CN113637643B

CN113637643B - 一株能稳定分泌抗青环海蛇毒素的单克隆抗体细胞株

Info

Publication number: CN113637643B
Application number: CN202111128969.3A
Authority: CN
Inventors: 王荣智; 黄晓婷; 高烨宏; 汪世华; 林明; 陈睿; 凌素美
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2021-09-26
Filing date: 2021-09-26
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2041-09-26
Also published as: CN113637643A

Abstract

本发明属于抗体工程领域，具体涉及一株能稳定分泌抗青环海蛇毒素SN311的单克隆抗体细胞株。该杂交瘤细胞株8B1分类命名为抗海蛇蛇毒SN311单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2020年11月23日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号是：CGMCC No.21012。本发明以原核表达纯化MBP‑SN311重组抗原为免疫抗原，SN311重组抗原为检测抗原包被酶标板，通过iELISA法筛选获得一株阳性杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为建立青环海蛇蛇毒SN311的ELISA免疫检测方法奠定了基础。

Description

一株能稳定分泌抗青环海蛇毒素的单克隆抗体细胞株

技术领域

本发明属于细胞抗体工程领域，具体涉及一株能稳定分泌抗青环海蛇毒素单克隆抗体（IgG）的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus Daudin）属于爬行纲，海蛇科，广泛分布于波斯湾、印度洋和太平洋区域，在我国主要分布在辽宁、江苏、浙江、福建、广东、广西和台湾近海。青环海蛇毒液毒性非常强烈，常见的青环海蛇毒素的LD₅₀为0.05 mg/kg，其首要致死因子为神经毒素，青环海蛇毒液中的神经毒素主要就是α-神经毒素。α-神经毒素主要通过特异性结合脊椎动物中突触后运动终板上的烟碱乙酰胆碱受体，阻断骨骼肌的神经肌肉接头传递，因此中毒的人和动物出现肌肉麻痹，多以呼吸肌麻痹导致窒息死亡。

对青环海蛇毒腺的高质量cDNA文库中进行的大规模随机测序中，发现了编码三种不同的短链α-神经毒素，即SN311，SN316和SN285，这三种毒素均由21个氨基酸编码的信号肽和60个氨基酸编码的成熟肽组成，成熟蛋白名为SN311，SN316，SN285。SN311与SN316高度同源，只在SN311中的Lys46和SN316中的Ser46存在差异，SN311重组蛋白能够迅速阻断神经肌肉传递，其LD₅₀值为0.0827 mg/kg。SN311具有典型的短链α-神经毒素的初级结构，属于三指家族。

目前对青环海蛇毒素的研究相对较少，原因是青环海蛇排毒量较低且提取获得纯度高的毒素要花费高额成本，对于青环海蛇咬伤防治以及毒素检测方法也未有报道，也未有关于抗青环海蛇毒素单克隆抗体的应用，因此开展关于青环海蛇蛇毒免疫检测方法的研究具有重要意义。

酶联免疫吸附（ELISA）技术是建立在免疫学基础上发展起来的，是将具有免疫活性的抗原或者抗体与酶结合成具有免疫活性和酶活性的酶标抗原或者酶标抗体，使之能够与待测样品结合形成复合产物，最后通过测定而能够对待测样品实现定量分析，具有灵敏性高，特异性强且操作简便，成本低的特点，在现代医学研究，食品化学分析，生物学等各大领域得到广泛应用，如今已发展有夹心法、间接法、直接法、竞争法四种技术方法。

蛇毒SN311是小分子多肽，具备免疫原性和抗原性，属于完全抗原，能够直接免疫动物获得相应的抗体，但由于其难以提纯获得，因此还未有关于其基于单克隆抗体的ELISA免疫分析方法建立，因此，制备出能够稳定分泌抗青环海蛇毒素SN311的单克隆抗体（IgG）杂交瘤细胞株，为商品化开发生产高质量的酶联检测试剂盒奠定夯实基础。

