WO2024096643A1 - N-당질화 돌연변이 벼를 이용한 단일클론항체 생산용 벼의 제조방법 및 이에 의해 제조된 단일클론항체 - Google Patents

N-당질화 돌연변이 벼를 이용한 단일클론항체 생산용 벼의 제조방법 및 이에 의해 제조된 단일클론항체 Download PDF

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WO2024096643A1
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rice
monoclonal antibody
vector
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plant
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PCT/KR2023/017434
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김성룡
신준혜
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주식회사 피토맵
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)

Definitions

  • It relates to a method for producing rice for monoclonal antibody production using N-glycosylation mutant rice and the monoclonal antibody produced thereby.
  • N-glycosylation which attaches a sugar chain to the Asn(N) of Asn-X-Ser/Thr residues in the protein sequence, corresponds to a representative protein post-translational modification (PTMs) process that occurs in all eukaryotes.
  • PTMs protein post-translational modification
  • the N-sugar chain has very important functions such as the efficacy, structure, stability, and substrate recognition of glycoproteins, and sugar chains of various structures are added depending on the protein synthesis host.
  • the effectiveness or stability (persistence in the body) of biopharmaceuticals may vary, and immunogenicity may appear against these heterogeneous carbohydrates upon repeated administration to the human body.
  • the Fc region of an antibody plays an important role in effector functions such as antibody dependent cell cytotoxicity (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC) reactions induced by binding to immune cell Fc receptors, and these reactions determine the therapeutic efficacy of antibody therapeutics.
  • ADCC antibody dependent cell cytotoxicity
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • the binding affinity of an antibody can vary depending on the sugar chain structure added to the Fc region.
  • this effector function is significantly reduced when fucose carbohydrates are attached.
  • sugar chain engineering has emerged to maximize the therapeutic efficacy of antibodies by controlling the Fc-attached sugar chain structure of antibodies. Among them, it has been found that afucosylated glycan increases the ADCC efficacy of antibodies.
  • GlycArt developed GlycoMAb technology that improves ADCC performance by reducing the fucose carbohydrate content, and Biowa introduced Potelligent technology by knocking out the FUT8 gene.
  • this glycosylation technology was applied to trastuzumab, afucosylated trastuzumab (TrasGEX) was produced, and non-clinical research results showed that it had a significantly superior cancer cell proliferation inhibition effect compared to existing trastuzumab.
  • biopharmaceuticals are produced using animal cells, E. coli, or yeast, but production is not easy due to high production costs.
  • the present inventor made efforts to develop a Biobetter product with significant effects, and as a result, produced a vector suitable for the PhytoRice cell line (Korean application number: 10-2020-0090189), a plant cell platform. A monoclonal antibody with remarkable effectiveness was prepared. Since the cost of culturing plant cells is lower than that of animal cells, it is expected that large amounts of improved trastuzumab can be produced at a significantly lower cost.
  • One aspect is to provide a recombinant vector for rice transformation, including a rice-derived ⁇ -amylase 3D (RAmy3D) promoter and a monoclonal antibody coding gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • RAmy3D rice-derived ⁇ -amylase 3D
  • Another aspect is to provide rice transformed with the above recombinant transformation vector.
  • Another aspect includes constructing a recombinant vector for rice transformation, comprising a rice-derived ⁇ -amylase 3D (RAmy3D) promoter and a monoclonal antibody coding gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1; Transforming the constructed recombinant vector for rice transformation into rice; and cultivating transformed rice to obtain a monoclonal antibody.
  • a recombinant vector for rice transformation comprising a rice-derived ⁇ -amylase 3D (RAmy3D) promoter and a monoclonal antibody coding gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • Transforming the constructed recombinant vector for rice transformation into rice and cultivating transformed rice to obtain a monoclonal antibody.
  • Another aspect is to provide a monoclonal antibody produced by the above production method.
