CN105675761A - 同时测定小檗皮中四种生物碱成分含量的hplc方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定小檗皮中四种生物碱成分含量的HPLC方法，所述四种生物碱成分为木兰花碱、药根碱、巴马汀和小檗碱，包括以下步骤：(1)制备供试品溶液；(2)制备对照品溶液；(3)分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测；(4)根据检测结果计算得到小檗皮中的木兰花碱、药根碱、巴马汀和小檗碱含量。本发明方法准确可靠、简便快速，为提高小檗皮的质量控制水平、促进药材的开发利用奠定了基础。同时，本发明的方法还准确检测出了小檗皮不同基源品种不同部位中的四种生物碱成分，为小檗皮的临床应用提供了有效的参考。

Description

同时测定小檗皮中四种生物碱成分含量的HPLC方法

技术领域

本发明涉及藏药材质量控制方法技术领域，具体涉及同时测定小檗皮中四种生物碱成分含量的HPLC方法。

背景技术

藏药小檗皮始载于《四部医典》，藏文译音“吉尔哇”、“杰星”等，来源于小檗科植物甘肃小檗BerberiskansuensisSchneid.及同属数种植物的干燥内皮。小檗皮具有清热解毒、排黄水等功效，是常用的藏药材，也是八味小檗皮散、四味姜黄汤散等藏药复方制剂的主要组成药味，可用于治疗黄水病、尿路感染、眼病等疾病，具有较好的开发利用价值。因此，检测小檗皮药材中有效成分的含量，对小檗皮药材的质量进行监控，具有十分重要的现实意义。

小檗皮药材的有效成分主要为生物碱类化合物，如小檗碱、木兰花碱、巴马汀和药根碱等。目前已有文献(子巴，HPLC法测定不同产地藏药小檗皮中盐酸小檗碱含量比较[J].四川中医,2011,29(9):45-46.；张琦等，藏药小檗皮中小檗碱的含量测定[J].中国民族医药杂志,2000,6(3):41-42.)报道测定了藏药小檗皮中小檗碱的含量。

然而，考虑到小檗皮药材中的有效成分繁多，以单一有效成分含量作为质量标准的指标可靠性不高。同时，目前小檗皮药材的用药部位界定不清，使用较为混乱：《部颁标准·藏药分册》规定为干燥内皮，但并没有明确指明是那个部位的内皮；六省区卫生局制订的《藏药标准》规定为茎或根的内皮；而且市场调研也发现有藏药材市场和饮片企业仍然销售带有栓皮的小檗皮药材的情况。用药部位的混乱必然影响药材的质量，如果不知道小檗皮不同部位中各个有效成分含量的差异，在临床上混乱使用，也对小檗皮的安全性和临床疗效的稳定性造成了极大的隐患。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种同时测定小檗皮中四种生物碱成分含量的HPLC方法，所述四种生物碱成分为木兰花碱、药根碱、巴马汀和小檗碱，包括以下步骤：

(1)制备供试品溶液：

取小檗皮粉末，加以盐酸-甲醇作为提取溶剂提取，过滤得供试品溶液；其中，所述盐酸与甲醇的体积比为1:200～1:50；

(2)制备对照品溶液：

取木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品，混合，加甲醇配制成混合对照品溶液；

(3)分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈色谱柱；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱程序为0～10分钟，17％～19％A；10～11分钟，19％～28％A；11～18分钟，28％～34％A；18～25分钟，34％～34％A；