发明内容

本发明目的是提供一株能稳定分泌抗青环海蛇毒素SN311的单克隆抗体（IgG）杂交瘤细胞株。

本发明首先保护一株杂交瘤细胞株8B1，其分类命名为抗海蛇蛇毒SN311单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2020年11月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为：为北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.21012。

其次保护一种由所述杂交瘤细胞株8B1产生的单克隆抗体（IgG）。

所述的单克隆抗体的制备方法，是将杂交瘤细胞株8B1，通过制备腹水和纯化，获得单克隆抗体（IgG）。

上述杂交瘤细胞株8B1产生的单克隆抗体在检测青环海蛇毒素SN311中的应用。

一种包含上述杂交瘤细胞株8B1产生的单克隆抗体的青环海蛇毒素SN311检测试剂盒。

所述的杂交瘤细胞8B1产生的单克隆抗体的制备方法是：青环海蛇毒素SN311为小分子肽类毒素，由21个氨基酸信号肽和60个氨基酸成熟肽组成，为完全抗原。为了增强动物免疫效果，对青环海蛇毒素SN311碱基序列进行二聚体处理，表达纯化毒素SN311与髓鞘碱性蛋白（MBP）的重组蛋白MBP-SN311，作为小鼠免疫用抗原；同时还表达了纯化毒素SN311蛋白作为检测用抗原。小鼠免疫后，将血清效价达1:8000的小鼠脾细胞与SP2/0用PEG1450按照常规方法进行融合，用含体积分数（v/v）20%胎牛血清的HAT RPMI-1640培养基作为基础筛选融合细胞，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗青环海蛇毒素SN311完全抗原的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，选择吸光值和灵敏度均较高的培养孔；采用有限稀释法多次进行亚克隆，最终筛选获得可稳定分泌抗青环海蛇毒素SN311单克隆抗体的抗海蛇蛇毒SN311单克隆抗体杂交瘤细胞株8B1。将获得的杂交瘤细胞株8B1以1×10⁶cells/只的量注射到用石蜡预致敏过的9周龄的Balb/c小鼠腹腔中，待小鼠腹部明显膨大且腹部皮肤具有紧张感时抽取腹水，置4℃下13000 r/min离心20min，取中间层；经Protein G亲和层析法精提纯化，得到抗青环海蛇毒素SN311的单克隆抗体8B1，将抗体置于-20℃冰箱中保存备用。

本发明以原核表达纯化MBP-SN311重组抗原为免疫抗原，SN311重组抗原为检测抗原包被酶标板。通过iELISA法筛选获得一株阳性杂交瘤细胞8B1，该杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体（IgG），为建立青环海蛇毒素SN311免疫检测方法奠定了基础。

本发明的显著优点在于：

目前还未有基于单克隆抗体（IgG）的青环海蛇毒素SN311的ELISA免疫分析的报道，更未见有关于青环海蛇毒素SN311的免疫检测方法。本研究使用的免疫分析方法相较于现有的检测方法来说，具有特异性好，灵敏度高，精确度强，操作简单，成本低等特点，适合大批量样品检测。

附图说明

图1是本发明重组抗原的表达与纯化电泳图。（A）泳道M：蛋白Maker；泳道1：空载pET-28a总蛋白；泳道2：空载pET-28a-SN311蛋白；泳道3: pET-28a-SN311总蛋白；泳道4-5:纯化的SN311蛋白。（B）泳道M：蛋白Maker；泳道1：空载pET-28a总蛋白；泳道2：空载pBD-mbp-SN311蛋白；泳道3: pBD-mbp-SN311总蛋白；泳道4-5: 纯化的MBP-SN311蛋白。

图2是本发明免疫小鼠血清效价测定。

图3是本发明细胞融合结果。

图4是本发明抗体纯化结果鉴定。泳道M：Maker；泳道1：腹水总蛋白；泳道2：纯化的抗蛇毒SN311单克隆抗体。

图5是本发明杂交瘤细胞株染色体分析。

图6是本发明单克隆抗体亲和力检测结果。

图7是本发明单克隆抗体间接iELISA特异性分析结果。

图8是本发明单克隆抗体间接竞争ELISA标准检测曲线图。

图9是本发明单克隆抗体间接竞争ELISA标准检测直线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明的杂交瘤细胞株8B1，分类命名为抗海蛇蛇毒SN311单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2020年11月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北层西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是：CGMCC No.21012。

