JP2023535053A - Ｎ－グリコシル化突然変異イネ、その製造方法及びそれを利用したタンパク質生産用イネの製造方法 - Google Patents

Ｎ－グリコシル化突然変異イネ、その製造方法及びそれを利用したタンパク質生産用イネの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023535053A
JP2023535053A JP2023504492A JP2023504492A JP2023535053A JP 2023535053 A JP2023535053 A JP 2023535053A JP 2023504492 A JP2023504492 A JP 2023504492A JP 2023504492 A JP2023504492 A JP 2023504492A JP 2023535053 A JP2023535053 A JP 2023535053A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rice
trastuzumab
seq
glycosylation
guide rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023504492A
Other languages
English (en)
Inventor
ソンリョン キム
ジュンヘ シン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Phytomab Co Ltd
Original Assignee
Phytomab Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Phytomab Co Ltd filed Critical Phytomab Co Ltd
Publication of JP2023535053A publication Critical patent/JP2023535053A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Abstract

本発明は、Ｎ－グリコシル化（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）突然変異イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、その製造方法及びそれを利用したタンパク質生産用イネの製造方法に関し、前記植物特異的なＮ－グリコシル化過程に関与する総８個の遺伝子に対する突然変異細胞株を獲得し、これから医療用タンパク質の生産可能性を確認したので、これを効果的にタンパク質の生産に利用することができる。

Description

本発明は、農村進興庁の支援下で課題固有番号１３９５０６２８２５、詳細課題番号ＰＪ０１３６５９０１２０２０によって行われたもので、前記課題の研究管理専門機関は農村進興庁であり、研究事業名は「次世代バイオグリーン２１事業」であり、研究課題名は、「人体類似糖蛋白質生産のイネ細胞株の開発及び医療用タンパク質の生産」であり、主管機関は、西江大学校産学協力団であり、研究期間は２０１８年３月１日～２０２０年１２月３１日である。
本特許出願は、２０２０年７月２１日に韓国特許庁に提出された韓国特許出願第１０－２０２０－００９０１８９号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として組み込まれる。
本発明は、Ｎ－グリコシル化（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）突然変異イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、その製造方法及びそれを利用したタンパク質生産用イネの製造方法に関し、より詳しくは、植物特異的なＮ－グリコシル化過程に関与する総８個の遺伝子を矯正して植物特異的なグリコシル化を除去することで、医療用タンパク質を生産することができるイネ細胞株を確立する技術に関する。
植物体を含むすべての真核生物体におけるタンパク質の翻訳後修飾（ｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、最終的なタンパク質の活性のために必須な過程である。とりわけ、Ｎ－グリコシル化（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）過程は、膜タンパク質や分泌タンパク質のための修飾過程であり、タンパク質の配列の中でアスパラギン（ＡＳＮ）－Ｘ（プロリンを除くアミノ酸）－セリンまたはスレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）のモチーフにおいてアスパラギン残基に特別な糖鎖を付ける過程である。このような糖鎖の重合過程は、糖タンパク質の活性、構造、作用位置及び基質の認識、かつ安定性などに重要な影響を及ぼす。
小胞体から始まるタンパク質のＮ－グリコシル化過程は、研究されたすべての真核生物で共通に発生し、マンノースが露出した形態の糖鎖（ｏｌｉｇｏｍａｎｎｏｓｉｄｉｃ Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ｆｏｒｍ）が付着する。かかる糖鎖はゴルジ体で複雑な形態の糖鎖に転換され、この過程でフコース（ｆｕｃｏｓｅ）、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）などの多様な糖がつくが、このような過程を複合（ｃｏｍｐｌｅｘ）Ｎ－グリコシル化過程であると呼ぶ。
このような複合型Ｎ－グリコシル化過程は、生物体ごとに少しずつ違い、特に植物体では動物と異なり、α１，３フコースとβ１，２キシロースを特異的に付着し、トランスゴルジ網で生じる最後の転換過程でα１，４フコースとβ１，３ガラクトースを付着するようになる。
環境刺激やストレスを感知する受容体は、大部分糖蛋白質の形態で存在することと予想される。よって、グリコシル化に関する研究はかかるタンパク質の作用機序を理解するために求められ、ひいて、ストレスに対応する植物の作用機序を理解するのに役立つと見込まれる。
現在まで植物体のＮ－グリコシル化遺伝子の機能に関する研究は、シロイヌナズナで主に研究されてきたが、小胞体におけるＮ－グリコシル化に関与する遺伝子の突然変異体で細胞壁構造の変形と根の生長の阻害が観察されたし、ストレスに対する敏感性が増加された。
シロイヌナズナとタバコとの複合型Ｎ－グリコシル化に関与する遺伝子の突然変異体では目立つ表現型の変化は観察されず、生存にも大きな支障はないことが分かった。
それと異なり、単子葉モデル植物であるイネの複合型Ｎ－グリコシル化遺伝子の突然変異は、発逹段階で多様な表現型を示し、特に塩ストレス処理に対して増加された敏感度を示した。
かかる結果は、シロイヌナズナとタバコにおいて複合型Ｎ－結合型糖鎖の構造が生命現象やストレス反応に必須ではないことに対し、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）では、複合的な糖鎖構造がＥＲストレス（ｓｔｒｅｓｓ）などに一層敏感な影響を及ぼすなど、まだ知られていない重要な機能を遂行することができることを暗示する。しかし、現在までイネにおけるこれら遺伝子の機能的な研究とストレス関連性の研究は、まだ初期状態にとどまっている。また従前の研究によれば、イネのＮ－グリコシル化関連遺伝子の突然変異時、生命現象に致命的な影響を与えることで当該遺伝子の機能研究に多くの困難を経験している。
タンパク質のＮ－グリコシル化過程は、タンパク質の機能や安定性に重要な影響を及ぼすと知られているが、今のところ植物体でのＮ－グリコシル化に関する研究は不備な実情である。植物において環境刺激やストレスを感知する大部分の受容体及び細胞壁の構成に関与するタンパク質が糖蛋白質の形態で存在することと予想される。したがって、グリコシル化関連研究は、そのようなタンパク質の作用機序を理解するために求められ、さらに、ストレスに対応する植物の作用機序を理解するのに役立つことと見込まれる。
