KR102370615B1 - 식물 특이적 n-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법 - Google Patents

식물 특이적 n-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 α1,3-퓨코실트랜스퍼라제(fucosyltransferase) 및 β1,2-자일로실트랜스퍼라제(xylosyltransferase) 유전자가 녹-아웃된 벼 식물세포는 α1,3-퓨코스와 β1,2-자일로스가 제거된 당단백질을 생산하며 기존의 식물세포와 단백질에 당쇄가 붙는 패턴이 상이하여, 항체 또는 백신용 재조합 단백질 생산을 위한 새로운 숙주세포로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법{Method for producing genome-edited plant cells expressing glycoproteins without plant specific N-glycans}
본 발명은 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법에 관한 것이다.
N-당화(N-glycosylation) 과정은 거의 모든 진핵 생물에서 당단백질의 번역 후 변형(post-translational modification) 과정 중에 일어나는 생물학적 경로이다. N-당사슬은 올리고만노시드 코어 구조(Man3GlcNAc2)로 알려진 공통 구조를 가지고 있지만, 결합된 당의 종류 및 이들의 결합 형성 위치 및 방법은 매우 다양하다.
식물의 N-당화 경로는 포유류의 그것과 상당히 다른데, 식물 특이적 N-당사슬인 α1,3-퓨코스(Fucose), β1,2-자일로스(xylose), β1,3-갈락토스(galactose), α1,4-퓨코스는 당화과정 경로에서 N-글리칸 코어구조에 부착되어 고유한 식물 N-당사슬(glycan) 구조를 형성한다. 식물계 내에서 N-당화 과정은 상당히 유사한 경로로 구성된다. 최근 수십 년간, 식물은 온전한 단백질 접힘(folding), 비용 대비 효과, 단순성 및 안전성과 같은 장점을 지닌 매력적인 치료용 단백질 발현 및 생산 숙주로서 인정받고 있음에도 불구하고, 식물성 유래 재조합 단백질을 포함하는 의약품이 인간에게 면역원성을 유도할 수 있다는 가능성이 제시됨에 따라 이러한 우려를 극복하기 위한 식물에서의 N-당사슬 공학 기술이 다양하게 연구되고 있다.
식물에서 α1,3-퓨코실트랜스퍼라제(α1,3-fucosyltransferase; 이하, α1,3-fucT)와 β1,2-자일로실트랜스퍼라제(β1,2-xylosyltransferase; 이하, β1,2-xylT)의 기능은 독립적으로 이루어진다. 애기장대 (Arabidopsis thaliana)와 담배 (Nicotiana benthamiana)에서 α1,3-fucT와 β1,2-xylT를 각각 단독으로 하향 조절(down-regulation) 하였을 때, 이들 각각은 서로의 기능에 영향을 미치지 않는 것으로 보고되었다. 마찬가지로, 벼에서는 T-DNA 삽입에 의해 β1,2-xylT 유전자가 기능하지 않는 돌연변이 세포주를 분석하였을 때, N-당사슬 프로파일링 데이터에서 β1,2-자일로스를 함유한 N-당사슬은 검출되지 않았지만 α1,3-퓨코스는 여전히 남아 있었다. 이는 α1,3-fucT와 β1,2-xylT를 동시에 하향 조절해야 할 필요가 있음을 의미하였다. 다만, 벼에서 α1,3-fucT 돌연변이에 대해서는 분석이 되지 않았으므로, α1,3-fucT의 하향 조절이 β1,2-자일로스 부착에 영향을 미치는지는 밝혀진 바가 없었다.
담배와 벼 (Oryza sativa)에서 RNA 간섭에 의한 α1,3-fucT 및 β1,2-xylT의 하향조절 연구가 이루어졌다. 이들 식물에서 발현된 재조합 단백질에서는 α1,3-퓨코스와 β1,2-자일로스가 부착되지 않은 GnGn 형태의 N-당사슬(GlcNAc2Man3GlcNAc2)이 증가한 것으로 확인되었다. 마찬가지로 담배 (N. tabacum) 유래 BY-2 세포에서 α1,3-fucT 및 β1,2-XylT의 이중 녹-아웃(double knock-out) 돌연변이는 식물 특이적 N-당사슬이 없는 당단백질을 생산하는 것으로 보고되었다. 또한, 상기 이중 녹-아웃 돌연변이는 이후의 β1,3-갈락토실트랜스퍼라제(β1,3-galactosyltransferase)와 α1,4-퓨코실트랜스퍼라제의 기능 또한 저해됨이 확인되었는데, 이는 이들 효소가 α1,3-퓨코스와 β1,2-자일로스의 부착을 요구함을 의미한다. 이러한 배경에서 벼 또한 당단백질의 생산에 있어 유사한 N-당화 경로를 사용할 것으로 생각되었다.
