する（その生産物は、呈色反応に
よって示される）。
ク質複合体を形成する場合には、GAL4の２つの機能性ドメインは最適条件下に置
かれ、レポーター遺伝子lac-Zの転写を活性化する（その生産物は、呈色反応に
よって示される）。
【００２９】 「ホット−フェノール」法を使用して、ヒマの未熟の実から全RNAを抽出し、
ポリアデニレートメッセンジャーRNA（mRNA）をオリゴ−dTカラム（Pharmacia）
で単離した。続いて、プライマーとして、遺伝子の翻訳開始及び停止コドンを含
むコード領域の側に位置する配列を有するオリゴヌクレオチドのペアを使用して
、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術をmRNAに適用することによって、酵素オレ
エート１２−ヒドロキシラーゼをコードするcDNAを調製した。
ポリアデニレートメッセンジャーRNA（mRNA）をオリゴ−dTカラム（Pharmacia）
で単離した。続いて、プライマーとして、遺伝子の翻訳開始及び停止コドンを含
むコード領域の側に位置する配列を有するオリゴヌクレオチドのペアを使用して
、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術をmRNAに適用することによって、酵素オレ
エート１２−ヒドロキシラーゼをコードするcDNAを調製した。
【００３０】 ターゲットタンパク質が、検査した全タンパク質又はその部分と相互作用でき
るため、結合ドメインをコードする配列を含有するプラスミドpBD-GAL4において
、オレエート１２−ヒドロキシラーゼをコードする全遺伝子及びその末端領域５
’及び３’の両方がクローン化されたことが明白である。
るため、結合ドメインをコードする配列を含有するプラスミドpBD-GAL4において
、オレエート１２−ヒドロキシラーゼをコードする全遺伝子及びその末端領域５
’及び３’の両方がクローン化されたことが明白である。
【００３１】 ３つのDNAインサートを、初めに、フォワードプライマー用の制限部位EcoRI及
びリバースプライマー用の制限部位SalIを有する好適なプライマーにて増幅し、
上記酵素にて分解し、予め同じ酵素によって分解しておいたベクターpBD-GALA4
に直接挿入し、コンピテント細胞エピキュリアン・コリ（Epicurian coli）XL1-
Blueに導入した。
びリバースプライマー用の制限部位SalIを有する好適なプライマーにて増幅し、
上記酵素にて分解し、予め同じ酵素によって分解しておいたベクターpBD-GALA4
に直接挿入し、コンピテント細胞エピキュリアン・コリ（Epicurian coli）XL1-
Blueに導入した。
【００３２】 予期したフラグメントを含有する組換クローンを制限分析によって特徴付けし
、それらのアイデンティティーを、Taq色素デオキシターミネーターサイクル配
列決定キッド（Perkin Elmer）を使用して行なう配列反応によって確認し、自動
シーケンサーにて分析した。ついで、cDNAライブラリーを、λHybridZapファー
ジベクター（GALA4の活性化ドメイン及びヒマのタンパク質の一貫するハイブリ
ッドタンパク質を発現する）において、ヒマの未熟の実から調製した。
、それらのアイデンティティーを、Taq色素デオキシターミネーターサイクル配
列決定キッド（Perkin Elmer）を使用して行なう配列反応によって確認し、自動
シーケンサーにて分析した。ついで、cDNAライブラリーを、λHybridZapファー
ジベクター（GALA4の活性化ドメイン及びヒマのタンパク質の一貫するハイブリ
ッドタンパク質を発現する）において、ヒマの未熟の実から調製した。
【００３３】 実際には、キットの販売者（Stratagene）が指示するプロトコルに従って操作
するダブルフィラメントcDNAの合成に、ヒマのポリアデニレートmRNAを使用した
。
するダブルフィラメントcDNAの合成に、ヒマのポリアデニレートmRNAを使用した
。
【００３４】 ついで、ライブラリーの構築に有用である高分子量を有するcDNAの分子を、低
分子量のもの（合成が不完全である分子のフラクション）から分離した。
分子量のもの（合成が不完全である分子のフラクション）から分離した。
【００３５】 高分子量cDNAのフラクションをλHybridZapファージベクターに挿入し、ファ
ージのヘッド及びテール用のタンパク質を含有するパッキングエキストラクトに
てパックした。生成されたライブラリー中に存在するインサートのサイズを、PC
Rによってチェックし、ベクターpAD-GAL4用の特殊なプライマーペアにて増幅し
た。得られた結果は、cDNAライブラリーのフラグメントが平均サイズ１.４Kbを
有することを示した。
ージのヘッド及びテール用のタンパク質を含有するパッキングエキストラクトに
てパックした。生成されたライブラリー中に存在するインサートのサイズを、PC
Rによってチェックし、ベクターpAD-GAL4用の特殊なプライマーペアにて増幅し
た。得られた結果は、cDNAライブラリーのフラグメントが平均サイズ１.４Kbを
有することを示した。
【００３６】 増幅後、ラムダファージにおけるライブラリーを、インビボでの切断によって
、プラスミドライブラリーに移した。
、プラスミドライブラリーに移した。
【００３７】 続いて、ライブラリーを、大腸菌（E. coli）の菌株 XLORにおいて増殖し、プ
ラスミドDNAを抽出し、別の同時形質転換プロセスにおいて、レポーター遺伝子h
is3及びlacZを有する酵母細胞（菌株YGR-2）を使用して、全遺伝子及びオレエー
ト１２−ヒドロキシラーゼの部分を含有するベイトプラスミドから抽出されたDN
Aにて同時形質転換した。
ラスミドDNAを抽出し、別の同時形質転換プロセスにおいて、レポーター遺伝子h
is3及びlacZを有する酵母細胞（菌株YGR-2）を使用して、全遺伝子及びオレエー
ト１２−ヒドロキシラーゼの部分を含有するベイトプラスミドから抽出されたDN
Aにて同時形質転換した。
【００３８】 発現ライブラリーによるオレエート１２−ヒドロキシラーゼの３つの配列のテ
ストから、lacZ遺伝子の活性の典型的な青色を有する酵母のコロニーが確認され
、このようにして、ベイトタンパク質と未知タンパク質との相互作用が示された
。
ストから、lacZ遺伝子の活性の典型的な青色を有する酵母のコロニーが確認され
、このようにして、ベイトタンパク質と未知タンパク質との相互作用が示された
。
【００３９】 続くこれらコロニーに関する分析により、両レポーター遺伝子の転写を活性化
させた「陽性」の同時形質転換酵母クローンが確認された。これは、オレエート
１２−ヒドロキシラーゼのＮ−末端領域と未知のターゲットタンパク質とが完全
に相互作用したことを示している。
させた「陽性」の同時形質転換酵母クローンが確認された。これは、オレエート
１２−ヒドロキシラーゼのＮ−末端領域と未知のターゲットタンパク質とが完全
に相互作用したことを示している。
【００４０】 この陽性の酵母クローンから単離したプラスミドを、符号pTarg1で示している
。
。
【００４１】 オレエート１２−ヒドロキシラーゼと確認された新規タンパク質との間の相互
作用の特異性を、それぞれ、全オレエート１２−ヒドロキシラーゼ遺伝子及びこ
の遺伝子の５’末端部分を含有するベイトプラスミドによるサッカロミセス・セ
レビシアエ（S. cerevisiae）の酵母細胞YRG-2における同時形質転換試験によっ
て確認した。２つの配列のテストから、lacZ遺伝子の活性の典型的な青色を有す
る２つの酵母コロニーが確認された（各同時形質転換プロセスに関して１つ）。
作用の特異性を、それぞれ、全オレエート１２−ヒドロキシラーゼ遺伝子及びこ
の遺伝子の５’末端部分を含有するベイトプラスミドによるサッカロミセス・セ
レビシアエ（S. cerevisiae）の酵母細胞YRG-2における同時形質転換試験によっ
て確認した。２つの配列のテストから、lacZ遺伝子の活性の典型的な青色を有す
る２つの酵母コロニーが確認された（各同時形質転換プロセスに関して１つ）。
【００４２】 ベイトタンパク質の存在及びサイズを確認ため及び確認されたタンパク質Targ
12をコードする遺伝子の存在及びサイズを確認するため、結合ドメイン領域用及
び活性化ドメイン領域用の特異なプライマーを使用して、レポーター遺伝子lacZ
の発現テストで陽性を示した酵母コロニーから抽出したDNAについてPCR分析を行
った。
12をコードする遺伝子の存在及びサイズを確認するため、結合ドメイン領域用及
