CN113252810B - 一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法，属于中药技术领域，采用UPLC‑MS/MS法同时测定细辛中马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃酸Ⅲ及马兜铃酸Ⅶa含量的方法，专属性更强，控制成分更多，且对不同药用部位进行全方位测定分析，从而对药材质量的进行更全面的评估，对细辛药材的合理应用提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法，具体的，涉及一种同时测定细辛中马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃酸Ⅲ及马兜铃酸Ⅶa六种成分含量的测定方法，属于中药技术领域。
背景技术
马兜铃酸(Aristolochic acid，AA)为硝基菲类化合物，主要存在于马兜铃属植物中。因马兜铃酸具有强烈的致癌性，2003年以来，我国药品监管部门先后取消了青木香、关木通、广防己、天仙藤、马兜铃等药材的质量标准，《中国药典》2020年版一部中仅收录了细辛。细辛为马兜铃科植物北细辛、汉城细辛或华细辛的干燥根和根茎，标准中采用HPLC法对其中的马兜铃酸Ⅰ(即马兜铃酸A)进行了限量检查。
马兜铃酸为一类物质，研究发现马兜铃酸A、B均具有致突变作用，且马兜铃酸B的致突变作用强于马兜铃酸A。另外马兜铃酸D也很可能是马兜铃酸中具有遗传毒性的成分。因此，测定任何单一成分不足以全面衡量药材毒性，使其使用存在一定的安全隐患。建立一种能同时检测多种马兜铃酸类成分的方法，对此类药材质量和安全性控制将具有重要的意义。
关于药材中马兜铃酸类成分测定的分析方法，已经有很多研究报道，主要采用反相高效液相色谱法(RPLC)和高效液相串联质谱法(HPLC-MS)，但对入药率最高的细辛无相关报道，且主要集中于马兜铃酸I、II等个别成分。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法，能够同时测定马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃酸Ⅲ及马兜铃酸Ⅶa的含量，从而对药材质量的评估更全面。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法，采用UPLC-MS/MS法同时测定药材中马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃酸Ⅲ及马兜铃酸Ⅶa含量的方法。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述药材为细辛。
本发明技术方案的进一步改进在于：分别配制混合对照品溶液和供试品溶液，精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱质谱联用仪，测定，外标法计算含量，即得。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述对照品溶液的配制方法为：取马兜铃酸A、B、C、D、Ⅲ及Ⅶa对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中各含10～50ng的混合对照品溶液，即得。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述对照品溶液为加甲醇制成每1ml中各含50ng的混合对照品溶液。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述供试品溶液的配制方法为：取供试品粉末，过四号筛，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30～60分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述供试品溶液的配制过程中超声处理30分钟。
本发明技术方案的进一步改进在于：色谱条件为：
色谱柱：Water C18柱1.7μm 2.1×50mm；
以乙腈为流动相A，0.1％～0.2％甲酸为流动相B，采用梯度洗脱，
0～7min，流动相A：28％，流动相B：72％；
7～7.5min，流动相A：28→44％，流动相B：72→56％；
7.5～12min，流动相A：44％，流动相B：56％；
柱温：30℃，
流速：0.3ml·min-1。
本发明技术方案的进一步改进在于：质谱条件为：
离子源：ESI，扫描方式：正离子扫描，监测模式：多反应监测模式MRM，毛细管电压：3.00kV，锥孔电压：60V，脱溶剂气温度：350℃；
质谱参数如下：
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明能够同时测定6种马兜铃酸类成分(马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃酸Ⅲ及马兜铃酸Ⅶa)的含量，专属性更强，控制成分更多，且对不同药用部位进行全方位测定分析，从而对药材质量的进行更全面的评估，对细辛药材的合理应用提供依据。
中药成分复杂，且本试验中各待测成分含量极微，采用多反应监测(MRM)可以较好地排除其他常量特征成分干扰，从而得到毒性成分的准确含量。
附图说明
图1A是本发明混合对照品中马兜铃酸A的TIC图；
图1B是本发明批号171201样品根中马兜铃酸A的TIC图；
图1C是本发明回收率实验加样回收样品中马兜铃酸A的TIC图；
图2A是本发明混合对照品中马兜铃酸B的TIC图；
图2B是本发明批号171201样品根中马兜铃酸B的TIC图；
图2C是本发明回收率实验加样回收样品中马兜铃酸C的TIC图；
