BR112020009133A2 - composições e métodos de tratamento de distúrbios imunológicos usando cepas de bactérias lactococcus imunomoduladoras - Google Patents

composições e métodos de tratamento de distúrbios imunológicos usando cepas de bactérias lactococcus imunomoduladoras Download PDF

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BR112020009133A2
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Holly Ponichtera
Andrea Itano
Mark Bodmer
Taylor Cormack
Maria Sizova
Carolina Baez-Giangreco
Duncan McHale
Kritika Ramani
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Abstract

A presente invenção refere-se a métodos e composições relacionadas a cepas de Lactococcus imunomoduladoras úteis como agentes terapêuticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO- SIÇÕES E MÉTODOS DE TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS IMUNO- LÓGICOS USANDO CEPAS DE BACTÉRIAS LACTOCOCCUS IMU- NOMODULADORAS".
PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade dos Pedidos de Patente Provisórios U.S. que têm os números de série 62/586.604, depositado em 15 de novembro de 2017, 62/660.693, depositado em de abril de 2018, 62/661.459, depositado em 23 de abril de 2018 e 62/721.941, depositado em 23 de agosto de 2018, o conteúdo de cada um dos quais são incorporados ao presente documento a título de re- ferência em sua totalidade.
SUMÁRIO
[0002] Em determinados aspectos, são fornecidos no presente do- cumento métodos e composições (por exemplo, composições bacteri- anas, composições farmacêuticas) relacionados ao tratamento e/ou prevenção de doença (por exemplo, câncer, doença autoimune, doen- ça inflamatória, doença metabólica), em um sujeito (por exemplo, um sujeito humano) que compreende administrar uma composição bacte- riana que compreende bactérias Lactococcus e/ou um produto de tais bactérias (por exemplo, vesículas extracelulares (EVs) e/ou biomassas farmaceuticamente ativas (PhABs)). Em determinados aspectos, são fornecidos no presente documento métodos e composições relaciona- dos ao tratamento e/ou prevenção de um distúrbio imunológico em um sujeito (por exemplo, um sujeito humano) que compreende administrar uma composição bacteriana (farmacêutica) que compreende bactérias Lactococcus imunomoduladoras reveladas no presente documento e/ou um produto de bactérias Lactococcus imunomoduladoras revela- das no presente documento (por exemplo, vesículas extracelulares (EVs) e/ou biomassas farmaceuticamente ativas (PhABs)). Também são fornecidos no presente documento métodos para produzir e/ou identificar tal bactéria e/ou produto bacteriano. Em algumas modalida- des, são fornecidos aqui biorreatores que compreendem as bactérias Lactococcus reveladas no presente documento.
[0003] Em certas modalidades, são fornecidas no presente docu- mento bactérias Lactococcus imunomoduladoras. Em algumas moda- lidades, as bactérias Lactococcus imunomoduladoras são uma cepa imunomoduladora de cepa de Lactococcus lactis cremoris. Em certas modalidades, a cepa Lactococcus imunomoduladora é a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA-125368). Em algumas modalidades, as bactérias imunomoduladoras são uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococ- cus lactis cremoris) que compreende uma proteína listada na Tabela 1 e/ou um gene que codifica uma proteína listada na Tabela 1. Em al- gumas modalidades, as bactérias imunomoduladoras são uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lac- tis cremoris) que compreende uma proteína associada à membrana listada na Tabela 2 e/ou um gene que codifica uma proteína associada à membrana listada na Tabela 2. Em algumas modalidades, as bacté- rias imunomoduladoras são uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) isenta ou substan- cialmente isenta de uma proteína listada na Tabela 3 e/ou um gene que codifica uma proteína listada na Tabela 3. Em algumas modalida- des, as bactérias imunomoduladoras são uma cepa de bactérias Lac- tococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) isenta ou substancialmente isenta de uma proteína de síntese de exo- polissacarídeo (EPS) listada na Tabela 4 e/ou um gene que codifica uma proteína de síntese de EPS listada na Tabela 4. Em algumas mo- dalidades, as bactérias imunomoduladoras são uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris)
isenta ou substancialmente isenta de um EPS sintetizado totalmente ou em parte por uma proteína listada na Tabela 4. Em algumas moda- lidades, as bactérias imunomoduladoras são uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) isenta ou substancialmente isenta de EPS. Em algumas modalidades, as composições bacterianas fornecidas no presente documento com- preendem uma cepa de Lactococcus imunomoduladora fornecida no presente documento. Em algumas modalidades, as bactérias imuno- moduladoras são uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) isenta ou substancialmente isenta de uma proteína listada na Tabela 5 e/ou um gene que codifica uma proteína listada na Tabela 5. Em algumas modalidades, as bacté- rias imunomoduladoras são uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) que compreende uma proteína listada na Tabela 6 e/ou um gene que codifica uma pro- teína listada na Tabela 6.
[0004] Em algumas modalidades, são fornecidas no presente do- cumento PhABs produzidas a partir de e/ou compreendendo uma cepa de Lactococcus imunomoduladora fornecida no presente documento. Em algumas modalidades, as PRABs compreendem células integrais, frações de células, sobrenadante de fermentação, frações de sobre- nadante e/ou vesículas extracelulares produzidas a partir de bactérias imunomoduladoras descritas no presente documento. Em algumas modalidades, as composições bacterianas fornecidas no presente do- cumento compreendem uma PhAB de cepa de Lactococcus imunomo- duladora fornecida no presente documento.
[0005] Em algumas modalidades, são fornecidas no presente do- cumento EVs produzidas e/ou geradas e/ou isoladas de uma cepa de Lactococcus imunomoduladora fornecida no presente documento. Em algumas modalidades, as composições bacterianas compreendem tan-
to EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladora como bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladoras (por exemplo, bactérias vi- vas, bactérias exterminadas, bactérias atenuadas). Em determinadas modalidades, são fornecidas no presente documento composições bacterianas que compreendem bactérias da cepa de Lactococcus imunomoduladoras (por exemplo, Cepa A de Lactococcus lactis cre- moris) na ausência de EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladora. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreen- dem EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladora na ausência de bactérias da cepa de Lactococcus imunomoduladoras.
[0006] Em algumas modalidades, a cepa de Lactococcus imuno- moduladora compreende pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 99,5% de iden- tidade de sequência, pelo menos 99,6% de identidade de sequência, pelo menos 99,7% de identidade de sequência, pelo menos 99,8% de identidade de sequência, pelo menos 99,9% de identidade de sequên- cia) com a sequência de nucleotídeos (por exemplo, sequência genô- mica, sequência de 16S, sequência de CRISPR) da Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris. Em algumas modalidades, a administração da composição bacteriana trata o distúrbio imunológico no sujeito. Em al- gumas modalidades, o distúrbio imunológico é uma doença autoimune. Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é uma doença in- flamatória. Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é uma alergia.
[0007] Em determinadas modalidades, são fornecidos no presente documento métodos de tratamento de um sujeito que tem um distúrbio imunológico (por exemplo, uma doença autoimune, uma doença infla- matória, uma alergia), que compreendem administrar ao sujeito uma composição bacteriana que compreende bactérias da cepa de Lacto- coccus imunomoduladoras fornecidas no presente documento (por exemplo, uma bactéria exterminada, uma bactéria viva, uma biomassa farmaceuticamente ativa e/ou uma bactéria atenuada). Em algumas modalidades, a cepa de Lactococcus imunomoduladora é a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA-125368). Em algumas modalidades, a cepa de Lactococcus imunomoduladora é uma cepa que compreende pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pe- lo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência (por exemplo, identidade de sequên- cia genômica, identidade de sequência 168, identidade de sequência CRISPR) (por exemplo, pelo menos 99,5% de identidade de sequên- cia, pelo menos 99,6% de identidade de sequência, pelo menos 99,7% de identidade de sequência, pelo menos 99,8% de identidade de se- quência, pelo menos 99,9% de identidade de sequência) com a se- quência de nucleotídeos correspondente da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA-125368). Em algumas modalidades, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bactérias na composição bacteriana são a cepa de Lactococcus imunomoduladora.
Em algumas modalidades, todas ou substancialmente todas as bacté- rias na formulação bacteriana são a cepa de Lactococcus imunomodu- ladora.
Em algumas modalidades, a formulação bacteriana compreen- de pelo menos 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 108, 4 x 106, 5x 108, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 108, 9 x 106, 1 x 107, 2x 107, 3 x 107, 4 x 10, 5x107, 6x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9x 107, 1 x 108, 2x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108 ou 1 x 10º unidades de formação de colônia da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
Em algumas modalidades, a composição bacteriana compreende EVs e/ou
PhABs (por exemplo, células inteiras, frações de células, sobrenadan- te de fermentação, frações de sobrenadante e/ou vesículas extracelu- lares) produzidas a partir da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[0008] Em determinadas modalidades, são fornecidas no presente documento composições bacterianas que compreendem uma cepa de Lactococcus imunomoduladora (por exemplo, um bactéria extermina- dora, uma bactéria viva, uma biomassa farmaceuticamente ativa e/ou uma bactéria atenuada). Em algumas modalidades, a cepa de Lacto- coccus imunomoduladora é a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA-125368). Em algumas modalidades, a cepa de Lactococcus imunomoduladora é uma cepa que compreen- de pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de se- quência (por exemplo, identidade de sequência genômica, identidade de sequência 168, identidade de sequência CRISPR) (por exemplo, pelo menos 99,5% de identidade de sequência, pelo menos 99,6% de identidade de sequência, pelo menos 99,7% de identidade de sequên- cia, pelo menos 99,8% de identidade de sequência, pelo menos 99,9% de identidade de sequência) com a sequência de nucleotídeos corres- pondente da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de De- pósito ATCC PTA-125368). Em algumas modalidades, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bactérias na composição bacteriana são a cepa de Lactococcus imunomoduladora. Em algumas modalidades, todas ou substancialmente todas as bactérias na formulação bacteria- na são a cepa de Lactococcus imunomoduladora. Em algumas moda- lidades, a formulação bacteriana compreende pelo menos 1 x 10%, 5x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 108, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 1086, 7 x 106, 8 x 108, 9 x1086, 1x 107, 2x107, 3 x 107, 4x 107, 5x 107, 6x 107, 7 x 107, 8x
107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108 ou 1 x 10º unidades de formação de colônia da cepa de Lactococcus imunomoduladora. Em algumas modalidades, a com- posição bacteriana compreende EVs e/ou PhABs (por exemplo, célu- las inteiras, frações de células, sobrenadante de fermentação, frações de sobrenadante e/ou vesículas extracelulares) produzidas a partir da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[0009] Em determinadas modalidades, as composições bacteria- nas fornecidas no presente documento compreendem uma razão es- pecífica de bactérias da cepa de Lactococcus imunomoduladora para partículas de EV de cepa Lactococcus imunomoduladora. Por exem- plo, em algumas modalidades, a composição bacteriana compreende pelo menos 1 bactéria da cepa de Lactococcus imunomoduladora para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 21, 2,2, 2,3, 24, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 71,3, TA, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,
38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72,73,74,75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x10%, 2x10%, 3x10º%, 4x10º, 5x10%, 6x103, 7x10%, 8x103%, 9x10%, 1x10º%, 2x10%, 3x10º, 4x10º, 5x10º, 6x10%, 7x10%, 8x10%, 9x10%, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7Xx105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x108, 7x108, 8x106, 9x108, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108,
1x10º, 2x10º, 3x10º, 4x10º, 5x10º, 6x10º%, 7x10º, 8x10º, 9x10º%, 1x10º, 2x107%, 3x10%, 4x10%, 5x107%, 6x107%, 7x10%%, 8x10%, 9x10%, 1x10, 2x10%, 3x1071, 4x10), 5x10%!, 6x10%, 7x10%1, 8x10!, 9x10!, e/ou 1x10"? partículas de EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora. Em algumas modalidades, a composição bacteriana compreende cer- ca de 1 bactéria de cepa de Lactococcus imunomoduladora para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 24, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22,23, 24,25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72,73, 74,75, 76,77,78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,
98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x10%, 3x10º, 4x10%, 5x103, 6x10º, 7Xx10%, 8x103, 9x10%, 1x10º, 2x10º, 3x10º, 4x10º, 5x10º, 6x10º, 7x10º, 8x10%, 9x10%, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x108, 2x106, 3x106, 4x108, 5x106, 6x106, 7x108, 8x106, 9x108, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x10º, 2x10º, 3X10º, 4x10º, 5x10%º, 6x10%º, 7x10º, 8x10%º, 9x10%, 1x10%%º, 2x10º, 3x10º, 4x10%º, 5x10%%, 6x107%, 7x10%º, 8x107%, 9x10%, 1x10%, 2x10, 3x10!, 4x10, 5x10, 6x10%, 7x10%!, 8x10%, 9x10!, e/ou 1x107? par- tículas de EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora. Em algumas modalidades, a composição bacteriana compreende não mais que 1 bactéria Lactococcus lactis cremoris para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1,
3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42,43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72,73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x10%, 2x10%, 3x103, 4x10%, 5x10%, 6x10%, 7x10º%, 8x10º, 9x10%, 1x10%, 2x10%, 3x10º, 4x10º, 5x10º%, 6x10%, 7x10º, 8x10º, 9x10º, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x108, 3x1086, 4x108, 5x106, 6x106, 7x106, 8x1086, 9x108, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5xX107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x10º%, 2x10º, 3x10º, 4x10º, 5Xx10%º, 6x10%º, 7x10º, 8x10º, 9x10%, 1x10%%º, 2x10%%, 3x10%%, 4x10º, 5x10%%, 6x10%, 7x10%%, 8x107%, 9x10%, 1x107!, 2x101, 3x10%!, 4x10, 5x10!, 6x10, 7x10, 8x10%, 9x10*!, e/ou 1x10*? partículas de EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
Em algumas modalidades, a composição bacteriana compreende pelo menos 1 partícula de EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42,43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63,
64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72,73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x10%, 2x10%, 3x103, 4x10%, 5x10%, 6x10%, 7x10º%, 8x10º, 9x10%, 1x10%, 2x10%, 3x10º, 4x10º, 5x10º%, 6x10%, 7x10º, 8x10º, 9x10º, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x108, 3x1086, 4x108, 5x106, 6x106, 7x106, 8x1086, 9x108, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5xX107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x10º%, 2x10º, 3x10º, 4x10º, 5Xx10%º, 6x10%º, 7x10º, 8x10º, 9x10%, 1x10%%º, 2x10%%, 3x10%%, 4x10º, 5x10%%, 6x10%, 7x10%%, 8x107%, 9x10%, 1x107!, 2x101, 3x10%!, 4x10, 5x10!, 6x107!, 7x10), 8x107!, 9x10), e/ou 1x107? bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladora. Em algumas modalidades, a com- posição bacteriana compreende cerca de 1 partícula de EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,
48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x10%, 2x10%, 3x103%, 4x10%, 5x10%, 6x10%, 7x10%, 8x10%, 9x10º, 1x10º%, 2x10%, 3x10º, 4x10%, 5x10º%, 6x10%, 7x10º, 8x10%, 9x10º%, 1x105, 2x105, 3x105, 4x10º, 5x105, 6x10º, 7x105, 8x10º%, 9x105, 1x108, 2x108, 3Xx1086, 4x108, 5x1086, 6x1086, 7x108, 8x1086, 9x108, 1x107, 2x107, 3x107,
4x107, 5xX107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x10º, 5x108, 6x108, 7x108%, 8x108, 9x108, 1x10ºº, 2x10ºº, 3x10º, 4x10º, 5x10º, 6x10%º, 7x10º, 8x10º, 9x10º, 1x10%%º, 2x10%%º, 3x10%, 4x10º, 5x10º, 6x10%%, 7x10%º, 8x10º, 9x10%%, 1x10!, 2x10, 3x107!, 4x10!, 5x10, 6x10!!, 7x10*, 8x10!, 9x10!, e/ou 1x10? bactérias de cepa de Lac- tococcus imunomoduladoras. Em algumas modalidades, a composição bacteriana compreende não mais que 1 partícula de EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,
48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x10%, 2x10%, 3x103%, 4x10%, 5x10%, 6x10%, 7x10%, 8x10%, 9x10º, 1x10º%, 2x10%, 3x10º, 4x10%, 5x10º%, 6x10%, 7x10º, 8x10%, 9x10º%, 1x105, 2x105, 3x105, 4x10º, 5x105, 6x10º, 7x105, 8x10º%, 9x105, 1x108, 2x108, 3Xx1086, 4x108, 5x1086, 6x1086, 7x108, 8x1086, 9x108, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5xX107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x10º, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x10ºº, 2x10ºº, 3x10º, 4x10º, 5x10º, 6x10%, 7x10º, 8x10%, 9x10º, 1x10%º, 2x10%%, 3x10%º, 4x10%º, 5x10º, 6x10%, 7x10%%, 8x10%, 9x107%, 1x107!, 2x107!, 3x10!, 4x10!, 5x10, 6x10!!, 7x10!, 8x10), 9x10*!, e/ou 1x10? bactérias de cepa de Lacto- coccus imunomoduladoras.
[0010] Em algumas modalidades, a composição bacteriana é ad-
ministrada oralmente, de modo intravenoso, intratumoral ou subcutãâ- neo. Em algumas modalidades, a composição bacteriana é adminis- trada em 2 ou mais (por exemplo, 3 ou mais, 4 ou mais ou 5 ou mais doses). Em algumas modalidades, a administração ao sujeito das duas ou mais doses é separada por pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 di- as, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias ou 21 dias. Em algumas modalidades, uma segunda bactéria é administrada como parte de um consórcio ecológico.
[0011] Em algumas modalidades, o sujeito apresenta dermatite atópica entre branda e moderada. Em algumas modalidades, o sujeito apresenta dermatite atópica branda. Em algumas modalidades, o su- jeito apresenta dermatite atópica moderada.
[0012] Em algumas modalidades, o sujeito apresenta psoríase en- tre branda e moderada. Em algumas modalidades, o sujeito apresenta psoríase branda. Em algumas modalidades, o sujeito apresenta psorí- ase moderada.
[0013] Em algumas modalidades, é administrada ao sujeito uma dose diária entre cerca de 66 mg e cerca de 3,3 g de uma cepa de Lactococcus imunomoduladora fornecida no presente documento (por exemplo, Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA-125368) ou uma cepa que compreende pelo menos 99% de identidade de sequência (por exemplo, identidade de sequência genômica, identidade de sequência 168, identidade de sequência CRISPR) (por exemplo, pelo menos 99,5% de identidade de sequên- cia, pelo menos 99,6% de identidade de sequência, pelo menos 99,7% de identidade de sequência, pelo menos 99,8% de identidade de se- quência, pelo menos 99,9% de identidade de sequência) com a se-
quência de nucleotídeos da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA-125368)). Em algumas modalidades, é administrada ao sujeito uma dose diária de cerca de 66 mg de uma cepa de Lactococcus imunomoduladora fornecida no presente docu- mento. Em algumas modalidades, é administrada ao sujeito uma dose diária de cerca de 660 mg de uma cepa de Lactococcus imunomodu- ladora fornecida no presente documento. Em algumas modalidades, é administrada ao sujeito uma dose diária de cerca de 3,3 g de uma ce- pa de Lactococcus imunomoduladora fornecida no presente documen- to. Em algumas modalidades, a dose diária é formulada em uma cáp- sula. Em algumas modalidades, é administrada ao sujeito a dose de uma cepa de Lactococcus imunomoduladora fornecida no presente documento durante pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias.
[0014] Em algumas modalidades, o sujeito tem um índice de mas- sa corporal de 18 kg/m2 a 35 kg/m2. Em algumas modalidades, o su- jeito tem um diagnóstico confirmado de psoríase do tipo placa entre branda e moderada durante pelo menos 6 meses que envolve < 5% de área de superfície do corpo (BSA) (excluindo o couro cabeludo). Em algumas modalidades, o sujeito apresenta um mínimo de 2 lesões pso- ríaticas. Em algumas modalidades, o sujeito apresenta dermatite ató- pica entre branda e moderada com um mínimo de 3 a um máximo de 15% de envolvimento de BSA. Em algumas modalidades, o sujeito te- ve um diagnóstico confirmado de dermatite atópica entre branda a moderada durante pelo menos 6 meses com um escore IGA de 2 ou 3. Em algumas modalidades, o sujeito apresenta pelo menos duas lesões associadas à dermatite atópica.
[0015] Em algumas modalidades, o sujeito não é gestante. Em al- gumas modalidades, o sujeito não está amamentando. Em algumas modalidades, o sujeito não está sendo tratado com um fármaco anti-
inflamatório. Em algumas modalidades, o sujeito não apresenta uma infecção ativa (por exemplo, sepse, pneumonia, abscesso). Em algu- mas modalidades, o sujeito não apresenta insuficiência renal ou hepá- tica (por exemplo, para mulheres um nível sérico de creatinina > 125 upumol/l, para homens um nível sérico de creatinina de > 125 umol/l, uma alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) 2 1,5x ou 2x o limite superior de normalidade (ULN), fosfatase alcalina (ALP) e/ou bilirrubina > 1,5x ULN.
[0016] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana suprime a resposta imunológica em hipersensibilidade de tipo retarda- do (DTH). Em determinadas modalidades, a composição bacteriana induz uma célula T reguladora ou uma resposta anti-inflamatória. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana inibe respostas antígeno específicas. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata dermatite alérgica de contato. Em determinadas mo- dalidades, a composição bacteriana trata miocardite autoimune. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata diabetes mellitus tipo 1. Em determinadas modalidades, a composição bacteria- na trata granulomas. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata neuropatias periféricas. Em determinadas modalida- des, a composição bacteriana trata tireoidite de Hashimoto. Em deter- minadas modalidades, a composição bacteriana trata esclerose múlti- pla. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata ar- trite reumatoide.
[0017] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata inflamação do cólon. Em determinadas modalidades, a composi- ção bacteriana trata colite. Colite pode ser aguda e autolimitada ou de longo prazo. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata colite ulcerativa. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata doenças digestivas. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata doença de Crohn. Em determinadas mo- dalidades, a composição bacteriana trata doença inflamatória intestinal (DII). Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata colite microscópica. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata colite colagenosa. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata colite por derivação. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata colite química. Em deter- minadas modalidades, a composição bacteriana trata colite isquêmica. Em determinadas modalidades, a composição bacteriana trata colite indeterminada. Em determinadas modalidades, a composição bacteri- ana trata colite atípica. Em algumas modalidades, o método compre- ende adicionalmente administrar ao sujeito um agente terapêutico (por exemplo, um antibiótico, um imunossupressor, um agente anti- inflamatório). Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente: administrar ao sujeito uma segunda bactéria terapêutica.
[0018] Em algumas modalidades, o sujeito é um mamífero. Em algumas modalidades, o sujeito é um ser humano. Em algumas moda- lidades, o sujeito é um mamífero não humano (por exemplo, um ca- chorro, um gato, uma vaca, um cavalo, um porco, um jumento, uma cabra, um camelo, um camundongo, um rato, um porquinho da índia, uma ovelha, uma lhama, um macaco, um gorila ou um chimpanzé).
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0019] A Figura 1 mostra a eficácia de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris administrada por via oral na redução de inchaço da ore- lha antígeno-específico (espessura da orelha) em comparação com o veículo (controle negativo), anti-inflamatório Dexametasona (controle positivo), e Bactérias A, B e C em um modelo de camundongo com hipersensibilidade do tipo retardado.
[0020] A Figura 2 é um gráfico de linhas que mostra a porcenta- gem de alteração de peso em u modelo de colite induzida por DSS aguda durante um período de 12 dias para a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em comparação com as Bactérias A, B e C, controle positivo (anti-p40) e controle negativo (Veículo de sacarose). O grupo de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris mostrou menos alteração de peso que o anticorpo anti-p40 (controle positivo).
[0021] A Figura 3A e Figura 3B são gráficos que mostram que a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris administrada por via oral reduz o inchaço da orelha antígeno-específico (espessura da orelha) em comparação com o veículo (controle negativo) e Dexametasona (Figu- ra 3A) e Fingolimode (Figura 3B).
[0022] A Figura 4 é um gráfico que mostra a eficácia da Cepa À de Lactococcus lactis cremoris (com e sem um plasmídeo de 13kb) e da Cepa B de Lactococcus lactis cremoris (com e sem um plasmídeo de 30kb) na redução de inchaço de orelha antígeno-especiífico (espes- sura da orelha) em comparação com o veículo e Dexametasona em um modelo de camundongo com hipersensibilidade do tipo retardado baseado em KLH. A Cepa A de Lactococcus lactis cremoris sem um plasmídeo de 13kb tem eficácia reduzida em comparação com a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris com um plasmídeo de 13kb. Por ou- tro lado, a remoção de um plasmídeo de 30kb da Cepa B de L. /lactis cremoris aumenta a eficácia em comparação com a Cepa B de L. lac- tis cremoris com o plasmídeo de 30kb.
[0023] A Figura 5 mostra a eficácia de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris administrada por via oral na redução de inchaço da ore- lha antígeno-específico (espessura da orelha) em comparação com o veículo (controle negativo), e anti-inflamatório Dexametasona (controle positivo), em um Modelo de Camundongo com hipersensibilidade do tipo retardado por transferência adotiva (AdDTH) baseada em OVA.
[0024] As Figuras 6A, 6B e 6C mostram a capacidade da Cepa À de Lactococcus lactis cremoris na redução da expressão de IL-12p70
(Figura 6A), 1L-22 (Figura 6B) e KC (Figura 6C) em um Modelo de Camundongo com Hipersensibilidade de Tipo Retardado por Transfe- rência Adotiva (AdDTH). O círculo representa veículo, o quadrado re- presenta dexametasona e o triângulo representa a Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris.
[0025] A Figura 7 mostra a eficácia de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris no aprimoramento dos escores de inflamação cutânea em um modelo de psoríase por imiquimode em comparação com o creme de controle, veículo e dexametasona.
[0026] A Figura 8 mostra a eficácia de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris submetida à irradiação gama na redução de inchaço da orelha antígeno-específico (espessura da orelha) em 24 horas em comparação com o veículo (controle negativo), e anti-inflamatório De- xametasona (controle positivo) em um modelo de camundongo com hipersensibilidade do tipo retardado baseado em KLH. Conforme mos- trado, a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris submetida à irradiação gama mantém a eficácia.
[0027] As Figuras 9A, 9B, 9C e 9D mostram a capacidade da Ce- pa A de Lactococcus lactis cremoris submetida à irradiação gama para reduzir a expressão de IL-12p70 (Figura 9A), TNF (Figura 9B), IL-6 (Figura 9C) e IL-13 (Figura 9D) em um modelo de camundongo com hipersensibilidade de tipo retardado baseado em KLH. O círculo repre- senta veículo, o quadrado representa dexametasona e o triângulo re- presenta Cepa A de Lactococcus lactis cremoris submetida à irradia- ção gama diminui as respostas de citocina pró-inflamatória em leucóci- tos do linfonodo drenante do local. O círculo representa veículo, o quadrado representa dexametasona e o triângulo representa a Cepa À de Lactococcus lactis cremoris.
[0028] As Figuras 10A e 10B mostram a capacidade de a Cepa À de Lactococcus lactis cremoris submetida à irradiação gama reduzir a secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6 e TNFa) dos linfonodos de drenagem intestinal (Figura 10A), enquanto a Cepa A de Lactococ- cus lactis cremoris submetida à irradiação gama induz as células imu- nes periféricas a secretarem mais IL-10 (Figura 10B).
DESCRIÇÃO DETALHADA Geral
[0029] Em determinados aspectos, são fornecidos no presente do- cumento métodos e composições (por exemplo, composições bacteri- anas, composições farmacêuticas) relacionados ao tratamento e/ou prevenção de doença (por exemplo, câncer, doença autoimune, doen- ça inflamatória, doença metabólica), em um sujeito (por exemplo, um sujeito humano) que compreende administrar uma composição bacte- riana que compreende bactérias Lactococcus e/ou um produto de tais bactérias (por exemplo, vesículas extracelulares (EVs) e/ou biomassas farmaceuticamente ativas (PhABs)). Em determinados aspectos, tam- bém são fornecidos métodos de tratamento um distúrbio imunológico (por exemplo, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, uma alergia) em um sujeito que compreende administrar ao sujeito uma composição bacteriana que compreende uma cepa de Lactococcus imunomoduladora fornecida no presente documento, EVs geradas ou isoladas de uma cepa de Lactococcus imunomoduladora fornecida no presente documento e/ou uma PhAB produzida a partir de ou compre- endendo uma cepa de Lactococcus imunomoduladora fornecida no presente documento. Definições
[0030] "Administração" se refere amplamente a uma via de admi- nistração de uma composição a um sujeito. Exemplos de vias de ad- ministração incluem administração oral, administração retal, adminis- tração tópica, inalação (nasal) ou injeção. A administração por injeção inclui administração intravenosa (IV), intramuscular (IM), intratumoral
(IT) e subcutânea (SC). As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser administradas de qualquer forma por qualquer via eficaz, incluindo, mas sem limitações, intratumoral, oral, parenteral, enteral, intravenosa, intraperitoneal, tópica, transdérmica (por exemplo, com o uso de qualquer emplastro padrão), intradérmica, oftálmica, de modo (intra)nasal, local, não oral, como aerossol, inala- ção, subcutânea, intramuscular, bucal, sublingual, (trans)retal, vaginal, intra-arterial e intratecal, transmucosal (por exemplo, sublingual, lin- gual, (trans)bucal, (trans)uretral, vaginal (por exemplo, trans- e periva- ginal), intravesical, intrapulmonar, intraduodenal, intragástrico e intra- brônquico. Em modalidades preferenciais, as composições farmacêuti- cas descritas no presente documento são administradas por via oral, retal, intratumoral, tópica, intravesical, por injeção no linfonodo de dre- nagem ou adjacente ao mesmo, por via intravenosa, por inalação ou aerossol ou por via subcutânea.
[0031] Conforme usado no presente documento, o termo "anticor- po" pode se referir tanto a um anticorpo intacto como a um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Anticorpos intactos são glicoproteí- nas que incluem pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadei- as leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pe- sada inclui uma região variável de cadeia pesada (abreviada no pre- sente documento como Vr) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve inclui uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como V.) e uma região constante de cadeia leve. As regiões Vn e V. podem ser, ainda, subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de comple- mentaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conserva- das, denominadas regiões de framework (FR). Cada Vx e V. é com- posta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir da terminação amino até a terminação carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2,
CDR2, FR3, CDR3, FRA4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. O termo "anticorpo" inclui, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticor- pos policlonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anti- corpos humanos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos de cadeia simples e fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno.
[0032] Os termos "fragmento de ligação ao antígeno" e "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, conforme usado no presente documento, se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade para se ligar a um antígeno. Exemplos de frag- mentos de ligação abrangidos no termo "fragmento de ligação ao antí- geno" de um anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fv ligado a dissulfeto, Fd, diacorpos, anticorpos de cadeia simples, NANOBODI- ESG, CDRH3 isolado e outros fragmentos de anticorpo que retêm pelo menos uma porção da região variável de um anticorpo intacto. Esses fragmentos de anticorpo podem ser obtidos com o uso de técnicas re- combinantes e/ou enzimáticas convencionais e podem ser triados quanto à ligação ao antígeno da mesma maneira que os anticorpos intactos.
[0033] "Aumento celular" se refere amplamente ao influxo de célu- las ou expansão de células em um ambiente que não estão substanci- almente presentes no ambiente antes da administração de uma com- posição e não estão presentes na própria composição. As células que aumentam o ambiente incluem células imunológicas, células estro- mais, células bacterianas e fúngicas. Os ambientes de interesse espe- cífico são os microambientes em que células cancerígenas residem ou estão localizadas. Em alguns casos, o microambiente é um microam- biente tumoral ou um linfonodo de drenagem tumoral. Em outros ca- sos, o microambiente é um sítio de tecido pré-cancerígeno ou o sítio de administração local de uma composição ou um sítio no qual a com- posição se acumulará após administração remota.
[0034] "Clado" se refere às OTUs ou membros de uma árvore filo- genética que estão a jusante de um nó estatisticamente válido em uma árvore filogenética. O clado compreende um conjunto de folhas termi- nais na árvore filogenética que é uma unidade evolutiva monofilética distinta e que compartilha, até certo ponto, similaridade de sequência. "Unidades taxonômicas operacionais", "OTU" (ou plural, "OTUs") refe- rem-se a uma folha terminal em uma árvore filogenética e são defini- das por uma sequência de ácidos nucleicos, por exemplo, o genoma inteiro, ou uma sequência genética específica e todas as sequências que compartilham identidade de sequência com essa sequência de ácidos nucleicos no nível de espécie. Em algumas modalidades, a se- quência genética específica pode ser a sequência 168 ou uma porção da sequência 16S. Em outras modalidades, os genomas inteiros de duas entidades são sequenciados e comparados. Em uma outra mo- dalidade, regiões selecionadas, tais como etiquetas de sequência mul- tilocus (MLST), genes específicos ou conjuntos de genes podem ser geneticamente comparadas. Em modalidades de 168, as OTUs que compartilham 197% de identidade média de nucleotídeos através de toda a 168 ou parte da região variável da 16S são consideradas a mesma OTU (consultar, por exemplo, Claesson M J, Wang Q, O'Sulli- van O, Greene-Diniz R, Cole J R, Ros R P e O'Toole P W. 2010. Com- parison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Res 38: e200. Konstantinidis K T, Ramette A e Tiedje J M. 2006. The bacterial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1.929 a 1.940.). Em modalidades que envolvem o genoma completo, MLSTs, genes específicos ou conjuntos de genes, as OTUs que compartilham 195%
de identidade média de nucleotídeos são consideradas a mesma OTU (consultar, por exemplo, Achtman M e Wagner M. 2008. Microbial di- versity e the genetic nature of microbial species. Nat. Rev. Microbiol. 6: 431 a 440. Konstantinidis K T, Ramette A e Tiedje J M. 2006. The bac- terial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1.929 a 1.940.). OTUs são frequentemente definidas comparando-se sequências entre organismos. Em geral, sequências com menos de 95% de identidade de sequência não são consideradas como parte da mesma OTU. OTUs também podem ser caracterizadas por qualquer combinação de marcadores ou genes nucleotídicos, em particular, genes altamente conservados (por exemplo, genes "de ma- nutenção"), ou uma combinação dos mesmos. Tal caracterização em- prega, por exemplo, dados WGS ou uma sequência genômica comple- ta.
[0035] Uma "combinação" de duas ou mais cepas microbianas in- clui a coexistência física das duas cepas microbianas, no mesmo ma- terial ou produto ou em produtos fisicamente conectados, bem como a coadministração ou colocalização temporal das cepas microbianas monoclonais.
[0036] O termo "diminuir" ou "depletar" significa uma alteração, de modo que a diferença seja, dependendo das circunstâncias, pelo me- nos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1/100, 1/1.000, 1/10.000, 1/100.000, 1/1.000.000 ou indetectável após o tratamento em comparação com um estado de pré-tratamento.
[0037] O termo "consórcio ecológico" é um grupo de bactérias que trocam metabólitos e corregulam positivamente uma à outra, em con- traste com duas bactérias que induzem sinergia de hospedeiro através da ativação de trajetórias de hospedeiro complementares para eficácia aprimorada.
[0038] O termo "epitopo" significa um determinante de proteína capaz de ligação específica a um anticorpo. Epitopos normalmente consistem em grupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativa, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar. Certos epi- topos podem ser definidos por uma sequência de aminoácidos especí- fica à qual um anticorpo tem capacidade para se ligar.
[0039] Conforme usado no presente documento, "bactérias geneti- camente modificadas" são quaisquer bactérias que tenham sido gene- ticamente alteradas a partir de seu estado natural por intervenção hu- mana e a progênie de quaisquer tais bactérias. Bactérias genetica- mente modificadas incluem, por exemplo, os produtos de modificação genética alvejada, os produtos de triagens mutagênicas aleatórias e os produtos de evolução dirigida.
[0040] Conforme usado no presente documento, o termo "vesícula extracelular" ou "EV" se refere a uma composição derivada de uma bactéria que compreende lipídios bacterianos e proteínas bacterianas e/ou ácidos nucleicos bacterianos e/ou porções químicas de carboidra- to contidas em uma nanopartícula. Essas EV podem conter 1, 2,3, 4, 5, 10 ou mais que 10 espécies diferentes de lipídio. EV podem conter 1, 2, 3, 4, 5, 10 ou mais que 10 espécies diferentes de proteína. EV podem conter 1, 2, 3, 4, 5, 10 ou mais que 10 espécies diferentes de ácido nucleico. EV podem conter 1, 2, 3, 4, 5, 10 ou mais que 10 es- pécies diferentes de carboidrato.
[0041] O termo "gene" é usado amplamente para se referir a qual- quer ácido nucleico associado a uma função biológica. O termo "gene" se aplica a uma sequência genômica específica, bem como a um CDNA ou um mRNA codificado por essa sequência genômica.
[0042] "Identidade" como entre sequência de ácidos nucleicos de duas moléculas de ácido nucleico pode ser determinada como uma porcentagem de identidade com o uso de algoritmos de computador conhecidos como o programa "FASTA", com o uso, por exemplo, dos parâmetros predefinidos como em Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2444 (outros programas incluem o pacote de pro- grama de GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Mrtin J. Bishop, ed., Aca- demic Press, San Diego, 1994 e Carillo et a/. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por exemplo, a função BLAST do banco de dados do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia pode ser usada para determinar a identidade. Outros programas comercial ou publi- camente disponíveis incluem, programa "MegAlign" da DNAStar (Ma- dison, Wis.) e o programa "Gap" do grupo de computadores da Univer- sidade de Genética de Wisconsin (UWG) (Madison Wis.)).
[0043] Conforme usado no presente documento, o termo "distúrbio imunológico" se refere a qualquer doença, distúrbio ou sintoma de do- ença causado por uma atividade do sistema imunológico, incluindo doenças autoimunes, doenças inflamatórias e alergias. Distúrbios imu- nológicos incluem, porém sem limitação, doenças autoimunes (por exemplo, lúpus, escleroderma, anemia hemolítica, vasculite, diabetes tipo um, doença de Grave, artrite reumatoide, esclerose múltipla, sín- drome de Goodpasture, anemia perniciosa e/ou miopatia), doenças inflamatórias (por exemplo, acne vulgar, asma, doença celíaca, prosta- tite crônica, glomerulonefrite, doença inflamatória intestinal, doença inflamatória pélvica, lesão por reperfusão, artrite reumatoide, sarcoido- se, rejeição a transplante, vasculite e/ou cistite intersticial) e/ou alergi- as (por exemplo, alergias alimentares, alergias a fármacos e/ou alergi- as ambientais).
[0044] O termo "aumentar" significa uma alteração, de modo que a diferença seja, dependendo das circunstâncias, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 vezes, 4 vezes, 10 ve- zes, 100 vezes, 1003 vezes, 10% vezes, 1055 vezes, 1006 vezes e/ou
1077 vezes maior após o tratamento em comparação com um estado de pré-tratamento. Propriedades que podem ser aumentadas incluem células imunológicas, células bacterianas, células estromais, células supressoras derivadas de mieloide, fibroblastos, metabólitos e citoci- nas.
[0045] O "espaçador transcrito interno" ou " ITS" é uma parte de RNA não funcional localizada entre RNAs ribossômicos estruturais (rRNA) em um transcrito precursor comum, frequentemente usado pa- ra identificação de espécies eucarióticas em fungos específicos. O rRNA de fungos que forma o núcleo do ribossoma é transcrito como um gene sinal e consiste nas regiões 8S, 5.8S e 28S com ITS4 e 5 en- tre as regiões 8S e 5.88 e 5.8S e 288, respectivamente. Esses dois segmentos intercistrônicos entre as regiões 18S e 5.8S e 5.8S e 28S são removidos por splicing e contêm variações significativa entre as espécies para fins de código de barras conforme anteriormente des- crito (Schoch et al., Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. PNAS 109:6.241 a 6.246. 2012). O rDNA 188 é tradicionalmente usado para reconstru- ção filogenética, entretanto, o ITS pode desempenhar essa função, visto que geralmente é altamente conservado, mas contém regiões hipervariáveis que abrigam diversidade de nucleotídeos suficiente para diferenciar gêneros e espécies da maioria dos fungos.
[0046] O termo "isolado" ou "enriquecido" engloba um micróbio, bactérias ou outra entidade ou substância que foi (1) separada de pelo menos alguns dos componentes aos quais a mesma estava associada quando inicialmente produzida (independentemente de ser na nature- za ou em uma configuração experimental) e/ou (2) produzida, prepa- rada, purificada e/ou fabricada pela mão do homem. Micróbios isola- dos podem ser separados de pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cer-
ca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou mais dos outros compo- nentes aos quais foram inicialmente associados.
Em algumas modali- dades, micróbios isolados são mais que cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cer- ca de 99% ou mais que cerca de 99% puros.
Conforme usado no pre- sente documento, uma substância é "pura" se a mesma é substanci- almente livre de outros componentes.
Os termos "purificar", "purifican- do" e "purificado" se referem a um micróbio ou outro material que te- nha sido separado de pelo menos parte dos componentes com os quais foi associado quando inicialmente produzido ou gerado (por exemplo, na natureza ou em um ambiente experimental), ou durante qualquer momento após sua produção inicial.
Um micróbio ou uma população microbiana pode ser considerado purificado se for isolado na produção ou após a mesma, tal como de um material ou ambiente que contém o micróbio ou população microbiana, e um micróbio ou população microbiana purificado pode conter até cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou acima de cerca de 90% de outros materiais e ainda ser considerado "isolado". Em algumas modalidades, micróbios ou população microbiana purificados são mais que cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais que cerca de 99% puros.
No caso das composições microbianas fornecidas no presente documento, o um ou mais tipos microbianos presentes na composição podem ser independentemente purificados de um ou mais outros mi- cróbios produzidos e/ou presentes no material ou ambiente que con- tém o tipo microbiano.
As composições microbianas e os componentes microbianos dos mesmos são geralmente purificados a partir de produ-
tos de habitat residual.
[0047] "Metabólito", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer e todos os compostos moleculares, composições, moléculas, íons, cofatores, catalisadores ou nutrientes usados como substratos em qualquer reação metabólica celular ou microbiana ou resultante como compostos de produto, composições, moléculas, íons, cofatores, catalisadores ou nutrientes de qualquer reação metabólica celular ou microbiana.
[0048] "Micróbio" se refere a qualquer organismo natural ou gene- ticamente modificado caracterizado como uma bactéria, fungos, alga microscópica, protozoário, e aos estágios de desenvolvimento ou es- tágios de ciclo de vida (por exemplo, vegetativo, esporo (incluindo es- porulação, dormência e germinação), latente, biofilme) associados ao organismo. Exemplos de micróbios intestinais incluem: Actinomyces graevenitzii, Actinomyces odontolyticus, Akkermansia muciniphila, Bacteroides caccae, Bacteroides fragilis, Bacteroides putredinis, Bac- teroides thetaiotaomicron, Bacteroides vultagus, Bifidobacterium ado- lescentis, Bifidobacterium bifidum, Bilophila wadsworthia, Lactococcus lactis, Butyrivibrio, Campylobacter gracilis, Clostridia cluster Ill, Clostri- dia cluster IV, Clostridia cluster IX (grupo Acidaminococcaceae), Clos- tridia cluster Xl, Clostridia cluster XIll (grupo Peptostreptococcus), Clostridia cluster XIV, Clostridia cluster XV, Collinsella aerofaciens, Coprococcus, Corynebacterium sunsvallense, Desulfomonas pigra, Dorea formicigenerans, Dorea longicatena, Escherichia coli, Eubacte- rium hadrum, Eubacterium rectale, Faecalibacteria prausnitzii, Gemel- la, Lactococcus, Lanchnospira, Mollicutes cluster XVI, Mollicutes clus- ter XVIII, Prevotella, Rothia mucilaginosa, Ruminococcus callidus, Ru- minococcus gnavus, Ruminococcus torques e Streptococcus.
[0049] "Microbioma" se refere amplamente aos micróbios que re- sidem sobre ou no sítio corporal de um sujeito ou paciente. Os micró-
bios em um microbioma podem incluir bactérias, vírus, micro- organismos eucarióticos e/ou vírus. Micróbios individuais em um mi- crobioma podem ser metabolicamente ativos, dormentes, latentes ou existirem como esporos, podem existir de modo planctônico ou em bio- filmes, ou podem estar presentes no microbioma de maneira sustentá- vel ou transitória. O microbioma pode ser um microbioma comensal ou em estado saudável ou um microbioma em estado de doença. O mi- crobioma pode ser nativo ao sujeito ou paciente, ou componentes do microbioma podem ser modulados, introduzidos ou depletados devido a mudanças no estado de saúde (por exemplo, pré-cancerígeno ou estado cancerígeno) ou condições de tratamento (por exemplo, trata- mento com antibiótico, exposição a diferentes micróbios). Em alguns aspectos, o microbioma ocorre em uma superfície da mucosa. Em al- guns aspectos, o microbioma é um microbioma do trato gastrointesti- nal. Em alguns aspectos, o microbioma é um microbioma tumoral.
[0050] Um "perfil de microbioma" ou uma "assinatura de microbio- ma" de um tecido ou amostra se refere a uma caracterização pelo me- nos parcial da constituição bacteriana de um microbioma. Em algumas modalidades, um perfil de microbioma indica que pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais cepas bacterianas estão presentes ou ausen- tes em um microbioma.
[0051] "Modificado", em referência a uma bactéria, se refere am- plamente a uma bactéria sofreu uma mudança de sua forma do tipo selvagem. Exemplos de modificações bacterianas incluem modificação genética, expressão gênica, modificação de fenótipo, formulação, mo- dificação química e dose ou concentração. Exemplos de propriedades melhoradas são descritos ao longo deste relatório descritivo e incluem, por exemplo, atenuação, auxotrofia, ancoragem ou antigenicidade. À modificação de fenótipo por incluir, a título de exemplo, desenvolvi-
mento de bactérias em meios que modificam o fenótipo de uma bacté- ria, que aumentam ou diminuem a virulência.
[0052] Conforme usado no presente documento, um gene é "supe- rexpresso" em uma bactéria se for expresso em um nível mais alto em uma bactéria geneticamente modificada sob pelo menos algumas con- dições do que é expresso por uma bactéria do tipo selvagem da mes- ma espécie sob as mesmas condições. De modo similar, um gene é "subexpresso" em uma bactéria se for expresso em um nível mais bai- xo em uma bactéria geneticamente modificada sob pelo menos algu- mas condições do que é expresso por uma bactéria do tipo selvagem da mesma espécie sob as mesmas condições.
[0053] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" são usados de modo intercambiável. Os mesmos se referem a uma forma polimé- rica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotí- deos ou ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Os polinucleotí- deos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem realizar qualquer função. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinu- cleotídeos: regiões de codificação ou não codificação de um gene ou fragmento de gene, loci (locus) definidos a partir de análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mMRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, poli- nucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qual- quer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleo- tídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, as modificações na estrutura do nucleotí- deo podem ser conferidas antes ou após a montagem do polímero. Um polinucleotídeo pode ser, ainda, modificado, tal como por conjuga- ção com um componente de identificação. Em todas as sequências de ácidos nucleicos fornecidas no presente documento, nucleotídeos U são intercambiáveis com nucleotídeos T.
[0054] Conforme usado no presente documento, uma substância é "pura" se a mesma é substancialmente livre de outros componentes. Os termos "purificar", "purificando" e "purificado" se referem a uma EV ou outro material que tenha sido separado de pelo menos parte dos componentes com os quais foi associado quando inicialmente produzi- do ou gerado (por exemplo, na natureza ou em um ambiente experi- mental), ou durante qualquer momento após sua produção inicial. Uma EV pode ser considerada purificada se for isolada na produção ou após a mesma, tal como de um ou mais outros componentes bacteria- nos, e um micróbio ou população microbiana purificado pode conter até cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou acima de cerca de 90% de outros materiais e ainda ser considerado "purificado". Em algumas modalidades, EV purificadas são mais que cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cer- ca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais que cerca de 99% puros. Composições de EV e os componentes microbianos das mes- mas são, por exemplo, purificadas a partir de produtos residuais do habitat.
[0055] Conforme usado no presente documento, o termo "compo- sição de EV purificada" ou "composição de EV" se refere a uma prepa- ração que inclui EV que foram separadas de pelo menos uma subs- tância associada encontrada em um material-fonte (por exemplo, se- paradas de pelo menos um outro componente bacteriano) ou qualquer material associado às EV em qualquer processo usado para produzir a preparação. Também se refere a uma composição que foi significati- vamente enriquecida ou concentrada. Em algumas modalidades, as EV são concentradas em 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 ve-
zes, 100 vezes, 1.000 vezes, 10.000 vezes ou mais de 10.000 vezes.
[0056] "Unidades taxonômicas operacionais" e "OTU (ou OTUs)" referem-se a uma folha terminal em uma árvore filogenética e são de- finidas por uma sequência de ácidos nucleicos, por exemplo, o geno- ma inteiro, ou uma sequência genética específica e todas as sequên- cias que compartilham identidade de sequência com essa sequência de ácidos nucleicos no nível de espécie. Em algumas modalidades, a sequência genética específica pode ser a sequência 16S ou uma por- ção da sequência 16S. Em outras modalidades, os genomas inteiros de duas entidades são sequenciados e comparados. Em uma outra modalidade, regiões selecionadas, tais como etiquetas de sequência multilocus (MLST), genes específicos ou conjuntos de genes podem ser geneticamente comparadas. Para 168, as OTUs que compartilham > 97% de identidade média de nucleotídeos através de toda a 16S ou parte da região variável da 168 são consideradas a mesma OTU. Consultar, por exemplo, Claesson MJ, Wang Q, O'Sullivan O, Greene- Diniz R, Cole JR, Ross RP e O'Toole PW. 2010. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 168 rRNA gene regions. Nucleic Acids Res 38: e200. Konstantinidis KT, Ramette A, e Tiedje JM. 2006. The bacterial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1.929 a 1.940. Para genomas com- pletos, MLSTs, genes específicos, além da 168, ou conjuntos de ge- nes, as OTUs que compartilham > 95% de identidade média de nucle- otídeos são consideradas a mesma OTU. Consultar, por exemplo, Achtman M e Wagner M. 2008. Microbial diversity e the genetic nature of microbial species. Nat. Rev. Microbiol. 6: 431 a 440. Konstantinidis KT, Ramette A, e Tiedje JM. 2006. The bacterial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1.929 a
1.940. OTUs são frequentemente definidas comparando-se sequên-
cias entre organismos. Em geral, sequências com menos de 95% de identidade de sequência não são consideradas como parte da mesma OTU. OTUs também podem ser caracterizadas por qualquer combina- ção de marcadores ou genes nucleotídicos, em particular, genes alta- mente conservados (por exemplo, genes "de manutenção"), ou uma combinação dos mesmos. Unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com atribuições taxonômicas realizadas para, por exemplo, gênero, espécie e clado filogenético, são fornecidas no presente documento.
[0057] Conforme usado no presente documento, "ligação específi- ca" se refere à capacidade de um anticorpo para se ligar a um antíge- no predeterminado ou à capacidade de um polipeptídeo para se ligar a seu parceiro de ligação predeterminado. Tipicamente, um anticorpo ou polipeptídeo se liga especificamente a seu antígeno predeterminado ou parceiro de ligação com uma afinidade que corresponde a um Kp de cerca de 107 M ou menos, e se liga ao antígeno predetermina- do/parceiro de ligação com uma afinidade (conforme expressa por Kp) que é pelo menos 10 vezes menor, pelo menos 100 vezes menor ou pelo menos 1.000 vezes menor que sua afinidade para ligação a um antígeno não específico e não relacionado/parceiro de ligação (por exemplo, BSA, caseína). Alternativamente, a ligação específica se aplica mais amplamente a um sistema de dois componentes, em que um componente é uma proteína, lipídio ou carboidrato, ou combinação dos mesmos, e engata com o segundo componente que é uma proteí- na, lipídio, carboidrato ou combinação dos mesmos de uma forma es- pecífica.
[0058] Os termos "sujeito" ou "paciente" se referem a qualquer animal. Um sujeito ou um paciente descrito como "em necessidade do mesmo" se refere a alguém em necessidade de um tratamento para uma doença. Mamíferos (isto é, animais mamíferos) incluem seres humanos, animais de laboratório (por exemplo, primatas, ratos, ca-
mundongos), gado (por exemplo, vacas, ovelha, cabras, porcos) e animais de laboratório (por exemplo, cães, gados, roedores). Por exemplo, o sujeito pode ser um mamífero não humano incluindo, po- rém sem limitação, um cachorro, um gato, uma vaca, um cavalo, um porco, um jumento, uma cabra, um camelo, um camundongo, um rato, um porquinho da índia, uma ovelha, uma lhama, um macaco, um gorila ou um chimpanzé. O sujeito ou paciente pode estar saudável, ou pode estar sofrendo de um distúrbio imunológico em qualquer estágio de desenvolvimento.
[0059] "Cepa" se refere a um membro de uma espécie bacteriana com uma assinatura genética de modo que possa ser diferenciado de membros intimamente relacionados da mesma espécie bacteriana. À assinatura genética pode ser a ausência da totalidade ou parte de pelo menos um gene, a ausência da totalidade ou parte de pelo menos uma região reguladora (por exemplo, um promotor, a terminador, um ribos- witch, um sítio de ligação a ribossoma), a ausência ("cura") de pelo menos um plasmídeo nativo, a presença de pelo menos um gene re- combinante, a presença de pelo menos um gene mutado, a presença de pelo menos um gene estranho (um gene derivado de uma outra es- pécie), a presença de pelo menos uma região reguladora mutada (por exemplo, um promotor, um terminador, um riboswitch, um sítio de liga- ção a ribossoma), a presença de pelo menos um plasmídeo não nati- Vo, a presença de pelo menos um cassete de resistência a antibiótico, ou uma combinação dos mesmos. Assinaturas genéticas entre cepas diferentes podem ser identificadas por amplificação de PCR opcional- mente seguida por sequenciamento de DNA da região genômica (ou regiões genômicas) de interesse ou de todo o genoma. No caso em que uma cepa (em comparação com uma outra da mesma espécie) ganhou ou perdeu resistência a antibiótico ou ganhou ou perdeu uma capacidade biossintética (tal como uma cepa auxotrófica), as cepas podem ser diferenciadas por seleção ou contrasseleção com o uso de um antibiótico ou nutriente/metabólito, respectivamente.