  • One aspect is a rice trait, including a rice-derived ⁇ -amylase 3D (RAmy3D) promoter, a monoclonal antibody light chain synthesis gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1, and a monoclonal antibody heavy chain synthesis gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Rmy3D rice-derived ⁇ -amylase 3D
  • a monoclonal antibody light chain synthesis gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1
  • a monoclonal antibody heavy chain synthesis gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • vector refers to a means for expressing a gene of interest in a host cell. refers to DNA fragment(s) or nucleic acid molecules that are delivered into a cell, replicate DNA, and can reproduce independently in the host cell.
  • “Expression vector” means a recombinant DNA molecule containing a coding sequence of interest and an appropriate nucleic acid sequence necessary to express the operably linked coding sequence in a particular host organism.
  • the expression vector may include one or more replication origins, promoters, selection markers, enhancers, termination signals, and polyadenylation sequences available in eukaryotic cells. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or may contain elements of both.
  • expression vector refers to a recombinant DNA or RNA construct, such as a plasmid, phage, recombinant virus or other vector that, upon introduction into a suitable host cell, results in the expression of the cloned DNA.
  • Suitable expression vectors are well known to those skilled in the art and include those that are replicable in eukaryotic and/or prokaryotic cells and those that remain episomal or integrate into the host cell genome.
  • the vector may be a recombinant expression vector.
  • a preferred example of an expression vector is the Ti-plasmid vector, which is capable of transferring part of itself, the so-called T-region, into plant cells when present in a suitable host such as Agrobacterium tumefaciens.
  • Another type of Ti-plasmid vector (see EP 0 116 718 B1) is currently used to transfer hybrid DNA sequences into plant cells or protoplasts from which new plants can be produced with the hybrid DNA properly inserted into the plant's genome.
  • a particularly preferred form of Ti-plasmid vectors are the so-called binary vectors as claimed in EP 0 120 516 B1 and US Pat. No. 4,940,838.
  • viral vectors such as those that may be derived from double-stranded plant viruses (e.g., CaMV) and single-stranded viruses, geminiviruses, etc., e.g., non-intact plant viruses. It may be selected from viral vectors. The use of such vectors can be particularly advantageous when it is difficult to properly transform plant hosts.
  • the expression vector will preferably include one or more selectable markers.
  • the marker is a nucleic acid sequence that has characteristics that can be generally selected by chemical methods, and includes all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells.
  • herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin
  • antibiotic resistance genes such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol. , but is not limited to this.
  • the promoter of the plant expression vector may be CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, RAmy 3D, MAS, or histone promoter, but is not limited thereto.
  • the term "promoter” refers to the region of DNA upstream from a structural gene and refers to the DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription.
  • a “plant promoter” is a promoter capable of initiating transcription in plant cells.
  • a “constitutive promoter” is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental states or cell differentiation. Constitutive promoters may be preferred in the present invention because selection of transformants can be accomplished at various stages and by various tissues. Therefore, constitutive promoters do not limit selection possibilities.
  • the vector can use a common terminator, examples of which include nopaline synthase (NOS), rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, and agrobacterium tumefaciens terminator. These include, but are not limited to, the terminator of the Octopine gene. Regarding the necessity of terminators, it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of terminators may be highly desirable in the context of the present invention.
  • NOS nopaline synthase
  • rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator include, but are not limited to, the terminator of the Octopine gene.
  • the recombinant vector can be constructed using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter capable of advancing transcription e.g., pL ⁇ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., pL ⁇ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., pL ⁇ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • the origin of replication operating in the eukaryotic cell included in the vector includes the f1 origin of replication, SV40 origin of replication, pMB1 origin of replication, adeno origin of replication, AAV origin of replication, and BBV origin of replication. It is not limited. Additionally, it usually has a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • Plant transformation refers to any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily require a regeneration and/or tissue culture period. Transformation of plant species is now common for plant species including both monocots as well as dicots. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells.
  • the method is the calcium/polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373). Electroporation (Shillito RD et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), microinjection into plant elements (Crossway A.
  • Agrobacterium tumfaciens by infiltration of plants or transformation of mature pollen or spores. It can be appropriately selected from mediated gene transfer (non-complete), infection by viruses, etc.
  • a preferred method according to the invention involves DNA transfer mediated by the genus Agrobacterium .
  • the vector may be pPM102 of the structure shown in Figure 2, but is not limited thereto.
