CN1683403A - 日本血吸虫细胞周期静止素，其编码核酸及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种编码日本血吸虫细胞周期静止素的新的基因，基因编码的多肽，多肽的抗体。本发明还公开了此多肽用于筛选日本血吸虫细胞周期静止素的抑制剂，多核苷酸作为引物或者作为探针的应用，尤其公开了此多肽与多核苷酸作为诊断试剂盒、疫苗的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——日本血吸虫细胞周期静止素，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的应用。
背景技术
血吸虫病仍然是当今严重的公共卫生问题之一，疫苗可用于预防和治疗血吸虫病，研究并找到合适的抗血吸虫病疫苗成为现在研究的热点。国内在对应于WHO推荐的曼氏血吸虫病六个疫苗候选分子-Sj 28 GST、副肌球蛋白、磷酸丙糖异构酶、完整膜蛋白、照射减毒抗原-5和脂肪酸结合蛋白，以及Sj32、组织蛋白酶B、原肌球蛋白、卵黄铁蛋白、LDH、Sj16和CyPA等的研究后观察到，它们的保护性效果不尽人意。因此，疫苗的成功研制需要新的血吸虫病疫苗侯选基因，特别是影响血吸虫的生长发育和血吸虫在影响宿主免疫系统的攻击中起作用的分子。细胞周期静止素就属于该类分子。
Stathmin-like Protein(SLP)基因从日本血吸虫童虫全长cDNA文库中一个随机克隆用通用引物PCR获得的基因，其GenBank中的同类物是曼氏血吸虫的细胞周期静止素，分子量为16kDa，又称Sj16。Stathmin，被称为细胞周期静止素，是广泛存在于细胞中的一种磷蛋白，被认为是一种调节蛋白和能整合控制细胞增殖、分化和活力的各种信号途径的中继分子。其主要的功能是干扰微管的动力学，它能与可溶性的微管蛋白(T)结合形成S2T的复合物，减少游离的微管蛋白的数量，阻止微管的形成并促进其解聚。Stathmin通过磷酸化调节其生物学活性，磷酸化降低了对微管蛋白的亲和力以及对微管动力学的影响，使细胞能通过有丝分裂的进程。Stathmin还是包括神经蛋白SCG10，SCLIP和RB3/RB3′/RB3在内的蛋白家族的共有的成分，这些蛋白的Stathmin样功能域在体外同样有结合微管蛋白的能力。在曼氏血吸虫和日本血吸虫中，SLP由感染期尾蚴和童虫大量分泌，具有免疫体调节功能，实验证实其具有促进胸腺细胞凋亡，抑制宿主免疫功能的作用，可能是血吸虫免疫逃避机制之一。该蛋白与人的stathmin只有30％的同源性，不能被抗人stathmin的抗体所识别。
本发明人经过广泛而深入的研究，从日本血吸虫中分离了编码日本血吸虫细胞周期静止素DNA，并表达纯化了日本血吸虫细胞周期静止素，并进一步揭示了基于此多核苷酸与多肽的应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供分离的新的多肽——日本血吸虫细胞周期静止素以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供针对本发明的多肽——日本血吸虫细胞周期静止素的抗体。
本发明的另一个目的是提供了抑制本发明多肽表达的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供本发明的多肽应用于筛选日本血吸虫细胞周期静止素的抑制剂；或者用于肽指纹图谱鉴定。
本发明的另一个目的是提供本发明的核酸分子作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列的应用。
本发明的另一个目的是提供一种检测日本血吸虫的试剂盒，其含有特异性检测日本血吸虫细胞周期静止素的引物、抗体或多肽本身。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防日本血吸虫病的疫苗，其含有日本血吸虫细胞周期静止素或编码该酶的多核苷酸的真核表达载体。
在本发明的第一方面，本发明涉及一种分离的多肽，该多肽是日本血吸虫源的，它包含：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。更佳地，该多肽不含信号肽序列。
在本发明的第二方面，本发明还涉及一种分离的多核苷酸，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：
(a)编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；
更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中1-354位的序列。
在本发明的第三方面，本发明还涉及一种能与本发明多肽特异性结合的抗体。
在本发明的第四方面，提供了抑制本发明多肽表达的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供本发明的多肽和编码序列的用途。例如，利用多肽应用于筛选日本血吸虫细胞周期静止素的抑制剂，所筛选出的抑制剂以安全有效剂量与药物上可接受的赋型剂组成治疗日本血吸虫病的药物组合物；或者用于肽指纹图谱鉴定。利用编码序列或其片段作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列的应用。
在本发明的第六方面，提供了一种检测日本血吸虫的试剂盒，其含有特异性检测日本血吸虫细胞周期静止素的引物、抗体或多肽本身。
在本发明的第七方面，提供一种用于预防日本血吸虫的疫苗，其含有细胞周期静止素或编码该酶的多核苷酸的真核表达载体。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的，例如，利用本发明可以涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明多肽的方法。