벼에서는 β1,2-xylT를 코딩하는 단일 유전자에 T-DNA 삽입이 이루어졌을 때, β1,2-자일로스 부착이 일어나지 않음이 보고되었다. 또한 β1,2-xylT와 α1,3-fucT의 각 단일 유전자를 대상으로 siRNA(small interfering RNA)를 이용한 하향 조절은 α1,3-퓨코스와 β1,2-자일로스를 함유한 N-글리칸의 양을 매우 감소시켰다. 이는 β1,2-자일로스와 α1,3-퓨코스의 부착이 각각 단일 유전자에 의해 일어나거나 혹은 크게 영향받는다는 것을 암시하고 있다.
본 발명은 당화 경로의 초기에 식물 특이적 N-당사슬의 부착이 일어나지 않는 벼 세포주 제조를 위해 CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) 시스템을 사용하여 벼의 α1,3-FuxT 및 β1,2-xylT 유전자를 이중 녹-아웃하기 위해 설계되었다. 기존의 연구 및 추가적인 연구를 통해 sgRNA(single guide RNA)의 서열을 결정하였고, 이를 Cas9을 포함하는 벡터에 삽입 및 벼에 형질전환하여 독특한 형태의 당사슬을 가지는 당단백질을 발현하는 세포주를 개발하였다.
한편, 한국공개특허 제2008-0094918호에는 '식물에서 N-글리칸의 인간화 및 최적화 조성물 및 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2005-0000380호에는 '게놈이 개변된 세포'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 식물 특이적 N-당사슬인 α1,3-퓨코스(Fucose) 및 β1,2-자일로스(xylose)가 제거된(부착되지 않은) 당단백질을 생산하는 벼(Oryza sativa) 세포주를 개발하기 위해, 멀티플렉스 유전체 교정 시스템인 polycistronic tRNA-gRNA CRISPR 시스템을 이용하여 벼의 α1,3-퓨코실트랜스퍼라제(α1,3-fucT) 및 β1,2-자일로실트랜스퍼라제(β1,2-xylT) 유전자를 녹-아웃시킨 결과, 돌연변이 α1,3-fucT/β1,2-xylT 벼 세포의 배양 배지에서 α1,3-퓨코스 또는 β1,2-자일로스가 부착된 형태의 N-당사슬은 검출되지 않았으며, (FA)(FA) 형태[Fuc(α1-4)[Gal(β1-3)]GlcNAc(β1-2)Man(α1-3)[Fuc(α1-4)[Gal(β1-3)]GlcNAc(β1-2)Man(α1-6)]Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc 또는 Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-2Manα1-6(Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc]의 N-당사슬이 전체 당사슬의 45~50 중량%를 차지함을 알 수 있었고, 상기와 같은 돌연변이 α1,3-fucT/β1,2-xylT 벼 세포에서의 N-당화 패턴이 종래 담배(Nicotiana benthamiana) 식물에서 수행된 α1,3-fucT 및 β1,2-xylT 유전자의 이중 녹-아웃에서 확인되는 N-당화 패턴과 매우 상이함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 α1,3-퓨코실트랜스퍼라제(fucosyltransferase) 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 β1,2-자일로실트랜스퍼라제(xylosyltransferase) 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계를 포함하는, 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포 및 상기 식물세포로부터 유래한 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전체 교정 식물세포를 목적 당단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 배양하는 단계를 포함하는 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 목적 당단백질의 생산방법 및 상기 생산방법에 의해 생산된 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 목적 당단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 α1,3-퓨코실트랜스퍼라제 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 β1,2-자일로실트랜스퍼라제 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하기 위한 벼 식물세포 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식물 특이적 N-당사슬인 α1,3-퓨코스와 β1,2-자일로스가 제거된 당단백질을 생산하는 벼 세포는 기존의 식물세포와 단백질에 당쇄가 붙는 패턴이 상이하여, 항체 또는 백신용 재조합 단백질 생산을 위한 새로운 숙주세포로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 벼의 α1,3-fucT에 대한 T-DNA 삽입 돌연변이체에서 T-DNA 삽입 방향 및 프라이머 위치에 대한 모식도(A)와 PCR을 통한 동일좌 위에서의 T-DNA 삽입 여부를 확인한 결과(B)이다.
도 2는 α1,3-fucT 돌연변이 벼에서 β1,2-자일로스와 α1,3-퓨코스에 대한 SDS-PAGE 겔 사진(A 및 D) 및 웨스턴 블롯 결과(B, C, E 및 F)이다.
도 3은 α1,3-fucT 돌연변이 벼의 질량 분석 방법을 이용한 N-당사슬 분석 결과이다.
도 4는 α1,3-fucT 및 β1,2-xylT의 이중 녹-아웃을 위한 polycistronic tRNA-gRNA CRISPR 시스템 벡터 제작을 위한 PCR 클로닝 도식 및 polycistronic tRNA-gRNA 부위의 최종 클로닝 모습을 보여준다.