[0060] Conforme usado no presente documento, o termo "tratar" uma doença em um sujeito ou "tratar" um sujeito com suspeita de ter uma doença se refere à submissão do sujeito a um tratamento farma- cêutico, por exemplo, a administração de um ou mais agentes, de mo- do que pelo menos um sintoma da doença seja diminuído ou impedido de piorar. Assim, em uma modalidade, o "tratamento" refere-se, entre outros, ao retardamento da progressão, agilização da remissão, indu- ção da remissão, aumento da remissão, aceleração da recuperação, aumento da eficácia ou diminuição da resistência a terapêuticos alter- nativos, ou uma combinação dos mesmos. Bactérias
[0061] Em determinados aspectos, são fornecidos métodos de uso de uma composição bacteriana que compreende uma cepa de Lacto- coccus imunomoduladora fornecida no presente documento, EVs ge- radas ou isoladas de uma cepa de Lactococcus imunomoduladora for- necida no presente documento e/ou uma PhAB produzida a partir de ou compreendendo uma cepa de Lactococcus imunomoduladora for- necida no presente documento. Em algumas modalidades, a cepa de Lactococcus imunomoduladora é uma cepa de Lactococcus lactis cremoris. Em algumas modalidades, a cepa de Lactococcus imuno- moduladora é a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA-125368). Em algumas modalidades, a cepa de Lactococcus imunomoduladora é uma cepa que compreende pelo me- nos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pe- lo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 99,5% de identidade de sequência, pelo menos 99,6% de identidade de sequência, pelo menos 99,7% de identidade de sequência, pelo menos 99,8% de identidade de sequência, pelo menos 99,9%) com a sequência de nucleotídeos (por exemplo, se- quência de nucleotídeos genômica, de 168 ou de CRISPR) da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA- 125368).
[0062] Mediante os termos do Tratado de Budapeste sobre o Re- conhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para o Propósito de Procedimento de Patente, a Cepa A de Lactococcus lac- tis cremoris foi depositada em 11 de outubro de 2018, com a Coleção de Cultura de Tipo Americano (American Type Culture Collection (ATCC)) de 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110 a 2209 EUA e foi atribuída ao Número de Acesso de ATCC PTA-125368.
[0063] O requerente representa que a ATCC é um depositário que oferece a permanência do depósito e acessibilidade pronta ao mesmo pelo público se uma patente for concedida. Todas as restrições sobre a disponibilidade ao público do material assim depositado serão irre- vogavelmente removidas mediante a concessão de uma patente. O material ficará disponível durante a pendência do pedido de patente a alguém determinado pelo Comissionário a ser intitulado ao mesmo mediante 37 CFR 1.14 e 35 U.S.C. 122. O material depositado será mantido com todos os cuidados necessários para manter o mesmo viável e não contaminado por um período de pelo menos cinco anos após a solicitação mais recente do fornecimento de uma amostra do plasmídeo depositado e, de qualquer forma, por um período de pelo menos trinta (30) anos após a data de depósito ou pela vida executá- vel da patente, o período que for mais longo. O requerente reconhece seu dever de substituir o depósito se o depositário for incapaz de for- necer uma amostra quando solicitado devido à condição do depósito.
[0064] Em algumas modalidades, as bactérias descritas no pre- sente documento são modificadas para aprimorar a colonização e/ou o enxerto no trato gastrointestinal mamífero (por exemplo, metabolismo modificado, como degradação de mucina aprimorada, perfil de compe- tição intensificado, mobilidade aumentada, adesão aumentada às célu- las epiteliais intestinais, quimiotaxia modificada). Em algumas modali- dades, as bactérias descritas no presente documento são modificadas para intensificar seu efeito imunomodulador e/ou terapêutico (por exemplo, sozinhas ou em combinação com outro agente terapêutico). Em algumas modalidades, as bactérias descritas no presente docu- mento são modificadas para intensificar a ativação imune (por exem- plo, através da produção modificada de polissacarídeos, pili, fimbriae, adesinas). Em algumas modalidades, as bactérias descritas no pre- sente documento são modificadas para aprimorar a fabricação bacteri- ana (por exemplo, tolerância ao oxigênio mais alta, tolerância à con- densação de congelamento aprimorada, tempos de geração mais cur- tos).
[0065] A Cepa A Lactococcus lactis cremoris pode ser cultivada de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, Lacto- coccus lactis cremoris pode ser desenvolvido em Meio ATCC 2722, Meio ATCC 1490, ou outro meio que usa métodos revelados, por exemplo, em Caballero et al., 2017. "Cooperating Commensals Resto- re Colonization Resistance to Vancomycin-Resistant Enterococcus fa- ecium" Cell Host & Microbe 21:592—602, que está incorporado a título de referência em sua totalidade.
[0066] Em algumas modalidades, as bactérias Lactococcus imu- nomoduladoras pertencem a uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) que compreende um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais) proteínas listadas na Tabela 1 e/ou um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais) genes que codificam as proteínas listadas na Tabela 1. Em algumas modali- dades, as bactérias imunomoduladoras compreendem todas as proteí- nas listadas na Tabela 1 e/ou todos os genes que codificam as proteí- nas listadas na Tabela 1.
[0067] Em algumas modalidades, as bactérias Lactococcus imu- nomoduladoras pertencem a uma cepa de bactérias de Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) que compre- ende uma ou mais (por exemplo, um, dois ou três) proteínas associa- das à membrana listadas na Tabela 2 e/ou um ou mais (por exemplo, um, dois ou três) genes que codificam proteínas associadas à mem- brana listados na Tabela 2. Em algumas modalidades, as bactérias imunomoduladoras compreendem todas as proteínas listadas na Ta- bela 2 e/ou todos os genes que codificam as proteínas listadas na Ta- bela 2.
[0068] Em algumas modalidades, as bactérias Lactococcus imu- nomoduladoras pertencem a uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) isenta ou substan- cialmente isenta de um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais) proteínas listadas na Tabela 3 e/ou um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4,5,6,7,8,9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, ou mais) genes que codificam as proteínas listadas na Tabela 3. Em algumas modalidades, as bactérias imunomoduladoras são isentas de todas as proteínas listadas na Tabela 2 e/ou todos os genes que codificam as proteínas listadas na Tabela 2.
[0069] Em algumas modalidades, as bactérias Lactococcus imu- nomoduladoras pertencem a uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) isenta ou substan- cialmente isenta de um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17) proteínas de síntese de exopolissacarí-
deo (EPS) listadas na Tabela 4 e/ou um ou mais (por exemplo, 1,2,3, 4, 5,6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17) genes que codificam as proteínas de síntese de EPS listadas na Tabela 4. Em algumas moda- lidades, as bactérias imunomoduladoras são isentas de todas as prote- ínas listadas na Tabela 4 e/ou todos os genes que codificam as proteí- nas listadas na Tabela 4. Em algumas modalidades, as bactérias imu- nomoduladoras são uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) isenta ou substancialmente isenta de um EPS sintetizado totalmente ou em parte por uma proteína listada na Tabela 4. Em algumas modalidades, as bactérias imunomo- duladoras são uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) isenta ou substancialmente isen- ta de EPS.
[0070] Em determinados aspectos, as bactérias da cepa de Lacto- coccus imunomoduladoras descritas no presente documento são subs- tancialmente isentas de exopolissacarídeos.
[0071] Em algumas modalidades, as bactérias Lactococcus imu- nomoduladoras pertencem a uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) que compreende um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais) proteínas listadas na Tabela 6 e/ou um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais) genes que codificam as proteínas listadas na Tabela 6. Em algumas modali- dades, as bactérias imunomoduladoras compreendem todas as proteí- nas listadas na Tabela 6 e/ou todos os genes que codificam as proteí- nas listadas na Tabela 6.
[0072] Em algumas modalidades, as bactérias Lactococcus imu- nomoduladoras pertencem a uma cepa de bactérias Lactococcus (por exemplo, uma cepa de Lactococcus lactis cremoris) isenta ou substan-
cialmente isenta de uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou mais) proteínas listadas na Tabela 5 e/ou um ou mais (por exemplo, 1, 2,3,4,5,6,7 ou mais) genes que codificam proteínas listadas na Ta- bela 5. Em algumas modalidades, as bactérias imunomoduladoras são isentas de todas as proteínas listadas na Tabela 5 e/ou todos os genes que codificam as proteínas listadas na Tabela 5.
Tabela 1: Proteínas da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris Exemplificadoras
IMTQFTTELLNFLAQKQDIDEFFRTSLETAMNDLLQAELSAFLGYEPYDKVGYNSGNSRNGSYSRQF Agrupamento: Transvosase Dara ETKYGTVOLSIPRDRNGNFSPALLPAYGRRDDHLEEMVIKLYQTGVTTREISDIIERMYGHHYSPATI e omento de se oncia de sor baseg: — EENISKATQENVATFHERSLEANYSVLFLDGTYLPLRRGTVSKECIHIALGITPEGOKAVLGYEIAPNEN o 18905 a 1 INASWSTLLDKLQNQGIQQVSLVVTDGFKGLEQIISQAYPLAKQQRCLIHISRNLASKVKRADRAVILE ão IQFKTIYRAENLEMAVQALENFIAEWKPKYRKVMESLENTDNLLTFYQFPYQINWHSIYSTNLIESLNKEI
KRQTKKKVLFPNEEALERYLVTLFEDYNFKQOSQRIHKGFGQCADTLESLFD IMKVTGFPKATYYYWVNCFERVNKDELIEKEMLKIRQEHANAGYRPMSELLKQRGYHVNHKKVORL
IMKKLGLRVTSYWHKSRKYNSYKGKVGTVAKNKLHRRFRTSIPHQKITTDTTEFKYYEDGIQKKCYLN Agrupamento: Transposase del [S1077E A9CB06 — PYIDLENSEVISYHISKQPSYOSIDIALNQALAVTSDCPYRRTFHSDQGWGYQMRDYVSKLKSHRIFQ| ISMSRKGNCHDNSVMENFFGLLKQEIYYGHIFSSFEELEQVIVIWIRYYNTKRIKQKLNWMSPIQFRLN a QNN Ss , to: T 15256 roviss — MTQFTTELLNFLAGKQDIDEFFRTSLETAMNDLLQAELSAFLGYEPYDKVGYNSGNSRNGSYSRAF N 9rupamento: Transposase ETKYGTVOLSIPRDRNGNFSPALLPAYGRRDDHLEEMGYQTLSNRCNDSRNL ? Agrupamento: Proteína não carae IMTKYSFELKLKVVQDYDNGVGGCDYLAKKYHVTNEAIVRRWVKAYKELGAVGIQRKRQNTVYSTQ ds AZRKL1 — |FKLNAVNLYLTSEKSYRELAHELGMNNPPLLTRWVSNYRKKGEFAFSNVOGRPRKESELLEISIKKA
KDVVNETEQELARLONDNLNLRMEVEYLKGLRRLRQEQHKRENPEWSVNSDENSSSHLSNS IMVCELRREFKFPLKQLLAISELSKATYYYWVNRFERPNKDEMIEQVMLEIRQEHTNAGYRPMVELLK| IQRGIYVNHKKVORLMKKLGLRVTTFWHKSRKYNSYKGKVGTVAKNKLHRRENTSIPHQKITTDTTEF] Agrupamento: Transposase SSEVX2 — KYYDKGVOKKLYLTPYLDLFNNEVISYEISKQPTYQAIATALQEALELTSDCLYRRTFHSDQGWAYQ
IMKNYVFKLKSQKIIOSMSRKGNCHDNSVMENFFGLLKQEIYYGHVFNSFEELEQAITKWIHYYNTKRI
KKKLNWMSPIQYRLTYSK | — agrupamento: PIL4 5 IGowJR5 — MMINYQGEVFTETEFYGREILEAIQLTNKFPTPKKVLIDRLEEMIHEQLDLIDKEELNNYIHAKK Agrupamento: Proteína de biossín- ese de dinucleotídeo molibdopte-|TOW7Q8 — MKIIENRERSIQKKFFVNEKENERIKLMMKKTGITNFSVFARRACCNKEIFTLDFSEYKNIISEISATKSE| ina-guanina MobC LKRIGNNINQIAKHLNENKNNQTESLMSDYQNQLESLEEKIQKVVHYISEG
Fator acessório secreção ESAT- IMMLKKEWQAILKHKFFIIVIIALALVPAIYNYIFLGESMWDPSGKLNDLPVAVVNLDKTSELNGKKFKLG 6 Esah 7 7 A2G188 DDVITEMKKSKDLDYHFVSKDKASEGIKKGDY YMVITFPENFSENATTLMNKEPKTVQLDYQTTRGH 7 NYISSKMSESAMNQLKSEVSKNITQTYTKTRIAS IMKKKMRLKVLLASTATALLLLSGCOSNQTDQTVATYSGGKVTESSFYKELKQSPTTKTMLANMLIYR|
ALNHAYGKSVSTKTVNDAYDSYKQQYGENFDAFLSQNGFSRSSFKESLRTNFLSEVALKKLKKVSE Proteína Foldase PrsA POC2B5 SQLKAAWKTYQPKVTVQHILTSDEDTAKQVISDLAAGKDFAMLAKTDSIDTATKDNGGKISFELNNKT] LDATFKDAAYKLKNGDYTQTPVKVTDGYEVIKMINHPAKGTFTSSKKVLTASVYAKWSRDSSIMORV|
ISQVLKNQHVTIKDKDLADALDSYKKLATTN MQRKKKGLSFLLAGTVALGALAVLPVGEIQAKAAISQQTKGSSLANTVTAATAKQAATDTTAATTNQ AIATQLAAKGIDYNKLNKVQQQDIYVDVIVQMSAAPASENGTLRTDYSSTAEIQQETNKVIAAQASVK AAVEQVTQQTAGESYGYVVNGFSTKVRVVDIPKLKQIAGVKTVTLAKVYYPTDAKANSMANVQAVW
SNYKYKGEGTVVSVIDSGIDPTHKDMRLSDDKDVKLTKSDVEKFTDTVKHGRYFNSKVPYGFNYAD NNDTITDDKVDEQHGMHVAGIIGANGTGDDPAKSVVGVAPEAQLLAMKVFTNSDTSATTGSDTLVS ã
AIEDSAKIGADVLNMSLGSDSGNQTLEDPEIAAVONANESGTAAVISAGNSGTSGSATEGVNKDYY N GLQDNEMVGTPGTSRGATTVASAENTDVITOAVTITDGTGLQLGPETIQLSSNDFTGSFDQKKFYVV| -
KDASGNLSKGKVADYTADAKGKIAIVKRGELTFDDKQKYAQAAGAAGLIIVNNDGTATPVTSMALTT FPTFGLSSVTGQKLVDWVTAHPDDSLGVKIALTLVPNQKYTEDKMSDFTSYGPVSNLSFKPDITAP
GGNIWSTONNNGYTNMSGTSMASPFIAGSQALLKQALNNKNNPFYAYYKQLKGTALTDFLKTVEM Proteinase tipo PIII P15292 INTAQPINDINYNNVIVSPRRQGAGLVDVKAAIDALEKNPSTVVAENGYPAVELKDFTSTDKTFKLTFT
NRTTHELTYQMDSNTDTNAVYTSATDPNSGVLYDKKIDGAAIKAGSNITVPAGKTAQIEFTLSLPKSF DQQQFVEGFLNFKGSDGSRLNLPYMGFFGDWNDGKIVDSLNGITYSPAGGNFGTVPLLTNKNTGT QYYGGMVTDADGNQTVDDQAIAFSSDKNALYNDISMKYYLLRNISNVQVDILDGQGNKVTTLSSST NLTKTYYNAHSQQYIYYHAPAWDGTYYDOQRDGNIKTADDGSYTYRISGVPEGGDKRQVFDVPFKL DSKAPTVRHVALSAKTKNGKTQYYLTAEVKDDLSGLDATKSVKTAINEVTNLDATFTDAGTTADGYT KIETPLSDEQAQALGNGDNSAELYLTDNASNATDQDASVQKPGSTSFDLIVNGSGIPDKISSTTTGY EANTAOGGGTYTFSGTYPAAVDGTYTDAQGKKHDLNTTYDAATNSFTASMPVTNADYAAQVDLYAD KAHTQLLKHFDTKVRLTAPTFTDLKFNNGSDQTSEATIKVTGTVSADTKTVNVGDTVAALDAQHHFS DVPVNYGDNTIKVIATDEDGNTTTEQKTITSSYDPDMLKNPVTFDQGVTFGSNEFNATSAKFYDPK GIATITGKVKHPTTTLOVDGKQIPIKDDLTFSFTLDLGTLGQAKPFGVVVGDTTONKTFQEALTFILDA 'APTLSLDSSTDAPVYTNDPNFQITGTATDNAQYLSLSINGSSVASQYADININSGKPGHMAIDQPVK LLEGKNVLTVAVTDSEDNTTTKNITVYYEPKKTLAAPTVTPSTTEPAQTVTLTANAAATGETVQYSAD IGGKTYQDVPAAGVTITANGTFKFKSTDLYGNESPAVDYVVTNIKADDPAQLQAAKQOALTNLIASAKT LSASGKYDDATTTALAAATQOKAQTALDQTNASVDSLTGANRDLQTAINQLAAKLPADKKTSLLNQLQ
SVKDALGTDLGNQTDPSTGKTFTAALDDLVAQAQAGTQTDDQLQATLAKILDEVLAKLAEGIKAATP AEVGNAKDAATGKTWYADIADTLTSGQASADASDKLAHLQALQSLKTKVAAAVEADKTVGKGDDTT|
GTSDKGSGQAGTPAPATGDTGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSADDTTDRNGQHTTGTSD KGGGQGTPAPATGDTGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSADDTTDRNGQHTTGTSDKGGG QGTPAPATGDTGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQHTTGKGALPKTGETTE
RPAFGFLGVIVVILMGVLGLKRKQREE Agrupamento: Proteína não carac- IMRAAEGLFVYNKTNFHYLPQNIAFADFKSGKFATSGMSMILIDSVNHRILDVMKDRGAGQLRAYFNOQ| erizada Ov9Y4 SPSARAAVKTITVDLFTPYRAMIKDLFPNANIVADRFHVVTQAYRELNKVRISVMKQFGSDSKEYR IQLKRFWKLLMKHENALDYMTSKNRINFKHAYLTDKEVIDRLLALSDELRDAYAFYQVIL & lerizada PRIAFKFQNYRIRKQKFL = Agrupamento: Proteína não carac- MIENTINIAYARKFYKTKDYHSFCNLIKGNKGLFGNKTVNQKANISFVKSEGEKHTHIYLDYQETCKVA| erizada OUZT2 HPNFLQLINLLKNYDPEFSEEKLPTFDLNDKIFGEYEIKVIPISKTKIVNTIDDVMNEIAKEIVLKYNQDM
FKVTSKLGEISLTPIQEKFDKLKDI MIIPEKONKQKQVLTLNELEKRKVVEHNALIOSVAKMQKTALKMFELAVSCIDTEEPPKNNTVYLSKS ELFKFFEVSSSSKHSQFKEAVNYMQKQAFFNIKADKKLGIEYESIVPIPYVKWNDYNDEVTIRFDOAI
MPYLIDLKAEFTQYKISELQKLNSKYSIILYRWLSMNYNQYEHYSVKGGRRADQVEAYRTPSIKVKEL Agrupamento: RepB Q9AIQ4
REITDTINEHQHFPHFETRVLKKAIEEINAHTSFNVTYEKVKKGRSIDSIVFHIEKKRMADDNSYKLED KVYQEDKARKAETEKDLVFOAMOQSPYTRLLIENMFLNVYETTDSQIMAGLQKNVYPLYDELKELRGL, NGVKDHLSYVSSKQEAYSKRNVAKYLKKAIEQYLPTVKRQDLNHE
MSEDLKTIKELADELGVSKSYVDKIIRILKLHTKLDKVGNKYVISKKQEKSIITRIENSKSTTETHTESTT Agrupamento: Proteína não cara) H6 |QSHTKVDAEVDFLKEEIAYLKSNHDKQLTNKDKQIETLSNLLDQQQRLALQDKKWLEEYKAEINDLK lerizada ALKMPSEDTKEEQSNYRSLEKEKDFVQTIQESYESEIKVLNQKLAEQEEQIQEIOKEKETKEKKWFQ
FWK
IMAQTFDRKILRALQDNGVREIRAYEVVSKRLTIFQTDRGTFKYSDSLYRLVAPRQELWRNCTTGFIS Agrupamento: RepC 005547
EEKYHEYKK
IMNHFKGKQFKKDVIIVAVGYYLRYNLSYREIQELLYDRGINVCHTTIYRWVQEYSKVLYHLWKKKNR Proteína hivotética IQSFYSWKMDETYIKIKGRWHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFLKRLHKQFGQPRVIVTDK Pp APSIGSAFRKLQOSNGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHRPIKRRNKFYRSLRTASTTIKGMETIRGIYKKN
RRNGTLFGFSVSTEIKVLMGILA
IMKEYFQGDEFKDISKNGKDRKWKERKINNLNLAKIFDSLDYPDSFIFNIKSCAEYLNFKRSSDGSLRL Agrupamento: Proteína de replica FQMYTCKNKQCAICSWRRSMKYQVQISKIVEEAMIRKPKGRFLFLTLTVENVSGEGLNNELSLLSEA ão P i Pisa as2233 — FNRLMKYKKVSKNILGFLRATEVTINESMDTYHPHIHVLLFISPTYFKNKNNYISQDEWTELWKKSAK É LDYRPIVDVRSIKPKNEKTSDIRSAILETAKYPVKPMELNYDSAKVVDDLQKGLYRKRQIAFGGLFKO!
KKELELDDIENGDLINIGDEENPISDGEIISVLWNHERQNYYVR Agrupamento: Proteína não carac-),, — MINYQGEDFTETEFYGREILEAIQLTNKFPTPKKVLIDMLEEMIHEQLDFIDKEELNNYINAKKYVOTLT a erizada IEDEVKNLCFEVKDLYEDVLKEFEIKL o
NM Agrupamento: Proteína não caraio, — MTCSNLTIHLHAKNRSKLFGSKKYALQELEAESTAFVVANHLNIDTKDYSIGYLNSWGFDKISDEQLE = terizada (Fragmento) INVIKNDKLSNNKIKGENE Tabela 2: Proteínas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris associadas à membrana selecionada Fat a ão ESAT IMMLKKEWQAILKHKFFIIVIIALALVPAIYNYIFLGSMWDPSGKLNDLPVAVVNLDKTSELNGKKFKLG Psãa Mo Pearação “loae1i88 — DDVITEMKKSKDLDYHFVSKDKASEGIKKGDYYMVITFPENFSENATTLMNKEPKTVQLDYQTTRGH P— NYISSKMSESAMNQLKSEVSKNITOTYTKTRIAS
IMKKKMRLKVLLASTATALLLLSGCQSNQTDQTVATYSGGKVTESSFYKELKQSPTTKTMLANMLIYR
ALNHAYGKSVSTKTVNDAYDSYKQQYGENFDAFLSQNGFSRSSFKESLRTNFLSEVALKKLKKVSE Proteína Foldase PrsA PocaBs — SQLKAAWKTYQPKVTVQHILTSDEDTAKQVISDLAAGKDFAMLAKTDSIDTATKDNGGKISFELNNKT| LDATFKDAAYKLKNGDYTQTPVKVTDGYEVIKMINHPAKGTFTSSKKVLTASVYAKWSRDSSIMORV|
ISQVLKNQHVTIKDKDLADALDSYKKLATTN Proteinase tivo PI bis29o — MORKKKGLSFLLAGTVALGALAVLPVGEIQAKAAISQQTKGSSLANTVTAATAKQAATDTTAATTNO rolsinasa Jipo. | AIlATQLAAKGIDYNKLNKVQQQDIYVDVIVOMSAAPASENGTLRTDYSSTAEIQQETNKVIAAQASVK
AAVEQVTQQTAGESYGYVVNGFSTKVRVVDIPKLKQIAGVKTVTLAKVYYPTDAKANSMANVQAVW] SNYKYKGEGTVVSVIDSGIDPTHKDMRLSDDKDVKLTKSDVEKFTDTVKHGRYFNSKVPYGFNYAD NNDTITDDKVDEQHGMHVAGIIGANGTGDDPAKSVVGVAPEAQLLAMKVFTNSDTSATTGSDTLVS
AIEDSAKIGADVLNMSLGSDSGNQTLEDPEIAAVONANESGTAAVISAGNSGTSGSATEGVNKDYY GLQDNEMVGTPGTSRGATTVASAENTDVITOAVTITDGTGLQLGPETIQLSSNDFTGSFDQKKFYVV|
KDASGNLSKGKVADYTADAKGKIAIVKRGELTFDDKQKYAQAAGAAGLIIVNNDGTATPVTSMALTT FPTFGLSSVTGQKLVDWVTAHPDDSLGVKIALTLVPNQKYTEDKMSDFTSYGPVSNLSFKPDITAP GGNIWSTONNNGYTNMSGTSMASPFIAGSQALLKQALNNKNNPFYAYYKQLKGTALTDFLKTVEM INTAQPINDINYNNVIVSPRRQGAGLVDVKAAIDALEKNPSTVVAENGYPAVELKDFTSTDKTFKLTFT NRTTHELTYQMDSNTDTNAVYTSATDPNSGVLYDKKIDGAAIKAGSNITVPAGKTAQIEFTLSLPKSF DQQQFVEGFLNFKGSDGSRLNLPYMGFFGDWNDGKIVDSLNGITYSPAGGNFGTVPLLTNKNTGT QYYGGMVTDADGNQTVDDQAIAFSSDKNALYNDISMKYYLLRNISNVQVDILDGQGNKVTTLSSST NLTKTYYNAHSQQYIYYHAPAWDGTYYDOQRDGNIKTADDGSYTYRISGVPEGGDKRQVFDVPFKL A
DSKAPTVRHVALSAKTKNGKTQYYLTAEVKDDLSGLDATKSVKTAINEVTNLDATFTDAGTTADGYT S KIETPLSDEQAQALGNGDNSAELYLTDNASNATDQDASVQKPGSTSFDLIVNGSGIPDKISSTTTGY =
EANTAOGGGTYTFSGTYPAAVDGTYTDAQGKKHDLNTTYDAATNSFTASMPVTNADYAAQVDLYAD KAHTQLLKHFDTKVRLTAPTFTDLKFNNGSDQTSEATIKVTGTVSADTKTVNVGDTVAALDAQHHFS DVPVNYGDNTIKVIATDEDGNTTTEQKTITSSYDPDMLKNPVTFDQGVTFGSNEFNATSAKFYDPK GIATITGKVKHPTTTLOQVDGKQIPIKDDLTFSFTLDLGTLGQKPFGVVVGDTTQONKTFQEALTFILDA 'APTLSLDSSTDAPVYTNDPNFQITGTATDNAQYLSLSINGSSVASQYADININSGKPGHMAIDQPVK LLEGKNVLTVAVTDSEDNTTTKNITVYYEPKKTLAAPTVTPSTTEPAQTVTLTANAAATGETVQYSAD GGKTYQDVPAAGVTITANGTFKFKSTDLYGNESPAVDYVVTNIKADDPAQLQAAKQALTNLIASAKT LSASGKYDDATTTALAAATQKAQTALDQTNASVDSLTGANRDLQTAINQLAAKLPADKKTSLLNQLO SVKDALGTDLGNQTDPSTGKTFTAALDDLVAQAQAGTQTDDQLQATLAKILDEVLAKLAEGIKAATP AEVGNAKDAATGKTWYADIADTLTSGQASADASDKLAHLQALQSLKTKVAAAVEADKTVGKGDDTT GTSDKGSGQGTPAPATGDTGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSADDTTDRNGQHTTGTSD KGGGQGTPAPATGDTGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSADDTTDRNGQHTTGTSDKGGG QGTPAPATGDTGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQHTTGKGALPKTGETTE RPAFGFLGVIVVILMGVLGLKRKQOREE
Tabela 3: Proteínas de Lactococcus lactis cremoris exemplificadoras não encontradas na Cepa A de Lactococcus lac- tis cremoris
MTQFTTELLNFLAQKQDIDEFFRTSLETAMNDLLQAELSAFLGYEPYDKVGYNSGNSR Agrupamento: Transposase rr NGSYSRQFETKYGTVQLSIPRDRNGNFSPALLPAYGRRDDHLEEMVIKLYQTGVTTRE 9UP p ISDIIERMYGHHYSPATISNISKATQENVATFHERSLEANYSVLFLDGTYLPLRRGTVSK
ECIHIAHLALHOKDRRLFLDMKSPQMKTMLLGPPC Agrupamento: Transposase rouscs MQKRYSKEFKETLIVFEYHSGQSVTQLSKEYDVAPATIYKWIDLYSKSNESSVSKADFLE grp : Tansp LKRQLAKVKEERDILKKY MTYNSTLPKVFVYLLTTIETLYOTRVPLEVONRKNVHLATSDCLVIACYLWGVLHFSETL| h to: 7 aoaivonyxa KAKHQLAQSLFPNFLEYYRFVRRCNALLPSIQVIRQALVFKEVEGMSVSIIDSFPIPLCQ a 9rupamento: Transposase PIRNFRSKVLGDYANVGYNATKGQYFYGCKCHALVSESGYVIDYTITPASMADSSMTE Sg EVLNQFGTPTVLGDMGYLG = Agrupamento: Transposase 181077 MISYHISKQPSYQSIDIALNQALAVTSDCPYRRTFHSDQGWGYQMRDYVSKLKSHRIF É P' to) Pp TOUZJO QSMSRKGNCHDNSVMENFFGLLKQEIYYGHIFSSFEELEQVIVIWIRYYNTKRIKQKLN (Fragmento) MSPIQFRLNYONN Agrupamento: Proteína de ligação AsgeEvX7 penicilina 2A MPENKNFSRRSKKETGKKSLKIPKIRPKKQKNLKK
MKVTGFPKATYYYWVNCFERVNKDELIEKEMLKIRQEHANAGYRPMSELLKQRGYHV Agrupamento: Transposase G8P734 NHKKVQPLMKKLGLRVTSYWHKSRKYNSYKGNVGTVAKNKLHRRFRTSIPHQKITTDT| grp: ' p EFKYYEDGIQKKCYLNPYIDLFNSEVISYHISKQPSYQSIDIALNOALAVTSDCPYRRTF
HSDQOGWGYQMRDYVSKLKSHRIF
MAKNKLHRRFENTSIPHQKITTDTTEFKYYDKGVQKKLYLTPYLDLFNNEVISYEISKQPT Agrupamento: Transposase ADA1VvoPU3o VOAIATALQEALELTSDCLYRRTFHSDQGWAYQMKNYVFKLKSQKIIASMSRKGNCHD grp: ' p NSVMENFFGLLKQEIYYGHVFNSFEELEQAITKWIHYYNTKRIKKKLNWMSPIQYRLTY
SK MEHSATQRESQKIWTAIKNWFLVDKVFLISFIIANIAISLGEGVTTRFFNYHVIVTVSGLMLVI IGGFKETGLLQOYLGQTLVKRSTTTRQLVRFTTLLTFFLAVFFTNDLTILTVLPLYLAITKEIK
INRKSVYIGAALIVPACHIGSALLPQGNPHNLYLYSFYKVAAHHGGVPLTNLDFFKGTGA Proteína membrana interna YbiR — |P75788 LWILGLLILMIACQFIDNEPLVIETKVNQFNKVETSIFVVLMLLMAASVFGYVNFYLAGAV 'ALVVLIYRPRLFKGIDYHLLFTFIFFFLIVGNIANIHVLTDFISNTLVGPQASFLGTVIMSQ FISNIAAPILISPFTPHAVSLVLGADIGGIGTIVSSMATLIAYKVIRMNARGETRGFVKYFIIV|
INAGFVLILTLIGLIIVTLVG
MTYNSTLPKVFVYLLTTIDTLYQTRVPLEVONRKNVHLATSDCLVIACYLWGVLHFSET Agrupamento: Transposase IG8PA31 LKAKHQLAQSLFPNFLEYSRFVRRCNALLPSIQVIRQALVFKEVEGMSVSIIDSFPIPLC
QPIRNFRSKVLGDYANVGYNATKGQYFYGCKCHALVTVNQAMS Agrupamento: “Transposase para elemento de sequência de inserçãoAOA1IVOPFP4 MAQSLFPNFLEYYRFVRRCNALLPSIQVIRQALVFKEVEGISVSIIDNFPIPLCQPIRNFR |IS982B SKVLGDYANVGYNATKGQYFYGCKCHALVTVNQAMS & [| horapamento Transposase — AOADEZOIB2 fMARRKFOKAFKNSAVILILEEGYSVKEVSAELEVHANSIVRAA o N MQSYDLLDELDSEDKFRKDIKYSRQLPEMFSTEDINAASENITYAILGELRDRYNGSEP ?
TFSYQELAELGGLWVTRKNGVKSLYNGKRLQKIMYDLNEALKNFSYYQVRETNDDG PKSWKTINIFSVIDFDGTKKEVKLTISNAQISSEQVDAKGHVIDKPLYVYDLINSKDWRT| Agrupamento: Proteína de replicação GOWKP8 KHLQYNRGINNSLPSKYSKRVYRFISEFRSFPKGTKMRIDDFDKKILKILKTQEDSFNT
KEVFDLRKNRKKYLETAVKEISELNTPEGTQIVKNLDYIYHTSGRRIOSIEFTYTPFNADL ISGSNHISMNSRTSSPGTDSPFINEARMVLEYFNYLSKVNFNLDENGIIKHLPNYYDIQFE|
LDDIQLLQPIHKLLESGVAIDELLQOVAEMKAIDWKLDSNQMINNFRPSVVFGNKFSEYR AFLTTYKAQNIHKLVFDSSSDFYVPMNGPWDSK
MTYNSTLPKVFVYLLTTIETLYQTKVPLEVONRKNVHLATSDCLVIACYLWGVLHFSETL Agrupamento: “Transposase para KAKHQLAQSLFPNFLEYSRFVRRCNALLLSIQLIRQALVFKEFEGIDVSIIDSFPIPLCQPI elemento de sequência de inserçãoGOWKP9 RNFRSKVLGDYANIGYNATKGQYFYGCKCHALVSESGYVIDYVISPASIADSTMAEEVL |IS982B SQFGTPIVLGDMGYLGQVLHDRLELKEIELITPVRMNMKKKDITFPNFSKRRKVIERVFS
FLTNLGAERCKSRSSYGFLVKLEMTLLTYSLILKSAKTVNSMTLRYSTGYQVMAE [| herapamento: Proteína não caracter RoROVSDWKS [EIVTDEIKNVVORLLDDDENFSGWYIEKELEIKIGIKVSRMTISNLRNKKTTLGNTRFET
[Ea E TEcorFNCTAENNHE
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IMSNSFGFTDLMNKDEHKRKKTNTKNIPIEEIKENENNNYDLVDIDKLADSIDELGLLQPV Proteína oclusão nuclecid Me 02015 — EVKQRDKYSYELIAGHRRFNAIKKLISENRLPEDYEVLAKKVDEDEDELVTRLKLHETNL roie'ha oclusão Muclaoida - IQTRSLLKMPEEEKIAIIDDYMDILDKAKKQGLQINGKPVKGKTRDLIAERFGISHYTAQKL
IRKAKEQGGEEEGAKISPQKKTAKKPITQLKKIETQLEKLEFEGTEEEQEIKKKLIELLMK Agrupamento: Proteína não caracter, 11, IMSVDRSYSPYEVIRAYHDRGMMKWGAFATGELTEAQNTFEKEKKDDKVIQTLPHHVV ada LHLLNQSFSNQVQIKVKYQSKDKLTEVYGFVSEFINNQVRVKSTDKIYLISIEQINIS R MEQLKLNKYFDYSLEPRRAILFQDVKSNYASIECVORNLNPLTTSLCVMSRADHSKGL 3
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AASQDKEEKDVS Agrupamento: Proteína não caracterion9y, ada IMDKYIRRAYQRMNQMSFGGQALAWFLSIRLSDLVLKK Agrupamento: Proteína de enzima del, 1 pps, MAEAKFEAALIKKLEAEGWTYRKDLSYVSIKVLEGHWREVLNENNAYKLNGKPLSDVE restrição R do tipo | HsdR FGLVIQEVORIKTPYDAQLLLVGAGGVGSIPITRDDGSNLEVWTNVKYLDTK Agrupamento: Transvosase Tnoa — laspova IMIFKLRNRTEIAINKRKPKEPIIFHSDHGSHFKSASFRKLLDEHQLLASYSKPGYPYGNA grp : Tansp Pp TEVFFKYLKHREINRRTYHSIQEVQLSCFEYIEQFYNNYNPHSANNGLTPN
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KNYSMELKENAVQCYLTTDLTYEAVARKFEITNFTLLASWVNHFKIYGEVPISKKRGRR KKLESIASSMTQNPNDSQRIKELEQELRYAQIEVAYLKGLRRLEKNALMNKNQDSSTVS|
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DLWKKKNRQSFYSWKMDETYIKIKGRGHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFL Agrupamento: Transposase AOAIVOPDS7 KRLHNQFGEPKAIVTDKAPSLGSAFRKLQSVGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHRPIKRR
NKFYQSLRTASSTIKGMETLRGIYKKNRRNGTLCSDPQNIDFSNLYFWKGYNKLDTKL REIVERFIMARRKFDKQFKNSAVKLILEEGYSVKEVSQELEVHANSLYRWVQEVEEYG
ESAFPGNGTALADAQHKIKLLEKENRYLQEELELLKKFRVFLKRSK e nussa) | fonema Pita deem FBEBIEE RAE Agrupamento: Proteína de choque frioD2BMP1
HKKINKF , ; ; IMNKGTINWFNADKGYGFIMADDMQDVFAYLLSIQOGNDFKKYDEGQKVTFDIKMTSRG [O Peenenestemestassma foras SR [O esmas semeros fui — poe Por Teor mA TaNRDo Tae aVEcos ni ni PQAVNITKA
Agrupamento: Proteína não caracterido 15 IMARRKFDKQFKNSAVKLILEEGYSVKEVSQELEVHANSLYRWVQEVEEYGESAFPGN ada IGTALADAQHKIKLLEKENRYLQEELELLKKFRVFLKRSK
IMKHHGKIKIKHAVKVLKVSRSGFYEYMHRRPSKQQVEREILSEKIKAVFHEHKGRYGA RITKVLHNTGIMTNTKRVGKLMHLMGLYAKGSRYKYKHYNRKGASLSRPNLINQIFKA 'APNKVWLGDMTYIPTKEGTLYLAVNIDVFSLKIVGWSMSSRMQDKLVRDCFLQACGK EHPQPGLIVHTDAGSAYTSSRYQSTLRQVGAQSSMSRKGNPYENAMMESFYKTLKR
ELINDAHFETRAEATQEIFKYIETYYNTKRMHSGLDYKSPKDFEKYNS Agrupamento: Polimerase de DNAl o noygrkão MLENEYFVFTSTLTTMIRKOAQSIITGLKGHNQNSVTKNTTRLVTGYFPIDLIKGYRPSQ dirigida por DNA KLSEAKQAEQRGQQIIMMTEKQFIDFLAQSFYLLSQGL Agrupamento: Proteína não caracter nn gn ãQ MKLREIIKEIPDDDWLENEQSSINYRSFIGRAPKKYIVGELLDYEALYIGEVKKNKNYONH ada RFLVEDKFIEHSGR Agrupamento: Proteína não caracter 11 nego MKKTIFILHIPFILLLWLCITSPFFIKNSLLNSSFGHIFKGVENISHSGPLATVLLLFVIPLLS R ada LISCLYLAFKKNQSGRKYVIYILMSLFSLVCLSVFSVIMIIGLGNYL S IMNHFKGKQFKKDVIIVAVGYYLRYNLSYREVQELLYDCGINVCHTTIYRWVQEYSKVLY =
DLCKKKNRQSFYSWKMDESYIKIKGRGHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFL KRLHKQFGEPKAIVTDKAPSLGSAFRKLQSVGLYTKTEHRTVNYLNNLIEQDHRPIKRR
NKFYQSLRTASSTIKGMETLRGIYKKNRRNGTLFGFSVSTEIKVLMGITA Agrupamento: Proteína não caracteri ong, MKTQELNLKQFVMLSEKELQEISGCGGGWGSAFAGWLGGIGVNSGATAQQAVVNQLNG ada TDFHAYNHNPYGSGGTPND , to: Proteína nã ter: IMFTLIFSNLTGGINIKAIYKDKTVDVWEISKNNEQPDWVKNAFKENYLSWYDERLKILMN a o o: Froleina não caractenhoavHK7 IGIKPSAKSSLKLGIMGSVAGSLAGGLAGNNIYVMGEIGDYLDITNRKVVSKEKFLKKYS Agrupamento: Proteína não caracteril 16 IMKYFVTFLSPTQNMGILNWQTMILDDYLVDDSYWENTKLELSKEVEWITQSELYKKVK ada RNDGSGNDIILSVPVSAVLETIKSFFILGHS
IMRNTKEKILTATEQLIYKKGYTGTSINDILDETATGKGQFYYYFDSKKEACLAVIDNHVKI Regulador transcricional AcuR I03J6K8 QKHLLNGILSRDESPLANLKEMLDWIYSDHAQKKIYYGCPVGNLVIELSALDEDFRKP
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Agrupamento: Proteína não caracter uk, MKKLDMIVIGPGPAPPTAVIRRKSLCQQLNLKKKSKLLQVDAIRREYTIADVAQKRWQSC ada QTFIDVLRKGILKQLIAELS
MOQNNYTSKGKHLTESERLLIERWHNKEKVSNREIAYRLGKAPQTIHNEIQORGTVQLKY
KTKYSAKIAQESYKTLRTHSKRSTKLNAQLDDQISKAVKNKISLEVIHQELKGVVCLRTL Agrupamento: Transposase AOAOD6EOF2 NWISSGILSVAYHELLYPQYRKPKKQRVTQPKHMLGOSIEERPESVDERSEYGHWEI 9rup: : P DTVLLTKEKGECLLTLTERKTRLEIIRLIPNKTTHSVNQALRGIEFLALSVTSDNGREFAK
LSEALDCPVYYCHAYASHERGTNENHNRMIRRHLPKGTKKTTKQVVAYIENWMNNYP RKMFNFKTPNQMLIES| IMFNNKNTAFVVTDPQVEFLKPKGAGYGLTKDILRKYHTTENLTELFKHAKAKGYKIFISP| Proteí- POoADI7 HYFYDHDQNWKFGGQAQGEQMMLNNKMFHREHQOYQETVKGSGADFVEELKPYLDENTI| ha família isocorismatase YecD ITSPHKIFGPESNDLALQLRKNGIDTVILAGMNANLCVDSHLRELVESGFHVHVAADAT o IGAPGQEAYDAAITNFGFVADRTMSTAKVLEEL o
MKKIDVKNIVVGFGKGGKTLAKFLSGKGESVVVIEQSTLMYGGTCINIGCIPSKFLIVNG N EKGLKFTEASEKKAMLTGNLNLKNYHMIADEATAEVIDGKAKFVSDHEIEVMDAEGEVI ? AQLIGERIFINTGATPVLPPIPGLVDSRNVVTSTELMDLKQLPEHLTIIGSGYIGLEFASMF| Dissulfe- p77212 ASYGSKVTVLDIFDNFLPRDDEDISKLVRSDLESRGIIFKLGVKIDAITDNSVEIINKEGKK to nucletídeo piridina putativo 'SILSDKILVATGRKPNTAGLGLENTNIQLGARGEIVVNDKLETTVQNVWALGDVHGGL
QFTYTSLDDFRIVSNNLYGDGKRSLSDRKNVPTSVFITPALSKVGLNEKDAKAAGIDYR LFKLAATAIPKSAVLNQSKGLLKALVDPETDKILGITIYAEESYETINLVSLAIEVGLPYTLL RDKIYTHPTMTEALNDLFAAKNEVK MELKENAVQCYLTTDLTYEAVARKFEITNFTLLASWVNHFKIYGEVPISKKRGWRKKLE SIASSMTQNPNDSQRIKEPEQELRYAQIEVAYLKGLRRLEKNALMNKNQDSSTVSVKP SNSKKS
MKVTGFPKATYYYWVNCFERVNKDELIEKEMLKIRQEHANAGYRPMSELLKQRGYHV Agrupamento: Transposase G8P734 NHKKVQPLMKKLGLRVTSYWHKSRKYNSYKGNVGTVAKNKLHRRFRTSIPHQKITTDT] 9rup: : P EFKYYEDGIQKKCYLNPYIDLFNSEVISYHISKHPSYQSIDIALNOALAVTSDCPYRRTF
HSDQGWGYQMRDYVSKLKSHRIF
Agrupamento: Transposase I7LSK3 MSHKGNCQDNSVMENFFGLLKQEIYYGHIFSSFEELEQVIVIWIRYYNTKRIKQKLNWM gra Transp SPIQFRLNYQDN MTYNSTLPKVFVYLLTTIETLYQTRVPLEVONRKNVHLATSDCLVIACYLWGVLHFSETL|
KAKHQLAQSLFPNFLEYSRFVRRCNALLPIIQVIRQALVFKEVEGMSVSIIDSFPIPLCQP IRNFRSKVLGDYANVGYNATKGQYFYGCKCHALVSESGYVIDYTITPASMADSSMTEE LSQFGTPTVLGDMGYLGQOSLHDRLELKEIDLMTPVRKNMKQKKILFPNFSKRRKVIER FSFLTNLGAERCKSRSPQGFQLKLEMILLAYSLLLKSAKSLEPETLRYSIGYQVMAK IMIKLVAIDLDGTLLDPNRQITAEVKTAVKKAKAAGVKIVITTGRPLPGVVDILKALELTDQ
ISDYVITYNGGLVOQATGEEFIKETLSSEDWLDLDAAARKIGLPIHAITREGIYTPNHDVG Fosfatase putativa |A5XD45 RYTVQEAQMVKMPLYIRQPEDIAALEIAKVYMMVDEPAALDDGIAYLPFEFFERYNVVKS
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FDASIDSEFGPIYYKGYGSYFFQDEMYTKINPSYNLIELHSTAELLSPNLLIVDFRGKQK N AS = Agrupamento: Proteína não caracterio se, ada MLSAGLLGIDPGHYIEHAFIGLVADKLRSFDLGVKIYESQEKTNPFYDI
MTYTHLTSNELAMIEAY YNNHOQSVAKTAVLLNRSRQTIHKVYQFFKTGHNALDYFNQY
KKNKTRCGRRPIVLSDEQTEYIQKRVVAGWTPDVIVGRAEFSISCSMRTLYRMFKQGV Agrupamento: transposase 1S1062 Ía547803 FEVTHLPMKGKRKANGHKETRGKQSFRRSLRDRGNDYSKFNQEFGHLEGDTIVGKK amília IS30 HKSAVITLVERLSKVIITLAPEGRRAIDIENRLNQWMQSVPKHLFKSMTFDCGKEFSNW
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MNYFKGKQFQKDVIIVAVGYYLRYNLSYREIQELLYDLGINVCHTTIYRWVQEYSKVLY HLWKKKNRPSFYSWKMDETYIKIKGRWHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFL KRLHKQFGQPRVIVTDKAPSIGSAFRKLOSNGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHRPIKRR PT L NKARSIRTASTTIKGMETIRGNKKNRRNGTLFOFSVSTERVIMGILTA — MVTYTDLLPKPTENQQAFILDHGKTEDDGQLKYADDAKSYGWNMRQYGKLKAGAVVL
NRHPGKITKDRKWEIYGGGYVESVSDEDENGNVTAVITHAFTIEPPIKQOGDSFIENFDW Agrupamento: PIL7 11 |IGOWKN9 NTPNKKKRKKPNSWAYFWDQYGMNEISYTDFVGLIENRHLSPIDDTOSLPVEKDLTNA 7 EVEEIEEASSKGFTVLVDEVGPNRPNGTOKRKFTGRHTDWERVNKAKQKTGALGEEI
LDFLIQOKAEKNKTKLPEHVSKTEGDGHGYDIRAFDOQSGNEIHIEVKASKTNFSDGFEM |SANEVASSLEDTPYKIYFVHDLDVTSKVCKIKIYDGPFTEENFMMVPTNYKIFKK oo Ee PRE Ramo IETOIIMENETADRS ada GQEIVQEKLKEKEINKEKTQDIPS uu Remo femea erga IT PT Om on GOSaTon omni co ada N MKLLLIDNYDSFTYLLVQYFEELDCSVTVVNDQDKMSOQKIRISPDFICENYDAITISPGPK o Aminodesoxicorisma- P28819 PKEAVFSRDVVQLYAGKIPMLGICLGQQVIAECFGGNVVLGERPMHGKISVIRHNCQO S to/antranilato sintase GIFKGLPQNLKVARYHSLIVDKLPNDFEIDAQGSEDGVIQAMHQOPKLKLWALQFHPESLV = EYGHEMLNNFLKVV ?