本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：
“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。类似地，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。
蛋白质或多核苷酸“变体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
“生物活性”是指具有天然分子的结构、调控或生物化学功能的蛋白质。类似地，术语“免疫学活性”是指天然的、重组的或合成蛋白质及其片段在合适的动物或细胞中诱导特定免疫反应以及与特异性抗体结合的能力。
“抑制物”是指当与日本血吸虫细胞周期静止素结合时，一种可封闭或调节日本血吸虫细胞周期静止素的生物学活性的分子。抑制物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合日本血吸虫细胞周期静止素的分子。
“调节”是指日本血吸虫细胞周期静止素的功能发生改变，包括蛋白质活性的升高或降低、结合特性的改变及日本血吸虫细胞周期静止素的任何其它生物学性质、功能或免疫性质的改变。
″基本上纯″是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化日本血吸虫细胞周期静止素。基本上纯的日本血吸虫细胞周期静止素在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。日本血吸虫细胞周期静止素多肽的纯度可用氨基酸序列分析。
“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。
“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用。
“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链。
“衍生物”是指HFP或编码其的核酸的化学修饰物。这种化学修饰物可以是用烷基、酰基或氨基替换氢原子。核酸衍生物可编码保留天然分子的主要生物学特性的多肽。
“抗体”是指完整的抗体分子及其片段，如Fab、F(ab’)2及Fv，其能特异性结合日本血吸虫细胞周期静止素的抗原决定簇。
“分离的”一词指将物质从它原来的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)之中移出。比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，但同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分。既然载体或组合物不是它天然环境的成分，它们仍然是分离的。
如本发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的日本血吸虫细胞周期静止素”是指日本血吸虫细胞周期静止素基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化日本血吸虫细胞周期静止素。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。日本血吸虫细胞周期静止素多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种新的多肽——日本血吸虫细胞周期静止素，其基本上是由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括日本血吸虫细胞周期静止素的片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的日本血吸虫细胞周期静止素相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(I)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；或者(II)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代包含取代基；或者(III)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)通过本文的阐述，这样的片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
在本发明的第二方面，本发明提供了分离的多核苷酸，基本由编码具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列。本发明的多核苷酸是从日本血系成虫的cDNA文库中发现的。它包含的多核苷酸序列全长为354个碱基的开放读框编码了117个氨基酸。根据氨基酸序列同源比较发现，此多肽与曼氏血吸虫的细胞周期静止素有63％的同源性，可推断出该蛋白就是日本血吸虫细胞周期静止素。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，”核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较好是至少20-30个核苷酸，更好是至少50-60个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码日本血吸虫细胞周期静止素的多核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的编码日本血吸虫细胞周期静止素的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段，3)表达序列标签(EST)技术分离的多核苷酸片段。