び活性化ドメイン領域用の特異なプライマーを使用して、レポーター遺伝子lacZ
の発現テストで陽性を示した酵母コロニーから抽出したDNAについてPCR分析を行
った。
【００４３】 得られた増幅産生物の確実性は、予期したフラグメントのサイズだけでなく、
該フラグメントについて行ったハイブリッド形成分析によっても示された。
該フラグメントについて行ったハイブリッド形成分析によっても示された。
【００４４】 さらに、pTarg1のプラスミドDNAを酵母コロニーから単離し、cDNAインサート
を「Double GeneClean」キット（BIO 101 Inc.）にて精製した。精製したフラグ
メントを、続いて、ベクターpGET-T（Promega）においてクローン化し、ついで
、大腸菌（E. coli）DH5aのコンピテント細胞に導入した。
を「Double GeneClean」キット（BIO 101 Inc.）にて精製した。精製したフラグ
メントを、続いて、ベクターpGET-T（Promega）においてクローン化し、ついで
、大腸菌（E. coli）DH5aのコンピテント細胞に導入した。
【００４５】 組換クローンから単離したプラスミドDNAを、自動シーケンサーABI 373A（Per
kin Elmer）を使用して、Taq色素デオキシターミネーターサイクル配列決定キッ
ド（Perkin Elmer）による配列分析に供した。
kin Elmer）を使用して、Taq色素デオキシターミネーターサイクル配列決定キッ
ド（Perkin Elmer）による配列分析に供した。
【００４６】 プラスミドpTarg1のインサートのDNAについて行った配列分析により、単離さ
れたフラグメントはサイズ762bpを有し、前に５’末端の７５bpを持ち、後ろに
３’末端の147bpを持つ540bpのオープンリーディングフレーム（ODF）を有する
ことが認められた。ORFは、分子量19.8KDoを持つアミノ酸180個のタンパク質を
コードする。
れたフラグメントはサイズ762bpを有し、前に５’末端の７５bpを持ち、後ろに
３’末端の147bpを持つ540bpのオープンリーディングフレーム（ODF）を有する
ことが認められた。ORFは、分子量19.8KDoを持つアミノ酸180個のタンパク質を
コードする。
【００４７】 FASTA及びBLAST分析によって、ヌクレオチド及びアミノ酸配列を、データバン
クにおいて利用可能な配列と比較したが、同種の配列は発見されなかった。これ
は、ヒマのDNAトラクト及び確認されたタンパク質が特異的であること示してい
る。
クにおいて利用可能な配列と比較したが、同種の配列は発見されなかった。これ
は、ヒマのDNAトラクト及び確認されたタンパク質が特異的であること示してい
る。
【００４８】 オレエート１２−ヒドロキシラーゼと相互作用し得るタンパク質のアイデンテ
ィティーを確認するため、各種の種のゲノムDNAについて分析を行った。得られ
た結果は、ヒマにのみシグナルが存在することを示した。これは、単離された遺
伝子が、ヒマのゲノムに特有のものであり、その確認用に使用されたシステムか
らのアウトプットではないことを示している。
ィティーを確認するため、各種の種のゲノムDNAについて分析を行った。得られ
た結果は、ヒマにのみシグナルが存在することを示した。これは、単離された遺
伝子が、ヒマのゲノムに特有のものであり、その確認用に使用されたシステムか
らのアウトプットではないことを示している。
【００４９】 さらに、各種発育段階（１０、２０、３０、３５及び４０DAP）のヒマの実、
ヒマの葉、茎及び根から抽出されたメッセンジャーRNAについて、発現分析を行
った。
ヒマの葉、茎及び根から抽出されたメッセンジャーRNAについて、発現分析を行
った。
【００５０】 ３２ＰでマークしたpTarg1のフラグメントによるノーザンブロットのハイブリ
ッド形成の結果は、葉及び受粉後１０及び２０日の実において遺伝子の発現が認
められることを示した。
ッド形成の結果は、葉及び受粉後１０及び２０日の実において遺伝子の発現が認
められることを示した。
【００５１】 同じフィルターを、２０DAPの未熟な実において発現し始めるオレエート１２
−ヒドロキシラーゼのフラグメントとハイブリダイズさせたところ、この時点で
は、シグナルは非常に弱く、その後、その発現は、３０、３５及び４０DAPの段
階において増大した。予測したように、葉、茎及び根に相当するRNAのサンプル
では、ハイブリッド形成のシグナルは存在しなっかた。
−ヒドロキシラーゼのフラグメントとハイブリダイズさせたところ、この時点で
は、シグナルは非常に弱く、その後、その発現は、３０、３５及び４０DAPの段
階において増大した。予測したように、葉、茎及び根に相当するRNAのサンプル
では、ハイブリッド形成のシグナルは存在しなっかた。
【００５２】 これらの結果に基づき、新規なタンパク質は、おそらく、リシノール酸の合成
開始時、ヒマの実の第１発育段階に介在して、調節作用を行うものと結論付けら
れる。本発明の遺伝子は、好適な調節配列（プロモーター及びターミネーター）
のコントロール下に置かれることによって、植物中の発現ベクターにおいてクロ
ーン化される。
開始時、ヒマの実の第１発育段階に介在して、調節作用を行うものと結論付けら
れる。本発明の遺伝子は、好適な調節配列（プロモーター及びターミネーター）
のコントロール下に置かれることによって、植物中の発現ベクターにおいてクロ
ーン化される。
【００５３】 本発明の目的に適するベクターは、例えば、Bevan M., (1984), Nucleic Acid
Research 12: 8711-8721に記載のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agr
obacterium tumefaciences）のTiプラスミドに由来するものである。
Research 12: 8711-8721に記載のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agr
obacterium tumefaciences）のTiプラスミドに由来するものである。
【００５４】 これらのベクターは、常法によって植物を形質転換させるために使用される。
好ましくは、G. Anらによって開示された方法（Binary vectors, Plant Mocecul
ar Biology Manual A3, Kluwer Academic, Dordrecht, p. 1-19, 1988）が使用
され、この方法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが、それ自体のDNA
の部分を植物細胞に移すことができるとの能力に基づくものである。
好ましくは、G. Anらによって開示された方法（Binary vectors, Plant Mocecul
ar Biology Manual A3, Kluwer Academic, Dordrecht, p. 1-19, 1988）が使用
され、この方法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが、それ自体のDNA
の部分を植物細胞に移すことができるとの能力に基づくものである。
【００５５】 本発明の遺伝子を含有するプラスミドpTarg１は、E. coli DH5α/MA292として
、Centraal Bureau Voor Schimmelculturesに寄託されており、寄託番号CBS 101
642が付与されている。
、Centraal Bureau Voor Schimmelculturesに寄託されており、寄託番号CBS 101
642が付与されている。
【００５６】 以下の実施例は、本発明を詳細に記載することを目的とするものであり、発明
自体の範囲を限定するものではない。
自体の範囲を限定するものではない。
【００５７】
【実施例１】 RNAの単離 ヒマの未熟な（受粉後、１０−４０日）実から、Shirzadegan M.ら, (1991),
Nucl. Acids Res.: 19, 6055に開示された「ホット−フェノール」法（ただし、
いくつかの変更を行っている）によって、全RNAを抽出した。
Nucl. Acids Res.: 19, 6055に開示された「ホット−フェノール」法（ただし、
いくつかの変更を行っている）によって、全RNAを抽出した。
【００５８】 要約すると、植物性材料２ｇを、液体窒素中で粉砕し、ついで、予め８０℃に