  • the vector may be codon optimized to express Trastuzumab in rice.
  • codon optimization means that the use of codons is optimized for each biological species in order to optimize protein synthesis. Since the optimized codon is different depending on the species, codon optimization is necessary even when you want to efficiently express a desired protein in another species. For example, when a human protein is expressed in E. coli. If the codons encoding the same amino acid are changed to those mainly used by E. coli, the protein can be expressed more efficiently.
  • the term “rice” may refer to plant cells of rice.
  • the “plant cell” used for plant transformation may be any type of cultured cell, cultured tissue, cultured organ or whole plant, preferably cultured cell, cultured tissue or cultured organ and more preferably cultured cell. there is.
  • Plant refers to differentiated or undifferentiated plant tissues, such as, but not limited to, roots, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues, and various types of cells used in culture, such as single cells, protoplasts ( protoplast), shoot and callus tissue.
  • Plant tissue may be in planta or in organ culture, tissue culture, or cell culture.
  • the method of selecting the transformed host cells can be easily performed according to methods well known in the art, using the phenotype expressed by the selection marker.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
  • the term “monoclonal antibody” may refer to a monoclonal antibody produced in rice.
  • the monoclonal antibody produced in rice has the same secondary and tertiary protein structures as trastuzumab, but has a different sugar chain structure as G0.
  • the G0 sugar chain structure refers to a sugar chain in the form (G0) that ends with GlcNA without galactose.
  • the monoclonal antibody produced from rice may be produced in small amounts having a G0-Gn structure.
  • Another aspect provides rice transformed with the above recombinant vector for rice transformation.
  • Another aspect includes constructing a recombinant vector for rice transformation, comprising a rice-derived ⁇ -amylase 3D (RAmy3D) promoter and a monoclonal antibody coding gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1; Transforming the constructed recombinant vector for rice transformation into rice; and culturing the transformed rice to obtain a monoclonal antibody.
  • a recombinant vector for rice transformation comprising a rice-derived ⁇ -amylase 3D (RAmy3D) promoter and a monoclonal antibody coding gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • Another aspect provides a monoclonal antibody produced by the above production method.
  • the monoclonal antibody of the present invention is manufactured from a plant cell platform, it can be produced at a very low cost compared to that manufactured from existing animal cells, and the monoclonal antibody manufactured from the plant cell platform has a plant-specific carbohydrate structure. Since it does not have any side effects, it is free from side effects compared to existing substances produced from plant cells.
  • Figure 1 is a diagram showing the N-glycan structure of PhytoRice, a plant cell line.
  • Figure 2 is a schematic diagram of the pPM102 vector, a vector for expressing monoclonal antibodies.
  • Figure 3 is a diagram showing the location where the pPM102 vector was inserted through transformation.
  • Figure 4 is a diagram showing the purification of a monoclonal antibody with increased efficacy produced from a plant cell line transformed by the vector.
  • Figure 5 is a diagram confirming the N-sugar chain structure of a monoclonal antibody produced in a plant cell line transformed by the above vector through MALDI-TOF.
  • Figure 6 is a diagram confirming the N-sugar chain structure of a monoclonal antibody produced in a plant cell line transformed with the above vector through UPLC-FLD.
  • Figure 7 is a diagram showing the secondary structure of a monoclonal antibody produced in a plant cell line transformed with the vector.
  • Figure 8 is a diagram showing the tertiary structure of a monoclonal antibody produced in a plant cell line transformed with the vector.
  • Figure 9 is a diagram confirming the cancer cell proliferation inhibitory effect of a monoclonal antibody produced in a plant cell line transformed by the above vector.
  • Figure 10 is a diagram confirming antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) of a monoclonal antibody produced in a plant cell line transformed by the vector.
  • ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity
  • the plant cell line for producing the improved monoclonal antibody was the plant-specific glycosylation gene mutant cell line of Korean Patent Publication No. 10-2022-0011373. Specifically, the PMOsC1 cell line, a plant cell line from which all plant-specific carbohydrates have been removed, was used.