(4)根据检测结果计算得到小檗皮中的木兰花碱、药根碱、巴马汀和小檗碱含量。

进一步地，步骤(1)中，所述甲醇的浓度为70％，盐酸的浓度为36～37％。

进一步地，步骤(1)中，所述提取是超声或回流提取。

进一步地，所述提取的时间是30分钟。

进一步地，步骤(1)中，所述样品重量与提取溶剂的质量体积比为60-120g/mL，优选的质量体积比为100g/mL。

进一步地，步骤(1)中，所述盐酸与甲醇的体积比为1:100。

进一步地，步骤(3)中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm。

更进一步地，所述色谱柱为InertSustainC₁₈色谱柱。

进一步地，所述色谱条件的柱温为25℃～35℃；流速为1.0mL/min。

进一步地，所述小檗皮的基源品种为鲜黄小檗Berberisdiaphana、匙叶小檗Berberisvernae或甘肃小檗Berberiskansuensis。

进一步地，所述小檗皮的部位为茎木、茎内皮、茎栓皮、根木、根内皮或根栓皮。

由于中国食品药品检定研究院提供的法定对照品只有盐酸小檗碱、盐酸药根碱和盐酸巴马汀，因此参照《中国药典》2015版一部“黄柏”药材中小檗碱的HPLC含量测定方法(国家药典委员会.中国药典2015年版一部.北京:中国医药科技出版社，2015，305)，本发明实际测定的药根碱含量是以盐酸药根碱计，巴马汀含量是以盐酸巴马汀计，小檗碱含量是以盐酸小檗碱计。

本发明通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了同时测定小檗皮中四种生物碱成分——木兰花碱、巴马汀、药根碱和小檗碱含量的HPLC方法，该方法准确可靠、简便快速，为提高小檗皮的质量控制水平、促进药材的开发利用奠定了基础。同时，本发明的方法还准确检测出了不同基源品种不同部位中四种生物碱成分，为小檗皮的临床应用提供了有效的参考。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1-4依次为木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的紫外光谱图。

图5为流动相为乙腈-0.02moL/L磷酸二氢钾溶液时样品色谱峰的分离情况。

图6为流动相为乙腈-水溶液时样品色谱峰的分离情况。

图7为流动相为乙腈-0.2％磷酸溶液时样品色谱峰的分离情况。

图8流动相为甲醇-0.2％磷酸溶液时样品色谱峰的分离情况。

图9为在梯度洗脱条件1下样品色谱峰的分离情况。

图10为在梯度洗脱条件2下样品色谱峰的分离情况。

图11为在梯度洗脱条件3下样品色谱峰的分离情况。

图12为在梯度洗脱条件4下样品色谱峰的分离情况。

图13为在梯度洗脱条件5下样品色谱峰的分离情况。

图14为小檗皮HPLC图谱(60min)。

图15为柱温为25℃时样品色谱峰的分离情况。

图16为柱温为30℃时样品色谱峰的分离情况。

图17为柱温为35℃样品色谱峰的分离情况。

图18为InertSustainC₁₈色谱柱(4.6×250mm，5μm，S/N：4GR98105，C/N：5020-07346)下的色谱图。

图19为InerstilODS-3色谱柱(250×4.6mm，5μm，SN：1A7143038，C/N：5020-01732)下的色谱图。

图20为WondaSilC₁₈-WR色谱柱(250×4.6mm，5μm，SN：3D5701-15，C/N：5020-39033)下的色谱图。

图21为混合对照品溶液(A)和小檗皮样品溶液(B)的HPLC色谱图，峰1为木兰花碱；峰2为盐酸药根碱；峰3为盐酸巴马汀；峰4为盐酸小檗碱。

图22为小檗皮不同药用部位的HPLC色谱图，峰1为木兰花碱；峰2为盐酸药根碱；峰3为盐酸巴马汀；峰4为盐酸小檗碱。

图23为小檗皮不同部位中四种生物碱成分及总生物碱含量的比较：数据以平均值±标准偏差表示。根据方差分析和Tukeys多重比较，误差棒上相同的字母表示组间没有显著性差异，而不同的字母则表示组间具有显著性差异(p<0.05)。

具体实施方式

仪器与试药：

美国Agilent1200高效液相色谱仪，配置二极管阵列(DAD)检测器；SartoriusBP121s电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；CQ-250超声波清洗器(上海必能信有限公司)。