加熱した抽出用緩衝液（０.１M LiCl、０.１M Tris-HCl pH７.６、0.01M EDTA、
１％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、フェノール）６mlに懸濁させた。懸濁液
を８０℃で５分間インキュベートし、クロロホルム／イソアミル（２４／１，ｖ
／ｖ）の混合物３mlを添加した。サンプルを渦巻き状で撹拌し、ついで、12,000
rpm、４℃で１５分間遠心した。水相を回収し、さらに、フェノール／クロロホ
ルム／イソアミル（２５／２４／１）による抽出サイクルに供し、上記と同じ条
件下で遠心した。上澄液を回収し、４M LiClの一定量を添加することによってRN
Aを沈殿させた。サンプルを−２０℃で１夜インキュベートし、ついで、13,000r
pm、４℃で３０分間遠心した。
加熱した抽出用緩衝液（０.１M LiCl、０.１M Tris-HCl pH７.６、0.01M EDTA、
１％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、フェノール）６mlに懸濁させた。懸濁液
を８０℃で５分間インキュベートし、クロロホルム／イソアミル（２４／１，ｖ
／ｖ）の混合物３mlを添加した。サンプルを渦巻き状で撹拌し、ついで、12,000
rpm、４℃で１５分間遠心した。水相を回収し、さらに、フェノール／クロロホ
ルム／イソアミル（２５／２４／１）による抽出サイクルに供し、上記と同じ条
件下で遠心した。上澄液を回収し、４M LiClの一定量を添加することによってRN
Aを沈殿させた。サンプルを−２０℃で１夜インキュベートし、ついで、13,000r
pm、４℃で３０分間遠心した。
【００５９】 RNAペレットを水に再懸濁させ、マイクロ遠心チューブに移し、４M LiCl及び
０.５M EDTA０.２容を添加することによって沈殿させた。13,000rpm、４℃で３
０分間遠心分離を行った後、ペレットを水に再懸濁させ、５M NaCl ０.１容及び
100％エタノール２.５容を添加して、沈殿させた。15,000rpm、４℃で３０分間
遠心を行った後、ペレットを回収し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、水
に再懸濁させた。
０.５M EDTA０.２容を添加することによって沈殿させた。13,000rpm、４℃で３
０分間遠心分離を行った後、ペレットを水に再懸濁させ、５M NaCl ０.１容及び
100％エタノール２.５容を添加して、沈殿させた。15,000rpm、４℃で３０分間
遠心を行った後、ペレットを回収し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、水
に再懸濁させた。
【００６０】
【実施例２】 オレエート１２−ヒドロキシラーゼをコードするcDNAの単離 販売者の指示に従って、オリゴ−dTカラム（Pharmacia）を使用して、実施例
１で得られた全RNAから、ポリアデニレートメッセンジャーRNA（poliA-RNA）を
調製した。
１で得られた全RNAから、ポリアデニレートメッセンジャーRNA（poliA-RNA）を
調製した。
【００６１】 ついで、ポリアデニレートメッセンジャーRNA３.５μｇを、Pharmaciaにより
販売されているキットを使用し、キットの販売者によって指示された実験条件下
で操作して行なうダブルフィラメントcDNAの合成に使用した。
販売されているキットを使用し、キットの販売者によって指示された実験条件下
で操作して行なうダブルフィラメントcDNAの合成に使用した。
【００６２】 データバンク（GenBank, ACU22378）にデポジットされているオレエート１２
−ヒドロキシラーゼの配列に基づき、下記のオリゴヌクレオチドを合成した。 （１） 5'GGA TCC CTC AGG AAA GTG CTT A 3' (FORWARD) （２） 5' TCT AGA CAT TCC TTC TTG TTC TAA TT3' (REVERSE) これらのオリゴヌクレオチド（翻訳開始又は停止コドンを含む酵素をコードす
るタンパク質の側に存在する領域に相当する）を、ポリメラーゼ連鎖反応（RCP
）技術によるオレエート１２−ヒドロキシラーゼに対応するフラグメントの単離
用のプライマーとして使用した。
−ヒドロキシラーゼの配列に基づき、下記のオリゴヌクレオチドを合成した。 （１） 5'GGA TCC CTC AGG AAA GTG CTT A 3' (FORWARD) （２） 5' TCT AGA CAT TCC TTC TTG TTC TAA TT3' (REVERSE) これらのオリゴヌクレオチド（翻訳開始又は停止コドンを含む酵素をコードす
るタンパク質の側に存在する領域に相当する）を、ポリメラーゼ連鎖反応（RCP
）技術によるオレエート１２−ヒドロキシラーゼに対応するフラグメントの単離
用のプライマーとして使用した。
【００６３】 DNA Thermal Cycler 480装置（Perkin Elmer Cetus）において、ダブルフィラ
メントcDNA６μl、１０mM Tris-HCl pH８.３、１.５mM MgCl２、５０mM KCl、各
プライマー２.５μM、dNTP０.１mM及びポリメラーゼTaq（Boheringer）２.５単
位を含有する反応混合物（２５μl）を使用して、増幅を行った。
メントcDNA６μl、１０mM Tris-HCl pH８.３、１.５mM MgCl２、５０mM KCl、各
プライマー２.５μM、dNTP０.１mM及びポリメラーゼTaq（Boheringer）２.５単
位を含有する反応混合物（２５μl）を使用して、増幅を行った。
【００６４】 ９５℃における５分間の第１変性サイクルの後、次のサイクル：９４℃におい
て１分間（変性）、５６℃において１分間（対合）、７２℃において２分間（連
鎖延長）を計３５サイクル、ついで、７２℃において１０分間（最後の延長）に
よって、反応を続けた。
て１分間（変性）、５６℃において１分間（対合）、７２℃において２分間（連
鎖延長）を計３５サイクル、ついで、７２℃において１０分間（最後の延長）に
よって、反応を続けた。
【００６５】 増幅産生物（約1200塩基対のフラグメントに相当する）を、１.０％のアガロ
ースゲル上で分離し、インサートのDNAバンドを回収し、GeneClean（登録商標）
キット（BIO 101 Inc.）にて精製した。このようにして単離したDNA約100ngを、
T4 DNAリガーゼ２単位の存在下、４℃、１夜で、反応混合物１０μl中のプラス
ミドpGEM-T５０ngにリゲートさせた。
ースゲル上で分離し、インサートのDNAバンドを回収し、GeneClean（登録商標）
キット（BIO 101 Inc.）にて精製した。このようにして単離したDNA約100ngを、
T4 DNAリガーゼ２単位の存在下、４℃、１夜で、反応混合物１０μl中のプラス
ミドpGEM-T５０ngにリゲートさせた。
【００６６】 この混合物５μlを使用して、大腸菌 DH5a（BRL）のコンピテント細胞を形質
転換した。アンピシリン５０μlを含有するLB培地（NaCl １０ｇ/ｌ、酵母エキ
ストラクト５ｇ/ｌ、Bacto-triptone １０ｇ/ｌ及び寒天２０ｇ/ｌ）のプレート
上で、形質転換エージェントを選別した。
転換した。アンピシリン５０μlを含有するLB培地（NaCl １０ｇ/ｌ、酵母エキ
ストラクト５ｇ/ｌ、Bacto-triptone １０ｇ/ｌ及び寒天２０ｇ/ｌ）のプレート
上で、形質転換エージェントを選別した。
【００６７】 ６個の陽性クローンから抽出したプラスミドDNAを、Van de Loo F.らによって
単離された（1995, PNAS, 92, 6743-6747）オレエート１２−ヒドロキシラーゼ
の遺伝子とのヌクレオチドの一致を確認するため、配列分析に供した。反応及び
配列分析を、ABI Prism 373A DNAシーケンサー（AB-PEC）を使用して、Taq色素
デオキシターミネーターサイクル配列決定キッド（AB-PEC）によって行った。
単離された（1995, PNAS, 92, 6743-6747）オレエート１２−ヒドロキシラーゼ
の遺伝子とのヌクレオチドの一致を確認するため、配列分析に供した。反応及び
配列分析を、ABI Prism 373A DNAシーケンサー（AB-PEC）を使用して、Taq色素
デオキシターミネーターサイクル配列決定キッド（AB-PEC）によって行った。