  • TMab_LC optimal heavy chain gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the optimal light chain gene (hereinafter referred to as TMab_LC) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 were cloned under the RAmy3D promoter.
  • TMab_LC optimal light chain gene
  • the pPM102 vector consisting of an ORF fused with the signal peptide sequence of the RAmy3E gene (MGKHHVTLCCVVFAVLCLASSLAQA; SEQ ID NO. 3) and the RAmy3D terminator sequence was constructed (FIG. 2).
  • Agrobacterium-mediated transformation was performed on the pPM102 vector cloned into E. coli prepared in Example 1-2 above into the plant cell line. As a result of checking the copy number and insertion location of the T-DNA inserted into the plant, it was confirmed that 1 copy was inserted at position 27799415 (the first exon of LOC_Os07g46540) on chromosome 7 of rice ( Figure 3). After identifying the characteristics of each cell line through characterization of the transformed cell lines, immunoblotting was performed on the 64 lines initially selected with antibiotics to determine the final line that expressed the target protein at the highest level (hereinafter referred to as Phyto101). was successfully established.
  • the transformed plant callus was cultured in suspension for 1 week, and then the cells were treated with induction medium and incubated for 7 days.
  • the culture medium was separated and recovered through centrifugation, filtered to a depth of 0.2 ⁇ m, and concentrated by ultrafiltration using Vivaspin (50 MWCO, Sartorius). After final purification of the filter solution using Protein A column and ion column, 2 ⁇ g was confirmed on SDS/PAGE gel. As a result, as shown in Figure 4, it was confirmed that the candidate monoclonal antibody was produced normally.
  • the N-saccharide structure of the monoclonal antibody purified in Example 3 was analyzed using matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS).
  • MALDI-TOF MS matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry
  • WT-TMAb trastuzumab
  • the N-carbohydrate structure of the monoclonal antibody of the present invention was analyzed in depth by UPLC-FLD (ultra-high performance liquid chromatography linked with fluorescence detection) method. As a result, as shown in Figure 6, similar to the MALDI-TOF results, it was confirmed that most of the G0 (about 94%) sugar structure was present. In addition to the G0 sugar structure, a trace amount (about 6%) of G0-Gn structure was also detected. It has been done.
  • the secondary and tertiary structures are the same as Herceptin, which has been previously confirmed to be commercially available, but the fucose carbohydrate is removed. It was confirmed that mass production of monoclonal antibodies was possible.
  • CCK-8 cell proliferation assay was performed using breast cancer cells. As a result, as shown in Figure 9, starting at 333 ng/ml, the cell proliferation rate was lower than that of Herceptin, and at a concentration of 1 ⁇ g/ml or more, there was a significant difference from Herceptin.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • the candidate substance has the same secondary and tertiary structures as commercially available Herceptin and has similar effects.
  • the sugar chain had a G0 form (including a trace amount of G0-Gn sugar chain structure).
  • trastuzumab which is produced from plant cells, which has a low ADCC and a plant-specific carbohydrate structure that may cause immunogenicity when administered to the human body, it has a more remarkable effect than Herceptin under certain concentration conditions.
  • it is optimized to be produced from plant cells, especially rice, rather than animal cells, it can be produced in large quantities at a significantly lower cost than before.

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Abstract

본 발명은 단일클론항체 코딩 유전자를 포함하는, N-당질화 돌연변이 벼를 이용한 단일클론항체 생산용 벼의 제조방법 및 이에 의해 제조된 단일클론항체에 관한 것으로서, 식물 세포의 단일클론항체 생산에 최적화된 벡터를 제조하였다. 상기 단일클론항체는 식물 세포 플랫폼에서 제조된 것이기에, 기존의 동물 세포에서 제조된 것에 비해 매우 저렴한 비용으로도 생산이 가능하며, 상기 식물 세포 플랫폼에서 제조된 단일클론항체는 식물 특유의 당질 구조를 가지고 있기 않기에, 기존에 식물 세포로 생산된 물질에 비해 부작용 문제에서도 자유롭다.