도 5는 α1,3-fucT 및 β1,2-xylT의 이중 녹-아웃을 위한 polycistronic tRNA-gRNA CRISPR 시스템 벡터의 모식도(A 및 B) 및 상기 벡터로 형질전환된 벼 세포의 PCR 결과(C)이다.
도 6은 α1,3-fucT/β1,2-XylT 돌연변이 벼 #3, 6, 7, 17 및 13 세포주의 SDS-PAGE 겔 사진(A) 및 웨스턴 블롯 결과(B 내지 D)로, (B)는 Lewis A(Lea) 에피토프에 결합하는 JIM84 항체, (C)는 항-퓨코스 항체 그리고 (D)는 항-자일로스 항체를 사용한 결과이다.
도 7은 질량 분석 방법을 이용한 야생형 벼(A) 및 α1,3-fucT/β1,2-XylT 돌연변이 벼(B)의 N-당사슬 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 α1,3-퓨코실트랜스퍼라제(fucosyltransferase) 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 β1,2-자일로실트랜스퍼라제(xylosyltransferase) 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계를 포함하는, 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 식물 특이적 N-당사슬은 올리고만노시드 코어 구조(Man3GlcNAc2)에 부착되는 α1,3-퓨코스(Fucose) 및 β1,2-자일로스(xylose)이다.
본 명세서에서 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 이중가닥의 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 Cas 단백질 및 gRNA를 이용하여 식물세포 또는 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다.
또한, 용어 "표적 서열"은 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물세포 또는 식물체의 유전체 내에 있는 유전자의 일부 DNA를 의미한다. 상기 표적 서열은 유전자의 코딩 영역 및 비-코딩(non-coding) 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물세포 또는 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 서열을 선별할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법에 있어서, 표적 유전자는 α1,3-퓨코실트랜스퍼라제(α1,3-fucT) 유전자 및 β1,2-자일로실트랜스퍼라제(β1,2-xylT) 유전자로, 상기 2개의 유전자는 바람직하게는 벼 유래의 유전자일 수 있고, 각각 벼의 게놈 DNA 염기서열(Accession no. AP014964.1)에서 벼 염색체 8:23273415-23281020(α1,3-fucT)와 벼 염색체 8: 24887866-24891466(β1,2-xylT)에 해당하는 염기서열일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "gRNA(guide RNA, 가이드 RNA)"는 교정 대상 유전자의 표적 서열을 암호화하는 DNA 서열에 특이적인(상보적인) RNA를 의미하며, 표적 DNA 서열과 전부 또는 일부 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 서열로 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 gRNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 엔도뉴클레아제가 표적 DNA 서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 gRNA는 바람직하게는, 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 그 유래 미생물 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법에 있어서, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 gRNA는 crRNA(CRISPR RNA)를 의미하며, 서열번호 12의 염기서열은 벼 유래 α1,3-fucT의 인트론 부위에, 서열번호 13의 염기서열은 벼 유래 α1,3-fucT의 엑손 부위에, 서열번호 14의 염기서열은 벼 유래의 β1,2-xylT의 인트론 부위에, 서열번호 15의 염기서열은 벼 유래 β1,2-xylT의 엑손 부위에 각각 특이적인 서열이다.
또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것 또는 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9(CRISPR associated protin 9), Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 DNA의 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 DNA의 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기 쌍 사이를 추정하여 절단한다.
Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포의 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 표적 유전자의 표적 서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 삽입하고 이를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있는 발현 시스템을 포함하는 모든 플라스미드일 수 있다. 상기 플라스미드는 목적 유전자 발현을 위한 요소(elements)를 포함하는 것으로, 복제원점(replication origin), 프로모터, 작동 유전자(operator), 전사 종결 서열(terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 임의로 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위(ribosome binding site; RBS) 및/또는 전사 조절 인자 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포 및 상기 식물세포로부터 유래한 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 식물세포는 바람직하게는 단자엽 식물 유래 세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 벼(Oryza sativa) 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 벼 세포는 α1,3-퓨코실트랜스퍼라제(fucosyltransferase) 및 β1,2-자일로실트랜스퍼라제(xylosyltransferase) 유전자의 이중 녹-아웃을 통해, 식물 특이적 N-당사슬인 α1,3-퓨코스(Fucose) 및 β1,2-자일로스(xylose)가 부착되지 않은 당단백질을 생산하는 세포로, (FA)(FA) 형태[Fuc(α1-4)[Gal(β1-3)]GlcNAc(β1-2)Man(α1-3)[Fuc(α1-4)[Gal(β1-3)]GlcNAc(β1-2)Man(α1-6)]Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc 또는 Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-2Manα1-6(Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc]의 N-당사슬을 당단백질로부터 분리된 전체 당사슬의 40 중량% 이상으로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 당단백질로부터 분리된 전체 당사슬의 45~50 중량%로 (FA)(FA) 형태의 N-당사슬을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 유전체 교정 식물세포를 목적 당단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 배양하는 단계를 포함하는 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 목적 당단백질의 생산방법 및 상기 생산방법에 의해 생산된 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 목적 당단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 생산방법에 있어서, 상기 유전체 교정 식물세포는 식물 특이적 N-당사슬인 α1,3-퓨코스(Fucose) 및 β1,2-자일로스(xylose)가 부착되지 않은 당단백질을 생산하는 세포로, 생산하고자 하는 목적 당단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 상기 식물세포를 형질전환한 후 세포 배양을 통해 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산할 수 있는 것이다. 상기 목적 당단백질은 이에 한정되지 않으나, 항체 또는 백신용 유용 단백질일 수 있다.