盐酸药根碱(批号110733-201108)、盐酸巴马汀(批号11073-201108)、盐酸小檗碱(批号0713-9605)均购于中国食品药品检定研究院，木兰花碱购于成都曼思特生物科技有限公司(批号MUST-14122416，含量>98％)，乙腈为色谱纯(Fisher)，水为超纯水，盐酸为浓度36～37％的市售盐酸，其余试剂均为分析纯。

18批小檗皮药材，其中8批商品药材从各地藏医药或药材市场收集，另10批药材均为野外实地采集，分别为小檗科植物鲜黄小檗(Berberisdiaphana)、匙叶小檗(Berberisvernae)和甘肃小檗(Berberiskansuensis)具体如下所示：

No.	来源
		1	青海省黄南州藏院
2	青海省西宁市药材市场
		3	青海省西宁亚朗中藏药材批发部
4	西藏自治区藏药厂3 -->
		5	西藏自治区雄巴拉曲神水藏药厂
6	西藏自治区山南雍布拉康藏药厂
		7	四川省甘孜州德格县藏医院
8	四川省甘孜州得荣县中藏医院
		9	甘肃夏河县博拉乡(鲜黄小檗)
10	青海果洛州玛沁县(鲜黄小檗)
		11	四川康定县雅加埂(鲜黄小檗)
12	青海同仁县曲库乎乡(匙叶小檗)
		13	甘肃卓尼县刀告乡(匙叶小檗)
14	甘肃夏河县王格尔塘镇(匙叶小檗)
		15	甘肃夏河县达麦乡(匙叶小檗)
16	甘肃卓尼县申藏乡(匙叶小檗)
		17	甘肃卓尼县麻日村(甘肃小檗)
18	甘肃临潭县术布乡(甘肃小檗)

实施例1本发明方法的工艺参数筛选

本实施例中所用的小檗皮药材选自第4批：西藏自治区藏药厂。

1色谱条件的考察

(1)测定波长的选择

分别取木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品溶液，在200～400nm波长下扫描，得紫外光谱图(见图1-4)。根据木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的紫外吸收图谱，取供试品溶液分别在230、260、270、280nm不同波长下测定其峰面积，结果见表1。根据四种成分在不同波长下的峰面积及其响应丰度，综合考虑，最终确定测定波长为270nm。

表1小檗皮不同波长条件下考察结果

(2)流动相及梯度洗脱程序的考察

分别考察了乙腈-0.02moL/L磷酸二氢钾溶液、乙腈-水、乙腈-0.2％磷酸溶液、甲醇-0.2％磷酸溶液等流动相体系，结果见图5、图6、图7和图8。

结果表明，乙腈-0.02moL/L磷酸二氢钾体系主要色谱峰分离度较差，且峰型不对称，乙腈-水体系小檗碱和巴马汀色谱峰的分离度较差，而在水相加入0.2％磷酸后能明显使主要色谱峰的分离度提高，但甲醇的洗脱能力明显比乙腈更弱，造成色谱峰保留时间延后，故最终确定流动相系统为乙腈-0.2％磷酸溶液。

另外，分别考察了不同的梯度洗脱条件(表2、表3、表4、表5和表6)，优化流动相的比例，结果见图9、图10、图11、图12和图13。

经过反复的条件优化，根据四种成分的色谱峰峰型、分离度和保留时间，最终确定流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液，最佳梯度洗脱程序见表6。在该条件下，四种待测成分的色谱峰分离度良好，峰形对称，符合HPLC含量测定要求。

表2梯度洗脱条件1

表3梯度洗脱条件2

表4梯度洗脱条件3

表5梯度洗脱条件4

表6梯度洗脱条件5(筛选的最佳洗脱条件)

(3)采样时间的确定

在小檗皮样品溶液HPLC分析时，首先采用梯度洗脱采集60min的色谱图，梯度洗脱程序见表7，结果见图14。由图14可知，在25min后已无色谱峰出现，且基线平稳。因此，最终确定小檗皮HPLC分析的采样时间为25min。