Description

N-당질화 돌연변이 벼를 이용한 단일클론항체 생산용 벼의 제조방법 및 이에 의해 제조된 단일클론항체
본 출원은 2022년 11월 2일 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2022-0144615호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
N-당질화 돌연변이 벼를 이용한 단일클론항체 생산용 벼의 제조방법 및 이에 의해 제조된 단일클론항체에 관한 것이다.
현재 생산되는 항체 등의 바이오의약품의 70%는 특정 부위에 당사슬이 부착된 당단백질이다. 단백질 서열 중 Asn-X-Ser/Thr 잔기의 Asn(N)에 당사슬을 부착하는 N-당질화는 모든 진핵생물에서 발생하는 대표적인 단백질번역후변형(post-translational modification, PTMs)과정에 해당한다. N-당사슬은 당 단백질의 효능, 구조, 안정성, 기질의 인식 등 매우 중요한 기능을 가지고 있으며 단백질 합성 숙주에 따라 다양한 구조의 당 사슬이 부가된다. 이러한 당사슬의 성분과 구조에 따라 바이오의약품의 유효성이나 안정성(체내 지속성)이 달라질 수 있으며, 인체 반복 투여 시 이러한 이질적인 당질에 대한 면역원성이 나타날 수도 있다.
항체의 Fc 부위는 면역세포 Fc 수용체와의 결합으로 유도되는 antibody dependent cell cytotoxicity (ADCC)와 complement dependent cytotoxicity (CDC) 반응과 같은 effector 기능에 중요한 역할을 하며 이러한 반응은 항체치료제의 치료 효능을 결정하는 주요 인자로서, 항체의 결합 친화력은 Fc 부위에 부가되는 당사슬 구조에 의해 달라질 수 있다. 특히 fucose 당질이 부착된 경우 이러한 effector 기능이 현저히 감소되는 것으로 보고된다. 이에 따라 항체의 Fc 부착 당사슬 구조를 제어하여 항체의 치료 효능을 극대화하기 위한 당사슬 공학이 대두되었으며, 그 중에서도 fucose 없는 당질(afucosylated glycan)이 항체의 ADCC 효능을 증가시킨다는 사실이 밝혀졌다.
상기와 같은 내용에 기반하여, GlycArt사는 fucose 당질 함량을 감소시켜 ADCC 성능을 향상시키는 GlycoMAb 기술을 개발하였고, Biowa사는 FUT8 유전자 knock-out하여 포텔리전트(Potelligent) 기술을 선보였다. 또한, 트라스트주맙(trastuzumab)에도, 이러한 당질화 기술을 적용하였을 때, afucosylated trastuzumab(TrasGEX)이 생산되었으며, 비임상연구 결과, 이는 기존의 트라스트주맙에 비해 현저히 뛰어난 암세포 증식 억제 효과가 있음이 밝혀졌다. 이러한 물질을 생산하기 위하여 동물세포 혹은 대장균이나 효모를 이용하여 바이오 의약품들이 생산되고 있지만, 생산비용이 높기에 생산이 쉽지 않은 실정이다.
상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 본 발명자는 현저한 효과를 가지는 바이오베터(Biobetter) 제품을 개발하기 위해 노력한 결과, 식물 세포 플랫폼인 PhytoRice 세포주(한국 출원번호: 10-2020-0090189)에 적합한 벡터를 제작하여 현저한 효과를 갖는 단일클론항체을 제조하였다. 상기 식물 세포는 동물 세포에 비해 배양에 필요한 비용이 저렴하기에, 현저하게 낮은 비용으로도 다량의 개선된 트라스트주맙을 제조할 수 있을 것으로 예상된다.
일 양상은 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 단일클론항체 코딩 유전자를 포함하는, 벼 형질전환용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 단일클론항체 코딩 유전자를 포함하는, 벼 형질전환용 재조합 벡터를 구성하는 단계; 상기 구성된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 벼에 형질전환하는 단계; 및 형질전환된 벼를 배양하여 단일클론항체를 수득하는 단계를 포함하는, 단일클론항체 대량생산방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 생산방법에 의해 생산된, 단일클론항체를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일 양상은 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 단일클론항체 경쇄 합성 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 단일클론항체 중쇄 합성 유전자를 포함하는, 벼 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, DNA를 복제하고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현벡터는 진핵세포에서 이용 가능한 하나 이상의 복제기점, 프로모터, 선택마커, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.