본 발명은 또한, α1,3-퓨코실트랜스퍼라제(fucosyltransferase) 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 β1,2-자일로실트랜스퍼라제(xylosyltransferase) 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하기 위한 벼 식물세포 유전체 교정용 조성물을 제공한다. 본 발명의 유전체 교정용 조성물은, 표적 유전자의 표적 서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하고 있어, 상기 조성물을 식물세포에 처리할 경우, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체가 RNA 유전자 가위로 작동하여 표적 유전자를 교정할 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. α1,3-fucT T-DNA 삽입 돌연변이 벼의 보유 및 분석
α1,3-fucT에 대한 T-DNA 삽입 돌연변이 벼는 RiceGE(K-05274, http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)에서 구입하여 캘러스 유도 배지(4 g/L의 비타민을 포함한 N6 염, 30 g/L의 수크로스, 2 mg/L의 2,4-디클로로아세트산, 0.2 mg/L 키네틴, pH 5.8 멸균 후 50 mg/L의 하이그로마이신 첨가)에 치상하여 캘러스를 유도 및 증식하였다. 두 개의 동일 좌위에 T-DNA가 삽입되었음을 확인하기 위해, 3개의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다(K05274 isect F2: 5'-CAG AAT CGG CCA ATG CCA AG-3', 서열번호 1; K05274 isect R1: 5'-TCA AAT GCA AGA GCA CAA GG-3', 서열번호 2; pGA RBP: 5'-TTG GGG TTT CTA CAG GAC GTA AC-3', 서열번호 3). α1,3-퓨코스의 소멸은 아래 설명된 바와 같이 MALDI-TOF 및 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다.
2. α1,3-fucT 및 β1,2-xylT 유전자의 이중 녹-아웃을 위한 sgRNA 및 벡터 구조 설계
α1,3-fucT 및 β1,2-xylT 유전자의 이중 녹-아웃을 위해, Xie 등 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2015, 112(11):3570-5)에 기술된 바와 같이 endogenous tRNA 처리 시스템을 이용한 CRISPR/Cas9 멀티플렉스 편집('polycistronic tRNA-gRNA CRISPR 시스템')을 사용하였다. 요약하면 α1,3-fucT(벼 염색체 8:23273415-23281020)와 β1,2-xylT(벼 염색체 8: 24887866-24891466)에 해당하는 벼의 게놈 DNA 염기서열(Accession no. AP014964.1)을 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 입수하여 CRISPR-PLANT 데이터베이스(https://www.genome.arizona.edu/crispr/)에서 검색하였다.
α1,3-fucT 및 β1,2-xylT 유전자 당 2개의 sgRNA(α1,3-fucT: gR-FT1-Chr8:23273201-23273221 및 gR-FT2- Chr8:23274079-23274117; β1,2-xylT: gR-XT1-Chr8:24889543-24889563 및 gR-XT2- Chr8:24889911-24889931)을 선택하였다. 구체적으로, pGTR(Addgene, cat no.63143)를 템플릿으로 하고 표 1의 프라이머 세트를 사용하여 도 4A에 개시된 것과 같이 L5AD5-F와 gR-FT-1(1-12) R, gR-FT-1(9-20) F와 gR-FT-2(1-12) R-2nd, gR-FT-2(9-20)와 F-2nd gR-XT-1(1-12) R, gR-XT-1(9-20) F와 gR-XT-2(1-12) R, gR-XT-2(9-20) F와 L3AD5-R 프라이머 세트를 통해 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 결과로 증폭된 각각의 DNA 절편은 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하고 Golden gate cloning의 원리에 따라 조립하였으며 조건은 다음과 같다: BsaI 제한 효소 및 T7 DNA ligase가 있는 상태에서 37℃ 5분 및 20℃ 10분의 과정을 50번 반복한 후 1시간 동안 20℃에서 유지. 조립된 단편은 S5AD5-F와 S3AD5-R의 프라이머 세트를 사용한 PCR에 의해 증폭된 후 FokI으로 절단시켜, BsaI 제한효소로 절단된 pMYD540 (시판되는 pRGEB32(Addgene, cat no. 63142)의 하이그로신 저항성 부위를 포스피노트리신에 대한 저항성 마커(bar)로 치환한 벡터)에 삽입하여 목적하는 pMYD542 벡터를 제조하였다(도 4B 및 도 5A).
