CN115248263A - 一种定量检测唾液中抗癫痫药物的hplc-ms/ms方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗癫痫药物使用监测系统以及通过该系统定量检测唾液中抗癫痫药物的HPLC‑MS/MS方法，它包括如下步骤：(1)抗癫痫药物标准曲线的建立：a、对照品溶液的制备，b、系列浓度基质混合对照品溶液的制备，c、分别吸取系列浓度基质混合对照品溶液注入LC‑MS/MS仪，测定峰面积，得到抗癫痫药物的标准曲线；(2)待测样品中抗癫痫药物含量测定：d、供试品溶液的制备，e、供试品溶液的测定。本发明定量检测唾液中抗癫痫药物的HPLC‑MS/MS方法，具有稳定、高速、灵敏、重新性好等优点，用无创的唾液药物浓度检测替代有创血药浓度检测，采样便捷，样本存储要求低，极大的提高了检测效率和操作的便捷性，适合在临床大范围推广。
Description
技术领域
本发明涉及体内定量药物浓度分析，具体涉及一种定量检测唾液中抗癫痫药物的HPLC-MS/MS方法。
背景技术
在癫痫发作的治疗中，抗癫痫药物有特殊重要的意义。抗癫痫药物可通过两种方式来消除或减轻癫痫发作，一是影响中枢神经元，以防止或减少他们的病理性过度放电；其二是提高正常脑组织的兴奋阈，减弱病灶兴奋的扩散，防止癫痫复发。一般的传统抗癫痫药有苯妥英钠、卡马西平、乙琥胺、丙戊酸钠等，还有新型临床广泛使用的左乙拉西坦、拉莫三嗪、奥卡西平，新型抗癫痫药，较传统抗癫痫药毒副作用更小，作用更强，适合各种人群，尤其是儿童、老年人这类特殊人群。临床上，有新型抗癫痫药，逐渐取代传统抗癫痫用药的趋势。
抗癫痫药物作用的强度与药物在血浆中的浓度成正比，药物在体内的浓度随着时间而变化，因此目前主要采用高效液相色谱法监测血药浓度，以使药物的使用达到恰到好处，避免药物的毒副作用，但通过监测血液中药物浓度的方法是有创的，给患者带来了痛苦，其次监测成本高，增加了监测成本。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种抗癫痫药物使用监测系统，包括计算机设备，所述计算机设备用于执行包括如下步骤的计算机程序：
①检测或输入唾液中抗癫痫药物或其代谢物的含量，所述抗癫痫药物包括左乙拉西坦、拉莫三嗪或奥卡西平中的至少一种，所述抗癫痫药物的代谢物选自10-羟基-卡马西平；
②当左乙拉西坦的含量超过46μg/mL、拉莫三嗪的含量超过15μg/mL、奥卡西平的含量超过1μg/mL或10-羟基-卡马西平的含量超过35μg/mL，提示超量用药；
③当左乙拉西坦的含量低于12μg/mL、拉莫三嗪的含量低于2.5μg/mL、奥卡西平的含量低于0.01μg/mL或10-羟基-卡马西平的含量低于3μg/mL，提示补充用药。
本发明还提供了一种用于前述系统的液质联用检测唾液中抗癫痫药物及其代谢物含量的方法，它包括如下步骤：
(1)抗癫痫药物标准曲线的建立
a、对照品溶液的制备：取抗癫痫药物或抗癫痫药物代谢物对照品，加水或二甲基亚砜溶解，即得；
b、系列浓度标准工作溶液的制备：取步骤a对照品溶液，加稀释剂配置系列浓度对照品溶液，再加空白唾液配置含药的生物基质，取含药生物基质加内标溶液混匀，离心，取上清液加流动相A混匀即得；
c、分别吸取系列浓度标准工作溶液注入LC-MS/MS仪，测定峰面积，得到抗癫痫药物的标准曲线；
色谱条件如下：
色谱柱：以C18为填充剂；以含0.1％甲酸和5mmol/L乙酸铵的水溶液为流动相A，以体积比为500：500：1的乙腈-甲醇-甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：
质谱条件：离子源为ESI，扫描类型为MRM，质谱检测模式为正离子模式；
(2)待测样品中抗癫痫药物含量测定：
d、供试品溶液的制备
取唾液样品，离心，取上清液，加内标溶液混匀，再离心，取有机上清液加流动相A混匀，即得；