상기 벡터는 재조합 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다.
DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 제미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 식물 발현 벡터의 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, RAmy 3D, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다. 또한 상기 벡터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ　프로모터, CMV 프로모터,　trp　프로모터,　lac　프로모터,　tac　프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium)속에 의해 매개된 DNA 전달을 포함한다. 상기 벡터는 도 2에 개시된 구조의 pPM102일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터는 벼에서 트라스트주맙(Trastuzumab)이 발현되도록 코돈 최적화(codon optimization)된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "코돈 최적화"는 단백질 합성을 최적화하기 위해 각 생물종 마다 코돈의 사용이 최적화된 것을 의미한다. 생물 종에 따라 최적화 코돈이 다르기 때문에 원하는 단백질을 다른 생물 종에서 효율적으로 발현시키고자 하는 경우에도 코돈 최적화가 필요하다. 예를 들어, 사람의 단백질을 대장균에서 발현시킬 경우. 같은 아미노산을 암호화하고 있는 코돈들 중에서 대장균이 주로 사용하는 코돈으로 바꾸게 되면 단백질이 더 효율적으로 발현될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "벼"는 벼의 식물세포를 의미하는 것일 수 있다. 또한, 식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 될 수 있다. "식물"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "단일클론항체"는 벼에서 생산된 단일클론항체를 의미하는 것일 수 있다. 상기 벼에서 생산된 단일클론항체는 트라스트주맙과 동일한 2차 및 3차 단백질 구조를 가지나, 당사슬 구조가 G0으로서 상이하다. 상기 G0 당사슬 구조는 갈락토스없이 GlcNA으로 끝나는 형태(G0)의 당사슬을 의미한다. 또한, 상기 벼에서 생산된 단일클론항체는 G0-Gn 구조를 가지는 것이 미량 생산될 수 있다.
다른 양상은 상기 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼를 제공한다.
또 다른 양상은 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 단일클론항체 코딩 유전자를 포함하는, 벼 형질전환용 재조합 벡터를 구성하는 단계; 상기 구성된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 벼에 형질전환하는 단계; 및 형질전환된 벼를 배양하여 단일클론항체를 수득하는 단계를 포함하는, 단일클론항체 대량생산방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 생산방법에 의해 생산된 단일클론항체를 제공한다.
본 발명의 단일클론항체는 식물 세포 플랫폼에서 제조된 것이기에, 기존의 동물 세포에서 제조된 것에 비해 매우 저렴한 비용으로도 생산이 가능하며, 상기 식물 세포 플랫폼에서 제조된 단일클론항체는 식물 특유의 당질 구조를 가지고 있기 않기에, 기존에 식물 세포로 생산된 물질에 비해 부작용 문제에서도 자유롭다.
단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 식물 세포주인 PhytoRice의 N-당사슬(N-glycan) 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 단일클론항체 발현용 벡터인 pPM102 벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 형질전환을 통해 pPM102 벡터가 삽입된 위치를 나타낸 도이다.
도 4는 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물 세포주에서 생산된 효능이 증진된 단일클론항체를 정제한 모습을 나타낸 도이다.
도 5는 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물 세포주에서 생산된 단일클론항체의 N-당사슬 구조를 MALDI-TOF를 통해 확인한 도이다.
도 6은 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물 세포주에서 생산된 단일클론항체의 N-당사슬 구조를 UPLC-FLD를 통해 확인한 도이다.
도 7은 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물 세포주에서 생산된 단일클론항체의 2차 구조를 나타낸 도이다.
도 8은 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물 세포주에서 생산된 단일클론항체의 3차 구조를 나타낸 도이다.
도 9는 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물 세포주에서 생산된 단일클론항체의 암세포 증식 억제효과를 확인한 도이다.