Figure 112020014623585-pat00001
3. 벼의 형질전환 및 게놈 유전자를 이용한 효소 중합반응 분석
야생형 벼(Oryza sativa L. cv. Dongjin)로부터 유래된 캘러스는 아그로박테리움을 이용하여 형질전환 되었다. 간략히 설명하자면, pMYD542를 포함하고 있는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105를 N6 액체 배지 (Thompson et al., (1986) Plant Sci. 47:123-133)에 현탁한 뒤 아세토시린곤(acetosyringone) 100 μM를 첨가하고, 상기 배지에 벼 캘러스를 30분간 배양하였다. 아그로박테리움에 감염된 벼 캘러스는 N6CO 한천배지(N6 salts and vitamins supplemented with sucrose (30 g/L), 카사미노산(casamino acids, 1 g/L), 2,4-D (2 mg/L), 글루코스 (10 g/L), 젤라이트 (2 g/L), 아세토시린곤 (100 μM), pH 5.2)에 넣어 28℃에서 3-5일 동안 암배양하였다. 이 캘러스들은 250 mg/L 세포탁심(cefotaxime)을 이용하여 5번 세척한 후, 4.4 ppm의 DL-포스피노트리신(phosphinothricin)과 250 mg/L의 세포탁심이 포함된 N6 캘러스 유도배지에 치상하여 2-3주간 배양되었다. 새로이 생겨난 캘러스들은 새로운 배지로 옮겨져 증식되었으며, 3-4주에 한 번씩, 최소 3번 이상 반복함으로서 병목 현상을 유도한 후 실험에 이용되었다. 이들 세포주에의 목적 유전자 삽입을 확인하기 위해 각각의 캘러스로부터 게노믹 DNA를 Zymobead genomic DNA 키트(Zymo Research, USA)를 이용하여 추출한 후 이를 이용해 PCR이 수행되었다. 표적 유전자(bar)의 검출에는 다음의 프라이머가 이용되었다: PspXI-bar F1: 5'-TTA AAC TCG AGT CAA ATC TCG GTG ACG GGC-3' (서열번호 20) 및 35Sp-HindⅢ R1: 5'-AAA AGC GCG TAA TG TCA TG TCA TCA TCG TTT CC-3' (서열번호 21).
4. 벼 캘러스 배양 및 시료 채취
형질전환 세포를 선별한 뒤, 28℃, 암조건, 100 rpm의 조건으로 회전식진탕기에서 세포 현탁배양을 정립하였다. 세포주 유지를 위해, 현탁 배양은 300 ㎖ 플라스크에서 2 mg/L 2,4-D, 0.02 mg/L 키네틴, 3% 수크로스 및 4.4 ppm DL-PPT를 포함한 N6 배지에서 이루어졌다. 10 ㎖ 부피의 세포들이 매주 계대 배양을 위해 새로운 플라스크로 옮겨졌다. 증식된 캘러스는 다시 100 ㎖의 배지를 포함하는 500 ㎖ 플라스크(10 g/100 ㎖)에 옮겨져 5일마다 계대배양하였다. 남은 배양액은 여과지를 통해 여과한 후 다음 실험까지 -70℃ 냉동고에 보관되었다.
5. 면역블롯(immunoblot) 분석
α1,3-fucose와 β1,2-xylose의 소실을 확인하기 위해, SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)와 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 캘러스는 액체 질소를 이용한 균질화(1 ㎍/㎕의 비율) 후 인산염 완충 식염수(PBS)를 이용하여 재현탁하였으며, 세포 배양액의 경우 위에서 언급한 남은 배양액이 이용되었다. 캘러스 추출물과 배양 배지를 15,000 ×g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 불순물을 제거하였다. 이들 시료(30 ㎕/sample)는 12% 아크릴아미드 겔에 로딩하여 분리시키고, 단백질 밴드는 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue) 시약을 이용하여 확인하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 분리된 단백질은 트랜스퍼 버퍼(50 mM Tris, 40 mM glycine 및 20% methanol)와 mini-transblot 장치(Bio-Rad, USA) 를 이용하여 1시간 동안 150 mA의 전류를 가하는 방법으로 Hybond C 멤브레인(GE healthcare life science, Germany)에 이동시켰다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 멤브레인을 10% non-fat milk를 0.05% Tween-20을 포함한 TBST(Tris-buffered saline buffer)에 녹인 블록킹 용액에 넣고 8시간 가량 반응시켰다. 상기 멤브레인을 세척한 후 각각 1:5,000으로 희석한 rabbit anti-α1,3-fucose antibody(Agrisera), 1:5,000으로 희석한 rabbit anti-β1,2-xylose antibody(Agrisera) 또는 1:256으로 희석된 JIM84 antibody (Horsley et al., 1993, J. Exp. Bot. 44, Supplement p.223-229)로 표지시킨 후 1:7,000으로 희석된 2차 항체 anti-rabbit IgG conjugated to alkaline phosphatase(A6066; Sigma-Aldrich, USA)를 붙여주었다. 발색은 BCIP/NBT 시약(Millipore, USA)을 통해 이루어졌다.