全世界的にバイオ医薬品の市場は急増しつつあり、韓国の場合、次世代の主要事業のうちの一つとして脚光を浴びている。これまで動物細胞あるいは大膓菌や酵母を利用してバイオ医薬品が生産されているが、製造コストなど種々の慢性的な問題を抱えている。したがって、このような短所を補完するために、植物システムを利用した医療用タンパク質の生産を図る試みがなされている。
しかしながら、ヒトを含む哺乳類のＮ－グリコシル化は、植物と異なるように現われるから、このような問題点を克服したヒト型Ｎ－グリコシル化植物素材の開発は、非常に至急を要する事案である。
そこで、本発明者らは、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）における植物特異的なＮ－グリコシル化過程が環境ストレスに及ぼす機能を調べるために、かかる過程に関与する総８個の遺伝子に対する突然変異細胞株を獲得し、これを標的タンパク質の生産のための植物システムとして活用することができることを確認した。
それで、本発明の目的は、配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡを含むイネのＮ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクターを提供することである。
本発明の他の目的は、配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイドＲＮＡを含むベクターで形質転換されたＮ－グリコシル化突然変異イネを提供することである。
本発明のまた他の目的は、配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイドＲＮＡを含むイネのＮ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクターで形質転換する遺伝子矯正段階を含むＮ－グリコシル化突然変異イネの製造方法を提供することである。
本発明の別の目的は、イネでトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ；ＴＭａｂ）が発現されるようにコドン最適化されたものである、配列番号４４の塩基配列からなるトラスツズマブ軽鎖合成遺伝子及び配列番号４５の塩基配列からなるトラスツズマブ重鎖合成遺伝子を含むトラスツズマブ生産用組成物を提供することである。
本発明のまた別の目的は、イネでトラスツズマブが発現されるようにコドン最適化されたものである、配列番号４４の塩基配列からなるトラスツズマブ軽鎖合成遺伝子及び配列番号４５の塩基配列からなるトラスツズマブ重鎖合成遺伝子を含むトラスツズマブ発現用ベクターを提供することである。
本発明の更なる目的は、配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡを含むイネのＮ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクター；及び
イネでトラスツズマブが発現されるようにコドン最適化されたものである、配列番号４４の塩基配列からなるトラスツズマブ軽鎖合成遺伝子及び配列番号４５の塩基配列からなるトラスツズマブ重鎖合成遺伝子を含むトラスツズマブ発現用ベクター
で形質転換されたトラスツズマブ生産用イネを提供することである。
本発明の更なる他の目的は、次の段階を含むタンパク質生産用イネの製造方法を提供することである。
配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイドＲＮＡを含むイネのＮ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクターにイネを形質転換させる遺伝子矯正段階；及び
標的タンパク質をコーディングする遺伝子を含むベクターにイネを形質転換させる遺伝子導入段階。
本発明の更なる別の目的は、植物特異的Ｎ－グリコシル化突然変異イネのタンパク質生産用途に関する。
本発明は、Ｎ－グリコシル化（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）突然変異イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、その製造方法及びそれを利用したタンパク質生産用イネの製造方法に関し、本発明によるＮ－グリコシル化突然変異イネは、標的タンパク質を生産するための植物システムとして活用することができる。
本発明者は、植物特異的なグリコシル化過程に関与する遺伝子の突然変異細胞株を利用して、このような遺伝子の機能の欠陷が生命現象に及ぼす影響を植物細胞の水準で研究することにより、植物におけるＮ－グリコシル化の理解を助けようとした。
そこで、イネにおける植物特異的なＮ－グリコシル化過程が環境ストレスに及ぼす機能を調べるために、かかる過程に関与する総８個の遺伝子をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を利用して突然変異させ、その結果、８個の遺伝子（β１，２－ＸｙｌＴ、α１，３－ＦｕｃＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ、ＨＥＸＯ１、ＨＥＸＯ２、ＨＥＸＯ３、及びＨＥＸＯ４）の機能的な突然変異細胞株と４個の遺伝子（α１，３－ＦｕｃＴ、β１，２－ＸｙｌＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，及び４－ＦｕｃＴ）の突然変異細胞株をそれぞれ獲得したし、これらを標的タンパク質の生産のための植物システムとして活用することができることを確認した。
このような植物特異的グリコシル化を除去させた細胞株システムを利用して細胞水準でのストレスメカニズムを一層効果的に遂行するとともに、タンパク質生産システムを構築してタンパク質医薬品など有用タンパク質の生産のためのプラットフォームとして用いることができることと期待し得る。
以下、本発明をより詳しく説明する。
本発明の一態様は、配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡである。
本発明において、ガイドＲＮＡは、β１，２－ＸｙｌＴ、α１，３－ＦｕｃＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ、ＨＥＸＯ１、ＨＥＸＯ２、ＨＥＸＯ３及びＨＥＸＯ４からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子を標的とするものであることができる。
前記遺伝子は、植物特異的なグリコシル化過程で関与する遺伝子に該当する。
本発明において、ガイドＲＮＡは、配列番号１～１６からなる群より選ばれる２種以上の塩基配列を発現することができるようにデザインされた多シストロン性（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）のガイドＲＮＡであってもよい。
本明細書上の用語「多シストロン性」とは、一つの転写単位に由来するｍＲＮＡに翻訳開始、翻訳終結シグナルによって規定するアミノ酸配列（シストロン）が複数で存在する状態を意味する。これに対して１個だけが存在する時には単一シストロンと呼ぶ。
本発明の一具現例において、配列番号１～１６からなる群より選ばれる８種の塩基配列を発現することができるようにデザインされた多シストロン性のガイドＲＮＡを合成して用いた。前記８種の塩基配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、及び１５からなる群より選ばれるものであってもよく、または配列番号１、２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選ばれるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の他の態様は、配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイドＲＮＡを含むイネのＮ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）である。
前記用語「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。細胞内へ伝達するＤＮＡ断片（複数可）、核酸分子を意味し、ＤＮＡを複製して、宿主細胞から独立に再生産されることができる。