本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。更经常选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体全长cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因功能的出现或丧失；(3)测定日本血吸虫细胞周期静止素的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2000个核苷酸之内，较佳的为1000个核苷酸之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中，检测日本血吸虫细胞周期静止素基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷酸序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法如双脱氧链终止法测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或直接用日本血吸虫细胞周期静止素编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
本发明中，编码日本血吸虫细胞周期静止素的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码日本血吸虫细胞周期静止素的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。
本发明中，编码日本血吸虫细胞周期静止素的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的日本血吸虫细胞周期静止素。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码日本血吸虫细胞周期静止素的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在步骤(3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在本发明的第三方面，本发明提供了用多肽，及其片段、衍生物作为抗原以生产抗体的方法。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还提供了针对日本血吸虫细胞周期静止素抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
多克隆抗体的生产可用日本血吸虫细胞周期静止素直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。制备日本血吸虫细胞周期静止素的单克隆抗体的技术包括但不限于杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产。而已有的生产单链抗体的技术也可用于生产抗日本血吸虫细胞周期静止素的单链抗体。
抗日本血吸虫细胞周期静止素的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的日本血吸虫细胞周期静止素在虫体中的分布和分泌排泄。
与日本血吸虫细胞周期静止素结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。本发明中的抗体可用于预防或阻断日本血吸虫细胞周期静止素引起的病理改变。
在本发明的第四方面，抑制日本血吸虫细胞周期静止素mRNA的寡核苷酸(包括反义RNA、反义DNA、干扰RNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。干扰RNA(iRNA)是一类能在体内特异降解靶基因mRNA从而使该基因沉默的一小段双链RNA分子，其序列一般是mRNA 5’下游70bp以后的一段互补序列。通过将该段序列及其反向序列同时克隆到同一个真核表达载体中，转染日本血虫体或组织细胞，该质粒转录出来的RNA形成dsRNA，能特异降解靶基因的iRNA。mRNA沉默技术可用于治疗由于日本血吸虫谷胱苷肽硫转移酶的无表达或异常/无活性表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常，从而确认基因(蛋白质的生理功能)。
在本发明的第五方面，本发明的多肽以及该多肽的抑制剂可直接用于血吸虫病的诊断和治疗。
具体就本发明的新的日本血吸虫细胞周期静止素而言，该蛋白是日本血吸虫感染期分泌的蛋白质，诱发免疫应答，可以作为一个潜在的靶抗原，用于日本血吸虫病的免疫诊断。
本发明也提供了筛选化合物以鉴定阻遏日本血吸虫细胞周期静止素活性的药剂的方法，细胞周期静止素在日本血吸虫尾蚴和童虫阶段表达和分泌，能抑制宿主的免疫应答，使童虫和成虫能逃避宿主的免疫攻击。其抑制剂能有效干扰日本血吸虫的免疫逃避，导致机体发挥免疫攻击而死亡，因此，它可以作为一个重要的疫苗靶标和药物靶标。日本血吸虫细胞周期静止素的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。日本血吸虫细胞周期静止素的拮抗剂可以与日本血吸虫细胞周期静止素结合并消除其功能，或是抑制细胞周期静止素产生，或是与细胞周期静止素的活性位点结合使该多肽不能发挥生物学功能。
本发明还涉及定量和定位检测日本血吸虫细胞周期静止素水平的免疫学诊断试验方法。试验中所检测的日本血吸虫细胞周期静止素水平，可以用作日本血吸虫病感染程度(虫负)的一个指标。
本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析。