MKEFIIKNTDIWKIFLKYYRSDEEIVFLHSSQATENEHYSILAHKPYKKVSKYKGQVFFN IGEKKKFNFLDAVDLLKNEKVERPKNWPFYPELLGFVSYEQDPAYFAAYDEVLLFDHRT KRLRVVQFEQTDGQYWLTESEEIEVDSEIEFDGQNGIGAVFIDOTRQEYIASIKRLQDY
MKAGDIYVANLTQQFEIWSDQKPIDVFKKTRNQIPAPFSSFLQOYPEWKMTQISSSVERF Aminodesoxicorisma- SIHDGALISKPIKGTIARGEDVVTDRLQKEILSNSIKERTELLMVTDLLRNDIARISQPFS lo sintase componente 1 PO5041 LSVPKFAEIETFSHVHQLVTSIKSRIKEDLTFSEFMTALFPGGSITGTPKKRAMEIIKEVE 7 = = KQPRGIYTGMQAGWLSREMDLDMNIVIRTLVHDGEHYQLGVGGGITFESEAEAEFSEIL
LKAKPFLDILGLKDVPSILFTTGLVKNGELLNLEGHVNRLKKQYHHPDLEEKLRKFAQN TDGVLRVSTDGDSLNPEIRQLTHSNESYRVKLSSINDKPSPLSNFKLSGPDFQKVFR QEVLDVKKEGFQDILFHTDGLVSELSIGNFVAKKGNQYETPAKYALKGTFLDLFAKNHT LIYKDIAISDLKNYDCFYMTNAVRGLVEIKIDGISGSVAKFSKKSILV MNYFKGKQFQKDVIIVAVGYYLRYNLSYREIQELLYDRGINVCHTTIYRWVQEYSKVLY HLWKKKNRQSFYSWKMDETYIKIKGRWHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFL KRLHKQFGQPRVIVTDKAPSIGSAFRKLOSNGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHRPIKRR
NKFYRSLRTASTTIKGMETIRGIYKKNRRNGTLFGFSVSTEIKVLMGILA Agrupamento: Proteína não caracter, IMDNKDIELIQQMENKYDTFMPVLTNLIDSVEKFNSIYNNYIELRNFYGSEKWFEYMEIEK ada IPVKCGVLTEDQLFDMISDHNELLGVLLDLTSKMYKNF
MVQDTLLDSFRAGRRNYTIFQVGKATLLRVSDVMKLKKTDVFNLDGTVKQTAFIHDOK Agrupamento: Integrase Q7BLP2 GKGNTLYLKPVQQDLMLYHAWLIQQNMNSEWLFPSTSRPYRPITEKQFYKIMARVG
DLLGINYLGTHTMRKTGAYRVYTOSNYYWLSYAFIKPFK MNHFKGKQFQQDVIIVAVGYYLRYNLSYREVQELLYDRGINVCHTTIYRWVKEYSKILY HLWKKKNKQSFYSWKMDETYIKIKGRWHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFL KRLHKQFGQPRVIVTDKAPSIGSAFRKLORNGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHRPIKRR
NKFYRSLRTASSTIKGMETIRGIYKKNRRNGTLFGFSVSTEIKILMGIPA IMYNEVFVVSDIHGEYKKFKEILKYWDSNRQQLILLGDLCDRGLOASYECFYLAKYLCDN o Bis(5'-nucleosil)- MF 00199 GAILIKGNHEDLFLKFLNKTEDFKENYIKNGGLKTLESFGYSENNTFKDIVLDIKKNNDK| o tetrafosfatase simétrica 7 LIEFLTYLPNFYEWNDYIFVHAGVNLKINNWKDTSIRDFMWIREDFHFTPNRLNKTIVFG N HTETKILNKNNKYDIWIHDNKIGIDGGAVYGGYLYGVILDVHGIKDYVYV ? Agrupamento: Proteína não caracterimoy aq MINYQGEVFTETEFYGREILEAIQLTNKFPTPKKVLIDMLEEMIHEQLDLIDKEELNNYIN ada AKKYVQTLTEDEVKNLCFEVKDLYEDVLKEFEIKL Agrupamento: Proteína de biossínte- se de dinucleotídeo molibdopterina-TOV569 MKKTGITNFSVFARRACCNKEIFTLDFSEYKNIISEISATKSELKRIGNNINQIAKHLNENK guanina MobC NNQTESLMSDYQNQLESLEEKIQKVVHYISEG MTVIYMPKQOSNGTVHSAKDLKQLIDYVMNSEKTNDFEYVSGQNILDIHSTCDEMLATRTI| Agrupamento: Relaxase Mob DEI JA9FB66 IMANALKNKPQKNERFGYHFVQOSFSPDDHLTPEQVHEIGCKTMKEYLGSSAEFIIATHT
DKPHLHNVRPDRVLSQVV
IMKPTMAILERISKNSQENIDEVFTRLYRYLLRPDIYYVAYQNLYSNKGASTKGILDDTAD Proteí- GFSEEKIKKIIOSLKDGTYYPQPVRRMYIAKKNSKKMRPLGIPTFTDKLIQEAVRIILESIY ha codificada por íntron grupo Il LtPOA3UO EPVFEDVSHGFRPORSCHTALKTIKREFGGARWFVEGDIKGCFDNIDHVTLIGLINLKIK
FA DMKMSQLIYKFLKAGYLENWQYHKTYSGTPQGGILSPLLANIYLHELDKFVLQLKMKFD RESPERITPEYRELHNEIKRISHRLKKLEGEEKAKVLLEYQEKRKRLPTLPCTSQTNKVL KYVRYADDFIISVKGSKEDCQWIKEQLKLFIHNKLKMELSEEKTLITHSSQPARFLGYDI RVRRSGTIKRSGKVKKRTLNGSVELLIPLQDKIRQFIFDKKIAIQOKKDSSWFPVHRKYLIR STDLEIITIY-NSELRGICNYYGLASNFNQLNYFAYLMEYSCLKTIASKHKGTLSKTISMFK
DGSGSWGIPYEIKAGKQRRYFANFSECKSPYQFTDKISQAPVLYGYARNTLENRLKAK CCELCGTSDENTSYEIHHVNKVKNLKGKEKWEMAMIAKQRKTLVVCFHCHRHVIHKHK|
MKEISDNISKEYGCKIIVRPEQKLGNSHKNYLVYLAKNSYRKEIKNKLDFLMNHSHTWE
DFKEKARALNLKVDDTKKYTTYLLEGSEQTKKIRDRSLKNDKFLKENLKERIEKNTIGYS Agrupamento: Proteína PriA de mon TOUZo8 DEVVKLWKDKESIQEKGREKEIEILLEHWQVTKETEKDLVVTIDTAFDNEATIKIPARC tagem de primossoma DKLENGQYKIFIKKGDRFSYLDKKSPANHKIMYGATVAKNLQRQSGNIPLYSDNVNIK
LKQVFHEFDFLISQOGLSFDRSFETIGEELKATYQETQHQLDKLDTKILEYVETTKTLPYE
DTSIRDTIKNLTKERDDLRDTLYKVDKNIQY YQKSEQRLEAYQKNQSPKHKARDDDFEI Agrupamento: Família de proteínas IMSKNVKTIKELADELGTNKTRISRIINKNSIPTQKIKNKIVLEDNSVSLIRQYFKNETVSILR & associadas à replicação RepX, RepB ADAIBIRSI6 [TELDKAHSHIEKLSNLSDAQARLALQADKKLLEEYKAENDSLKALKMPTEGSQAEQANS 2 ' QPKEEVKALKFEIRALQEELNKQKIHSQEEREKLKAELTTPKKWYQFWK N | foeemene memeents nm EIOEORANAEEENANBAMANO
AKQIQELQKRNAQLEEENLILKKASAIFMQONSK
IMKAKKRIGTRAFKIILLRDYGVNISEGRILRLLKSMTLPKMSTIKPRFKSNKSPVFSSDNL Agrupamento: Transposase F9VEW3 LKQEFNPNSPNQVWTTDFTYISIGPKRHVYLCAILDLYSRKCIAWKVSDKIDAQLACDTL EIALNKRKPKEPIIFHSDOGSQFKSASFRKLLDEHQLLASYSKPGYPYDNAVTEVFFKYL]
KQREINRRTYHSIQEVOLSCFEYIEQFYNNYNPHSANNGLTPN
MRQLADALNVSFEYLTDTEILPIYQELSDDNKQQTINYAEDKLKSQKEQENIIHFRNSLIP Agrupamento: Regulador transcericio| ou x p7 KQATEQALSAGLGEGYTDNIETCTVYWDKQVNYDIGIPIKGDSMEPEFHYGQTALIKY hal putativo QSSPDYDGQVCAVDNVSMGNGFIKCVTVEEDGLLLOSLNIEEGONGERKFPDIKLYW
DDNPRIIGKVVAAFTPIEIDFLFKNLEL
MERKKKKKENIWAIIVPILIISLIGAWAYALRDSLIPNDYTKTNSSDQPTKTSVSNGYVEQ Agrupamento: Proteína de biossínte-, 0A218PFY7 KGVEAAVGSIALVDDAGVPEWVKVPSKVNLDKFTDLSTNNITIYRINNPEVLKTVTNRT [se de exopolissacarídeo EpsL DQARMKMSEVIAKYPNALIMNASAFDMQTGQVAGFQINNGKLIQDWSPGTTTQYAFVIN KDGSCKIYDSSTPASTIIKNGGQQAYDFGTAIIRDGKIQPSDGSVDWKIHIFIANDKDNNL| o o e AA SEA AS SOS ioSmiADOSSSAPONDA
K MAQTIQTLALNVRLSCQLLDVPESSYYERINRHPSKTQLRROQYLSLKISQLFNANRGIY
GAPKIHHLLLKQGEKVGLKLVQKLMKQLQLKSVVIKKFKPGYSLSDHINRKNLIQTEPTK proteína hipotética KNKVWSTDITYIPTAQGWAYLSTIMDRYTKKVIAWDLGKRMTVELVORTLNKAIKSQDY|
PEAVILHSDOGSQYTSLEYEELLKYYGMTHSFSRRGYPYHNASLESWHGHLKREWVY
QFKYKNFEEAYQSIFWYIEAFYNSKRIHOSLGYLTPNQFEKVSA MVDAYLDNNLGDDLMIRYFASYFYQHKIYLVESREHIRKTFYDIPNIYFYSEEDYKMNE Y| Agrupamento: Polissacarídeo piruvil, OAOM2ZR43 DFQLHVTIGGSMFILDDFKKLIRFRHRIKNSRKIKKRNIPSAIIGCNLGPFDKRNFGLKLA ransferase CsaB, csaB KFELKYKNLVTVRDKOSKELLLRGFKRKKINIKLFPDIIFSKVLYKSIPKYGLGMTLSQVF
RVTNVEF IMKNKFSIIVPVYNGESHIKKCIDTLLKQTYNDFEINNINDGSTDDTKSVLTKFYAKNLKVKIV & NTSNKGVSFARNLGINOSSGQYLLFVDSDDELSINALKYLSIMLNKKDRDLILFGFSLTG o glicosiltransferase putativa EpsJ p71059 DNNRKNDTSILKSIANQNTDCKMNILKSILSTKNNILGYVWRAVYSLDFIKKNNIFFETHL N = 7 KISEDYLFLLOSVEHSNNLFVITEEFYKYNLGETSMSNKFVPTLLNDMVWVNNWIESNIL]| -
VYPQFFVGFNCLVANTYIRYVONAIRNKEENFMLKYREIKINKRKYNFQRSINQVIFHL DKFDFKSKIGVILFRIHLDIVYELLFNIKERKN IMTNLNRKKFFINFOQSLVFFILIIIYGLTTKNVMGGSGIFSIDSILKYGILFICISVEGYIFLKN GNERRETSENYNNFKYYFIIITFLSLFASFKQVHFSFRTVOQSFIFIFIPMLYSYLILNNWTF
RQINFSMKIALFLSVIEYLFSIRMGFSQIISSLASINYNNTNASALESSTFALLSLGFAAYF Agrupamento: EpsH QA3ZK44 IGYYKKNFLCKIVSLLFVIMTFKRVITLSGCILVILGILKIKNLRVNRFFLIVSTITLVSFSLIYY
SIQPQNILEISEKIGFSIRDFSTNRTDRLAWLSMTDFKSYGLGSTTDFMYKLWGVDLE MDIVQLILEVGAFGVIVFIYFYLRFSKSNLYAFSFMALLLLNSILSSGMMSTFSWIIILIAMS
IMEYKEGM MKKLKISVIIRTYNEVKHIGEVLKSLTDQTYLNHEI!IVDSGSVDGTLDIIERYPVKLVSINK Agrupamento: Transferase 2, associ- AOAOM2ZWO08 EDFNYSYASNVGVONSSGDIVCFLSGHSVPVYKNYLEKINEIFQETEIGACYGEVIALPD| lada a rSAM/selenodomínio GSITEKIFNRIGYLKSKLSLNNKRFFLENKIHPGIFSCSNACARKKLLLKYPFKVELGHGG
EDVEVAYRIIQDGYFVAKSVELLVMHSHGSSLKKFIKEYKAWGKMYEDVLKFIKKNNDK E RIO E
MIFVTVGTHEQPFNRLIQKIDELVRDGQIKDDVFMQIGYSTYEPKYTKWASVIGYNDMT Agrupamento: EpsF QA3ZK46 AYFNKADIVITHGGPSTYMQVLQHGKIPIVVPRQEKFGEHINDHQLRVSKQVIKKGYPLI
LCEDVSALKICIESSRIRTDEFIKSNNKNFISNFKKIIAFEE
MKIALVGSSGGHLTHLYLLKKFWENEDRFWVTFDKTDAKSILKEERFYPCYYPTNRNV Agrupamento: EpsE Q9X491 KNTIKNTILAFKILRKEKPDLIISSGAAVAVPFFWIGKLFGAKTVYIEIFDRIDKPTLTGKLV
PVTDKFIVOWEELKKVYPKAINLGGIF
MEFFEDASSPESEEPKLVELKNFSYRELIIKRAIDILGGLAGSVLFLIAAALLYVPYKMSS ransferase açúcar putativa Epst — |p71062 KKDQGPMFYKQKRYGKNGKIFYILKFRTMIFNAEQYLELNPDVKAAYHANGNKLENDP 7 7 7 RVTKIGSFIRRHSIDELPQFINVLKGDMALVGPRPILLFEAKEYGERLSYLLMCKPGITGY|
TTHGRSKVLFPQRADLELYYLQYHSTKNDIKLLSLTIVOSINGSDAY MIDIHCHILPGIDDGAKTSGDTLTMLKSAIDEGITTITATPHHNPQFNNESPLILKKVKEV o QNIIDEHQLPIEVLPGQEVRIYGDLLKEFSEGKLLTAAGTSSYILIEFPSNHVPAYAKELF o? irosina-proteína fosfatase YwgE — |P96717 NIKLEGLQPILVHPERNSGIIENPDILFDFIEQGVLSQITASSVTGHFGKKIQKLSFKMIE N NHLTHFVASDAHNVTSRAFKMKEAFEIIEDSYGSDVSRMFQNNAESVILNESFYQEKPT] ?
KIKTKKLLGLF IMAKNKRSIDNNRYIITSVYNPOSPISEQYRTIRTTIDFKMADQGIKSFLVTSSEAAAGKST V| irosina-proteína quinase YwqgD Po6s716 SANIAVAFAQQGKKVLLIDGDLRKPTVNITFKVOQNRVGLTNILMHOSSIEDAIQGTRLSE - 7 NLTIITSGPIPPNPSELLASSAMKNLIDSVSDFFDVVLIDTPPLSAVTDAQILSSYVGGVVL
VRAYETKKESLAKTKKMLEQVNANILGVVLHGVDSSDSPSYYYYGVE
MQETQEQTIDLRGIFKIIRKRLSLILFSALIVTILGSIYTFFIASPVYTASTOLVVKLPNSDN Biossínte- Po6s715 SDAYAGQVSGNIQMANTINQVIVSPVILDKVOSNLNLSDDSFQKQVTAANQTNSQVITL se polissacarídeo capsular putativo VKYSNPYIAQKIADETAKIFSSDAAKLLNVTNVNILSKAKAQTTPISPKPKLYLAISVIAG
LVLGLAIALLKELFDNKINKEEDIEALGLTVLGVTSLCSNE
IMMKKGIFVITIVISIALIIGGFYSYNSRINNLSKADKGKEVVKNSSEKNQIDLTYKKYYKNL Agrupamento: Proteína de biossínte- 95), PKSVQNKIDDISSKNKEVTLTCIWQSDSVISEQFQQNLQKYYGNKFWNIKNITYNGETS [se de polissacarídeo EQLLAEKVQNQVLATNPDVVLYEAPLFNDNQNIEATASWTSNEQLITNLASTGAEVIVOQ
PSPPIYGGVVYPVQEEQFKOSLSTKYPYIDYWASYPDKNSDEMKGLFSDDGVYRTLN
FEI EEE gor OA O fonema fon PRESSE SSANHOUTOESCEMPICOMELTÃEO o
PKYLMGIIDEPNDSSAINLFKTLTQEEKKEMFIICQKWLFLEYQIEL
IMSVSIIDSFPIPLCQPIRNFRSKGLGDYANVGYNATKGQYFYGCKCHALVSESGYVIDY broteina hipotética ITPASMADSSMTEEVLSQFGTPTVLGDMGYLGQSLHDRLELKGIDLMTPVRKNMKQK| - KILFPNFSKRRKVIERVFESFLTNLGAERCKSRSPQGFQLKLEMILLAYSLLLKSAKSLEP
ETLRYSIGYQVMAK , I , : IMTIKNKKDLSSSIEQLEKAINQQETILKKFDNEQLDFEQIKKLENLLIQEREKAKQVOQIKIN era eua Io de sinalagaoBaaXZ2 RRSVLONNSENYKERKKRTRQLIQKGALLEKYLEAKHLTVDETEQLLQIFANMINKPELL
NFIGK
IMVQQIVLPIKDSNILKMVQDTLLDSFRAGRRNYTIFQVGKATLLRVSDVMKLKKTDVFN h A : ISDGTVKQTAFIHDQKTGKANTLYLKPVQQDLVVYHDWMVQQNLNSEWLFPSTSRPD & grupamento: Tirosina recombinase /B1N0GO RPITEKQFYKIMARVGDLLSINYLGTHTMRKTGAYRVYTOSNYNIGLVIHLLNHSSEAMT| -
LTYLGLDQASRETMLDQIDFG N Agrupamento: Proteína não caracteri IMDQKEVSQNQTKYIQFRLSEEQYNKLKISGETYGLSPNLYAKKLAQKSHLKKPYLEHD ? ada IG1FES7 QRAKSLLLELSKQGTNLNQIAKKLNQFDRMDNQDKELIEALRYTYGVLAQAQKGYQELW PaLoK
IMATIAKISNGASAASALNYALGQDRPMHEKTEQWLQDHQLERPVELTNCRAVAVGEGT NGIDPFIAKEQFDVVRQLHNQTKESNQVMRITOSFALDELNPKVQKDWQKANDLGVEL
AENLYPNHQSAVYTHLDGKNHVLHNHIIVNKVNLETGKKLREQKGESVORAREMNDR Agrupamento: Proteína de mobiliza 1,15, LASRENWHILEPPKERQTETEKELIAKNEYSYMDDLRERINKSLQDVSVSSYETFKERL ção ISDNGVILSERGQTFSYAFLDANNKQRRARETRLGSDFGKETILHELENRARQNEFSAV
EQREPAITPLERDTQQRESEIVSLEQAIEPRKSEALKRESKINRFIDTIKQFAGRVPELTO RVTRKLKQTKDKILDDFERRFSKDMKNYEQEQQKSLEKQANRDVQSEKKPTKDHDRG
MSR agrupamento: Proteína de mobiliza: IMNKDEQLVVQVLNAYKNGKIDFSNVPELDRLVRQEVNKDFRDYQEKIEAVANQKIESAI ,ão putativa ISGEPU9 IQEQLHRLEAENLKATILKDIQVEKQALLALKKELNEQKEQIKADRKREIVERYGILIANIV (CLFCFLVVGILIGRWIYKGIWDGWGLHILYDTVMEIKPKHPYGAVILGLGGFGLIGAGIYG|
FEL BFRONVTASTWFDORPRIFRRIFARR
IMVLDNKLGLTNSAELAKQEELLTKKRAKELFESGKIEDLEIGTFQGLSDIHQFLFQDIYD Adenosina monofosfato- la7DDR FAGKIREVNIAKGNFQFAPRIFLAQTLEYIDKLPQETFDEIIDKYSDMNVAHPFREGNGR proteina transferase ATRIWLDLILKNKLHKIVDWNQIDKDEYLNAMIRSTVSTNELKYLIQKALTDDLGKEQFFK|
IGIDASYYYEGYYEIKTEDL IMSIITEFEKNQKQVKALNELSKRKVVEHNSLITSIAKMDKTPLKMFELAVSCINTEAPPK DHTVYLSKTELFAFFKVSDNDKHSRFKQAVENMQKQAFFKIQEKKEYGFEFENIVPIPY
KWADYHDEVTIRFSPEIMPYLINLKQNFTQHALSDIAELNSKYSIILYRWLSMNYNQYE Agrupamento: RepB (054680 HYSAKGGRREEQVETYRNPSISIRELREMTDTMKDYPRFOQSLESYIIKNSLKEINEHTSF|
KVTYEKVKKGRSINSIVFHITKKRRADDNSYKLEDKVYQKAKVQKEQKENLLYAEAMQ ISKYTKLLLEHFLLSPYEMTNPATMAGLQRNVYPKYDELKDLMGIDGVKKHLSYIYDKQE
PYSKGNIAKYLKKAIEQYLPTVKRRGL IMSDNLKTIKELADELGVSKTAINKKVTDRERKLWFSKIGNKFVINEDGQKSIKRMFEGLT| & Agrupamento: Proteína de associa-o js, ENQESQTENLEQKPNSQTENFRNNNESNADIKYILDIIEY QKEQIKDLQNTKDEQFKQL N ão à replicação RepX ISNMQNLLDQQQRLALQDKKLLEEYKSENDRLKVLKMPSQETKEEQANIQPQEELETLK| >=
EQTRALNDKIKGQEELNNKSSKKWYQFWK Agrupamento: Peptidase truncada E /Gow.s2 IMFSYIYIILSYNTIKVKEVLKFEYRICTSFNWTSKFAEEMKTCFFNSGFKFKNFKGLDNR grp. op NAKEKSELISEAEVVILAGGHVPTQNIFFQQINLKNMSPVRIF
IMQIAKNYLYNAIYQVFIIIVPLLTIPYLSRILGPSGIGINSYTNSIVOYFVLFGSIGVGLYGN RQIAFVRDNQVKMSKVFYEIFILRLFTICLAYFLFVAFLIINGQYHAYYLSQSIAIVAAAFDI
ISWFFMGIENFKVTVLRNFIVKLLALFSIFLFEVKSYNDLNIYILITVLSTLIGNLTFFPSLHRY ransportador antígeno O putativo fp37746 LVKVNYRELRPIKHLKQSLVMFIPQIAVQIYWVLNKTMLGSLDSVTSSGFFDQSDKIVKL p —antigeno PP LAIATATGTVMLPRVANAFAHREYSKIKEYMYAGFSFVSAISIPMMFGLIAITPKFVPLF
FTSQFSDVIPVLMIESIANFIAWSNAIGNQYLLPTNQNKSYTVSVIIGAIVNLMLNIPLIIYLG VGASIATVISEMSVTVYQLFIIHKQLNLHTLFSDLSKYLIAGLVMFLIVFKISLLTPTSWIFI
LLEITVGIIYVVLLIFLKAEIINKLKFIMHK Agrupamento: Transposase (550546 IMNLFGDSDYLEKLSSKGDPLERLEKVVDFECFRPTLNRIFKYDLKNKSHGGRPPYDLV gra Transp LMLKILILORLYNLSDDAMEYQMIDRISFRRFLKIDDKVPDAKTIWNFRNQLSKSNRGN
LFSAFQEKLESQGMIAHKGQIVDATFIEAPKQRNPKDENELIKANRVPVNWTKNKRA QKDTAARWTIKGNERHYGYKNHIAIDTKSKFVKNYQTTPANVHDSQVIGVLVDPDEITL ADSAYQNKATPKGAELFTFLKNTRSKSLKADDKMFNKIISKIRVRIEHVFGFVENSMHG SSLRSIGFDRAVLNTDLTNLTYNLLRHEQVKRLNLKTWR
MRKYMIYLSSLLVTFILSYATITWLIMPVLTRYQSLARLINHFDYTALTLILLLTLINWLFGIQ Agrupamento: Orf14.9 Q9RCJ9I HLKHFSVIYLYLAFSVYLLLLFMVIFNKTTDFQAISLNPFDFIKADTRTIQEAVLNIIYFIPL
GGLYCINTDFKQFVIISLVTLLGIETIQFIFYLGTFAISDIILNFLGCLIGYYCCWEIKKS
MDETYIKIKGRGHYLYRTIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFLKRLHKQFGEPKAIVTDK proteína hipotética APSLGSAFRKLQOSVGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHRPIKRRNKFYQSLRTASSTIKGM
ETLRGIYKNNRRNGTLFGFSVSTEIKVLMGITA IMKKNVLLSIIVPIYNVEKYIGSLVNSLVKQTNKNFEVIFIDDGSTDESMOQILKEIIAGSEQE
FSLKLLOQVNQGLSSARNIGILNATGEYIFFLDSDDEIEINFVETILTSCYKYSQPDTLIFD Glucosiltransferase putativa EpstH —P71057 SSIDEFGNALDSNYGHGSIYRQKDLCTSEQILTALYKDEIPITAWSFVTKRSVIEKHNLL) 8 7 7 FSVGKKFEDNNFTPKVFYFSKNIGVISLRLYRYRKRSGSIMSNHPEKFFSDDAIFVTYDL N LDFYDQYKIRELGAVVGKLVMTRLAFFPDSKKLYNELNPIIKKVFKDYISIEKRHTKRIKM -
VKMYVFSSYVGYKLYRLVKGKHWK
MNHFKGKQFKKDVIIVAVGYYLRYNLSYREVQELLYDRGINVCHTTIYRWVQEYSKVLY proteína hipotética DLCKKKNRQSFYSWKMDETYIKIKGRWHYLYRAIDADGLTLDIWLQOKKRDTQAAYAFL 7 KRLHKQFGEPKAIVTDKAPSLGSAFRKLQOSVGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHWPIKRR
NKFYQSLRTASSTIKGMETLRGIYKNNRRNGTLFGFSVSTEIKVLMGITA | fevememe merseasaso “isso ENSAIAR o
IEAFYNSKRIHOSLGYLTPNQFEKVSA MNDLEKRKVVEHNSLITSIAKMQKTALKMFELAVSCIDTENPPKDNIIYLSKKELFAFFDV!|
SSASKHTRFKEAIELMQKQAFFQIKEVKDKGYEMTSIVPIPTVKWNSYNDDVMIQFNQF Proteína início replicação Po3856 IMPYLIDLKAEFTQYKISELKELNSKYSIILYRWLSMNYNQYEHYNVKGGRRAEQVENY - - RKPSISVKELREITDTVNEYKEIYDFEKRVLKKSLAEINAHTSFNVNYEKIKKGRSIDSIVF
HIEKKRMADDNSYKLGDKDYQDDKKQKSRNEADLLKQAMESKYTRLLSENFLIGMNDI MDTTTMVGLQKNVYPLYDELKELRGLNGVKDHLSYVSSKREEYSKHNIAKYLKKAIEQ
FEL JuPrvKRaDIENE
IMNDNLKTIKEVADELGVSKKKIENKLSYIKKKGNTLGKVIGGVRYLNKQEIKILNISPETS Agrupamento: Proteína semelhante a, OAOD4CCQ1 KAPETSKVPETSKVPETSKVPETSKVPETSKAPETSEVPETSKVPDKHVFSSSFDLLRE RepX QTAYLLKELEEKNKHIEKLIDNEKSMQNLLDQQQRLALQDKKLLEEYKSEINELKALKM
PQEDMKDDSSIRGEAQEEIVRLKAQLKLSEEERNKAKEKEPVKTESKKWWQLWK Agrupamento: Proteína não caracteri MNFGEVLOTKRKSMGLTQEDLADKLFVSSKTISNWETNKTTPDIDNVIRISQLFDISLNN da Ú IG6FEV8 LLLEGSNMVENIKKKAEINNLKKYSYCTVITDLVFLFIILSSHYGAELPISILIATCIGIGVNIA|
MFYFLNRIKILEDKTKKQQRKEIFITIILCILAFVVTILVSWFKH Agrupamento: Proteína não caracteril. ey, MIDLEEEGFLVLWGISIASSYTETISTLOQSGGSAIFTFLTYAIGLLFFILTVLPTNAVTTKS ada DNGFILFFLRAK
IMNYIKKFFIVLRLAILSQIGVAVYGGAKGFSLENGAHKLSLLAVLILIIFIVGNIYLLMYLGK Agrupamento: Exosortase E/protease,, OAOB8R3X5 KLGFLTLSKDFLTKKNIIYILVGTLIARTAGIGGTLLLNATGVTOTANDETIGQLFTGENPL o sistema VPEID-CTERM, xrtE LILLIGIAAPIMEEIVFRGGIVGYLFKDLPVVGIIVSSVLFGLMHSPTNIISFLIYGLIGLTCAI =
AYFKTRRLEVSIAIHFLNNILPALVLAFGIS N = Agrupamento: Proteína de mobiliza se yR MKKIKNRERIIQOKKFFVNEKEDERIKLMMRKTGITNFSIFARRACCNKEIFSIDFSEYKNII ção SEISATKSELKRIGNNINQIAKHLNENKNNQTKELMSDYQKQLENLEDKIQKVVHYISEG
MAKKQNYIWRNDRNFALDEYEQQQYYYVVESNDIINKARHDLTARELKLMDFVISKIQP
EDTQFNVIKTSMYELTKVLNIKANGKNYGDMAKAIGDLRKKEVLIYDDVHRTVTOTGW Agrupamento: Proteína de replicação /Q093T03 'QSAKYQENGQVEIKLNEDLAPHLLGLKTHYTQHLLIDTTKLKSRYSILLYKLMREADKD])
KGNSIAILOGTPEEFKEWLGAPKDY EYKDLKRNILKKAVEEINLKIDDMDLEILOGRCGR
KVVQVEIHNNWTVORAIEENSEYVESITTHDWLKGDSK Agrupamento: Proteína não caracteri97 11 ada MIYTSGYFIAFLGLIIMLFNFKDLYPKLNIWCRLGFILLCLGLILPMLFGFITGFINNH Agrupamento: Proteína não caracteri 525977 ada IMAREKSDIEYQVVTVRFPKEIYQEYKKILKSEGKIPTYDLRNYIFSVVDEYEKGOR roteína hipotética MNYFKGKQFQKDVIIVAVGYYLRYNLSYREIQELLYDRGINVCHTTIYRWVQEYSKVLY P' np: HLWKKKNRQSFYSWKMDETYIKIKGRWHYLYRAIDVDGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFL
KRLHKQFGQPRVIVKDKAPSIGSAFRKLOSNGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHRPIKRR
NKFYQSLRTASTTIKGMETIRGIYKKNRRNGTLFGFSVSTEIKVLMGILA Agrupamento: Regulador transcricio- AOAOE2UHK8 MAGYNVLDDAKARNLGLDILEVKETEYAVVPVKGSVPDSIHQAWKYLLEEFFPENGYK hal da família AraC HSGLPDFEVYTENDIHDPNYEMELWVPISKQ Agrupamento: Transposase de MIIVAVGYYLRYNLSYREVQDLLYDRGINVCHTTIYRWVQEYGKLLYQNGFYQGTEHR grp " Pp D2BRG5 IKYLNNLIEQDHRPVKRRNKFYRSLRTASPTIKGMEAIRGLYKKTRKEGTLFGFSVCTE IS1216E, família IS6
IKVLLGIPA
IMIKNHWMKKLKYLSLFFLLFAIYWFPDVILAYPEVYLKSLVGYERQVVATWIFLGNMSIS Agrupamento: Proteína UPFO0177 EMo48724 LFLGILICYKLGYYKNTISIFKIKNLLFLLITTIILFVIYFFSYTYYNSHFITPGIAKTQAAFSIQ! abiGi 5'região FPFVQFITIAICAPIFEEAAFRTTIYRFFKNDKIAYIVSCVGFAWMHTGPNPILIVYLPMSI
LTSIYHRRRVLGESILVHGVFNALLPIVIPLLQVITGLYYL Agrupamento: Proteína não caracteri-|, OAOM2ZU19 MKYFVTTLSPSKNMGTMNWOQTMILSDYCVNDSYWEKAKRELSEEVQWVTQSDLYKKI o ada KWNHDSNDDIILSKPVSIILETVKSDFPHANVWVYQ 2
NM Agrupamento: Sequência de sinais do), OAOM2ZU05 - ipo bacteriocina MEIQTNFQIISDEELSEIVGGGYPNNQOSMNDVLHWLNGHNDGNPKQLPKWMCGLG Agrupamento: Proteína não caracteri- AOAOM2ZV61 MTKYIYPNLKDNQKYLLKIIDGILTSNNISSEEKKLFLIAKSNIEKGRNFDPOQISELISSLOY ada LVHSDDVLVFFEEARKIMQINPGTGGSPYGWSNFESK
MAKITLNFOKRLQQHSNHLVILSAILIVLGYLGKYGVNQIWIWNSTMIIASIIGFIPVAIHAY IQAIKVKQISIDLLVSIAVIGALFIGEYEESAIVTFLFAFGGFLEKKTLEKTRSSIKELTNMAP RTALSADGEEMDIDEVEIGDKLLVKTGRQVPVDGRIYQGSGYVNEASITGESREIRKEA IGTKVFAGSILENGTIYVEAEKVGEDTTFGKIIELVEEAQDTKSPAEKFIDRFAKYYTPAVL
IAAITWVFSHNLELAITILVLGCPGALVIGAPVSNVAGIGNGAKRGVLIKGGDVMNTFS ATPase transporte cádmio putativa 060048 HIDTLLFDKTGTLTKGNTEVVVVKNYGASKELIDAVASAENESDHPLATAVVRMIGKFN
PIKFEKTDVVKGQGIIADNLLIGNEKMMVVNHITISPEQKQDITEITDSGASVVLVAADNR LQLIYGIADEIRSGVKESLEELRHEGISRMIMLTGDNETTAKAVAAQLGIDEVRANLMPE EKAEVVKSLKNSGKKIAFIGDGVNDSPSLALANIGIAMGSGTDTAIETSDIVLMRSSFDE LVHAYGLSKRTVANMTOQNIVIAIVVVLFLLASLILGGTGLVPSFVNMGTGMFVHEASILIVI NGMRLIRYREK MQNNYTSKGKHLTESERLLIERWHNKEKVSNREIAYRLGKAPQTIHNEIORGTVQLKY
KTKYSAKIAQESYKTLRTHSKRSTKLNAQLDDQISKAVKNKISLEVIHQELKGVVCLRTL Agrupamento: Transposase AOAOD6EOF2 NWISSGILSVAYHELLYPQYRKPKKQORVTQPKHMLGOQSIEERPESVDERSEYGHWEI
DTVLLTKEKGECLLTLTERKTRLEIIRLIPNKTTHSVNQALRGIEFLALSVTSDNGREFAK
LSEALDCPVYYCHAYASHERGTNENHNRMIRRHLPKGTKKTTKQVVAYIENWMNNYP RKMFNFKTPNQMLIES|
MNHFKGKQFQQDVIIVAVGYYLRYNLSYREVQEILYDRGINVSHTTIYRWVQEYGKLLY Agrupamento: Transposase Po4884 QIWKKKNKKSFYSWKMDETYIKIKGKWHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFLK
RLVKQFDEPKVVVTDKAPSITSAFKKLKEYGFYQGTEHRTIKYLNNLIEQDHRPVKRRN KFYRSLRTASTTIKGMEAIRGLYKKTRKEGTLFGFSVCTEIKVLLGIPA
IMNSRIFQHNTFTTLSIGFYKGTITLKEALTHGKVGIGTLDTANGEVTIIDGIAYHGDSENQ Alfa-acetolactato descarboxilase 081208 RLVEENETMPYVAMVEHQPIVKFTDNSVSNSEDFLSALTKRFPTANTAYTIVMTGQF o = KEVTVSSKPANNTRPYDEIMADQPYFTKENISGTMLGVWAPKHLTDLFGIGFHLHFVS Mm
EDKTFTAHVOQNFITENLAIELGKITQIEQEFPDEDENFDQHLFQ N MNIGYARVSTGLOQNLDLOKDSLKKYNCEKIFTDHMSGSKRERPGLKSAIEFSRPGDTIV = DNA-invertase hin Po3013 RLDRLGRNMEDLINIVNSLNNKGVSFHSLQENITMDKSSSTGQLMFHLFAAFAEFE 7 RNLILERSAAGREAARARGRLGGRPEKFSEQDVKLLKTLVESGTPIKSIADSWGVSRTTI|
IYRYINKF oo Eee Poema e e pane SEVIVOMUNUMEGNAAREA ada IGEVKKYDYFLFNILKVIFSIGALQLFIQORCFF MSKYKHHFSHHEHHCVQLVPLFGLLSESELVQVEQVVNHKIFEKGETVISPFAVPQLA| Proteína regulação fixação P29286 'AHGTLKIYQLSSAGKEQLLRVIEPGGYAGEDALFGVMNDNLYGETLEETQICFLROQO hitrogênio FixK DFKNLLLKYPELSLKLLETTVRRAAEMQYQAQFLMMEDVESRIANYLLQLVKVVDSNS
MIPMKMKDLATFIGTTPETISRKFKILEEKGFIERRGKIIKILDIDSLEDDYA Agrupamento: Proteína de ligação ao) IMMTKLMIDEKYAKELDKAEIDHHKPTAGAMLGHVLSNLFIENIRLTQAGIYAKSPVKCE Y| DNA não específica Dps / Proteína 11 164UM95 LREIAQKEVEYFFKISDLLLDENEIVPSTTEEFLKYHKFITEDPKAKYWTDEDLLESFIVD antioxidante do tipo ferritina de liga- FQAQNMFITRAIKLANKEEKFALAAGVVELYGYNLQVIRNLAGDLGKSVADFHDEDEDN Ição ao ferro/ Ferroxidase DN
Agrupamento: Proteína de ligação ad on n11571/22 MSKVIMRLNELSCPSCMAKIEAAMTTTKGVANAKVLFNASKVKAEFDENVVSADELISK fon de cobre EKLGYPVLSSKVTVV
IMNHFKGKQFQQDVIIVAVGYYLRYNLSYREVQEILYDRGINVSHTTIYRWVQEYGKLLY Agrupamento: Transposase po4ssa IQWKKKNKKSFYSWKMDETYIKIKGKWHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFLK grp: : Transp RLVKQFDEPKVVVTDKAPSITSAFKKLKEYGFYQGTEHRTIKYLNNLIEQDHRPVKRRN
KFYRSLRTASTTIKGMEAIRGLYKKTRKEGTLFGFSVCTEIKVLLGIPA | Proteína hipotética MKMLRVOKPLLFKFSQIQVLOYTKTQDAVYKVNSNTICSVYKLSFTLVQLRL
IMTYIELNPVNNVVLPKHNSSVEDFEISENKTITYDELKIVLEYCHKHNKNQRLTLIIEFLFL trosina recombinase XerC MF 01808 GLRLEELGGLQKSSVDFKKQTIKIKHVIDTKAIGDNSRKLYLPKTFASRREIYVNDRCIE - - - ILKWFFDNSLDDDFVFETTMIGTTVKQSATYLFVRNVCEASLGKQKNRKYNVHMLRHAH
ISLLAELDIPIKATMKRVGHSQESTTLRIYSHVSQKMNDSIMRKLNEI IMNHFKGKQFQQDVIIVAVGYYLRYNLSYREVQEILYDRGINVSHTTIYRWVQEYGKLLY o Agrupamento: Transposase po4ssa IQWKKKNKKSFYSWKMDETYIKIKGKWHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFLK Ss grp: : Transp RLVKQFDEPKVVVTDKAPSITSAFKKLKEYGFYQGTEHRTIKYLNNLIEQDHRPVKRRN =
KFYRSLRTASTTIKGMEAIRGLYKKTRKEGTLFGFSVCTEIKVLLGIPA
IMKQKKREQRSNKWAFLIYQESVPEDYLNLLEELHVPFILSPWHDKDVNRTTGEFKKPH Proteína replicação RepB p13921 KHGVFFFESLKSYSQVSELISDKLNSPEHVEVVMSPKGMYDYFTHAENPEKSPYNIEDI replicação ep ESGAGFELDKFLAENNEDLLNQVYEVMRDSGIKEFADFTDLIAKQFPDLLYFVFSKSYF
FKIYLDSKRYIEIKQKDDEDNHGK : IMEDIFQITIILFFSMLATLLSKKLKIPEVVGQMLIGIILAPSVLGLINGGHTIEVMSEIGVILL | par H(*) antiportador pa625S MFLAGLESDLEVLKKNLKPSILVVLLOSLKIKRALSELOIS
IMNHFKGKQFKKDVIIVAVGYYLRYNLSYREIQELLYDRGINVCHTTIYRWVQEYSKVLY teina hivotéti HLWKKKNRQSFYSWKMDETYIKIKGRWHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFL proteina nipolêfica KRLHKQFGQPRVIVTDKAPSIGSAFRKLOSNGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHRPIKRR
NKFYRSLRTASTTIKGMETIRGIYKKNRRNGTLFGFSVSTEIKVLMGIPA | — — agrupamento: Proteína de mobiliza|l6TH45 IMSEHLNMASIKKKQPNRKERKQISFRVSEPEYLNLERSAKVLNISVPAFVKKKAQGAR ção MobC VAPKINPDDSKEMARQLAALGNNVNQLAKRVNQIEFADKDTQERLSADLRRTLHGLG A auao AA AS ARO TOESSOUSTISSO
MATTHIKRSNGASRLVNYAEKRAVQKDGYNLDIEYAKSELKQVREIYGNKGATQAYAS
RVAFSPKEFDPKNVKDQLKALEIAKEIYSTAYPNQQIAMYVHNDTDSLHVHAVIGAINLL Agrupamento: Domínio Rela-, OA1VOPDY6 GKKMHGNWQEYRERLVKITDKVVEKHGLTVTVPHPRPEKRTMAELKMKARGQVTW ase/Nuclease de mobilização KDKIRQAVDTTMREAHISDFKSFKEKLGELAVNVIERGRDLTYTLTGTDYKSRGAKLGE
DYKKETIFYELDRRNQLOYGTSRARQGRAWLEGRGERLEQEQRARQNLAKRAEDLQ RRTLESTEQSIQPSHORPOKSKERGLGGPSL MVHEIVOYHNDFNTVPLRGFNERERRIVMALLHOQVKNKDVEVVQLDFDTLRGLSGWN
DTLAKSENSNAKFNRYLENLSDKIMTLRGTLRSEDGLQVVKFSLFPTFIIDGKNTMTLKV Agrupamento: Proteína iniciador Ae gA1VOPDZ8 QINPTFKYLTNIFDMFTAFELDDYNRMNTSYGQELYRLLKQYRTSGFYRVKIEDLRHLL replicação SVPESYTNAKMDQKVFSKTTVTDLTNAFPNFKIKQERGTGRGRPIIGYTFTFDKEAPNK
ELDRKKQEQIAQFWKSNDPEPMPNAVAQTEYQNPELRKEKEELEKHNASFGDLLKG Q
FKK NS MKFKKKNYTPQVDEKDCGCAALSMILKTYETEKSLASFLLNQRIKMHKVFEKIITIFFAFF - Agrupamento: Proteína da família LFFISQIPIYYVNYKNKENNLYGISNKISLPFIFIALFVIIAVALGKKRGFYHHSKKTLEFKNI brotease amino terminal CAAX AODAIVOPDX6 MLILVLVTISIILNILINRFIIFHHLGIMNNOQINIDSILSSLSCLGKIFGIALLAPILEESIFRASIY
QIFNNDKVSFLISSLLFAFLHSGYSWVFFTYLPVSLCMTFIYHRRKILTDSILFHSLFNLLV LGLNFLI
MLDILNKARIHKKWFLFSYSIISFCITIIYIVENHTFFKVYNWAKYNSDDSYKNKVDEILKHG Agrupamento: Transportador putativo ADA1IVOPESS5. MFWINGNLTSISSPLLICLFLLGAFFSLTIFFLTWRNLSTRTWTPIISFLGFLIPFIHSDGNFI
NLLILSFILILFGAISSVPSLRYF
MNHFKGKQFKKDVIIVAVGYYLRYNLSYREIQELLYDRGINVCHTTIYRWVQEYSKVLY proteína hipotética HLWKKKNRQSFYSWKMDETYIKIKGRWHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFL 7 KRLHKQFGQPRVIVTDKAPSIGSAFRKLQOSNGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHRPIKRR
NKFYRSLRTASTTIKGMETIRGIYKKNRRNGTLFGFSVSTEIKVLMGIPA o E A a ara
DNTVYLSKRDLFAFFKVSDNDKHSRFKQAVEKMQKQAFFQIKEEAGKGFKFKSIVPIPY
EWTDYNDEVKIEFHREIMPYLINLKKNFTQHALSDIAELNSKYSLILYRWLSMNYNOQYE|
HYSVKGGRRAEQVEAYRNPSIKVKEMRLMTDTVNEYHKYNDWDRYILKNSLKEINAHT SFNVTYDKIKKGRSIDSIVFHIEKKRMADDNSYKLGDKDYQEDKARKAETEDMLTLOAL KSPYTKLLMEHFLLSYLDLTDTKILSGLQAHVYPLYDELKDLRGLNGVKDHLSYVRAKR
EDYSKKNITKYLKKAIEQYLPTVKRQDL Oo meo E mia STE OSS AAA On SOIS om masa Ição à replicação RepX F Agrupamento: Proteína de replicação) IMVKKLLRVLFFNKTSTKKRQQKVFVDDNVNNSVDGNPEGNEEILFLRNLVSELQOSEKK IG9BNK7 DLHKLLDQQQARLALQDKKLLEEYKAENDSLKALKMPTEGSQAEQANSQPKEEVKALK
FEIRTLOEELNKQKIHSQEEREKLKAELTTPKKWYQFWK Agrupamento: Proteína não caracteri- ada AOAOHIRRO4 MNKLKKLQELEAKSDKQAELMGELEARLGLIENKOQ! o Agrupamento: Proteína não caracteri- IMANTETVIWKSVKGFEGQYEVSNTGLVKSFKGKTERIDRFDSNVQEILKRLSYDDCRR on ada I68P721 KR N IMNMKNKTNENFVQIPNKMFMNTNNDEKLVYVKLLOSQMIGYLDKDNRTTMTTVSLLVTI| ?
LLGWSKGQAYSNKKVVKALNGLKDKKYINFESIQDVFTVQINKWNDKEEHIVPVYDWKOS IGVKFSGHTOQIRLSVIDNLLEGKDFTLYAYTEYRKMKTHQYRICYEEWGFVLRMTKDGA FKNVNSSEVIIKVYSNGFDSDTKRRETNSYLTFDSVEDVKEVSLKPTYKAQSSKSVVKEQ EPELVEDDFDNFEEEELSFKAEAKKPLIKEKKITKKQANELKDEINKFFGNTMEDNIFKK
MASDKRITSVEQAMEIQDINKPMSLEMWKVVQDSDNFFVRESGNKKLKNKAWQKKF Agrupamento: Proteína não caracteri- 'SDLKEEIDKAKELAYKTKFTSKYLYNTITEYYVDGGECVISSDKLYDYVHNRRVYSND ada G8P722 EYTYFTPTNMVPHLKFIKVTEKY Agrupamento: Proteína não caracteri- MYFCYSNKQKDFLNQKGIDSLFSARHAKTNKLFYVFYQSEELGQALTEFTEKKAEFFK ada ADAOV8ENS5O |NN
MKDIGNSSNFTEDEELFLLRNKQGKIVGIKDLKQANFQETMKDWKKHLPKPSLLSIIIWV AVALLGGLAWSLIALAQGETINAIWFVIAAVCSYLIGYRFYALYIQORKIMRPNDLRATPSE
SHNDGKEFDPTNRVVLFGHHFASIAGAGPLVGPVLAAQMGYLPGTIWIIFGVIFAGGVQ Proteína inanição carbono A P15078 DMLVLWYSHRRRAKSIGAMAHDEVGRFAGGLTSFIVFIMTMIVLAVLALICVTAMANSA
AVFSIGMTIPIALLMGIYLKYIRPGHVNEISAIGFILLLVAIFGGRWVSESSFAHIFMLSP 'ALVWWVMGYTFIAAIIPAWILLTPRDYLSMFMKIGTIAVLAIAVVGVRPDVTIPALTNFA HNTDGPAFAGSLFPFLFVTIACGALSGFHVMMSSGTTPHLIAKESQTRMIGYGGMLFE SFVAIMALVAAISLNPGIYYSMNTPQASIQKLAASSYQADKSAEYNAAKAIPNVAMMPD IGSKLSIDWEGTTGEKALEQVAKDVGEQSIVSRTGGAPTLAVSMSNILHKVPLIGGTNM
MGFWYHFAIMFEALFILSAVSAATKSTRYLLNDALRGFKKLGRLGDDDWLPSKIITTAVI GVWGALLLMGVSDPNGGIKIMYPLFGISNQLIAAVALAIVCVMVIRKGYLKWVWIPALP)|
LVWDVCVTFAASWOQKIFSNDVNIGYFASYSAAKAQVASGKISGLALTNTOATMRNTMI IQGSLSVIFLLCVAILLVICALKVAKILRTNEVGDKFSSEEVFEESNLFETSSFWPSKLEHK LKSKVNE MNYFKGKQFQKDVIIVAVGYYLRYNLSYREIQELLYDRGINVCHTTIYRWVQEYSKVLY
HLWKKKNRQSFYSWKMDETYIKIKGRWHYLYRAIDVDGLTLDIWLRKKRDTQAAYAFL KRLHKQFGQPRVIVKDKAPSIGSAFRKLQSNGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHRPIKRR 2 proteína hipotética NKFYQSLRTASTTIKGMETIRGIYKKNRRNGTLFGFSVSTEIKVLMGILA Ss MKTLIHEDLRGKIIYLOEEIPFGQGRLIEQLRLPFLSQKLLTIPLIVDLKLAEFIRRQLYYCS = Agrupamento: Proteína de competên- PKWLKLQEKYYORGENLLNLTFERSFIAPLGLNLLEVFDDEIPLHKFTQIKOQNINLYYEN Cia putativa/fator de transcrição IG8PA25 FLINFOQNSFKAVYPPRFYAIMKKQKKDMNE
MAKNRNEIPEKLTWDLTTIYKTDKEWEAELTRIKSELSLVEETDPGHLLDSAESLLTITE KMLSISQQVEKLYVYASMKNDQDTREAKYQEYQSKATALYVKFGEVYAFYEPEFLKIS KEVYNKWLGELQKLKNYDHMFERLFAKKAHILSQKEEKLLAAAGEIFESPSETFEIFDN ADIKLPMVKNESDEMIQLTHGNYSSLMESKNRGVRKAAYKALYSNYEQYQHTYAKTLO) NVKVHNLNAQIRSYDSARQAALANNFVPEKVYDVLMEAIHQHLPLLHRYIELRKKILGI DLKMYDIYTPLSNLDYKFNYEDGVKKAEEVLAIFGKEYKGKVKAAFEQRWIDVEENIG KRSGAYSGGSYDTNAFMLLNWQETLDDLFTLVHETGHSMHSAFTRENQPYVYGNYPI FLAEIASTTNENILTETLLKESKDDKERFALLNHWLDSFRGTVFROSQFAEFEQKIHEAD
AAGEVLTSEYLNSLYGEINEKYYNLAVKENPEIQYEWARIPHFYYNFYVFQYATGFAAA Oligoendopeptidase F, FLAEKVVHGSTEDRQKYLEYLKAGSSAYPLEVIAKAGVDMESTDYLDAAFELFENRLS) plasmídeo P54124 ELEKLVEKGVHL
[ — agrupamento: Proteína ORF4 Po4881 MVETYKRTSNPMMNRPVVKAELVEWMRSSQTQITGELASLASVPVLTRLFPLV Agrupamento: Sequência de inserção) MQKRYSKEFKETLIAFYHSGQSVTQLSKEYDVAPATIYKWIDLYSKSNESSVSKADFLE 18981 048667 LKRQLAKVKEERDILKKVLTIFAEKKK
MKIGYARVSTFEQKLESQIEVLKEAGAEEVFQEKFTGTTVERPQFNLVFKKLKDGDTLI TKLDRLARNTREVLEIVOSLFNRGIKVHILNIGLIDNTPTGQLIFTIFSAFAQFERDLIVTR
QEGKNFAKLHDPSFREGRPQKFTEEQIQFAYELKQQGMTYKMIERKTGISIATQKRR Serine recombinase PinR IPOADIO FIKAKNQAIDKDY
MKEYFQGDEFKDISKNGKDRKWKERKINNLNLAKIFDSLDYPDSFIFNIKSCAEYLNFK RSSDGSLRLFQMYTCKNKQCAICSWRRSMKYQVOQISKIVEEAMIRKPKGRFLFLTLTV ENVSGEGLNNELSLLSEAFNRLMKYKKVSKNILGFLRATEVTINESMDTYHPHIHVLLFI
SPTYFKNKNNYISQDEWTELWKKSAKLDYRPIVDVRSIKPKNEKTSDIRSAILETAKYPV KPMELNYDSAKVVDDLQKGLYRKRQIAFGGLFKQIKKELELDDIENGDLINIGDEENPIS o Agrupamento: Proteína de replicação [052233 DGEIISVLWNHERQNYYVR N Dy Agrupamento: Proteína não caracteri- MTCSNLTIHLHAKNRSKLFGSKKYALQELEAESTAFVVANHLNIDTKDYSIGYLNSWGF = ada (Fragmento) TOVOK1 DKISDEQLENVIKNDKLSNNKIKGENE Agrupamento: Proteína não caracteri- MINYQGEDFTETEFYGREILEAIQLTNKFPTPKKVLIDMLEEMIHEQLDFIDKEELNNYIN ada ITOVLA4 AKKYVOTLTEDEVKNLCFEVKDLYEDVLKEFEIKL Tabela 4: Proteínas de Lactococcus lactis cremoris produtoras de Exopolissacarídeo selecionadas não encontradas na Cepa A de Lactococcus lactis cremoris
MERKKKKKENIWAIIVPILIISLIGAWAYALRDSLIPNDYTKTNSSDQPTKTSVSNGYVEQKG , EAAVGSIALVDDAGVPEWVKVPSKVNLDKFTDLSTNNITIYRINNPEVLKTVTNRTDQRMK Agrupamento: Proteína de biossínte- AOA218PFY7 MSEVIAKYPNALIMNASAFDMQTGQVAGFQINNGKLIQDWSPGTTTOYAFVINKDGSCKIYD| se de exopolissacarídeo EpsL
SSTPASTIIKNGGQQAYDFGTAIIRDGKIQPSDGSVDWKIHIFIANDKDNNLYAILSDTNAGYD INIMKSVSNLKLONMLLLDSGGSSQLSVNGKTIVASQDDRAVPDYIVMK
Agrupamento: Polissacarídeo piruvil IMVDAYLDNNLGDDLMIRYFASYFYQHKIYLVESREHIRKTFYDIPNIYFYSEEDYKMNEYDF ransferase CsaB, csaB AOAOM2ZR43 |QLHVTIGGSMFILDDFKKLIRFRHRIKNSRKIKKRNIPSAI/IGCNLGPFDKRNFGLKLAKFELKY
IKNLVTVRDKQSKELLLRGFKRKKINIKLFPDIIFSKVLYKSIPKYGLGMTLSQVFRVTNVEF IMKNKFSIIVPVYNGESHIKKCIDTLLKQTYNDFEININDGSTDDTKSVLTKFYAKNLKVKIVNTS
NKGVSFARNLGINOSSGQYLLFVDSDDELSINALKYLSIMLNKKDRDLILFGFSLTGDNNRK glicosiltransferase p71059 INDTSILKSIANQNTDCKMNILKSILSTKNNILGYVWRAVYSLDFIKKNNIFFETHLKISEDYLFLL] butativa EpsJ IQSVEHSNNLFVITEEFYKYNLGETSMSNKFVPTLLNDMVWVNNWIESNILTVYPQFFVGFN
ICLVANTYIRYVQNAIRNKEENFMLKYREIKINKRKYNFORSINQVIFHLDKFDFKSKIGVILFRI HLDIVYELLFNIKERKN IMTNLNRKKFFINFOSLVFFILIIYGLTTKNVMGGSGIFSIDSILKYGILFICISVEGYIFLKNGNE IRRETSENYNNFKYYFIINTFLSLFASFKQVHFSFRTVOSFIFIFIPMLYSYLILNNWTFROQINFS &
IMKIALFLSVIEYLFSIRMGFSQIISSLASINYNNTNASALESSTFALLSLGFAAYFGYYKKNFLC N Agrupamento: EpsH QA3ZK44 =
KIVSLLFVIMTFKRVITLSGCILVILGILKIKNLRVNRFFLIVSTITLVSFSLIYYYSIQPONILEISEK IGFSIRDFSTNRTDRLAWLSMTDFKSYGLGSTTDFMYKLWGVDLEMDIVOQLILEVGAFGVIV FIYFYLRFSKSNLYAFSFMALLLLNSILSSGMMSTFSWIIILIAMSTIMEYKEGM
MIFVTVGTHEQPFNRLIQKIDELVRDGOIKDDVFMQIGYSTYEPKYTKWASVIGYNDMTAYF Agrupamento: EpsF 03ZK46 NKADIVITHGGPSTYMQVLQHGKIPIVVPRQEKFGEHINDHQLRVSKQVIKKGYPLILCEDVS
ALKICIESSRIRTDEFIKSNNKNFISNFKKIIAFEE
MKIALVGSSGGHLTHLYLLKKFWENEDRFWVTFDKTDAKSILKEERFYPCYYPTNRNVKNTI Agrupamento: EpsE 09X491 KNTILAFKILRKEKPDLIISSGAAVAVPFFWIGKLFGAKTVYIEIFDRIDKPTLTGKLVYPVTDKF |VOWEELKKVYPKAINLGGIF [eme o Pre ESSES NGURIMENACONLELNPOVGANMANONAENDARVTO butativa Epsl IQGPMFYKQOKRYGKNGKIFYILKFRTMIFNAEQYLELNPDVKAAYHANGNKLENDPRVTKIG
SFIRRHSIDELPQFINVLKGDMALVGPRPILLFEAKEYGERLSYLLMCKPGITGYWTTHGRSK|
LFPQRADLELYYLQYHSTKNDIKLLSLTIVOSINGSDAY
IMAKNKRSIDNNRYIITSVNPOSPISEQYRTIRTTIDFKMADQGIKSFLVTSSEAAAGKSTVSA o , NIAVAFAQQOGKKVLLIDGDLRKPTVNITFKVONRVGLTNILMHOSSIEDAIQGTRLSENLTIITS) irosina-proteína quinase YwgD P96716
IGPIPPNPSELLASSAMKNLIDSVSDFFDVVLIDTPPLSAVTDAQILSSYVGGVVLVVRAYETK KESLAKTKKMLEQVNANILGVVLHGVDSSDSPSYYYYGVE
MQETQEQTIDLRGIFKIIRKRLSLILFSALIVTILGSIYTFFIASPVYYTASTQLVVKLPNSDNSDA Biossínte- Po6715 AGQVSGNIQMANTINQVIVSPVILDKVOSNLNLSDDSFQOKQVTAANQTNSQVITLTVKYSN se polissacarídeo capsular putativo PYIAQKIADETAKIFSSDAAKLLNVTNVNILSKAKAQTTPISPKPKLYLAISVIAGLVLGLAIALLK|
ELFDNKINKEEDIEALGLTVLGVTSLCSNE IMMKKGIFVITIVISIALIIGGFYSYNSRINNLSKADKGKEVVKNSSEKNQIDLTYKKYYKNLPKS 8 'QNKIDDISSKNKEVTLTCIWQSDSVISEQFQQNLQKYYGNKFWNIKNITYNGETSEQLLAE N Agrupamento: Proteína de biossínte- - d fi: id A9QSJ2 KVQNQVLATNPDVVLYEAPLFNDNQNIEATASWTSNEQLITNLASTGAEVIVQPSPPIYGGV se de polissacarídeo p PVQEEQFKQSLSTKYPYIDYWASYPDKNSDEMKGLFSDDGVYRTLNASGNKVWLDYIT
KYFTAN
IMNNLFYHRLKELVESSGKSANQIERELGYPRNSLNNYKLGGEPSGTRLIGLSEYFNVSPKY Agrupamento: EpsR 1006027
LMGIIDEPNDSSAINLFKTLTQEEKKEMFIICOKWLFLEYQIEL MQIAKNYLYNAIYQVFIIIVPLLTIPYLSRILGPSGIGINSYTNSIVOYFVLFGSIGVGLYGNRQIA FVRDNQVKMSKVFYEIFILRLFTICLAYFLFVAFLIINGOYHAYYLSQSIAIVAAAFDISWFFMGI
ENFKVTVLRNFIVKLLALFSIFLFVKSYNDLNIYILITVLSTLIGNLTFFPSLHRYLVKVNYRELR ransportador antígeno O putativo /P37746 PIKHLKQOSLVMFIPQIAVQIYWVLNKTMLGSLDSVTSSGFFDQSDKIVKLVLAIATATGTVMLP|
RVANAFAHREYSKIKEYMYAGFSFVSAISIPMMFGLIAITPKFVPLFFTSQFSDVIPVLMIESIAI IFIAWSNAIGNQYLLPTNQNKSYTVSVIIGAIVNLMLNIPLIIYLGTVGASIATVISEMSVTVYOQLF|
INHKQLNLHTLFSDLSKYLIAGLVMFLIVFKISLLTPTSWIFILLEITVGIIYVVLLIFLKAEIINKLKFI|
MHK IMKKNVLLSIIVPIYNVEKYIGSLVNSLVKQTNKNFEVIFIDDGSTDESMOQILKEIIAGSEQEFSL
KLLQQVNQGLSSARNIGILNATGEYIFFLDSDDEIEINFVETILTSCYKYSQPDTLIFDYSSIDE Glucosiltransferase p71057 FGNALDSNYGHGSIYRQKDLCTSEQILTALYKDEIPITAWSFVTKRSVIEKHNLLFSVGKKFE butativa EpsH IDNNFTPKVFYFSKNIGVISLRLYRYRKRSGSIMSNHPEKFFSDDAIFVTYDLLDFYDQYKIRE
LGAVVGKLVMTRLAFFPDSKKLYNELNPIIKKVFKDYISIEKRHTKRIKMYVKMYVFSSYVGY
KLYRLVKGKHWK Tabela 5 — Proteínas Selecionadas a partir de plasmídeo de 13kb de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris Proteína Foldase Prsà POC2B5 MKKKMRLKVLLASTATALLLLSGCQOSNQOTDQTVATYSGGKVTESSFYKELKQSPTT NS KTMLANMLIYRALNHAYGKSVSTKTVNDAYDSYKQQYGENFDAFLSQNGFSRSSFK =
ESLRTNFLSEVALKKLKKVSESQLKAAWKTYQPKVTVQHILTSDEDTAKQVISDLAA GKDFAMLAKTDSIDTATKDNGGKISFELNNKTLDATFKDAAYKLKNGDYTQTPVKVT DGYEVIKMINHPAKGTFTSSKKVLTASVYAKWSRDSSIMQRVISQVLKNQHVTIKDK
DLADALDSYKKLATTN Proteinase tipo PIII P15292 MQRKKKGLSFLLAGTVALGALAVLPVGEIQAKAAISOQTKGSSLANTVTAATAKQAA
TDTTAATTNQAIATQLAAKGIDYNKLNKVQQQDIYVDVIVOMSAAPASENGTLRTDY SSTAEIQQETNKVIAAQASVKAAVEQVTQQTAGESYGYVVNGFSTKVRVVDIPKLKQ IAGVKTVTLAKVYYPTDAKANSMANVQAVWSNYKYKGEGTVVSVIDSGIDPTHKDM RLSDDKDVKLTKSDVEKFTDTVKHGRYFNSKVPYGFNYADNNDTITDDKVYDEQHGM HVAGIIGANGTGDDPAKSVVGVAPEAQLLAMKVFTNSDTSATTGSDTLVSAIEDSAKI GADVLNMSLGSDSGNQTLEDPEIAAVONANESGTAAVISAGNSGTSGSATEGVNKD YYGLQODNEMVGTPGTSRGATTVASAENTDVITQAVTITDGTGLQLGPETIQLSSNDF TGSFDQKKFYVVKDASGNLSKGKVADYTADAKGKIAIVKRGELTFDDKQKYAQAAG AAGLIIVNNDGTATPVTSMALTTTFPTFGLSSVTGQKLVDWVTAHPDDSLGVKIALTL VPNQKYTEDKMSDFTSYGPVSNLSFKPDITAPGGNIWSTQNNNGYTNMSGTSMAS PFIAGSQALLKQALNNKNNPFYAYYKQLKGTALTDFLKTVEMNTAQPINDINYNNVIV SPRRQGAGLVDVKAAIDALEKNPSTVVAENGYPAVELKDFTSTDKTFKLTFTNRTTH ELTYQMDSNTDTNAVYTSATDPNSGVLYDKKIDGAAIKAGSNITVPAGKTAQIEFTLS LPKSFDQQQFVEGFLNFKGSDGSRLNLPYMGFFGDWNDGKIVDSLNGITYSPAGG NFGTVPLLTNKNTGTQYYGGMVTDADGNQTVDDQAIAFSSDKNALYNDISMKYYLL RNISNVQVDILDGQGNKVTTLSSSTNLTKTYYNAHSQQYIYYHAPAWDGTYYDQORD GNIKTADDGSYTYRISGVPEGGDKRQVFDVPFKLDSKAPTVRHVALSAKTKNGKTQ YYLTAEVKDDLSGLDATKSVKTAINEVTNLDATFTDAGTTADGYTKIETPLSDEQAQA LGNGDNSAELYLTDNASNATDQDASVQKPGSTSFDLIVNGSGIPDKISSTTTGYEAN TQGGGTYTFSGTYPAAVDGTYTDAQGKKHDLNTTYDAATNSFTASMPVTNADYAA
QVDLYADKAHTQLLKHFDTKVRLTAPTFTDLKFNNGSDQTSEATIKVTGTVSADTKT VNVGDTVAALDAQHHFSVDVPVNYGDNTIKVIATDEDGNTTTEQKTITSSYDPDMLK sv NPVTFDQGVTFGSNEFNATSAKFYDPKTGIATITGKVKHPTTTLQVDGKQIPIKDDLT Ss FSFTLDLGTLGQKPFGVVVGDTTQNKTFQEALTFILDAVAPTLSLDSSTDAPVYTND =
PNFQITGTATDNAQYLSLSINGSSVASQYADININSGKPGHMAIDQPVKLLEGKNVLT VAVTDSEDNTTTKNITVYYEPKKTLAAPTVTPSTTEPAQTVTLTANAAATGETVQYSA DGGKTYQDVPAAGVTITANGTFKFKSTDLYGNESPAVDYVVTNIKADDPAQLQAAK QALTNLIASAKTLSASGKYDDATTTALAAATQKAQTALDQTNASVDSLTGANRDLOT AINQLAAKLPADKKTSLLNQLOSVKDALGTDLGNQTDPSTGKTFTAALDDLVAQAQA GTQTDDQLOATLAKILDEVLAKLAEGIKAATPAEVGNAKDAATGKTWYADIADTLTS GQASADASDKLAHLQALQSLKTKVAAAVEADKTVGKGDDTTGTSDKGSGQGTPAP ATGDTGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSADDTTDRNGQHTTGTSDKGGGQ GTPAPATGDTGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSADDTTDRNGQHTTGTSD KGGGQGTPAPATGDTGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQHT
TGKGALPKTGETTERPAFGFLGVIVVILMGVLGLKRKQREE Agrupamento: Proteína não ca- | TOVOYA4 MRAAEGLFVYNKTNFHYLPQNIAFADFKSGKFATSGMSMILIDSVNHRILDVMKDRG racterizada AGQLRAYFNQYSPSARAAVKTITVDLFTPYRAMIKDLFPNANIVADRFHVVTQAYREL
NKVRISVMKQFGSDSKEYRQLKRFWKLLMKHENALDYMTSKNRINFKHAYLTDKEVI
COTIA OIDREASDERDAARATE o Agrupamento: Proteína não ca- | TOUTWS8 MDNDIRILIGLTDLNIDFDAKAEQHFNETNLNGTAPITWNLLLTYATNCEKFGTPMVH racterizada NGIKMVTHKGPRIAFKFQNYRIRKQKFL Agrupamento: Proteína não ca- | TOUZT2 MIENTINIAYARKFYKTKDYHSFCNLIKGNKGLFGNKTVNQKANISFVKSEGEKHTHIY racterizada LDYQETCKVAHPNFLQLINLLKNYDPEFSEEKLPTFDLNDKIFGEYEIKVIPISKTKIVN
TIDDVMNEIAKEIVLKYNQDMFKVTSKLGEISLTPIQEKFDKLKDI Agrupamento: RepB Q9AIQA MIIPEKQNKQKQVLTLNELEKRKVVEHNALIQOSVAKMQKTALKMFELAVSCIDTEEPP
KNNTVYLSKSELFKFFEVSSSSKHSQFKEAVNYMQKQAFFNIKADKKLGIEYESIVPI PYVKWNDYNDEVTIRFDQAIMPYLIDLKAEFTQYKISELQKLNSKYSIILYRWLSMNY NQYEHYSVKGGRRADQVEAYRTPSIKVKELREITDTINEHQHFPHFETRVLKKAIEEI
NAHTSFNVTYEKVKKGRSIDSIVFHIEKKRMADDNSYKLEDKVYQEDKARKAETEKD LVFQAMQSPYTRLLIENMFLNVYETTDSQIMAGLQKNVYPLYDELKELRGLNGVKDH ss LSYVSSKQEAYSKRNVAKYLKKAIEQYLPTVKRQDLNHE ) Agrupamento: Proteína não ca- | Q7BLH6 MSEDLKTIKELADELGVSKSYVDKIIRILKLHTKLDKVGNKYVISKKQEKSIITRIENSKS N racterizada TTETHTESTTOSHTKVDAEVDFLKEEIAYLKSNHDKQLTNKDKQIETLSNLLDQQARL ?