「発現ベクター」は、目的としたコーディング配列と、特定の宿主生物で作動可能に繋がれたコーディング配列を発現するのに必須な適正核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を意味する。発現ベクターは、真核細胞で利用可能な一つ以上の複製起点、プローモーター、選択マーカー、エンハンサー、終結シグナル及びポリアデニル化配列を含むことができる。発現ベクターは、一般に、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するか、両者ともの要素を含むことができる。したがって、発現ベクターは、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは適切な宿主細胞内への導入時、クローニングされたＤＮＡの発現を招く他のベクターを意味する。適切な発現ベクターは、当業者によく知られており、真核細胞及び／または原核細胞内で複製可能なものなど及びエピソームとして残るものなど、もしくは宿主細胞ゲノム内に統合されるものなどを含む。
公知のベクターとしては、ｐＲＯＫＩＩ、ｐＢＩ７６、ｐＥＴ２１、ｐＳＫ（＋）、ｐＬＳＡＧＰＴ、ｐＵＣ、及びｐＧＥＭが挙げられる。ただし、これら限定されるものではないが、前記組換えベクターは、望ましくは組換え植物発現ベクターである。
植物発現ベクターの望ましい例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのような適当な宿主に存在する時にそれ自体の一部、いわゆるＴ－領域を植物細胞に転移させることができるＴｉ－プラスミドベクターである。他の類型のＴｉ－プラスミドベクター（ＥＰ０１１６７１８Ｂ１号参照）は、現在植物細胞、または雑種ＤＮＡを植物のゲノム内に適当に挿入する新しい植物が生産可能な原形質体に雑種ＤＮＡ配列を転移させるのに用いられている。Ｔｉ－プラスミドベクターの特に望ましい形態は、ＥＰ０１２０５１６Ｂ１号及び米国特許第４，９４０，８３８号に開示しているような、いわゆるバイナリー（ｂｉｎａｒｙ）ベクターである。
本発明によるＤＮＡを植物宿主に導入させるのに用いられることができる他の好適なベクターは、二本鎖の植物ウイルス（例えば、ＣａＭＶ）及び一本鎖のウイルス、ジェミニウイルスなどに由来するようなウイルスベクター、例えば不完全な植物ウイルスベクターから選択されることができる。かかるベクターの使用は、特に植物宿主を適当で形質転換し難い場合に有利であることがある。発現ベクターは、望ましくは、一つ以上の選択性マーカーを含む。前記マーカーは、通常、化学的な方法で選択し得る特性を持つ核酸配列であり、形質転換された細胞を非形質転換細胞から区別し得るすべての遺伝子がこれに当たる。その例としては、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）またはホスフィノトリシンのような除草剤抵抗性遺伝子、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一実施形態において、植物発現ベクターのプローモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓ、アクチン、ユビキチン、ｐＥＭＵ、ＭＡＳまたはヒストンプローモーターであってもよいが、これらに限定されない。「プローモーター」という用語は、構造遺伝子からのＤＮＡの上流領域を意味し、転写開始のためにＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ分子を指す。「植物プローモーター」とは、植物細胞で転写を開始することができるプローモーターである。「構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プローモーター」は、大部分の環境条件及び発達状態または細胞分化の下で活性を持つプローモーターである。形質転換体の選択が各種段階で各種組職によって行われることができるから構成的プローモーターが本発明で望ましいことがある。よって、構成的プローモーターは選択可能性を制限しない。また、前記ベクターは、通常のターミネーターを使用することができ、その例としては、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）、イネα－アミラーゼＲＡｍｙ１Ａターミネーター、ファゼオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎｅ）ターミネーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のオクトピン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ターミネーターの必要性に関して、かかる領域が植物細胞での転写の確実性及び効率を増加させるものと一般的に知られている。したがって、ターミネーターの使用は、本発明の内容で非常に望ましいことがある。
前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にして構築されることができる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主にする場合は、転写を進めることができる強力なプローモーター（例えば、ｐＬλプローモーター、ＣＭＶプローモーター、ｔｒｐプローモーター、ｌａｃプローモーター、ｔａｃプローモーター、Ｔ７プローモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位及び転写・解読終結配列を含むことが普通である。真核細胞を宿主にする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点、及びＢＢＶ複製起点などを含むが、これらに限定されるものではない。また、通常、転写終結配列として、ポリアデニ化配列を持つ。
植物の形質転換は、ＤＮＡを植物に転移させる任意の方法を意味する。かかる形質転換方法は、必ず再生及び（または）組職培養期間を有する必要はない。植物種の形質転換は、もう双子葉植物だけではなく単子葉植物の両者を含む植物種に対して一般的なものである。原則的に、任意の形質転換方法は、本発明による雑種ＤＮＡを適当な前駆細胞に導入させるのに用いられることができる。方法は、原形質体に対するカルシウム／ポリエチレングリコール方法（Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373）、原形質体の電気穿孔法（Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102）、植物物質へのマイクロインジェクション（Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185）、各種植物物質の（ＤＮＡまたはＲＮＡコーティングされた）粒子衝撃法（Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70）、植物の浸潤または成熟花粉または小胞子の形質転換によるアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介遺伝子転移において（不完全性）ウイルスによる感染（ＥＰ０３０１３１６号）などから適宜選択されることができる。本発明による望ましい方法は、アグロバクテリウム媒介ＤＮＡ伝達を含む。
植物の形質転換に用いられる「植物細胞」は、培養細胞、培養組職、培養機関または全体植物、望ましくは、培養細胞、培養組職または培養機関、及びより望ましくは、培養細胞のいずれの形態でも構わない。
「植物」は、分化または微分化された植物の組職、例えば、これらに限定されないが、根、幹、葉、花粉、種子、癌組職及び培養に用いられる多様な形態の細胞、すなわち単一細胞、原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）、芽及びカルス組職を含む。植物組職は、インプランタ（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）や機関培養、組職培養または細胞培養状態であってもよい。