编码日本血吸虫细胞周期静止素的多核苷酸也可用于多种治疗目的。重组的基因治疗载体可设计用于表达变异的日本血吸虫细胞周期静止素，以抑制内源性的日本血吸虫细胞周期静止素活性。例如，一种变异的日本血吸虫细胞周期静止素可以是缩短的、缺失了催化中心的日本血吸虫细胞周期静止素，虽可与下游的底物结合，但缺乏细胞周期静止素活性。或者根据该基因的多核苷酸序列设计一段小的反义核酸，干扰该基因的转录过程和转录后的翻译过程，同样可起到解除日本血吸虫免疫逃避和其他生理功能的作用。这种抑制内源性重组细胞周期静止素活性的质粒，可以以适当的剂型和方式进入肝胆道中，被日本血吸虫所吞食，进入其合胞体中而起作用。
编码日本血吸虫细胞周期静止素的多核苷酸可用于日本血吸虫病的诊断。编码日本血吸虫细胞周期静止素的多核苷酸可用于检测日本血吸虫的存在。如根据该多核苷酸序列设计引物，用多聚酶链式反应(PCR)从粪便标本的虫卵中提取核酸模板进行基因扩增，根据扩增的多核苷酸片段的大小是否符合预定值来确定日本血吸虫的感染。该技术高度敏感特异，能够克服常规形态学检测方法容易发生的漏检和误检。基因检测的方法不仅可以检测是否存在日本血吸虫的感染，而且还能对日本血吸虫进行分型，确定其亚种或株。编码日本血吸虫细胞周期静止素的DNA序列还可用于对活检标本进行杂交以判断日本血吸虫细胞周期静止素的表达状况。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条日本血染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。
简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条日本血染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。
在本发明的第六方面，日本血吸虫病的诊断除了除了常规的病原生物学检查，主要的方式是使用免疫学诊断试剂盒。主要有两类：酶联免疫试剂盒(ELISA)和快速免疫胶体金试剂盒(ICT)。日本血吸虫病的诊断即可通过检测血清或尿液中的循环抗原判断现症感染，也可通过检测血清或唾液中的特异性抗体来快速筛查。因此，检测循环抗原的方法能反映现症感染，但是敏感性较低。目前，临床用于辅助诊断的主要是抗体检测试剂盒。检测抗体的方法分为两种，一是用标记二抗作为检测试剂与被包被在反应板或反应膜上的抗原所捕获得抗体相结合，一种是用标记的抗原作为检测试剂。二抗作为检测试剂，一般只能检测一种抗体，而且非特异性结合比较高；标记抗原作为检测试剂，能检测多种抗体，特异性更高。
本发明可以利用纯化的日本血吸虫细胞周期静止素制备ELISA检测试剂盒，也可以利用纯化的日本血吸虫细胞周期静止素制备胶体金免疫层析检测试剂盒。
在本发明的第七方面，利用本发明的细胞周期静止素(SLP)基因可以进行疫苗的制作，该疫苗含有日本血吸虫细胞周期静止素或编码该酶的多核苷酸的真核表达载体。例如，DNA疫苗，将SLP基因的cDNA克隆到真核表达质粒pEGFP-N1；抽提质粒；将真核重组质粒DNA免疫小鼠后，取腹腔细胞涂片，荧光显微镜下观察荧光，以检测重组抗原的表达情况，如果检测到荧光，该重组质粒能在体表达目的蛋白，即可用于DNA疫苗。蛋白质疫苗，将SLP基因的cDNA克隆到原核表达质粒pET30a(+)，原核诱导表达后，用Ni-TED亲和层析柱纯化，得到纯化的(His)6融合蛋白，Bradford法检测蛋白质的浓度，即可用作蛋白质疫苗。多肽疫苗，SLP为重要的代谢酶，它在各物种之间相对保守，生物信息学发现，有一个表位位于酶活性部位，如果刺激机体产生的抗体刚好可以和此部位结合，将可能影响酶活性而产生致命的副作用，因此，肽疫苗的研制成为必须。
附图说明
图1为分离的日本血吸虫细胞周期静止素的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)，13.6kDa为蛋白质的分子量，箭头所指为分离出的蛋白条带。
图2为胶体金免疫层析模式图
标号
1测试线 2质控线 3玻璃纤维片
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：日本血吸虫细胞周期静止素的克隆
运用“SMART”cDNA文库构建试剂盒构建全长文库。
取文库液稀释到1∶100后，与噬菌体宿主菌XL1-Blue预吸附15分钟后，加入到顶琼脂中，然后铺到含LB和10mMMgSO4的平板上，6-18个小时后(见到噬菌斑互相融合)，加入SM液洗脱过夜，吸取洗脱液4000g离心5分钟，吸取上清加入20％PEG8000，沉淀DNA半小时后，12000g离心15分钟，用Mini Q水煮沸溶解，用通用引物进行PCR扩增。PCR反应体系(25μl总反应)：10×buffer(含Mg2+)2.5μl，10mM dNTP0.5μl，引物各0.5μl，文库DNA模板10.0μl，Taq酶0.25μl，补水至25.0μl。反应参数为：96℃预变性3min，94℃变性1min，72℃退火温度1min，72℃延伸2min10个循环，以后的退火温度分别为67度、62度、57度各10个循环，共40个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定获得一个约500bp的条带，回收该条带测序，得到一个510bp的序列(如SEQ ID NO：1所示)，该序列最大的ORF从第14bp到第367bp，编码117个氨基酸(SEQ ID NO：2)。我们将此克隆编码的蛋白质命名为日本血吸虫细胞周期静止素。
实施例2：cDNA克隆的同源检索
将本发明的日本血吸虫细胞周期静止素的序列及其编码的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215：403-10]，在Genbank、Swissport等数据库进行同源检索。与本发明的多肽同源性最高的基因是一种已知的曼是血吸虫tathmin-like Protein，在Genbank的准入号为AF091509。Blastx结果显示两者相同性为100％。
