CN108562656B - 中药制剂中生物碱和丹皮酚的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药制剂中生物碱和丹皮酚的含量测定方法，该方法采用高效液相色谱法检测消渴灵片和消渴灵胶囊中生物碱和丹皮酚的含量，为检查企业是否存在不投料或少投料、劣药材投料的行为提供有效依据。本发明根据中国药典2015年版四部通则0512，对检测的条件进行改进，优化溶液制备方法，使检测的方法更加高效、准确，检测方法具有专属性，阴性对照无干扰。

Description

中药制剂中生物碱和丹皮酚的含量测定方法

技术领域

本发明涉及一种中药制剂的检测方法，具体是消渴灵片和消渴灵胶囊中生物碱和丹皮酚的含量测定方法。

背景技术

消渴灵片由地黄、五味子、麦冬、黄芪、枸杞子等五味药材加水煎煮后，与牡丹皮、黄连、茯苓、红参、天花粉、石膏等的细粉混合制备而成，具益气养阴、清热泻火、生津止渴之功效，临床用于气阴两虚所致的消渴病。该药品的现行标准主要有《中国药典》2015年版一部及国家食品药品监督管理局标准YBZ06282004。除了性状、通则项外，《中国药典》收载了显微和薄层色谱鉴别来控制方中的茯苓、石膏、黄连、枸杞子等药材投料，但无含量测定项；而国家局标准YBZ06282004则在药典基础上，增加了天花粉、黄连、红参的显微鉴别、黄芪甲苷的薄层鉴别以及盐酸小檗碱的含量测定。消渴灵片处方中药材多达十一味，现行标准仅能反映药材投料的部分情况，难以反映投料药材的优劣。

发明内容

本发明的目的是提供一种中药制剂中生物碱和丹皮酚的含量测定方法，采用高效液相色谱法检测消渴灵片和消渴灵胶囊中生物碱和丹皮酚的含量，为检查企业是否存在不投料或少投料、劣药材投料的行为提供有效依据。

本发明所述中药制剂消渴灵片和消渴灵胶囊中生物碱和丹皮酚的含量测定方法包括以下步骤：

（1）色谱条件与系统适用性试验：HICHROM ALLtima C18 (250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，0.01mol/L磷酸二氢钾（用磷酸调PH至3）为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为275nm（丹皮酚）、345nm（非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱）。理论板数按盐酸巴马汀峰计算应不低于10000。

表1 梯度洗脱表

（2）对照品溶液的制备：取盐酸药根碱对照品、盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸药根碱3μg、盐酸巴马汀5μg、盐酸小檗碱30μg、丹皮酚10μg的溶液，即得。

（3）供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取3g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇100mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液50mL后，剩余滤液作为供试品溶液，即得。

（4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

（5）进行方法考察：分别进行线性关系考察、重复性考察、精密度考察、稳定性考察、专属性考察和回收率试验。

样品每片含黄连以非洲防己碱（C₂₀H₂₀NO₄ ⁺）、表小檗碱(C₂₀H₁₈NO₄)、盐酸药根碱(C₂₀H₂₀CLNO₄)、盐酸黄连碱(C₁₉H₁₄CLNO₄)、盐酸巴马汀(C₂₁H₂₂CLNO₄)以及盐酸小檗碱(C₂₀H₁₈CLNO₄)的总量计，不得少于0.50mg；含牡丹皮以丹皮酚(C₉H₁₀O₃)计，不得少于0.10mg。

本发明的有益效果是：

本发明根据中国药典2015年版四部通则0512，对检测的条件进行改进，优化溶液制备方法，使检测的方法更加高效、准确，检测方法具有专属性，阴性对照无干扰。该方法采用高效液相色谱法检测消渴灵片和消渴灵胶囊中生物碱和丹皮酚的含量，重复性和稳定性好、精密度和回收率高，为检查企业是否存在不投料或少投料、劣药材投料的行为提供有效依据。

附图说明

图1为企业生产的消渴灵片和消渴灵胶囊样品中黄连总碱含量箱型图；

图2为企业生产的消渴灵片和消渴灵胶囊样品中丹皮酚含量箱型图；

图3为非洲防己碱标准曲线图；

图4为表小檗碱标准曲线图；

图5为盐酸药根碱标准曲线图；

图6为盐酸黄连碱标准曲线图；

图7为盐酸巴马汀标准曲线图；

图8为盐酸小檗碱标准曲线图；

图9为丹皮酚标准曲线图；

图10为非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、丹皮酚混合对照品HPLC色谱图，图中1表示非洲防己碱，2表示表小檗碱，3-盐酸药根碱，4表示盐酸黄连碱，5表示盐酸巴马汀，6表示盐酸小檗碱，7表示丹皮酚；