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現される表現型を利用して、当業界で広く知られた方法によって容易に実施できる。例えば、前記選択標識が特定の抗生剤耐性遺伝子である場合には、前記抗生剤が含有された培地で形質転換体を培養することにより形質転換体を容易に選別することができる。
本発明において、ガイドＲＮＡは、β１，２－ＸｙｌＴ、α１，３－ＦｕｃＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ、ＨＥＸＯ１、ＨＥＸＯ２、ＨＥＸＯ３及びＨＥＸＯ４からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子を標的とするものであることができる。
本発明において、ガイドＲＮＡは、配列番号１～１６からなる群より選ばれる２種以上の塩基配列を発現することができるようにデザインされた多シストロン性のガイドＲＮＡであるのであることができる。
本発明の他の態様は、配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイドＲＮＡを含むベクターで形質転換されたＮ－グリコシル化突然変異イネである。
本発明において、ガイドＲＮＡは、β１，２－ＸｙｌＴ、α１，３－ＦｕｃＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ、ＨＥＸＯ１、ＨＥＸＯ２、ＨＥＸＯ３及びＨＥＸＯ４からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子を標的とするものであってもよい。
本発明において、ガイドＲＮＡは、配列番号１～１６からなる群より選ばれる２種以上の塩基配列を発現することができるようにデザインされた多シストロン性のガイドＲＮＡであってもよい。
本発明において、イネは、細胞、カルス、種子、及び成体からなる群より選ばれるものであってもよく、例えば、細胞のものであってもよいが、これに限定されるのではない。
本発明の他の態様は、配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイドＲＮＡを含むイネのＮ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクターで形質転換する遺伝子矯正段階を含むＮ－グリコシル化突然変異イネの製造方法である。
本発明において、ガイドＲＮＡは、β１，２－ＸｙｌＴ、α１，３－ＦｕｃＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ、ＨＥＸＯ１、ＨＥＸＯ２、ＨＥＸＯ３及びＨＥＸＯ４からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子を標的とするものであることができる。
本発明において、ガイドＲＮＡは、配列番号１～１６からなる群より選ばれる２種以上の塩基配列を発現することができるようにデザインされた多シストロン性のガイドＲＮＡであってもよい。
本発明において、イネは、細胞、カルス、種子、及び成体からなる群より選ばれるものであってもよく、例えば、細胞のものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の他の態様は、イネでトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ；ＴＭａｂ）が発現されるようにコドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたものである、配列番号４４の塩基配列からなるトラスツズマブ軽鎖合成遺伝子及び配列番号４５の塩基配列からなるトラスツズマブ重鎖合成遺伝子を含むトラスツズマブ生産用組成物である。
本明細書上の用語「コドン最適化」とは、タンパク質の合成を最適化するために各生物種ごとにコドンの使用が最適化されたものを意味する。生物種によって最適化コドンが異なるため、所望するタンパク質を他の生物種で効率的に発現させたい場合にもコドン最適化が必要である。例えば、ヒトのタンパク質を大膓菌で発現させる場合のようなアミノ酸を暗号化しているコドンの中で大膓菌が主に用いるコドンに変えると、タンパク質が一層効率的に発現可能である。
本発明の他の態様は、イネでトラスツズマブが発現されるようにコドン最適化されたものである、配列番号４４の塩基配列からなるトラスツズマブ軽鎖合成遺伝子及び配列番号４５の塩基配列からなるトラスツズマブ重鎖合成遺伝子を含むトラスツズマブ発現用ベクターである。
本発明の他の態様は、配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイドＲＮＡを含むイネのＮ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクター；及び
イネでトラスツズマブが発現されるようにコドン最適化されたものである、配列番号４４の塩基配列からなるトラスツズマブ軽鎖合成遺伝子及び配列番号４５の塩基配列からなるトラスツズマブ重鎖合成遺伝子を含むトラスツズマブ発現用ベクター
で形質転換されたトラスツズマブ生産用イネである。
本発明において、ガイドＲＮＡは、β１，２－ＸｙｌＴ、α１，３－ＦｕｃＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ、ＨＥＸＯ１、ＨＥＸＯ２、ＨＥＸＯ３及びＨＥＸＯ４からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子を標的とするものであることができる。
本発明において、ガイドＲＮＡは、配列番号１～１６からなる群より選ばれる２種以上の塩基配列を発現することができるようにデザインされた多シストロン性のガイドＲＮＡであるものであってもよい。
本発明において、イネは、細胞、カルス、種子、及び成体からなる群より選ばれるものであってもよく、例えば、細胞のものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の他の態様は、次の段階を含むタンパク質生産用イネの製造方法を提供することである。
配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイドＲＮＡを含むイネのＮ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクターでイネを形質転換させる遺伝子矯正段階；及び
標的タンパク質をコーディングする遺伝子を含むベクターにイネを形質転換させる遺伝子導入段階。
本発明において、標的タンパク質は、トラスツズマブであることがある。
本発明において、ガイドＲＮＡは、β１，２－ＸｙｌＴ、α１，３－ＦｕｃＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ、ＨＥＸＯ１、ＨＥＸＯ２、ＨＥＸＯ３及びＨＥＸＯ４からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子を標的とするものであることができる。
本発明において、ガイドＲＮＡは、配列番号１～１６からなる群より選ばれる２種以上の塩基配列を発現することができるようにデザインされた多シストロン性のガイドＲＮＡであるのであることができる。
本発明において、イネは細胞、カルス、種子、及び成体からなる群より選ばれるものであってもよく、例えば、細胞のものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明は、Ｎ－グリコシル化（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）突然変異イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、その製造方法及びそれを利用したタンパク質生産用イネの製造方法に関し、前記植物特異的なＮ－グリコシル化過程に関与する総８個の遺伝子に対する突然変異細胞株を獲得し、これから医療用タンパク質の生産可能性を確認したので、これを効果的にタンパク質の生産に利用することができる。