图3A是本发明混合对照品中马兜铃酸C的TIC图；
图3B是本发明批号171201样品根中马兜铃酸C的TIC图；
图3C是本发明回收率实验加样回收样品中马兜铃酸C的TIC图；
图4A是本发明混合对照品中马兜铃酸D的TIC图；
图4B是本发明批号171201样品根中马兜铃酸D的TIC图；
图4C是本发明回收率实验加样回收样品中马兜铃酸D的TIC图；
图5A是本发明混合对照品中马兜铃酸Ⅲ的TIC图；
图5B是本发明批号171201样品根中马兜铃酸Ⅲ的TIC图；
图5C是本发明回收率实验加样回收样品中马兜铃酸Ⅲ的TIC图；
图6A是本发明混合对照品中马兜铃酸Ⅶa的TIC图；
图6B是本发明批号171201样品根中马兜铃酸Ⅶa的TIC图；
图6C是本发明回收率实验加样回收样品中马兜铃酸Ⅶa的TIC图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：
实施例1
仪器
Waters Acquity UPLC/XEVO TQ-S超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪；KQ-400KDE超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；AE240型电子天平(上海梅特勒仪器有限公司)；
试药
对照品：马兜铃酸A(上海诗丹德，批号：3114，含量98.0％)，马兜铃酸B(上海诗丹德，批号：3519，含量99.7％)，马兜铃酸C(上海诗丹德，批号：4328，含量95.1％)，马兜铃酸D(上海诗丹德，批号：4327，含量94.5％)，马兜铃酸Ⅲ(上海诗丹德，批号：3520，含量99.4％)，马兜铃酸Ⅶa(上海诗丹德，批号：3521，含量99.6％)，
甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，Merck公司)；水为去离子水；其它试剂均为分析纯。
细辛样品12批，购自市场，编号1～12。
色谱及质谱条件
色谱条件：色谱柱：Water C18柱(1.7μm，2.1×50mm)；以乙腈为流动相A，0.1％甲酸为流动相B，梯度洗脱程序见表1；柱温：30℃，流速：0.3ml·min-1。
表1流动相梯度洗脱程序
质谱条件：离子源：ESI，扫描方式：正离子扫描，监测模式：多反应监测模式(MRM)，毛细管电压：3.00kV，锥孔电压：60V，脱溶剂气温度：350℃，质谱参数详见表2。
表2定性和定量离子及质谱条件表
混合对照品溶液的制备：取马兜铃酸A、B、C、D、Ⅲ及Ⅶa对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50ng的混合对照品溶液，即得，TIC图如图1A～6A所示。
供试品溶液的制备：取细辛饮片，粉碎(过四号筛)，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
线性关系考察
分别精密量取各对照品储备液配制系列浓度混合对照品溶液，分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，按正文条件进行测定，以进样浓度(ng·ml-1)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线。结果见表3，各待测成分线性关系良好。
表3各待测成分线性关系考察结果
精密度实验
取混合对照品溶液连续进样6次，分别计算各待测成分的精密度。结果各待测成分的RSD范围为2.1％～8.7％，仪器精密度良好。
重复性试验
取细辛供试品粉末(批号：171201)约0.5g，共六份，精密称定，照正文方法制备供试品溶液，样品中检出马兜铃酸A、马兜铃酸D及马兜铃酸Ⅶa，含量分别为0.663μg·g-1、22.158μg·g-1、1.049μg·g-1，RSD分别为7.5％、7.7％、8.5％。各待测成分方法重复性良好。
回收率试验
采用加样回收法，取重复性实验下已知含量的样品0.5g，共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液各25ml【马兜铃酸A：15.808ng·ml-1；马兜铃酸B：16.630ng·ml-1；马兜铃酸C：15.084ng·ml-1；马兜铃酸D：472.31μg·ml-1；马兜铃酸Ⅲ：20.171ng·ml-1；马兜铃酸Ⅶa：14.815ng·ml-1】，按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行分析，计算回收率，结果见表4，TIC图如图1C～6C所示。马兜铃酸A、B、C、D、Ⅲ及马兜铃酸Ⅶa的平均回收率(n＝6)分别为98.1％、100.2％、103.1％、101.7％、96.2％、104.3％，RSD分别为4.3％、4.2％、3.7％、5.2％、3.0％、2.5％，结果表明方法回收率良好，方法可行。
表4回收率试验结果
检出限测定
取各待测成分对照品溶液逐步稀释至信噪比约为3(S/N≈3)。此时各待测成分浓度即为检出限浓度，马兜铃酸A、B、C、D、Ⅲ及Ⅶa检出限浓度分别为0.2ng·ml-1、0.2ng·ml-1、1.0ng·ml-1、2.4ng·ml-1、0.2ng·ml-1、0.5ng·ml-1，折算样品检出限分别为10μg·kg-1、10μg·kg-1、50μg·kg-1、120μg·kg-1、10μg·kg-1、25μg·kg-1。
样品测定
药典规定用药部为根及根茎，为考察不同用药部位中马兜铃酸类成分分布情况，取全部12批样品，分离出根及根茎，分别进行测定(按供试品溶液进行制备)，对高于检出限成分采用外标法分别计算各成分的含量，结果见表5；其中，批号171201样品根的TIC图如图1B～6B所示。
表5样品测定结果(n＝2)