实施例3：用RT-PCR方法克隆编码日本血吸虫细胞周期静止素的基因
按Trizol Reagent说明书提取日本血吸虫成虫总RNA，用下列引物，按Promega AccessRT-PCR说明书进行RT-PCR(一步法)：
Primer1： 5’-ggcttccagtaaaatgaaagt-3’ (SEQ ID NO：3)
Primer2： 5’-gagttttcatcaatctttatt-3’ (SEQ ID N0：4)
Primer1为位于SEQ ID NO：1的5’端的第1bp开始的正向序列；
Primer2为SEQ ID NO：1的中的3’端反向序列。
扩增反应的条件：在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期：94℃ 30sec；40℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的1-484bp完全相同。
实施例4：Northern印迹法分析日本血吸虫细胞周期静止素基因的表达：
用一步法提取总RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。该法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠，0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行匀浆，加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1)，混合后离心。吸出水相层，加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀。将得到的RNA沉淀用70％乙醇洗涤，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用α-32P dATP通过随机引物法制备32P-标记的DNA探针。所用的DNA探针为图1所示的PCR扩增的日本血吸虫细胞周期静止素编码区序列(14bp至367bp)。将32P-标记的探针(约2×106cpm/ml)与转移了RNA的硝酸纤维素膜在一溶液中于42℃杂交过夜，该溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。杂交之后，将滤膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager进行分析和定量。
实施例5：重组日本血吸虫细胞周期静止素的体外表达、分离和纯化
根据SEQ ID NO：1和图1所示的编码区序列，设计出一对特异性扩增引物，序列如下：
Primer3：5’-CC
GAATTCATGAAAGTGACGCCAATTATC-3’ (Seq ID No：5)
Primer4：5’-AG
GTCGACCTAAGACGATTCATATTCCAT-3’ (Seq ID No：6)
此两段引物的5’端分别含EcoRI和Sal I酶切位点，其后分别为目的基因5’端和3’端的编码序列，NdeI和BamHI酶切位点相应于表达载体质粒pET-30a(+)(Novagen公司产品，Cat.No.69865.3)上的选择性内切酶位点。以含有全长目的基因的Sj尾蚴cDNA文库为模板，进行PCR反应。PCR反应条件为：总体积50μl中含文库DNA 20pg、引物Primer-5和Primer-6分别为10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司产品)1μl。循环参数：94℃ 20s，52℃30s，68℃ 2min，共25个循环。用EcoRI和Sal I分别对扩增产物和质粒pET-30a(+)进行双酶切，分别回收大片段，并用T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品)，在含卡那霉素(终浓度50μg/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆，在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中，宿主菌BL21(pET-SLP)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，28℃继续培养12小时。离心收集菌体，经超声波破菌，离心收集上清，用能与6个组氨酸(6His-Tag)结合的亲和层析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司产品)进行层析，用Throbinenterokinase酶切除载体序列后得到了纯化的目的蛋白日本血吸虫细胞周期静止素。经SDS-PAGE电泳，在14kDa处得到一单一的条带(图1)。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端15个氨基酸与SEQ ID NO：2所示的N-端15个氨基酸残基完全相同。
实施例6日本血吸虫细胞周期静止素的物理化学性质
将亲和层析纯化的日本血吸虫细胞周期静止素，用Throbinenterokinase酶切除载体序列后，经SDS-PAGE电泳，和标准分子量曲线，测得其分子量约为14kDa；该蛋白含酸性氨基酸残基18个，碱性氨基酸残基22个，利用Amerham等电聚焦电泳仪，经pH3-10和pH4-7梯度固定胶的等电聚焦电泳，测得其等电点为9.02。蛋白分子在水溶液环境中，呈球状，易溶于水，其半衰期在哺乳动物线粒体中为30小时，在酵母细胞中大于20小时，在大肠杆菌中超过10小时，蛋白质的结构不稳定。
实施例7抗日本血吸虫细胞周期静止素抗体的产生