e、抗癫痫药物的测定
取供试品溶液，注入LC-MS/MS仪检测，以步骤c相同的条件检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中抗癫痫药物含量。
进一步地，步骤b所述系列浓度对照品溶液中抗癫痫药物或抗癫痫药物代谢物浓度为2～1000μg/mL。
更进一步地，所述抗癫痫药物为左乙拉西坦和/或拉莫三嗪，所述抗癫痫药物代谢物为奥卡西平代谢物。
更进一步地，所述抗癫痫药物为左乙拉西坦，其对照品加水溶解；所述抗癫痫药物为拉莫三嗪，其对照品加二甲基亚砜溶解；所述抗癫痫药物代谢物为奥卡西平代谢物，其对照品加二甲基亚砜溶解。
更进一步地，所述奥卡西平代谢物为10-羟基-卡马西平。
进一步地，步骤b所述稀释剂为体积比为20：80的乙腈-水溶液；所述含药的生物基质中系列浓度对照品溶液和空白唾液的体积比为1:19；所述含药的生物基质和内标工作液的体积比为1:19；所述离心的温度4℃，转速13000rpm，时间5min；所述上清液和流动相A的体积比为1：39。
进一步地，步骤c所述色谱条件中色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，50mm*2,1mm*1.7u，流速为0.3-0.45mL/min，进样量为7.5μL，柱温为40℃。
进一步地，步骤c所述质谱条件中检测离子对分别为：左乙拉西坦m/z171.0→126.1，拉莫三嗪m/z 255.9→211.1，奥卡西平代谢物10-羟基-卡马西平m/z 255.0→237.2，左乙拉西坦-d6 m/z 177→131.1，拉莫三嗪-13C-d3 m/z 259.0→214.0，利卡西平-d4 m/z 259.0→241.0。
进一步地，步骤d所述离心的温度为4℃，转速为3000rpm，时间为15min；所述再离心的温度为4℃，转速为13000rpm，时间为5min；所述上清液与内标溶液的体积比为1：19，所述有机上清液与流动相A的体积比为1：39。
更进一步地，所述内标溶液为含待测药物同位素内标20ng/ml的乙腈；所述待测药物同位素内标具体为左乙拉西坦-d6，拉莫三嗪-13C-d3和利卡西平-d4。
本发明所用“待测药物同位素内标”和被检测物是同一个物质，但是其中的几个氢原子被氘所取代，或者是12C换成了13C，其理化性质基本不变，其中的“左乙拉西坦-d6”是左乙拉西坦中6个氢被氘所取代、利卡西平-d4”是利卡西平中4个氢被氘所取代，拉莫三嗪-13C-d3是拉莫三嗪中的13C代替12C，同时其中的3个氢被被氘所取代。
本发明定量检测唾液中抗癫痫药物的HPLC-MS/MS方法，具有稳定、高速、灵敏、重新性好的优点，用无创的唾液药物浓度检测替代有创血药浓度检测，采样便捷，样本存储要求低，极大的提高了检测效率和操作的便捷性，适合在临床大范围推广。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1色谱图
图2质谱检测离子对
图3标准曲线
图4唾液中左乙拉西坦、拉莫三嗪和奥卡西平代谢物的浓度检测(上图为同时服用左乙拉西坦500mg bid和拉莫三嗪50mg bid的受试者唾液检测结果，该受试者左乙拉西坦所测浓度值为3.02ug/mL，拉莫三嗪浓度为1.1ug/mL；下图为服用奥卡西平300mg bid的受试者唾液检测结果，该受试者奥卡西平活性代谢产物10-羟基-卡马西平唾液中的实测浓度值为5.43ug/mL)
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得，其中，同位素内标购买于深圳市纶元生物科技有限公司，左乙拉西坦-d6，CAS号1133229-30-7；拉莫三嗪-13C-d3，CAS号1246815-13-3；利卡西平-d4，CAS号1020719-39-4。