【００６８】 分析したプラスミドの１つ（配列番号１と同種のDNAのフラグメントを含有す
る）を、pc18-MAと称する。
る）を、pc18-MAと称する。
【００６９】
【実施例３】 「ベイト」ベクター（pBD-GAL4）の構築 ターゲットタンパク質が、検査した全タンパク質（ベイト）又はその部分と相
互作用できるため、プラスミドpBD-GAL4（Stratagene）において、オレエート１
２−ヒドロキシラーゼをコードする全遺伝子に相当するフラグメント、及び前記
遺伝子の５’及び３’領域に相当するフラグメントの両方がクローン化されたこ
とが明白である。
互作用できるため、プラスミドpBD-GAL4（Stratagene）において、オレエート１
２−ヒドロキシラーゼをコードする全遺伝子に相当するフラグメント、及び前記
遺伝子の５’及び３’領域に相当するフラグメントの両方がクローン化されたこ
とが明白である。
【００７０】 この目的のため、４つのオリゴヌクレオチドを合成し、その内、フォワードプ
ライマー（Ｆと省略する）は制限位置EcoRIを有し、リバースプライマー（Ｒと
省略する）は制限位置SalIを有する。プライマーのヌクレオチド配列は、次のと
おりである： （ａ） 5'GAA TTC CGC ATG TCT ACT GTC 3' （Forward, HydGal-F） （ｂ） 5'GTC GAC CAT TCC TTC TTG TTC 3' （Reverse, HydGal-R） （ｃ） 5'GTC GAC GCG ATC GTA AGG 3' （GalHydi-R） （ｄ） 5'GAA TTC AAT GTC TCT GGT AGA C 3' （GalHydi-F） オレエート１２−ヒドロキシラーゼの全遺伝子を増幅するために、プライマー
HydGal-F及びHydGal-Rを使用した。
ライマー（Ｆと省略する）は制限位置EcoRIを有し、リバースプライマー（Ｒと
省略する）は制限位置SalIを有する。プライマーのヌクレオチド配列は、次のと
おりである： （ａ） 5'GAA TTC CGC ATG TCT ACT GTC 3' （Forward, HydGal-F） （ｂ） 5'GTC GAC CAT TCC TTC TTG TTC 3' （Reverse, HydGal-R） （ｃ） 5'GTC GAC GCG ATC GTA AGG 3' （GalHydi-R） （ｄ） 5'GAA TTC AAT GTC TCT GGT AGA C 3' （GalHydi-F） オレエート１２−ヒドロキシラーゼの全遺伝子を増幅するために、プライマー
HydGal-F及びHydGal-Rを使用した。
【００７１】 オレエート１２−ヒドロキシラーゼの遺伝子の624bpの５’領域（配列番号：
２）及び633bpの３’領域（配列番号：３）を増幅するために、プライマーHydGa
l-F／HydGal-R及びHydGal-R／HydGal-Fを使用した。
２）及び633bpの３’領域（配列番号：３）を増幅するために、プライマーHydGa
l-F／HydGal-R及びHydGal-R／HydGal-Fを使用した。
【００７２】 上記プライマーによる増幅を、予めクローン化し、配列決定したオレエート１
２−ヒドロキシラーゼのフラグメント２０ngについて実施した。
２−ヒドロキシラーゼのフラグメント２０ngについて実施した。
【００７３】 予測されたサイズを有する増幅産生物を、制限酵素EcoRI及びSalI（Boheringh
er）１０単位にて分解し、１％アガロースゲル上で分離し、GeneClean（登録商
標）キット（BIO 101 Inc.）にて精製した。
er）１０単位にて分解し、１％アガロースゲル上で分離し、GeneClean（登録商
標）キット（BIO 101 Inc.）にて精製した。
【００７４】 別に、反応混合物1０ml中、T4 DNAリガーゼ２単位の存在下、４℃において、
１夜、酵素EcoRI及びSalIにてリニアライズしたプラスミドpBD-GAL4により各フ
ラグメント約100ngをリゲートした。エピキュリアン・コリ XL1 Blue（Stratage
ne）のコンピテント細胞を形質転換するために、リガーゼ混合物を使用した。組
換コロニーを、クロラムフェニコール３０μl/mlを添加したLB培地のプレート上
で選別した。（ａ）オレエート１２−ヒドロキシラーゼの全遺伝子（pBD-GALA4/
C18）；（ｂ）オレエート１２−ヒドロキシラーゼの遺伝子の５末端領域（pBD-G
ALA4/C18-5）；及び（ｃ）オレエート１２−ヒドロキシラーゼの遺伝子の３末端
領域（pBD-GALA4/C18-3）と縮合させたGal4の結合ドメインでなるフラグメント
を含有する組換「ベイト」プラスミドが確認された。
１夜、酵素EcoRI及びSalIにてリニアライズしたプラスミドpBD-GAL4により各フ
ラグメント約100ngをリゲートした。エピキュリアン・コリ XL1 Blue（Stratage
ne）のコンピテント細胞を形質転換するために、リガーゼ混合物を使用した。組
換コロニーを、クロラムフェニコール３０μl/mlを添加したLB培地のプレート上
で選別した。（ａ）オレエート１２−ヒドロキシラーゼの全遺伝子（pBD-GALA4/
C18）；（ｂ）オレエート１２−ヒドロキシラーゼの遺伝子の５末端領域（pBD-G
ALA4/C18-5）；及び（ｃ）オレエート１２−ヒドロキシラーゼの遺伝子の３末端
領域（pBD-GALA4/C18-3）と縮合させたGal4の結合ドメインでなるフラグメント
を含有する組換「ベイト」プラスミドが確認された。
【００７５】 制限分析によってプラスミドの特徴付けを行い、Taq色素デオキシターミネー
ターサイクル配列決定キッド（Perkin Elmer）による配列反応を行うことによっ
て、そのアイデンティティーを確認し、自動シーケンサーABI 373A（Perkin Elm
er）にて分析した。
ターサイクル配列決定キッド（Perkin Elmer）による配列反応を行うことによっ
て、そのアイデンティティーを確認し、自動シーケンサーABI 373A（Perkin Elm
er）にて分析した。
【００７６】
【実施例４】 ターゲットライブラリーの構築 GALA4の活性化ドメイン及びヒマの未熟な実のタンパク質でなるハイブリッド
タンパク質で構成される「ターゲット」ライブラリーを構築するため、ファージ
ベクターHybridZapを使用した。採用した条件は、キットの販売者によって指示
されているものである（Stratagene、HybridZap（登録商標）２−ハイブリッドc
DNAパッククローニングキット、カタログ番号：235612）。
タンパク質で構成される「ターゲット」ライブラリーを構築するため、ファージ
ベクターHybridZapを使用した。採用した条件は、キットの販売者によって指示
されているものである（Stratagene、HybridZap（登録商標）２−ハイブリッドc
DNAパッククローニングキット、カタログ番号：235612）。
【００７７】 ダブルフィラメントcDNAを合成するため、ヒマのポリアデニレートmRNA約５μ
lを使用した。
lを使用した。
【００７８】 ついで、制限部位EcoRIを有するリンカー３.６μgを添加しておいたcDNA分子
を、ポリメラーゼDNAPfu（Straragene）の作用によって平滑化し、酵素XhoI（そ
の部位は、第１のcDNAフィラメントを合成するために使用したプライマーpolydT
内に存在する）（120単位）による分解に供した。これにより、一方の末端にEco
RI部位及び他の末端のXhoI部位を有する分子が生成された。
を、ポリメラーゼDNAPfu（Straragene）の作用によって平滑化し、酵素XhoI（そ
の部位は、第１のcDNAフィラメントを合成するために使用したプライマーpolydT
内に存在する）（120単位）による分解に供した。これにより、一方の末端にEco
RI部位及び他の末端のXhoI部位を有する分子が生成された。
【００７９】 ついで、cDNAのサンプルを、２０mM Tris-HCl pH７.５、１０mM EDTA、100mM
NaClで平衡化したSephacryl S-500カラムを通し、400revsで２分間、遠心に供し
た。
NaClで平衡化したSephacryl S-500カラムを通し、400revsで２分間、遠心に供し
た。
【００８０】 ３つのフラクションが回収され、その分子量を、５％非変性ポリアクリルアミ
ドゲル（Sambrook, J.ら, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）で