实施例1本发明单克隆抗体的制备与鉴定

1、抗原载体构建

1）蛇毒SN311蛋白质序列及基因序列的获得。由中山大学建立青环海蛇毒腺表达文库表达克隆青环海蛇新基因序列，得到青环海蛇毒素SN311的成熟肽区域序列为：

MTCCNQQSSQPKTTTNCAESSCYKKTWSDHRGTRIERGCGCPQVKKGIKLECCHTNECNN

按照大肠杆菌的密码子偏好性，推导出青环海蛇毒素SN311的碱基序列，对青环海蛇毒素SN311碱基序列进行二聚体处理，且进行优化设计，化学合成后可直接插入到载体中，最终确定的序列如下：

5’-ATGACATGTTGCAACCAACAGTCATCGCAACCTAAAACCACTACAAATTGTGCAGAGAGCTCTTGCTATAAAAAGACTTGGAGCGATCACCGTGGAACTAGAATTGAAAGGGGATGTGGTTGCCCTCAGGTGAAGAAAGGTATTAAACTTGAATGTTGCCATACAAACGAATGCAACAATGGATCAATGACATGTTGCAACCAACAGTCATCGCAACCTAAAACCACTACAAATTGTGCAGAGAGCTCTTGCTATAAAAAGACTTGGAGCGATCACCGTGGAACTAGAATTGAAAGGGGATGTGGTTGCCCTCAGGTGAAGAAAGGTATTAAACTTGAATGTTGCCATACAAACGAATGCAACAAT-3’

2）将人工合成的SN311基因序列构建入pET-28a、pBD-mbp载体中，依据载体pET-28a以及SN311的优化序列的信息，设计上下游引物，设计序列如下：

SN311-F-EcoR Ⅰ: 5’-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAC-3’

SN311-R-Hind Ⅲ: 5’-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTTGTTACATTC-3’

3）重组质粒pET-28a-SN311以及pBD-mbp-SN311的构建

将扩增的青海环蛇毒素SN311基因分别插入到同样经过EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切处理的pET-28a和pBD-mbp载体中，用T4-DNA连接酶连接过夜，从而得到了重组质粒pET-28a-SN311和pBD-mbp-SN311。将上述重组质粒分别转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，涂布于LB+Kana（0.25 μg/mL）平板上。

4）重组质粒的筛选、检测

挑取上述LB+Kana（0.25 μg/mL）平板上的单菌落，接种于LB+Kana（0.25 μg/mL）的液体培养基于37℃摇床培养8 h，将菌体送去测序鉴定。

2、蛇毒SN311的重组抗原的表达与纯化

1）菌株pET28a-SN311/BL21(DE3)和pBD-mbp-SN311/BL21(DE3)活化与蛋白表达，取1 mL新鲜菌液接种于100 mL LB液体培养基（100 μg/mL Kana)，37℃、180 r/min摇床震荡培养2~3 h。待菌液OD600 nm为0.6~0.8时，加入100 μL浓度为10 mol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），置于18℃摇床中培养过夜。