实施例1、唾液中左乙拉西坦、拉莫三嗪和奥卡西平代谢物含量检测
(1)抗癫痫药物标准曲线的建立
a、对照品溶液的制备：分别称定5mg左乙拉西坦、拉莫三嗪和奥卡西平代谢物(10-羟基-卡马西平)标准对照品；左乙拉西坦加1ml水溶解，拉莫三嗪加1ml DMSO溶解，奥卡西平代谢物10-羟基-卡马西平加1ml DMSO溶解，得对照品溶液；
b、系列浓度标准工作溶液的制备：取步骤a对照品溶液，加稀释剂(20％乙腈·80％水)稀释成各药物浓度分别为1mg/ml的溶液，再进一步用稀释剂(20％乙腈·80％水)配制成药物浓度在2～1000μg/mL范围内的系列浓度对照品溶液，最后分别按照体积比1:19加入空白唾液配置成药物浓度在0.1～50μg/mL范围内的含药生物基质，具体配置浓度及过程如下：
内标工作液配置：分别称定1mg左乙拉西坦-d6、拉莫三嗪-13C-d3、利卡西平-d4；左乙拉西坦-d6加1ml水溶解，拉莫三嗪-13C-d3加1ml DMSO溶解，利卡西平-d4加1ml DMSO溶解，三种内标混合，加乙腈稀释为各内标浓度20ng/ml，配置过程如下：
取含药生物基质按1:19体积比添加内标工作液，混匀后4℃，13000rpm，离心5min，取上清液按体积1:39加流动相A混匀，即得系列浓度标准工作溶液；
c、分别吸取系列浓度标准工作溶液注入LC-MS/MS仪，测定峰面积，得到抗癫痫药物成分的标准曲线；
色谱条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18；以0.1％甲酸·5mmol/L乙酸铵·水为流动相A，以乙腈：甲醇：甲酸＝500：500：1为流动相B，流速为0.4ml/min，进样量为7.5μL，柱温为40℃，梯度洗脱程序为：
色谱出峰时间为：左乙拉西坦RT＝0.94min，左乙拉西坦-d6 RT＝0.93min，拉莫三嗪RT＝1.29min，拉莫三嗪-13C-d3 RT＝1.28min，奥卡西平代谢物10-羟基-卡马西平RT＝1.41min，利卡西平-d4 RT＝1.40min(见图1)。
质谱条件：离子源为ESI，扫描类型为MRM，质谱检测模式为正离子模式；
检测离子对分别为：左乙拉西坦m/z 171.0→126.1，拉莫三嗪m/z 255.9→211.1，奥卡西平代谢物10-羟基-卡马西平m/z 255.0→237.2，左乙拉西坦-d6 m/z 177→131.1，拉莫三嗪-13C-d3 m/z 259.0→214.0，利卡西平-d4 m/z 259.0→241.0(图2)；
(2)待测样品中抗癫痫药物含量测定：
d、供试品溶液的制备
受试者漱口15分钟后，采用Salivette唾液采样管采集唾液样本，离心(离心条件T＝4℃，转速＝3000rpm，时间＝15min)分离并收集上清液2ml分装入冻存管后-80℃冻存。
样品解冻至室温,取40ul唾液，加入760ul含待测药物同位素内标(左乙拉西坦-d6、拉莫三嗪-13C-d3、利卡西平-d各20ng/ml)的乙腈，涡旋震荡1min，再离心(离心条件T＝4℃，转速＝13000rpm，时间＝5min)，取25ul有机层上清液，加入975ul流动相A相，涡旋混合，即得；
e、抗癫痫药物的测定
取供试品溶液7.5μL，注入LC-MS/MS仪检测，以步骤d相同的条件检测，用空白样品监测操作过程是否存在污染，根据步骤(1)的标准曲线得到唾液中各抗癫痫药物含量。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例1精密度与准确度、线性验证
1.试验方法步骤：
a、取190ul空白唾液，分别加入定量下限工作液或质控工作液10ul，配置唾液中左乙拉西坦、拉莫三嗪、奥卡西平代谢物浓度都为0.1ug/ml的定量下限唾液样品和0.25、2.5、40ug/ml的质控系列唾液样品；