图11为缺黄连阴性对照HPLC色谱图；

图12为缺牡丹皮阴性对照HPLC色谱图。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1

中药制剂消渴灵片和消渴灵胶囊中生物碱和丹皮酚的含量测定方法，方法包括以下内容：

仪器与试药：

戴安ULtimate 3000 高效液相色谱仪，配DAD检测器；ML204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），Hei-VAP 型旋转蒸发仪（德国HeidoLph公司）。

非洲防己碱对照品购于Stanford ChemicaLs 公司，批号MS170319-20，纯度99.91%；

表小檗碱对照品购于Stanford ChemicaLs 公司，批号PF170306-12，纯度97.54%；

盐酸药根碱对照品购于中国药品生物制品检定研究院，批号110733-201609，纯度89.5%；

盐酸黄连碱对照品购于中国药品生物制品检定研究院，批号112026-201601，纯度95.1%；

盐酸巴马汀对照品购于中国药品生物制品检定研究院，批号110732-201611，纯度86.8%；

盐酸小檗碱对照品购于中国药品生物制品检定研究院，批号110713-201613，纯度86.8%；

丹皮酚对照品购于中国药品生物制品检定研究院，批号110708-201407，纯度86.8%；

乙腈、磷酸二氢钾试剂为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

消渴灵片和消渴灵胶囊均为2017年国家评价性抽验的样品，样品每片含黄连以非洲防己碱（C₂₀H₂₀NO₄ ⁺）、表小檗碱(C₂₀H₁₈NO₄)、盐酸药根碱(C₂₀H₂₀CLNO₄)、盐酸黄连碱(C₁₉H₁₄CLNO₄)、盐酸巴马汀(C₂₁H₂₂CLNO₄)以及盐酸小檗碱(C₂₀H₁₈CLNO₄)的总量计，不得少于0.50mg；含牡丹皮以丹皮酚(C₉H₁₀O₃)计，不得少于0.10mg。

方法学考察所用样品由A公司提供，批号：ZKA1603。

检测方法包括以下步骤：

（1）色谱条件与系统适用性试验：HICHROM ALLtima C18 (250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，0.01mol/L磷酸二氢钾（用磷酸调PH至3）为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为275nm（丹皮酚）、345nm（非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱）。理论板数按盐酸巴马汀峰计算应不低于10000。

表1 梯度洗脱表

（2）对照品溶液的制备：取盐酸药根碱对照品、盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸药根碱3μg、盐酸巴马汀5μg、盐酸小檗碱30μg、丹皮酚10μg的溶液，即得。

（3）供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取3g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇100mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液50mL后，剩余滤液作为供试品溶液。

（4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。根据111批不同厂家不同批号样品的测定情况，对本次抽样的全部批消渴灵片以及胶囊进行汇总，结果见表2。对多于3个批号的企业样品作箱型图，详见图1～2。

表2 消渴灵片和胶囊含量测定各厂家结果汇总表

方法考察包括以下内容：

（1）线性关系考察

精密称定非洲防己碱对照品9.96mg、表小檗碱对照品9.05mg、盐酸药根碱对照品8.63mg、盐酸黄连碱11.92mg、盐酸巴马汀12.35mg至同一100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液1）；再精密称取盐酸小檗碱对照品10.64m至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即为盐酸小檗碱对照品溶液；又精密称取丹皮酚对照品11.80mg至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得丹皮酚储备液。精密吸取上述对照品溶液1）及丹皮酚储备液各5mL置同一20mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液①（含非洲防己碱对照品24.90μg/mL、表小檗碱对照品22.6μg/mL、盐酸药根碱对照品19.48μg/mL、盐酸黄连碱28.34μg/mL、盐酸巴马汀26.80μg/mL、丹皮酚58.94μg/mL）。精密称定非洲防己碱对照品10.09mg、盐酸药根碱对照品11.07mg至同一100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得对照品溶液2）；精密称定表小檗碱对照品9.52mg、盐酸黄连碱11.56mg、盐酸巴马汀11.45mg至同一100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液3）；分别精密吸取对照品溶液2）0.6mL、对照品溶液3）1mL、盐酸小檗碱对照品溶液3mL、丹皮酚储备液1mL至同一20mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液②（含非洲防己碱对照品3.02μg/mL、表小檗碱对照品4.64μg/mL、盐酸药根碱对照品2.97μg/mL、盐酸黄连碱5.50μg/mL、盐酸巴马汀4.97μg/mL、盐酸小檗碱27.71μg/mL、丹皮酚58.94μg/mL）。