2）MBP-SN311和SN311融合蛋白的纯化

将50 mL菌液收集至洁净的离心管中，置于4℃冷冻离心机中离心10 min，转速7000 r/min，离心之后弃掉上清，收集离心管内的菌体沉淀，然后加入10 mL事先配置好的Buffer A（70 mM NaH₂PO₄·2H₂O，0.3 M NaCl，5 mM C₃H₄N₂，pH 8.0）溶液将菌体重悬。破碎菌体溶液，超声波破碎仪开5 s破碎，停10 s冷却，防止过热，直至将菌体溶液破碎至澄清。将破碎至澄清的菌体溶液置于4℃冷冻离心机离心10 min，转速10000 r/min，离心之后收集上清液。将上清加入事先用Buffer A溶液平衡的Ni²⁺-NTA亲和层析柱中，反复上柱结合30min以上。后加入200 mL Buffer B（70 mM NaH₂PO₄·2H₂O，0.3 M NaCl，40 mM C₃H₄N₂，pH8.0）除去杂蛋白分子，随后用Buffer C（70 mM NaH₂PO₄·2H₂O，0.3 M NaCl，250 mM C₃H₄N₂，pH 8.0）将目的蛋白洗脱并收集。取20 μL收集到的蛋白溶液，向其中加入10 μL 5×SDS-PAGE蛋白裂解液，用移液枪充分混匀，沸水煮约10~15 min，离心后吸取10 μL上清进行SDS-PAGE电泳分析，如图1所示。

3、单克隆抗体的制备

1）小鼠免疫

以完全抗原MBP-SN311免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠。

首次免疫为将Freund’s完全佐剂等体积与完全抗原MBP-SN311混合进行，用乳化仪将混合物乳化至油包状态，乳化的结果以滴到水中30 min之内不散开为判断标准，乳化后对Balb/c小鼠进行皮下多点注射免疫。后续每间隔14天进行一次加强免疫，将Freund’s完全佐剂替换成Freund’s不完全佐剂，其他步骤同首次免疫。免疫一周后尾部取血，以SN311完全抗原包被酶标板，间接ELISA检测血清效价。直至小鼠抗血清效价达1:8000时，如图2所示。若未达到效价的小鼠可继续按照常规方法免疫，直至效价达到为止。若当天选取的小鼠效价达1:8000且有SN311特异性，则改用与首次免疫相同剂量的完全抗原MBP-SN311，将其用过滤除菌的生理盐水稀释成500 μL，直接注射于小鼠腹腔进行末次加强免疫，为取小鼠脾脏进行细胞融合做准备。

2）免疫血清效价测定

在小鼠第三次免疫后的5~7 d内，用间接酶联免疫吸附测定法（Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，iELISA）检测小鼠抗血清效价，操作步骤如下：

（1）抗血清采集：从小鼠尾部静脉取血，在37℃水浴锅内静置30 min，后在4℃条件下12000 r/min离心20 min，吸取上层血清，如立即使用可放置室温，如间隔时间较长置-20℃冰箱保存。

（2）包被（Coating）：用0.05 M Coating Buffer（1.59 g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃溶于蒸馏水并定容至1L，pH 9.6）稀释检测抗原纯化毒素SN311蛋白至终浓度为5 μg/mL，加入酶标板，每孔100 μL，放置37℃恒温箱中温育2 h。后每孔加入200 μL 0.01 M PBST（PBS+0.05vol% Tween-20）洗板三遍，再每孔加入200 μL 0.01 M PBS洗板三遍，在吸水纸上将孔内的水分扣干。

（3）封闭（Block）：配制含5wt%脱脂奶粉的0.01 M PBS 溶液（PBSM，以下统一表述为5% PBSM），加入200 μL 5% PBSM到酶标孔中，置于37℃恒温箱静置2 h或者放在4℃冰箱里封闭过夜。封闭之后洗板过程同步骤（2）。

（4）一抗（Anti-SN311 Ab）：用5% PBSM将上所述的抗血清以1:500作倍比稀释，依次加入酶标孔，每孔100 μL，放置37℃恒温箱温浴反应1 h，同时5% PBSM作阴性对照。

（5）二抗（GAMA-HRP）：用5% PBSM以1:8000的稀释比稀释酶标二抗（HAMA-HRP），每孔加入100 μL二抗，于37℃恒温箱反应1 h。

（6）显色（Coloration）：量取TMB A液（17 mM C₆H₈O₇，0.33 M CH₃COONa，30% H₂O₂0.3 mL）和TMB B液（10 mM C₆H₈O₇，1.2 mM C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈，1.8 mM TMB，50 mL Glycerol）等体积混匀，得到TMB显色液，用移液枪吸取100 μL显色液加入到酶标孔中，于37℃恒温箱中反应15 min。

