CN114137102B - 一种测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法 - Google Patents

一种测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药化学技术领域，提供了一种测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法。所述方法是先对待测样品进行衍生化处理再进行高效液相色谱的测定，衍生化处理是通过盐酸克仑特罗结构中含有的芳香伯胺基团，在溴化钾存在的条件下用亚硝酸钠进行重氮化后，与萘乙二胺偶合生成偶氮化合物。本发明提供的测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法分析成本低，方法简单方便，专属性好，准确度高，色谱柱耐用性好，对人体和环境造成的危害小。

Description

一种测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法
技术领域
本发明属于医药化学技术领域，更具体地说，是涉及一种测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法。
背景技术
氨溴特罗口服溶液是由盐酸氨溴索和盐酸克仑特罗组成的复方制剂，用于治疗急、慢性呼吸道疾病(如急、慢性支气管炎、支气管哮喘、肺气肿等)引起的咳嗽、痰液粘稠、排痰困难、喘息等症状。其中盐酸氨溴索为粘液溶解剂，能增加呼吸道粘膜浆液腺的分泌，减少粘液腺分泌，降低痰液粘度，促进肺表面活性物质的分泌，增加支气管纤毛运动，使痰液易于咳出。盐酸克仑特罗为选择性β受体激动剂，有松弛支气管平滑肌、增强纤毛运动、溶解粘液、促进痰液排出的作用。
作为氨溴特罗口服溶液中活性成分之一，盐酸克仑特罗的含量需准确测定。在氨溴特罗口服溶液中，盐酸克仑特罗处方含量为1μg/mL，是另一个活性成分盐酸氨溴索处方含量的1/1500。准确测量盐酸克仑特罗在氨溴特罗口服溶液中的含量并不容易，一方面由于盐酸克仑特罗含量较低，对测量方法的灵敏度要求较高；另一方面由于较高浓度的盐酸氨溴索以及在氨溴特罗口服溶液中以混合物形式存在的石榴香精中的杂质会干扰盐酸克仑特罗的测量，对测量方法的专属性要求较高；再者氨溴特罗口服溶液中含量比例较高的丙二醇和甘油对色谱柱的伤害较大。基于上述三个原因，准确测量氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗的含量存在一定的难度。
国家食品药品监督管理局公布的氨溴特罗口服溶液国家药品标准(WS1-(X-118)-2006Z)中收载了盐酸氨溴索含量测定方法，其色谱条件为：用十八烷基键合硅胶为填充剂，以1.7％磺基丁二酸钠二辛酯甲醇溶液-水-醋酸(700:300:100)为流动相，检测波长为296nm，进样量为50μL。该测定方法中流动相使用了1.7％的磺基丁二酸钠二辛酯溶液，由于盐浓度过高，对色谱柱损伤较大，致使色谱柱耐受性大大降低，不能满足日常样品检测要求，不适合氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的测定。
国内文献《HPLC法测定氨溴特罗口服溶液中两组分的含量和有关物质》报道的色谱条件为：用Zorbax SB-C18(4.6mm*250mm，5μm)为色谱柱，流动相为乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(含0.2％三乙胺，用磷酸调节pH至3.5)(19：81)，流速为1.0mL/min，检测波长为245nm，柱温为30℃，进样量为20μL。但是该方法在重现时发现阴性对照峰会干扰盐酸克仑特罗峰，其专属性不够，不能准确测定盐酸克仑特罗的含量。重现结果的高效液相色谱图如图1所示。
采用上述两种方法测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量均存在色谱柱不耐用、专属性差等不足，因此开发一种专属性强、色谱柱耐用的HPLC测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法，以解决现有技术中用HPLC测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法存在色谱柱不耐用、专属性差等的技术问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一方面，本发明提供一种测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法，包括：