ALQDKKWLEEYKAEINDLKALKMPSEDTKEEQSNYRSLEKEKDFVQTIQESYESEIK
VLNQKLAEQEEQIQEIQKEKETKEKKWFQFWK Agrupamento: RepC 005547 MAQTFDRKILRALQDNGVREIRAYEVVSKRLTIFOTDRGTFKYSDSLYRLVAPRQEL
WRNCTTGFISEEKYHFYKK Agrupamento: Transposase Q2VHJO MNHFKGKQFKKDVIIVAVGY YLRYNLSYREIQELLYDRGINVCHTTIYRWVQEYSKVL
YHLWKKKNRQSFYSWKMDETYIKIKGRWHYLYRAIDADGLTLDIWLRKKRDTQAAY AFLKRLHKQFGQPRVIVTDKAPSIGSAFRKLOSNGLYTKTEHRTVKYLNNLIEQDHR PIKRRNKFYRSLRTASTTIKGMETIRGIYKKNRRNGTLFGFSVSTEIKVLMGILA
Tabela 6 — Proteínas Selecionadas a partir de plasmídeo de 30kb de Cepa B de Lactococcus lactis cremoris Agrupamento: Proteína de biossín-AOA218PFY7 |MERKKKKKENIWAIIVPILINISLIGAWAYALRDSLIPNDYTKTNSSDQPTKTSVSNGYVEQKG ese de exopolissacarídeo EpsL EAAVGSIALVDDAGVPEWVKVPSKVNLDKFTDLSTNNITIYRINNPEVLKTVTNRTDQRMK MSEVIAKYPNALIMNASAFDMQTGQVAGFOINNGKLIQDWSPGTTTQYAFVINKDGSCKIYD]|
SSTPASTIIKNGGQQAYDFGTAIIRDGKIQPSDGSVDWKIHIFIANDKDNNLYAILSDTNAGYD
INIMKSVSNLKLONMLLLDSGGSSQLSVNGKTIVASQDDRAVPDYIVMK Agrupamento: Transposase B delA4vCc87 MAQTIQTLALNVRLSCQLLDVPESSYYERINRHPSKTQLRROYLSLKISQLFNANRGIYGAP 18981 IKIHHLLLKQGEKVGLKLVQKLMKQLQLKSVVIKKFKPGYSLSDHINRKNLIQTEPTKKNKVW STDITYIPTOQGWAYLSTIMDRYTKKVIAWDLGKRMTVELVORTLNKAIKSQDYPEAVILHSD Ss QGSQYTSLEYEELLKYYGMTHSFSRRGYPYHNASLESWHGHLKREWVYQFKYKNFEEAY 8 IQSIFWYIEAFYNSKRIHOSLGYLTPNQFEKVSA 2 Agrupamento: Polissacarídeo piruvilADAOM2ZR43 |MVDAYLDNNLGDDLMIRYFASYFYQHKIYLVESREHIRKTFYDIPNIYFYSEEDYKMNEYDF ransferase CsaB, csaB IQLHVTIGGSMFILDDFKKLIRFRHRIKNSRKIKKRNIPSAIIGCNLGPFDKRNFGLKLAKFELKY
IKNLVTVRDKQSKELLLRGFKRKKINIKLFPDIIFSKVLYKSIPKYGLGMTLSQVFRVTNVEF glicosiltransferase . P71059 IMKNKFSIIVPVYNGESHIKKCIDTLLKQTYNDFEININDGSTDDTKSVLTKFYAKNLKVKIVNTS butativa EpsJ NKGVSFARNLGINOSSGQYLLFVDSDDELSINALKYLSIMLNKKDRDLILFGFSLTGDNNRK INDTSILKSIANQNTDCKMNILKSILSTKNNILGYVWRAVYSLDFIKKNNIFFETHLKISEDYLFLL]
IQSVEHSNNLFVITEEFYKYNLGETSMSNKFVPTLLNDMVWVNNWIESNILTVYPQFFVGFN
ICLVANTYIRYVQNAIRNKEENFMLKYREIKINKRKYNFORSINQVIFHLDKFDFKSKIGVILFRI |HLDIVYELLFNIKERKN Agrupamento: EpsH 03ZK44 IMTNLNRKKFFINFOSLVFFILIIYGLTTKNVMGGSGIFSIDSILKYGILFICISVEGYIFLKNGNE oo eee e PP RES ecrimLsuraSnOVrSFRTVOSPFRPILYSVULNNVTFRONES
IMKIALFLSVIEYLFSIRMGFSQIISSLASINYNNTNASALESSTFALLSLGFAAYFGYYKKNFLC KIVSLLFVIMTFKRVITLSGCILVILGILKIKNLRVNRFFLIVSTITLVSFSLIYYYSIQPONILEISEK
IGFSIRDFSTNRTDRLAWLSMTDFKSYGLGSTTDFMYKLWGVDLEMDIVOQLILEVGAFGVIV |IFIYFYLRFSKSNLYAFSFMALLLLNSILSSGMMSTFSWIIILIAMSTIMEYKEGM Agrupamento: Transferase 2, asso-AOAOM2ZWO8 |MKKLKISVIIRTYNEVKHIGEVLKSLTDQTYLNHENIIIVDSGSVDGTLDIIERYPVKLVSINKEDF iada a rSAM/selenodomínio INYSYASNVGVONSSGDIVCFLSGHSVPVYKNYLEKINEIFOETEIGACYGEVIALPDGSITEKI
IFNRIGYLKSKLSLNNKRFFLENKIHPGIFSCSNACARKKLLLKYPFKVELGHGGEDVEVAYRII
IQDGYFVAKSVELLVMHSHGSSLKKFIKEYKAWGKMYEDVLKFIKKNNDKSQ Agrupamento: EpsF 03ZK46 MIFVTVGTHEQPFNRLIQKIDELVRDGOIKDDVFMQIGYSTYEPKYTKWASVIGYNDMTAYF
NKADIVITHGGPSTYMQVLQHGKIPIVVPRQEKFGEHINDHQLRVSKQVIKKGYPLILCEDVS
ALKICIESSRIRTDEFIKSNNKNFISNFKKIIAFEE R Agrupamento: EpsE 09X491 MKIALVGSSGGHLTHLYLLKKFWENEDRFWVTFDKTDAKSILKEERFYPCYYPTNRNVKNTI N KNTILAFKILRKEKPDLIISSGAAVAVPFFWIGKLFGAKTVYIEIFDRIDKPTLTGKLVYPVTDKF ? |VOWEELKKVYPKAINLGGIF ransferase açúcar P71062 MEFFEDASSPESEEPKLVELKNFSYRELIIKRAIDILGGLAGSVLFLIAMALLYVPYKMSSKKD butativa Epsl IQGPMFYKQOKRYGKNGKIFYILKFRTMIFNAEQYLELNPDVKAAYHANGNKLENDPRVTKIG SFIRRHSIDELPQFINVLKGDMALVGPRPILLFEAKEYGERLSYLLMCKPGITGYWTTHGRSK|
LFPQRADLELYYLOYHSTKNDIKLLSLTIVOSINGSDAY irosina-proteína fosfatase YwagE |P96717 MIDIHCHILPGIDDGAKTSGDTLTMLKSAIDEGITTITATPHHNPQFNNESPLILKKVKEVOQNIID|
EHQLPIEVLPGQEVRIYGDLLKEFSEGKLLTAAGTSSYILIEFPSNHVPAYAKELFYNIKLEGL IQPILVHPERNSGIIENPDILFDFIEQGVLSQITASSVTGHFGKKIQKLSFKMIENHLTHFVASDA|
HNVTSRAFKMKEAFEIIEDSYGSDVSRMFOQNNAESVILNESFYQEKPTKIKTKKLLGLF | [rosina-proteina quinase YwaD —Pa6szI6 — MAKNKRSIDNNRYIITSVNPOSPISEQYRTIRTTIDFKMADOGIKSFLVTSSEAMAGKSTVSA
NIAVAFAQQGKKVLLIDGDLRKPTVNITFKVONRVGLTNILMHOSSIEDAIAGTRLSENLTIITS) IGPIPPNPSELLASSAMKNLIDSVSDFFDVVLIDTPPLSAVTDAQILSSYVGGVVLVVRAYETK
KESLAKTKKMLEQVNANILGVVLHGVDSSDSPSYYYYGVE Biossíntese . Pa6715 MQETQEQTIDLRGIFKIIRKRLSLILFSALIVTILGSIYTFFIASPVYTASTQLVVKLPNSDNSDA bolissacarídeo - 'AGQVSGNIQMANTINQVIVSPVILDKVOSNLNLSDDSFQKQVTAANQTNSQVITLTVKYSN apsular putativo PYIAQKIADETAKIFSSDAAKLLNVTNVNILSKAKAQTTPISPKPKLYLAISVIAGLVLGLAIALLK|
IELFDNKINKEEDIEALGLTVLGVTSLCSNE Agrupamento: Proteína de blossín-A9QSJ2 IMMKKGIFVITIVISIALIIGGFYSYNSRINNLSKADKGKEVVKNSSEKNQIDLTYKKYYKNLPKS ese de polissacarídeo 'QNKIDDISSKNKEVTLTCIWOSDSVISEQFQQNLAKYYGNKFWNIKNITYNGETSEQLLAE
KVONQVLATNPDVVLYEAPLFNDNQNIEATASWTSNEQLITNLASTGAEVIVOPSPPIYGGV PVQEEQFKOSLSTKYPYIDYWASYPDKNSDEMKGLFSDDGVYRTLNASGNKVWLDYIT a
KYFTAN N Agrupamento: EpsR (006027 IMNNLFYAHRLKELVESSGKSANQIERELGYPRNSLNNYKLGGEPSGTRLIGLSEYFNVSPKY ? uu eee Er ER ssamnauToEsevFICaNmUnEVOEL Agrupamento: Transposase À Ia2VAJS IMSVSIIDSFPIPLCQPIRNFRSKGLGDYANVGYNATKGQYFYGCKCHALVSESGYVIDYTITP
ASMADSSMTEEVLSQFGTPTVLGDMGYLGQSLHDRLELKGIDLMTPVRKNMKQKKILFPNF ISKRRKVIERVFSFLTNLGAERCKSRSPQGFQLKLEMILLAYSLLLKSAKSLEPETLRYSIGYQ
MAK Agrupamento: Transdução de sinalADAOBSQAXZ2 |MTIKNKKDLSSSIEQLEKAINQQETILKKFDNEQLDFEQIKKLENLUIQEREKAKQVOIKINRSV | mea o [oNsenviERGGRTROLOKGAL EVEN IVOETEQU OF ANMINPELVIRO Agrupamento: Tirosina recombinase B1NOGO IMVOAIVLPIKDSNILKMVQDTLLDSFRAGRRNYTIFOVGKATLLRVSDVMKLKKTDVFNSDG
VKQTAFIHDAKTGKANTLYLKPVQQDLVVYHDWMVQQNLNSEWLFPSTSRPDRPITEKQ |FYKIMARVGDLLSINYLGTHTMRKTGAYRVYTQSNYNIGLVIHLLNHSSEAMTLTYLGLDOA
Agrupamento: Proteína não caracte-G1FE57 MDQKEVSQNQTKYIQFRLSEEQYNKLKISGETYGLSPNLYAKKLAQKSHLKKPYLEHDQAK o a E a EE E anna NaFDRVDNODKELEA RYIVOVLAGAOKSYAELVAALOK Agrupamento: Proteína de mobiliza-H2A9L4 IMATIAKISNGASAASALNYALGQDRPMHEKTEQWLQDHQLERPVELTNCRAVAVGGTNGI ão DPFIAKEQFDVVRQLHNQTKESNQVMRITOSFALDELNPKVQKDWQKANDLGVELAENLY PNHOSAVYTHLDGKNHVLHNHIIVNKVNLETGKKLREQKGESVORAREMNDRLASRENVH|
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ERRFSKDMKNYEQEQQKSLEKQANRDVOSEKKPTKDHDRGMSR Agrupamento: Proteína de mobiliza-S6EPU9 IMNKDEQLVVQVLNAYKNGKIDFSNVPELDRLVRQEVNKDFRDYQEKIEAVANQKIESAIQE s ão putativa IQLHRLEAENLKATILKDIQVEKQALLALKKELNEQKEQIKADRKREIVERYGILIANIVCLFCFL N 'GILIGRWIYKGIWDGWGLHILYDTVMEIKPKHPYGAVILGLGGFGLIGAGIYGSFRLMYTA ?
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EMTNPATMAGLQORNVYPKYDELKDLMGIDGVKKHLSYIYDKQEPYSKGNIAKYLKKAIEQ Agrupamento: Proteína de associa--GOWJS1 IMSDNLKTIKELADELGVSKTAINKKVTDRERKLWFSKIGNKFVINEDGQKSIKRMFEGLTEN ão à replicação RepX IQESQTENLEQKPNSQTENFRNNNESNADIKYILDIIEY QKEQIKDLONTKDEQFKQLSNMON
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Produção de EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladora
[0073] Em certos aspectos, as EVs de cepa de Lactococcus imu- nomoduladoras descritas no presente documento podem ser prepara- das com o uso de qualquer método conhecido na técnica.
[0074] Em algumas modalidades, as EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladoras são preparadas sem uma etapa de purificação de EV. Por exemplo, em algumas modalidades, as bactérias da cepa de Lactococcus imunomoduladoras que compreendem as EVs descritas no presente documento são exterminadas com o uso de um método que deixa as EVs bacterianas de cepa de Lactococcus imunomodula- doras intactas, e os componentes bacterianos resultantes, incluindo as EVs, são usados nos métodos e composições descritos no presente documento. Em algumas modalidades, as bactérias da cepa de Lacto- coccus imunomoduladoras são exterminadas com o uso de um antibió- tico (por exemplo, com o uso de um antibiótico descrito no presente documento). Em algumas modalidades, as bactérias de cepa de Lac- tococcus imunomoduladoras são exterminadas com o uso de irradia- ção UV.
[0075] Em algumas modalidades, as EV descritas no presente documento são purificadas a partir de um ou mais outros componentes bacterianos. Métodos para purificar EV provenientes de bactérias são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, as EV são prepara- das a partir de culturas bacterianas com o uso dos métodos descritos em S. Bin Park, et al. PLoS ONE. 6(3):e17629 (2011) ou G. Norheim, et al. PLOS ONE. 10(9): e0134353 (2015), cada um dos quais é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Em algumas mo- dalidades, as bactérias são cultivadas em alta densidade óptica e, en- tão, centrifugadas para aglomerar as bactérias (por exemplo, a 10.000 x g por 30 min a 4 ºC). Em algumas modalidades, os sobrenadantes de cultura são, então, passados através do filtro para excluir as células bacterianas intactas (por exemplo, um filtro de 022 um). Em algumas modalidades, os sobrenadantes filtrados são centrifugados para aglo- merar as EV bacterianas (por exemplo, a 100.000 a 150.000 x g por 1 a 3 horas a 4 ºC). Em algumas modalidades, as EV são, ainda, purifi- cadas ressuspendendo-se os aglomerados de EV resultantes (por exemplo, em PBS) e aplicando-se as EV ressuspensas ao gradiente de sacarose (por exemplo, um gradiente de sacarose descontínuo a 30 a 60%), seguido por centrifugação (por exemplo, a 200.000 x g por horas a 4 ºC). As bandas de EV podem ser coletadas, lavadas (por exemplo, com PBS) e centrifugada para aglomerar as EV (por exem- plo, a 150.000 x g por 3 horas a 4 ºC). As EV purificadas podem ser armazenadas, por exemplo, a -80 ºC até o uso. Em algumas modali- dades, as EV são, ainda, purificadas por tratamento com DNase e/ou proteinase K.
[0076] Por exemplo, em algumas modalidades, culturas de bacté- rias de cepa de Lactococcus imunomoduladoras reveladas no presen- te documento podem ser centrifugadas a 11.000 x g por 20 a 40 min a 4 ºC para peletizar as bactérias. Os sobrenadantes de cultura podem ser passados através de um filtro de 0,22 um para excluir células bac- terianas intactas. Os sobrenadantes filtrados podem, então, ser con- centrados com o uso dos métodos podem incluir, porém sem limitação, precipitação com sulfato de amônio, ultracentrifugação ou filtração. Por exemplo, para precipitação com sulfato de amônio, sulfato de amônio 1,5 a 3 M pode ser adicionado ao sobrenadante filtrado lentamente, com agitação a 4 ºC. As precipitações pode ser incubadas a 4 ºC por 8 a 48 horas e, então, centrifugadas a 11.000 x g por 20 a 40 min a 4 ºC. Os péletes resultantes contêm EVs de cepa de Lactococcus imuno- moduladoras e outros resíduos. Com o uso da ultracentrifugação, os sobrenadantes filtrados podem ser centrifugados a 100.000 a 200.000 x g por 1 a 16 horas a 4 ºC. O pélete dessa centrifugação contém EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladoras e outros detritos. Em al- gumas modalidades, com o uso de uma técnica de filtração, tal como através do uso de um filtro rotatório Amicon Ultra ou por filtração de fluxo tangencial, os sobrenadantes podem ser filtrados de modo a reter espécies de peso molecular > 50 ou 100 kDa.
[0077] Alternativamente, EVs podem ser obtidas a partir de cultu- ras de bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladoras continu- amente durante o crescimento ou em pontos de tempo selecionados durante o crescimento, conectando-se um biorreator a um sistema de fluxo tangencial alternado (ATF) (por exemplo, XCell ATF junto à Re- pligen). O sistema ATF retém as células intactas (>0,22 um) no biorre- ator e permite que os componentes menores (por exemplo, EV, proteí- nas livres) passem através de um filtro para coleta. Por exemplo, o sis- tema pode ser configurado de modo que o filtrado <0,22 um seja, en- tão, passado através de um segundo filtro de 100 kDa, permitindo que espécies, tais como EV entre 0,22 um e 100 kDa, sejam coletadas e espécies menores que 100 kDa sejam bombeadas de volta para o biorreator. Alternativamente, o sistema pode ser configurado para permitir que o meio no biorreator seja reabastecido e/ou modificado durante o desenvolvimento da cultura. As EV coletadas por esse mé- todo podem ser, ainda, purificadas e/ou concentradas por ultracentri- fugação ou filtração conforme descrito acima para sobrenadantes fil- trados.
[0078] As EV obtidas por métodos fornecidos no presente docu- mento podem ser, ainda, purificadas por cromatografia em coluna com base em tamanho, cromatografia de afinidade e por ultracentrifugação em gradiente, com o uso dos métodos que podem incluir, porém sem limitação, uso de um gradiente de sacarose ou gradiente Optiprep. Brevemente, com o uso de um método com gradiente de sacarose, se a precipitação com sulfato de amônio ou a ultracentrifugação foram usadas para concentrar os sobrenadantes filtrados, os aglomerados são ressuspensos em sacarose a 60%, Tris 30 mM, pH 8,0. Se filtra- ção foi usada para concentrar o sobrenadante filtrado, o concentrado é trocado de tampão para sacarose a 60%, Tris 30 mM, pH 8,0, com o uso de uma coluna Amicon Ultra. Amostras são aplicadas a um gradi- ente de sacarose descontínuo a 35 a 60% e centrifugadas a 200.000 x g por 3 a 24 horas a 4 “ºC. Brevemente, com o uso de um método com gradiente Optiprep, se a precipitação com sulfato de amônio ou ultra- centrifugação for usada para concentrar os sobrenadantes filtrados, os aglomerados são ressuspensos em Optiprep a 35% em PBS. Em al- gumas modalidades, se filtração for usada para concentrar o sobrena- dante filtrado, o concentrado é diluído com o uso de Optiprep a 60% até uma concentração final de Optiprep a 35%. Amostras são aplica- das a um gradiente de sacarose descontínuo a 35 a 60% e centrifuga- das a 200.000 x g por 3 a 24 horas a 4 ºC.
[0079] Em algumas modalidades, para confirmar a esterilidade e o isolamento das preparações de EV, as EV são diluídas em série em meio de ágar usado para cultura de rotina das bactérias a serem tes- tadas e incubadas com o uso de condições de rotina. Preparações não estéreis são passadas através de um filtro de 0,22 um para excluir as células intactas. Para aumentar ainda mais a pureza, EV isoladas po- dem ser tratadas com DNase ou proteinase K.
[0080] Em algumas modalidades, para a preparação de EV usa- das para injeções in vivo, as EV purificadas são processadas conforme descrito anteriormente (G. Norheim, et al. PLoS ONE. 10(9): e0134353 (2015)). Brevemente, após a centrifugação em gradiente de sacarose, bandas que contêm EV são ressuspensas até uma concentração final de 50 ug/ml em uma solução que contém sacarose a 3% ou outra so- lução adequada para injeção in vivo conhecida pelo versado na técni- ca. Essa solução também pode conter adjuvante, por exemplo, hidró-
xido de alumínio, a uma concentração de O a 0,5% (p/v).
[0081] Em certas modalidades, para tornar as amostras compatí- veis com testes adicionais (por exemplo, para remover a sacarose an- tes do imageamento TEM ou ensaios in vitro), as amostras são troca- das de tampão para PBS ou Tris 30 mM, pH 8,0 com o uso de filtração (por exemplo, colunas Amicon Ultra), diálise, ou ultracentrifugação (200.000 x g, 2 3 horas, 4 º“C) e ressuspensão.
[0082] Em algumas modalidades, a esterilidade das preparações de EV pode ser confirmada colocando-se em placar uma porção das EV em meio de ágar usado para cultura padrão das bactérias usadas na geração das EV e incubando-a com o uso de condições padrão.
[0083] Em algumas modalidades, as EV selecionadas são isoladas e enriquecidas por cromatografia e porções químicas de superfície de ligação em EV. Em outras modalidades, as EV selecionadas são iso- ladas e/ou enriquecidas por classificação de células fluorescentes por métodos que usam reagentes de afinidade, corantes químicos, proteí- nas recombinantes ou outros métodos conhecidos pelo versado na técnica. Composições Bacterianas
[0084] Em determinados aspectos, são fornecidas no presente do- cumento composições bacterianas que compreendem uma cepa de Lactococcus imunomoduladora fornecida no presente documento, EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladoras fornecidas no presente documento, e/ou uma cepa de Lactococcus imunomoduladora PRhAB fornecida no presente documento. Em algumas modalidades, a formu- lação bacteriana compreende adicionalmente um veículo farmaceuti- camente aceitável.
[0085] Em algumas modalidades, a composição bacteriana com- preende uma bactéria exterminada, uma bactéria viva e/ou uma bacté- ria atenuada. As bactérias podem ser exterminadas por calor por pas-
teurização, esterilização, tratamento por alta temperatura, cozimento por aspersão e/ou secagem por aspersão (tratamentos térmicos po- dem ser realizados a 50ºC, 65ºC, 85ºC ou uma variedade de outras temperaturas e/ou uma quantidade variada de tempo). As bactérias também podem ser exterminadas ou inativadas usando irradiação y (irradiação gama), exposição à luz UV, inativação por formalina, e/ou métodos de congelamento, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, as bactérias podem ser expostas a 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 50kGy de radiação antes da administração. Em al- gumas modalidades, as bactérias (por exemplo, cepa de Lactococcus) são exterminadas usando irradiação gama. Em algumas modalidades, as bactérias são exterminadas ou inativadas usando irradiação de elé- trons (por exemplo, radiação beta) ou irradiação de raios x.
[0086] Em determinadas modalidades, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bactérias na composição bacteriana são a cepa de Lactococcus imunomoduladora. Em determinadas modali- dades, substancialmente todas as bactérias na composição bacteriana são a cepa de Lactococcus imunomoduladora. Em certas modalida- des, a composição bacteriana compreende pelo menos 1 x 10º unida- des de formação de colônia (CFUs), 1 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 1 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 5 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 1 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 2 x 106 unidades de formação de colônia (CFUs), 3 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 4 x 10º uni- dades de formação de colônia (CFUs), 5 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 6 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 7 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 8 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 9 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 1 x 107 unidades de formação de colônia (CFUs), 2 x 107 uni-
dades de formação de colônia (CFUs), 3 x 107 unidades de formação de colônia (CFUs), 4 x 107 unidades de formação de colônia (CFUs), 5 x 107 unidades de formação de colônia (CFUs), 6 x 107 unidades de formação de colônia (CFUs), 7 x 107 unidades de formação de colônia (CFUs), 8 x 107 unidades de formação de colônia (CFUs), 9 x 107 uni- dades de formação de colônia (CFUs), 1 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 2 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 3 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 4 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 5 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 6 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 7 x 10º uni- dades de formação de colônia (CFUs), 8 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 9 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 1 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 5 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs), 1 x 10*º unidades de formação de colônia (CFUs) 5 x 10*º unidades de formação de colônia (CFUs), 1 x 10"! unidades de formação de colônia (CFUs) 5 x 10** unidades de forma- ção de colônia (CFUs), 1 x 10!? unidades de formação de colônia (CFUs) 5 x 10*? unidades de formação de colônia (CFUs), 1 x 103 unidades de formação de colônia (CFUs) da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[0087] Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bactérias na composi- ção são da cepa de Lactococcus imunomoduladora. 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bactérias na composi- ção são da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[0088] Em algumas modalidades, as composições descritas no presente documento podem incluir apenas uma cepa da Lactococcus imunomoduladora descrita no presente documento. Por exemplo, 1, 2,
3,4,5,6,7,8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 das cepas de Lactococcus imunomoduladoras no presente documento, em qual- quer combinação, podem estar incluídos nas composições fornecidas no presente documento.
[0089] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladora subs- tancialmente ou totalmente isentas de bactérias. Em algumas modali- dades, as composições farmacêuticas compreendem tanto EVs de ce- pa de Lactococcus imunomoduladora como bactérias de cepa de Lac- tococcus imunomoduladoras (por exemplo, bactérias vivas, bactérias exterminadas, bactérias atenuadas). Em certas modalidades, as com- posições farmacêuticas compreendem bactérias da cepa de Lactococ- cus imunomoduladora que são substancialmente ou totalmente isentas de EVs.
[0090] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos 1 bactéria da cepa de Lactococcus imuno- moduladora para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, TA, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8. 9,9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71,72, 73, 74,75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x10º, 2x103%, 3x10%, 4x103%, 5x10%, 6x103, 7x10%, 8x10%, 9x10%, 1x10º, 2x10, 3Xx10%, 4x10%, 5x10%, 6x10%, 7x10%, 8x10%, 9x10%, 1x105, 2x105, 3x105,
4x10, 5x105, 6x10º, 7x105, 8x10º%, 9x105, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x1086, 6x108, 7x106, 8x1086, 9x108, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x10º, 7x108, 8x108%, 9x108 , 1x10º%, 2x10º, 3x10º, 4x10º, 5x10º, 6x10º, 7x10º, 8x10º, 9x10%, 1x107%, 2x10%º, 3x107º%, 4x107º, 5x10%, 6x10%, 7x10º, 8x10º, 9x10%, 1x107!, 2x107!, 3x101, 4x101, 5x10], 6x10%, 7x10, 8x10*!, 9x10*!, e/ou 1x10? partículas de EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[0091] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende cerca de 1 bactéria da cepa de Lactococcus imunomodu- lador para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8. 9,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x10%, 2x10%, 3x103, 4x10%, 5xX10%, 6x103, 7x10%, 8x10%, 9x10%, 1x10%, 2x10%, 3x10º, 4x10º, 5Xx10%, 6x10%, 7x10%, 8x10%, 9x10%, 1xX105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x10º, 9x105, 1x106, 2x106, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x106, 8x108, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x10, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x10º, 2x10º%, 3x10º%, 4x10º, 5x10º, 6x10º, 7x10º, 8x10º, 9x10º, 1x107, 2x10%%, 3x10%, 4x107, 5x107%, 6x10%, 7x10%%, 8x10%, 9x10º, 1x107!, 2x107!, 3x1071, 4x10, 5x107!, 6x107!, 7x10!, 8x101, 9x10,
e/ou 1x10? partículas de EV de cepa de Lactococcus imunomodulado- ra.
[0092] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma determinada razão específica de partículas de bac- térias da cepa de Lactococcus imunomoduladora para partículas de EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora. O número de partícu- las de bactérias da cepa de Lactococcus pode ser baseado no número de partículas real ou (se as bactérias estiverem vivas) no número de CFUs. O número de partícula pode ser estabelecido pela combinação de um número definido de EVs de cepa de Lactococcus imunomodu- ladoras purificadas com um número definido de bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladoras purificadas, modificando as condições de crescimento sob as quais as bactérias da cepa de Lactococcus imunomoduladoras são cultivadas, ou modificando as próprias bacté- rias da cepa de Lactococcus imunomoduladoras para produzir mais ou menos EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladoras.
[0093] Em algumas modalidades, para quantificar os números de EVs da cepa de Lactococcus imunomoduladoras e/ou bactérias da ce- pa de Lactococcus imunomoduladoras presentes em uma amostra bacteriana, microscopia eletrônica (por exemplo, EM de seções conge- ladas ultrafinas) pode ser usada para visualizar as vesículas e bacté- rias e contar seus números relativos. Alternativamente, combinações de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), contador de par- tículas e dispersão dinâmica de luz (DLS) ou uma combinação dessas técnicas podem ser usadas. NTA e o contador de partículas contam partículas e mostram seus tamanhos. DLS fornece a distribuição de tamanho de partículas, mas não a concentração. Bactérias frequente- mente têm diâmetros de 1 a 2 um. A faixa total é de 0,2 a 20 um. Re- sultados combinados do contador de partículas e NTA podem revelar os números de bactérias em uma determinada amostra. O contador de partículas revela os números de partículas com diâmetros de 0,7 a 10 um. NTA revela os números de partículas com diâmetros de 50 a
1.400 nm. Para a maioria das amostras bacterianas, o contador de partículas isoladamente pode revelar o número de bactérias em uma amostra. EV têm um diâmetro de 20 a 250 nm. NTA permitirá a conta- gem dos números de partículas que têm diâmetro de 50 a 250 nm. DLS revela a distribuição de partículas de diferentes diâmetros em uma faixa aproximada de 1 nm a 3 um.
[0094] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende não mais que 1 bactéria da cepa de Lactococcus imuno- moduladora para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, TA, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8. 9,9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71,72, 73, 74,75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x10º, 2x10%, 3xX10%, 4x103%, 5x10%, 6x10%, 7x10%, 8x10%, 9x10%, 1x10%, 2x10, 3Xx10%, 4x10%, 5x10%, 6x10%, 7x10%, 8x10%, 9x10%, 1x105, 2x105, 3x105, 4x10, 5x105, 6x10º, 7x105, 8x10º%, 9x105, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x106, 8x106, 9x108, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x10º, 7x108, 8x108%, 9x108 , 1x10º%, 2x10º, 3x10º, 4x10º, 5x10º, 6x10º, 7x10º, 8x10º, 9x10%, 1x107%, 2x10%º, 3x107º%, 4x107º, 5x10%, 6x10%, 7x10º, 8x10º, 9x10%, 1x107!, 2x107!, 3x101, 4x101, 5x10], 6x10%, 7x10,
8x10!!, 9x10*!, e/ou 1x10? partículas de EV da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[0095] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos 1 partícula de EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2,2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, TA, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8. 9,9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71,72, 73, 74,75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x10º, 2x10%, 3xX10%, 4x103%, 5x10%, 6x10%, 7x10%, 8x10%, 9x10%, 1x10%, 2x10, 3x10%, 4x10º, 5x10%, 6x10º, 7x10º, 8x10º, 9x10%, 1x105, 2x105, 3x10º, 4x10, 5x105, 6x10º, 7x105, 8x10º%, 9x105, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x1086, 6x108, 7x106, 8x1086, 9x108, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107 , 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x10º, 7x108, 8x108%, 9x108 , 1x10º%, 2x10º, 3x10º, 4x10º, 5x10º, 6x10º, 7x10º, 8Xx10º, 9x10%º, 1x10%%, 2x10%º, 3x10%, 4x10º, 5x10%%, 6x10%%, 7x10º, 8x10º, 9x10%, 1x107!, 2x107!, 3x101, 4x101, 5x10], 6x10%, 7x10, 8x10*!, 9x10*!, e/ou 1x10º? bactéria da cepa de Lactococcus imuno- moduladora.
[0096] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende cerca de 1 partícula de EV de cepa de Lactococcus imu- nomoduladora para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6,
3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, TA, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8. 9,9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70, 71,72, 73, 74,75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x10º, 2x103%, 3x10%, 4x103%, 5x10%, 6x103, 7x10%, 8x10%, 9x10%, 1x10º, 2x10, 3x10%, 4x10º, 5x10%, 6x10º, 7x10º, 8x10º, 9x10%, 1x105, 2x105, 3x10º, 4x105, 5xX105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x108, 2x1086, 3x106, 4x108, 5x108, 6x108, 7x106, 8x106, 9x108, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107 , 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x10º, 7Xx108, 8x108, 9x108, 1x10º%, 2x10º, 3x10º, 4x10ºº, 5x10º, 6x10º, 7x10º, 8Xx10º, 9x10%º, 1x10%%, 2x10%º, 3x10%, 4x10º, 5x10%%, 6x10%%, 7x10º, 8x107º, 9x10%º, 1x107!, 2x1071, 3x10%!, 4x107!, 5x10], 6x10%, 7x10, 8x10*!, 9x10*!, e/ou 1x10*? bactéria de cepa de Lactococcus imuno- moduladora.
Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende não mais que 1 partícula de EV de Lactococcus imuno- moduladora para cada 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8. 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, TA, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8. 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8. 9,9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68. 69, 70,
71,72, 73, 74,75, 76, 77, 78. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98. 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x10º, 2x103%, 3x10%, 4x103%, 5x10%, 6x103, 7x10%, 8x10%, 9x10%, 1x10º, 2x10, 3x10%, 4x10º, 5x10%, 6x10º, 7x10º, 8x10º, 9x10%, 1x105, 2x105, 3x10º, 4x105, 5xX105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x108, 2x1086, 3x106, 4x108, 5x108, 6x108, 7x106, 8x106, 9x108, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x10º, 7Xx108, 8x108, 9x108, 1x10º%, 2x10º, 3x10º, 4x10ºº, 5x10º, 6x10º, 7x10º, 8Xx10º, 9x10%º, 1x10%%, 2x10%º, 3x10%, 4x10º, 5x10%%, 6x10%%, 7x10º, 8x107º, 9x10%º, 1x107!, 2x1071, 3x10%!, 4x107!, 5x10], 6x10%, 7x10, 8x10*!, 9x10*!, e/ou 1x10*? bactéria da cepa de Lactococcus imuno- moduladora.
[0097] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das partí- culas na composição farmacêutica são EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[0098] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%,
66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das partí- culas na composição farmacêutica são bactérias de cepa de Lactococ- cus imunomoduladora.
[0099] Em algumas modalidades, não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das partí- culas na composição farmacêutica são EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[00100] Em algumas modalidades, não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das partí- culas na composição farmacêutica são bactérias são bactérias da ce- pa de Lactococcus imunomoduladoras.
[00101] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%,
31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das partículas na composição farmacêutica são EVs de cepa de Lactococcus imunomo- duladora.
[00102] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das partículas na composição farmacêutica são bactérias de cepa de Lactococcus imu- nomoduladora.
[00103] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, ou 99% da proteína na composição consistem em proteínas da EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[00104] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%,
5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da proteína na composição farmacêutica consistem na proteína de bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[00105] Em algumas modalidades, não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da proteína na composição farmacêutica consistem na proteína de EV da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[00106] Em algumas modalidades, não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da proteína na composição farmacêutica consistem em proteína de bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladoras.
[00107] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, ou 99% da proteína na composição far- macêutica consistem na proteína da EV de cepa de Lactococcus imu- nomoduladora.
[00108] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da proteína na composição farmacêutica consistem na proteína de bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[00109] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipí-
deos na composição farmacêutica são lipídeos de EV de cepa de Lac- tococcus imunomoduladora.
[00110] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipí- deos na composição farmacêutica são lipídeos de bactérias da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[00111] Em algumas modalidades, não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipí- deos na composição farmacêutica consistem em lipídeos de EV da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[00112] Em algumas modalidades, não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%,
66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipí- deos na composição consistem em lipídeos de bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladoras.
[00113] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipídeos na composição farmacêutica são lipídeos de EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
[00114] Em algumas modalidades, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipídeos na composição farmacêutica são lipídeos de bactérias da cepa de Lacto- coccus imunomoduladora.
[00115] Em algumas modalidades, as EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladoras na composição farmacêutica são purificadas a par- tir de um ou mais outros componentes bacterianos. Em algumas mo-
dalidades, a composição farmacêutica compreende, ainda, outros componentes bacterianos. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende células de bactérias.
[00116] Conforme descrito em detalhes abaixo, as composições farmacêuticas reveladas no presente documento podem ser especial- mente formuladas para administração sob a forma sólida ou líquida, inclusive aquelas adaptadas para administração por via oral ou retal.
[00117] Em algumas modalidades, a composição descrita no pre- sente documento pode ser uma composição farmacêutica, um suple- mento dietário, ou um produto alimentício (por exemplo, um alimento ou bebida). Em algumas modalidades, o produto alimentício é uma ra- ção animal.
[00118] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica para administração oral descrita no presente documento compreende um componente adicional que permite a entrega eficiente das bacté- rias ao cólon. Em algumas modalidades, a preparação farmacêutica que permite a entrega das bactérias ao cólon pode ser usada. Exem- plos de tais formulações incluem composições sensíveis a pH, como formulações em sachê tamponadas ou polímeros entéricos que libe- ram seus conteúdos quando o pH se tornar alcalino após os polímeros entéricos atravessarem o estômago. Quando uma composição sensí- vel a pH for usada para formular a preparação farmacêutica, a compo- sição sensível a pH pode ser um polímero cujo limite de pH da decom- posição da composição é entre cerca de 6,8 e cerca de 7,5.
[00119] Uma outra modalidade de uma composição farmacêutica útil para a entrega das bactérias ao cólon é uma que garanta a entrega ao cólon retardando a liberação das bactérias em aproximadamente 3 a 5 horas, o que corresponde o tempo de trânsito no intestino delgado. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica para liberação retardada inclui um invólucro de hidrogel. O hidrogel! é hidratado e dila-
ta mediante contato com o fluidos gastrointestinais, com o resultado que os conteúdos são efetivamente liberados (predominantemente |i- berado no cólon). As unidades de dosagem de liberação retardada in- cluem composições contendo bactérias que têm um material que re- veste ou seletivamente reveste as bactérias. Exemplos de tal material de revestimento seletivo incluem polímeros degradáveis in vivo, gra- dualmente polímeros hidrolisáveis, gradualmente polímeros solúveis em água e/ou polímeros degradáveis por enzimas. Uma ampla varie- dade de materiais de revestimento para retardar eficientemente a libe- ração está disponível e inclui, por exemplo, polímeros à base de celu- lose como hidróxi propil celulose, polímeros de ácido acrílico e copoli- meros como polímeros e copolímeros de ácido metacrílico, e políme- ros e copolímeros de vinila como polivinilpirrolidona.
[00120] “Exemplos de composição que permite a entrega ao cólon incluem, ainda, composições bioadesivas que se aderem especifica- mente à membrana mucosa colônica (por exemplo, um polímero des- crito no relatório descritivo da Patente nº US 6.368.586, incorporada no presente documento a título de referência) e composições em que um inibidor de protease é incorporado para proteger particularmente uma preparação biofarmacêutica nos tratos gastrointestinais contra a de- composição devido a uma atividade de uma protease.
[00121] Um exemplo de um sistema que permite que a entrega ao cólon é um sistema de entrega de uma composição ao cólon por mu- dança de pressão de modo que os conteúdos sejam liberados usando a mudança de pressão causada pela geração de gás na fermentação bacteriana em uma porção distal do estômago. Tal sistema não é par- ticularmente limitado , e um exemplo mais específico do mesmo é uma cápsula que tem os conteúdos dispersos em uma base de supositório e que é revestido com um polímero hidrofóbico (por exemplo, etilcelu- lose).
[00122] “Um outro exemplo do sistema que permite a entrega ao có- lon é um sistema de entrega de uma composição ao cólon, sendo que o sistema é especificamente decomposto por uma enzima (por exem- plo, uma carboidrato hidrolase ou uma carboidrato redutase) presente no cólon. Tal sistema não é particularmente limitado, e exemplos mais específicos dos mesmos incluem sistemas que usam componentes alimentícios como polissacarídeos não amiláceos, amilose, goma de xantana e azopolímeros.
[00123] Em algumas modalidades, formulações probióticas são for- necidas como formas encapsuladas, revestidas entéricas ou em pó, sendo que tais doses variam até 10" cfu (por exemplo, até 10º cfu). Em algumas modalidades, a composição compreende 5 x 10" cfu de cepa de Lactococcus imunomoduladora e 10% (p/p) de amido de milho em uma cápsula. A cápsula é revestida entérica para liberação duode- nal em pH 5,5. Em algumas modalidades, a cápsula é revestida entéri- ca para liberação duodenal em pH 5,5. Em algumas modalidades, a composição compreende um pó de cepa de Lactococcus imunomodu- ladora seco por congelamento que é considerada a situação "Suposi- ção Qualificada de Segurança" (QPS). Em algumas modalidades, a composição é estável em temperatura congelada ou refrigerada.
[00124] Os métodos para produzir composições microbianas podem incluir três etapas de processamento principais. As etapas são: depósi- to de organismo, produção de organismo e preservação. Em certas modalidades, uma amostra que contém uma abundância de cepa de Lactococcus imunomoduladora pode ser cultivada evitando-se uma etapa de isolamento.
[00125] Para o depósito, as cepas incluídas na composição micro- biana podem ser (1) isoladas diretamente a partir de um espécime ou tomadas a partir de um estoque depositado, (2) opcionalmente cultiva- das em um ágar de nutriente ou caldo que suporta o crescimento para gerar biomassa viável e (3) a biomassa opcionalmente preservada em múltiplas alíquotas em armazenamento a longo prazo.