도 10은 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물 세포주에서 생산된 단일클론항체의 항체 의존성 세포 독성(Antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 확인한 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise, include)"및/또는 "포함하는(comprising, including)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
[실시예]
실시예 1. 단일클론항체 발현용 pPM102 벡터의 제조
1-1. 식물 세포주의 준비
개선된 단일클론항체를 생산하기 위한 식물 세포주는 한국 공개특허 10-2022-0011373의 식물 특이적 당질화 유전자 돌연변이 세포주를 사용하였다. 구체적으로, 식물특이적인 당질이 모두 제거된 식물세포주인 PMOsC1 세포주를 사용하였다.
1-2. 단일클론항체 발현용 벡터의 준비
상기 식물 세포주를 활용하여 단일클론항체인 트라스트주맙을 생산하기 위한 최적화된 벡터를 제조하였다. 식물 세포주에서 트라스트주맙을 생산하기 위하여, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 최적의 중사슬 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 최적의 경사슬 유전자(이하, TMab_LC)를 RAmy3D 프로모터하에 클로닝하였다. 구체적으로 RAmy3E 유전자의 신호펩타이드 서열(MGKHHVTLCCVVFAVLCLASSLAQA; 서열번호 3)과 융합한 ORF와 RAmy3D 터미네이터 서열로 이루어진 pPM102 벡터를 제작하였다(도 2).
실시예 2. 식물 형질전환 및 선별
식물 세포주에 상기 실시예 1-2에서 제조한 대장균에 클로닝한 pPM102벡터를 Agrobacterium 매개 형질전환(transformation)을 수행하였다. 식물체로 삽입된 T-DNA의 copy 수 및 삽입위치 등을 확인한 결과, 벼의 7번 염색체의 27799415 위치(LOC_Os07g46540의 첫번째 Exon)에 1 copy 삽입됨을 확인하였다(도 3). 형질전환된 세포주들에 대한 특성 분석을 통해 각 세포주들의 특성을 파악한 다음, 항생제로 1차 선발된 64개 라인에서, 면역블롯팅을 수행하여 타겟단백질을 가장 높게 발현하는 최종 라인(이하, Phyto101)을 성공적으로 확립하였다.
실시예 3. 단일클론항체의 제조 및 정제
형질전환된 식물 캘러스를 1주일간 현탁배양한 다음, 세포들을 유도배지로 처리하여 7일간 유도배양하였다. 원심분리를 통해 배양액을 분리 회수하고 0.2 μm depth filter 후 Vivaspin(50 MWCO, Sartorius)로 ultrafiltration하여 농축하였다. 필터액을 Protein A 컬럼, 이온컬럼으로 최종정제 후 2 μg을 SDS/PAGE gel에서 확인하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 후보물질인 단일클론항체가 정상적으로 생산됨을 확인하였다.
실시예 4. 단일클론항체의 특성 확인
4-1. N-당사슬 구조 확인
MALDI-TOF MS(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry)를 이용하여 상기 실시예 3에서 정제된 단일클론항체의 N-당질 구조를 분석하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 시판되는 트라스트주맙인 허셉틴(Herception)은 대부분 fucose가 결합된 당질구조를 가지고 있는 것으로 확인되었나, 본 발명 세포주에서 생산된 단일클론항체(HERGREEN)는 G0의 당질 구조를 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 야생형 식물세포에서 발현되는 트라스트주맙(WT-TMAb)의 구조를 확인했을 때에도, WT-TMab은 β1,2-xylose와 α1,3-fucose가 부착된 식물특이적 당질구조를 가지고 있음을 확인하였다.
본 발명의 단일클론항체의 N-당질 구조를 UPLC-FLD(ultra-high performance liquid chromatography linked with fluorescence detection) 방법으로 심층분석하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, MALDI-TOF 결과와 유사하게 대부분 G0(약 94%)의 당질구조를 가지고 있음을 확인하였으며, G0 당질구조 이외에도 G0-Gn 구조도 미량(약 6%) 검출되었다.