の電気泳動によって確認した。
ドゲル（Sambrook, J.ら, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）で
の電気泳動によって確認した。
【００８１】 cDNAの第１のフラクション（高分子量を持つフラクションに相当）約100ngを
、酵素EcoRI及びXhoIで予め分解したλHybridZapファージベクター１μgによっ
てリゲートし、ファージのヘッド及びテール用のタンパク質を含有するパッキン
グエキストラクトでパックした。インビボでのパッキングによって得られたファ
ージ粒子の全量を、その一定量に菌株XL1-Blue MRF'をプレートすることによっ
て測定した。
、酵素EcoRI及びXhoIで予め分解したλHybridZapファージベクター１μgによっ
てリゲートし、ファージのヘッド及びテール用のタンパク質を含有するパッキン
グエキストラクトでパックした。インビボでのパッキングによって得られたファ
ージ粒子の全量を、その一定量に菌株XL1-Blue MRF'をプレートすることによっ
て測定した。
【００８２】 得られた一次ライブラリーは、リゲートされたベクターアームμg当りプラー
ク形成ユニット（pfu）合計１.４×１０６及びDNAインサートの９７％を含有す
る。生成したライブラリーのサイズを、PCR反応に供することによって確認し、
ランダムに２０個のファージプラークを選別し、ベクターpAD-GAL4用の特殊なプ
ライマーペア： ａ）５’ＡＤプライマー：5' AGG GAT GTT TAA TAC CAC TAC3' ｂ）３’ＡＤプライマー：5' GCA CAG TTG AAG TGA ATC TGC3' によって増幅した。得られた結果は、cDNAライブラリーのインサートが平均サイ
ズ１.４Kbを有することを示した。
ク形成ユニット（pfu）合計１.４×１０６及びDNAインサートの９７％を含有す
る。生成したライブラリーのサイズを、PCR反応に供することによって確認し、
ランダムに２０個のファージプラークを選別し、ベクターpAD-GAL4用の特殊なプ
ライマーペア： ａ）５’ＡＤプライマー：5' AGG GAT GTT TAA TAC CAC TAC3' ｂ）３’ＡＤプライマー：5' GCA CAG TTG AAG TGA ATC TGC3' によって増幅した。得られた結果は、cDNAライブラリーのインサートが平均サイ
ズ１.４Kbを有することを示した。
【００８３】
【実施例５】 HybridZapファージライブラリーのpAD-GALA4プラスミドライブラリーへの変換 λHybridZapファージにおいて構築した一次ライブラリーを、採用したキット
の販売者（Stratagene）によって開示された方法に従って、インビボでの切断に
よってpAD-GAL4プラスミドライブラリーに変換した。
の販売者（Stratagene）によって開示された方法に従って、インビボでの切断に
よってpAD-GAL4プラスミドライブラリーに変換した。
【００８４】 一次ライブラリーを増幅するため、ファージ１×１０６を使用して宿主細胞XL
1 Blue MRF'に感染させ、ファージ内部で複製を行ない、細胞溶解後、ファージ
粒子約１×１０９からなるライブラリーが回収された。
1 Blue MRF'に感染させ、ファージ内部で複製を行ない、細胞溶解後、ファージ
粒子約１×１０９からなるライブラリーが回収された。
【００８５】 増幅したライブラリーの一定量（１×１０８pfu）を、ExAssistヘルパーファ
ージ１×１０１０pfu及びXL1 Blue MRF'細胞１×１０９とインキュベートして、
ファージベクターから切断されたプラスミドベクターを含有するファージミド粒
子を生成した。
ージ１×１０１０pfu及びXL1 Blue MRF'細胞１×１０９とインキュベートして、
ファージベクターから切断されたプラスミドベクターを含有するファージミド粒
子を生成した。
【００８６】 ライブラリーのファージの数に対して過剰の数のヘルパーファージ及び細菌細
胞を使用して、各細胞がヘルパーファージによって及びラムダファージによって
感染されており、このようにして、インビボにおいて効果的かつ典型的な切断が
達成されたことを確認した。
胞を使用して、各細胞がヘルパーファージによって及びラムダファージによって
感染されており、このようにして、インビボにおいて効果的かつ典型的な切断が
達成されたことを確認した。
【００８７】 ３７℃において、１５分間、ラムダファージを、ヘルパーファージ及びXL1 Bl
ue MRF'細胞とインキュベートし、その後、LB培地２０mlを添加し、３７℃にお
いて、さらに３時間、インキュベートを続けた。
ue MRF'細胞とインキュベートし、その後、LB培地２０mlを添加し、３７℃にお
いて、さらに３時間、インキュベートを続けた。
【００８８】 ファージ粒子を細胞溶解し、プラスミド粒子を放出し、回収するため、懸濁液
を７０℃で２０分間インキュベートし、ついで、500revsにおいて１０分間遠心
した。上澄液（ファージミドストック）を回収し、４℃で保存した。
を７０℃で２０分間インキュベートし、ついで、500revsにおいて１０分間遠心
した。上澄液（ファージミドストック）を回収し、４℃で保存した。
【００８９】 大腸菌 XLORの細胞を、比１０：１のファージミド１×１０８と、３７℃にお
いて１５分間インキュベートした。ついで、アンピシリン５０μg/mlを含有する
LB培地500mlを添加し、インキュベーションを３７℃で３時間続けた。
いて１５分間インキュベートした。ついで、アンピシリン５０μg/mlを含有する
LB培地500mlを添加し、インキュベーションを３７℃で３時間続けた。
【００９０】 この操作により、プラスミドベクター内にターゲットライブラリーを含有する
細胞が得られた。
細胞が得られた。
【００９１】 懸濁液を、500revsで１０分間遠心し、Sambrook, J.ら, 1989, Cold Spring H
arbor Laboratory Pressに開示されたアルカリ細胞溶解のプロトコルに従って、
ペレットからプラスミドDNAを単離した。
arbor Laboratory Pressに開示されたアルカリ細胞溶解のプロトコルに従って、
ペレットからプラスミドDNAを単離した。
【００９２】
【実施例６】 ライブラリーのスクリーニング 「ベイト」タンパク質と相互作用する「ターゲット」タンパク質を確認するた
め、レポーター遺伝子his3及びlacZを含有する酵母の菌株S.セレビシアエ YRG-2
を、ベイトプラスミドから調製したDNA及びターゲットプラスミドライブラリー
から調製したDNAと同時形質転換した。
め、レポーター遺伝子his3及びlacZを含有する酵母の菌株S.セレビシアエ YRG-2
を、ベイトプラスミドから調製したDNA及びターゲットプラスミドライブラリー
から調製したDNAと同時形質転換した。
【００９３】 プラスミドpBD-GALA4/C18、pBD-GALA4/C18-5'及びpBD-GALA4/C18-3'から抽出
したDNA約５μgを、別の同時形質転換プロセスにおいて、ターゲットライブラリ
ーから抽出したDNA１０μgと同時形質転換させた。同時形質転換産生物を、アミ
ノ酸ロイシン（Leu-）、トリプトファン（Trp-）及びヒスチジン（His-）を含有
しないSD選別培地（アミノ酸を含有しない酵母窒素化塩基６.７ｇ/ｌ、Ｄ-ソル
ビトール182.2ｇ/ｌ、寒天２０ｇ/ｌ、１０倍に濃縮した好適なアミノ酸溶液100
ml及びグルコース２％）（組換プラスミドpBD-GALA4(Trp-)及びpAD-GAL4(Leu-)
の両方を含有する酵母コロニーのみが成長できる）上でプレートし、３０℃で５
日間インキュベートした。このようにして得られた酵母コロニーを、Watman 3MM
濾紙に移し、色素産生物質５−ブロモ−４−クロロインドリルβ−Ｄ−ガラクト
シドを含有する溶液中に濾紙を浸し、３０℃で１夜インキュベートすることによ
るレポーター遺伝子LacZに関する発現テストに供した。
したDNA約５μgを、別の同時形質転換プロセスにおいて、ターゲットライブラリ
ーから抽出したDNA１０μgと同時形質転換させた。同時形質転換産生物を、アミ
ノ酸ロイシン（Leu-）、トリプトファン（Trp-）及びヒスチジン（His-）を含有
しないSD選別培地（アミノ酸を含有しない酵母窒素化塩基６.７ｇ/ｌ、Ｄ-ソル
ビトール182.2ｇ/ｌ、寒天２０ｇ/ｌ、１０倍に濃縮した好適なアミノ酸溶液100