図１は、ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ）とＣａｓ９の活性度の確認のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）実験結果の写真である。 図２ａは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクターであるｐＳＫ４３７ベクターの模式図である。 図２ｂは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクターであるｐＳＫ４３８ベクターの模式図である。 図３は、＃１－１２－２０－１１カルスラインの懸濁培養で獲得された単一細胞（左）あるいは単一細胞由来の細胞群（右）を示す写真である。 図４は、獲得された単一細胞株のα１，３－フコースとβに対する免疫ブロット結果の写真である。 図５は、植物特異的グリコシル化遺伝子突然変異の単一細胞株で発現されたトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ；ＴＭａｂ）の確認結果の写真である。
本発明は、配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡを含むベクターで形質転換されたＮ－グリコシル化突然変異イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に関する。
次に、本発明を下記の実施例によってより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
本明細書の全般に亘って、特定物質の濃度を示すために使用される「％」は、別途の言及がない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。
実施例１：標的配列のデザイン及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクターの構築
植物特異的Ｎ－グリコシル化及びＮ－結合型糖鎖付加過程に関与する８個の遺伝子（β１，２－ＸｙｌＴ、α１，３－ＦｕｃＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ、ＨＥＸＯ１、ＨＥＸＯ２、ＨＥＸＯ３、ＨＥＸＯ４）、そして４個の遺伝子（β１，２－ＸｙｌＴ、α１，３－ＦｕｃＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ）に対する突然変異イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）細胞株を作るために、ＣＲＩＳＰＲ－ＰｇＲＮＡデザインツールを利用して各遺伝子のエキソン部位で遺伝子当たり２個の最適標的配列を選抜してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクターの構築に用いた。
８個の遺伝子の標的部位をＰＣＲで増幅して選別されたｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）－Ｃａｓ９複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）が実際にＤＮＡを切断することができるかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏ切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）実験を通じて確認した。かかる実験のためにＣａｓ９発現ベクターであるｐＥＴ２８ｂ－Ｃａｓ９－Ｈｉｓ（＃４７３２７、ａｄｄｇｅｎｅ、ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／４７３２７／）を含む大膓菌を利用してＩＰＴＧ誘導方法によってＣａｓ９を合成して精製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写させた各々のｇＲＮＡと精製されたＣａｓ９タンパク質とを、それぞれの遺伝子の標的配列を含むＰＣＲ産物と混ぜて３７℃で２時間の間培養した。培養後、酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を処理することで、反応を終結した上で、反応液の一部を１％アガロースゲルに電気泳動してＤＮＡの切断の有無を確認した。
図１から分かるように、それぞれの標的に対するｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体が活性を持つことを確認することができた。
このうち８個の遺伝子に対するベクター構築のために、下記表１におけるＴ１にあたる遺伝子当たり１個の標的ガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡ配列を選択したし、４個の遺伝子のベクター構築のためには、Ｔ１及びＴ２にあたる選抜された二つの標的配列をいずれも用いた。
図２ａ及び図２ｂから明らかなように、８個の遺伝子の標的ガイドＲＮＡ配列（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３及び１５）及び４個の遺伝子のｇＲＮＡ配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８）を発現することができるようにデザインした多シストロン性（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）のｇＲＮＡ配列をイネのＵ６プローモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）にそれぞれ合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、ＵＳＡ）した後、ｐＳＢ１１－Ｃａｓ９ベクター（Ｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）の選別マーカーである除草剤抵抗性ＰＰＴ遺伝子をハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ＨＰＴ）に置換したｐＳＫ４２９を構築した。
ｐＳＫ４２９をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断して前記合成された多シストロン性のｇＲＮＡ配列を挿入することでベクターｐＳＫ４３７及びｐＳＫ４３８をそれぞれ製造した。植物形質転換のためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｓ、ＬＢＡ４４０４）をクローニングされた前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクターで形質転換した。
実施例２：植物形質転換及び選別
表面殺菌したイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）種子を２Ｎ６塩（ｓａｌｔ）（Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｈａａｒｌｅｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄが添加された２Ｎ６培地（以下、カルス誘導培地という）に置床して３～４週間カルス形成を誘導した。イネの形質転換は、Ｈｉｅｉら（１９９４）の方法を変形して遂行した。簡略に、形成されたカルスをｐＳＫ４３７とｐＳＫ４３８で形質転換されたアグロバクテリウム懸濁溶液（ＯＤ６００＝０．３）と２３℃で３日間空調培養したし、３日後、カルスをカルス誘導培地に４０ｍｇ／Ｌハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）及び２００ｍｇ／Ｌセフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）を添加した２Ｎ６ＣＨ培地（以下カルス選抜培地という）へ移した。その後、カルスを２週間ごとに新しい培地に継代培養し、これから形質転換されたカルスを最終選別した。
実施例３：遺伝子矯正カルスの選別