（7）终止（Teimination）：取出显色应后的酶标板，随即向酶标孔中加入2 M H₂SO₄终止显色反应，每孔50 μL，显色终止后将酶标板置于酶标仪上检测OD450 nm值。

3）细胞融合

取免疫小鼠的脾脏通过研磨过滤获得脾细胞。将1.0×10⁷个SP2/0细胞与3.0×10⁷个脾细胞混合在一起，室温离心7 min，转速1100 r/min，离心后弃掉上清液，用手轻轻敲打离心管，松散细胞沉淀。将含有细胞沉淀的离心管置于37℃温水中，向其中缓缓滴加1 mL预热的PEG 1450溶液，滴加过程按照先慢后快的原则，在1 min钟内加完，之后静置1 min。静置之后，缓慢加入40 mL预热的1640不完全培养基终止融合，按照先慢后快的滴加原则，头一分钟内缓慢滴加1 mL培养基，第二分钟内加完3 mL培养基，第三分钟内加完5 mL培养基，以此类推，直至加完40 mL 1640不完全培养基，之后将细胞混合液放置CO₂培养箱中静置10min。将静置之后的细胞混合液室温离心7 min，转速1100 r/min，倒掉细胞上清，将细胞沉淀转移至含有100 mL预热的2vol% HAT完全培养基（含20vol% FBS）的无菌玻璃瓶中，轻轻晃动玻璃瓶，使细胞散开，然后放进CO₂培养箱中静置10 min，后用8孔排枪往事先铺好饲养细胞的96孔板中加入融合后的细胞，每孔100 μL，细胞融合后观察细胞生长情况，如图3所示。

4）阳性杂交瘤细胞的筛选

在细胞融合之后的8 d左右，利用间接ELISA法对融合后的细胞集落进行筛选。事先用0.05 M Coating Buffer（1.59 g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃溶于蒸馏水并定容至1L，pH9.6）将青环海蛇毒素SN311稀释至浓度为5 μg/mL，以100 μL/well封闭好10板青环海蛇毒素SN311 ELISA酶标板，用8孔排枪往细胞培养板中每孔取100 μL融合细胞培养上清，加入到酶标板中，放置于37℃恒温箱中孵育1 h，同时每孔吸取120 μL 2vol% HAT完全培养基补进细胞培养板中。一个小时之后用0.01 M PBST洗三遍，再用0.01 M PBS洗三遍，拍干后加入稀释的山羊抗小鼠-HRP，每孔100 μL，置于37℃恒温箱中孵育1 h，后加入配好的TMB显色液，每孔100 μL，于37℃恒温箱中放置15 min，取出酶标板，添加50 μL 2 M H₂SO₄溶液终止显色反应，后测定OD450 nm的值，筛选杂交瘤细胞的同时应注意同时取融合小鼠的血上清做阳性对照，以阳性对照值为参考，选取杂交瘤细胞做亚克隆。

5）腹水的制备与纯化

将杂交瘤细胞株8B1以1×10⁶cells/只的量注射到石蜡致敏过的雌性Balb/c小鼠腹腔中，一周后观察小鼠，待小鼠腹部膨大且有紧张感时抽取腹水，后置于4℃离心10 min，转速13000 r/min，离心后可观察到腹水分为三个液相层，中间透明液相层为单克隆抗体，最下面的沉淀为血细胞，最上层白色物质为脂肪等组织碎片。用移液枪吸取中间液相层置于新的EP管中，后用封口膜封好置于-80℃超低温冰箱储存。杂交瘤细胞株8B1分泌的抗体属于IgG_2b型抗体，利用Protein G亲和层析介质法从腹水中纯化单克隆抗体，接着用10%SDS-PAGE凝胶电泳检测验证抗体的纯度，如图4所示。从图中可以看出，纯化后的抗体在40-50 kDa处和25-30 kDa处有明显的条带，分别对应IgG抗体的重链和轻链，而且几乎没有杂带，表明Protein G亲和层析介质法纯化IgG抗体效果很好，然后将纯化的单克隆抗体于-20℃保存。