ml及びグルコース２％）（組換プラスミドpBD-GALA4(Trp-)及びpAD-GAL4(Leu-)
の両方を含有する酵母コロニーのみが成長できる）上でプレートし、３０℃で５
日間インキュベートした。このようにして得られた酵母コロニーを、Watman 3MM
濾紙に移し、色素産生物質５−ブロモ−４−クロロインドリルβ−Ｄ−ガラクト
シドを含有する溶液中に濾紙を浸し、３０℃で１夜インキュベートすることによ
るレポーター遺伝子LacZに関する発現テストに供した。
【００９４】 ライブラリーを持つオレエート１２−ヒドロキシラーゼの３つの配列のテスト
から、lacZ遺伝子の活性の典型的な青色を有する（ベイトタンパク質と未知ター
ゲットタンパク質との相互作用を示す）７つの酵母コロニーが確認された。これ
らのコロニーの確実性を確認するため、これらを選別培地上で再プレートし、X-
Galテストを繰返した。
から、lacZ遺伝子の活性の典型的な青色を有する（ベイトタンパク質と未知ター
ゲットタンパク質との相互作用を示す）７つの酵母コロニーが確認された。これ
らのコロニーの確実性を確認するため、これらを選別培地上で再プレートし、X-
Galテストを繰返した。
【００９５】 確認された７つのコロニーの内、１つのみが表現型であることが再確認され、
他は疑陽性であることが証明された。
他は疑陽性であることが証明された。
【００９６】 オレエート１２−ヒドロキシラーゼ遺伝子の５’領域を含有する陽性の酵母コ
ロニーが、プラスミドpBD-GALA4/C18-5'を使用した同時形質転換プロセスから得
られたことが証明された。
ロニーが、プラスミドpBD-GALA4/C18-5'を使用した同時形質転換プロセスから得
られたことが証明された。
【００９７】 形質転換コントロール試験を、４つのプラスミドpGal4、p53、pSV40及びpLami
nC（Stratagene）を使用して並行して実施した。これらのプラスミドを、表１に
示すように、単独で又は混合して使用した。これらは、組合せにより、正又は負
のコントロールとして作用する。表１に、ベイトタンパク質が未知のターゲット
タンパク質と相互作用する形質転換プロセスの結果を合わせて示している。
nC（Stratagene）を使用して並行して実施した。これらのプラスミドを、表１に
示すように、単独で又は混合して使用した。これらは、組合せにより、正又は負
のコントロールとして作用する。表１に、ベイトタンパク質が未知のターゲット
タンパク質と相互作用する形質転換プロセスの結果を合わせて示している。
【００９８】
【表１】 形質転換産生物 ＳＤ１ ＳＤ２ ＳＤ３ ＳＤ４ 発 育 pGAL4 青 p53 白 pSV40 白 pLaminC 白 p53及びpSV40 青 青 pLsminC及びpSV40 白 ０ pBDGAL4-ベイト 白 pBDGAL4-ターゲット 白 pBDGAL4-ターゲット pBDGAL4-ベイト 白 白 青 青 表中、SD1＝Leuを含有しないSD培地；SD2＝Trp含有しないSD培地；SD3＝Leu及び
Trpを含有しないSD培地；及びSD4＝Leu、Trp及びHisを含有しないSD培地
Trpを含有しないSD培地；及びSD4＝Leu、Trp及びHisを含有しないSD培地
【００９９】
【実施例７】 相互作用特異性の確認 オレエート１２−ヒドロキシラーゼと確認された新規なタンパク質との間の相
互作用特異性を確認するため、酵母において、同時形質転換試験を行い、ターゲ
ットプラスミド（pTarg1）のDNAを、オレエート１２−ヒドロキシラーゼの全遺
伝子、５’領域及びベイトタンパク質p53及びpLaminCの遺伝子と組合せてテスト
した。
互作用特異性を確認するため、酵母において、同時形質転換試験を行い、ターゲ
ットプラスミド（pTarg1）のDNAを、オレエート１２−ヒドロキシラーゼの全遺
伝子、５’領域及びベイトタンパク質p53及びpLaminCの遺伝子と組合せてテスト
した。
【０１００】 X-GALテストにおいて陽性を示した酵母コロニーからプラスミドDNA pTarg1を
単離するため、陽性酵母を、YPAD生育培地（ペプトン２０ｇ/ｌ、酵母エキスト
ラクト１０ｇ/ｌ、硫酸アデニン４０mg/ｌ及びグルコース２％）２mlに接種し、
３０℃において２日間インキュベートした。
単離するため、陽性酵母を、YPAD生育培地（ペプトン２０ｇ/ｌ、酵母エキスト
ラクト１０ｇ/ｌ、硫酸アデニン４０mg/ｌ及びグルコース２％）２mlに接種し、
３０℃において２日間インキュベートした。
【０１０１】 プラスミドDNAを回収するため、ガラスボールを使用して、酵母の細胞膜を機
械的に破壊し、Sambrook, J.ら, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press
に開示された方法に従って、核酸を沈殿させた。
械的に破壊し、Sambrook, J.ら, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press
に開示された方法に従って、核酸を沈殿させた。
【０１０２】 プラスミドpTarg1約５μgを、全オレエート１２−ヒドロキシラーゼ遺伝子を
含有するプラスミドのDNA５μgとの同時形質転換試験、及びオレエート１２−ヒ
ドロキシラーゼ遺伝子の５−末端部分（pBD-GAL4/C18-5'）を含有するプラスミ
ドのDNA５μgとの他の試験に使用した。２つの配列テストからlacZ遺伝子の活性
の典型的な青色を有する（ベイトタンパク質と未知のターゲットタンパク質との
相互作用を示す）２つの酵母コロニーが確認された（各同時形質転換プロセスに
関して１つ）。
含有するプラスミドのDNA５μgとの同時形質転換試験、及びオレエート１２−ヒ
ドロキシラーゼ遺伝子の５−末端部分（pBD-GAL4/C18-5'）を含有するプラスミ
ドのDNA５μgとの他の試験に使用した。２つの配列テストからlacZ遺伝子の活性
の典型的な青色を有する（ベイトタンパク質と未知のターゲットタンパク質との
相互作用を示す）２つの酵母コロニーが確認された（各同時形質転換プロセスに
関して１つ）。
【０１０３】 上記コロニーを、選別SD培地（Leu-、Trp-、His-）上でプレートし、再びX-Ga
lとテストした。確認された２つのコロニーが表現型であることが再確認された
。
lとテストした。確認された２つのコロニーが表現型であることが再確認された
。
【０１０４】 一方、ターゲットタンパク質をベイトタンパク質p53及びpLaminCによりテスト
した際には、予想されたように、X-Galテストにおいて、青色を有するコロニー
は認められなかった。これらの結果は、確認された新規なタンパク質が、オレエ
ート１２−ヒドロキシラーゼと特異的に相互作用したことを示している。
した際には、予想されたように、X-Galテストにおいて、青色を有するコロニー
は認められなかった。これらの結果は、確認された新規なタンパク質が、オレエ
ート１２−ヒドロキシラーゼと特異的に相互作用したことを示している。
【０１０５】 ベイトとして使用したタンパク質の存在及びサイズを確認し、ターゲットタン
パク質（TargH12）をコードするフラグメントの存在及びサイズを確認するため
に、レポーター遺伝子lacZの発現テストで陽性を示した２つの酵母クローンから
抽出したDNAについて、PCR分析を行った。
パク質（TargH12）をコードするフラグメントの存在及びサイズを確認するため
に、レポーター遺伝子lacZの発現テストで陽性を示した２つの酵母クローンから
抽出したDNAについて、PCR分析を行った。
【０１０６】 結合ドメイ（ＢＤ）領域用及び活性化ドメイン（ＡＤ）領域用の特殊なプライ
マーを、キットの販売者によって指示された条件下での増幅に使用した。
マーを、キットの販売者によって指示された条件下での増幅に使用した。
【０１０７】 活性化ドメイン用の特殊なプライマーの配列は実施例４に記載したとおりであ
り、一方、結合ドメイン用の配列は、次のとおりである。 ａ） ５’ＢＤ：5'GTG CGA CAT CAT CAT CGG AAG3' ｂ） ３’ＢＤ：5'CCT AAG AGT CAC TTT AAA ATT3' 増幅産生物の確実性は、予測されたフラグメントのサイズ及びこれらについて
行ったハイブリッド形成分析によって示された。
り、一方、結合ドメイン用の配列は、次のとおりである。 ａ） ５’ＢＤ：5'GTG CGA CAT CAT CAT CGG AAG3' ｂ） ３’ＢＤ：5'CCT AAG AGT CAC TTT AAA ATT3' 増幅産生物の確実性は、予測されたフラグメントのサイズ及びこれらについて