6. 질량 분석 방법을 이용한 N-당사슬 분석
위에서 수집된 돌연변이 벼 세포주의 세포 배양액과 대조군(야생형 벼 세포 배양액)을 15,000 ×g, 4℃로 30분 동안 원심분리하였다. 동결건조기를 이용하여 수분을 제거하여 약 2L의 시료가 농축되었으며, 삼투막을 이용한 투석방법을 이용하여 염을 제거하였다. 이들을 다시 동결건조기를 통해 건조시켰으며, 0.1% 포름산을 이용하여 현탁 및 원심분리하였다. 상층액을 Con A-Sepharose 4B column (GE Healthcare, Sweden)에 적용하였고, 컬럼에 결합한 당단백질은 0.5 M α-D-메틸글루코시드(methylglucoside)로 용출시켰다. 용출물을 다시 동결건조한 후, 2 ㎎의 시료에 50 ㎍의 트립신(T0303; Sigma-Aldrich) 또는 키모트립신(C4129; Sigma-Aldrich)를 처리하고 37℃에서 16시간 동안 반응시켰으며, 그 후 10분간 가열하여 효소를 비활성화시켰다. N-당사슬은 1.0 mU PNGase A (Roche Diagnostics, Germany)에 의해 pH 4.0으로 적정된 60 ㎕ 0.5 M citrate/phosphate buffer에서 16시간 동안 반응함으로서 단백질로부터 분리시켰고, Carbograph Ultra Clean column (Alltech, USA)을 이용하여 이전에 기술된 바와 같이 정제하였다 (Packer et al., 1998, Glycoconj J. 15:737-747). Pyridylamination manual 키트(Takara Bio Inc., Japan)를 이용하여 판매자의 매뉴얼대로 당쇄구조를 해석하였다. 추가적인 2-aminopyridine (PA)-N-당사슬의 정제를 위하여 이전에 기술된 바와 같이 TSK gel Amide-80 column (4.6 × 250 mm; Tosoh Co., Japan)과 474 Fluorescence Detector (Waters Co.)이 장착된 Waters 2690 Alliance HPLC separation module (Waters Co., USA)를 이용하여 NP-HPLC를 수행하였다 (Guile et al., 1996, Anal Biochem 240:210-226). 여기(excitation)와 방출(emission)은 각각 310 및 380 nm 파장에서 형광 탐지가 이루어졌고, PA-N-당사슬의 분자량은 4800 Plus matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) analyzer(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 결정하였다. 75~130분 사이에 모아진 NP-HPLC 분획물로부터 정제된 PA-N-당사슬은 이전에 기술된 바와 같이 MALDI-TOF/MS 분석에 이용하였다 (Shin et al., 2010, Enzyme Microb Technol 47:189-193). 양성 이온 모드의 리플렉터에서 2,5-디히드록시벤조산(10 ㎎/㎖ in 50% acetonitrile/0.1% trifluoroacetic acid, 10 mM NaCl)을 매트릭스로 이용하여 질량 스펙트럼이 얻어졌다. 정제된 PA-N-당사슬은 동일 부피의 매트릭스 용액과 혼합되었고, 2 ㎕의 혼합액이 표적 플레이트에 적용되고 공기에 의해 건조되었다 (Pfenninger et al., 1999, J Mass Spectrom 34:98-104). 1,000-2,400 m/z 범위가 측정되었으며 DATA Explore 소프트웨어(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 분석하였다. 피크들은 PA-N-당사슬의 계산된 분자량에 따라 일치화 되었고, 만노스( mannose), 갈락토스(galactose), 퓨코스(fucose), 자일로스(xylose), 그리고 N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine) 잔기가 확인되었다. N-당사슬 구조들은 SimGlycan version 2.8 (PREMIER Biosoft Int., USA)에서 동정된 식물 N-당사슬과 비교하였다. 상대적인 양은 이전에 기술된 바와 같이 질량 스펙트럼에서 해당하는 피크의 크기에 따라서 계산되었다 (Gil et al., 2008, Anal. Biochem. 379:45-59). 모든 실험들은 최소 3번 반복되었으며, 유사한 결과값을 나타냈다.