4-2. 입체 구조 확인
상기 실시예 3에서 정제된 단일클론항체의 2차 구조를 확인하기 위하여, Far UV Circular Dichroism(CD) 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 기존에 시판되고 있는 트라스트주맙인 허셉틴과 동일한 2차 구조를 가지고 있음을 확인하였다. 단백질의 3차 구조를 Near UV CD로 분석했을 때에도, 도 9에 나타낸 바와 같이, 허셉틴과 동일한 3차 구조를 가지고 있음을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해, 식물 세포주 최적화된 pPM102 벡터를 사용하여 단일클론항체를 생산하는 경우, 기존에 유용성이 확인되어 시판되고 있는 허셉틴과 2차 구조 및 3차 구조가 동일하면서도, fucose 당질이 제거된 단일클론항체를 대량생산 할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 단일클론항체의 항암 효과 확인
5-1. 암세포 증식 억제효과 확인
식물 세포주 최적화된 벡터를 사용하여 생산한 단일클론항체가 유사한 구조를 가지는 허셉틴과 유사한 효과를 가지고 있는지 확인하였다. 유방암세포를 사용하여 CCK-8 세포증식 분석(cell proliferation assay)을 수행하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 333 ng/ml을 기점으로 허셉틴에 비해 낮은 세포 증식률을 나타내었으며, 1 μg/ml 이상의 농도에서는 허셉틴과 현저한 수준의 차이를 나타내었다.
상기와 같은 결과는 후보물질이 트라스트주맙과 같이 HER2 수용체와 결합하는 특성을 가지고 있음을 시사한다.
5-2. 항체 의존성 세포 독성 확인
후보물질의 항체 의존성 세포 독성(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 효능을 조사하기 위하여, in vitro ADCC assay를 수행하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 1 ~50 ng/ml의 저농도에서 허셉틴보다 우수한 ADCC를 나타내는 것을 확인하였으며, 그 외의 농도에는 허셉틴과 유사한 수준의 ADCC를 나타내었다. 또한, 상기 CCK-8를 활용한 세포증식 분석에서 허셉틴과 유사한 세포증식 억제 효능을 보여 주었던, 야생형 식물세포 생산 트라스트주맙(WT-TM)은 확연하게 낮은 ADCC를 보여주었다.
상기와 같은 결과를 통해, 상기 후보물질은 시판중인 허셉틴과 동일한 2차 및 3차 구조를 가지고 있어 유사한 효과를 가지고 있다. 또한, 당사슬이 G0 형태(미량의 G0-Gn 당사슬 구조 포함)를 가지고 있는 것으로 확인된다. 이는 ADCC가 낮고, 식물 특이적인 당질구조를 가져 인체 투여시 면역원성을 유발할 가능성이 있는 식물세포에서 생산된 트라스트주맙과 달리, 특정 농도 조건에서는 오히려 허셉틴 보다도 현저한 효과를 가지고 있다. 더욱이, 동물 세포가 아닌 식물 세포, 그 중에서도 벼에서 생산될 수 있도록 최적화된 것이기에, 기존보다 현저하게 저렴한 비용으로 대량으로 생산할 수 있다.

Claims (9)

  1. 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 단일클론항체 경쇄 합성 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 단일클론항체 중쇄 합성 유전자를 포함하는, 벼 형질전환용 재조합 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 도 2a에 개시된 구조의 pPM102인 것을 특징으로 하는 벼 형질전환용 재조합 벡터.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 벼에서 트라스트주맙(Trastuzumab)이 발현되도록 코돈 최적화(codon optimization)된 것인, 벼 형질전환용 재조합 벡터.
  4. 청구항 1항 내지 청구항 3항 중, 어느 한 항의 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼.
  5. 청구항 4항에 있어서, 상기 벼는 벼 캘러스인 것인, 형질전환된 벼.
  6. 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 단일클론항체 코딩 유전자를 포함하는, 벼 형질전환용 재조합 벡터를 구성하는 단계;
    상기 구성된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 벼에 형질전환하는 단계; 및
    형질전환된 벼를 배양하여 단일클론항체를 수득하는 단계;
    를 포함하는, 단일클론항체 대량생산방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 형질전환은 아그로박테리움(Agrobacterium)속에 의한 것인, 단일클론항체 대량생산방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 벼는 벼 캘러스인 것인, 단일클론항체 대량생산방법.
  9. 청구항 6의 생산방법에 의해 생산된, 단일클론항체.
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