[00126] Em modalidades com o uso de uma etapa de cultivo, o ágar ou caldo pode conter nutrientes que fornecem elementos essenciais e fatores específicos que possibilitam o crescimento. Um exemplo seria um meio composto por 20 g/I de glicose, 10 g/| de extrato de levedura, g/l de peptona de soja, 2 g/l de ácido cítrico, 1,5 g/l de fosfato de sódio monobásico, 100 mg/l de citrato de amônio férrico, 80 mg/l de sulfato de magnésio, 10 mg/l de cloreto de hemina, 2 mg/l de cloreto de cálcio, 1 mg/l de menadiona. Outro exemplo seria um meio com- posto por 10 g/I de extrato de bife, 10 g/| de peptona, 5 g/I de cloreto de sódio, 5 g/| de dextrose, 3 g/I de extrato de levedura, 3 g/I de aceta- to de sódio, 1 g/l de amido solúvel e 0,5 g/| de HCI de I-cisteína a pH 6,8. Uma variedade de meios microbiológicos e variações são bem conhecidas na técnica (por exemplo, R.M. Atlas, Handbook of Microbi- ological Media (2010) CRC Press). O meio de cultura pode ser adicio- nado à cultura no início, pode ser adicionado durante a cultura ou pode ser fluído de modo intermitente/contínuo através da cultura. As cepas na composição bacteriana podem ser cultivadas sozinhas, como um subconjunto da composição microbiana ou como uma coleção inteira compreendendo a composição microbiana. Como um exemplo, uma primeira cepa pode ser cultivada juntamente com uma segunda cepa em uma cultura contínua misturada, a uma taxa de diluição inferior à taxa de crescimento máximo de uma das células para impedir que a cultura seja lavada para fora do cultivo.
[00127] A cultura inoculada é incubada mediante condições favorá- veis por um tempo suficiente para construir biomassa. Para as compo- sições microbianas para uso humano, isso é frequentemente à tempe- ratura de 37 ºC, pH e outros parâmetros com valores similares ao ni- cho humano normal. O ambiente pode ser controlado ativamente, con-
trolado passivamente (por exemplo, por meio de tampões), ou pode ficar à deriva. Por exemplo, para composições bacterianas anaeróbi- cas, um ambiente anóxico/de redução pode ser empregado. Isso pode ser alcançado por adição de agentes de redução como cisteína ao caldo e/ou privando o mesmo de oxigênio. Como um exemplo, uma cultura de uma composição bacteriana pode ser cultivada a 37 ºC, pH 7, no meio acima, pré-reduzida com 1 g/l de HCI de cisteína.
[00128] “Quando a cultura tiver gerado biomassa suficiente, a mes- ma pode ser preservada para depósito. Os organismos podem ser co- locados em um meio químico que protege contra congelamento (adici- onando "crioprotetores"), secagem ("lioprotetores") e/ou choque osmó- tico ("osmoprotetores"), dispensados em múltiplos recipientes (opcio- nalmente idênticos) para criar um banco uniforme e, então, tratando a cultura para preservação. Os recipientes são geralmente impermeá- veis e têm fechos que asseguram o isolamento do ambiente. O trata- mento de criopreservação é alcançado congelando-se um líquido em temperaturas ultrabaixas (por exemplo, a ou abaixo de - 80 ºC). A pre- servação seca remove água da cultura por evaporação (no caso de secagem por aspersão ou "secagem fria") ou por sublimação (por exemplo, para secagem por congelamento, secagem por congelamen- to por aspersão). A remoção de água aprimora a estabilidade de ar- mazenamento de composição microbiana a longo prazo em tempera- turas elevadas acima de condições criogênicas. Se a composição mi- crobiana compreende, por exemplo, espécies de formação de esporo e resulta na produção de esporos, a composição final pode ser purifi- cada por meios adicionais como densidade centrifugação de gradiente e preservada com o uso das técnicas [?]descritas acima[?]. O depósito de composição microbiana pode ser realizado cultivando-se e preser- vando-se as cepas individualmente, ou misturando-se as cepas em conjunto para criar um banco combinado. Como um exemplo de crio-
preservação, uma composição microbiana cultura pode ser colhida através de centrifugação para peletizar as células do meio de cultura, o sobrenadante decantado e substituído por caldo de cultura fresco contendo 15% de glicerol. A cultura pode, então, ser aliquotada em criotubos de 1 ml, vedada e colocada em - 80 ºC para retenção de via- bilidade a longo prazo. Esse procedimento alcança a viabilidade acei- tável mediante a recuperação do armazenamento congelado.
[00129] A produção microbiana pode ser conduzida com o uso de etapas de cultura similares ao depósito, incluindo o meio composição e condições de cultura descritos acima. Pode ser conduzida em maiores escalas de operação, especialmente para desenvolvimento clínico ou produção comercial. Em escalas maiores, pode haver vários subculti- vos da composição microbiana antes do cultivo final. No final do culti- vo, a cultura é colhida para possibilitar a formulação adicional em uma forma de dosagem para administração. Isso pode envolver a concen- tração, remoção de componentes de meio indesejáveis e/ou introdu- ção em um meio químico que preserva a composição microbiana e torna a mesma aceitável para administração por meio da via escolhida. Por exemplo, uma composição microbiana pode ser cultivada a uma concentração de 10º*º CFU/ml, então, concentrada 20 vezes por micro- filtração de fluxo tangencial; o meio gasto pode ser trocado por diafil- tração com um meio preservativo que consiste em 2% de gelatina, 100 MM de trealose e 10 mM de tampão de fosfato de sódio. A suspensão pode, então, ser seca por congelamento a um pó e titulada.
[00130] Após a secagem, o pó pode ser mesclado a uma potência adequada, e misturado com outras culturas e/ou uma carga como ce- lulose microcristalina para consistência e facilidade de manuseio, e a composição bacteriana formulada como fornecida no presente docu- mento.
[00131] Em certos aspectos, são fornecidas composições bacteria-
nas para administração em indivíduos. Em algumas modalidades, as composições bacterianas são combinadas com materiais ativos e/ou inativos adicionais para produzir um produto final, que pode ser em unidade de dosagem única ou em um formato de múltiplas doses.
[00132] Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos um carboidrato. Um "carboidrato" se refere a um açúcar ou po- límero de açúcares. Os termos "sacarídeo", "polissacarídeo", "carboi- drato" e "oligossacarídeo" podem ser usados de forma intercambiável. A maioria dos carboidratos são aldeídos ou cetonas com muitos gru- pos hidroxila, normalmente um em cada átomo de carbono da molécu- la. Carboidratos têm geralmente a fórmula molecular CrH2nOrn. Um carboidrato pode ser um monossacarídeo, um dissacarídeo, trissacarí- deo, oligossacarídeo ou polissacarídeo. A maioria dos carboidratos básicos é um monossacarídeo, tal como glicose, sacarose, galactose, manose, ribose, arabinose, xilose e frutose. Dissacarídeos são dois monossacarídeos unidos. Dissacarídeos exemplificativos incluem sa- carose, maltose, celobiose e lactose. Tipicamente, um oligossacarídeo inclui entre três e seis unidades de monossacarídeo (por exemplo, ra- finose, estaquiose), e polissacarídeos incluem seis ou mais unidades de monossacarídeo. Polissacarídeos exemplificativos incluem amido, glicogênio e celulose. Carboidratos podem conter unidades de sacarí- deo modificadas, tais como 2'-desoxirribose, sendo que um grupo hi- droxila é removido, 2'-fluororribose, sendo que um grupo hidroxila é substituído por um flúor, ou N-acetilglucosamina, uma forma de glicose que contém nitrogênio (por exemplo, 2'-fluororribose, desoxirribose e hexose). Carboidratos podem existir em muitas formas diferentes, por exemplo, conformadoras, formas cíclicas, formas acíclicas, estereoi- sômeros, tautômeros, anômeros e isômeros.
[00133] Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos um lipídio. Como usado no presente documento, um "lipídio"
inclui gorduras, óleos, triglicerídeos, colesterol, fosfolipídeos, ácidos graxos em qualquer forma incluindo ácidos graxos livres. Gorduras, Óleos, e ácidos graxos podem ser saturados, insaturados (cis ou trans) ou parcialmente insaturados (cis ou trans). Em algumas modalidades, o lipídio compreende pelo menos um ácido graxo selecionado dentre ácido láurico (12:0), ácido mirístico (14:0), ácido palmítico (16:0), ácido palmitoleico (16:1), ácido margárico (17:0), ácido heptadecenoico (17:1), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2), ácido linolênico (18:3), ácido octadecatetraenoico (18:4), ácido araquí- dico (20:0), ácido eicosenoico (20:1), ácido eicosadienoico (20:2), áci- do eicosatetraenoico (20:4), ácido eicosapentaenoico (20:5) (EPA), ácido docosanoico (22:0), ácido docosenoico (22:1), ácido docosapen- taenoico (22:5), ácido docosa-hexaenoico (22:6) (DHA) e ácido tetra- cosanoico (24:0). Em algumas modalidades, a composição compreen- de pelo menos um lipídio modificado, por exemplo, um lipídio que foi modificado por cozimento.
[00134] Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos um mineral suplementar ou fonte mineral. Exemplos de mine- rais incluem, sem limitação: cloreto, sódio, cálcio, ferro, cromo, cobre, iodo, zinco, magnésio, manganês, molibdênio, fósforo, potássio e se- lênio. Formas adequadas de qualquer um dos minerais supracitados incluem sais minerais solúveis, sais minerais ligeiramente solúveis, sais minerais insolúveis, minerais quelados, complexos minerais, mi- nerais não reativos, tais como minerais de carbonila, e minerais redu- zidos, e combinações dos mesmos.
[00135] Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos uma vitamina suplementar. A pelo menos uma vitamina pode ser solúvel em gordura ou vitaminas solúveis em água. Vitaminas ade- quadas incluem, porém sem limitação, vitamina C, vitamina A, vitamina E, vitamina B12, vitamina K, riboflavina, niacina, vitamina D, vitamina
B6, ácido fólico, piridoxina, tiamina, ácido pantotênico e biotina. For- mas adequadas de qualquer um dos supracitados são sais da vitami- na, derivados da vitamina, compostos que têm atividade igual ou simi- lar à da vitamina e metabólitos da vitamina.
[00136] Em algumas modalidades, a composição compreende um excipiente. Exemplos não limitadores de excipientes adequados inclu- em um agente de tamponamento, um conservante, um estabilizante, um aglutinante, um agente de compactação, um lubrificante, um acen- tuador de dispersão, um agente de desintegração, um agente flavori- zante, um adoçante e um agente colorante.
[00137] Em algumas modalidades, o excipiente é um agente de tamponamento. Exemplos não limitadores de agentes de tampona- mento adequados incluem citrato de sódio, carbonato de magnésio, bicarbonato de magnésio, carbonato de cálcio e bicarbonato de cálcio.
[00138] Em algumas modalidades, o excipiente compreende um conservante. Exemplos não limitadores de conservantes adequados incluem antioxidantes, tais como alfa-tocoferol e ascorbato, e antimi- crobianos, tais como parabenos, clorobutano!l e fenol.
[00139] Em algumas modalidades, a composição compreende um aglutinante como um excipiente. Exemplos não limitadores de agluti- nantes adequados incluem amidos, amidos pré-gelatinizados, gelatina, polivinilpirolidona, celulose, metilcelulose, carboximetilcelulose sódica, etilcelulose, poliacrilamidas, poliviniloxoazolidona, álcoois polivinílicos, álcool de C12-C18 ácido graxo, polietilenoglicol, polióis, sacarídeos, oli- gossacarídeos e combinações dos mesmos.
[00140] Em algumas modalidades, a composição compreende um lubrificante como um excipiente. Exemplos não limitadores de lubrifi- cantes adequados incluem estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearato de zinco, óleos vegetais hidrogenados, esterotex, monoes- tearato de polioxietileno, talco, polietilenoglicol, benzoato de sódio, lau-
ril sulfato de sódio, lauril sulfato de magnésio e óleo mineral leve.
[00141] Em algumas modalidades, a composição compreende um intensificador de dispersão como um excipiente. Exemplos não limita- dores de dispersantes adequados incluem amido, ácido algínico, poli- vinilpirrolidonas, goma guár, caulim, bentonita, celulose de madeira purificada, glicolato de amido de sódio, silicato isoarmórfico e celulose microcristalina como tensoativos emulsionantes de alto HLB.
[00142] Em algumas modalidades, a composição compreende um desintegrante como um excipiente. Em algumas modalidades, o desin- tegrante é um desintegrante não efervescente. Exemplos não limitado- res de desintegrantes não efervescentes incluem amidos, tais como amido de milho, amido da batata, amidos pré-gelatinizados e modifica- dos dos mesmos, adoçantes, argilas, tais como bentonita, celulose mi- crocristalina, alginatos, glicolato de amido de sódio, gomas, tais como água, guár, alfarrobeira, caraia, pectina e tragacanto. Em algumas mo- dalidades, o desintegrante é um desintegrante efervescente. Exemplos não limitadores de desintegrantes efervescentes adequados incluem bicarbonato de sódio em combinação com ácido cítrico, e bicarbonato de sódio em combinação com ácido tartárico.
[00143] Em algumas modalidades, a formulação bacteriana com- preende um revestimento entérico ou microencapsulamento. Em cer- tas modalidades, o revestimento entérico ou microencapsulamento aprimora o alvejamento a uma região desejada do trato gastrointesti- nal. Por exemplo, em certas modalidades, a composição bacteriana compreende um revestimento entérico e/ou microcápsulas que dissol- vem a um pH associado a uma região particular do trato gastrointesti- nal. Em algumas modalidades, o revestimento entérico e/ou microcáp- sulas dissolvem a um pH de cerca de 5,5 a 6,2 para liberação no duo- deno, a um valor de pH de cerca de 7,2 a 7,5 para liberação no íleo e/ou a um valor de pH de cerca de 5,6 a 6,2 para liberação no cólon.
Os revestimentos entéricos exemplificativos e microcápsulas são des- critos, por exemplo, na Publicação de Patente nº U.S. 2016/0022592, que é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.
[00144] Em algumas modalidades, a composição é um produto ali- mentício (por exemplo, um alimento ou uma bebida), tal como um ali- mento ou bebida saudável, um alimento ou bebida para bebês, um alimento ou bebida para mulheres grávidas, atletas, idosos ou outro grupo especificado, um alimento funcional, uma bebida, um alimento ou bebida para uso especificado de saúde, um suplemento dietético, um alimento ou bebida para pacientes ou uma ração animal. Exemplos específicos de alimentos e bebidas incluem várias bebidas, tais como sucos, bebidas refrescantes, bebidas de chá, preparações para drin- ques, bebidas gelatinosas e bebidas funcionais; bebidas alcoólicas, tais como cervejas; alimentos contendo carboidratos, tais como produ- tos alimentícios de arroz, macarrão, pães e massas; produtos de pasta como presuntos de peixe, salsichas, produtos de pasta de frutos do mar; produtos de embalagens retort, tais como curries, alimento cober- to com molhos espessos ricos em amido e sopas chinesas; sopas; produtos lácteos, tais como leite, bebidas lácteas, sorvetes, queijos e iogurtes; produtos fermentados, tais como pastas de soja fermentadas, iogurtes, bebidas fermentadas e picles; produtos de feijão; vários pro- dutos de confeitaria, incluindo biscoitos, bolachas e semelhantes, do- ces, gomas de mascar, gomas, sobremesas frias, incluindo geleias, caramelos de creme e sobremesas congeladas; alimentos instantãà- neos, tais como sopas instantâneas e sopas instantâneas de soja; ali- mentos para micro-ondas; e semelhantes Adicionalmente, os exem- plos também incluem alimentos e bebidas saudáveis nas formas de pós, grânulos, tabletes, cápsulas, líquidos, pastas e geleias.
[00145] Em certas modalidades, as bactérias reveladas no presente documento são administradas em conjunto com um pré-biótico ao su-
jeito.
Os pré-bióticos são carboidratos que são geralmente digeríveis por um animal hospedeiro e são seletivamente fermentados ou meta- bolizados por bactérias.
Os pré-bióticos podem ser carboidratos de cadeia curta (por exemplo, oligossacarídeos) e/ou açúcares simples (por exemplo, monossacarídeos e dissacarídeos) e/ou mucinas (prote- íÍnas pesadamente glicosiladas) que alteram a composição ou o meta- bolismo de um microbioma no hospedeiro.
Os carboidratos de cadeia curta também são chamados de oligossacarídeos e geralmente con- têm de 2 ou 3 e até 8, 9, 10, 15 ou mais porções químicas de açúcar.
Quando os pré-bióticos são introduzidos a um hospedeiro, os pré- bióticos afetam as bactérias dentro do hospedeiro e não afetam dire- tamente o hospedeiro.
Em certos aspectos, uma composição de pré- biótico pode estimular seletivamente o crescimento e/ou a atividade de um dentre um número limitado de bactérias em um hospedeiro.
Os pré-bióticos incluem oligossacarídeos como fruto-oligossacarídeos (FOS) (incluindo inulina), galacto-oligossacarídeos (GOS), trans-galacto-oligos- sacarídeos, xilo-oligossacarídeos (XOS), quito-oligossacarídeos (COS), oligossacarídeos de soja (por exemplo, estaquiose e rafinose) gentio- oligossacarídeos, isomalto-oligossacarídeos, mano-oligossacarídeos, malto-oligossacarídeos e mananoligossacarídeos.
Os oligossacarídeos não são necessariamente componentes únicos e podem ser misturas contendo oligossacarídeos com diferentes graus de oligomerização, por vezes incluindo o dissacarídeo parental e os açúcares monoméri- cos.
Vários tipos de oligossacarídeos são encontrados como compo- nentes naturais em muitos alimentos comuns, incluindo frutas, vege- tais, leite e mel.
Os exemplos específicos de oligossacarídeos são lac- tulose, lactossacarose, palatinose, sacarose de glicosila, goma guar, goma arábica, tagalose, amilose, amilopectina, pectina, xilano e ciclo- dextrinas.
Os pré-bióticos também podem ser purificados ou química ou enzimaticamente sintetizados.
Produção de PhABs
[00146] Em certos aspectos, os PhABs descritos no presente do- cumento podem ser preparados com o uso de qualquer método co- nhecido na técnica.
[00147] Em algumas modalidades, as PhABs descritas no presente documento são preparadas por fracionamento. As células e/ou sobre- nadantes bacterianos de células bacterianas cultivadas são fraciona- dos em várias biomassas farmacologicamente ativas (PhABs) e/ou produtos derivados das mesmas. As células e/ou sobrenadantes bac- terianos são fracionados com o uso de materiais e métodos conheci- dos na técnica (consultar, por exemplo, Sandrini et al. Fractionation by ultracentrifugation of gram negative cytoplasmic and membrane pro- teins. 2014. Bio-Protocol. 4(21); Scholler et al. Protoplast and cyto- plasmic membrane preparations from Streptococcus sanguis and Streptococcus mutans. 1983. J Gen Micro. 129: 3271 a 3279; Thein et al. Efficient subfractionation of gram-negative bacteria for proteomics studies. 2010. Am Chem Society. 9: 6135 a 6147; Hobb et al. Evalua- tion of procedures for outer membrane isolation from Campylobacter jejuni. 2009. 155(Pt. 3): 979 a 988).
[00148] Adicionalmente, as PhABs obtidas por métodos fornecidos no presente documento podem ser adicionalmente purificadas por cromatografia de coluna com base em tamanho, por cromatografia de afinidade e por ultracentrifugação de gradiente, com o uso de métodos que podem incluir, mas sem limitações, o uso de um gradiente de sa- carose ou gradiente de Optiprep. Brevemente, com o uso de um méto- do com gradiente de sacarose, se a precipitação com sulfato de amô- nio ou a ultracentrifugação foram usadas para concentrar os sobrena- dantes filtrados, os aglomerados são ressuspensos em sacarose a 60%, Tris 30 mM, pH 8,0. Se filtração foi usada para concentrar o so- brenadante filtrado, o concentrado é trocado de tampão para sacarose a 60%, Tris 30 mM, pH 8,0, com o uso de uma coluna Amicon Ultra. Amostras são aplicadas a um gradiente de sacarose descontínuo a 35 a 60% e centrifugadas a 200.000 x g por 3 a 24 horas a 4 ºC. Breve- mente, com o uso de um método com gradiente Optiprep, se a precipi- tação com sulfato de amônio ou ultracentrifugação for usada para con- centrar os sobrenadantes filtrados, os aglomerados são ressuspensos em Optiprep a 35% em PBS. Em algumas modalidades, se filtração for usada para concentrar o sobrenadante filtrado, o concentrado é diluído com o uso de Optiprep a 60% até uma concentração final de Optiprep a 35%. Amostras são aplicadas a um gradiente de sacarose descontí- nuo a 35 a 60% e centrifugadas a 200.000 x g por 3 a 24 horas a 4 ºC.
[00149] Em algumas modalidades, para confirmar a esterilidade e o isolamento das preparações de PhAB, as PhABs são serialmente dilu- ídas em meio de ágar usado para cultura de rotina das bactérias sen- do testadas e incubadas com o uso de condições de rotina. Prepara- ções não estéreis são passadas através de um filtro de 0,22 um para excluir as células intactas. Para aumentar adicionalmente a pureza, as PhABs isoladas podem ser DNase ou proteinase tratadas com K.
[00150] Em algumas modalidades, para a preparação de PhABs usadas para injeções in vivo, PRABs purificadas são processadas co- mo descrito anteriormente (G. Norheim, et al. PLoS ONE. 10(9): e0134353 (2015)). Brevemente, após a centrifugação de gradiente de sacarose, bandas contendo PhABs são ressuspensas a uma concen- tração final de 50 ug/ml em uma solução contendo 3% de sacarose ou outra solução adequada para injeção in vivo conhecida por um ele- mento versado na técnica. Essa solução também pode conter adjuvan- te, por exemplo, hidróxido de alumínio, a uma concentração de O a 0,5% (p/v).
[00151] Em certas modalidades, para tornar as amostras compatí- veis com testes adicionais (por exemplo, para remover a sacarose an-
tes do imageamento TEM ou ensaios in vitro), as amostras são troca- das de tampão para PBS ou Tris 30 mM, pH 8,0 com o uso de filtração (por exemplo, colunas Amicon Ultra), diálise, ou ultracentrifugação (200.000 x g, 2 3 horas, 4 º“C) e ressuspensão.
[00152] Em algumas modalidades, a esterilidade das preparações de PhAB pode ser confirmada dispondo-se em placas uma porção das PhABs em meio de ágar usado para cultura padrão das bactérias usa- das na geração das PhABs e incubando-se com o uso de condições padrão.
[00153] Em algumas modalidades, PhABs seletas são isoladas e enriquecidas por cromatografia e porções químicas de superfície de ligação em PhABs. Em outras modalidades, PhABs seletas são isola- das e/ou enriquecidas por classificação de célula fluorescente por mé- todos com o uso de reagentes de afinidade, corantes químicos, proteí- nas recombinantes ou outros métodos conhecidos por alguém versado na técnica. Administração
[00154] Em certos aspectos, é fornecido no presente documento um método para entregar uma bactéria e/ou uma composição bacteri- ana descrita no presente documento a um sujeito. Em algumas moda- lidades dos métodos fornecidos no presente documento, as bactérias são administradas em conjunto com a administração de um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, as bactérias são co- formuladas em uma composição farmacêutica com o agente terapêuti- co adicional. Em algumas modalidades, as bactérias são coadminis- tradas com o agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é administrado ao sujeito antes da ad- ministração das bactérias (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6,7,8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou 55 minutos antes, cerca de 1,2, 3, 4,5, 6,7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou
23 horas antes, ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias antes). Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é administrado ao sujeito após a administração das bactérias (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou 55 minutos após, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 horas após ou cerca de 1,2,3, 4,5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias após). Em algumas modalida- des, o mesmo modo de entrega é usado para entregar tanto as bacté- rias quanto o agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, diferentes modos de entrega são usados para administrar as bactérias e o agente terapêutico adicional. Por exemplo, em algumas modalida- des, as bactérias são administradas oralmente enquanto o agente te- rapêutico adicional é administrado por meio de injeção (por exemplo, uma injeção intravenosa, intramuscular e/ou intratumoral).
[00155] Em determinadas modalidades, as composições farmacêu- ticas, formas de dosagem e kits descritos no presente documento po- dem ser administrados em conjunto com qualquer outro tratamento de distúrbio autoimune convencional. Esses tratamentos podem ser apli- cados conforme necessário e/ou conforme indicado e podem ocorrer antes, concomitantemente ou após a administração das composições farmacêuticas, formas de dosagem e kits descritos no presente docu- mento.
[00156] O regime de dosagem pode ser qualquer um dentre uma variedade de métodos e quantidades e pode ser determinado pelo versado na técnica de acordo com os fatores clínicos conhecidos. Conforme é conhecido nas técnicas médicas, as dosagens para qual- quer paciente podem depender de muitos fatores, incluindo a espécie do sujeito, o tamanho, a área de superfície do corpo, idade, sexo, imu- nocompetência e saúde em geral, o micro-organismo específica a ser administrado, a duração e a via de administração, o tipo e o estágio da doença, por exemplo, tamanho do tumor, e outros compostos, tais co- mo fármacos sendo administrados concomitantemente. Além dos fato- res acima, tais níveis podem ser afetados pela infecciosidade do mi- cro-organismo e pela natureza do micro-organismo, conforme pode ser determinado pelo versado na técnica. Nos presentes métodos, níveis de dosagem mínima adequados de micro-organismos podem ser ní- veis suficientes para que o micro-organismo sobreviva, se desenvolva e sofra replicação. Os métodos de tratamento descritos no presente documento podem ser adequados para o tratamento de um distúrbio imunológico (por exemplo, uma doença autoimune, uma doença infla- matória, uma alergia). A dose das composições farmacêuticas descri- tas no presente documento pode ser adequadamente definida ou ajus- tada de acordo com a forma de dosagem, a via de administração, o grau ou estágio de uma doença-alvo e semelhantes. Por exemplo, a dose eficaz geral dos agentes pode variar entre 0,01 mg/kg de peso corporal/dia e 1.000 mg/kg de peso corporal/dia, entre 0,1 mg/kg de peso corporal/dia e 1.000 mg/kg de peso corporal/dia, 0,5 mg/kg de peso corporal/dia e 500 mg/kg de peso corporal/dia, 1 mg/kg de peso corporal/dia e 100 mg/kg de peso corporal/dia ou entre 5 mg/kg de pe- so corporal/dia e 50 mg/kg de peso corporal/dia. A dose eficaz pode ser 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1.000 mg/kg de peso corporal/dia ou mais, mas a dose não é limitada a isso.
[00157] Em algumas modalidades, a dose administrada a um sujei- to é suficiente para prevenir o distúrbio imunológico, atrasar seu início ou retardar ou interromper sua progressão ou prevenir um relapso do distúrbio imunológico. Um indivíduo versado na técnica reconhecerá que a dosagem dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a força do composto específico empregue, bem como a idade, a espé- cie, a condição e o peso corporal do sujeito. O tamanho da dose tam-
bém será determinado pela via, temporização e frequência de adminis- tração, bem como a existência, a natureza e a extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que possam acompanhar a administração de um composto específico e o efeito fisiológico desejado.
[00158] Doses e regimes de dosagem adequados podem ser de- terminados por técnicas convencionais de detecção de faixa conheci- das por aqueles de habilidade comum na arte. Em geral, o tratamento é iniciado com dosagens menores, que são inferiores à dose ideal do composto. Depois disso, a dosagem é aumentada por pequenos in- crementos até que o efeito ideal sob as circunstâncias seja alcançado. Um protocolo eficaz de dosagem e tratamento pode ser determinado por meios de rotina e convencionais, iniciando, por exemplo, com uma baixa dose em animais de laboratório e, então, aumentado a dosagem enquanto monitora os efeitos, e variando sistematicamente o regime de dosagem também. Estudos com animais são comumente usados para determinar a dose máxima tolerável ("MTD") de agente bioativo por quilograma de peso. Aqueles versados na técnica regularmente extrapolam a doses para eficácia, enquanto evita a toxicidade, em ou- tras espécies, incluindo seres humanos.
[00159] “De acordo com o disposto acima, em aplicações terapêuti- cas, as dosagens dos agentes ativos usados de acordo com a inven- ção variam dependendo do agente ativo, da idade, peso e condição clínica do paciente destinatário, e da experiência e julgamento do mé- dico ou profissional que administra a terapia, entre outros fatores que afetam a dosagem selecionada. Em geral, a dose deve ser suficiente para resultar no retardamento e, de preferência, regressão, do avanço de um distúrbio imunológico.
[00160] As administrações separadas podem incluir qualquer núme- ro de duas ou mais administrações (por exemplo, doses), incluindo duas, três, quatro, cinco ou seis administrações. Alguém versado na técnica pode determinar prontamente o número de administrações a realizar, ou a conveniência de realizar uma ou mais administrações adicionais, de acordo com métodos conhecidos na técnica para moni- torar métodos terapêuticos e outros métodos de monitoramento forne- cidos no presente documento. Em algumas modalidades, as doses podem ser separadas por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou dias ou 1, 2, 3 ou 4 semanas. Consequentemente, os métodos for- necidos no presente documento incluem métodos para fornecer ao su- jeito uma ou mais administrações de uma bactéria, em que o número de administrações pode ser determinado através do monitoramento do sujeito e, com base nos resultados do monitoramento, determinar a possibilidade de fornecer ou não uma ou mais administrações adicio- nais. A decisão quanto à possibilidade de fornecer ou não uma ou mais administrações adicionais pode ser baseada em uma variedade de resultados de monitoramento, incluindo, mas sem limitações, indi- cação de crescimento tumoral ou inibição de crescimento tumoral, aparecimento de novas metástases ou inibição de metástase, o título de anticorpo antibactéria do sujeito, o título de anticorpo antitumor do sujeito, a saúde geral do sujeito e/ou o peso do sujeito.
[00161] O período de tempo entre as administrações pode ser qual- quer um dentre uma variedade de períodos de tempo. O período de tempo entre administrações pode ser uma função de qualquer um den- tre uma variedade de fatores, incluindo etapas de monitoramento, co- mo descrito em relação ao número de administrações, ao período de tempo para que um sujeito monte uma resposta imune e/ou o período de tempo para que um sujeito limpe as bactérias do tecido normal. Em um exemplo, o período de tempo pode ser uma função do período de tempo para que um sujeito apresente uma resposta imunológica; por exemplo, o período de tempo pode ser maior do que o período de tempo para que um sujeito apresente uma resposta imunológica, tal como mais que cerca de uma semana, mais que cerca de dez dias, mais de cercar de duas semanas ou mais que cerca de um mês; em um outro exemplo, o período de tempo pode ser menor que o período de tempo para que um sujeito apresente uma resposta imunológica, tal como menos que cerca de uma semana, menos que cerca de dez di- as, menos que cerca de duas semanas ou menos que cerca de um mês. Em outro exemplo, o período de tempo pode ser uma função do período de tempo para que um sujeito elimine as bactérias do tecido normal; por exemplo, o período de tempo pode ser mais que o período de tempo para que um sujeito elimine as bactérias do tecido normal, como mais que cerca de um dia, mais que cerca de dois dias, mais que cerca de três dias, mais que cerca de cinco dias ou mais que cer- ca de uma semana.
[00162] Em algumas modalidades, a entrega de um agente terapêu- tico de distúrbio imunológico em combinação com as bactérias descri- tas no presente documento reduz os efeitos adversos e/ou aprimora a eficácia do agente terapêutico de distúrbio imunológico.
[00163] A dose eficaz de um agente terapêutico de distúrbio imuno- lógico descrito no presente documento é a quantidade do agente tera- pêutico que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente específico, a composição e o modo de administra- ção, com a menor toxicidade para o paciente. O nível de dosagem efi- caz pode ser identificado com o uso dos métodos descritos no presen- te documento e dependerá de uma variedade de fatores farmacociné- ticos, incluindo a atividade das composições específicas administra- das, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de ex- creção do composto específico a ser empregue, a duração do trata- mento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combi- nação com as composições específicas empregues, a idade, sexo, pe-
so, condição, saúde geral e histórico médico prévio do paciente a ser tratado e fatores semelhantes bem conhecidos nas artes médicas. Em geral, uma dose eficaz de uma terapia de distúrbio imunológico será a quantidade do agente terapêutico que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima.
[00164] A toxicidade de uma terapia de distúrbio imunológico é o nível de efeitos adversos experimentados pelo sujeito durante e após o tratamento. Os eventos adversos associados à toxicidade de terapia de distúrbio imunológico incluem, mas sem limitações, dor abdominal, indigestão ácida, refluxo ácido, reações alérgicas, alopécia, anafilaxia, anemia, ansiedade, falta de apetite, artralgias, astenia, ataxia, azote- mia, perda de equilíbrio, dor Óssea, hemorragia, coágulos sanguíneos, baixa pressão sanguínea, pressão sanguínea elevada, dificuldade pa- ra respirar, bronquite, hematomas, contagem baixa de glóbulos bran- cos, contagem baixa de hemácias, contagem baixa de plaquetas, car- diotoxicidade, cistite, cistite hemorrágica, arritmias, doença de válvula cardíaca, cardiomiopatia, doença da artéria coronária, catarata, neuro- toxicidade central, disfunção cognitiva, confusão, conjuntivite, consti- pação, tosse, câibra, cistite, trombose de veia profunda, desidratação, depressão, diarreia, tontura, boca seca, pele seca, dispepsia, dispneia, edema, desequilíbrio de eletrólito, esofagite, fadiga, perda de fertilida- de, febre, flatulência, ruborização, refluxo gástrico, doença de refluxo fastroesofageal, dor genital, granulocitopenia, ginecomastia, glaucoma, perda de cabelo, síndrome de mão-pé, dor de cabeça, perda de audi- ção, insuficiência cardíaca, palpitações cardíacas, azia, hematoma, cistite hemorrágica, hepatotoxicidade, hiperamilasemia, hipercalcemia, hipercloremia, hiperglicemia, hipercalemia, hiperlipasemia, hipermag- nesemia, hipernatremia, hiperfosfatemia, hiperpigmentação, hipertrigli- ceridemia, hiperuricemia, hipoalbuminemia, hipocalcemia, hipoclore-
mia, hipoglicemia, hipocalemia, hipomagnesemia, hiponatremia, hipo- fosfatemia, impotência, infecção, reações de sítio de injeção, insônia, deficiência de ferro, coceira, dor de articulação, insuficiência renal, leucopenia, disfunção do fígado, perda de memória, menopausa, do- res na boca, mucosite, dor muscular, mialgias, mielossupressão, mio- cardite, febre neutropênica, náusea, nefrotoxicidade, neutropenia, sangramento nasal, dormência, ototoxicidade, dor, palmar-plantar eri- trodisestesia, pancitopenia, pericardite, neuropatia periférica, faringite, fotofobia, fotossensibilidade, pneumonia, pneumonite, proteinuria, êm- bolo pulmonar, fibrose pulmonar, toxicidade pulmonar, coceira, batida cardíaca rápida, hemorragia retal, inquietação, rinite, convulsões, falta de ar, sinusite, trombocitopenia, zumbido, infecção do trato urinário, hemorragia vaginal, secura vaginal, vertigem, retenção de água, fra- queza, perda de peso, ganho de peso e xerostomia. Em geral, a toxi- cidade é aceitável se os benefícios ao sujeito, alcançados através da terapia, superarem os eventos adversos experimentados pelo sujeito devido à terapia.
[00165] Em algumas modalidades, a administração da composição bacteriana trata o distúrbio imunológico. Agentes terapêuticos
[00166] Em certos aspectos, os métodos fornecidos no presente documento incluem a administração a um sujeito de uma bactéria e/ou uma composição bacteriana descrita no presente documento (por exemplo, uma composição bacteriana contendo cepa de Lactococcus imunomoduladora) sozinha ou em combinação com outro agente tera- pêutico. Em algumas modalidades, a composição bacteriana e a outra terapia adicional podem ser administradas ao sujeito em qualquer or- dem. Em algumas modalidades, a composição bacteriana e a outra terapia adicional são administradas de modo conjunto.
[00167] Em algumas modalidades, a bactéria é administrada ao su-
jeito antes que o agente terapêutico adicional seja administrado (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas antes ou pelo menos 1,2,3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias antes). Em algumas modalidades, a bac- téria é administrada ao sujeito depois de o agente terapêutico adicional ser administrado (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas depois ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias depois). Em algu- mas modalidades, a bactéria e o agente terapêutico adicional são ad- ministrados ao sujeito simultaneamente ou quase simultaneamente (por exemplo, administrações ocorrem em até uma hora uma da ou- tra). Em algumas modalidades, é administrado ao sujeito um antibióti- co antes de a bactéria ser administrada ao sujeito (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas antes ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias antes). Em algumas modalidades, ao sujeito é administrado um antibiótico após a bactéria ser administrada ao sujeito (por exem- plo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas antes ou pelo menos 1, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias depois). Em algumas modalidades, a bactéria e o antibiótico são administrados ao sujeito simultaneamente ou quase simultaneamente (por exemplo, administrações ocorrem em até uma hora uma da outra).
[00168] Em certas modalidades, o sujeito pode ser submetido à ci- rurgia. Os tipos de cirurgia incluem, mas sem limitações, cirurgia pre- ventiva, diagnóstica ou testes, curativa e paliativa.
[00169] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um antibiótico. Por exemplo, se a presença de uma bactéria associada ao distúrbio imunológico e/ou um perfil de microbioma associado ao distúrbio imunológico for detectada de acordo com os métodos forne- cidos no presente documento, antibióticos podem ser administrados para eliminar as bactérias associadas ao distúrbio imunológico do su- jeito. "Antibióticos" se referem amplamente a compostos com capaci- dade para inibir ou prevenir uma infecção bacteriana. Os antibióticos podem ser classificados de várias formas, incluindo seu uso para in- fecções específicas, seu mecanismo de ação, sua biodisponibilidade ou seu espectro de micróbio-alvo (por exemplo, bactérias Gram-nega- tivas vs. Gram-positivas, bactérias aeróbicas vs. anaeróbicas, etc.), e estes podem ser usados para exterminar bactérias específicas em áreas específicas do hospedeiro ("nichos") (Leekha, et al 2011. Gene- ral Principles of Antimicrobial Therapy. Mayo Clin Proc. 86(2): 156 a 167). Em certas modalidades, os antibióticos podem ser usados para alvejar seletivamente bactérias de um nicho específico. Em algumas modalidades, os antibióticos conhecidos para tratar uma infecção es- pecífica que inclui um nicho de distúrbio imunológico podem ser usa- dos para alvejar micróbios associados ao distúrbio imunológico, inclu- indo bactérias associadas ao distúrbio imunológico nesse nicho. Em outras modalidades, os antibióticos são administrados após o trata- mento bacteriano. Em algumas modalidades, os antibióticos são admi- nistrados após o tratamento bacteriano para remover o enxerto.
[00170] Em alguns aspectos, os antibióticos podem ser seleciona- dos com base em suas propriedades bactericidas ou bacteriostáticas. Antibióticos bactericidas incluem mecanismos de ação que rompem a parede celular (por exemplo, B-lactamas), a membrana celular (por exemplo, daptomicina) ou DNA bacteriano (por exemplo, fluoroquino- lonas). Agentes bacteriostáticos inibem a replicação bacteriana e in-
cluem sulfonamidas, tetraciclinas e macrolidas, e atuam inibindo a sín- tese de proteína. Além disso, embora alguns fármacos possam ser bactericidas em certos organismos e bacteriostáticos em outros, co- nhecer o organismo-alvo permite que o versado na técnica selecione um antibiótico com as propriedades adequadas. Em certas condições de tratamento, antibióticos bacteriostáticos inibem a atividade de anti- bióticos bactericidas. Assim, em certas modalidades, antibióticos bac- tericidas e bacteriostáticos não são combinados.
[00171] — Antibióticos incluem, porém sem limitação, aminoglicosí- deos, ansamicinas, carbacefemas, carbapenemas, cefalosporinas, gli- copeptídeos, lincosamidas, lipopeptídeos, macrolidas, monobactamas, nitrofuranos, oxazolidononas, penicilinas, antibióticos polipeptídicos, quinolonas, fluoroquinolona, sulfonamidas, tetraciclinas e compostos antimicobacterianos, e combinações dos mesmos.
[00172] — Aminoglicosídeos incluem, porém sem limitação, amicacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina, paromo- micina e espectinomicina. Aminoglicosídeos são eficazes, por exem- plo, contra bactérias Gram-negativas, tais como Escherichia coli, Kleb- siella, Pseudomonas aeruginosa e Francisella tularensis, e contra cer- tas bactérias aeróbicas, mas menos eficazes contra anaeróbios obri- gatórios/facultativos. Acredita-se que os aminoglicosídeos se liguem à subunidade ribossômica bacteriana 30S ou 508, inibindo, assim, a sín- tese de proteína bacteriana.
[00173] —Ansamicinas incluem, porém sem limitação, geldanamicina, herbimicina, rifamicina e estreptovaricina. Acredita-se que geldanami- cina e herbimicina inibam ou alterem a função da proteína de choque térmico 90.
[00174] Carbacefemas incluem, porém sem limitação, loracarbef. Acredita-se que carbacefemas inibam a síntese da parece celular bac- teriana.
[00175] —Carbapenemas incluem, porém sem limitação, ertapenema, doripenema, imipenema/cilastatina e meropenema. Carbapenemas são bactericidas tanto para bactérias Gram-positivas como para bacté- rias Gram-negativas como antibióticos de amplo espectro. Acredita-se que carbapenemas inibam a síntese da parece celular bacteriana.
[00176] — Cefalosporinas incluem, porém sem limitação, cefadroxila, cefazolina, cefalotina, cefalotina, cefalexina, cefaclor, cefamandol, ce- foxitina, cefprozila, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefditorem, cefope- razona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepima, fosamila de ceftarolina e ceftobiprol. Cefalospo- rinas selecionadas são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram- negativas e contra bactérias Gram-positivas, incluindo Pseudomonas, certas cefalosporinas são eficazes contra Staphylococcus aureus re- sistente à meticilina (MRSA). Acredita-se que cefalosporinas inibam a síntese da parece celular bacteriana interrompendo-se a síntese da camada de peptidoglicano de paredes celulares bacterianas.
[00177] —Glicopeptídeos incluem, porém sem limitação, teicoplanina, vancomicina e telavancina. Glicopeptídeos são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-positivas aeróbicas e anaeróbicas, incluindo MRSA e Clostridium difficile. Acredita-se que glicopeptídeos inibam a síntese da parece celular bacteriana interrompendo-se a síntese da camada de peptidoglicano de paredes celulares bacterianas.
[00178] — Lincosamidas incluem, porém sem limitação, clindamicina e lincomicina. Lincosamidas são eficazes, por exemplo, contra bactérias anaeróbicas, bem como Staphylococcus e Streptococcus. Acredita-se que lincosamidas se liguem à subunidade ribossômica bacteriana 508, inibindo, assim, a síntese de proteína bacteriana.
[00179] —Lipopeptídeos incluem, porém sem limitação, daptomicina. Lipopeptídeos são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram- positivas. Acredita-se que lipopeptídeos se liguem à membrana bacte-
riana e provoquem despolarização rápida.
[00180] “Macrolidas incluem, porém sem limitação, azitromicina, cla- ritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina e espiramicina. Macrolidas são eficazes, por exemplo, contra Streptococcus e Micoplasma. Acredita-se que macrolidas se liguem à subunidade bacteriana ou ribossômica 508, inibindo, assim, a síntese de proteína bacteriana.
[00181] Monobactamas incluem, porém sem limitação, aztreonam. Monobactamas são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram- negativas. Acredita-se que monobactamas inibam a síntese da parece celular bacteriana interrompendo-se a síntese da camada de peptido- glicano de paredes celulares bacterianas.
[00182] Nitrofuranos incluem, porém sem limitação, furazolidona e nitrofurantoína.
[00183] “Oxazolidononas incluem, porém sem limitação, linezolid, posizolid, radezolid e torezolid. Acredita-se que oxazolidononas sejam inibidores de síntese de proteína.
[00184] Penicilinas incluem, porém sem limitação, amoxicilina, am- picilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, temocilina e ticarcilina. Penicilihas são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-positivas, anaeróbios facultativos, por exemplo, Streptococcus, Borrelia e Treponema. Acredita-se que peni- cilinas inibam a síntese da parece celular bacteriana interrompendo-se a síntese da camada de peptidoglicano de paredes celulares bacteria- nas.
[00185] Combinações de penicilinas incluem, porém sem limitação, amoxicilina/clavulanato, ampicilina/sulbactama, piperacilina/tazobacta- ma e ticarcilina/clavulanato.
[00186] Antibióticos polipeptídicos incluem, porém sem limitação,
bacitracina, colistina e polimixina B e E. Antibióticos polipeptídicos são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-negativas. Acredita-se que certos antibióticos polipeptídicos inibam o pirofosfato de isoprenila envolvido na síntese da camada de peptidoglicano de paredes celula- res bacterianas, enquanto outros desestabilizam a membrana externa bacteriana deslocando-se contraíons bacterianos.
[00187] —“Quinolonas e fluoroquinolona incluem, porém sem limita- ção, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, gemifloxacina, levofloxa- cina, lomefloxacina, moxifloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, oflo- xacina, trovafloxacina, grepafloxacina, esparfloxacina e temafloxacina. Quinolonas/fluoroquinolona são eficazes, por exemplo, contra Strepto- coccus e Neisseria. Acredita-se que quinolonas/fluoroquinolona inibam a girase do DNA bacteriano ou a topoisomerase |V, inibindo, assim, a replicação e a transcrição do DNA.
[00188] —Sulfonamidas incluem, porém sem limitação, mafenida, sul- facetamida, sulfadiazina, sulfadiazina de prata, sulfadimetoxina, sulfa- metizol, sulfametoxazol, sulfanilimida, sulfasalazina, sulfisoxazol, tri- metoprim-sulfametoxazol (Co-trimoxazol) e sulfonamidocrisoidina. Acredita-se que sulfonamidas inibam a síntese de folato por inibição competitiva de di-hidropteroato sintetase, inibindo, assim, a síntese de ácido nucleico.
[00189] Tetraciclinas incluem, porém sem limitação, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina e tetraciclina. Tetraciclinas são eficazes, por exemplo, contra bactérias Gram-negativas. Acredita-se que tetraciclinas se liguem à subunidade ribossômica bacteriana 30S, inibindo, assim, a síntese de proteína bacteriana.
[00190] Compostos antimicobacterianos incluem, porém sem limita- ção, clofazimina, dapsona, capreomicina, ciclosserina, etambutol, etio- namida, isoniazida, pirazinamida, rifampicina, rifabutina, rifapentina e estreptomicina.
[00191] — Antibióticos adequados também incluem arsfenamina, clo- ranfenicol, fosfomicina, ácido fusídico, metronidazol, mupirocina, pla- tensimicina, quinupristina/dalfopristina, tigeciclina, tinidazol, trimeto- prim amoxicilina/clavulanato, ampicilina/sulbactama, amfomicina risto- cetina, azitromicina, bacitracina, buforina Il, carbomicina, cecropina PI, claritromicina, eritromicinas, furazolidona, ácido fusídico, fusidato de Na, gramicidina, imipenem, indolicidina, josamicina, magainana Il, me- tronidazol, nitroimidazóis, micamicina, mutacina B-Ny266, mutacina B- JHI 140, mutacina J-T8, nisina, nisina A, novobiocina, oleandomicina, ostreogricina, piperacilina/tazobactama, pristinamicina, ramoplanina, ranalexina, reuterina, rifaximina, rosamicina, rosaramicina, espectino- micina, espiramicina, estafilomicina, estreptogramina, estreptogramina A, sinergistina, taurolidina, teicoplanina, telitromicina, ticarcilina/ácido clavulânico, triacetiloleandomicina, tilosina, tirocidina, tirotricina, van- comicina, vemamicina e virginiamicina.
[00192] Em algumas modalidades, o produto terapêutico adicional é um agente imunossupressor, um DMARD, um fármaco de controle da dor, um esteroide, um fármaco anti-inflamatório não esteroide (NSAID) ou um antagonista de citocina e combinações dos mesmos. Agentes representativos incluem, porém sem limitação, ciclosporina, retinoides, corticosteroides, derivado de ácido propiônico, derivado de ácido acé- tico, derivados de ácido enólico, derivados de ácido fenâmico, inibido- res de Cox-2, lumiracoxibe, ibuprofeno, magnésio salicilato de colina, fenoprofeno, salsalato, difunisal, tolmetina, cetoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, indometacina, sulindac, etodolac, cetorolac, nabumetona, naproxeno, valdecoxibe, etoricoxibe, MKO0966; rofecoxibe, acetomino- feno, celecoxibe, diclofenac, tramadol, piroxicam, meloxicam, tenoxi- cam, droxicam, lornoxicam, isoxicam, ácido mefanâmico, ácido meclo- fenâmico, ácido flufenâmico, tolfenamic, valdecoxibe, parecoxibe, eto- dolac, indometacina, aspirina, ibuprofeno, firocoxibe, metotrexato
(MTX), fármacos antimaláricos (por exemplo, hidroxicloroquina e clo- roquina), sulfassalazina, leflunomida, azatioprina, ciclosporina, sais de ouro, minociclina, ciclofosfamida, D-penicilamina, minociclina, aurano- fina, tacrolimus, miocrisina, clorambucila, antagonistas de TNF alfa (por exemplo, antagonistas de TNF alfa ou antagonistas do receptor de TNF alfa), por exemplo, ADALIMUMABE (Humira&), ETANER- CEPT (EnbrelO&O), INFLIXIMABE (RemicadeG&; TA-650), CERTOLIZU- MABE PEGOL (Cimzia&; CDP870), GOLIMUMABE (SimpomO; CNTO 148), ANAKINRA (Kineret&), RITUXIMABE (RituxanO; MabTheraO), ABATACEPT (Orencia&), TOCILIZUMABE (RoActemra /ActemraO), antagonistas de integrina (TYSABRIG (natalizumabe)), antagonistas de IL-1 (ACZ885 (llaris)), Anakinra (Kineret&)), antagonistas de CDA, antagonistas de IL-23, antagonistas de 11-20, antagonistas de IL-6, an- tagonistas de BLyS (por exemplo, Atacicept, Benlysta&/ LymphosStat- BO (belimumabe)), inibidores de p38, antagonistas de CD20 (ocre- lizumabe, ofatumumabe (ArzerraO)), antagonistas de interferon gama (fontolizumabe), prednisolona, prednisona, dexametasona, cortisol, cortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, betametasona, triancino- lona, beclometasoma, fludrocortisona, desoxicorticosterona, aldostero- na, doxiciclina, vancomicina, pioglitazona, SBI-087, SCIO-469, Cura- 100, oncoxina + viusida, TWHF, metoxsaleno, vitamina D - ergocalcife- rol, milnaciprano, paclitaxel, rosig tazona, tacrolimus (Prograf&O), RA- DOO)|, rapamune, rapamicina, fostamatinibe, fentanila, XOMA 052, fos- tamatinibe dissódico, rosigtazona, curcumina (Longvida?"Y), rosuvasta- tina, maraviroc, ramipnl, milnaciprano, cobiprostona, somatropina, ve- tor de terapia do gene tgAAC94, MK0359, GW856553, esomeprazol, everolimus, trastuzumabe, inibidores de JAKI e JAK2, inibidores de pan JAK, por exemplo, piridona tetracíclica 6 (P6), 325, PF-956980, denosumabe, antagonistas de IL-6, antagonistas de CD20, antagonis- tas de CTLAA, antagonistas de IL-8, antagonistas de IL-21, antagonis-
tas de |L-22, antagonistas de integrina (TysarbriO (natalizumabe)), an- tagonistas de VGEF, antagonistas de CXCL, antagonistas de MMP, antagonistas de defensina, antagonistas de IL-1 (incluindo antagonis- tas de IL-1 beta) e antagonistas de IL-23 (por exemplo, engodos re- ceptores, anticorpos antagonistas, etc.).
[00193] Em algumas modalidades, o agente é um agente imunos- supressor. Exemplos de agentes imunossupressores incluem, porém sem limitação, corticosteroides, mesalazina, mesalamina, sulfassalazi- na, derivados de sulfassalazina, fármacos imunossupressores, ciclos- porina A, mercaptopurina, azatiopurina, prednisona, metotrexato, anti- histaminas, glicocorticoides, epinefrina, teofilina, cromolina sódica, an- ti-leucotrienos, fármacos anticolinérgicos para rinite, antagonistas de TLR, inibidores de inflamassoma, descongestionantes anticolinérgicos, estabilizadores de mastócitos, anticorpos monoclonais anti-lgE, vaci- nas (por exemplo, vacinas usadas para vacinação em que a quantida- de de um alergênio é gradualmente aumentada), inibidores de citocina, tais como anticorpos anti-IL-6, inibidores de TNF, tais como inflixima- be, adalimumabe, certolizumabe pegol, golimumabe ou etanercept, e combinações dos mesmos.
[00194] Em algumas modalidades, a terapia de distúrbio imunológi- co compreende administrar bactérias terapêuticas e/ou a combinação terapêutica de bactérias ao sujeito, de modo que um microbioma sau- dável possa ser reconstituído no sujeito. Em algumas modalidades, as bactérias terapêuticas são bactérias não associadas a distúrbios imu- nológicos. Em algumas modalidades, as bactérias terapêuticas consis- tem em bactérias probióticas.
[00195] Em algumas modalidades, o terapêutico adicional é um te- rapêutico contra câncer. Em algumas modalidades, o terapêutico con- tra câncer é um agente quimioterápico. Os exemplos de tais agentes quimioterapêuticos incluem, mas sem limitações, agentes de alquila-
ção como ciclosfosfamida; sulfonatos de alquila como bussulfano, im- prossulfano e pipossulfano; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altre- tamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trieti-ilenotiofosfora- mida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); a camptotecina (incluindo o análogo sintético topoteca- no); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo sua adozelesina, carze- lesina e análogos sintéticos de bizelesina); criptoficinas (particularmen- te criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterrobina; pancratista- tina; uma sarcodictiína; espongistatina; mostardas de nitrogênio como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, no- vembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureia como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lo- mustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos como os antibióticos de enediína (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamal e caliqueamicina omegal1; dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, como clodronato; uma esperamicina; assim como cro- móforo de neocarzinostatina e cromóforos de antibiótico de enediína de cromoproteína relacionados, aclacinomosinas, actinomicina, autrar- nicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomi- cina, carzinofilina, cromomicinais, dactinomicina, daunorrubicina, de- torrubicina, 6-diazo-5-0x0-l-norleucina, doxorrubicina (incluindo morfo- lino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorru- bicina e deoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidi- na, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos como metotre-
xato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico como denopteri- na, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pi- rimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, canfora, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgênios co- mo calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitios- tano, testolactona; anti-adrenais como aminoglutetimida, mitotano, tri- lostano; reabastecedor de ácido fólico como ácido frolínico; aceglato- na; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecol- cina; diaziquona; elformitino; acetato de eliptinio; uma epotilona; eto- glucide; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinana; lonidainina; maitansi- noides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamete; pirarubicina; losoxan- trona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo de PSK); razoxana; rizoxina; sizofurano; espirogermãâã- nio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricote- cenos (especialmente toxina de T-2, verracurina A, roridina A e angui- dina); uretanos; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofos- famida; tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel e doxetaxel; cloram- bucila; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; com- plexos de coordenação de platina como cisplatina, oxaliplatina e car- boplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxan- trona; vincristina; vinorelbina; novantrona; teniposídeo; edatrexato; da- unomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecano (por exem- plo, CPT-11); inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilomiti- na (DMFO); retinoides como ácido retinoico; capecitabina; e sais, áci- dos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos supracitados.