b、取40ul唾液样品，加入760ul含待测药物同位素内标(左乙拉西坦-d6、拉莫三嗪-13C-d3、利卡西平-d4各20ng/ml)的乙腈，涡旋震荡1min，再离心(离心条件T＝4℃，转速＝13000rpm，时间＝5min)，取25ul有机层上清液，加入975ul流动相A相重构，涡旋混合，取7.5μL注入LC-MS/MS仪检测；
c、按实施例1的色谱条件和质谱条件测定3批，根据每批随行标准曲线，计算样品的实测浓度，用Excel软件中单因素方差分析计算批间和批内精密度，同时计算相对偏差。检测完毕后分别用强洗针液甲酸：甲醇：乙腈＝1:100:100，弱洗针液20％乙腈·水·0.5％甲酸，柱塞杆清洗液20％乙腈·水；对检测仪器进行清洗。
2.试验结果:
2.1三批精密度和准确度分析
左乙拉西坦、拉莫三嗪和奥卡西平代谢物的LLOQ样品和低、中、高三个浓度质控样品的日内和日间RSD均小于15％，准确度在90～112％内，均符合标准要求。
表1：唾液中左乙拉西坦、拉莫三嗪和奥卡西平代谢物精密度和准确度分析
(三批，每个浓度n＝6个重复样本)
2.2标准曲线线性验证(见图3)
以药物浓度/内标浓度为x轴，以峰面积为y轴绘制标准曲线，其中
唾液中左乙拉西坦浓度的标准曲线：y＝0.00204x+0.0232(r＝0.9992)；
唾液中拉莫三嗪浓度的标准曲线：y＝0.000614x+0.00626(r＝0.9977)；
唾液中奥卡西平代谢物10-羟基-卡马西平浓度的标准曲线：y＝0.00333x+0.0862(r＝0.9976)。
2.3受试者样本检测
图4(上)为同时服用左乙拉西坦500mg bid和拉莫三嗪50mg bid的受试者唾液检测结果，该受试者左乙拉西坦所测浓度值为3.02ug/mL，拉莫三嗪浓度为1.1ug/mL。图4(下)为服用奥卡西平300mg bid的受试者唾液检测结果，该受试者奥卡西平活性代谢产物10-羟基-卡马西平唾液中的实测浓度值为5.43ug/mL。从图4可见，使用本发明方法可一次进样，同时检测出左乙拉西坦、拉莫三嗪和奥卡西平代谢物的浓度，其范围为0.1～50μg/mL。
用本发明检测方法对若干服用抗癫痫药物患者的唾液进行检测，得出了药物在唾液中治疗窗，即当左乙拉西坦的含量超过46μg/mg、拉莫三嗪的含量超过15μg/mg、奥卡西平的含量超过1μg/mg或10-羟基-卡马西平的含量超过35μg/mg，会产生难以耐受的毒性；当左乙拉西坦的含量低于12μg/mg、拉莫三嗪的含量低于2.5μg/mg、奥卡西平的含量低于0.01μg/mg或10-羟基-卡马西平的含量低于3μg/mg，则不产生治疗效应。
综上，本发明定量检测唾液中抗癫痫药物的HPLC-MS/MS方法，稳定、高速、灵敏、重新性好，可替代有创血药浓度检测，极大的提高了检测效率和操作的便捷性，适合在临床大范围推广。
Claims (10)
1.一种抗癫痫药物使用监测系统，其特征在于：包括计算机设备，所述计算机设备用于执行包括如下步骤的计算机程序：
①检测或输入唾液中抗癫痫药物或其代谢物的含量，所述抗癫痫药物包括左乙拉西坦、拉莫三嗪或奥卡西平中的至少一种，所述抗癫痫药物的代谢物选自10-羟基-卡马西平；
②当左乙拉西坦的含量超过46μg/mL、拉莫三嗪的含量超过15μg/mL、奥卡西平的含量超过1μg/mL或10-羟基-卡马西平的含量超过35μg/mL，提示超量用药；
③当左乙拉西坦的含量低于12μg/mL、拉莫三嗪的含量低于2.5μg/mL、奥卡西平的含量低于0.01μg/mL或10-羟基-卡马西平的含量低于3μg/mL，提示补充用药。
2.一种用于权利要求1所述系统的液质联用检测唾液中抗癫痫药物及其代谢物含量的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)抗癫痫药物标准曲线的建立
a、对照品溶液的制备：取抗癫痫药物和/或抗癫痫药物代谢物对照品，加水或二甲基亚砜溶解，即得对照品溶液；