실시예 1. CRISPR/Cas9에 대한 α1,3-fucT 및 β1,2-xylT의 표적 위치 결정
벼 β1,2-xylT와 α1,3-fucT는 모두 염색체 8에 존재하며, 각각 3개 및 7개의 엑손을 가지고 있다. 이전 연구에서 첫 번째 엑손에 T-DNA가 삽입된 β1,2-xylT T-DNA 삽입 돌연변이 벼(RCN11)는 N-당사슬에 β1,2-자일로스가 부착하지 않는 것으로 확인되었다. 그러나 벼 α1,3-fucT에 대한 정보는 존재하지 않았으므로, sgRNA를 이용하여 타겟팅할 엑손을 결정하기 위해 T-DNA 삽입 돌연변이를 사용하여 분석하였으며, 첫 번째 엑손에 T-DNA가 삽입되었을 때 효과적인 녹-아웃(knock-out)이 일어남을 발견하였다(도 2 및 도 3). 이 돌연변이는 성장 단계에서 왜소증을 보였지만 성공적으로 종자를 형성하였다(데이터 미제시). 항-α1,3-퓨코스 항체를 이용한 웨스턴 블랏에서, α1,3-fucT 돌연변이 벼에서는 밴드가 나타나지 않는 반면 야생형 벼에서는 짙은 밴드가 확인되었다. MALDI-TOF 데이터는 α1,3-퓨코스 잔기가 없는 형태의 N-당사슬만이 존재함을 나타냈으며, 이는 α1,3-fucT 유전자에 결함이 생겼음을 반영하였다. 이 정보를 이용하여 CRISPR-PLANT의 검색 결과 목록에서 sgRNA 시퀀스를 선택하고 벡터 제조(도 4 및 도 5A)를 완료하였다.
실시예 2. 게노믹 DNA PCR 및 면역블롯 분석을 통한 돌연변이 α1,3-fucT/β1,2-xylT 벼 세포주 선별
벼의 형질전환에 이어 증식된 세포들로부터 추출된 게노믹 DNA를 이용하여 PCR이 수행되었으며, 예상했던 대로 bar 유전자가 증폭되었다(도 5C). 이러한 세포주들을 추가적으로 더 많이 증식시켜 면역블롯 분석에 사용하였다. 비록 최초 증식된 세포들을 이용한 첫 번째 분석에서는 α1,3-퓨코스와 β1,2-자일로스의 감소가 미약한 것으로 확인되었지만, 지속적인 계대배양 이후 재분석 하였을 때에는 해당 세포주들로부터 α1,3-퓨코스와 β1,2-자일로스가 거의 완벽하게 감소함을 확인할 수 있었다(데이터 미제시). 이처럼 CRISPR/Cas9의 작동이 지연되는 이유는 아마도 sgRNA와 Cas9의 복합체 형성이 지연되었거나 또는 이들 복합체가 게놈 편집 과정에 일정한 시간이 필요하기 때문인 것으로 사료되었다. CRISPR/Cas9의 작동 지연과는 별개로, 이들 세포주의 성장률은 별도의 영양소를 추가해주지 않아도 야생형 벼의 성장률과 큰 차이를 보이지 않았다.
실시예 3. 면역블롯 분석을 통한 α1,3-fucT/β1,2-xylT 돌연변이의 특성
식물 특이적 항체를 이용한 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 분석은 5개의 독립적인 벼 세포 라인에서 α1,3-퓨코스와 β1,2-자일로스가 극적으로 감소했음을 보여준다(도 6). 우리가 사용한 양성 대조군인 돌연변이 gntI 벼는 당단백질 위에 만노스(mannose)로만 구성된 N-당사슬만을 발현하는 세포주이며(한국등록특허 제1906463호 참고), 항-α1,3-퓨코스, 항-β1,2-자일로스, Lewis A(Lea) 에피토프에 결합하는 JIM84 항체에 대한 반응은 보이지 않았다. 하지만 돌연변이 α1,3-fucT/β1,2-xylT 벼는 야생형 벼와 마찬가지로 Lewis A(Lea) 에피토프에 결합하는 JIM84 항체와 반응시켰을 때 밴드가 확인되었다. 이는 β1,3-갈락토스와 α1,4-퓨코스가 여전히 존재하고 있음을 의미하며, 타 식물들에서 이루어진 이전 연구들에서의 결과와는 다른 현상이 벼에서 일어났음을 의미하였다. 흥미롭게도 SDS-PAGE 상에서 야생형 벼의 단백질 함량은 돌연변이 α1,3-fucT/β1,2-xylT 벼 세포보다 높았지만 웨스턴 블롯에서의 밴드 강도는 비슷하거나 낮은 것으로 확인되었다.
실시예 4. 질량분석법을 이용한 돌연변이 α1,3-fucT/β1,2-xylT 벼의 N-당사슬 프로파일링
야생형 벼 및 돌연변이 α1,3-fucT/β1,2-xylT 벼의 배양 현탁액에 존재하는 총 분비 당단백질을 PA로 표시하였다. 각 샘플은 HPLC에 의해 정제되었고, MALDI-TOF/MS를 사용한 질량분석법으로 분석되었다(도 7 및 표 2). 야생형 벼 세포 배양 배지에서 분비된 당단백질의 N-당사슬은 15종류의 형태로 나타났는데, 그 중 GnGnXF3(31.2%)가 가장 많은 비율을 차지하였으며, GnMXF3(20.0%)와 (FA)GnXF3(14.5%)가 뒤를 이었다. 그러나 돌연변이 α1,3-fucT/β1,2-xylT 벼 세포 배양 배지에서 추출한 당단백질은 야생형에서는 찾아볼 수 없는 구조인 A(FA)F3 (=(FA)(FA)) 및 (FA)Gn이 각각 47.9% 및 20.2% 확인되었으며, 그 뒤를 이어 코어 구조인 MM이 17.1% 차지하고 있음이 확인되었다. 또한, 돌연변이 α1,3-fucT/β1,2-xylT 벼 세포의 배양 배지에서는 α1,3-퓨코스 또는 β1,2-자일로스가 부착된 형태의 N-당사슬은 검출되지 않았다. 이는 본 발명의 방법에 따른 벼 세포에서의 α1,3-fucT와 β1,2-xylT의 이중 녹-아웃이 완벽하게 이루어졌음을 의미하였다.