２Ｎ６ＣＨ培地からハイグロマイシン抵抗性カルスを選抜した後、当該カルスでの遺伝子矯正（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）がされたかどうかは、表２に示したように、標的配列を含む周辺配列に対するプライマー配列を利用してＰＣＲ方法で調査した。
ＰＣＲ産物は、キット（Expin PCR SV mini kit、GeneAll社製、韓国）を利用して精製した後、サンガーシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行い、その配列を分析した。分析ツール（Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis tool(ice.synthego.com/#/)）を利用して標的配列周辺の塩基配列のＩＮＤＥＬ分析を行い、これから最も高い矯正効率を示すカルスを選別した。
その結果、ｐＳＫ４３７ベクターを利用した群から８個の遺伝子突然変異細胞株を獲得するにあたり、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ遺伝子を除く６個の遺伝子で、ほぼ１００％に近い遺伝子矯正効率を示すイネのカルスライン＃１－１２－２０－１１を選抜した。
ｐＳＫ４３８ベクターを利用した群から４個の遺伝子突然変異細胞株の獲得のための選別作業もこれと同様な方法で遂行された。
実施例４：懸濁培養を利用した遺伝子矯正単一細胞株の獲得
最も高い矯正効率を示した＃１－１２－２０－１１ラインのカルスを２Ｎ６液体培地に接種して、２８℃、１１０ｒｐｍの条件で懸濁培養したし、２週間ごとに継代培養して単一細胞株を得た。
懸濁培養体をフィルター（１００μｍ孔径）でフィルタリングし、これから獲得した単一細胞あるいは単一細胞由来の細胞群を図３のように示した。
遠心分離によって捕集された細胞を１ｍＬの２Ｎ６液体培地に再懸濁後、２Ｎ６ＣＨ寒天培地に塗り広げて肉眼で見える大きさになるまで生長させて、２Ｎ６ＣＨ寒天培地で生長したそれぞれの細胞株を増殖させた後、新たな２Ｎ６ＣＨ寒天培地に分離して生長させた。単一細胞由来の細胞株を最終獲得するために、生長されたそれぞれの細胞株カルスごとに相異なる二つの部位からカルスを切り離し、これから誘電体ＤＮＡを抽出した後、標的配列周辺のＰＣＲをそれぞれ遂行した。
一つの細胞株における異なる二つの部位でのＰＣＲ産物の塩基配列を利用してＩＮＤＥＬ分析を行い、互いに同一のＩＮＤＥＬパターンを示す細胞株は、最終的に単一細胞由来の細胞株（＃ＳＣ）であると評価した。その結果、８個の遺伝子突然変異細胞株である＃ＳＣ－２６から細胞株の２つのラインを獲得したし、これをそれぞれＰＭＯｓＣ１とＰＭＯｓＣ２と名付けた。４個の遺伝子突然変異細胞株の獲得のために、＃１９のカルスを利用して同様な方法で単一細胞由来細胞株の２つのラインを最終選抜し、これをそれぞれＰＭＯｓＣ３とＰＭＯｓＣ４であると名付けた。夫々の細胞株に対する遺伝子矯正効率は表３にまとめて示した。
実施例５：獲得された細胞株のＮ－結合型糖鎖の構造の分析
選別された細胞株のＮ－結合型糖鎖の構造を調べるために、免疫ブロット法と液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を用いた。
まず、免疫ブロットのために、細胞株から総タンパク質を抽出し、ウエスタンブロットによって植物特異的Ｎ－結合型糖鎖であるα１，３－フコースとβ１，２－キシロースの相対的な量を野生型（ＷＴ）である東津萌米と比較した。タンパク質は、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）から抽出し、総タンパク質１０μｇをＰＡＧＥ電気泳動後、抗－α１，３－フコース（Ａｇｒｉｓｅｒａ社、Ｓｗｅｄｅｎ）と抗－β１，２－キシロース（Ａｇｒｉｓｅｒａ社、Ｓｗｅｄｅｎ）を利用して免疫ブロットした（Ｍ、ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ１、東津萌米（ＷＴ）；ｌａｎｅ２、ＰＭＯｓＣ１；ｌａｎｅ３、ＰＭＯｓＣ２；ｌａｎｅ４、ＰＭＯｓＣ３；ｌａｎｅ５、ＰＭＯｓＣ４）．
その結果、図４から確認できるように、選抜された細胞株からα１，３－フコースおよびβ１，２－キシロースはほとんど検出されないものが分かった。このような結果を通じて、α１，３－ＦｕｃＴとβ１，２－ＸｙｌＴ酵素遺伝子の突然変異が定常的に生じたことを確認することができた。さらに、選抜された細胞株のＮ－結合型糖鎖の構造の変化を一層詳しく分析しようとした。
このために、抽出されたタンパク質をトリプシン処理した後、ＰＮＧａｓｅ Ａを処理してタンパク質からＮ－結合型糖鎖を分離し、これをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry）を利用して分析した。
表４から分かるように、ＷＴで多様なＮ－結合型糖鎖の構造が検出されたこととは異なり、ＰＭＯｓＣ１及びＰＭＯｓＣ２の細胞株ではＭＧｎ及びＧｎＧｎの２種のＮ－結合型糖鎖の構造が検出され、ＰＭＯｓＣ３及びＰＭＯｓＣ４では、ＭＭ、ＭＧｎ、ＧｎＧｎの３種の糖鎖構造が検出された。特に、ＰＭＯｓＣ１及びＰＭＯｓＣ２の細胞株におけるＧｎＧｎ構造の比率は、それぞれ、８０．８％と９２．３％と現われた。一方、ＰＭＯｓＣ３及びＰＭＯｓＣ４の単一細胞株の場合、ＭＭ構造が最も多く検出されたが、かかる相対量は、それぞれ５０．８％と４２．３％であることが観察された。このような細胞株の差は、Ｈｅｘｏ１～Ｈｅｘｏ４にあたるヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＥＸＡ）遺伝子の突然変異がされたか否かに起因するものと考えられる。
表５から確認できるように、ＰＭＯｓＣ１細胞株の懸濁培地に分泌した分泌タンパク質からの結果において、ＭＭ、ＭＧｎ、ＧｎＧｎ構造はそれぞれ１．０％、１．６％、９７．４％の比率を示し、細胞での結果よりも一層深化されたＧｎＧｎ構造の偏向性を観察した。このような結果を通じて、ＰＭＯｓＣ１及びＰＭＯｓＣ２でほぼ１００％の遺伝子矯正効率を示した６個の遺伝子の突然変異を再確認したし、比較的低い遺伝子矯正効率を示したβ１，３－ＧａｌＴとα１，４－ＦｕｃＴ遺伝子は、実際にはタンパク質のＮ－グリコシル化には検出するに値する機能を現わすことができないことが明かされた。
このような選抜された細胞株でのβ１，３－ＧａｌＴとα１，４－ＦｕｃＴ酵素の機能抑制現象は、たぶんこのような酵素に先行して作用するα１，３－ＦｕｃＴとβ１，２－ＸｙｌＴの突然変異によって非正常的なＮ－グリコシル化が生じ、これによって、β１，３－ＧａｌＴおよびα１，４－ＦｕｃＴ酵素の基質であるα１，３－フコースおよびβ１，２－キシロースで修飾された正常なＮ－グリコシル化が欠けている非正常的な基質タンパク質が作られた結果であると思われる。
これに併せて、ＭＭ構造の非常に低い量の検出あるいは未検出の結果は、ヘキソサミニダーゼ遺伝子が突然変異されたことを示している。
上記の結果から、我々は最終的に８個の遺伝子で突然変異を起こしたＰＭＯｓＣ１及びＰＭＯｓＣ２単一細胞株を獲得したし、これらのＮ－グリコシル化構造分析から結果的に８個の標的酵素の機能を抑制した細胞株を確立することができた。また、ＰＭＯｓＣ３及びＰＭＯｓＣ４細胞株の糖鎖構造の分析を通じて、４個の遺伝子突然変異に成功したことを確認した。
このような細胞株は、今後環境刺激及びストレス関連実験を遂行するために効率的な細胞株システムの確立と、当該遺伝子の機能を研究することができる有用なリソースになることと予想される。なお、このような植物特異的グリコシル化遺伝子突然変異細胞株を種々の有用タンパク質を生産し得る生産フラットフォームとして利用することができるだろう。
実施例６：植物特異的グリコシル化突然変異細胞株における乳がん治療剤であるトラスツズマブの発現