行ったハイブリッド形成分析によって示された。
【０１０８】
【実施例８】 プラスミドTarg1の配列分析 pTtarg1のプラスミドDNAを、プラスミドpAD-Gal4の特殊なプライマー、５’Ａ
Ｄプライマー及び３’ＡＤプライマーを使用する増幅反応に供した。生成された
フラグメントを、GeneClean（登録商標）キット（BIO 101 Inc.）によって精製
した。このようにして精製したDNA約100ngを、反応混合物１０μl中、T4 DNAリ
ガーゼ２単位の存在下、４℃において１夜、プラスミドpGEM-T（Promega）５０n
gとリゲートした。
Ｄプライマー及び３’ＡＤプライマーを使用する増幅反応に供した。生成された
フラグメントを、GeneClean（登録商標）キット（BIO 101 Inc.）によって精製
した。このようにして精製したDNA約100ngを、反応混合物１０μl中、T4 DNAリ
ガーゼ２単位の存在下、４℃において１夜、プラスミドpGEM-T（Promega）５０n
gとリゲートした。
【０１０９】 リガーゼ混合物５μgを使用して、大腸菌 DH5a（BGL）のコンピテント細胞を
形質転換させた。形質転換エージェントを、アンピシリン５０μg/mlを添加した
ＬＢ培地において選別した。
形質転換させた。形質転換エージェントを、アンピシリン５０μg/mlを添加した
ＬＢ培地において選別した。
【０１１０】 ６つの陽性（すなわち、白色を呈する）コロニーからプラスミドDNAを抽出し
、ABI Prism 373A DNAシーケンサー（AB-PEC）を使用して、Taq色素デオキシTサ
イクル配列決定キット（AB-PEC）によって配列決定した。
、ABI Prism 373A DNAシーケンサー（AB-PEC）を使用して、Taq色素デオキシTサ
イクル配列決定キット（AB-PEC）によって配列決定した。
【０１１１】 配列分析により、単離された762bpの遺伝子（配列番号：４）が、５’に７５b
pが先行し、ポリ（Ａ）テールが存在する３’に147bpが続く540bpのオープンリ
ーディングフレーム（ORF）を含有することが観察された。ORFは、分子量19.8Kd
oを持つアミノ酸180個のタンパク質（配列番号：５）（TarH12と表示）をコード
する。
pが先行し、ポリ（Ａ）テールが存在する３’に147bpが続く540bpのオープンリ
ーディングフレーム（ORF）を含有することが観察された。ORFは、分子量19.8Kd
oを持つアミノ酸180個のタンパク質（配列番号：５）（TarH12と表示）をコード
する。
【０１１２】
【実施例９】 サザンブロット分析 オレエート１２−ヒドロキシラーゼと相互作用し得るタンパク質のアイデンテ
ィティー及びプラスミドpTarg1のインサートに相当する遺伝子のリシンコピーの
数を確認するため、Dellaportaら, 1983, Plant Mol. Biol.：１, 19-21の方法
によって単離した異なる種類のゲノムDNAについて分析を行った。
ィティー及びプラスミドpTarg1のインサートに相当する遺伝子のリシンコピーの
数を確認するため、Dellaportaら, 1983, Plant Mol. Biol.：１, 19-21の方法
によって単離した異なる種類のゲノムDNAについて分析を行った。
【０１１３】 ヒマ（Ricinus communis）、レスキエレッラ・フェンドレリ（Lesquerella fe
ndleri）、リヌム・ウジタチシウム（Linum usitatissium）、ブラッシカ・ナプ
ス（Brassica napus）、ヘリアンタス・アンヌス（Helianthus annus）、リムナ
ンテス・ドウグラッシ（Limnates douglasii）、リコペルシコン・エスクレンタ
ム（Lycopersicon esculentum）、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）、ゼア
メイズ（Zeamays）、ニコチアナ・タバクム及びサッカロミセス・セレヴィシア
エから、それぞれ単離したゲノムDNA約６μgを、反応混合物100μl中、３７℃に
おいて、１時間、酵素EcoRI（Boehringer）100単位で分解した。
ndleri）、リヌム・ウジタチシウム（Linum usitatissium）、ブラッシカ・ナプ
ス（Brassica napus）、ヘリアンタス・アンヌス（Helianthus annus）、リムナ
ンテス・ドウグラッシ（Limnates douglasii）、リコペルシコン・エスクレンタ
ム（Lycopersicon esculentum）、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）、ゼア
メイズ（Zeamays）、ニコチアナ・タバクム及びサッカロミセス・セレヴィシア
エから、それぞれ単離したゲノムDNA約６μgを、反応混合物100μl中、３７℃に
おいて、１時間、酵素EcoRI（Boehringer）100単位で分解した。
【０１１４】 分解混合物を、０.８％アガロースゲル上に負荷し、水平電気泳動に供した。
サザン法（Sambrook, J.ら, Cold Spring Harbor Laboratory Press）により、D
NAを、ニトロセルロースフィルター（Hybond-N(+), Hamersham）上に移した。
サザン法（Sambrook, J.ら, Cold Spring Harbor Laboratory Press）により、D
NAを、ニトロセルロースフィルター（Hybond-N(+), Hamersham）上に移した。
【０１１５】 ６５℃において４時間プレ−ハイブリッド形成を行った後、６×SSC、１％SDS
、１０×Denhardt'及び使用するハイブリッド形成溶液ml当り１０μgの濃度でrR
NAを含有する溶液中、６５℃において１夜、このフィルターをハイブリダイズし
た。プローブとして、３２ＰでマークしたプラスミドpTarg1から単離した762bp
のフラグメント（Sambrook及びFritsch, E.F.及びManiatis, T. (1989), Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring H
arbor, NY), ２版, 1989）を使用した。
、１０×Denhardt'及び使用するハイブリッド形成溶液ml当り１０μgの濃度でrR
NAを含有する溶液中、６５℃において１夜、このフィルターをハイブリダイズし
た。プローブとして、３２ＰでマークしたプラスミドpTarg1から単離した762bp
のフラグメント（Sambrook及びFritsch, E.F.及びManiatis, T. (1989), Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring H
arbor, NY), ２版, 1989）を使用した。
【０１１６】 フィルターを、６５℃において、２×SSC、０.２％SDS中、３０分間で２回、
及び０.２×SSC、0.02％SDS中、２０分間で１回洗浄し、ついで、オートラジオ
グラフィーによってＸ線にさらした。
及び０.２×SSC、0.02％SDS中、２０分間で１回洗浄し、ついで、オートラジオ
グラフィーによってＸ線にさらした。
【０１１７】 ハイブリッド形成は、ヒマから単離されたゲノムDNAについてのみシングルバ
ンドを示した。これは、単離された遺伝子が、この植物のゲノム（シングルコピ
ー中に存在する）に特異的であること、及び得られた結果が、その確認のために
使用したシステムによるものではないことをを示している（図１）。
ンドを示した。これは、単離された遺伝子が、この植物のゲノム（シングルコピ
ー中に存在する）に特異的であること、及び得られた結果が、その確認のために
使用したシステムによるものではないことをを示している（図１）。
【０１１８】
【実施例１０】 発現分析 タンパク質TargH12をコードする遺伝子の発現分析を行うため、メッセンジャ
ーRNAを、ヒマの各種組織（葉、茎及び根）及び各種の発育段階（受粉後、１０
、２０、３０、３５及び４０日）の実から調製した。
ーRNAを、ヒマの各種組織（葉、茎及び根）及び各種の発育段階（受粉後、１０
、２０、３０、３５及び４０日）の実から調製した。
【０１１９】 各サンプル約７μgを、ホルムアルデヒドを含有する１.４％アガロースゲル上