Figure 112020014623585-pat00002
본 발명의 돌연변이 α1,3-fucT/β1,2-xylT 벼 세포는 α1,3-fucT와 β1,2-xylT의 녹-아웃이 N-당화의 후반부 β1,3-갈락토오스 및 α1,4-퓨코스의 부착까지 저해되었던 기존의 연구와는 다르게 여전히 기능하였고(표 2), 종래 연구와 비교하여 단백질에 당쇄 결합 패턴이 완전히 다름을 알 수 있었다. 즉, 본 발명의 돌연변이 α1,3-fucT/β1,2-xylT 벼 세포는 유용 재조합 단백질 생산을 위한 신규한 숙주세포로 사용될 수 있음이 예상되었다.
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for producing genome-edited plant cells expressing glycoproteins without plant specific N-glycans <130> PN20008 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cagaatcggc caatgccaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcaaatgcaa gagcacaagg 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttggggtttc tacaggacgt aac 23 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 taggtctcca gaatggttaa agttttagag ctagaa 36 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgggtctcat tctattttcc ttgcaccagc cgggaa 36 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 taggtctcca gctctcgacc ggttttagag ctagaa 36 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgggtctcaa gctggaccac ctgcaccagc cgggaa 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 taggtctcct ttgcttggat agttttagag ctagaa 36 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgggtctcac aaaattttaa gtgcaccagc cgggaa 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 taggtctccg gtctttgtgg agttttagag ctagaa 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cgggtctcag accacattag gtgcaccagc cgggaa 36 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA coding sequence <400> 12 aggaaaatag aatggttaaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA coding sequence <400> 13 ggtggtccag ctctcgaccg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA coding sequence <400> 14 cttaaaattt tgcttggata 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA coding sequence <400> 15 cctaatgtgg tctttgtgga 20 <210> 16 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc aacaaagcac cagtgg 46 <210> 17 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa caaaaaaaaa agcaccgact cg 52 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc a 31 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa c 31 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ttaaactcga gtcaaatctc ggtgacgggc 30 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aaaagcgcgt aatgtcatgt catcatcgtt tcc 33

Claims (9)

  1. 벼 α1,3-퓨코실트랜스퍼라제(fucosyltransferase) 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 벼 β1,2-자일로실트랜스퍼라제(xylosyltransferase) 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 벼 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계를 포함하는, 식물 특이적 N-당사슬인 α1,3-퓨코스(Fucose) 및 β1,2-자일로스(xylose)가 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 벼 식물세포의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항의 제조방법에 의해 제조된 식물 특이적 N-당사슬인 α1,3-퓨코스(Fucose) 및 β1,2-자일로스(xylose)가 제거된 당단백질을 생산하는 유전체 교정 벼 식물세포.
  4. 삭제
  5. 제3항의 벼 식물세포로부터 유래한 벼 식물체.
  6. 제3항의 유전체 교정 벼 식물세포를 목적 당단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 배양하는 단계를 포함하는 식물 특이적 N-당사슬인 α1,3-퓨코스(Fucose) 및 β1,2-자일로스(xylose)가 제거된 목적 당단백질의 생산방법.
  7. 제6항의 생산방법에 의해 생산된 식물 특이적 N-당사슬인 α1,3-퓨코스(Fucose) 및 β1,2-자일로스(xylose)가 제거된 목적 당단백질로서,
    상기 당단백질은 (FA)(FA) 형태[Fuc(α1-4)[Gal(β1-3)]GlcNAc(β1-2)Man(α1-3)[Fuc(α1-4)[Gal(β1-3)]GlcNAc(β1-2)Man(α1-6)]Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc 또는 Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-2Manα1-6(Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc]의 N-당사슬을 전체 당사슬의 40 중량% 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는 당단백질.
  8. 삭제
  9. 벼 α1,3-퓨코실트랜스퍼라제(fucosyltransferase) 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 벼 β1,2-자일로실트랜스퍼라제(xylosyltransferase) 유전자의 표적 서열에 특이적인 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 식물 특이적 N-당사슬인 α1,3-퓨코스(Fucose) 및 β1,2-자일로스(xylose)가 제거된 당단백질을 생산하기 위한 벼 식물세포 유전체 교정용 조성물.
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