b、系列浓度标准工作溶液的制备：取步骤a对照品溶液，加稀释剂配置系列浓度对照品溶液，再加空白唾液配置含药的生物基质，取含药的生物基质加内标溶液混匀，离心，取上清液加流动相A混匀，即得系列浓度标准工作溶液；
c、分别吸取系列浓度标准工作溶液注入LC-MS/MS仪，测定峰面积，得到抗癫痫药物的标准曲线；
色谱条件如下：
色谱柱：以C18为填充剂；以含0.1％甲酸和5mmol/L乙酸铵的水溶液为流动相A，以体积比为500：500：1的乙腈-甲醇-甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：
质谱条件：离子源为ESI，扫描类型为MRM，质谱检测模式为正离子模式；
(2)待测样品中抗癫痫药物含量测定：
d、供试品溶液的制备
取唾液样品，离心，取上清液，加内标溶液混匀，再离心，取有机上清液加流动相A混匀，即得；
e、抗癫痫药物的测定
取供试品溶液，注入LC-MS/MS仪检测，以步骤c相同的条件检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中抗癫痫药物含量。
3.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于：步骤b所述系列浓度对照品溶液中抗癫痫药物或抗癫痫药物代谢物浓度为2～1000μg/mL。
4.根据权利要求2或3所述检测方法，其特征在于：所述抗癫痫药物为左乙拉西坦和/或拉莫三嗪；所述代谢物为奥卡西平代谢物；所述奥卡西平代谢物为10-羟基-卡马西平。
5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于：所述抗癫痫药物为左乙拉西坦，其对照品加水溶解；所述抗癫痫药物为拉莫三嗪，其对照品加二甲基亚砜溶解；所述抗癫痫药物代谢物为奥卡西平代谢物，其对照品加二甲基亚砜溶解。
6.根据权利要2所述检测方法，其特征在于：步骤b所述稀释剂为体积比为20：80的乙腈-水溶液；所述含药的生物基质中系列浓度对照品溶液和空白唾液的体积比为1:19；所述含药的生物基质和内标溶液的体积比为1:19；所述离心的温度4℃，转速13000rpm，时间5min；所述上清液和流动相A的体积比为1：39。
7.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于：步骤c所述色谱条件中色谱柱为ACQUITYUPLC BEH C18，50mm*2,1mm*1.7u，流速为0.3-0.45mL/min，进样量为7.5μL，柱温为40℃。
8.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于：步骤c所述质谱条件中检测离子对分别为：左乙拉西坦m/z 171.0→126.1，拉莫三嗪m/z 255.9→211.1，奥卡西平代谢物10-羟基-卡马西平m/z 255.0→237.2，左乙拉西坦-d6m/z 177→131.1，拉莫三嗪-13C-d3 m/z259.0→214.0，利卡西平-d4 m/z 259.0→241.0。
9.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于：步骤d所述离心的温度为4℃，转速为3000rpm，时间为15min；所述再离心的温度为4℃，转速为13000rpm，时间为5min；所述上清液与内标溶液的体积比为1：19；所述有机上清液与流动相A的体积比为1：39。
10.根据权利要求2、7或10所述检测方法，其特征在于：所述内标溶液为含待测药物同位素内标20ng/ml的乙腈；所述含待测药物同位素内标具体为左乙拉西坦-d6，拉莫三嗪-13C-d3和/或利卡西平-d4。
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