表7采样时间考察的HPLC梯度洗脱程序

(4)柱温考察

分别考察了柱温为25℃、30℃和35℃条件下小檗皮中木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱色谱峰的分离情况，结果分别见图15、图16及图17。

结果表明，在三种柱温条件下，四种成分的色谱峰均分离良好，最终选用常用的30℃作为柱温条件。

(5)色谱柱考察

分别考察了3根不同厂家的色谱柱，观察供试品溶液中木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱色谱峰的分离情况，见图18、图19和图20。

结果表明，使用不同填料的色谱柱，四种成分的色谱峰均能得到较好的分离。

根据保留时间、峰型、峰的分离度和对称度综合考虑，最终选用InertSustainC₁₈色谱柱(4.6×250mm，5μm)作为优选的色谱柱。

根据上述研究结果，确定小檗皮药材中四种成分HPLC含量测定的最佳色谱条件为：色谱柱为InertSustainC₁₈色谱柱(4.6×250mm，5μm)；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样量为10μL；检测波长为270nm；流动相为乙腈(A)–0.2％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱程序为0～10min，17％～19％A；10～11min，19％～28％A；11～18min，28％～34％A；18～25min，34％～34％A。

在上述色谱条件下，小檗皮样品中木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰与其他色谱峰能够达到基线分离，分离度均大于1.5，符合HPLC含量测定要求。对照品和样品溶液的代表性HPLC色谱图见图21。

2对照品溶液的制备

精密称取木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含木兰花碱1.56mg、盐酸药根碱0.138mg、盐酸巴马汀0.072mg、盐酸小檗碱0.432mg的混合对照品溶液，即得。

3供试品溶液的制备

在供试品溶液的制备中，发明人对提取方法、提取溶媒、提取时间及提取溶媒用量进行了考察，最终确定最佳的供试品溶液制备方法为：取样品粉末0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入盐酸-70％甲醇(1:100)50mL，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用盐酸-70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(1)提取溶媒考察

取样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入不同溶剂50mL，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用各自溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，在上述色谱条件下进样测定，结果见表8；其中，1:100为体积比。

表8不同提取溶媒条件下各成分的含量(％)

结果表明，添加了少量盐酸的甲醇均可以有效提取出四种生物碱成分。

其中，盐酸-70％甲醇(1:100)溶液提取的木兰花碱含量最高，且盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量也较高，故最终选择盐酸-70％甲醇(1:100)作为优选的提取溶剂。

(2)提取方法考察

取样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-70％甲醇(1:100)50mL，称定重量，分别用不同方法提取，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，在上述色谱条件下进样测定，结果见表9。

表9提取方法考察

结果表明，三种提取方法均可以有效提取出四种生物碱成分。

其中，超声和回流提取的效率较高，综合考虑简便性和提取效果，优选的提取方法为超声提取。

(3)提取时间的考察

取样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-70％甲醇(1:100)溶液50mL，称定重量，分别超声处理(功率200W，频率40kHz)10、20、30、40、60min，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，在上述色谱条件下进样测定，结果见表10。

表10提取时间考察

结果表明，10-60min的提取时间均能有效提取出四种生物碱成分。

综合考虑时间和提取效果，确定优选的提取时间为30min。

(4)提取溶媒用量的考察

取样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入盐酸-70％甲醇(1:100)溶液30、40、50、60mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，在上述色谱条件下进样测定，结果见表11。

表11提取溶媒用量考察

结果表明，30-60mL的用量均能有效提取出四种生物碱成分。

综合用量和效果考虑，确定优选的提取溶媒用量为50mL。

4最终方法的确定

综上，最终方法确定为：

(1)制备供试品溶液：

取样品粉末0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入盐酸-70％甲醇(1:100)50mL，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用盐酸-70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。其中，当采用盐酸-70％甲醇(1:50)或是盐酸-70％甲醇(1:200)时，也是可行的。