に負荷し、電気泳動に供した。標準のノーザンブロット法を使用して、RNAを、
ニトロセルロースフィルター（Hybond-N(+)R Hamersham）上に移した。フィルタ
ーを、３２ＰでマークしたプラスミドpTarg1の762bpのフラグメントに相当する
プローブとハイブリダイズさせた。６×SSC、１％SDS、１０×Denhardt'及びtRN
A１０μgを含有するハイブリッド形成溶液中、６５℃において、５時間、プレ−
ハイブリッド形成を行った後、同じハイブリッド形成溶液中、６５℃において１
夜、反応を行った。
に負荷し、電気泳動に供した。標準のノーザンブロット法を使用して、RNAを、
ニトロセルロースフィルター（Hybond-N(+)R Hamersham）上に移した。フィルタ
ーを、３２ＰでマークしたプラスミドpTarg1の762bpのフラグメントに相当する
プローブとハイブリダイズさせた。６×SSC、１％SDS、１０×Denhardt'及びtRN
A１０μgを含有するハイブリッド形成溶液中、６５℃において、５時間、プレ−
ハイブリッド形成を行った後、同じハイブリッド形成溶液中、６５℃において１
夜、反応を行った。
【０１２０】 フィルターを、６５℃において、２×SSC、０.２％SDS中、２０分間で２回、
及び６５℃において、０.２×SSC、0.02％SDS中、２０分間で１回洗浄し、つい
で、オートラジオグラフィーによってＸ線にさらした。
及び６５℃において、０.２×SSC、0.02％SDS中、２０分間で１回洗浄し、つい
で、オートラジオグラフィーによってＸ線にさらした。
【０１２１】 結果は、１０及び２０DAPの未熟な実に相当するサンプルにおいて、約１Kbの
バンドに局在するシグナルの存在を示した（図２）。同様のシグナルは、葉から
抽出されたRNAのサンプルにおいて観察された。
バンドに局在するシグナルの存在を示した（図２）。同様のシグナルは、葉から
抽出されたRNAのサンプルにおいて観察された。
【０１２２】 同じノーザンフィルターを、２０DAPの未熟な実において発現し始めるオレエ
ート１２−ヒドロキシラーゼのフラグメントとハイブリダイズさせたところ、シ
グナルは非常に弱く、その後、その発現は、３０、３５及び４０DAPの段階にお
いて増大した（図３）。葉、茎及び根に対応するRNAのサンプルでは、ハイブリ
ッド形成のシグナルは観察されなかった。
ート１２−ヒドロキシラーゼのフラグメントとハイブリダイズさせたところ、シ
グナルは非常に弱く、その後、その発現は、３０、３５及び４０DAPの段階にお
いて増大した（図３）。葉、茎及び根に対応するRNAのサンプルでは、ハイブリ
ッド形成のシグナルは観察されなかった。
【０１２３】 これらの結果から、ダブルハイブリッドシステムによって単離されたタンパク
質は、おそらく、リシノール酸合成の開始時、ヒマの実の発育の第１段階に介在
するものと推論される。
質は、おそらく、リシノール酸合成の開始時、ヒマの実の発育の第１段階に介在
するものと推論される。
【配列表】
【図１】 制限酵素EcoRIによって分解し、３２ＰでマークしたプラスミドpTarglの762bp
フラグメントとハイブリダイズした各種の種のゲノムDNAのサザンブロットの結
果を示す図である。
フラグメントとハイブリダイズした各種の種のゲノムDNAのサザンブロットの結
果を示す図である。
【図２】 各種発育段階（１０、２０、３０、３５及び４０DAP）のヒマの実、ヒマの葉
、茎及び根から抽出されたメッセンジャーRNAのノーザンブロットの結果を示す
図である。
、茎及び根から抽出されたメッセンジャーRNAのノーザンブロットの結果を示す
図である。
【図３】 各種発育段階（１０、２０、３０、３５及び４０DAP）のヒマの実、ヒマの葉
、茎及び根から抽出されたメッセンジャーRNAのノーザンブロットの結果を示す
図である。
、茎及び根から抽出されたメッセンジャーRNAのノーザンブロットの結果を示す
図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月２５日（２００１．４．２５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/02 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 9/02 5/00 Ａ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ＦＲＡＺＩＯＮＥ ＭＥＴＡＰＯＮＴＯ， ＬＯＣＡＬＩＴＡ ＰＡＮＴＡＮＥＬＬ Ｏ， Ｓ．Ｓ．ＪＯＮＩＣＡ， 106 Ｋ Ｍ 448，２， Ｉ−75012 ＢＥＲＮＡＬ ＤＡ， ＩＴＡＬＹ (72)発明者 セッリーニ フランチェスコ イタリア国 マテラ イ−75010 ビア トゥーリ 26 (72)発明者 チファレッリ ローザ アンナ イタリア国 モンテスカグリオソ イ− 75024 ビア モンテッローネ 19 (72)発明者 カッリエロ フィロメーナ イタリア国 モンテスカグリオソ イ− 75024 ビア フィウメ 50 Ｆターム(参考） 2B030 AB03 AD08 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA08 CA04 DA12 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD13 LL05 4B065 AA80X AA89Y AB01 AC14 BA02 CA28 CA53
Claims (8)
- 【請求項１】 ヌクレオチド配列：配列番号４を有することを特徴とする、ヒマ（Ricinus co
mmunis）のゲノムDNAから単離された遺伝子。 - 【請求項２】 ヌクレオチド配列：配列番号４を有する遺伝子を含有することを特徴とする、
組換発現ベクター。 - 【請求項３】 大腸菌（E. coli）DH5α MA292として、寄託番号CBS 101642で寄託されている
、請求項２記載のベクター。 - 【請求項４】 請求項２記載の組換発現ベクターによって形質転換されていることを特徴とす
る、微生物。 - 【請求項５】 細胞内に、ヌクレオチド配列：配列番号４を有する遺伝子を含有することを特
徴とする、トランスジェニック植物。 - 【請求項６】 アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）、リヌム・ウジタチシミ
ュウム（Linum usitatissimum）、ヘリアンタス・アンヌス（Helianthus annus
）及びブラッシカ・ナプス（Brassica napus）から選ばれる、請求項５記載のト
ランスジェニック植物。 - 【請求項７】 請求項５記載のトランスジェニック植物から得られた種子。
- 【請求項８】 配列：配列番号５を有するアミノ酸配列を特徴とする、タンパク質。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| IT1999MI001080 IT1312109B1 (it) | 1999-05-18 | 1999-05-18 | Gene isolato da ricinus communis che codifica per una nuova proteinache interagisce con l'enzima oleato 12-idrossilasi |
| IT99A001080 | 1999-05-18 | ||
| PCT/EP2000/004181 WO2000070052A1 (en) | 1999-05-18 | 2000-04-27 | Gene isolated from ricinus communis encoding a new protein that interacts with the oleate 12-hydroxylase enzyme |
Publications (1)
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|---|---|
| JP2002543842A true JP2002543842A (ja) | 2002-12-24 |
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|---|---|---|---|---|
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