[00196] Em algumas modalidades, o terapêutico contra câncer é um agente imunoterápico contra câncer. Imunoterapia se refere a um tra- tamento que usa o sistema imunológico de um sujeito para tratar cân- cer, por exemplo, inibidores de ponto de verificação, vacinas contra câncer, citocinas, terapia celular, células CAR-T e terapia celular den- drítica. Exemplos não limitadores de imunoterapias são inibidores de ponto de verificação, incluindo, nivolumabe (BMS, anti-PD-1), pembro- lizumabe (Merck, anti-PD-1), ipiimumabe (BMS, anti-CTLA-4), ME- DI4736 (AstraZeneca, anti-PD-L1) e MPDL3280A (Roche, anti-PD-L1). Outras imunoterapias podem ser vacinas contra tumor, tais como Gar- dail, Cervarix, BCG, sipulencel-T, Gp100:209-217, AGS-003, DCVax-L, Algenpantucel-L, Tergenpantucel-L, TG4010, ProstAtak, Prostvac-V/R- TRICOM, Rindopepimul, acetato peptídico E75, IMA901, POL-103A, Belagenpumatucel-L, GSK1572932A, MDX-1279, GV1001 e Tecemo- tida. A imunoterapia pode ser administrada por meio de injeção (por exemplo, por via intravenosa, intratumoral, subcutânea ou nos linfono- dos), mas pode também ser administrada por via oral, tópica ou por meio de aerossol. Imunoterapias podem compreender adjuvantes, tais como citocinas.
[00197] Em algumas modalidades, o agente imunoterápico é um inibidor de ponto de verificação imune. A inibição do ponto de verifica- ção imune se refere amplamente à inibição dos pontos de verificação que as células cancerígenas podem produzir para impedir ou regular de modo decrescente uma resposta imunológica. Exemplos de proteí- nas de ponto de verificação imune incluem, porém sem limitação, CTLAA, PD-1, PD-L1, PD-L2, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, KIR, LAG3, TIM-3 ou VISTA. Inibidores de ponto de verificação imune podem ser anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam e inibem uma proteína de ponto de verificação imune. Exemplos de inibidores de ponto de verificação imune incluem, porém sem limi-
tação, nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe, AMP-224, AMP- 514, STI-A1110, TSR-042, RG-7446, BMS-936559, MEDI-4736, MSB- 0020718C, AUR-012 e STI-A1010.
[00198] Em algumas modalidades, o agente imunoterápico é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que, por exemplo, se liga a um antígeno associado ao câncer. Exemplos de antí- genos associados ao câncer incluem, porém sem limitação, adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína ("AFP"), ARTC1, B- RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusão BCR-ABL b3a2, beta- catenina, BING-4, CA-125, CALCA, antígeno carcinoembrionário ("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDKA, CDKNZ2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1IA1I, CTAG1, CTAG?, ciclina D1, ciclina-A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD?, fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antíge- no de tumor epitelial ("ETA"), proteína de fusão ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pmel1i7, GPNMB, HAUS3, hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, carboxil esterase intestinal, K-ras, calicreí- na 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecido como CCDC110, LAGE-1, proteína de fusão LDLR-fucosiltransferase AS, lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A?2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C?2, enzima málica, mamaglobina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm- 2, ME1, melan-A/MART-1, Meloe, midquina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUCB5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miosina, miosina classe |, N-bruto, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-?2, OA1, OGT, OS-9, polipeptídeo P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica ("(PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1,
RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RUZ2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP11, survivina, proteína de fusão SYT-SSX1 ou SYT-SSX2, TAG-1, TAG-2, telomera- se, TGF-betaRIl, TPBG, TRAG-3, triosefosfato isomerase, TRP- 1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, tirosinase ("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-1b/GAGED2a. Em algumas modalidades, o antígeno é um neo-antígeno.
[00199] Em algumas modalidades, o agente imunoterápico é uma vacina contra câncer e/ou um componente de uma vacina contra cân- cer (por exemplo, um peptídeo e/ou proteína antigênico). A vacina con- tra câncer pode ser uma vacina de proteína, uma vacina de ácido nu- cleico ou uma combinação das mesmas. Por exemplo, em algumas modalidades, a vacina contra câncer compreende um polipeptídeo que compreende um epitopo de um antígeno associado ao câncer. Em al- gumas modalidades, a vacina contra câncer compreende um ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA, tal como mMRNA) que codifica um epitopo de um antígeno associado ao câncer. Em algumas modalida- des, o ácido nucleico é um vetor (por exemplo, um vetor bacteriano, vetor viral). Os exemplos de vetores bacterianos incluem, mas sem limitações, Mycobacterium bovis (BCG), Salmonella Typhimurium ssp., Salmonella Typhi ssp., esporos de Clostridium sp., Escherichia coli Nissle 1917, Escherichia coli K-12/LLO, Listeria monocitogenes e Shi- gella flexneri. Os exemplos de vetores virais incluem, mas sem limita- ções, vaccinia, adenovírus, vírus de RNA e avipox com deficiência de replicação, fowlpox com deficiência de replicação, canarypox com de- ficiência de replicação, MVA com deficiência de replicação e adenoví- rus com deficiência de replicação.
[00200] Em algumas modalidades, a imunoterapia contra câncer compreende administração de uma célula apresentadora de antígeno (APC) preparada com um antígeno específico para câncer. Em algu-
mas modalidades, o APC é uma célula dendrítica, um macrófago ou uma célula B.
[00201] “Exemplos de antígenos associados ao câncer incluem, po- rém sem limitação, adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa- fetoproteína ("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusão BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, antí- geno carcinoembrionário ("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CDA45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG?, ciclina D1, ciclina-A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD?, fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep- CAM, EpCAM, EphA3, antígeno de tumor epitelial ("ETA"), proteína de fusão ETV6-AML1, EzH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA- A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, carboxil esterase intestinal, K-ras, calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecido como CCDC110, LAGE-1, proteína de fu- são LDLR-fucosiltransferase AS, lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE- A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE- A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima málica, mamaglobina-A, MART?2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, melan-A/MART-1, Meloe, midqui- na, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUCSAC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM- 3, miosina, miosina classe |, N-bruto, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY- BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipeptídeo P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfi- ca ("PEM"), PPPIR3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RUZ2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusão SYT-SSX1 ou SYT- SSX2, TAG-1, TAG-2, telomerase, TGF-betaRIl, TPBG, TRAG-3, tri-
osefosfato isomerase, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, ti- rosinase ("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-1b/GAGED?2a. Em algumas mo- dalidades, o antígeno é um neo-antígeno.
[00202] Em algumas modalidades, a imunoterapia contra câncer compreende a administração de um receptor de antígeno quimérico específico para câncer (CAR). Em algumas modalidades, o CAR é administrado na superfície de uma célula T. Em algumas modalidades, a CAR se liga especificamente a um antígeno associado a câncer.
[00203] Em algumas modalidades, o imunoterapia contra câncer compreende a administração de uma célula T específica para câncer ao sujeito. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T de CD4+. Em algumas modalidades, a célula T de CD4+ é uma célula T de TH1, uma célula T de TH2 ou uma célula T de TH17. Em algumas modalidades, a célula T expressa um receptor de célula T específico para um antígeno associado a câncer.
[00204] Em algumas modalidades, a vacina contra câncer é admi- nistrada com um adjuvante. Exemplos de adjuvantes incluem, porém sem limitação, uma proteína imunomoduladora, adjuvante 65, a- GalCer, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, fosfato de cálcio, peptídeo B-glucano, CpG ODN DNA, GPI-0100, lipídio A, lipopolissa- carídeo, Lipovant, montanida, N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, Pam3CSKA, quil A, toxina da cólera (CT) e toxina lábil ao calor de Es- cherichia coli enterotoxigênica (LT), incluindo derivados destes (CTB, mMMmMCT, CTA1I-DD, LTB, LTK63, LTR72, dmLT) e dimicolato de trealo- se.
[00205] Em algumas modalidades, o agente imunoterápico é uma proteína imunomoduladora para o sujeito. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é uma citocina ou quimiocina. Exemplos de proteínas imunomoduladoras incluem, porém sem limitação, quimioa- traente de linfócitos B ("BLC"), quimiocina com motivo C-C 11 ("Eota-
xina-1"), proteína quimiotática eosinofílica 2 ("Eotaxina-2"), fator esti- mulador de colônia de granulócitos ("G-CSF"), fator estimulador de co- lônia de macrófago de granulócitos ("GM-CSF), 1-309, molécula de adesão intercelular 1 ("ICAM-1"), interferon alfa ("IFN-alfa"), interferon beta ("IFN-beta"), interferon gama ("IFN-gama"), interlucina-1 alfa ("IlL- 1 alfa"), interlucina-1 beta ("lIL-1 beta"), antagonista do receptor de in- terleucina 1 ("lL-1 ra"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-4 ("IL-4"), interleucina-5 ("IL-5"), interleucina-6 ("IL-6"), receptor solúvel em inter- leucina-6 ("IL-6 sR"), interleucina-7 ("IL-7"), interleucina-8 ("IL-8"), in- terleucina- 10 ("IL-10"), interleucina- 11 ("IL-11"), subunidade beta de interleucina- 12 ("IL-12 p40" ou "IL-12 p70"), interleucina-13 ("IL-13"), interleucina-15 ("IL-15"), interleucina-16 ("IL-16"), interleucina-17A-F ("IL-17A-F"), interleucina-18 ("IL-18"), interleucina-21 ("IL-21"), inter- leucina-22 ("IL-22"), interleucina-23 ("IL-23"), interleucina-33 ("IL-33"), ligante (com motivo C-C ) de quimiocina 2 ("MCP-1"), fator estimulador de colônia de macrófagos ("M-CSF"), monocina induzida por interferon gama ("MIG"), ligante (com motivo C-C) de quimiocina 2 ("MIP-1 alfa"), ligante (com motivo C-C) de quimiocina 4 ("MIP-1 beta"), proteína-1- delta inflamatória de macrófagos ("MIP-1 delta"), subunidade B do fator de crescimento derivado de plaquetas ("PDGF-BB"), ligante (com mo- tivo C-C) de quimiocina 5, célula T normal expressa e secretada regu- lada na ativação ("RANTES"), inibidor de TIMP metalopeptidase 1 ("TIMP-1"), inibidor de TIMP metalopeptidase 2 ("TIMP-2"), linfotoxina- alfa de fator de necrose tumoral ("TNF alfa"), linfotoxina-beta de fator de necrose tumoral ("TNF beta"), receptor solúvel de TNF tipo 1 ("STNFRI"), STNFRIIAR, fator neurotrófico derivado do cérebro ("BDNF"), fator básico de crescimento de fibroblastos ("DFGF"), proteí- na morfogenética óssea 4 ("BMP-4"), proteína morfogenética óssea 5 ("BMP-5"), proteína morfogenética óssea 7 ("BMP-7"), fator de cresci- mento nervoso ("b-NGF"), fator de crescimento epidérmico ("EGF"),
receptor do fator de crescimento epidérmico ("EGFR"), fator de cres- cimento endotelial vascular derivado da glândula endócrina ("EG- VEGF"), fator de crescimento de fibroblastos 4 ("FGF-4"), fator de crescimento de queratinócitos ("FGF-7"), fator de diferenciação de crescimento 15 ("GDF-15"), fator neurotrófico derivado de células gliais ("GDNF"), fator de crescimento semelhante ao EGF de ligação à hepa- rina do hormônio de crescimento ("HB-EGF"), fator de crescimento de hepatócitos ("HGF"), proteína de ligação ao fator de crescimento se- melhante à insulina 1 ("IGFBP-1"), proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 2 ("IGFBP-2"), proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 3 (" IGFBP-3"), proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 4 ("IGFBP- 4"), proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 6 ("IGFBP-6"), fator de crescimento semelhante à insulina 1 ("IGF-1"), insulina, fator estimulador de colônia de macrófagos ("M-CSF R"), re- ceptor do fator de crescimento nervoso ("NGF R"), neurotrofina-3 ("NT- 3"), neurotrofina-4 ("NT-4"), fator inibidor de osteoclastogenese ("oste- oprotegerina"), receptores do fator de crescimento derivado de plaque- tas ("(PDGF-AA'"), biossíntese de fosfatidilinositol-glicano ("PIGF"), Skp, culina, complexo contendo F-box ("SCF"), receptor do fator de células- tronco ("SCF R"), fator de crescimento transformador alfa ("TGFalfa"), fator de crescimento transformador beta-1 ("TGF beta 1"), fator de crescimento transformador beta-3 ("TGF beta 3"), fator de crescimento endotelial vascular ("VEGF"), receptor do fator de crescimento endote- lial vascular 2 ('VEGFR2"), receptor do fator de crescimento endotelial vascular 3 ("(VEGFR3"), VEGF-D 6CKine, receptor da proteína tirosina quinase UFO ("Axl"), betacelulina ("BTC"), quimiocina epitelial associ- ada à mucosas ("CCL28"), ligante (com motivo C-C) de quimiocina 27 ("CTACK"), ligante (com motivo C-X-C) de quimiocina 16 ("CXCL16"), quimiocina com motivo C-X-C 5 ("ENA-78"), ligante (com motivo C-C)
de quimiocina 26 ("Eotaxina-3"), proteína quimiotática de granulócitos 2 ("GCP-2"), GRO, ligante (com motivo C-C) de quimiocina 14 ("HCC- I"), ligante (com motivo C-C) de quimiocina 16 ("HCC-4"), interleucina- 9 ("IL-9"), interleucina-17 F ("IL-17F"), proteína de ligação à interleuci- na-18 ("IL-18 BPa"), interleucina-28 A ("IL-28A"), interleucina 29 ("IL- 29"), interleucina 31 ("IL-31"), quimiocina com motivo C-X-C 10 ("IP- 10"), receptor de quimiocina CXCR3 ("l-TAC"), fator inibidor de leuce- mia ("LIF"), ligantes (com motivo C) de quimiocina na luz ("linfotacti- na"), proteína quimioatraente de monócitos 2 ("MCP-2"), proteína qui- mioatraente de monócitos 3 ("MCP-3"), proteína quimioatraente de monócitos 4 ("MCP-4"), quimiocina derivada de macrófagos ("MDC"), fator inibidor de migração de macrófagos ("MIF"), ligante (com motivo C-C) de quimiocina 20 ("MIP-3 alfa"), quimiocina com motivo C-C 19 ("MIP-3 beta"), ligante (com motivo C-C) de quimiocina 23 ("MPIF-1"), cadeia de proteína alfa estimuladora de macrófagos ("MSPalfa"), pro- teína 1 de montagem de nucleossoma tipo 4 ("NAP-2"), fosfoproteína secretada 1 ("osteopontina"), citocina pulmonar e regulada por ativa- ção ("PARC"), fator plaquetário 4 ("PF4"), fator derivado de células es- tromais- 1 alfa ("SDF-1 alfa"), ligante (com motivo C-C) de quimiocina 17 ("'TARC"), quimiocina expressa no timo ("TECK"), linfopoietina es- tromal tímica ("TSLP 4- IBB"), antígeno CD 166 ("ALCAM"), agrupa- mento de diferenciação 80 ("B7-1"), membro da superfamília do recep- tor do fator de necrose tumoral 17 ("(BCMA'"), agrupamento de diferen- ciação 14 ("CD14"), agrupamento de diferenciação 30 ("CD30"), agru- pamento de diferenciação 40 ("ligante de CD40"), molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembionário 1 (glicoproteína bi- liar) (CEACAM-1"), receptor de morte 6 ("DR6"), deoxitimidina quinase ("Dtk"), glicoproteína de membrana tipo 1 ("endoglina"), proteína tirosi- na quinase receptora erbB-3 ("ErbB3"), molécula de adesão endotélio- leucócito 1 ("E-selectina"), antígeno da apoptose 1 ("Fas"), tirosina quinase semelhante a Fms 3 ("FIt-3L"), membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 1 ("GITR"), membro da superfa- mília do receptor do fator de necrose tumoral 14 ("HVEM"), molécula de adesão intercelular 3 ("ICAM-3"), IL-1 R4, IL-1 RI, I1L-10 Rbeta, IL- 17R, IL-2Rgama, 1IL-21R, proteína da membrana do lisossomo 2 ("LIMPII"), lipocalina associada a gelatinase neutrofílica ("lipocalina-2"), CD62L ("L-selectina"), endotélio linfático ("LYVE-1"), sequência relaci- onada ao polipeptídeo MHC classe | A ("MICA"), sequência relaciona- da ao polipeptídeo MHC classe | B ("MICB"), NRGI-betal, receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas tipo beta ("PDGF Rbeta"), molécula de adesão celular endotelial de plaquetas ("(PECAM-1"), RA- GE, receptor celular do vírus da hepatite A 1 ("'TIM-1"), membro da su- perfamília do receptor do fator de necrose tumoral IOC ("TRAIL R3"), domínio de ligação à transglutaminase da proteína trapina ("trapina- 2"), receptor de uroquinase ("uPAR"), proteína de adesão celular vas- cular 1 ('VCAM-1"), XEDARActivina A, proteína relacionada a Agouti ("AgRP"), ribonuclease 5 ("angiogenina"), angiopoietina 1, angiostati- na, cateprina S, CD40, proteína da família críptica IB ("cripto-1"), DAN, proteína relacionada a Dickkopf 1 ("DKK-1"), E-caderina, molécula de adesão celular epitelial "EpCAM"), ligante de Fas (Fasl ou CD95L), Fcg RIIB/C, FovUistatina, galectina-7, molécula de adesão intercelular 2 ("ICAM-2"), I1L-13 RI, IL-13R2, I1L-17B, IL-2 Ra, I1L-2 Rb, 11-23, LAP, molécula de adesão celular neuronal ("NrCAM"), inibidor do ativador de plasminogênio- 1 ("PAI-1"), receptores do fator de crescimento deri- vado de plaquetas ("PDGF-AB'"), resistina, fator derivado de células estromais 1 ("SDF-1 beta"), sagpl30, proteína relacionada a frizzled se- cretada 2 ("ShhN"), lectinas do tipo imunoglobulina de ligação ao ácido siálico ("Siglec-5"), ST2, fator de crescimento transformador-beta 2 ("TGF beta 2"), Tie-2, trombopoietina ("TPO"), membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 10D ("TRAIL R4"), receptor de disparo expresso em células mieloides 1 ("TREM-1"), fator de cresci- mento endotelial vascular C ("VEGF-C"), VEGFRIAdiponectina, adipsi- na ("AND"), alfa-fetoproteína ("AFP"), angiopoietina-tipo 4 ("ANG- PTL4"), beta-2-microglobulina ("B2M"), molécula de adesão de células basais ("(BCAM"), antígeno do carboidrato 125 ("CA125"), antígeno de câncer 15-3 ("CA15-3"), antígeno carcinoembrionário ("CEA"), proteína receptora de CAMP ("CRP"), receptor do fator de crescimento epidér- mico humano 2 ("ErbB2"), folistatina, hormônio estimulador de folículos ("FSH"), ligante (com motivo C-X-C) de quimiocina 1 ("GRO alfa"), go- nadotropina coriônica humana ("beta HCG"), receptor do fator de cres- cimento semelhante à insulina 1 ("IGF-1 sR"), IL-1 sRII, IL-3, IL-18 Rb, IL-21, leptina, matriz metaloproteinase-1 ("MMP-1"), matriz metalopro- teinase-2 ("MMP-2"), matriz metaloproteinase-3 ("MMP-3"), matriz me- taloproteinase-8 ("MMP-8"), matriz metaloproteinase-9 ("MMP-9"), ma- triz metaloproteinase-10 ("MMP-10"), matriz metaloproteinase-13 ("MMP-13"), molécula de adesão de células neurais ("'NCAM-1"), en- tactina ("Nidogen-1"), enolase específica de neurônios ("NSE"), oncos- tatina M ("OSM"), procalcitonina, prolactina, antígeno específico da próstata ("PSA"), lectina do tipo lg de ligação ao ácido siálico 9 ("Si- glec-9"), ADAM 17 endopeptidase ("TACE"), tireoglobulina, inibidor da metaloproteinase 4 ("TIMP-4"), TSH2B4, proteína contendo domínio desintegrina e metaloproteinase 9 ("ADAM-9"), angiopoietina 2, mem- bro da superfamília do ligante do fator de necrose tumoral 13/membro da superfamília da fosfoproteína nuclear 32 rica em leucina ácida B ("APRIL"), proteína morfogenética óssea 2 ("BMP-2"), proteína morfo- genética óssea 9 ("BMP-9"), componente complemento 5a ("C5a"), catepsina L, CD200, CD97, quemerina, membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 6B ("DcR3"), proteína de ligação ao ácido graxo 2 ("FABP2"), proteína de ativação de fibroblastos, alfa ("FAP"), fator de crescimento de fibroblastos 19 ("FGF-19"), galectina-
3, receptor do fator de crescimento de hepatócitos ("HGF R"), IFN- gamalfa/beta R2, receptor do fator de crescimento semelhante à insu- lina 2 ("IGF-2"), fator de crescimento semelhante à insulina 2 ("IGF-2 R"), receptor de interleucina-1 6 ("IL-1R6"), interleucina 24 ("IL-24"), interleucina 33 ("IL-33", calicreína 14, asparaginil endopeptidase ("le- gumaína"), receptor de lipoproteína de baixa densidade oxidado 1 ("LOX-1"), lectina de ligação à manose ("MBL"), neprilisina ("'NEP"), homólogo de Notch 1 associado à translocação (drosofila) ("Notch-1"), nefroblastoma superexpresso ("NOV"), osteoactivina, proteína de mor- te celular programada 1 ("PD-1"), N-acetilmuramoil-L-alanina amidase ("PGRP-5"), serpina A4, proteína a relacionada a frizzled secretada 3 ("sFRP-3"), trombomodulina, receptor do tipo Toll 2 ("'TLR2"), membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 10A ("TRAIL RI"), transferrina ("TRF"), WIF-IACE-2, albumina, AMICA, angiopoietina 4, fator de ativação de células B ("BAFF"), antígeno do carboidrato 19- 9 ("CA19-9"), CD 163 , clusterina, CRT AM, ligante (com motivo C-X- C) de quimiocina 14 ("CXCL14"), cistatina C, decorina ("DCN"), proteí- na relacionada a Dickkopf 3 ("Dkk-3"), proteína tipo delta 1 ("DLL1"), fetuína A, fator de crescimento de ligação à heparina 1 ("aFGF"), re- ceptor alfa de folato ("FOLR1"), furina, proteína de classificação asso- ciada a GPCR 1 ("GASP-1"), proteína de classificação associada a GPCR 2 ("GASP-2"), receptor do fator estimulador de colônia de gra- nulócitos ("GCSF R"), hepsina serina protease ("HAI-2"), receptor de interleucina-17B ("lIL-17B R"), interleucina 27 ("IL-27"), gene de ativa- ção de linfócitos 3 ("LAG-3"), apolipoproteína A-V ("LDL R"), pepsino- gênio |, proteína de ligação ao retinol 4 ("RBP4"), SOST, proteoglicado de sulfato de heparano ("Syndecan-1"), membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 13B ("TACI"), inibidor da via do fator tecidual ("'TFPI"), TSP-1, superfamília do receptor do fator de ne- crose tumoral, membro 10b ("TRAIL R2"), TRANCE, troponina |, ativa-
dor do plasminogênio de uroquinase ("uPA"), caderina 5, caderina tipo 2 ou VE (endotelial vascular) também conhecida como CD144 ("VE- caderina"), proteína da via de sinalização induzível por WNTI 1 ("WISP-1") e ativador do receptor de fator nuclear « B ("RANK").
[00206] Em algumas modalidades, o agente terapêutico contra cân- cer é um composto anti-câncer. Compostos anti-câncer exemplificati- vos incluem, porém sem limitação, alentuzumabe (CampathO), alitreti- noína (PanretinO), anastrozol (ArimidexO), bevacizumabe (AvastinO), bexaroteno (Targretin&O), bortezomibe (VelcadeO), bosutinibe (Bosu- Ilifo), vedotina de brentuximabe (Adcetris&), cabozantinibe (Come- triq'), carfilzomibe (Kyprolis'"), cetuximabe (ErbituxO), crizotinibe (XalkoriO), dasatinibe (SprycelO), diftitox de denileucina (OntakO), clo- ridrato de erlotinibe (TarcevaO), everolimus (Afinitor&O), exemestano (AromasinO), fulvestrant (FaslodexO), gefitinibe (IressaO), tiuxetano de ibritumomabe (ZevalinO), mesilato de imatinibe (GleevecO), ipilimuma- be (YervoyT"Y), ditosilato de lapatinibe (TykerbO), letrozol (FemaraO), nilotinibe (Tasigna&), ofatumumabe (ArzerraO), panitumumabe (Vecti- bixO), cloridrato de pazopanibe (Votrient&), pertuzumabe (Perjeta”“), pralatrexato (FolotynO), regorafenibe (StivargaO), rituximabe (Ritu- xanO), romidepsina (IstodaxO), tosilato de sorafenibe (NexavarO), ma- lato de sunitinibe (Sutent&O), tamoxifeno, tensirolimus (ToriselO), tore- mifeno (FarestonO), tositumomabe e 131I-tositumomabe (BexxarO), trastuzumabe (HerceptinO), tretinoína (VesanoidO), vandetanibe (Ca- prelsa6&), vemurafenibe (Zelboraf&), vorinostat (Zolinzab) e ziv- aflibercept (ZaltrapO).
[00207] “Compostos anti-câncer exemplificativos que modificam a função de proteínas que regulam a expressão gênica e outras funções celulares (por exemplo, inibidores de HDAC, ligantes receptores de retinoide) são vorinostat (Zolinza&), bexaroteno (TargretinO) e romi- depsina (IstodaxO), alitretinoína (PanretinO) e tretinoína (VesanoidO).
[00208] “Compostos anti-câncer exemplificativos que induzem apop- tose (por exemplo, inibidores de proteassoma, antifolatos) são borte- zomibe (VelcadeO), carfilzomibe (Kyprolis ”) e pralatrexato (FolotynO).
[00209] Compostos anti-câncer exemplificativos que aumenta a resposta imunológica antitumoral (por exemplo, anti CD20, anti CD52; antígeno-4 associado ao linfócito T anti-citotóxico) são rituximabe (Ri- tuxanO), alentuzumabe (CampathO), ofatumumabe (ArzerraO) e ipi- limumabe (YervoyT"Y).
[00210] Compostos anti-câncer exemplificativos que distribuem agentes tóxicos a células cancerígenas (por exemplo, fusões anti- CD20-radionuclídeo; fusões IL-2-toxina da difteria; fusões anti-CD30- monormetilauristatina E (MMAE)) são tositumomabe e 131l- tositumomabe (BexxarO) e tiuxetano de ibritumomabe (ZevalinO), dif- titox de denileucina (Ontak&) e vedotina de brentuximabe (AdcetrisO).
[00211] Outros compostos anti-câncer exemplificativos são inibido- res de células pequenas e conjugados dos mesmos de, por exemplo, Janus quinase, ALK, Bcl-2, PARP, PI3K, receptor de VEGF, Braf, MEK, CDK e HSP90.
[00212] Compostos anti-câncer à base de platina exemplificativos incluem, por exemplo, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, satraplati- na, picoplatina, nedaplatina, triplatina e lipoplatina. Outros fármacos à base de metal adequados para tratamento incluem, porém sem limita- ção, compostos à base de rutênio, derivados de ferroceno, compostos à base de titânio e compostos à base de gálio.
[00213] Em algumas modalidades, o terapêutico contra câncer é uma porção química radioativa que compreende um radionuclídeo. Radionuclídeos exemplificadores incluem, porém sem limitação Cr-51, Cs-131, Ce-134, Se-75, Ru-97, 1-125, Eu-149, Os-189m, Sb-119, |- 123, Ho-161, Sb-117, Ce-139, Em-111, Rh-103m, Ga-67, TI-201, Pd- 103, Au-195, Hg-197, Sr-87m, Pt-191, P-33, Er-169, Ru-103, Yb-169,
Au-199, Sn-121, Tm-167, Yb-175, Em-113m, Sn-113, Lu-177, Rh-105, Sn-117m, Cu-67, Sc-47, Pt-195m, Ce-141, 1-131, Tb-161, As-77, Pt- 197, Sm-153, Gd-159, Tm-173, Pr-143, Au-198, Tm-170, Re-186, Ag- 111, Pd-109, Ga-73, Dy-165, Pm-149, Sn-123, Sr-89, Ho-166, P-32, Re-188, Pr-142, 11-194, Em-114m/Em-114, e Y-90. Distúrbios imunológicos
[00214] Em algumas modalidades, os métodos e composições des- critos no presente documento se referem ao tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio associado a uma resposta imunológica patológica, tal como uma doença autoimune, uma reação alérgica e/ou uma doença inflamatória. Em algumas modalidades, a doença ou dis- túrbio é uma doença inflamatória intestinal (por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerativa). Em algumas modalidades, os métodos e composições descritos no presente documento referem-se ao trata- mento ou prevenção de hipersensibilidade de tipo retardado, miocardi- te autoimune, granulomas, neuropatias periféricas, tireoidite de Hashi- moto, inflamação do cólon, colite, colite microscópica, colite colageno- sa, colite por derivação, colite química, colite isquêmica, colite inde- terminada, colite atípica.
[00215] Os métodos descritos no presente documento podem ser usados para tratar qualquer sujeito em necessidade do mesmo. Con- forme usado no presente documento, um "sujeito em necessidade do mesmo" inclui qualquer sujeito que tenha uma doença ou distúrbio as- sociado a uma resposta imunológica patológica (por exemplo, uma doença inflamatória intestinal), bem como qualquer sujeito com uma maior probabilidade de adquirir tal doença ou distúrbio.
[00216] As composições descritas no presente documento podem ser usadas, por exemplo, como uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar (reduzir, parcial ou completamente, os efeitos adver- sos de) uma doença autoimune, tal como doença inflamatória intestinal crônica, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, síndrome de Muckle- Wells, artrite reumatoide, esclerose múltipla ou doença de Hashimoto; uma doença alérgica, tal como uma alergia alimentar, polinose ou as- ma; uma doença infecciosa, tal como infecção com Clostridium difficile; uma doença inflamatória, tal como uma doença inflamatória mediada por TNF (por exemplo, uma doença inflamatória do trato gastrointesti- nal, tal como pouchite, uma condição inflamatória cardiovascular, tal como aterosclerose, ou uma doença inflamatória pulmonar, tal como doença pulmonar obstrutiva crônica); uma composição farmacêutica para suprimir a rejeição de transplante de órgãos ou outras situações nas quais a rejeição tecidual pode ocorrer; um suplemento, alimento ou bebida para melhorar as funções imunológicas; ou um reagente pa- ra suprimir a proliferação ou função de células imunológicas.
[00217] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos no pre- sente documento são úteis para o tratamento de inflamação. Em cer- tas modalidades, a inflamação de qualquer tecido e órgãos do corpo, incluindo inflamação musculoesquelética, inflamação vascular, infla- mação neural, inflamação do sistema digestivo, inflamação ocular, in- flamação do sistema reprodutor e outra inflamação, conforme discutido abaixo.
[00218] Distúrbios imunológicos do sistema musculoesquelético in- cluem, porém sem limitação, aquelas afecções que afetam as articula- ções esqueléticas, incluindo articulações das mãos, punho, cotovelo, ombro, mandíbula, coluna, pescoço, quadril, joelho, tornozelo e pés, e afecções que afetam os tecidos que conectam os músculos aos ossos, tais como tendões. Exemplos de tais distúrbios imunológicos, que po- dem ser tratados com os métodos e composições descritos no presen- te documento, incluem, porém sem limitação, artrite (incluindo, por exemplo, osteoartrite, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, artrite infecciosa aguda e crônica, artrite associada à go-
ta e pseudogota e artrite idiopática juvenil), tendinite, sinovite, tenossi- novite, bursite, fibrosite (fibromialgia), epicondilite, miosite e osteíte (incluindo, por exemplo, doença de Paget, osteíte pubiana e osteíte fibrosa cística).
[00219] Distúrbios imunológicos oculares se referem a um distúrbio imunológico que afeta qualquer estrutura do olho, incluindo as pálpe- bras. Exemplos de distúrbios imunológicos oculares que podem ser tratados com os métodos e composições descritos no presente docu- mento incluem, porém sem limitação, blefarite, blefarocalase, conjunti- vite, dacrioadenite, queratite, queeratoconjuntivite seca (olho seco), esclerite, triquíase e uveiíte
[00220] “Exemplos de distúrbios imunológicos do sistema nervoso que podem ser tratados com os métodos e composições descritos no presente documento incluem, porém sem limitação, encefalite, sín- drome de Guillain-Barre, meningite, neuromiotonia, narcolepsia, escle- rose múltipla, mielite e esquizofrenia. Exemplos de inflamação da vas- culatura ou sistema linfático que pode ser tratada com os métodos e composições descritos no presente documento incluem, porém sem limitação, aterosclerose, artrite, flebite, vasculite e linfangite.
[00221] “Exemplos de distúrbios imunológicos do sistema digestivo que podem ser tratados com os métodos e composições descritos no presente documento incluem, porém sem limitação, colangite, colecis- tite, enterite, enterocolite, gastrite, gastroenterite, doença inflamatória intestinal, ileíte e proctite. Doenças inflamatórias intestinais incluem, por exemplo, certas formas reconhecidas na técnica de um grupo de afecções relacionadas. São conhecidas diversas formas principais de doenças inflamatórias intestinais, sendo que a doença de Crohn (do- ença intestinal regional, por exemplo, formas inativas e ativas) e colite ulcerativa (por exemplo, formas inativas e ativas) são as mais comuns desses distúrbios. Além disso, a doença inflamatória intestinal abrange síndrome do intestino irritável, colite microscópica, enterite linfocítica- plasmocítica, doença celíaca, colite colagenosa, colite linfocítica e en- terocolie eosinofílica. Outras formas menos comuns de IBD incluem colite indeterminada, colite pseudomembranosa (colite necrosante), doença inflamatória intestinal isquêmica, doença de Behcet, sarcoido- se, esclerodermia, displasia associada a IBD, massas ou lesões asso- ciadas à displasia e colangite esclerosante primária.
[00222] Exemplos de distúrbios imunológicos do sistema reprodutor que podem ser tratados com os métodos e composições descritos no presente documento incluem, porém sem limitação, cervicite, corioam- nionite, endometrite, epididimite, onfalite, ooforite, orquite, salpingite, abcesso no tubo ovariano, uretrite, vaginite, vulvite e vulvodinia.
[00223] Os métodos e composições descritos no presente docu- mento podem ser usados para tratar afecções imunológicas que têm um componente inflamatório. Tais afecções incluem, porém sem limi- tação, alopecia universal disseminada aguda, doença de Behcet, do- ença de Chagas, síndrome de fadiga crônica, disautonomia, encefa- lomielite, espondilite anquilosante, anemia aplástica, hidradenite supu- rativa, hepatite autoimune, ooforite autoimune, doença celíaca, doença de Crohn, diabetes mellitus tipo 1, arterite de células gigantes, síndro- me de Goodpasture, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, púrpura de Henoch-Schonlein, doença de Ka- wasaki, lúpus eritematoso, colite microscópica, poliarterite microscópi- ca, doença do tecido conjuntivo misto, síndrome de Muckle-Wells, es- clerose múltipla, miastenia grave, síndrome de opsoclonia-mioclonia, neurite óptica, tireoidite de Ord, pênfigo, poliarterite nodosa, polimial- gia, artrite reumatoide, síndrome de Reiter, síndrome de Sjogren, arte- rite temporal, granulomatose de Wegener, anemia hemolítica autoimu- ne do tipo quente, cistite intersticial, doença de Lyme, morfeia, psoría- se, sarcoidose, esclerodermia, colite ulcerativa e vitiligo.
[00224] Os métodos e composições descritos no presente docu- mento podem ser usados para tratar doenças de hipersensibilidade mediadas por células T que têm um componente inflamatório. Tais afecções incluem, porém sem limitação, hipersensibilidade ao contato, dermatite de contato (incluindo a causada por hera venenosa), urticá- ria, alergias cutâneas, alergias respiratórias (febre do feno, rinite alér- gica, alergia a ácaros residenciais) e enteropatia sensível a glúten (do- ença celíaca).
[00225] — Outros distúrbios imunológicos que podem ser tratados com os métodos e composições incluem, por exemplo, apendicite, dermati- te, dermatomiosite, endocardite, fibrosite , gengivite, glossite, hepatite, hidradenite supurativa, irite, laringite, mastite, miocardite, nefrite, otite, pancreatite, parotite, pericardite, peritonoite, faringite, pleurite, pneu- monite, prostatite, pielonefrite e estomatite, rejeição de transplante (envolvendo órgãos tais como rim, fígado, coração, pulmão, pâncreas (por exemplo, células de ilhota), medula óssea, córnea, intestino del- gado, aloenxertos de pele, homoenxertos de pele e xenoenxertos de válvulas cardíacas, doença do soro e doença do enxerto versus hos- pedeiro), pancreatite aguda, pancreatite crônica, síndrome do descon- forto respiratório agudo, síndrome de Sexary, hiperplase adrenal con- gênita, tireoidite não supurativa, hipercalcemia associada ao câncer, pênfigo, dermatite herpetiforme bolhosa, eritema multiforme grave, dermatite esfoliativa, dermatite seborreica, rinite alérgica sazonal ou perene, asma brônquica, dermatite de contato, dermatite atópica, rea- ções de hipersensibilidade a fármaco, conjuntivite alérgica, queratite, herpes zóster oftálmico, irite e oiridociíclite, coriorretinite, neurite óptica, sarcoidose sintomática, quimioterapia para tuberculose pulmonar ful- minante ou disseminada, púrpura trombocitopênica idiopática em adul- tos, trombocitopenia secundária em adultos, anemia hemolítica adqui- rida (autoimune), leucemia e linfomas em adultos, leucemia aguda na infância, enterite regional, vasculite autoimune, esclerose múltipla, do- ença pulmonar obstrutiva crônica, rejeição de transplante de órgão só- lido, sepse. Os tratamentos preferenciais incluem o tratamento de re- jeição de transplante, artrite reumatoide, artrite psoriática, esclerose múltipla, diabetes tipo 1, asma, doença inflamatória intestinal, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, doença pulmonar obstrutiva crônica e inflamação acompanhando afecções infecciosas (por exemplo, sepse).
[00226] Os métodos e composições descritos no presente docu- mento podem ser usados para tratar distúrbios metabólicos e síndro- mes metabólicas. Tais afecções incluem, porém sem limitação, diabe- tes tipo Il, encefalopatia, doença de Tay-Sachs, doença de Krabbe, galactosemia, fenilcetonúria (PKU) e doença da urina do xarope de bordo.
[00227] Os métodos e composições descritos no presente docu- mento podem ser usados para tratar doenças neurodegenerativas e neurológicas. Tais condições incluem, porém sem limitação, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, doença de Príon, doença de Hun- tington, doenças neuronais motoras (MND), ataxia espinocerebelar, atrofia muscular espinhal, distonia, hipertensão idiopática intracrania- na, epilepsia, doença do sistema nervoso, doença do sistema nervoso central, distúrbios do movimento, esclerose múltipla, encefalopatia e disfunção cognitiva pós-operatória.
Câncer
[00228] Em algumas modalidades, os métodos e composições des- critos no presente documento se referem ao tratamento de câncer. Em algumas modalidades, qualquer câncer pode ser tratado com o uso dos métodos descritos no presente documento. Exemplos de cânceres que podem ser tratados pelos métodos e composições descritos no presente documento incluem, porém sem limitação, células canceríge- nas da bexiga, sangue, osso, medula óssea, cérebro, mama, cólon,
esôfago, gastrointestino, gengiva, cabeça, rim, fígado, pulmão, nasofa- ringe, pescoço, ovário, próstata, pele, estômago, testículo, língua ou útero.
Além disso, o câncer pode ser especificamente do seguinte tipo histológico, embora não se limite a estes: neoplasia maligna; carcino- ma; carcinoma; carcinoma indiferenciado; carcinoma de células gigan- tes e fusiformes; carcinoma de células pequenas; carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma basocelular; carcinoma de pilomatriz; carcinoma de células de transi- ção; carcinoma de células de transição papilar; adenocarcinoma; gas- trinoma maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carci- noma hepatocelular e colangiocarcinoma combinados; adenocarcino- ma trabecular; carcinoma adenoide cístico; adenocarcinoma no pólipo adenomatoso; adenocarcinoma de polipose familiar Coli; carcinoma sólido; tumor carcinoide maligno; adenocarcinoma bronquiíolo-alveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromofóbico; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de cé- lulas claras; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicu- lar; adenocarcinoma papilar e folicular; carcinoma esclerosante não encapsulante; carcinoma cortical adrenal; carcinoma endometoide; carcinoma de apêndice cutâneo; adenocarcinoma apócrino; adenocar- cinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepi- dermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistade- nocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocar- cinoma mucinoso; carcinoma de células de anel em sinete; carcinoma do duto infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatório; doença de Paget mamária; carcinoma de células acina- res; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma com metaplasia es- camosa; timoma maligno; tumor estromal ovariano maligno; tecoma maligno; tumor de células granulosas maligno; e roblastoma maligno; carcinoma de células de Sertoli; tumor de células leydig maligno; tumor de células lipídicas maligno; paraganglioma maligno; paraganglioma extra-mamário maligno; feocromocitoma; glomangiossarcoma; mela- noma maligno; melanoma amelanótico; melanoma de espalhamento superficial; melanoma maligno em nevo pigmentado gigante; melano- ma de células epitelioides; nevo azul maligno; sarcoma; fibrossarcoma; histiocitoma fibroso maligno; mixossarcoma; lipossarcoma; leiomios- sarcoma; rabdomiossarcoma; rabdomiossarcoma embrionário; rabdo- miossarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor misto maligno; tumor mulleriano misto; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinossarcoma; mesênquima maligno; tumor de Brenner maligno; tumor filodes malig- no; sarcoma sinovial; mesotelioma maligno; disgerminoma; carcinoma embrionário; teratoma maligno; struma ovarii maligno; coriocarcinoma; mesonefroma maligno; hemangiossarcoma; hemangioendotelioma ma- ligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma maligno; linfangiossar- coma; osteossarcoma; osteossarcoma justacortical; condrossarcoma; condroblastoma maligno; condrossarcoma mesenquimal; tumor de cé- lulas gigantes do osso; sarcoma de Ewing; tumor odontogênico malig- no; odontossarcoma ameloblástico; ameloblastoma maligno; fibrossar- coma ameloblástico; pinealoma maligno; cordoma; glioma maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplasmático; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligoden- droblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebelar; ganglio- neuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogênico olfativo; meningioma maligno; neurofibrossarcoma; neurilemoma ma- ligno; tumor de células granulares maligno; linfoma maligno; doença de Hodgkin; linfoma de Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno de pe- quenos linfócitos; linfoma maligno de células grandes difuso; linfoma maligno folicular; micose fungoide; outros linfomas não Hodgkin espe- cificados; histiocitose maligna; mieloma múltiplo; sarcoma de mastóci- tos; doença imunoproliferativa do intestino delgado; leucemia; leuce-
mia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia celular de linfossarcoma; Leucemia mieloide; leucemia basofílica; leu- cemia eosinofílica; leucemia monocítica; leucemia de mastócitos; leu- cemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; plasmacitoma, câncer co- lorretal, câncer retal e leucemia de células pilosas.
[00229] Em algumas modalidades, os métodos e composições for- necidos no presente documento se referem ao tratamento de uma leu- cemia. O termo "leucemia" significa doenças malignas amplamente progressivas dos órgãos/sistemas hematopoiéticos e é geralmente ca- racterizado por uma proliferação e desenvolvimento distorcidos de leu- cócitos e seus precursores no sangue e na medula óssea. Exemplos não limitadores de doenças de leucemia incluem, leucemia não linfocí- tica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crônica, leucemia promielocítica aguda, leuce- mia de células T do adulto, leucemia aleucêmica, uma leucemia leuco- citêmica, leucemia basofílica, leucemia de células blásticas, leucemia bovina, leucemia mielocítica crônica, leucemia cutânea, leucemia em- brionária, leucemia eosinofílica, leucemia de Gross, leucemia de célu- las de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células-tronco, leu- cemia subleucêmica, leucemia celular indiferenciada, leucemia de cé- lulas pilosas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leu- cemia histiocítica, leucemia de células-tronco, leucemia monociítica aguda, leucemia leucopênica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfogênica, leucemia linfoide, leucemia de células de linfossarcoma, leucemia de mastócitos, leucemia mega- cariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leuce- mia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia granulocítica mieloi- de, leucemia mileomonocítica, leucemia de Naegeli, leucemia de célu- las plasmáticas, leucemia plasmacítica e leucemia promielocítica.
[00230] Em algumas modalidades, os métodos e composições for-
necidos no presente documento se referem ao tratamento de um car- cinoma.
O termo "carcinoma" se refere a um crescimento maligno constituído por células epiteliais que tendem a se infiltrar nos tecidos circundantes e/ou resistir aos sinais de morte celular fisiológicos e não fisiológicos e dá origem a metástases.
Tipos exemplificativos não limi- tadores de carcinomas incluem, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenocístico, carcinoma cístico adenoide, carcinoma ade- nomatoso, carcinoma do córtex adrenal, carcinoma alveolar, carcino- ma celular alveolar, carcinoma de células basais, carcinoma basocelu- lar, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, carci- noma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogêni- co, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma co- riônico, carcinoma coloide, carcinoma de comedo, carcinoma do corpo, carcinoma cribriforme, carcinoma en cuirasse, carcinoma cutâneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma de duto, carcinoma duro, carcinoma embrionário, carcinoma encefaloide, carcinoma epienoide, carcinoma epitelial adenoide, carcinoma exofíti- co, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma de células de anel em sinete, carcinoma simplex, carcinoma de células pequenas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoidais, carcinoma de células fusiformes, carcinoma esponjoso, carcinoma es- camoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma de cordas, car- cinoma telangiectásico, carcinoma telangiectoide, carcinoma de célu- las de transição, carcinoma tuberoso, carcinoma tuberoso, carcinoma verrucoso, carcinoma viloso, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma de matriz capi- lar, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de cé- lulas de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipernefroide, carcino- ma embrionário infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico,
carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de célu- las de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carci- noma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparo, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucoso, carci- noma do muco, carcinoma mixomatoide, carcinoma nasofaríngeo, car- cinoma de células tipo grão de aveia, carcinoma ossificante, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma pré- invasivo, carcinoma de células espinhosas, carcinoma pultáceo, carci- noma de células renais do rim, carcinoma de células de reserva, carci- noma sarcomatoide, carcinoma schneideriano, carcinoma escirroso, carcinoma de células de Merkel, carcinoma de glândula salivar e car- cinoma do escroto.
[00231] Em algumas modalidades, os métodos e composições for- necidos no presente documento se referem ao tratamento de um sar- coma. O termo "sarcoma" geralmente se refere a um tumor que é constituído por uma substância semelhante ao tecido conjuntivo em- brionário e é geralmente composto por células estreitamente embala- das embebidas em uma substância fibrilar, heterogênea ou homogê- nea. Sarcomas incluem, porém sem limitação, condrossarcoma, fi- brossarcoma, linfossarcoma, melanossarcoma, mixossarcoma, os- teossarcoma, sarcoma endometrial, sarcoma estromal, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células grandes, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, lipossarcoma, sar- coma alveolar de partes moles, sarcoma ameloblástico, sarcoma botri- oide, sarcoma cloroma, coriocarcinoma, sarcoma embrionário, sarco- ma tumoral de Wilms, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiplo idiopático, sarcoma imuno- blástico de células B, linfoma, sarcoma imunoblástico de células T,
sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupf- fer, angiossarcoma, leucossarcoma, sarcoma mesenquimatoso malig- no, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sar- coma serocístico, sarcoma sinovial e sarcoma telangiectásico.
[00232] As neoplasias exemplificativas adicionais que podem ser tratadas com o uso dos métodos e composições descritos no presente documento incluem doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, mieloma múltiplo, neuroblastoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, rabdomiossarcoma, trombocitose primária, macroglobulinemia primária, tumores de pulmão de células pequenas, tumores cerebrais primários, câncer de estômago, câncer de cólon, insulanoma pancreá- tico maligno, carcinoide maligno, lesões de pele pré-malignas, câncer testicular, linfomas, câncer da tireoide, neuroblastoma, câncer esofági- co, câncer do trato genitourinário, hipercalcemia maligna, câncer cervi- cal, câncer endometrial e câncer adrenal cortical.
[00233] Em algumas modalidades, o câncer tratado é um melano- ma. O termo "melanoma" é considerado um tumor que se origina do sistema melanocítico da pele e outros órgãos. Exemplos não limitado- res de melanomas são melanoma de Harding-Passey, melanoma ju- venil, melanoma lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma acral- lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, mela- noma de Cloudman, melanoma S91, melanoma nodular, melanoma subungueal e melanoma de espalhamento superficial.
[00234] Categorias específicas de tumores que podem ser tratados com o uso dos métodos e composições descritos no presente docu- mento incluem distúrbios linfoproliferativos, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer do colo do útero, câncer endo- metrial, câncer ósseo, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer da tireoide, câncer de cabeça e pescoço, câncer do sistema nervoso central, câncer do sistema nervo-
so periférico, câncer de pele, câncer de rim, bem como metástases de todos os citados acima. Os tipos particulares de tumores incluem car- cinoma hepatocelular, hepatoma, hepatoblastoma, rabdomiossarcoma, carcinoma esofageal, carcinoma de tireoide, ganglioblastoma, fibros- sarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma os- teogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, tumor de Ewing, leimiossarcoma, rabdoterliossarcoma, carcinoma dutal invasi- vo, adenocarcinoma papilar, melanoma, carcinoma de célula escamo- sa pulmonar, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma (bem dife- renciada, moderadamente diferenciada, insatisfatoriamente diferencia- da ou não diferenciada), carcinoma bronquioalveolar, carcinoma de célula renal, hipernefroma, adenocarcinoma hipernefroide, carcinoma de duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tu- mor de Wilms, tumor testicular, carcinoma pulmonar incluindo carci- noma pulmonar de célula pequena, de célula não pequena e de célula grande, carcinoma de bexiga, glioma, astrocioma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, retinoblastoma, neuroblas- toma, carcinoma de cólon, carcinoma retal, malignâncias hematopoié- ticas incluindo todos os tipos de leucemia e linfoma incluindo: leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielogenosa crônica, leucemia linfocítica crônica, leucemia de célula de masto, leucemia megacariocíticao, linfoma mie- loide, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin.
[00235] Cânceres tratados em certas modalidades também include lesões pré-cancerígenas, por exemplo, queratose actínica (queratose solar), toupeiras (nevos displásicos), celite actínica (lábios do agricul- tor), cornos cutâneos, esôfago de Barrett, gastrite atrófica, disquerato- se congênita, disfagia sideropênica, líquen plano, fibrose submucosa oral, elastose actínica (solar) e displasia cervical.
[00236] Cânceres tratados em algumas modalidades incluem tumo-
res não cancerígenos ou benignos, por exemplo, de origem endodér- mica, ectodérmica ou mesenquimal, incluindo, porém sem limitação, colangioma, pólipo colônico, adenoma, papiloma, cistadenoma, ade- noma de células hepáticas, mole hidatidiforme, adenoma tubular renal, papiloma de células escamosas, pólipo gástrico, hemangioma, oste- oma, condroma, lipoma, fibroma, linfangioma, leiomioma, rabdomioma, astrocitoma, nevo, meningioma e ganglioneuroma.
EXEMPLOS Exemplo 1: Imunomodulação de bactérias comensais humanas em um modelo de hipersensibilidade do tipo retardado baseado em KLH
[00237] A hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) é um modelo animal de dermatite atópica (ou dermatite de contato alérgica), con- forme revisado por Petersen et al. (In vivo pharmacological disease models for psoriasis e atopic dermatitis in drug discovery. Basic & Cli- nical Pharm & Toxicology. 2006. 99(2): 104 a 115; consultar também Irving C. Allen (edição) Mouse Models of Innate Immunity: Methods e Protocols, Methods in Molecular Biology, 2013. volume 1031, DOI
10.1007/978-1-62703-481-4 13). A mesma pode ser induzida em uma variedade de cepas de camundongo e rato com o uso de vários hapte- nos ou antígenos, por exemplo, um antígeno emulsionado com um ad- juvante. A DTH é caracterizada por sensibilização, bem como uma re- ação mediada por células T específica para antígeno que resulta em eritema, edema e infiltração celular — especialmente infiltração de célu- las apresentadoras de antígeno (APCs), eosinófilos, células T CD4+ ativadas e células Th2 que expressam citocina.
[00238] As formulações de teste foram preparadas para modelo de hipersensibilidade do tipo retardado baseado em KLH. O modelo de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) fornece um mecanismo in vivo para estudar a resposta imunológica mediada por células, e resul-
tando em inflamação, após exposição a um antígeno específico ao qual os camundongos foram sensibilizados. Diversas variações do modelo de DTH foram usadas e são bem conhecidas na técnica (Irving C. Allen (ed.). Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Proto- cols, Methods in Molecular Biology. Vol. 1031, DOI 10.1007/978-1- 62703-481-4 13, Springer Science + Business Media, LLC 2013). Por exemplo, a emulsão de Homocianina de Caramujo Megathura crenula- ta (KLH) e Adjuvante Completo de Freund (CFA) foram recentemente preparados no dia da imunização (dia 0). Para esta finalidade, 8 mg de pó de KLH são pesados e são completamente ressuspensos em 16 ml de solução salina. Uma emulsão é preparada misturando a KLH/solução salina com um volume igual de solução CFA (por exemplo 10 ml de KLH/solução salina + 10 ml de solução CFA) usando seringas e um conector de chave de três vias. KLH e CFA são vigorosamente mistu- rados durante vários minutos para formar uma emulsão branca para obter estabilidade máxima. Um teste de gota é realizado para verificar se uma emulsão homogênea foi obtida, a mistura continua até que uma gota intacta permaneça visível na água.