(2)制备对照品溶液：

精密称取木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含木兰花碱1.56mg、盐酸药根碱0.138mg、盐酸巴马汀0.072mg、盐酸小檗碱0.432mg的混合对照品溶液，即得。

(3)分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：

色谱柱为InertSustainC₁₈色谱柱(4.6×250mm，5μm)；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样量为10μL；检测波长为270nm；流动相为乙腈(A)–0.2％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱程序为0～10min，17％～19％A；10～11min，19％～28％A；11～18min，28％～34％A；18～25min，34％～34％A。

(4)根据检测结果计算得到小檗皮中的木兰花碱、药根碱、巴马汀和小檗碱含量。

实施例2本发明方法的方法学验证

1线性关系的考察

精密吸取上述混合对照品溶液0.5、1、2、4、5、6、8mL，分别置于不同的10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。7种溶液各精密吸取10μL注入液相色谱仪，进行测定。以各成分的峰面积值为纵坐标，浓度(mg/mL)为横坐标进行回归处理，建立标准曲线，结果见表12。

表12线性关系考察结果

结果显示，各对照品在各自质量浓度范围内线性关系良好，证明本发明方法线性范围广，准确度高。

2精密度试验

精密吸取供试品溶液10μL，连续进样6次，记录各成分的峰面积，结果见表13。

结果显示，木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积值的RSD值分别为0.29％、0.55％、0.15％、0.14％，表明精密度良好。

表13精密度试验结果

3稳定性试验

取药材粉末约0.5g，精密称定，分别于0、1、2、4、8、12、24h进样测定，计算含量，结果见表14。

结果显示，木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量的RSD值分别为0.65％、1.07％、1.65％、0.71％，表明供试品溶液在24h内稳定。

表14稳定性试验结果

4重复性试验

取同一批次药材粉末6份，每份约0.5g，精密称定，在上述色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表15。

结果显示，样品中木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量的RSD分别为0.73％、1.55％、1.52％、0.55％，RSD均小于3％，表明建立的方法重复性良好。

表15重复性试验结果

5加样回收率试验

取同一批已知含量的样品粉末9份，每份约0.25g，精密称定，分别按已知含量的80％、100％、120％三个水平加入四种成分的对照品，按“3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下依次测定，计算回收率，结果见表16。

结果显示，四种成分的回收率在95％～105％，RSD均小于3％，表明方法回收率良好。

表16四种生物碱成分的加样回收率试验结果

实施例3小檗皮药材中四种生物碱成分的HPLC含量测定

取各小檗皮样品，每批平行3次，按实施例1中“4”项的方法进行HPLC测定，计算各样品中木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量，结果见表17。

表17小檗皮药材中四种成分的含量测定结果(n＝3)

结果表明，临床应用和市场流通的小檗皮药材中四种有效成分的总含量约为9.51％，其中木兰花碱的含量最高(均值5.98％)，其次为小檗碱(均值2.43％)，而药根碱(均值0.78％)和巴马汀(均值0.31％)的含量最低。

因此，本发明所建立的含量测定方法简单、快速、准确可靠，今后可用于小檗皮药材的质量控制和质量评价。

实施例4小檗皮三个基源品种不同部位中四种生物碱成分的HPLC含量测定

为了解生物碱成分在不同部位的分布情况，发明人对小檗皮三个品种的六个部位(茎木、茎内皮、茎栓皮、根木、根内皮和根栓皮)进行了对比研究。按实施例1中“4”项的方法进行HPLC测定，不同药用部位的HPLC色谱图见图22，含量测定结果见表18。并采用GraphPadPrism软件对不同部位的含量数据进行单因数方差分析和Tukeys多重比较，p<0.05为差异有统计学意义。

表18小檗皮三个基源品种不同部位中四种成分含量测定结果(n＝3)