用经亲和层析纯化的4mg日本血吸虫细胞周期静止素加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用该蛋白加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml日本血吸虫细胞周期静止素包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与日本血吸虫细胞周期静止素结合。该抗体是多克隆抗体，在琼脂免疫双扩试验中与重组抗原效价在1∶32以上，与虫体粗抗原的反应效价在1∶16以上。该抗体能够检测到重度感染的日本血吸虫病人的细胞周期静止素循环抗原。
实施例8：本发明的多核苷酸片段用作杂交探针的应用
从本发明的多核苷酸中挑选出合适的寡核苷酸片段用作杂交探针有多方面的用途，如用该探针可与不同来源的正常组织或病理组织的基因组或cDNA文库杂交以鉴定其是否含有本发明的多核苷酸序列和检出同源的多核苷酸序列，进一步还可用该探针检测本发明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常组织或病理组织细胞中的表达是否异常。从本发明的多核苷酸SEQ ID NO：1中选择寡核苷酸片段用作杂交探针，应遵循以下原则和需要考虑的几个方面：探针大小优选范围为18-50个核苷酸；GC含量为30％-70％，超过则非特异性杂交增加；探针内部应无互补区域；符合以上条件的可作为初选探针，然后进一步作计算机序列分析，包括将该初选探针分别与其来源序列区域(即SEQ ID NO：1)和其它已知的基因组序列及其互补区进行同源性比较，若与非靶分子区域的同源性大于85％或者有超过15个连续碱基完全相同，则该初选探针一般就不应该使用；此外，再根据已设计好的探针片段或其互补片段的替换突变序列作为第二探针。
探针1(probe1)，属于第一类探针，与SEQ ID NO：1的基因片段完全同源或互补(40Nt)：
5’-ttcagaaaagggcgccaccacatctataaagttatggata-3’ (Seq ID No：7)
探针2(probe2)，属于第二类探针，相当于SEQ ID NO：1的基因片段或其互补片段的替换突变序列(40Nt)：
5’-ttcagaaaagggcgccaccgcatctataaagttatggata-3’ (Seq ID No：8)
核酸探针通常采用滤膜杂交方法，包括斑点印迹法、Southern印迹法、Northern印迹法和复印方法等，它们都是将待测的多核苷酸样品固定在滤膜上后使用基本相同的步骤杂交。
与以下具体实验步骤有关的其它未列出的常用试剂及其配制方法请参考文献：DNAPROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press，1989(USA)以及更常用的分子克隆实验手册书籍如《分子克隆实验指南》(1998年第二版)[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社。
步骤：1)将新鲜或新鲜解冻的日本血吸虫用冷匀浆缓冲液(0.25mol/L蔗糖；25mmol/L Tris-HCl，pH7.5；25mmol/LnaCl；25mmol/L MgCl2)悬浮沉淀(大约10ml/g)，4℃用电动匀浆器以全速匀浆组织悬液，直至组织被完全破碎。用苯酚抽提法组织中的DNA，然后用乙醇沉淀。必须除去RNA污染时，可将RNA酶A加到DNA溶液中，终浓度为100ug/ml，37℃保温30分钟消化RNA，然后再重新抽提DNA。样膜的制备：
2)取4×2张适当大小的硝酸纤维素膜(NC膜)，用铅笔在其上轻轻标出点样位置及样号，每一探针需两张NC膜，以便在后面的实验步骤中分别用高强度条件和强度条件洗膜。 吸取及对照各15微升，点于样膜上，在室温中晾干。置于浸润有0.1mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl的滤纸上5分钟(两次)，晾干置于浸润有0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0)，3mol/LNaCl的滤纸上5分钟(两次)，晾干。夹于干净滤纸中，以铝箔包好，60-80℃真空干燥2小时。
3)探针用磷酸激酶标记32P后过Sephadex G-50柱，用液体闪烁仪监测同位素量，合并
第一峰的收集液后即为所需制备的32P-Probe(第二峰为游离γ-32P-dATP)。
4)预杂交：将样膜置于塑料袋中，加入3-10mg预杂交液(10×Denhardts；6×SSC，0.1mg/ml CT DNA(小牛胸腺DNA)。)，封好袋口后，68℃水浴摇2小时。
5)杂交：将塑料袋剪去一角，加入制备好的探针，封好袋口后，42℃水浴摇过夜。
6)洗膜：
高强度洗膜：
取出已杂交好的样膜；2×SSC，0.1％SDS中，55℃洗15分钟(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，55℃洗15分钟(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，62℃洗30分钟(2次)，室温晾干。
低强度洗膜：
取出已杂交好的样膜；2×SSC，0.1％SDS中，52℃洗15分钟(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，52℃洗15分钟(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，55℃洗15分钟(2次)，室温晾干。
7)X-光自显影：
-70℃，X-光自显影(压片时间根据杂交斑放射性强弱而定)。
实验结果：
采用低强度洗膜条件所进行的杂交实验，以上四个探针杂交斑放射性强弱没有明显区别；而采用低强度洗膜条件所进行的杂交实验，探针1的杂交斑放射性强度明显强于其它三个探针杂交斑的放射性强度。因而可用探针1定性和定量地分析本发明的多核苷酸在不同组织中的存在和差异表达。