[00239] No dia 0, camundongos fêmeas C57BI/6J, com aproxima- damente 7 semanas de idade, foram iniciados com antígeno de KLH em CFA por imunização subcutânea (4 locais, 50 ul por local).
[00240] A dexametasona, um corticosteroide, é um anti-inflamatório conhecido que melhora as reações de DTH em camundongos e serve como um controle positivo para suprimir a inflamação neste modelo (Taube e Carlsten, Action of dexamethasone in the suppression of de- layed-type hypersensitivity in reconstituted SCID mice. Inflamm Res.
2000. 49(10): 548-52). Para o grupo de controle positivo, solução es- toque de 17 mg/ml de Dexametasona foi preparada diluindo 6,8 mg de Dexametasona em 400 ul de etanol a 96%. Para cada dia de dosa- gem, uma solução de trabalho é preparada diluindo a solução estoque
100x em PBS estéril para obter uma concentração final de 0,17 mg/ml em um frasco de septo para dosagem intraperitoneal. Os camundon- gos tratados com dexametasona receberam 100 ul de Dexametasona i.p. (5 ml/kg de uma solução de 0,17 mg/ml). Sacarose congelada ser- viu como o controle negativo (veículo). A Cepa A de Lactococcus lactis cremoris foi dosada em 100ul de células bacterianas a 1x10º10 CFU/ml p.o. diariamente. Dexametasona (controle positivo), veículo (controle negativo), e a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris foram dosados diariamente.
[00241] No dia8,os camundongos foram desafiados intradermica- mente (i.d.) com 10 ug de KLH em solução salina (em um volume de ul) na orelha direita e um controle na orelha esquerda. A resposta inflamatória foi medida usando métodos conhecidos na técnica. A es- pessura do pavilhão auricular foi medida 48 horas após o desafio anti- gênico (Figuras 1 e 3). Conforme determinado pela espessura da ore- lha, a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris foi tão eficaz quanto a Dexametasona na supressão da inflamação em comparação com os camundongos que receberam veículo isoladamente.
[00242] A eficácia da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris pode ser adicionalmente estudada usando horários e doses variadas. Por exemplo, o tratamento com a composição bacteriana contendo a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris pode ser iniciado em algum ponto, tanto no momento da preparação como no momento do desafio com DTH. Por exemplo, a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (1x10º CFU por camundongo por dia) pode ser administrada ao mesmo tem- po que as injeções subcutâneas (dia O), ou pode ser administrada an- tes, ou mediante, injeção intradérmica. A cepa A de Lactococcus lactis cremoris é administrada em doses variadas e em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camundongos são injetados de forma intravenosa com a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em uma faixa entre
1x10º e 5x10º células bacterianas por camundongo. Embora alguns camundongos receberão a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção i.v., outros camundongos podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção intraperitoneal (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gavagem oral, administração tópica, injeção intradérmica (i.d.), ou outros meios de administração. Alguns camundongos podem receber a Cepa A de Lac- tococcus lactis cremoris todo dia (por exemplo, começando no dia 0), enquanto outros podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cre- moris em intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) Grupos adicionais de camundongos podem rece- ber alguma razão de células bacterianas para cepa A de Lactococcus lactis cremoris. As células bacterianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As células bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou podem ser irradiadas ou extermi- nadas por calor antes da administração.
[00243] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x10º e 5x10º células bacterianas em uma administração se- parada ou misturada com a administração da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. Assim como com a Cepa A de Lactococcus lactis cre- moris, a administração de células bacterianas pode ser variada em re- lação à via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir ga- vagem oral, injeção i.v., injeção i.p., injeção i.d., administração tópica ou administração por via nasal.
[00244] — Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agente anti-inflamatório (ou agentes anti-inflamatórios) (por exemplo, anti-CD154, bloqueio de membros da família TNF ou outro tratamen- to), e/ou um controle adequado (por exemplo, veículo ou anticorpo de controle) em vários pontos no tempo e em doses eficazes.
[00245] — Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió-
ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/I), ampici- lina (1,0 g/I), gentamicina (1,0 g/I) e anfotericina B (0,2 g/I) são adicio- nadas à água potável, e o tratamento com antibiótico é suspenso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem o recebimento de antibió- ticos.
[00246] Os animais de estudo podem ser sacrificados por exsan- guinação do plexo orbital sob anestesia com CO2/O>, seguido de luxa- ção cervical no dia 10. Para a preparação do soro, é permitido que as amostras de sangue coagulem antes da centrifugação. Os soros são transferidos para tubos limpos em um tubo separado. Após a exsan- guinação de todos os animais, ambas as orelhas (cada orelha em um frasco separado), o baço, os linfonodos mesentéricos (MLN), todo o intestino delgado e o cólon são coletados em frascos criogênicos, con- gelados e armazenados a <-70 ºC.
[00247] Os tecidos podem ser dissociados com o uso de enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabricante. As células são manchadas para análise por citometria de fluxo com o uso de técni- cas conhecidas na arte. Os anticorpos de manchamento podem incluir anti-CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, an- ti-MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Outros marcadores que podem ser analisados incluem marcador de células imunológicas pan CDA45, marcadores de células T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de macrófagos/mieloides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSFIR, PD-L1, Gr-1, F4/80). Além da imunofenotipagem, citocinas séricas são anali- sadas, incluindo, porém sem limitação, TNFa, I1L-17, I1L-13, I11L-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M- CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES e MCP-1. Análise de citocina pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido e/ou em células imunológicas infiltradas CD45+ purifica- das obtidas ex vivo. Finalmente, a imuno-histoquímica é realizada em várias seções de tecido para medir células T, macrófagos, células dendríticas e expressão de proteína na molécula de ponto de verifica- ção. Exemplo 2: Uma avaliação de artigos de teste na modulação de colite induzida por DSS em Camundongos C57BL/6
[00248] —Colite induzida por sulfato de dextrano sódico (DSS) é um modelo animal bem estudado de colite, conforme revisado por Ran- dhawa et al. (A review on chemical-induced inflammmatory bowel di- sease models in rodents. Korean J Physiol Pharmacol. 2014. 18(4): 279 a 288; consultar também Chassaing et al. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Curr Protoc Immunol. 4 de fevereiro de 2014; 104: Unidade 15.25). Neste modelo, os camundongos são trata- dos com DSS em água potável, resultando em diarreia e perda de pe- so.
[00249] Os grupos de camundongos foram tratados com DSS para induzir colite conforme conhecido na técnica (Randhawa et al. 2014; Chassaing et al. 2014; consultar também Kim et al. Investigating intes- tinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. 2012. 60:
3.678). Por exemplo, a colite foi induzida em camundongos por expo- sição a 3% de água potável tratada com DSS a partir do Dia 0 até o Dia 5. Um grupo não recebeu DSS e serviu como controles naive. Os animais foram dosados com veículo de sacarose (controle negativo), Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (1x10º CFU por camundongo por dia), Cepa X de Lactococcus lactis cremoris (1x10º CFU por ca- mundongo por dia), ou controle positivo anti-p40 (administrado i.p. nos dias O, 3, 7 e 10). Todos os animais foram pesados diariamente. Como medido pela redução na perda de peso, a Cepa A de Lactococcus lac- tis cremoris foi mais eficaz do que anti-p40 (controle positivo), ou Bac-
térias A, B ou C (Figura 2).
[00250] Em outros estudos, o tratamento com a composição bacte- riana contendo a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris pode ser ini- ciado em algum momento, tanto no dia 1 de administração de DSS, ou em algum momento posterior. Por exemplo, a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris pode ser administrada ao mesmo tempo que a iniciação de DSS (dia 1), ou podem ser administradas após os primeiros sinais da doença (por exemplo, perda de peso ou diarreia), ou durante os estágios de colite grave. Os camundongos podem ser observados dia- riamente em relação ao peso, morbidade, sobrevivência, presença de diarreia e/ou sangue nas fezes.
[00251] A cepa A de Lactococcus lactis cremoris é administrada em doses variadas, intervalos variados, e/ou vias de administração varia- das. Por exemplo, alguns camundongos são injetados de forma intra- venosa com a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em uma dose entre 1x10º e 5x10º células bacterianas por camundongo. Embora al- guns camundongos receberão a Cepa A de Lactococcus lactis cremo- ris através de injeção i.v., outros camundongos podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção intraperitoneal (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração. Alguns camundongos podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris todo dia (por exem- plo, começando no dia 1), enquanto outros podem receber a Cepa À de Lactococcus lactis cremoris em intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) Grupos adicionais de camundongos podem receber alguma razão de células bacterianas para cepa A de Lactococcus lactis cremoris. As células bacterianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As células bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou po- dem ser irradiadas ou exterminadas por calor antes da administração.
[00252] As composições bacterianas contendo a Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris podem ser testadas quanto à sua eficácia em um modelo de camundongo de colite induzida por DSS, isoladamente ou em combinação com todas as células bacterianas, com ou sem a adição de outros agentes anti-inflamatórios.
[00253] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x10º e 5x10º células bacterianas em uma administração se- parada ou misturada com a administração da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. Assim como com a Cepa A de Lactococcus lactis cre- moris , a administração de células bacterianas pode ser variada em relação à via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir gavagem oral, injeção i.v., injeção i.p. ou administração por via nasal.
[00254] — Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agente(s) anti-inflamatório(s) adicional(is) (por exemplo, anti-CD154, bloqueio de membros da família TNF ou outro tratamento), e/ou um controle adequado (por exemplo, veículo ou anticorpo de controle) em vários pontos no tempo e em doses eficazes.
[00255] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/I), ampici- lina (1,0 g/I), gentamicina (1,0 g/I) e anfotericina B (0,2 g/I) são adicio- nadas à água potável, e o tratamento com antibiótico é suspenso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos recebem DSS sem receber antibióticos previamente.
[00256] Em vários pontos no tempo, os camundongos são submeti- dos a endoscopia por vídeo com o uso de um endoscópio para ani- mais pequenos (Karl Storz Endoskipe, Alemanha) sob anestesia com isoflurano. Imagens estáticas e vídeo serão gravados para avaliar a extensão da colite e a resposta ao tratamento. A colite será pontuada com o uso de critérios conhecidos na técnica. Material fecal será cole- tado para estudo.
[00257] O trato gastrointestinal (GI), os linfonodos e/ou outros teci- dos podem ser removidos por análise histológico, de citocina e/ou ci- tométrica de fluxo ex vivo com o uso de métodos conhecidos na técni- ca. Por exemplo, os tecidos são coletados e podem ser dissociados com o uso de enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabricante. As células são manchadas para análise por citometria de fluxo com o uso de técnicas conhecidas na arte. Os anticorpos de manchamento podem incluir anti-CD11c (células dendríticas), anti- CDB80, anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti- CD103. Outros marcadores que podem ser analisados incluem marca- dor de células imunológicas pan CD45, marcadores de células T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD- 1, CTLA-4) e marcadores de macrófagos/mieloides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1IR, PD-L1, Gr-1, F4/80). Além da imunofenotipa- gem, citocinas séricas são analisadas, incluindo, porém sem limitação, TNFa, IL-17, 11-13, I1L-12p70, IL12p40, I1L-10, IL-6, IL-5, IL-4, I1L-2, IL- 1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES e MCP-1. A análise de citocina pode ser realizada em células imunológi- cas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imu- nológicas infiltradas no trato Gl CD45+ purificadas obtidas ex vivo. Fi- nalmente, a imuno-histoquímica é realizada em várias seções de teci- do para medir células T, macrófagos, células dendríticas e expressão de proteína na molécula de ponto de verificação.
[00258] Afim de examinar o impacto e a longevidade da proteção contra a doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser novamente provocados com um ativador de doença. Os camundongos serão analisados quanto à suscetibilidade à gravidade de colite após a nova provocação.
[00259] Após o sacrifício, o cólon, o intestino delgado, o baço e os linfonodos mesentéricos podem ser coletados de todos os animais e o sangue coletado para análise. Exemplo 3: Cepa A de Lactococcus lactis cremoris elou EVs deriva- das de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em um modelo de camundongo de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE)
[00260] AEAE é um modelo de animal com esclerose múltipla bem estudado, conforme revisado por Constantinescu et al. (Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. outubro de 2011; 164(4): 1.079 a 1.106) À mesma pode ser induzida em uma variedade de cepas de camundon- go e rato com o uso de diferentes peptídeos associados à mielina, pela transferência adotiva de células T encefalitogênicas ativadas, ou o uso de camundongos transgênicos TCR suscetíveis à EAE, conforme dis- cutido em Mangalam et al. (Two discreet subsets of CD8+ T cells mo- dulate PLP91-110 induced experimental autoimmune encephalomyelitis em HLA-DR3 transgenic mice. J Autoimmun. junho de 2012; 38(4): 344 a 353).
[00261] As composições bacterianas contendo a Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris são testadas quanto à sua eficácia em um modelo de camundongo de EAE, isoladamente ou em combinação com todas as células bacterianas, com ou sem a adição de outros tratamentos com anti-inflamatório Por exemplo, camundongos C57BlI/6 fêmeas com 6 a 8 semanas de idade são obtidos junto à Taconic (Germantown, NY). Grupos de camundongos serão administrados com duas injeções sub- cutâneas (s.c.) em dois sítios nas costas (superior e inferior) de 0,1 ml de glicoproteína de oligodentrócitos de mielina 35 a 55 (MOG35-55; 100 ug por injeção; 200 ug por camundongo (total 0,2 ml por camun- dongo)), emulsionado em adjuvante completo de Freund (CFA; 2a 5 mg de mycobacterium tuberculosis H37Ra exterminado/ml de emul- são). Aproximadamente 1 a 2 horas após o ocorrido acima, os camun-
dongos são injetados por via intraperitoneal (i.p.) com 200 ng de toxina Pertussis (PTx) em 0,1 ml! de PBS (2 ug/ml). Uma injeção adicional IP de PTx é administrada no dia 2. Alternativamente, uma quantidade adequada de um peptídeo de mielina alternativo (por exemplo, proteí- na proteolípidica (PLP)) será usada para induzir EAE. Alguns animais servirão como controles virgens. A gravidade de EAE será avaliada, e uma pontuação de incapacidade será atribuída diariamente começan- do no dia 4 de acordo com os métodos conhecidos na técnica (Manga- lam et al. 2012).
[00262] O tratamento com composição bacteriana contendo Cepa À de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lac- tococcus lactis cremoris é iniciado em algum ponto, no momento da imunização ou após a imunização com EAE. Por exemplo, a composi- ção bacteriana contendo a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas da composição da Cepa A de Lactococcus lactis cre- moris podem ser administradas ao mesmo tempo que a imunização (dia 1), ou as mesmas podem ser administradas mediante os primeiros sinais de incapacidade (por exemplo, cauda mole), ou durante EAE grave. As composições bacterianas contendo a Cepa A de Lactococ- cus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lac- tis cremoris são administradas em doses variadas e em intervalos de- finidos. Por exemplo, alguns camundongos são injetados de forma in- travenosa com doses eficazes de Cepa A de Lactococcus lactis cre- moris. Por exemplo, os camundongos podem receber entre 1x10º e 5x10º células bacterianas por camundongo. Embora alguns camun- dongos receberão a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de inje- ção i.v., outros camundongos podem receber Lactococcus lactis cre- moris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção intraperitoneal (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), ad-
ministração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de adminis- tração. Alguns camundongos podem receber a Cepa A de Lactococ- cus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lac- tis cremoris todo dia (por exemplo, começando no dia 1), enquanto ou- tros podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris intervalos alter- nados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias). Grupos adicionais de camundongos podem receber alguma razão de células bacterianas para cepa A de Lactococcus lactis cremoris. As células bacterianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As células bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou podem ser irradiadas ou exterminadas por calor an- tes da administração.
[00263] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x10º e 5x10º células bacterianas em uma administração se- parada ou misturada com a administração da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas da administração de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. Assim como com a Cepa A de Lactococ- cus lactis cremoris , a administração de células bacterianas pode ser variada em relação à via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir gavagem oral, injeção i.v., injeção 1.p., injeção subcutânea (s.c.) ou administração por via nasal.
[00264] Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agente anti-inflamatório adicional (ou agentes anti-inflamatórios adicio- nais) ou terapêutico para EAE (ou terapêuticos para EAE) (por exem- plo, anti-CD154, bloqueio de membros da família TNF, vitamina D ou outro tratamento), e/ou um controle adequado (por exemplo, veículo ou anticorpo de controle) em vários pontos no tempo e em doses efi- Cazes.
[00265] — Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió-
ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/I), ampici- lina (1,0 g/I), gentamicina (1,0 g/I) e anfotericina B (0,2 g/I) são adicio- nadas à água potável, e o tratamento com antibiótico é suspenso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem o recebimento de antibió- ticos.
[00266] Em vários pontos no tempo, os camundongos são sacrifi- cados, e os sítios de inflamação (por exemplo, cérebro e medula espi- nhal), linfonodos ou outros tecidos podem ser removidos por análise histológica, de citocina e/ou citométrica de fluxo ex vivo com o uso dos métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os tecidos são dissocia- dos com o uso de enzimas de dissociação de acordo com as instru- ções do fabricante. As células são manchadas para análise por cito- metria de fluxo com o uso de técnicas conhecidas na arte. Os anticor- pos de manchamento podem incluir anti-CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Outros marcadores que podem ser analisados incluem marcador de células imunológicas pan CD45, marcadores de células T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de macrófagos/mieloides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1IR, PD-L1, Gr-1, F4/80). Além da imunofe- notipagem, citocinas séricas são analisadas incluindo, porém sem limi- tação, TNFa, IL-17, I1L-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL- 2, IL-11, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1I, RANTES, e MCP-1. A análise de citocina pode ser realizada em células imunológi- cas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imu- nológicas infiltradas no sistema nervoso central (CNS) CD45+ purifica- das obtidas ex vivo. Finalmente, a imuno-histoquímica é realizada em várias seções de tecido para medir células T, macrófagos, células dendríticas e expressão de proteína na molécula de ponto de verifica-
ção.
[00267] Afim de examinar o impacto e a longevidade da proteção contra a doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser novamente provocados com um ativador de doença (por exemplo, células T encefalitogênicas ativadas ou reinjeção de peptí- deos indutores de EAE). Os camundongos serão analisados quanto à suscetibilidade à doença e gravidade de EAE após a nova provocação. Exemplo 4: Cepa A de Lactococcus lactis cremoris elou EVs deri- vadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em um modelo de camundongo de artrite induzida por colágeno (CIA)
[00268] A artrite induzida por colágeno (CIA) é um modelo animal comumente usado para estudar artrite reumatoide (RA), conforme descrito por Caplazi et al. (Mouse models of rhneumatoid arthritis. Vete- rinary Pathology. 1 de setembro de 2015. 52(5): 819 a 826) (consultar também Brand et al. Collagen-induced arthritis. Nature Protocols.
2007. 2: 1.269 a 1.275; Pietrosimone et al. Collagen-induced arthritis: a model for murine autoimmune arthritis. Bio Protoc. 20 de outubro de 2015; 5(20): e1626).
[00269] Entre outras versões do modelo de roedor com CIA, um modelo envolve a imunização de camundongos HLA-DQ8 Tg com co- lágeno tipo Il de galinha conforme descrito por Taneja et al. (J. Immu- nology. 2007. 56: 69 a 78; consultar também Taneja et al. J. Imnmuno- logy 2008. 181: 2.869 a 2.877; e Taneja et al. Arthritis Rheum., 2007. 56: 69 a 78). A purificação de CIl de galinha foi descrita por Taneja et al. (Arthritis Rheum., 2007. 56: 69 a 78). Os camundongos são monito- rados para início e progressão da doença CIA após imunização, e a gravidade da doença é avaliada e "classificada" conforme descrito por Wooley, J. Exp. Med. 1981. 154: 688 a 700.
[00270] Os camundongos são imunizados para indução de CIA e separados em vários grupos de tratamento. As composições bacteria-
nas contendo a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs deri- vadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris são testadas quanto à sua eficácia em CIA, isoladamente ou em combinação com todas as células bacterianas, com ou sem a adição de outros tratamentos com anti-inflamatório.
[00271] O tratamento com composição bacteriana contendo Cepa À de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lac- tococcus lactis cremoris é iniciado no momento da imunização com colágeno ou após a imunização. Por exemplo, em alguns grupos, a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa À de Lactococcus lactis cremoris podem ser administradas ao mesmo tempo que a imunização (dia 1), ou a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremo- ris podem ser administradas mediante os primeiros sinais de doença, ou mediante o início de sintomas graves. A cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é administrada em doses variadas e em intervalos definidos.
[00272] Por exemplo, alguns camundongos são injetados de forma intravenosa com a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em uma do- se entre 1x10º e 5x10º células bacterianas por camundongo. Embora alguns camundongos receberão a Cepa A de Lactococcus lactis cre- moris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção i.v., outros camundongos podem receber a Cepa À de Lactococcus lactis cremoris através de injeção intraperitoneal (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração. Alguns camundongos podem rece- ber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris todo dia (por exemplo, come- çando no dia 1), enquanto outros podem receber a Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias). Grupos adicionais de camundongos podem receber alguma razão de células bacterianas para a Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. As células bacterianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As células bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou podem ser irradiadas ou extermi- nadas por calor antes da administração.
[00273] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x10º e 5x10º células bacterianas em uma administração se- parada ou misturada com a administração da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou Evs derivadas da administração de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. Assim como com a Cepa A de Lactococ- cus lactis cremoris , a administração de células bacterianas pode ser variada em relação à via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir gavagem oral, injeção i.v., injeção 1.p., injeção subcutânea (s.c.), injeção intradérmica (i.d.) ou administração por via nasal.
[00274] — Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agente anti-inflamatório adicional (ou agentes anti-inflamatórios adicio- nais) ou agente terapêutico para CIA (ou terapêuticos para EAE) (por exemplo, anti-CD154, bloqueio de membros da família TNF, vitamina D ou outro tratamento), e/ou um controle adequado (por exemplo, veí- culo ou anticorpo de controle) em vários pontos no tempo e em doses eficazes.
[00275] — Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/I), ampici- lina (1,0 g/I), gentamicina (1,0 g/I) e anfotericina B (0,2 g/I) são adicio- nadas à água potável, e o tratamento com antibiótico é suspenso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem o recebimento de antibió-
ticos.
[00276] Em vários pontos no tempo, amostras séricas são obtidas para avaliar níveis de anticorpo IgG de CIl antigalinha e anticamun- dongo com o uso de um ELISA padrão (Batsalova et al. Comparative analysis of collagen type Il-specific immune responses during deve- lopment of collagen-induced arthritis in two B10 mouse strains. Arthritis Res Ther. 2012. 14(6): R237). Além disso, alguns camundongos são sacrificados, e os sítios de inflamação (por exemplo, sinóvia), linfono- dos ou outros tecidos podem ser removidos por análise histológica, de citocina e/ou citométrica de fluxo ex vivo com o uso dos métodos co- nhecidos na técnica. A sinóvia e o fluido sinovial serão analisados quanto à infiltração de células plasmáticas e à presença de anticorpos com o uso de técnicas conhecidas na arte. Além disso, os tecidos são dissociados com o uso de enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabricante para examinar os perfis dos infiltrados celula- res. As células são manchadas para análise por citometria de fluxo com o uso de técnicas conhecidas na arte. Os anticorpos de mancha- mento podem incluir anti-CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti- CDB86, anti-CD40, anti-MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Ou- tros marcadores que podem ser analisados incluem marcador de célu- las imunológicas pan CD45, marcadores de células T (CD3, CDA, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de macrófagos/mieloides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1IR, PD-L1, Gr-1, F4/80). Além da imunofenotipa- gem, citocinas séricas são analisadas incluindo, porém sem limitação, TNFa, IL-17, I1L-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1), IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP11I, RANTES, e MCP-1. A análise de citocina pode ser realizada em células imunológicas obti- das a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológi- cas infiltradas na sinóvia CD45+ purificadas obtidas ex vivo. Finalmen-
te, a imuno-histoquímica é realizada em várias seções de tecido para medir células T, macrófagos, células dendríticas e expressão de prote- íÍna na molécula de ponto de verificação.
[00277] Afim de examinar o impacto e a longevidade da proteção contra a doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser novamente provocados com um ativador de doença (por exemplo, reinjeção ativada com peptídeos indutores de CIA). Os ca- mundongos serão analisados quanto à suscetibilidade à doença e gra- vidade de CIA após a nova provocação. Exemplo 5: Cepa A de Lactococcus lactis cremoris elou EVs deri- vadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em um modelo de camundongo de Diabetes Tipo | (TID)
[00278] A diabetes tipo 1 (T1ID) é uma doença autoimune na qual o sistema imunológico alveja as ilhotas de Langerhans do pâncreas, destruindo, dessa maneira, a capacidade do corpo para produzir insu- lina.
[00279] Esses são diversos modelos de modelos de animal de T1D, conforme analisado por Belle et al. (Mouse models for type 1 diabetes. Drug Discov Today Dis Models. 2009; 6(2): 41 a 45; consulte também Aileen JF King. The use de modelos de animal in diabetes research. Br J Pharmacol. junho de 2012; 166(3): 877 a 894. Esses são modelos para T1D quimicamente induzido, T1D induzido por patógeno, bem como modelos nos quais os camundongos desenvolvem espontanea- mente T1D.
[00280] As composições bacterianas contendo a Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Lactococcus lactis cre- moris são testadas quanto à sua eficácia em um modelo de camun- dongo de T1D, isoladamente ou em combinação com todas as células bacterianas, com ou sem a adição de outros tratamentos com anti- inflamatório.
[00281] “Dependendo do método de indução de T1D e/ou se desen- volvimento de T1D é espontâneo, tratamento com Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é iniciado em algum momento, ou em torno do tempo de indução ou após indução, ou antes do início (ou mediante o início) de T1D de ocorrência espontânea.
A cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremo- ris é administrada em doses variadas e em intervalos definidos.
Por exemplo, alguns camundongos são injetados de forma intravenosa com a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em uma dose entre 1x10º e 5x10º células bacterianas por camundongo.
Outros camun- dongos podem receber 25, 50 ou 100 mg de cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris por camundongo.
Embora alguns camundongos receberão a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa À de Lactococcus lactis cremoris através de injeção i.v., outros camun- dongos podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris atra- vés de injeção intraperitoneal (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), adminis- tração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração.
Alguns camundongos podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Lactococcus lactis cremoris todo dia, enquanto outros podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cre- moris em intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias) Grupos adicionais de camundongos podem rece- ber alguma razão de células bacterianas para a Cepa A de Lactococ- cus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lac- tis cremoris.
As células bacterianas podem estar vivas, mortas ou en- fraquecidas.
As células bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou podem ser irradiadas ou extermina- das por calor antes da administração.
[00282] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x10º e 5x10º células bacterianas em uma administração se- parada ou misturada com a administração da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas da administração de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. Assim como com a Cepa A de Lactococ- cus lactis cremoris , a administração de células bacterianas pode ser variada em relação à via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir gavagem oral, injeção 1.v., injeção i.p. ou administração por via nasal.
[00283] Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com tratamentos adicionais e/ou um controle apropriado (por exemplo, veí- culo ou anticorpo de controle) em diversos pontos no tempo e em do- ses eficazes.
[00284] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/I), ampici- lina (1,0 g/I), gentamicina (1,0 g/I) e anfotericina B (0,2 g/I) são adicio- nadas à água potável, e o tratamento com antibiótico é suspenso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem o recebimento de antibió- ticos.
[00285] A glicose no sangue é monitorada a cada duas semanas antes do começo do experimento. Em diversos pontos no tempo, pos- teriormente, glicose no sangue sem jejum é medida. Em diversos pon- tos no tempo, camundongos são sacrificados e sítio do pâncreas, lin- fonodos, ou outros tecidos pode ser removido para análise ex vivo de histologia, citocina e/ou citometria de fluxo com o uso de métodos co- nhecidos na técnica. Por exemplo, os tecidos são dissociados com o uso de enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabri- cante. As células são manchadas para análise por citometria de fluxo com o uso de técnicas conhecidas na arte. Os anticorpos de mancha-
mento podem incluir anti-CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti- CDB86, anti-CD40, anti-MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Ou- tros marcadores que podem ser analisados incluem marcador de célu- las imunológicas pan CD45, marcadores de células T (CD3, CDA, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de macrófagos/mieloides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1IR, PD-L1, Gr-1, F4/80). Além da imunofenotipa- gem, citocinas séricas são analisadas incluindo, porém sem limitação, TNFa10, IL-6, IL-5, IL-4, I1L-2, IL-11, IPFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1I, RANTES, e MCP-1. A análise de citocina pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas de filtragem de tecido puri- ficadas obtidas ex vivo. Finalmente, a imuno-histoquímica é realizada em várias seções de tecido para medir células T, macrófagos, células dendríticas e expressão de proteína na molécula de ponto de verifica- ção. A produção de anticorpo também pode ser avaliada por ELISA.
[00286] A fim de examinar o impacto e longevidade de proteção contra doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser novamente confrontados com um desencadeador de doen- ça, ou avaliados para susceptibilidade a relapso. Os camundongos se- rão analisados para susceptibilidade a início de diabetes e gravidade após novo confrontamento (ou relapso de ocorrência espontânea). Exemplo 6: Cepa A de Lactococcus lactis cremoris elou EVs deri- vadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em um modelo de Colangite Esclerosante Primária (PSC)
[00287] A Colangite Esclerosante Primária (PSC) é uma doença crônica do fígado que danifica lentamente os dutos biliares e leva uma cirrose de fase terminal. A mesma é associada a doença inflamatória intestinal (IBD).
[00288] “Há diversos modelos de animal para PSC, conforme anali-
sado por Fickert et al. (Characterization of models of animals for pri- mary sclerosing cholangitis (PSC). J Hepatol. junho de 2014. 60(6):
1.290 a 1.303; consulte também Pollheimer e Fickert. Animal modelos in primary biliary cirrhosis e primary sclerosing cholangitis. Clin Rev Allergy Immunol. junho de 2015. 48(2-3): 207 a 217). A indução de do- ença em PSC modelos inclui indução química (por exemplo, colangite induzida por 3,5-dietoxicarbonil-1,4-di-hidrocolidina (DDC)), induzida por patógeno (por exemplo, Cryptosporidium parvum), obstrução biliar experimental (por exemplo, ligação de duto biliar comum (CBDL)) e modelo transgênico de camundongo de lesão biliar ocasionada por antígeno (por exemplo, camundongos transgênicos Ova-Bil). Por exemplo, a ligação de duto biliar é realizada conforme descrito por Georgiev et al. (Characterization of time-related changes after experi- mental bile duct ligation. Br J Surg. 2008. 95(5): 646 a 656), ou doença é induzida por exposição a DCC, conforme descrito por Fickert et al. (A new xenobiotic-induced mouse model of sclerosing cholangitis and bi- liary fibrosis. Am J Path. Volume 171(2): 525 a 536.
[00289] As composições bacterianas contendo a Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris são testadas quanto à sua eficácia em um modelo de camundongo de PSC, isoladamente ou em combinação com todas as células bacterianas, com ou sem a adição de algum outro agente tera- pêutico. Colangite induzida por DCC
[00290] — Por exemplo, camundongos C57bl/6 de 6 a 8 semanas são obtidos a partir de Taconic ou outro vendedor. Os camundongos são alimentados com uma dieta suplementada com 0,1% de DCC por di- versas durações. Alguns grupos receberão ração suplementada com DCC por 1 semana, outros por 4 semanas, outros por 8 semanas. Al- guns grupos de camundongos podem receber uma dieta suplementa-
da com DCC para uma duração de tempo e, então, podem se recupe- rar, posteriormente, recebendo uma dieta normal.
Esses camundongos podem ser estudados por sua capacidade de se recuperar de doença e/ou sua susceptibilidade a relapso mediante exposição subsequente a DCC.
O tratamento com cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é iniciado em algum ponto, no momento da alimentação com DCC ou subsequente à exposição inicial a DCC.
Por exemplo, a cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremo- ris podem ser administradas no dia 1, ou as mesmas podem ser admi- nistradas algum tempo em seguida.
A cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremo- ris é administrada em doses variadas e em intervalos definidos.
Por exemplo, alguns camundongos são injetados de forma intravenosa com a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em uma faixa entre 1x10º e 5x10º células bacterianas por camundongo.
Outros camun- dongos podem receber 25, 50, 100 mg de Cepa A de Lactococcus lac- tis cremoris por camundongo.
Embora alguns camundongos receberão a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção i.v., outros ca- mundongos podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção i.p., injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração.
Alguns ca- mundongos podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris todo dia (por exemplo, começando no dia 1), enquanto outros podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa À de Lactococcus lactis cremoris intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias). Grupos adicionais de camundongos podem receber alguma razão de células bacterianas para a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. As células bacterianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As células bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou as mesmas podem ser irradiadas ou exterminadas por calor antes da administra- ção. Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem receber en- tre 1x10º e 5x10º células bacterianas em uma administração separada ou misturada com a administração da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas da administração de Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris Assim como com a Cepa A de Lactococcus lac- tis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cre- moris, a administração de células bacterianas pode ser variada em re- lação à via de administração, dose e cronograma. Isso pode incluir ga- vagem oral, injeção i.v., injeção i.p. ou administração por via nasal. Al- guns grupos de camundongos podem ser tratados com agentes adici- onais e/ou um controle apropriado (por exemplo, veículo ou anticorpo) em diversos pontos no tempo e em doses eficazes.
[00291] — Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/I), ampici- lina (1,0 g/I), gentamicina (1,0 g/I) e anfotericina B (0,2 g/I) são adicio- nadas à água potável, e o tratamento com antibiótico é suspenso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem o recebimento de antibió- ticos. Em diversos pontos no tempo, amostras de soro são analisadas para ALT, AP, bilirubina e níveis de ácido de bile de soro (BA).
[00292] Em diversos pontos no tempo, camundongos são sacrifica- dos, peso corporal e de fígado são registrados, e sítios de inflamação (por exemplo, fígado, intestino grosso e delgado, baço), linfonodos, ou outros tecidos podem ser removidos para caracterização histomorfoló- gica ex vivo, citocina e/ou análise de citometria de fluxo com o uso de métodos conhecidos na técnica (consulte Fickert et al. Characterizati- on of models of animal for primary sclerosing cholangitis (PSC)). J He- patol. 2014. 60(6): 1.290 a 1.303). Por exemplo, dutos biliares são manchados para expressão de ICAM-1, VCAM-1, MadCAM-1. Alguns tecidos são manchados para examinação histológica, enquanto outros são dissociados com o uso de enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabricante. As células são manchadas para análise por citometria de fluxo com o uso de técnicas conhecidas na arte. Os anticorpos de manchamento podem incluir anti-CD11c (células dendrí- ticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII, anti-CD8a, anti- CD4 e anti-CD103. Outros marcadores que podem ser analisados in- cluem marcador de célula pan-imune CD45, marcadores de célula T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4), e marcadores de macrófago/mieloide (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSFIR, PD-L1, Gr-1, F4/80), bem como ex- pressão de molécula de adesão (ICAM-1, VCAM-1, MadCAM-1). Além da imunofenotipagem, citocinas séricas são analisadas incluindo, po- rém sem limitação, TNFa, IL-17, IL-13, I1L-12p70, IL12p40, I1L-10, IL-6, IL-5, IL-4, I1L-2, IL-11, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, 1IP10, MIP11I, RANTES, e MCP-1. A análise de citocina pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas filtradas por duto biliar CD45+ purifica- das obtidas ex vivo.
[00293] O tecido de fígado é preparado para análise histológica, por exemplo, com o uso de tingimento com vermelho Sirius seguido por quantificação da área fibrótica. No final do tratamento, sangue é cole- tado para análise de plasma de enzimas de fígado, por exemplo, AST ou ALT, e para determinar níveis de Bilirubina. O teor hepático de Hi- droxiprolina pode ser medido com o uso de protocolos estabelecidos. A análise de expressão gênica hepática de inflamação e marcadores de fibrose pode ser realizado por gqRT-PCR com o uso de iniciadores validados. Esses marcadores podem incluir, porém sem limitação, MCP-1, alfa-SMA, Collta1, e TIMP-. Medições de metabólito podem ser realizadas em plasma, tecido e amostras fecais com o uso de mé- todos metabolômicos estabelecidos. Finalmente, imuno-histoquímica é realizada em seções de fígado para medir neutrófilos, células T, ma- crófagos, células dendríticas, ou outros infiltrados de célula imune.
[00294] A fim de examinar o impacto e longevidade de proteção contra doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser novamente avaliados com DCC em um tempo posterior. Os camundongos serão analisados quanto à suscetibilidade à colangite e gravidade da colangite após a nova provocação. Colangite induzida por BDL
[00295] —Alternativamente, as composições bacterianas contendo a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa À de Lactococcus lactis cremoris são testadas quanto à sua eficácia em colangite induzida por BDL. Por exemplo, camundongos C57BI/6J de 6 a 8 semanas são obtidos a partir de Taconic ou outro vendedor. Após um período de aclimação, os camundongos são submetidos a um pro- cedimento cirúrgico para realizar uma ligação de duto biliar (BDL). Al- guns animais de controle recebem uma cirurgia simulada. O procedi- mento de BDL leva a lesão no fígado, inflamação e fibrose dentro de 7-21 dias.
[00296] O tratamento com cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é inicia- do em algum ponto, no momento da cirurgia ou em algum momento após a cirurgia. A cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs de- rivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é administrada em doses variadas e em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camun- dongos são injetados de forma intravenosa com a Cepa A de Lacto-
coccus lactis cremoris em uma faixa entre 1x10º e 5x10º células bacte- rianas por camundongo.
Outros camundongos podem receber 25, 50, 100 mg de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris por camundongo.
Embora alguns camundongos receberão a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção i.v., outros camundongos podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção i.p., injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração.
Alguns camundongos recebem a Cepa A de Lactococ- cus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Lactococcus lactis cremoris todo dia (por exemplo, começando no dia 1), enquanto outros podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias). Grupos adicionais de camundongos podem receber alguma razão de células bacterianas para a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris.
As células bacte- rianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas.
As mesmas célu- las bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e admi- nistradas, ou as mesmas podem ser irradiadas ou exterminadas por calor antes da administração.
Por exemplo, alguns grupos de camun- dongos podem receber entre 1x10º e 5x10º células bacterianas em uma administração separada ou misturada com a administração da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas da admi- nistração de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris.
Assim como com a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris, a administração de células bacteria- nas pode ser variada por via de administração, dose e cronograma |s- so pode incluir gavagem oral, injeção i.v., injeção i.p. ou administração por via nasal. Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agentes adicionais e/ou um controle apropriado (por exemplo, ve- ículo ou anticorpo) em diversos pontos no tempo e em doses eficazes.
[00297] — Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió- ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/I), ampici- lina (1,0 g/I), gentamicina (1,0 g/I) e anfotericina B (0,2 g/I) são adicio- nadas à água potável, e o tratamento com antibiótico é suspenso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem o recebimento de antibió- ticos. Em diversos pontos no tempo, amostras de soro são analisadas para ALT, AP, bilirubina e níveis de ácido de bile de soro (BA).
[00298] Em diversos pontos no tempo, camundongos são sacrifica- dos, peso corporal e de fígado são registrados, e sítios de inflamação (por exemplo, fígado, intestino grosso e delgado, baço), linfonodos, ou outros tecidos podem ser removidos para caracterização histomorfoló- gica ex vivo, citocina e/ou análise de citometria de fluxo com o uso de métodos conhecidos na técnica (consulte Fickert et al. Characterizati- on of models of animal for primary sclerosing cholangitis (PSC)). J He- patol. 2014. 60(6): 1.290 a 1.303). Por exemplo, dutos biliares são manchados para expressão de ICAM-1, VCAM-1, MadCAM-1. Alguns tecidos são manchados para examinação histológica, enquanto outros são dissociados com o uso de enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabricante. As células são manchadas para análise por citometria de fluxo com o uso de técnicas conhecidas na arte. Os anticorpos de manchamento podem incluir anti-CD11c (células dendrí- ticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII, anti-CD8a, anti- CD4 e anti-CD103. Outros marcadores que podem ser analisados in- cluem marcador de célula pan-imune CD45, marcadores de célula T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4), e marcadores de macrófago/mieloide (CD11b,
MHCII, CD206, CD40, CSFIR, PD-L1, Gr-1, F4/80), bem como ex- pressão de molécula de adesão (ICAM-1, VCAM-1, MadCAM-1). Além da imunofenotipagem, citocinas séricas são analisadas incluindo, po- rém sem limitação, TNFa, IL-17, IL-13, I1L-12p70, IL12p40, I1L-10, IL-6, IL-5, IL-4, I1L-2, IL-11, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, 1IP10, MIP11I, RANTES, e MCP-1. A análise de citocina pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas filtradas por duto biliar CD45+ purifica- das obtidas ex vivo.
[00299] O tecido de fígado é preparado para análise histológica, por exemplo, com o uso de tingimento com vermelho Sirius seguido por quantificação da área fibrótica. No final do tratamento, sangue é cole- tado para análise de plasma de enzimas de fígado, por exemplo, AST ou ALT, e para determinar níveis de Bilirubina. O teor hepático de Hi- droxiprolina pode ser medido com o uso de protocolos estabelecidos. A análise de expressão gênica hepática de inflamação e marcadores de fibrose pode ser realizado por gqRT-PCR com o uso de iniciadores validados. Esses marcadores podem incluir, porém sem limitação, MCP-1, alfa-SMA, Collta1, e TIMP-. Medições de metabólito podem ser realizadas em plasma, tecido e amostras fecais com o uso de mé- todos metabolômicos estabelecidos. Finalmente, imuno-histoquímica é realizada em seções de fígado para medir neutrófilos, células T, ma- crófagos, células dendríticas, ou outros infiltrados de célula imune.
[00300] A fim de examinar o impacto e longevidade de proteção contra doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser analisados para recuperação. Exemplo 7: A cepa A de Lactococcus lactis cremoris elou EVs de- rivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em um modelo de camundongo de Esteato-Hepatite Não Alcoólica (NASH).
[00301] A Esteato-Hepatite Não Alcoólica (NASH) é uma forma gra-
ve de Doença Gordurosa Não Alcoólica do Fígado (NAFLD), em que acúmulo de gordura hepática (esteatose) e inflamação levam a lesão de fígado e morte de célula de hepatócito (balonamento).
[00302] Há vários modelos animais de NASH, conforme revisado por Ibrahim et a/. (Animal models of nonalcoholic steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Dig Dis Sci. Maio de 2016. 61(5): 1.325 a 1.336; consulte também Lau et al. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: current perspectives and recent advances, janeiro de 2017. 241(1): 36 a 44).
[00303] As composições bacterianas contendo a Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris são testadas quanto à sua eficácia em um mo- delo de camundongo de NASH, isoladamente ou em combinação com todas as células bacterianas, com ou sem a adição de algum outro agente terapêutico Por exemplo, camundongos C57BI/6J com 8 a 10 semanas de idade, obtidos junto à Taconic (Germantown, NY) ou outro fornecedor, são colocados em uma dieta com deficiência de metionina colina (MCD) por um período de 4 a 8 semanas, durante o qual as ca- racterísticas de NASH serão desenvolvidas, incluindo esteatose, infla- mação, balonização e fibrose.
[00304] O tratamento com cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é inicia- do em algum ponto, no início da dieta, ou em algum ponto após o iní- cio da dieta (por exemplo, uma semana depois). Por exemplo, a cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris podem ser administradas no mesmo dia do início da dieta MCD. A cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é adminis- trada em doses variadas e em intervalos definidos. Por exemplo, al- guns camundongos são injetados de forma intravenosa com a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em doses entre 1x10º e 5x10º células bacterianas por camundongo. Outros camundongos podem receber 25, 50 ou 100 mg de cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris por camundongo. Embora alguns camundongos receberão a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção i.v., outros camundongos podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa À de Lactococcus lactis cremoris através de injeção intraperitoneal (i.p.), injeção subcutânea (s.c.), administração por via nasal, gavagem oral ou outros meios de administração. Alguns camundongos podem rece- ber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Lactococcus lactis cremoris todo dia (por exemplo, começando no dia 1), enquanto outros podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremo- ris intervalos alternados (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias). Grupos adicionais de camundongos podem receber alguma razão de células bacterianas para a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. As células bacterianas podem estar vivas, mortas ou enfra- quecidas. As células bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e administradas, ou podem ser irradiadas ou extermina- das por calor antes da administração.
[00305] — Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x10º e 5x10º células bacterianas em uma administração se- parada ou misturada com a administração da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas da administração de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. Assim como com a Cepa A de Lactococ- cus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lac- tis cremoris, a administração de células bacterianas pode ser variada em relação à via de administração, dose e cronograma.. Isso pode in-
cluir gavagem oral, injeção i.v., injeção 1.p. ou administração por via nasal. Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agen- te terapêutico (ou agentes terapêuticos) NASH adicional (por exemplo, agonistas de FXR, agonistas de PPAR, antagonistas de CCR2/5 ou outro tratamento) e/ou controle apropriado em diversos pontos no tempo e doses eficazes.
[00306] Em diversos pontos no tempo e/ou no final do tratamento, camundongos são sacrificados e fígado, intestino, sangue, fezes ou outros tecidos podem ser removidos para análise histológica ex vivo, bioquímica, molecular ou citocina e/ou citometria de fluxo com o uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, tecidos de fígado são pesados e preparados para análise histológica, que pode compre- ender tingimento com H&E, Vermelho Sirius e determinação de pontu- ação de atividade NASH (NAS). Em diversos pontos no tempo, sangue é coletado para análise de plasma de enzimas de fígado, por exemplo, AST ou ALT, com o uso de ensaios padrão. Além disso, o teor hepáti- co de colesterol, triglicerídeos, ou ácidos de ácido graxo podem ser medidos com o uso de protocolos estabelecidos. A análise de expres- são gênica hepática de inflamação, fibrose, esteatose, estresse por ER, ou marcadores de estresse oxidativos pode ser realizada por gqRT- PCR com o uso de iniciadores validados. Os marcadores podem inclu- ir, porém sem limitação, IL-6, MCP-1, alfa-SMA, Collia1, CHOP, e NRF2. Medições de metabólito podem ser realizadas em plasma, teci- do e amostras fecais com o uso de métodos metabolômicos à base de espectrometria de massa e bioquímica estabelecidos. As citocinas sé- ricas são analisadas incluindo, porém sem limitação, TNFa, I1L-17, IL- 13, IL-12p70, IL12p40, I1L-10, IL-6, IL-5, IL-4, I1L-2, IL-11, IFNy, GM- CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP11I, RANTES, e MCP-1. A análise de citocina pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas filtradas por duto biliar CD45+ purificadas obtidas ex vivo. Finalmente, imuno- histoquímica é realizada em seções de fígado ou intestino para medir neutrófilos, células T, macrófagos, células dendríticas, ou outros infil- trados de célula imune.
[00307] A fim de examinar o impacto e longevidade de proteção contra doença, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser analisados para recuperação. Exemplo 8: Cepa A de Lactococcus lactis cremoris elou EVs deri- vadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris em um modelo de camundongo de psoríase
[00308] Psoríase é uma doença de pele inflamatória crônica media- da por célula T. A chamada psoríase do "tipo placa" é a forma mais comum de psoríase e é tipificada por escalas secas, placas vermelhas e espessamento da pele devido à infiltração de células imunológicas na derme e epiderme. Diversos modelos de animal contribuíram para o entendimento dessa doença, conforme analisado por Gudjonsson et al. (Mouse models of psoriasis. J Invest Derm. 2007. 127: 1.292 a
1.308; consulte também van der Fits et al. Imiquimod-induced psoria- sis-like skin inflammation in mice is mediated via the I1L-23/IL-17 axis. J. Immunol. 1 de maio de 2009. 182(9): 5836 a 5845).
[00309] A psoríase pode ser induzida em uma variedade de mode- los de camundongo, incluindo aqueles que usam modelos transgêni- cos, knockout, ou xenoenxerto, bem como aplicação tópica de imiqui- mod (IMQ), um ligante TLR7/8.
[00310] As composições bacterianas contendo a Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris são testadas quanto à sua eficácia em um modelo de camundongo de psoríase, isoladamente ou em combinação com todas as células bacterianas, com ou sem a adição de outros tratamentos com anti-inflamatório Por exemplo, camundongos C57BI/6 ou Balb/c de 6 a 8 semanas são obtidos a partir de Taconic (Germantown, NY), ou outro vendedor. Os camundongos são raspados nas costas e na orelha direita. Grupos de camundongos recebem uma dose tópica diá- ria de 62,5 mg de creme IMQ comercialmente disponível (5%) (Aldara; 3M Pharmaceuticals). A dose é aplicada às áreas raspadas por 5 ou 6 dias consecutivos. Em intervalos regulares, camundongos são classifi- cados para eritema, escalonamento e espessamento em uma escala de O a 4, conforme descrito por van der Fits et al. (2009). Os camun- dongos são monitorados para espessura da orelha com o uso de um micrômetro Mitutoyo.
[00311] O tratamento com cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é inicia- do em algum ponto, no momento da primeira aplicação de IMQ ou posteriormente. Por exemplo, a cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris podem ser administradas ao mesmo tempo em que as injeções subcutâneas (dia O), ou as mesmas podem ser administradas antes da, ou median- te, aplicação. A cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs deri- vadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é administrada em doses variadas e em intervalos definidos. Por exemplo, alguns camun- dongos são injetados de forma intravenosa com a Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris em uma dose entre 1x10º e 5x10º células bacte- rianas por camundongo. Outros camundongos podem receber 25, 50, 100 mg de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris por camundongo. Embora alguns camundongos receberão a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção i.v., outros camundongos podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris através de injeção intraperitoneal (i.p.), administração por via nasal, gavagem oral, administração tópica, inje-
ção intradérmica (i.d.), injeção subcutânea (s.c.), ou outros meios de administração. Alguns camundongos podem receber a Cepa A de Lac- tococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Lactococcus lactis cremoris todo dia (por exemplo, começando no dia 0), enquanto outros podem receber a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs de- rivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris intervalos alterna- dos (por exemplo, a cada dois dias ou uma vez a cada três dias). Gru- pos adicionais de camundongos podem receber alguma razão de célu- las bacterianas para a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. As células bacterianas podem estar vivas, mortas ou enfraquecidas. As células bacterianas podem ser coletadas frescas (ou congeladas) e adminis- tradas, ou podem ser irradiadas ou exterminadas por calor antes da administração.
[00312] Por exemplo, alguns grupos de camundongos podem rece- ber entre 1x10º e 5x10º células bacterianas em uma administração se- parada ou misturada com a administração da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e/ou EVs derivadas da administração de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. Assim como com a Cepa A de Lactococ- cus lactis cremoris e/ou EVs derivadas de Cepa A de Lactococcus lac- tis cremoris, a administração de células bacterianas pode ser variada em relação à via de administração, dose e cronograma. Isso pode in- cluir gavagem oral, injeção i.v., injeção 1.p., injeção i.d., injeção s.c., administração tópica, ou administração por rota nasal.
[00313] Alguns grupos de camundongos podem ser tratados com agente anti-inflamatório (ou agentes anti-inflamatórios) (por exemplo, anti-CD154, bloqueio de membros da família TNF ou outro tratamen- to), e/ou um controle adequado (por exemplo, veículo ou anticorpo de controle) em vários pontos no tempo e em doses eficazes.
[00314] Além disso, alguns camundongos são tratados com antibió-
ticos antes do tratamento. Por exemplo, vancomicina (0,5 g/I), ampici- lina (1,0 g/I), gentamicina (1,0 g/I) e anfotericina B (0,2 g/I) são adicio- nadas à água potável, e o tratamento com antibiótico é suspenso no momento do tratamento ou poucos dias antes do tratamento. Alguns camundongos imunizados são tratados sem o recebimento de antibió- ticos.
[00315] Em diversos pontos no tempo, amostras da pele das costas e orelha são tomadas por análise de tingimento de criosecção com o uso de métodos conhecidos na técnica. Outros grupos de camundon- gos são sacrificados, e linfonodos, baço, linfonodos mesentéricos (MLN), o intestino delgado, cólon e outros tecidos podem ser removi- dos para estudos histológicos, análise histológica, de citocina e/ou ci- tométrica de fluxo ex vivo com o uso dos métodos conhecidos na téc- nica. Alguns tecidos podem ser dissociados com o uso de enzimas de dissociação de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de criosecção, as amostras de tecido, ou células obtidas ex vivo são manchadas para análise por citometria de fluxo com o uso de técnicas conhecidas na técnica. Os anticorpos de manchamento podem incluir anti-CD11c (células dendríticas), anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, an- ti-MHCII, anti-CD8a, anti-CD4 e anti-CD103. Outros marcadores que podem ser analisados incluem marcador de células imunológicas pan CDA45, marcadores de células T (CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Roryt, Granzima B, CD69, PD-1, CTLA-4) e marcadores de macrófagos/mieloides (CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSFIR, PD-L1, Gr-1, F4/80). Além da imunofenotipagem, citocinas séricas são anali- sadas incluindo, porém sem limitação, TNFa, IL-17, I1L-13, I1L-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-11, IPFNy, GM-CSF, G-CSF, M- CSF, MIG, IP10, MIP1I, RANTES, e MCP-1. A análise de citocina pode ser realizada em células imunológicas obtidas a partir de linfonodos ou outro tecido, e/ou em células imunológicas filtradas por pele CD45+ purificadas obtidas ex vivo. Finalmente, a imuno-histoquímica é reali- zada em várias seções de tecido para medir células T, macrófagos, células dendríticas e expressão de proteína na molécula de ponto de verificação.