4、单克隆抗体的特性鉴定

1）染色体分析：用0.1wt%秋水仙素处理处于生长对数期的杂交瘤细胞8B1，培养6h后悬起细胞，将细胞重悬液收集至15 mL离心管内，室温离心8 min，转速1200 r/min，离心后轻轻倒掉上清，然后吸取8 mL预热的0.075 mol/L氯化钾溶液加进细胞沉淀中，用移液枪轻柔地将细胞吹起，将重悬的细胞液置于37℃培养箱继续孵育30 min。取出加入1 mL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液（甲醇-冰醋酸的体积比（v/v）为3:1），摇匀之后室温静置5 min，室温离心8 min，转速1200 r/min，收集细胞沉淀，再次加入5 mL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液，用移液枪轻轻吹起细胞沉淀，室温静置30 min，之后室温离心8 min，转速1200 r/min，收集细胞沉淀后加入5 mL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液，用移液枪吹起摇匀，置于4℃冰箱过夜。隔天取出室温离心8 min，转速1200 r/min，收集细胞沉淀，后用300 μL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液吹起摇匀。从冰箱中取出事先处理干净预冷的的载玻片，用移液枪吸取10 μL上述含有细胞的固定液，从高处（50 cm以上）滴至载玻片中间，立即用移液枪吹散，后在酒精灯上来回移动载玻片，使其均匀受热，以干燥细胞样品。干燥好的载玻片放置一边，吸取50 μL染液（用PBS按照1:10稀释Giemsa母液）滴至载玻片上，室温静置20 min。待染色体制片做好后置于高倍显微镜下观察杂交瘤细胞染色体并采集图片。如图5所示，用0.1wt%秋水仙素对阳性杂交瘤细胞8B1进行处理后，染色并显微镜下观测，计算处于分裂中期的杂交瘤细胞的染色体数目为107±2条，杂交瘤细胞的染色体数目接近于两个亲本的染色体数目之和，证明该阳性杂交瘤细胞为骨髓瘤细胞与脾细胞融合而成。

2）单克隆抗体亲和力测定

根据Beatty的方法，用iELISA进行单克隆抗体亲和力常数Kaff的测定。用0.05 MCoating Buffer（1.59 g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃溶于蒸馏水并定容至1L，pH 9.6）将青环海蛇毒素SN311完全抗原分别稀释成10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL包被在ELISA酶标板中。用5% PBSM对纯化后的单克隆抗体溶液做倍比稀释，最终将抗体稀释成53.5 ng/mL、26.75 ng/mL、13.375 ng/mL、6.6875 ng/mL、3.34375ng/mL、1.671875ng/mL、0.8359375 ng/mL、0.41796875 ng/mL。取出事先包被好的酶标板，然后各吸取100 μL稀释好的抗体加入到酶标孔内，其余步骤同以上iELISA检测。

记录数据并分析计算不同浓度梯度的青环海蛇毒素SN311抗原在IC₅₀时所对应的抗体浓度，根据下面所列公式可以计算出单克隆抗体的亲和力常数。

上述式子中：[Ab]的值为抗原SN311浓度在[Ag]时，其IC50时的抗体浓度；

[Ab]t的值则为抗原SN311浓度在[Ag]t时，其IC50时的抗体浓度；

n则为为[Ag]与[Ag]t的比值

测定结果如图6所示，利用Origin8.0软件进行拟合曲线的制作，根据各曲线中的IC₅₀，按照亲和常数测定公式技算出抗体的亲和力为1.869×10⁹ L/mol，为高亲和力抗体。