实施例2
色谱条件：色谱柱：Water C18柱(1.7μm，2.1×50mm)；以乙腈为流动相A，0.2％甲酸为流动相B，梯度洗脱程序见表1；柱温：30℃，流速：0.3ml·min-1。
质谱条件：离子源：ESI，扫描方式：正离子扫描，监测模式：多反应监测模式(MRM)，毛细管电压：3.00kV，锥孔电压：60V，脱溶剂气温度：350℃，质谱参数详见表2。
混合对照品溶液的制备：取马兜铃酸A、B、C、D、Ⅲ及Ⅶa对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50ng的混合对照品溶液，即得。
供试品溶液的制备：取细辛饮片，粉碎(过四号筛)，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱质谱联用仪，测定，外标法计算含量，即得。
实施例3
色谱条件：色谱柱：Water C18柱(1.7μm，2.1×50mm)；以乙腈为流动相A，0.1％甲酸为流动相B，梯度洗脱程序见表1；柱温：30℃，流速：0.3ml·min-1。
质谱条件：离子源：ESI，扫描方式：正离子扫描，监测模式：多反应监测模式(MRM)，毛细管电压：3.00kV，锥孔电压：60V，脱溶剂气温度：350℃，质谱参数详见表2。
混合对照品溶液的制备：取马兜铃酸A、B、C、D、Ⅲ及Ⅶa对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含10ng的混合对照品溶液，即得。
供试品溶液的制备：取细辛饮片，粉碎(过四号筛)，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱质谱联用仪，测定，外标法计算含量，即得。
实施例4
色谱条件：色谱柱：Water C18柱(1.7μm，2.1×50mm)；以乙腈为流动相A，0.1％甲酸为流动相B，梯度洗脱程序见表1；柱温：30℃，流速：0.3ml·min-1。
质谱条件：离子源：ESI，扫描方式：正离子扫描，监测模式：多反应监测模式(MRM)，毛细管电压：3.00kV，锥孔电压：60V，脱溶剂气温度：350℃，质谱参数详见表2。
混合对照品溶液的制备取马兜铃酸A、B、C、D、Ⅲ及Ⅶa对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50ng的混合对照品溶液，即得。
供试品溶液的制备取细辛饮片，粉碎(过四号筛)，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理60分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
测定法分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱质谱联用仪，测定，外标法计算含量，即得。
上述实施例均按照药典要求进行了方法学验证，结果显示方法准确可靠、灵敏、专属，各项指标均符合质量控制的要求，该含量测定方法可以适用于细辛的质量控制。
Claims (4)
1.一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法，其特征在于：采用UPLC-MS/MS法同时测定药材中马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃酸Ⅲ及马兜铃酸Ⅶa含量的方法；
所述药材为细辛；采用的仪器为Waters Acquity UPLC/XEVO TQ-S超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪；
分别配制混合对照品溶液和供试品溶液，精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱质谱联用仪，测定，外标法计算含量，即得；
所述供试品溶液的配制方法为：取供试品粉末，过四号筛，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30～60分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；
色谱条件为：
色谱柱：Water C18柱1.7μm 2.1×50mm；
以乙腈为流动相A，0.1％～0.2％甲酸为流动相B，采用梯度洗脱，
0～7min，流动相A：28％，流动相B：72％；
7～7.5min，流动相A：28→44％，流动相B：72→56％；
7.5～12min，流动相A：44％，流动相B：56％；
柱温：30℃，
流速：0.3ml·min-1；
质谱条件为：
离子源：ESI，扫描方式：正离子扫描，监测模式：多反应监测模式MRM，毛细管电压：3.00kV，锥孔电压：60V，脱溶剂气温度：350℃；
质谱参数如下：
2.根据权利要求1所述的一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法，其特征在于：所述对照品溶液的配制方法为：取马兜铃酸A、B、C、D、Ⅲ及Ⅶa对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中各含10～50ng的混合对照品溶液，即得。
3.根据权利要求2所述的一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法，其特征在于：所述对照品溶液为加甲醇制成每1ml中各含50ng的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法，其特征在于：所述供试品溶液的配制过程中超声处理30分钟。
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