实施例9：制备诊断试剂盒
ELISA检测试剂盒的制备：将纯化的日本血吸虫细胞周期静止素用碳酸盐包被缓冲液((pH9.6)配成0.1mg/ml，96孔酶标般的每孔加50ul，4℃过夜，倒掉包被液后，用含10％脱脂奶粉的PBS-Tween20溶液l00ul封闭孔壁多余的蛋白结合位点，4℃封闭过夜后倒掉封闭液。在酶标板反应孔中加入待测血清50ul，轻摇5分钟后，静置37℃湿盒中30～60分钟，用PBS-Tween20洗涤液反复震荡洗涤3次，每次3分钟；再加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(1∶1000稀释液50ul)，重复上述结合和洗涤过程，然后加底物和显色剂显色，当出现显色明显时，加入2％硫酸溶液终止反应。肉眼观察或用酶标仪测定反应结果。
胶体金免疫层析检测试剂盒的制备：常见的免疫层析系统有浸条式(dipstick)、卡片式和盒式三种。盒式免疫层析系统具有图2所示的相同的基本原理和构造：由层析系统(层析膜和一个或两个吸收层相连)固相免疫反应系统(抗原或抗体呈线状包被在层析膜特定的位置上作为测试线或质控线)，样品和胶体金标记试剂从一端加入，在膜的毛细管作用下，沿膜表面向另一端移动，并被吸收层吸收。样品中的待测成分与胶体金检测试剂在层析过程中与结合在膜上的捕获试剂发生免疫结合反应，而停留在包被线(包括测试线1和质控线2)上，显示出一条红色的反应线。当样品中不含待测成分，则在测试线1处不显色，而作为阳性对照的质控线2则显红色。浸条式检测试剂盒将测试条下端先后加入待测样品液和标记的胶体金溶液中；卡片式和盒式检测试剂盒中，标记的胶体金以干燥的固体形式保存在一端的玻璃纤维片3上，卡片式只需将待测溶液和缓冲液直接滴加到玻璃纤维片上，合上卡片，几分钟后即可盖面的观察窗判断结果；盒式将检测条装入小塑料盒中，放胶体金的一端对应圆形的加样孔，样品和缓冲液从加样孔加入，几分钟后从长方形的观察窗中判断结果。
本检测试剂盒中，层析膜为孔径8μm的混合纤维素膜，纯化的日本血吸虫细胞周期静止素包被在吸收层的远端作为检测线，日本血吸虫病人的阳性血清包被在吸收层的近端作为质控线，标记日本血吸虫细胞周期静止素的胶体金溶液滴加到玻璃纤维片后干燥，放置在层析膜的另一端。
胶体金的制备及标记：将氯金酸盐用去离子的超纯水配成0.01％的浓度，煮沸后，迅速加入1％的柠檬酸三钠溶液，(每100ml加2ml)，不离火迅速振摇混匀，一直煮到溶液颜色变为葡萄酒红色后撤火，用超纯水补足原有体积。制备的胶体金的平均粒径约20nm。将制备好的胶体金溶液用0.25mol/L的碳酸钾溶液调pH 6.0，在搅拌情况下按15μg/mL的量加入纯化的细胞周期静止素，反应10分钟，15000g的离心力离心30分钟，沉淀用原体积1/10的PBS(pH6.0)重新悬浮。
实施例10：制备疫苗
1.DNA疫苗
将SLP基因的cDNA克隆到真核表达质粒pEGFP-N1；按《分子克隆实验指南》所述的碱裂解法大量抽提质粒；将真核重组质粒DNA免疫小鼠后，取腹腔细胞涂片，荧光显微镜下观察荧光，以检测重组抗原的表达情况，如果检测到荧光，该重组质粒能在体表达目的蛋白，即可用于DNA疫苗。采用适合于对应动物的CpG佐剂，按照目的基因构建的真核质粒80μg+CpG 20μg/只小鼠的量，大腿内侧肌肉注射，每2w免疫一次，共免疫3次，最后一次免疫后30天，日本血吸虫尾蚴40条/只小鼠攻击感染，45天后，检测虫数和虫卵数，计算减虫率、减卵率，评价保护性效果。
2.蛋白质疫苗
将SLP基因的cDNA克隆到原核表达质粒pET30a(+)，原核诱导表达后，用Ni-TED亲和层析柱纯化，得到纯化的(His)6融合蛋白，Bradford法检测蛋白质的浓度，即可用作蛋白质疫苗。取50μg/50μl目的蛋白+50μl福氏佐剂/只小鼠，乳化混合后，颈部、背部、腹部、腹股沟皮下及小鼠足垫多点注射免疫小鼠，每2w免疫一次，共3次，初次免疫用完全福氏佐剂，后面两次免疫用不完全福氏佐剂；末次免疫后2w，日本血吸虫尾蚴40条/只小鼠攻击感染，45天后，检测虫数和虫卵数，计算减虫率、减卵率，评价保护性效果。
3.多肽疫苗
SLP为重要的代谢酶，它在各物种之间相对保守，生物信息学发现，有一个表位位于酶活性部位，如果刺激机体产生的抗体刚好可以和此部位结合，将可能影响酶活性而产生致命的副作用，因此，肽疫苗的研制成为必须。利用噬菌体呈现技术研究SLP所有的抗原表位，研究找出与宿主无交叉反应的抗原表位，将与宿主无交叉反应的抗原表位联合免疫小鼠后，日本血吸虫尾蚴40条/只小鼠攻击感染，45天后，检测虫数和虫卵数，计算减虫率、减卵率，评价保护性效果。
序列表
<110>中山大学
<120>日本血吸虫细胞周期静止素，其编码核酸及其应用
<130>slp
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>510
<212>DNA
<213>schistosoma japonicum
<400>1
ggcttccagt aaaatgaaag tgacgccaat tatcttcgct gtattttgtg tcgtaggtgc 60
tatgacattg atcacagcta caacgttaga gcaagcacct cacccgagtg aaaaagacat 120
ggaattagtg tatattgatg cagaatatga aaaagaaggt ggactgaaat caatatgcaa 180
cgaaataaaa cggtcattca gaaaagggcg ccaccacatc tataaagtta tggataaata 240
tatacggaag gaagatttag gcatgaaaat gttagatgtt gccaaaatcc ttggaagacg 300
cattgaaaaa cgtatggaat acatagcgaa gaaactggat aagatgatgg aatatgaatc 360