1）单克隆抗体特异性iELISA特异性分析

用iElISA检测方法进行测定单克隆抗体的特异性。用0.05 M Coating Buffer（1.59 g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃溶于蒸馏水并定容至1L，pH 9.6）稀释不同的完全抗原（DA，STX，OA，LR，Citrinin，TTX，BSA，OVA，KLH，LF，SN311）至浓度为10 μg/mL，用移液枪以每孔100 μL的量包被到96孔酶标板中，用5% PBSM溶液将抗体稀释至浓度为3.34375 ng/mL，然后以每孔100 μL的量加进包被好的酶标板内，同时做阴性对照组实验置于37℃恒温培养箱反应1 h，其余具体操作步骤同iELISA法，最终测定其OD450 nm值并记录数据分析，如图7所示。

4）单克隆抗体竞争曲线与标准曲线

用已经确定的包被抗原浓度和一抗工作使用浓度作icELISA，从而建立青环海蛇毒素SN311的标准竞争曲线。包被青环海蛇毒素SN311完全抗原（10 μg/mL），用5%PBSM溶液稀释青环海蛇毒素SN311标品浓度为100 μg/mL，以此进行倍比稀释，浓度分别为50 μg/mL，25 μg/mL，12.5 μg/mL和6.25 μg/mL，3.125 μg/mL，1.5625 μg/mL以及0.78125μg/mL，0.390625 μg/mL，0.1953125 μg/mL，0.09765625 μg/mL，0.048828125 μg/mL，0.0244140625 μg/mL，0.01220703125 μg/mL，0.006103515625 μg/mL，将稀释好的青环海蛇毒素SN311标品溶液与稀释成3.34375 ng/mL的抗青环海蛇毒素SN311单克隆抗体等体积混匀，置于37℃恒温培养箱中反应40 min，后从混合液中每管吸取100 μL加入至酶标孔中，同时做阳性对照和阴性对照，后按iELISA法操作。对获得的数据进行处理，横坐标为蛇毒SN311标准品的实际浓度的对数值，纵坐标为B/B0，用Origin 8.0拟合竞争曲线以及标准曲线如图8，曲线方程为y=0.02859+[0.79755/(1+x/126.4461)^0.36034]，R²=0.97768，其中IC₅₀=126.45 ng/mL，计算毒素SN311最低检测浓度约为1 ng/mL。实验发现在IC₂₀~IC₈₀之间具有良好的线性关系，因此将此线性区间的点重新拟合成标准直线，如图9，公式y=0.71393-0.14104x，计算蛇毒SN311的线性检测范围为18～15135 ng/mL。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株能稳定分泌抗青环海蛇毒素的单克隆抗体细胞株

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Cys Cys Asn Gln Gln Ser Ser Gln Pro Lys Thr Thr Thr Asn

1 5 10 15

Cys Ala Glu Ser Ser Cys Tyr Lys Lys Thr Trp Ser Asp His Arg Gly

20 25 30

Thr Arg Ile Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Gln Val Lys Lys Gly Ile

35 40 45

Lys Leu Glu Cys Cys His Thr Asn Glu Cys Asn Asn

50 55 60

<210> 2

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacatgtt gcaaccaaca gtcatcgcaa cctaaaacca ctacaaattg tgcagagagc 60

tcttgctata aaaagacttg gagcgatcac cgtggaacta gaattgaaag gggatgtggt 120

tgccctcagg tgaagaaagg tattaaactt gaatgttgcc atacaaacga atgcaacaat 180

ggatcaatga catgttgcaa ccaacagtca tcgcaaccta aaaccactac aaattgtgca 240

gagagctctt gctataaaaa gacttggagc gatcaccgtg gaactagaat tgaaagggga 300

tgtggttgcc ctcaggtgaa gaaaggtatt aaacttgaat gttgccatac aaacgaatgc 360

aacaat 366

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggtcgcg gatccgaatt catgac 26

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcgagtgcg gccgcaagct tgttgttaca ttc 33

Claims

1.一株杂交瘤细胞株8B1，分类命名为抗海蛇蛇毒SN311单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2020年11月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.21012。

2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株8B1产生的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：将杂交瘤细胞株8B1，通过制备Balb/c小鼠腹水和纯化，获得单克隆抗体。