注：“—”表示含量低于0.001％

根据方差分析结果(图23)，匙叶小檗、甘肃小檗和鲜黄小檗的不同部位中生物碱成分含量有明显的差异(p<0.01)，根内皮及茎内皮中四种生物碱成分及总生物碱含量明显高于茎木、茎栓皮、根木和根栓皮(p<0.05)。例如，木兰花碱在茎内皮中含量最高，根内皮含有最多的盐酸小檗碱，而总生物碱含量高低依次为：茎内皮(8.77％±1.93％)＞根内皮(8.48％±3.18％)＞根木(1.13％±0.49％)＞根栓皮(0.93％±0.94％)＞茎栓皮(0.47％±0.36％)＞茎木(0.31％±0.21％)。这些结果表明，四种生物碱成分主要存在于小檗皮的根内皮及茎内皮中，而在茎木、茎栓皮、根木和根栓皮中的含量很低。

可见，利用本发明的HPLC方法，有效检测出了小檗皮三个基源品种不同部位中四种生物碱成分的含量，与藏医临床常用小檗根内皮或茎内皮入药而不用茎木、茎栓皮、根木和根栓皮的结果一致，也证明了本发明HPLC方法的准确性，从而为小檗皮的进一步开发利用提供了参考依据。

综上所述，本发明通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了同时测定小檗皮中四种生物碱成分——木兰花碱、巴马汀、药根碱和小檗碱含量的HPLC方法，该方法准确可靠、简便快速，为提高小檗皮的质量控制水平、促进药材的开发利用奠定了基础。同时，本发明的方法还准确检测出了小檗皮不同基源品种不同部位中四种生物碱成分，为小檗皮的开发利用提供了有效的参考。

Claims (10)

1.同时测定小檗皮中四种生物碱成分含量的HPLC方法，其特征在于：所述四种生物碱成分为木兰花碱、药根碱、巴马汀和小檗碱，包括以下步骤：

(1)制备供试品溶液：

取小檗皮粉末，加以盐酸-甲醇作为提取溶剂提取，过滤得供试品溶液；其中，所述盐酸与甲醇的体积比为1:200～1:50；

(2)制备对照品溶液：

取木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品，混合，加甲醇配制成混合对照品溶液；

(3)分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈色谱柱；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～10分钟，17％～19％A；10～11分钟，19％～28％A；11～18分钟，28％～34％A；18～25分钟，34％～34％A；

(4)根据检测结果计算得到小檗皮中的木兰花碱、药根碱、巴马汀和小檗碱含量。

2.根据权利要求1所述的HPLC方法，其特征在于：步骤(1)中，所述甲醇的浓度为70％，盐酸的浓度为36～37％。

3.根据权利要求1所述的HPLC方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取是超声或回流提取。

4.根据权利要求3所述的HPLC方法，其特征在于：所述提取的时间是30分钟。

5.根据权利要求1或2所述的HPLC方法，其特征在于：步骤(1)中，所述样品重量与提取溶剂的质量体积比为60-120g/mL，优选的质量体积比为100g/mL。

6.根据权利要求1或2所述的HPLC方法，其特征在于：步骤(1)中，所述盐酸与甲醇的体积比为1:100。

7.根据权利要求1所述的HPLC方法，其特征在于：步骤(3)中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm；优选的色谱柱型号为InertSustainC₁₈色谱柱。

8.根据权利要求1-7任一项所述的HPLC方法，其特征在于：所述色谱条件的柱温为25℃～35℃；流速为1.0mL/min。

9.根据权利要求1-8任一项所述的HPLC方法，其特征在于：所述小檗皮的基源品种为鲜黄小檗Berberisdiaphana、匙叶小檗Berberisvernae或甘肃小檗Berberiskansuensis。

10.根据权利要求1或9所述的HPLC方法，其特征在于：所述小檗皮为小檗属植物的茎木、茎内皮、茎栓皮、根木、根内皮或根栓皮。