gtcttaggta tattcataac acaatagtta atattgttgt ggatttcaga caatgctttt 420
ttctgctttt tgtttactac tttcttaatg aatttgagca aataataaag attgatgaaa 480
actcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 510
<210>2
<211>117
<212>PRT
<213>schistosoma japonicum
<400>2
Met Lys Val Thr Pro Ile Ile Phe Ala Val Phe Cys Val Val Gly Ala
1 5 10 15
Met Thr Leu Ile Thr Ala Thr Thr Leu Glu Gln Ala Pro His Pro Ser
20 25 30
Glu Lys Asp Met Glu Leu Val Tyr Ile Asp Ala Glu Tyr Glu Lys Glu
35 40 45
Gly Gly Leu Lys Ser Ile Cys Asn Glu Ile Lys Arg Ser Phe Arg Lys
50 55 60
Gly Arg His His Ile Tyr Lys Val Met Asp Lys Tyr Ile Arg Lys Glu
65 70 75 80
Asp Leu Gly Met Lys Met Leu Asp Val Ala Lys Ile Leu Gly Arg Arg
85 90 95
Ile Glu Lys Arg Met Glu Tyr Ile Ala Lys Lys Leu Asp Lys Met Met
100 105 110
Glu Tyr Glu Ser Ser
115
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>schistosoma japonicum
<400>3
ggcttccagt aaaatgaaag t 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>schistosoma japonicum
<400>4
gagttttcat caatctttat t 21
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>schistosoma japonicum
<400>5
ccgaattcat gaaagtgacg ccaattatc 29
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>schistosoma japonicum
<400>6
aggtcgacct aagacgattc atattccat 29
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>schistosoma japonicum
<400>7
ttcagaaaag ggcgccacca catctataaa gttatggata 40
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>schistosoma japonicum
<400>8
ttcagaaaag ggcgccaccg catctataaa gttatggata 40
Claims (9)
1、一种分离的多肽-日本血吸虫细胞周期静止素，其特征在于它包含有：SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。
2、一种分离的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含选自下组中的一种：
(a)编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
3、如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有SEQ ID NO：1中1-354位的序列。
4、一种能与多肽结合的抗体，其特征在于所述抗体是能与所述日本血吸虫细胞周期静止素特异性结合的抗体。
5、一类调节多肽表达的多核苷酸，其特征在于它们是抑制所述日本血吸虫细胞周期静止素的表达的多核苷酸，且具有SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列或其片段的反义序列或者与其序列一致的寡聚双链RNA。
6、如权利要求1所述多肽的应用，其特征在于它应用于筛选日本血吸虫细胞周期静止素的抑制剂；或者用于肽指纹图谱鉴定。
7、如权利要求2-3中的任一权利要求所述的多核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
8、一种检测日本血吸虫的试剂盒，其特征在于它含有特异性检测日本血吸虫细胞周期静止素的引物、权利要求4所述的抗体、权利要求1所述的多肽任一或其组合。
9、一种用于预防日本血吸虫病的疫苗，其特征在于其含有权利要求1所述的多肽或含有权利要求2或3所述的多核苷酸的真核表达载体。
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| JP2013545453A (ja) * | 2010-11-01 | 2013-12-26 | ユニバーシティ・オブ・テクノロジー、シドニー | 免疫変調剤およびそれらの使用 |
-
2005
- 2005-03-11 CN CNA2005100243593A patent/CN1683403A/zh active Pending
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