植物特異的グリコシル化遺伝子突然変異細胞株で乳がん治療剤であるトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ）の発現を試みた。トラスツズマブの軽鎖と重鎖の５’末端にイネのアミラーゼ３Ｅ（ＲＡｍｙ３Ｅ）タンパク質のシグナルペプチド配列（ＧＫＨＨＶＴＬＣＣＶＶＦＡＶＬＣＬＡＳＳＬＡＱＡ）を添加した後、イネのコドンに最適化されたトラスツズマブ軽鎖及び重鎖遺伝子を合成（ＧｅｎｅＡｒｔ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）して、ｐＥＡＱ－ＨＴベクター（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２００９）に導入したｐＳＫ４４６ベクターを構築した。かかる発現ベクターをＰＭＯｓＣ１細胞株で形質転換した後に５０ｍｇ／ＬのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）から選別した。対照群としては、形質転換しないＷＴ（東津）カルスラインから抽出したタンパク質を用いた。
選別されたカルスは２週間懸濁培養し、これから培養液を回収したし、４４０ｇ×５分間遠心分離後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（５０ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）で濃縮した。濃縮された溶液をヒトＩｇＧγ鎖とカッパ鎖の特異的な抗体を利用して（ＡＰ３０９Ｐ、ＡＰ５０２、ＰＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）免疫ブロットを行った（１、ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ；２、ＴＭａｂ形質転換細胞株懸濁培養に用いられた培地の濃縮液；３、ＷＴ（陰性対照（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ））；４、Ｈｅｒｚｕｍａ（トラスツズマブの類似体、陽性対照（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ））。
図５から分かるように、軽鎖及び重鎖とも正常的に細胞株で生産されることを確認した。
本発明は、Ｎ－グリコシル化（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）突然変異イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、その製造方法及びそれを利用したタンパク質生産用イネの製造方法に関するものであって、より詳しくは、植物特異的なＮ－グリコシル化過程に関与する総８個の遺伝子を矯正して、植物特異的グリコシル化を除去することにより、医療用タンパク質を生産することができるイネ細胞株を確立する技術に関するものである。

Claims (9)

  1. 配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡを含むイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）Ｎ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクター。
  2. ガイドＲＮＡは、β１，２－ＸｙｌＴ、α１，３－ＦｕｃＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ、ＨＥＸＯ１、ＨＥＸＯ２、ＨＥＸＯ３及びＨＥＸＯ４からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子を標的とするものである、請求項１に記載のイネのＮ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクター。
  3. ガイドＲＮＡは、配列番号１～１６からなる群より選ばれる２種以上の塩基配列を発現することができるようにデザインされた多シストロン性（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）のガイドＲＮＡである、請求項１に記載のイネのＮ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクター。
  4. 配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡを含むベクターで形質転換されたＮ－グリコシル化突然変異イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）。
  5. イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）でトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ；ＴＭａｂ）が発現されるようにコドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたものである、配列番号４４の塩基配列からなるトラスツズマブ軽鎖合成遺伝子及び配列番号４５の塩基配列からなるトラスツズマブ重鎖合成遺伝子を含むトラスツズマブ生産用組成物。
  6. イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）からトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ；ＴＭａｂ）が発現されるようにコドン最適化されたものである、配列番号４４の塩基配列からなるトラスツズマブ軽鎖合成遺伝子及び配列番号４５の塩基配列からなるトラスツズマブ重鎖合成遺伝子を含むトラスツズマブ発現用ベクター。
  7. 配列番号１～１６からなる群より選ばれる１種以上の塩基配列からなるガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡを含むイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のＮ－グリコシル化遺伝子矯正用ベクター；及び
    イネでトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ；ＴＭａｂ）が発現されるようにコドン最適化されたものである、配列番号４４の塩基配列からなるトラスツズマブ軽鎖合成遺伝子及び配列番号４５の塩基配列からなるトラスツズマブ重鎖合成遺伝子を含むトラスツズマブ発現用ベクター
    で形質転換されたトラスツズマブ生産用イネ。
  8. ガイドＲＮＡは、β１，２－ＸｙｌＴ、α１，３－ＦｕｃＴ、β１，３－ＧａｌＴ、α１，４－ＦｕｃＴ、ＨＥＸＯ１、ＨＥＸＯ２、ＨＥＸＯ３及びＨＥＸＯ４からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子を標的とするものである、請求項７に記載のトラスツズマブ生産用イネ。
  9. ガイドＲＮＡは、配列番号１～１６からなる群より選ばれる２種以上の塩基配列を発現することができるようにデザインされた多シストロン性（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）のガイドＲＮＡである、請求項７に記載のトラスツズマブ生産用イネ。
JP2023504492A 2020-07-21 2021-07-14 Ｎ－グリコシル化突然変異イネ、その製造方法及びそれを利用したタンパク質生産用イネの製造方法 Pending JP2023535053A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0090189 2020-07-21
KR1020200090189A KR102461600B1 (ko) 2020-07-21 2020-07-21 N-당질화 돌연변이 벼, 이의 제조방법 및 이를 이용한 단백질 생산용 벼의 제조방법
PCT/KR2021/009025 WO2022019560A1 (ko) 2020-07-21 2021-07-14 N-당질화 돌연변이 벼, 이의 제조방법 및 이를 이용한 단백질 생산용 벼의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023535053A true JP2023535053A (ja) 2023-08-15

Family