分别精密吸取混合对照品溶液①及盐酸小檗碱对照溶液2μL、5μL、10μL（线性4、5、6），混合对照品溶液②液2μL、5μL、10μL（线性1、2、3）注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线。

结果表明：非洲防己碱对照品在6.049ng～249 ng，表小檗碱对照品在9.286ng～226.25ng，盐酸药根碱在5.945ng～194.82ng，盐酸黄连碱对照品在10.994ng～283.398ng，盐酸巴马汀对照品在9.939ng～267.995ng，盐酸小檗碱在55.413ng～1847.104ng，丹皮酚在23.576ng～589.410ng，范围内线性关系良好。结果见表3、图3～9。

表3 线性关系表

（2）重复性考察

取消渴灵片样品6份，按检测方法中供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，测定，计算，结果重复性良好。见表4。

表4 重复性考察结果

（3）精密度考察

对同一供试品溶液，按检测方法中的色谱条件，连续测定6次。结果6次测定各成分的RSD均符合要求，详见表5。试验表明，本法的精密度良好。

表5 精密度考察结果

（4）稳定性考察：

对同一供试品溶液，每隔一定时间测定一次，详见表6。试验表明，在30小时内，各个被测物均稳定。

表6 稳定性考察结果

（5）专属性考察

分别取缺黄连的阴性对照制剂和缺牡丹皮阴性对照制剂3g，按检测方法内容中供试品溶液制备方法依法制成黄连、牡丹皮的阴性对照溶液，进样测定。结果黄连阴性对照色谱中，在与非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品色谱峰相应的位置上，未检出色谱峰；牡丹皮阴性对照色谱中，未检出丹皮酚色谱峰。见图8～10。表明阴性对照无干扰。

（6）回收率试验

精密吸取线性关系的考察项下的对照品溶液1）25mL、精密称取丹皮酚对照品9.49mg，盐酸小檗碱对照品15.14mg，置同一1000mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（含非洲防己碱对照品2.49μg/mL、表小檗碱对照品2.21μg/mL、盐酸药根碱对照品1.95μg/mL、盐酸黄连碱2.83μg/mL、盐酸巴马汀2.68μg/mL、盐酸小檗碱13.14μg/mL、丹皮酚9.48μg/mL）。

取已知含量的样品消渴灵片，研细，取约3g，共6份，精密称定，精密加入上述对照品溶液100mL，按检测方法内容中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，测定并计算，结果表明：本方法回收率良好，结果见表7。

表7 回收率试验结果

Claims (2)

1.中药制剂中生物碱和丹皮酚的含量测定方法，其特征在于，所述方法是采用高效液相色谱法检测消渴灵片和消渴灵胶囊中生物碱和丹皮酚的含量的方法，测定方法包括以下步骤：

（1）色谱条件与系统适用性试验：HICHROM ALLtima C18，以乙腈为流动相A，0.01mol/L磷酸二氢钾为流动相B，其中0.01mol/L磷酸二氢钾用磷酸调pH至3；进行梯度洗脱65min，洗脱程序：0～25min，5% A→25%A；25～35min，25%A→30%A；35～50min，30%A→45% A；50～51min，45%A→5% A；51～65min，5%A；在波长275nm处检测丹皮酚，波长345nm处检测非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱；

（2）对照品溶液的制备：取非洲防己碱对照品、表小檗碱对照品、盐酸药根碱对照品、盐酸黄连碱对照品、盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成，每1mL含盐酸药根碱3μg、盐酸巴马汀5μg、盐酸小檗碱30μg、丹皮酚10μg的溶液，即得；

（3）供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取3g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇100mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液50mL后，剩余滤液作为供试品溶液；

（4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；

（5）进行方法考察：分别进行线性关系考察、重复性考察、精密度考察、稳定性考察、专属性考察和回收率试验。

2.根据权利要求1所述中药制剂中生物碱和丹皮酚的含量测定方法，其特征在于，所述样品每片含黄连以非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀以及盐酸小檗碱的总量计，不得少于0.50mg；含牡丹皮以丹皮酚计，不得少于0.10mg。

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