[00316] A fim de examinar o impacto e longevidade de proteção contra psoríase, em vez de serem sacrificados, alguns camundongos podem ser estudados para avaliar recuperação, ou os mesmos podem ser analisados novamente com IMQ. Os grupos de camundongos pro- vocados novamente serão analisados quanto à suscetibilidade à pso- ríase e gravidade da resposta. Exemplo 9: Um estudo da segurança, tolerabilidade e eficácia de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris como um agente terapêu- tico oral para o tratamento de psoríase ou dermatite atópica entre branda e moderada
[00317] Um estudo clínico de Fase 1 de centro único realizado em que segurança, tolerabilidade e efeito farmacodinâmico preliminares da cepa A de Lactococcus lactis cremoris são determinados em parti- cipantes saudáveis e com psoríase ou dermatite atópica entre branda e moderada, porém que estão, de outro modo, bem.
[00318] Esteé um estudo clínico randomizado, controlado por pla- cebo, com escalonamentos e expansões de dose para avaliar segu- rança, tolerabilidade e efeito farmacodinâmico preliminares da cepa À de Lactococcus lactis cremoris , e é cego para o participante e investi- gador, não cego para o patrocinador, com doses ascendentes únicas e múltiplas. Esta investigação fornece uma oportunidade de obter infor- mações farmacodinâmicas usando uma variedade de biópsias de teci- dos e desfechos clínicos de compósito.
[00319] O estudo consiste em seis (6) coortes e testarão as doses de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris versus placebo. As três (3) coortes iniciais estão em voluntários saudáveis e estabelecerão a se-
gurança e a tolerabilidade da cepa A de Lactococcus lactis cremoris. Uma vez que isso foi estabelecido, a segurança e a tolerabilidade dos participantes com psoríase ou dermatite atópica serão testadas, jun- tamente com os efeitos farmacodinâmicos sobre o sistema imunológi- co sistêmico e observação de quaisquer efeitos clínicos.
[00320] Os grupos de tratamento são descritos na Tabela 7, e coor- tes adicionais opcionais podem ser adicionadas para incluir estudos de expansão de dose.
Tabela 7: Grupos e Intervenções Lo 12 voluntários saudáveis: Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é adminis- 1 8 na cepa A de Lactococcus lactis cremoris, 4 em placebo trada por via oral Dose = cápsula de 66mg, uma vez ao dia durante 15 dias Fármaco: cápsula oral de placebo 12 voluntários saudáveis: Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é adminis- 2 8 na cepa A de Lactococcus lactis cremoris, 4 em placebo trada por via oral Dose = cápsula de 660mg, uma vez ao dia durante 15 dias Fármaco: cápsula oral de placebo 12 voluntários saudáveis: Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é adminis- 8 Dose = cápsula de 3,3 g, uma vez ao dia durante 15 dias Fármaco: cápsula oral de placebo o 12 indivíduos com psoríase entre branda e moderada: Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é adminis- = 4 8 na cepa A de Lactococcus lactis cremoris, 4 em placebo trada por via oral Dose = cápsula de 660mg, uma vez ao dia, 29 dias Fármaco: cápsula oral de placebo 24 indivíduos com psoríase entre branda e moderada: Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é adminis- 16 na cepa A de Lactococcus lactis cremoris, 8 em placebo trada por via oral Dose = cápsula de 3,39, uma vez ao dia, 29 dias Fármaco: cápsula oral de placebo 24 indivíduos com dermatite entre branda e moderada: Cepa A de Lactococcus lactis cremoris é adminis- 16 na cepa A de Lactococcus lactis cremoris, 8 em placebo trada por via oral Dose = cápsula de 3,39, uma vez ao dia, 29 dias Fármaco: cápsula oral de placebo
[00321] O estudo tem pelo menos três (3) medidas de resultado: 1) segurança e tolerabilidade; 2) melhora clínica em indivíduos com pso- ríase entre branda e moderada; e 3) melhora clínica em indivíduos com dermatite atópica entre branda e moderada.
[00322] Para (1) Segurança e tolerabilidade, eventos adversos gra- ves (SAE), medições lab, medições de eletrocardiograma (ECG), me- dições de sinais vitais, exame físico, a escala de fezes de Bristol, mar- cadores de integridade GI e biomarcadores imunológicos são realiza- dos e avaliados; para (2) Melhoria clínica em indivíduos com psoríase entre branda e moderada, índice de pontuação da atividade da psoría- se (PASI), avaliação global dos investigadores (IGA), e pontuação de gravidade de lesão (LSS) são avaliados durante um período de 14 meses; e para (3) Melhora clínica em indivíduos com dermatite atópica entre branda e moderada, EASI, pontuação de gravidade da dermatite atópica (SCORAD), LSS, e IGA são avaliados durante um período de 14 meses.
[00323] As atividades antipsoríase e dermatite anti-atópica são ava- liadas pelo Investigador de acordo com critérios de resposta especiífi- cos de doença e descritos em termos de taxa de resposta objetiva, du- ração de resposta, sobrevivência livre de progressão, taxa de benefí- cio clínico, períodos de tempo livres de progressão, taxa de benefício clínico e controle de doença. Os investigadores buscarão aprimora- mento de linha de base no dia ou aproximadamente no dia 28 da do- sagem usando o PASI e o índice de pontuação de atividade de ecze- ma (EASI), ambos são conhecidos na técnica. Critérios de Inclusão e Exclusão:
[00324] Os critérios de inclusão para todas as partes do estudo in- cluem os seguintes:
1. O participante tem um índice de massa corporal de > 18kg/m2 a < 35kg/m2 na triagem.
2. Participantes que são explicitamente saudáveis, con- forme determinado pela avaliação médica, incluindo histórico médico, exame físico, exames laboratoriais e monitoramento cardíaco.
3. Para pacientes com psoríase entre branda e moderada: a. O participante teve um diagnóstico confirmado de psorí- ase do tipo placa entre branda e moderada durante pelo menos 6 me- ses que envolve < 5% de área de superfície do corpo (BSA) (excluindo o couro cabeludo).
b. O participante tem no mínimo 2 lesões psoriáticas com pelo menos 1 placa em um local adequado para biópsia.
4. Para pacientes com dermatite entre branda e modera- da: a. O participante apresenta dermatite atópica entre branda e moderada com um mínimo de 3 a um máximo de 15% de envolvi- mento de BSA.
b. O participante teve um diagnóstico confirmado de der- matite atópica entre branda a moderada durante pelo menos 6 meses com um escore IGA de 2 ou 3.
c. O participante tem no mínimo 2 lesões por dermatite atópica com pelo menos 1 em um local adequado para biópsia.
[00325] As seguintes categorias de paciente são excluídas do estudo:
1. Participante do sexo feminino que está grávida ou pla- neja engravidar durante o estudo, e/ou participante do sexo feminino que está amamentando ou é sexualmente ativa com potencial para engravidar que não está usando um método contraceptivo medica- mente aceito.
2. Participante que recebeu vacinação viva atenuada den- tro de 6 semanas antes da triagem ou pretende fazer tal vacinação du- rante o curso do estudo.
3. Participante recebeu qualquer fármaco experimental ou procedimento experimental dentro de 90 dias ou 5 meias-vidas, o que for mais longo, antes da administração da intervenção do estudo.
4. O participante exige tratamento com um fármaco anti- inflamatório durante o período de estudo. Será permitido o uso de pa- racetamol como um antipirético e/ou analgésico (máximo de 2 gra- mas/dia em qualquer período de 24 horas).
5. O participante apresenta uma infecção ativa (por exem- plo, sepse, pneumonia, abscesso) ou apresentou uma infecção que exige tratamento com antibióticos dentro de 6 semanas antes da ad- ministração do medicamento experimental (IMP). Em caso de dúvida, o pesquisador deve conversar com o médico do estudo do patrocina- dor.
6. O participante apresenta insuficiência renal ou hepática, definida como: a. Para voluntário saudáveis: i. para mulheres, nível sérico de creatinina 2125upumol/l; para homens, 2135 umol/l, ou ii: Alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) 21,5 x li- mite superior de normalidade (ULN), ou iii. Fosfatase alcalina (ALP) e/ou bilirrubina > 1,5 x ULN.
b. Para participantes com dermatite atópica entre branda e moderada, ou psoríase: i. Para mulheres, nível sérico de creatinina 2125 umol/l; para homens 2135 umol/l, ou ii. ALT ou AST > 2 x ULN e/ou bilirrubina > 1,5 x ULN.
Estudo de escalação de dose
[00326] Todos os pacientes recebem doses da cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris durante o período de tratamento, ou receberam uma toxicidade de limitação de dose (DLT) dentro do período de tra- tamento podem ser considerados avaliáveis para decisões de escala- ção de dose. As decisões de escalação de dose ocorrem quando o coorte de pacientes satisfez esses critérios.
[00327] Uma DLT é definida como um evento adverso (AE) ou valor de laboratório anormal que ocorre dentro dos primeiros 7 dias de tra- tamento com a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris, exceto para aqueles que são claramente e incontestavelmente devido à doença subjacente, progressão de doença ou causas estranhas. As decisões de escalação de dose ocorrem quando o coorte de pacientes satisfez esses critérios.
[00328] Para implementar as decisões de escalação de dose, as informações de toxicidade disponíveis (isto é, todas as AEs e todas as anomalias de laboratório, independente de avaliação de DLT) são ava- liadas pelos Investigadores de inscrição e os Patrocinadores médicos monitoram em uma reunião ou teleconferência de decisão de dose. As decisões são baseadas em uma avaliação de todos os dados relevan- tes disponíveis de todas as coortes de dose avaliadas no estudo em andamento. A administração de fármaco no seguinte coorte de dose superior não pode prosseguir até que o Investigador receba confirma- ção escrita do Patrocinador indicando que os resultados do coorte de dose anterior foram avaliados e que é permissível prosseguir para o próximo coorte de dose superior.
[00329] As escalações de dose intrapaciente são permitidas para todos os coortes após o nível de dose pretendido ter se mostrado se- guro (isto é, todos os pacientes tratados no nível de dose pretendido concluírem avaliações de DLT e < 1 paciente experimentar uma DLT). Exemplo 10 - Avaliação de deleção de gene em Cepas de Lacto- coccus lactis cremoris em um modelo de hipersensibilidade do tipo retardado baseado em KLH
[00330] A eficácia de Cepas de L. lactis cremoris que são desprovi- das de determinados plasmídeos foi avaliada. As cepas knockout fo- ram criadas usando técnicas de eletroporação conhecidas na técnica.
Resumidamente, células eletrocompetentes foram preparadas culti- vando a cepa de um dia para o outro em meio M17 (5g de digestão pancreática de caseína, 5g de peptona de soja, 5g de extrato de carne bovina, 2,5g de extrato de levedura, 0,5g de ácido ascórbico, 0,25g de MgSO4, 19g de B-glicerofosfato dissódico por 1) que incluía 1% de gli- cose. 2 ml de cultura de um dia para o outro foram inoculados com 50 ml de meio M17 e deixados desenvolver até uma densidade óptica em 600nm de 0,5 a 0,7 (cerca de 5 a 7h). A cultura foi, então, resfriada em gelo durante 10 min. As células foram centrifugadas durante 15 minu- tos em 3000g e ressuspensas em tampão de eletroporação (0,5M de Sacarose +10% de glicerol) que foi repetida mais 2 vezes. As células foram, então, ressuspensas em 500yul de tampão de eletroporação e separadas em alíquotas de 100ul e armazenadas a -80 ºC até a ele- troporação.
[00331] A eletroporação prosseguiu por descongelamento de célu- las no gelo antes da transferência para uma cubeta de eletroporação. As células foram, então, eletroporadas a 1,2kV para a Cepa A de Lac- tococcus lactis cremoris e 2,5 kV para a Cepa B de Lactococcus lactis cremoris. 900 ul de solução de recuperação (M17 + O0,5M (0,17g) de Sacarose + 0,5% (154I) de Glicose + 20mM (10ul) MgCI2 + 0,2 mM (10 ul) de CaCl2 por ml) foram, então, adicionados imediatamente. As células foram, então, mantidas em gelo durante 10 min. As células ele- troporadas foram subcultivadas 1:10 em meio M17 e incubadas duran- te 20 minutos a 30 “C antes da diluição e plaqueamento. As células foram, então, analisadas quanto à perda de plasmídeo por PCR.
[00332] Para elucidar o efeito das cepas sem os plasmídeos, as Cepas A e B de Lactococcus lactis cremoris (ambas com e sem plas- mídeos) foram avaliadas no modelo de DTH em camundongos. Como observado acima no Exemplo 1, os camundongos foram injetados com KLH e CFA i.d em 4 locais ao longo da parte traseira (50 ug por ca-
mundongo de KLH preparado em uma razão de 1:1 com CFA em um volume total de 50 ul por local). Os camundongos foram dosados du- rante 9 dias com 1x109 células viáveis por dia da seguinte forma: 1) PBS anaeróbica (veículo); 2) Cepa A de Lactococcus lactis cremoris; 3) Cepa A de Lactococcus lactis cremoris menos um plasmídeo de 13 kb; 4) Cepa B de Lactococcus lactis cremoris; 5) Cepas B de Lacto- coccus lactis cremoris menos um plasmídeo de 30 kb; e 6) Dexameta- sona (controle positivo). 24 horas após o desafio, a remoção de um plasmídeo de 13kb da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris reduziu a eficácia da cepa enquanto a remoção de um plasmídeo de 30kb da Cepa B de Lactococcus lactis cremoris melhorou a eficácia da cepa (Figura 4).
[00333] As cepas foram, então, sequenciadas para determinar os genes dentro do plasmídeo de 13kb da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris e o plasmídeo de 30kb da Cepa B de Lactococcus lactis cre- moris. Consultar a Tabela 5 e a Tabela 6.
Exemplo 11: Condições de fabricação
[00334] Meios enriquecidos são usados para cultivar e preparar a bactéria para uso in vitro e in vivo. Por exemplo, os meios podem con- ter açúcar, extratos de levedura, peptonas à base de planta, tampões, sais, elementos vestigiais, tensoativos, agentes anti-formação de es- puma e vitaminas. A composição de componentes complexos, como extratos de levedura e peptonas pode ser indefinida ou parcialmente definida (incluindo concentrações aproximadas de aminoácidos, açú- cares etc.). O metabolismo microbiano pode ser dependente da dispo- nibilidade de recursos, como carbono e nitrogênio. Diversos açúcares ou outras fontes de carbono podem ser testados. Alternativamente, os meios podem ser preparados e as bactéria selecionadas cultivadas conforme mostrado por Saarela et al., J. Applied Microbiology. 2005. 99: 1.330 a 1.339, que é aqui incorporado a título de referência. A in-
fluência do tempo de fermentação, crioprotetor e neutralização de con- centrado celular sobre a sobrevida de secagem por congelamento, es- tabilidade de armazenamento e exposição a ácido e bile da bactéria selecionada produzida sem ingredientes à base de leite.
[00335] Em grande escala, o meio é esterilizado. A esterilização pode ser processamento em Temperatura Ultra Alta (UHT). O proces- samento UHT é realizado em temperatura muito alta por períodos de tempo curtos. A faixa de UHT pode ser de 135 a 180 ºC. Por exemplo, o meio pode ser esterilizado entre 10 a 30 segundos a 135 ºC.
[00336] O inóculo pode ser preparado em frascos ou em biorreato- res menores e o crescimento é monitorado. Por exemplo, o tamanho de inóculo pode estar entre aproximadamente 0,5 e 3% do volume to- tal do biorreator. Dependendo da aplicação e necessidade de material, o biorreator volume pode ter pelo menos 2 |, 10 1, 80 1, 100 |, 250 |,
1.000 |, 2.500 |, 5.000 |, 10.000 |.
[00337] Antes da inoculação, o biorreator é preparado com meio em pH, temperatura e concentração de oxigênio desejados. O pH inicial do meio de cultura pode ser diferente do ponto de ajuste de processo. O estresse por pH pode ser prejudicial em baixa concentração celular; o pH inicial poderia estar entre pH 7,5 e o ponto de ajuste de processo. Por exemplo, o pH pode ser ajustado entre 4,5 e 8,0. Durante a fer- mentação, o pH pode ser controlado através do uso de hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou hidróxido de amônio. A temperatura pode ser controlada de 25 ºC a 45 ºC, por exemplo, a 37 ºC. As condi- ções anaeróbicas são criadas reduzindo-se o nível de oxigênio no cal- do de cultura de cerca de 8 mg/l a O mg/l. Por exemplo, nitrogênio ou misturas de gás (N2, CO2 e H2) podem ser usados a fim de estabele- cer condições anaeróbicas. Alternativamente, nenhum gás é usado e condições anaeróbicas são estabelecidas por células que consomem o oxigênio restante do meio. Dependendo da cepa e tamanho de inócu-
lo, o tempo de fermentação em biorreator pode variar. Por exemplo, o tempo de fermentação pode variar de aproximadamente 5 horas a 48 horas.
[00338] Reviver micróbios de um estado congelado pode exigir considerações especiais. O meio de produção pode estressar células após um descongelamento; um meio de descongelamento específico pode ser necessário para iniciar consistentemente uma série de se- mentes de material descongelado. A cinética de transferência ou pas- sagem de material de semente a meio fresco, para os propósitos de aumentar o volume de semente ou manter o estado de crescimento microbiano, pode ser influenciada pelo estado atual dos micróbios (por exemplo, crescimento exponencial, crescimento estacionário, sem es- tresse, com estresse).
[00339] A inoculação do fermentador (ou fermentadores) de produ- ção pode impactar a cinética de crescimento e a atividade celular. O estado inicial do sistema de biorreator precisa ser otimizado para facili- tar a produção bem-sucedida e consistente. A fração entre cultura de semente e o meio total (por exemplo, uma porcentagem) tem um im- pacto drástico sobre a cinética de crescimento. A faixa pode ser 1 a 5% do volume de trabalho do fermentador. O pH inicial do meio de cul- tura pode ser diferente do ponto de ajuste de processo. O estresse por pH pode ser prejudicial em baixa concentração celular; o pH inicial po- de estar entre pH 7,5 e o ponto de ajuste de processo. A agitação e o fluxo de gás no sistema durante a inoculação podem ser diferentes dos pontos de ajuste do processo. Estresses físicos e químicos devido a ambas as condições podem ser prejudiciais em concentração celular baixa.
[00340] As condições de processo e configurações de controle po- dem influenciar a cinética de crescimento microbiano e atividade celu- lar. Os deslocamentos em condições de processo podem alterar a composição da membrana, a produção de metabólitos, taxa de cres- cimento, estresse celular, etc. A faixa de temperatura ideal para cres- cimento pode variar com a cepa. A faixa pode ser 20 a 40 ºC. O pH ideal para crescimento e desempenho de atividade a jusante pode va- riar com a cepa. A faixa pode ser pH 5 a 8. Os gases dissolvidos no meio podem ser usados por células para metabolismo. Pode ser ne- cessário ajustar as concentrações de O2, CO> e N> por todo o proces- so. A disponibilidade de nutrientes pode se deslocar o crescimento ce- lular. Os micróbios podem ter cinética alternativa quando nutrientes em excesso estão disponíveis.
[00341] O estado de micróbios na extremidade de uma fermentação e durante a coleta pode impactar a sobrevida e a atividade celulares. Os micróbios podem ser precondicionados brevemente antes da coleta para preparar melhor os mesmos para os estresses físicos e químicos envolvidos na separação e processamento a jusante. Uma alteração em temperatura (frequentemente reduzindo a 20 a 5 ºC) pode reduzir o metabolismo celular, retardando o crescimento (e/ou morte) e altera- ção fisiológica quando removida do fermentador. A efetividade de con- centração centrífuga pode ser influenciada pelo pH da cultura. Elevar o pH em 1 a 2 pontos pode melhorar a eficácia de concentração, mas pode ser também prejudicial às células. Os micróbios podem ser es- tressados brevemente antes da coleta por aumento da concentração de sais e/ou açúcares no meio. As células estressadas dessa forma podem sobreviver melhor ao congelamento e liofilização durante a ju- sante.
[00342] Os métodos e tecnologia de separação podem impactar em quão eficientemente os micróbios são separados do meio de cultura. Os sólidos podem ser removidos com o uso de técnicas de centrifuga- ção. A efetividade de concentração centrífuga pode ser influenciada por pH de cultura ou com o uso de agentes de floculação. Elevar o pH em 1 a 2 pontos pode melhorar a eficácia de concentração, mas pode ser também prejudicial às células. Os micróbios podem ser estressa- dos brevemente antes da coleta por aumento da concentração de sais e/ou açúcares no meio. As células estressadas dessa forma podem sobreviver melhor ao congelamento e liofilização durante a jusante. Adicionalmente, micróbios podem ser também separados por meio de filtração. A filtração é superior às técnicas de centrifugação para purifi- cação se as células exigirem g minutos para centrifugação bem- sucedida. Os excipientes podem ser adicionados antes da separação. Os excipientes podem ser adicionados para crioproteção ou para pro- teção durante a liofilização. Os excipientes podem incluir, porém sem limitação, sacarose, trealose ou lactose, e os mesmos podem ser al- ternativamente misturados com tampão e antioxidantes. Antes da liofi- lização, gotículas de aglomerados celulares misturadas com excipien- tes são submersas em nitrogênio líquido.
[00343] A coleta pode ser realizada por centrifugação contínua. O produto pode ser ressuspensa com vários excipientes até uma con- centração final desejada. Os excipientes podem ser adicionados para crioproteção ou para proteção durante a liofiização. Os excipientes podem incluir, porém sem limitação, sacarose, trealose ou lactose, e os mesmos podem ser alternativamente misturados com tampão e an- tioxidantes. Antes da liofilização, gotículas de aglomerados celulares misturadas com excipientes são submersas em nitrogênio líquido.
[00344] A lliofilização de material, incluindo bactérias vivas, começa com a secagem primária. Durante a fase de secagem primária, o gelo é removido. Aqui, um vácuo é gerado e uma quantidade adequada de calor é fornecida ao material para o gelo sublimar. Durante a fase de secagem secundária, as moléculas de água ligadas a produto são re- movidas. Aqui, a temperatura é elevada até ser mais alta que na fase de secagem primária para quebrar quaisquer interações físico-
químicas que se formaram entre as moléculas de água e o material de produto. A pressão pode ser também reduzida adicionalmente para aumentar a dessorção durante esse estágio. Após o processo de se- cagem por congelamento ser concluído, a câmara pode ser preenchi- da com um gás inerte, tal como nitrogênio. O produto pode ser vedado dentro do secador por congelamento sob condições secas, impedindo a exposição à água atmosférica e contaminantes. Exemplo 12: Modelo de Camundongo com Hipersensibilidade de Tipo Retardado por Transferência Adotiva (AdDTH)
[00345] — Resumidamente, os camundongos foram adquiridos junto à Jackson Labs e a aclimatação permitida no viveiro por 1 semana antes do início do experimento. Os camundongos são alojados, 5 animais por gaiola, em gaiolas individualmente ventiladas com revestimento e enriquecimento padrão. A dieta padrão para roedores Purina (5001) e água autoclavada são fornecidas ad libitum e verificadas diariamente. As gaiolas ventiladas são trocadas uma vez por semana. As salas de alojamento de animais passam por um ciclo de iluminação que consis- te em 12 horas ligada e 12 horas desligada. Pisos, paredes e tetos são higienizados uma vez por mês e as salas mantêm uma faixa de umi- dade entre 30% a 70% e uma faixa de temperatura entre 20 a 26,11 graus Celsius (68 a 79 graus Fahrenheit). As verificações de saúde dos animais são feitas duas vezes ao dia.
[00346] No dia1,os camundongos BALB/c receptores foram adoti- vamente transferidos com 1X10º8 DO11. Linfócitos TOR Tg (i.p.).
[00347] Nodia0O,os camundongos foram anestesiados com isoflu- rano (um de cada vez) e seu dorso foi raspado. Os camundongos fo- ram injetados de forma subcutânea em 4 locais no dorso com 50 ul de Ovalbumina em emulsão de CFA (Hooke Labs catalog*t EK-0301).
[00348] “Uma solução estoque de dexametasona (17 mg/ml) foi cri- ada pela ressuspensão de 6,8 mg de dexametasona em 400 ul de eta-
nol a 96%. Para cada dia de dosagem, uma solução de trabalho é pre- parada diluindo a solução estoque 100x em PBS estéril para obter uma concentração final de 0,17 mg/ml em um frasco de septo para do- sagem intraperitoneal. Os camundongos tratados com dexametasona receberam 100 ul de Dexametasona i.p. (5 ml/kg de uma solução de 0,17 mg/ml). Sacarose congelada serviu como o controle negativo (ve- ículo). A Cepa A de Lactococcus lactis cremoris foi dosada em 100ul de células bacterianas a 1x10º10 CFU/ml diariamente. Dexametasona (controle positivo), veículo (controle negativo), e a Cepa A de Lacto- coccus lactis cremoris foram dosados diariamente.
[00349] “Nos dias 1a9,os camundongos foram submetidos à gava- gem ora (grupos 1 e 3) ou injetados por via intraperitoneal (i.p. grupo 2).
[00350] No dia38, após todos os camundongos serem submetidos à gavagem, cada camundongo foi anestesiado com isoflurano e uma medição de orelha esquerda de linha de base foi obtida usando cali- bres Fowler. Então, 10 ul de OVA323-339 (Invivogen) (dissolvido em PBS estéril a uma concentração de 1 mg/ml) foram injetados intrader- micamente na orelha esquerda. Conforme mostrado na Figura 5, a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris reduz o inchaço da orelha antí- geno-específico (espessura da orelha) em comparação com o veículo (controle negativo), e anti-inflamatório Dexametasona (controle positi- vo), em um Modelo de Camundongo com hipersensibilidade do tipo retardado por transferência adotiva (AdDTH) baseada em OVA.
[00351] No dia9, uma medição da orelha em 24 horas foi obtida usando calibres Fowler e os camundongos foram sacrificados e teci- dos como baço, linfonodos cervicais drenantes e linfonodos mesenté- ricos foram coletados para processamento ex vivo.
[00352] As suspensões de tecidos de células únicas foram prepara- das, contadas e plaqueadas para 200.000 células/poço e reestimula-
das com LPS e PMA/lonomicina durante 48 horas ou com peptídeo OVAS323-339 ou deixadas não estimuladas por 72 horas. Os sobrena- dantes foram coletados no final da estimulações e usados para análi- ses MSD ou Luminex a jusante.
[00353] “Conforme mostrado nas Figuras 6A, 6B e 6C, a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris reduz a expressão de IL-12p70 (Figura 6A), 11-22 (Figura 6B) e KC (Figura 6C) em um Modelo de Camundon- go com Hipersensibilidade de Tipo Retardado por Transferência Adoti- va (AdDTH). O círculo representa veículo, o quadrado representa de- xametasona e o triângulo representa a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris. Exemplo 13: Modelo de camundongo de psoríase por imiquimode
[00354] O modelo de psoríase por imiquimode é um modelo de in- flamação cutânea por Th17. Os camundongos desenvolveram a des- camação da pele e eritema que imita algumas patologias associadas à psoríase humana que é pontuada em uma escala de O a 4. Adicional- mente, uma inflamação da orelha pode ser avaliada similar à DTH.
[00355] — Resumidamente, os camundongos foram adquiridos junto à Taconic Labs e a aclimatação permitida no viveiro por | semana antes do início do experimento. Os camundongos são alojados, 5 animais por gaiola, em gaiolas individualmente ventiladas com revestimento e enriquecimento padrão. A dieta padrão para roedores Purina (5001) e água autoclavada são fornecidas ad libitum e verificadas diariamente. As gaiolas ventiladas são trocadas uma vez por semana. As salas de alojamento de animais passam por um ciclo de iluminação que consis- te em 12 horas ligada e 12 horas desligada. Pisos, paredes e tetos são higienizados uma vez por mês e as salas mantêm uma faixa de umi- dade entre 30% a 70% e uma faixa de temperatura entre 20 a 26,11 graus Celsius (68 a 79 graus Fahrenheit). As verificações de saúde dos animais são feitas duas vezes ao dia.
[00356] Uma solução estoque de dexametasona (17 mg/ml) foi cri- ada pela ressuspensão de 6,8 mg de dexametasona em 400 ul de eta- nol a 96%. Para cada dia de dosagem, uma solução de trabalho é pre- parada diluindo a solução estoque 100x em PBS estéril para obter uma concentração final de 0,17 mg/ml em um frasco de septo para do- sagem intraperitoneal. Os camundongos tratados com dexametasona receberam 100 ul de Dexametasona i.p. (5 ml/kg de uma solução de 0,17 mg/ml). Sacarose congelada serviu como o controle negativo (ve- ículo). A Cepa A de Lactococcus lactis cremoris foi dosada em 100ul de células bacterianas a 1x10º10 CFU/ml p.o. diariamente. Dexameta- sona (controle positivo), veículo (controle negativo), e a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris foram dosados diariamente.
[00357] No Dia O, os dorsos de camundongos foram raspados e depilados com Nair (-25 seg). O Nair é então limpo e os dorsos de camundongos lavados com água morna (2X).
[00358] Nos Dias 1 a 7, Aldara (5% de Imiquimode 62,5mg por ca- mundongo) ou creme de controle é aplicado nos dorsos de camun- dongos. O creme é espalhado novamente para garantir uma aplicação uniforme. Todos os dias uma pontuação de inflamação cutânea é re- gistrada.
[00359] No Dia 38, punches cutâneos posteriores são coletados para análises de RNA a jusante. As pontuações de inflamação cutânea são avaliadas com base na seguinte escala: O — normal, sem reação; 1 — eritema leve; 2 — eritema entre moderado a grave e algumas placas; 3 — eritema e placas marcados; 4- eritema e placas muito marcados. Conforme representada na Figura 7, a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris aprimorou os escores de inflamação cutânea em um modelo de psoríase por imiquimode em comparação com o creme de controle, veículo e dexametasona.
Incorporação a Título de Referência
[00360] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no presente documento são incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade como se cada publicação indivi- dual ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado estando incorporado a título de referência. Em caso de conflito, preva- lecerá o presente pedido, incluindo as definições no presente docu- mento. Equivalentes
[00361] Os peritos na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que a experimentação de rotina, mui- tos equivalentes das modalidades específicas da invenção descrita neste documento. Tais equivalentes são destinados a serem abrangi- dos pelas reivindicações a seguir.

Claims (94)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para tratar um distúrbio imunológico em um sujei- to, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma composição bacteriana que compreende uma cepa de Lactococ- cus imunomoduladora
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa de Lactococcus imunomoduladora é uma cepa que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência genô- mica, de 168 e/ou de CRISPR com a sequência de nucleotídeos da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA-125368).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa de Lactococcus imunomoduladora é uma cepa que compreende pelo menos 99% de identidade de sequência genô- mica, de 168 e/ou de CRISPR com a sequência de nucleotídeos da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA-125368).
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa de Lactococcus imunomoduladora é a Cepa À de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA- 125368).
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende vesículas ex- tracelulares (EVs) da cepa de Lactococcus imunomoduladora e bacté- rias da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%,
41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 13%, T4%, 15%, 16%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora e partículas de bacté- rias da cepa de Lactococcus imunomoduladoras na composição far- macêutica são EVs de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, ou 99% da EV de cepa de Lacto- coccus imunomoduladora total e partículas de bactérias na composi- ção farmacêutica são bactérias de cepa de Lactococcus imunomodu- ladora.
8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 13%, T4%, 15%, 16%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora total e proteína de bac-
térias da cepa de Lactococcus imunomoduladoras na composição far- macêutica são uma proteína de EV de cepa de Lactococcus imuno- moduladora.
9. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 13%, T4%, 15%, 16%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora total e proteína de bac- térias da cepa de Lactococcus imunomoduladora na composição far- macêutica são uma proteína de bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
10. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 13%, T4%, 15%, 16%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora e lipídeos de bactérias na composição farmacêutica são lipídeos de EV de cepa de Lactococ- cus imunomoduladora.
11. Método, de acordo com a reivindicação 5, composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 103Favor verificar relação de dependência, caracterizado pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, T5%, 16%, 177%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da EV de cepa de Lactococcus imunomodu- ladora total, lipídeos de bactérias da cepa de Lactococcus imunomodu- ladora na composição farmacêutica são lipídeos de bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladora isoladas de EVs.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o distúrbio imunológico é selecionado a partir de uma reação alérgica, doença inflamatória, do- ença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, hiper- sensibilidade tardia, miocardite autoimune, granulomas, neuropatias periféricas, tireoidite de Hashimoto, inflamação do cólon, colite, colite microscópica, colite colagenosa, colite por derivação, colite química, colite isquêmica, colite indeterminada, colite atípica, esclerose múltipla, doença de Hashimoto, doença alérgica, alergia alimentar, polenose, asma, uma doença infecciosa, uma infecção por Clostridium difficile, uma doença inflamatória, uma doença inflamatória mediada por TNF, uma doença inflamatória do trato gastrointestinal, pouquite, uma con-
dição inflamatória cardiovascular, aterosclerose, uma doença inflama- tória pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica, artrite, osteoartri- te, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, artrite infecciosa aguda e crônica, artrite associada à gota e pseudogota, ar- trite idiopática juvenil, tendinite, sinovite, tenossinovite, bursite, fibrosi- te, fibromialgia, epicondilite, miosite e osteíte, doença de Paget, osteíte pubiana, osteíte fibrosa cística, distúrbios imunológicos oculares, ble- farite, blefarocálase, conjuntivite, dacrioadenite, queratite, ceratocon- juntivite seca (olho seco), esclerite, triciquíase, uveite, sistema nervoso imune, encefalite, síndrome de Guillain-Barre, meningite, neuromioto- nia, narcolepsia, esclerose múltipla, mielite, esquizofrenia, inflamação da vasculatura ou sistema linfático, arteriosclerose, artrite, flebite, vas- culite, linfangite, distúrbios imunológicos do sistema digestivo, colangi- te, colecistite, enterite, enterocolite, gastrite, gastroenterite, ileíte, proc- tite, síndrome do intestino irritável, colite microscópica, enterite linfocí- tico-plasmocítica, doença celíaca, colite colagenosa, colite linfocítica, enterocolite eosinofílica, colite indeterminada, colite pseudomembra- nosa (colite necrosante), doença inflamatória intestinal isquêmica, do- ença de Behçet, sarcoidose, esclerodermia, displasia associada a IBD, massas ou lesões associadas a displasia, colangite esclerosante pri- mária, distúrbios imunológicos do sistema reprodutor, cervicite, corio- amnionite, endometrite, epididimite, onfalite, ooforite, orquite, salpingi- te, abscesso ovariano, uretrite, vaginite, vulvite, vulvodínia, condições autoimunes, alopecia disseminada aguda universal, doença de Behcet, doença de Chagas, síndrome de fadiga crônica, disautonomia, encefa- lomielite, espondilite anquilosante, anemia aplástica, hidradenite supu- rativa, hepatite autoimune, ooforite autoimune, doença celíaca, diabe- tes mellitus tipo 1, arterite de células gigantes, síndrome de Goodpas- ture, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre, púrpura de He- noch-Schonlein, Doença de Kawasaki, lúpus eritematoso, colite mi-
croscópica, poliarterite microscópica, doença mista do tecido conjunti- vo, síndrome de Muckle-Wells, esclerose múltipla, miastenia grave, síndrome do opsoclonus mioclonus, neurite óptica, tireoidite de Ord, pênfigo, poliarterite nodosa, polimialgia, artrite reumatoide, síndrome de Reiter, síndrome de Sjogren, arterite temporal, granulomatose de Wegener, anemia hemolítica autoimune tipo quente, cistite intersticial, doença de Lyme, morfeia, psoríase, sarcoidose, esclerodermia, colite ulcerosa, vitiligo, doenças de hipersensibilidade mediada por células T, hipersensibilidade de contato, dermatite de contato, urticária, alergias de pele, alergias respiratórias, febre do feno, rinite alérgica, alergia ao ácaros, enteropatia sensível ao glúten, doença celíaca, apendicite, dermatite, dermatomiosite, endocardite, fibrosite, gengivite, glossite, hepatite, hidradenite supurativa , irite, laringite, mastite, miocardite, ne- frite, otite, pancreatite, parotite, pericardite, peritonoite, faringite, pleuri- te, pneumonite, prostatite, pielonefrite, estomatismo, rejeição de trans- plante, pancreatite aguda, pancreatite crônica, síndrome do desconfor- to respiratório agudo, Síndrome de Sexary, hiperplase adrenal congê- nita, tireoidite não supurativa, hipercalcemia associada a câncer, pên- figo, dermatite bolhosa herpetiforme, eritema multiforme grave, derma- tite esfoliativa, dermatite seborreica, rinite alérgica sazonal ou perene, asma brônquica, dermatite de contato, dermatite atópica, reações de hipersensibilidade a fármacos, conjuntivite alérgica, ceratite, herpes zoster oftálmico, irite e oiridociíclite, coriorretinite, neurite óptica, sar- coidose sintomática, quimioterapia em tuberculose pulmonar fulminan- te ou disseminada, púrpura trombocitopenia idiopática em adultos, trombocitopenia secundária em adultos, púrpura trombocitopênica em adultos, trombocitopenia secundária em adultos, anemia hemolítica adquirida (autoimune), leucemia e linfomas em adultos, leucemia agu- da da infância, enterite regional, vasculite autoimune, esclerose múlti- pla, doença pulmonar obstrutiva crônica, rejeição de transplante de órgãos sólidos, sepse, artrite reumatoide, artrite psoriática, esclerose múltipla, diabetes tipo 1, asma, doença inflamatória do intestino, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, doença pulmonar obstrutiva crônica, inflamação que acompanha condições infecciosas e sepse.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o distúrbio imunológico é hipersensibilidade de tipo retardado, dermatite alérgica de contato, mi- ocardite autoimune, diabetes mellitus tipo 1, granulomas, neuropatias periféricas, tireoidite de Hashimoto, esclerose múltipla, artrite reuma- toide, inflamação do cólon, colite, colite ulcerativa, colite microscópica, colite colagenosa, colite por derivação, colite química, colite isquêmica, colite indeterminada, colite atípica, doenças digestivas, doença de Crohn, ou doença inflamatória intestinal
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a composição bacteri- ana é administrada por via oral, por via retal, por via intravenosa, por via intratumoral ou por via subcutânea.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos 50% das bac- térias na composição bacteriana são a cepa de Lactococcus imuno- moduladora.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos 90% das bac- térias na composição bacteriana são a cepa de Lactococcus imuno- moduladora.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que substancialmente todas as bactérias na composição bacteriana são a cepa de Lactococcus imu- nomoduladora.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende pelo menos 1 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs) da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que a composição bacteriana compreende pelo menos 1 x 107 CFUs da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende pelo menos 1 x 108 CFUs da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa de Lactococcus compreende uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos como identificado na Tabela
6.
23. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 22, carac- terizado pelo fato de que a cepa de Lactococcus é isenta ou substan- cialmente isenta de uma proteína que tem uma sequência de aminoá- cidos como identificado na Tabela 5.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, carac- terizado pelo fato de que a cepa de Lactococcus compreende uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos como identificado na Tabela 6 e é isenta ou substancialmente isenta de uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos como identificado na Tabela 5.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana é administrada em duas ou mais doses.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que a administração ao sujeito das duas ou mais doses é separada por pelo menos 1 dia.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato de que a administração das duas ou mais doses é sepa-
rada por pelo menos 1 semana.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias vivas.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 28, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias atenuadas.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções | a 29, caracterizado pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias mortas.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias irradiadas.
32. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que a composição bacteriana compreende bactérias submetidas à irradiação gama.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a administração da com- posição bacteriana trata o distúrbio imunológico.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 22, caracterizado pelo fato de que administração da composi- ção bacteriana induz uma resposta imunológica.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o método compreende adi- cionalmente administrar ao sujeito um agente terapêutico adicional.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracteriza- do pelo fato de que o agente terapêutico adicional é selecionado den- tre o grupo que consiste em agente imunossupressor, uma DMARD, um fármaco de controle de dor, um esteroide, um fármaco anti- inflamatório não esteroide (NSAID), um antagonista de citocina, ciclos-
porina, retinoides, corticosteroides, derivado de ácido propiônico, deri- vado de ácido acético, derivados de ácido enólico, derivados de ácido fenâmico, inibidores de Cox-2, lumiracoxibe, ibuprofeno, magnésio sa- licilato de colina, fenoprofeno, salsalato, difunisal, tolmetina, cetoprofe- no, flurbiprofeno, oxaprozina, indometacina, sulindac, etodolac, cetoro- lac, nabumetona, naproxeno, valdecoxibe, etoricoxibe, MKO0966; ro- fecoxibe, acetominofeno, celecoxibe, diclofenaco, tramadol, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, droxicam, lornoxicam, isoxicam, ácido mefe- nâmico, ácido meclofenâmico, ácido flufenâmico, tolfenâmico, val- decoxibe, parecoxibe, etodolac, indometacina, aspirina, ibuprofeno, firocoxibe, metotrexato (MTX), fármacos antimaláricos, hidroxicloroqui- na, cloroquina, sulfassalazina, leflunomida, azatioprina, ciclosporina, sais de ouro, minociclina, ciclofosfamida, D-penicilamina, minociclina, auranofina, tacrolimos, miocrisina, clorambucila, antagonistas de TNF alfa, antagonistas de TNF alfa, antagonistas do receptor de TNF alfa, ADALIMUMABE (Humira&), ETANERCEPT (EnbrelO), INFLIXIMABE (Remicade&; TA-650)) CERTOLIZUMABE PEGOL (Cimzia€; CDP870), GOLIMUMABE (SimpomO; CNTO 148), ANAKINRA (Kine- ret&), RITUXIMABE (RituxanO:; MabThera&G), ABATACEPT (Oren- cia&O), TOCILIZUMABE (RoActemra /ActemraO), antagonistas de inte- grina, TYSABRIG (natalizumabe)), antagonistas de IL-1, ACZ885 (lla- ris), Anakinra (KineretO), antagonistas de CDA4, antagonistas de IL-23, antagonistas de |1L-20, antagonistas de IL-6, antagonistas de BLyS, Atacicept, Benlysta&/ LymphoStat-BO (belimumabe)), inibidores de p38, antagonistas de CD20, Ocrelizumabe, Ofatumumabe (ArzerraO)), antagonistas de interferon gama, Fontolizumabe, prednisolona, Pred- nisona, dexametasona, Cortisol, cortisona, hidrocortisona, metilpred- nisolona, betametasona, triancinolona, beclometasoma, fludrocortiso- na, desoxicorticosterona, aldosterona, Doxiciclina, vancomicina, piogli- tazona, SBI-087, SCIO-469, Cura-100, Oncoxina + Viusida, TwHF, Me-
toxsaleno, Vitamina D - ergocalciferol, Milnaciprano, Paclitaxel, rosig tazona, Tacrolimus, Prograf&, RADOO!I, rapamune, rapamicina, fosta- matinibe, Fentanila, XOMA 052, Fostamatinibe dissódico, rosigtazona, Curcumina, Longvida'!”, Rosuvastatina, Maraviroc, ramipnl, Milnaci- prano, Cobiprostona, somatropina, vetor de terapia do gene tgAAC9A, MKO0359, GW856553, esomeprazol, everolimus, trastuzumabe, inibido- res de JAKI e JAK2, inibidores de pan JAK, por exemplo, piridona te- tracíclica 6 (P6), 325, PF-956980, denosumabe, antagonistas de IL-6, antagonistas de CD20, antagonistas de CTLAA4, antagonistas de |IL-8, antagonistas de IL-21, antagonistas de 11-22, antagonistas de integri- na, TysarbriO (natalizumabe), antagonistas de VGEF, antagonistas de CXCL, antagonistas de MMP, antagonistas de defensina, antagonistas de IL-1, antagonistas de IL-1 beta, antagonistas de 11-23, receptores de engodo, anticorpos antagonísticos, corticosteroides, mesalazina, mesalamina, sulfasalazina, derivados de sulfasalazina, fármacos imu- nossuppressores, ciclosporina A, mercaptopurina, azatiopurina, pred- nisona, metotrexato, anti-histamínicos, glicocorticoides, epinefrina, teo- filina, cromolina sódica, anti-leucotrienos, medicamentos anticolinérgi- cos para rinite, antagonistas de TLR, inibidores do inflamassoma, des- congestionantes anticolinérgicos, estabilizantes de mastócitos, anti- corpos monoclonais anti-lgE, vacinas, inibidores de citocinas, anticor- pos anti-IL-6, inibidores de TNF, infliimabe, adalimumabe, certolizu- mabe pegol, golimumabe e etanercept.
37. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, carac- terizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um antibióti- Co.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do pelo fato de que o antibiótico é selecionado dentre o grupo que consiste em aminoglicosídeos, ansamicinas, carbacefemas, carbape- nemas, cefalosporinas, glicopeptídeos, lincosamidas, lipopeptídeos,
macrólidos, monobactamas, nitrofuranos, oxazolidononas, penicilinas, antibióticos de polipeptídeo, quinolonas, fluoroquinolona, sulfonami- das, tetraciclinas, compostos antimicobacterianos e combinações dos mesmos.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 35 a 38, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente administrar ao sujeito uma segunda bactéria terapêuti- ca.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 39, caracterizado pelo fato de que o método compreende, ainda, administrar um prebiótico ao sujeito.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracteriza- do pelo fato de que o prebiótico é um fruto-oligossacarídeo, um galac- to-oligossacarídeo, um trans-galacto-oligossacarídeo, um xilo- oligossacarídeo, um quito-oligossacarídeo, um oligossacarídeo de so- ja, um gentio-oligossacarídeo, um isomalto-oligossacarídeo, um mano- oligossacarídeo, um malto-oligossacarídeo, um mananoligossacarídeo, lactulose, lactosacarose, palatinose, glicosil sacarose, goma guar, go- ma arábica, tagalose, amilose, amilopectina, pectina, xilano ou uma ciclodextrina.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um mamífero não humano.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que o mamífero é selecionado dentre o grupo que con- siste em um cão, um gato, uma vaca, um cavalo, um porco, um jumen- to, uma cabra, um camelo, um camundongo, um rato, um porquinho da Índia, uma ovelha, uma lhama, um macaco, um gorila ou um chimpan-
zé.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 44, caracterizado pelo fato de que uma segunda bactéria é administrada como parte de um consórcio ecológico.
46. Composição bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa de Lactococcus imunomoduladora e um veícu- lo farmaceuticamente aceitável.
47. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a cepa de Lactococcus imunomodu- ladora é uma cepa que compreende pelo menos 99% de identidade de sequência genômica, de 16S e/ou de CRISPR com a sequência de nucleotídeos da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA-125368).
48. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a cepa de Lactococcus imunomodu- ladora é uma cepa que compreende pelo menos 99,9% de identidade de sequência genômica, de 16S e/ou de CRISPR com a sequência de nucleotídeos da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósito ATCC PTA-125368).
49. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a cepa de Lactococcus imunomodu- ladora é a Cepa A de Lactococcus lactis cremoris (Número de Depósi- to ATCC PTA-125368).
50. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 49, caracterizada pelo fato de que a composi- ção bacteriana é formulada para administração oral, retal, intravenosa, intratumoral ou subcutânea.
51. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50% das bactérias na composição bacteriana são a cepa de Lactococ-
cus imunomoduladora.
52. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50, caracterizada pelo fato de que pelo menos 90% das bactérias na composição bacteriana são a cepa de Lactococ- cus imunomoduladora.
53. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 52, caracterizada pelo fato de que substanci- almente todas as bactérias na composição bacteriana são a cepa de Lactococcus imunomoduladora.
54. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 53, caracterizada pelo fato de que a composi- ção bacteriana compreende pelo menos 1 x 10º unidades de formação de colônia (CFUs) da cepa de Lactococcus imunomoduladora.
55. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que a composição bacteriana compre- ende pelo menos 1 x 107 CFUs da cepa de Lactococcus imunomodu- ladora.
56. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que a composição bacteriana compre- ende pelo menos 1 x 108 CFUs da cepa de Lactococcus imunomodu- ladora.
57. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que a cepa de Lactococcus compreende uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos como identifi- cado na Tabela 6.
58. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 46 a 57, caracterizada pelo fato de que a cepa de Lactococcus é isen- ta ou substancialmente isenta de uma proteína que tem uma sequên- cia de aminoácidos como identificado na Tabela 5.
59. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação
56, caracterizada pelo fato de que a cepa de Lactococcus compreende uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos como identifi- cado na Tabela 6 e é isenta ou substancialmente isenta de uma prote- Ína que tem uma sequência de aminoácidos como identificado na Ta- bela 5.
60. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 59, caracterizada pelo fato de que a composi- ção bacteriana compreende bactérias vivas.
61. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 60, caracterizada pelo fato de que a composi- ção bacteriana compreende bactérias atenuadas.
62. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 60, caracterizada pelo fato de que a composi- ção bacteriana compreende bactérias mortas.
63. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 62, caracterizada pelo fato de que a composi- ção bacteriana compreende bactérias irradiadas.
64. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo fato de que a composição bacteriana compre- ende bactéria submetida à irradiação gama.
65. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 64, caracterizada pelo fato de que a adminis- tração da composição bacteriana trata o distúrbio imunológico.
66. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 65, caracterizada pelo fato de que a adminis- tração da composição bacteriana induz uma resposta imunológica.
67. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 66, caracterizada pelo fato de que a cepa de Lactococcus imunomoduladora é formulada com um revestimento en- térico ou microencapsulação.
68. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 67, caracterizada pelo fato de que a cepa de Lactococcus imunomoduladora compreende uma ou mais proteínas listadas na Tabela 1 ou são isentas de uma proteína da Tabela 3.
69. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 68, caracterizada pelo fato de que a cepa de Lactococcus imunomoduladora compreende uma ou mais proteínas listadas na Tabela 2.
70. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 69, caracterizada pelo fato de que a cepa de Lactococcus imunomoduladora é isenta de uma ou mais proteínas lis- tadas na Tabela 4 e/ou um EPS produzido por uma proteína listada na Tabela 4.
71. Composição bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende vesículas extracelulares (EVs) de cepa de Lactococcus imunomoduladora isolada.
72. Composição bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende vesículas extracelulares (EVs) da cepa de Lactococcus imunomoduladora e bactérias da cepa de Lactococcus imunomodula- dora.
73. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, T%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 12%, 13%, 74%, 175%, 176%, TT%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98% ou 99% da EV de cepa de Lactococcus lactis cremoris total e par- tículas de bactérias da cepa de Lactococcus imunomoduladoras na composição farmacêutica são EVs de cepa de Lactococcus imunomo- duladora.
74. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, T%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 175%, 176%, TT%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora total e partículas de bactérias na composição farmacêutica são bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
75. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, T%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 175%, 176%, TT%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora total e proteína de bactérias da cepa de Lactococcus imunomoduladoras na composição farmacêutica são uma proteína de EV de cepa de Lacto-
coccus imunomoduladora.
76. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 175%, 176%, TT%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora total e proteína de bactérias da cepa de Lactococcus imunomoduladora na composição farmacêutica são uma proteína de bactérias de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
77. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 175%, 176%, TT%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora total e lipídeos de bactérias na composição farmacêutica são lipídeos de EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora.
78. Composição bacteriana, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que pelo menos, cerca de, ou não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, T%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 175%, 176%, TT%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da EV de cepa de Lactococcus imunomoduladora total e lipídeos de bactérias da cepa de Lactococcus imunomoduladoras na composição farmacêutica são lipídeos de bactérias de cepa de Lacto- coccus imunomoduladora.
79. Composição bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende bactérias da cepa de Lactococcus imunomoduladora iso- ladas de EVs.
80. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 79, caracterizada pelo fato de que a composi- ção bacteriana é substancialmente isenta de oxopolissacarídeos.
81. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 80, caracterizada pelo fato de que a composi- ção bacteriana é formulada para administração oral, retal, intravenosa, intratumoral ou subcutânea.
82. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 81, caracterizada pelo fato de que a composi- ção bacteriana compreende bactérias vivas.
83. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 81, caracterizada pelo fato de que a composi- ção bacteriana compreende bactérias atenuadas.
84. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 81, caracterizada pelo fato de que a composi-
ção bacteriana compreende bactérias mortas.
85. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 84, caracterizada pelo fato de que a adminis- tração da composição bacteriana trata o distúrbio imunológico.
86. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 85, caracterizada pelo fato de que a adminis- tração da composição bacteriana induz uma resposta imunológica.
87. Composição bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 86, caracterizada pelo fato de que a Cepa À de Lactococcus lactis é formulada com um revestimento entérico ou microencapsulação.
88. Método para tratar um distúrbio imunológico em um su- jeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma composição bacteriana, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 46 a 87.
89. Biorreator, caracterizado pelo fato de que compreende bactérias de Lactococcus lactis cremoris.
90. Biorreator, de acordo com a reivindicação 89, caracteri- zado pelo fato de que as bactérias são uma cepa que compreende pe- lo menos 90% de identidade de sequência genômica, de 168 e/ou de CRISPR com a sequência de nucleotídeos de Cepa A de Lactococcus lactis cremoris.
91. Biorreator, de acordo com a reivindicação 89, caracteri- zado pelo fato de que as bactérias são uma cepa que compreende pe- lo menos 99% de identidade de sequência genômica, de 168 e/ou de CRISPR com a sequência de nucleotídeos da Cepa A de Lactococcus lactis cremoris.
92. Biorreator, de acordo com a reivindicação 89, caracteri- zado pelo fato de que as bactérias são uma cepa que compreende pe- lo menos 90% de identidade de sequência genômica, de 168 e/ou de
CRISPR com a sequência de nucleotídeos da Cepa B de Lactococcus lactis cremoris.
93. Biorreator, de acordo com a reivindicação 89, caracteri- zado pelo fato de que as bactérias são uma cepa que compreende pe- lo menos 99% de identidade de sequência genômica, de 168 e/ou de CRISPR com a sequência de nucleotídeos da Cepa B de Lactococcus lactis cremoris.
94. Método de crescimento de bactérias em um biorreator, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um biorreator, como definido em qualquer uma das reivindicações 89 a 93; e fermentar as bactérias durante um período de tempo.
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