ID=79728850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023504492A Pending JP2023535053A (ja) 2020-07-21 2021-07-14 Ｎ－グリコシル化突然変異イネ、その製造方法及びそれを利用したタンパク質生産用イネの製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230295648A1 (ja)
EP (1) EP4186976A4 (ja)
JP (1) JP2023535053A (ja)
KR (1) KR102461600B1 (ja)
CN (1) CN116134132A (ja)
WO (1) WO2022019560A1 (ja)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0116718B2 (en) 1983-01-13 1996-05-08 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Process for the introduction of expressible genes into plant cell genomes and agrobacterium strains carrying hybrid Ti plasmid vectors useful for this process
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
CA1327173C (en) 1987-07-21 1994-02-22 Erwin Heberle-Bors Method of gene transfer into plants
EP3221455B1 (en) * 2014-11-20 2020-08-12 Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Compositions and methods for producing polypeptides with a modified glycosylation pattern in plant cells
KR20180060318A (ko) * 2016-11-28 2018-06-07 서울대학교산학협력단 바이오 의약품 생산을 위한 당쇄공학 적용 애기장대 기주식물 및 이를 이용한 바이오 의약품 생산 방법
BR112020009133A2 (pt) 2017-11-15 2020-10-13 Evelo Biosciences, Inc. composições e métodos de tratamento de distúrbios imunológicos usando cepas de bactérias lactococcus imunomoduladoras

Also Published As

Publication number Publication date
EP4186976A4 (en) 2024-05-01
KR20220011373A (ko) 2022-01-28
KR102461600B1 (ko) 2022-11-02
CN116134132A (zh) 2023-05-16
WO2022019560A1 (ko) 2022-01-27
US20230295648A1 (en) 2023-09-21
EP4186976A1 (en) 2023-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2003219402B2 (en) GnTIII (UDP-n-acethylglucosamine:beta-D mannoside beta (1,4)-N-acethylglucosaminy ltransferase III) expression in plants
EP2367941B1 (en) Method for the transformation of plant cell mitochondria
JP2001509376A (ja) フィードバック不感性トレオニンデヒドラターゼ／デアミナーゼを発現する植物および微生物を製造するための方法および組成物
EP2389441B1 (en) Gene targeting in plants
JP2023535053A (ja) Ｎ－グリコシル化突然変異イネ、その製造方法及びそれを利用したタンパク質生産用イネの製造方法
US6720478B1 (en) RAD51-like polynucleotide and uses thereof
EP2167668B1 (en) Improvements in or relating to organic compounds
EP1141303A1 (en) Maize rad2/fen-1 orthologues and uses thereof
US20050060775A1 (en) Production of human coagulation factor VIII from plant cells and whole plants
KR100974302B1 (ko) 페투인이 발현된 감자 식물체
US6706949B1 (en) RuvB orthologues and uses thereof
KR20240066509A (ko) N-당질화 돌연변이 벼를 이용한 단일클론항체 생산용 벼의 제조방법 및 이에 의해 제조된 단일클론항체
EP1131437A1 (en) Maize rad23 genes and uses thereof
US6815578B1 (en) Polynucleotide encoding MRE11 binding polypeptide and uses thereof
JP2002530082A (ja) トウモロコシｄｎａリガーゼｉオーソログおよびその使用
AU772028C (en) KIN17 orthologues and uses thereof
AU771177B2 (en) A novel maize RAD51-like gene and uses thereof
WO2005123928A1 (en) Production of human coagulation factor viii from plant cells and whole plants
EP1112370A1 (en) Maize sina orthologue-1 and uses thereof
US20030084476A1 (en) DNA polymerase eta ( Poleta) cDNA and uses thereof
WO2005045046A1 (en) Expression of plastid-targeted polypeptides in plants
Herman et al. residues were still detected albeit dramatically reduced as compared with wild-type cells. To suppress the remaining α1, 3-fucose residues, a second genome editing targeted both GnTI and α1, 3-fucosyltransferase (FucT) genes. No β1, 2-xylose nor α1, 3-fucose residues were detected on the glycoproteins produced by the GnTI/FucT-KO cell lines. Absence of complex N-glycans on secreted glycoproteins of GnTI-KO
CA2379700A1 (en) Maize orthologues of bacterial ruvb:cdnas and uses thereof
AU2002360309A1 (en) DNA Polmerase eta (POLeta) CDNA and uses thereof
WO2003027257A2 (en) Methods of controlling gene expression and gene silencing