配制对照品衍生化溶液：取盐酸克仑特罗对照品，加溶剂溶解稀释，加入溴化钾与亚硝酸钠发生重氮化反应，然后加入氨基磺酸铵振摇，再加入盐酸萘乙二胺发生偶合反应，制得对照品衍生化溶液；
配制供试品衍生化溶液：取待测氨溴特罗口服溶液样品，加溶剂稀释，加入溴化钾与亚硝酸钠发生重氮化反应，然后加入氨基磺酸铵振摇，再加入盐酸萘乙二胺发生偶合反应，制得供试品衍生化溶液；
含量测定：取供试品衍生化溶液和对照品衍生化溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算待测氨溴特罗口服溶液样品中盐酸克仑特罗的含量。
进一步的，在所述含量测定的步骤中，液相色谱中流动相A为乙酸和水的混合溶液，其中乙酸和水的体积比为(10：90)-(18：82)；流动相B为甲醇；按照如下梯度洗脱程序进行线性梯度洗脱：
Figure BDA0003335697420000031
进一步的，在所述含量测定的步骤中，液相色谱条件为：
色谱柱：C18柱，长250mm，内径4.6mm，填充料粒径5μm；
检测器：紫外检测器；
检测波长：445-455nm；
柱温：25-35℃；
流速：0.8-1.2mL/min；
进样量：20-100μL。
进一步的，所述溶剂为盐酸溶液。
进一步的，所述盐酸溶液的质量分数为0.4-18.5％。
进一步的，配制每1mL所述对照品衍生化溶液中加入0.3-0.6μg盐酸克仑特罗对照品、0.02-0.06mL的质量分数为8-12％的溴化钾溶液、0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的亚硝酸钠溶液、0.02-0.06mL的质量分数为1-2％的氨基磺酸铵溶液和0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的盐酸萘乙二胺溶液。
进一步的，配制每1mL所述供试品衍生化溶液中加入0.02-0.06mL的质量分数为8-12％的溴化钾溶液、0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的亚硝酸钠溶液、0.02-0.06mL的质量分数为1-2％的氨基磺酸铵溶液和0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的盐酸萘乙二胺溶液、以及加入的待测氨溴特罗口服溶液样品中含有盐酸克仑特罗0.3-0.6μg。
本发明中的溴化钾溶液、亚硝酸钠溶液、氨基磺酸铵溶液、盐酸萘乙二胺溶液均为水溶液。
进一步的，在所述配制对照品衍生化溶液和配制供试品衍生化溶液的步骤中，偶合反应温度为40-50℃。
进一步的，在所述配制对照品衍生化溶液和配制供试品衍生化溶液的步骤中，重氮化反应时间为3-10min，偶合反应时间为8-12min。
另一方面，本发明还提供一种上述测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法在测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量中的应用。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供的测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法是先进行衍生化处理再进行高效液相色谱的测定，衍生化处理是通过盐酸克仑特罗结构中含有的芳香伯胺基团，在溴化钾存在的条件下用亚硝酸钠进行重氮化后，再使用氨基磺酸铵分解重氮化后剩余的过量亚硝酸钠，最后与萘乙二胺偶合生成红色的偶氮化合物，在500nm左右波长下有较大吸收，而其他辅料在500nm波长下不出峰，使测定方法具有良好的专属性；同时盐酸克仑特罗重氮偶合后吸收强度增大；而衍生化过程中加入的衍生化试剂和溶剂，相当于对待测样品进行了稀释，减小了待测样品中的甘油、丙二醇对色谱柱的损伤。本发明提供的测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法分析成本低，方法简单方便，专属性好，准确度高，色谱柱耐用性好，对人体和环境造成的危害小，为氨溴特罗口服溶液的质量控制提供了有效手段。
附图说明
图1是依照《HPLC法测定氨溴特罗口服溶液中两组分的含量和有关物质》的方法重现试验的高效液相色谱图。
图2是实施例1的供试品衍生化溶液的高效液相色谱图。
图3是实施例1的对照品衍生化溶液的高效液相色谱图。
图4是盐酸克仑特罗衍生化溶液的紫外扫描图。
图5是盐酸克仑特罗衍生化溶液和盐酸氨溴索衍生化溶液在色谱条件1下高效液相色谱图。
图6是盐酸克仑特罗衍生化溶液和盐酸氨溴索衍生化溶液在色谱条件2下高效液相色谱图。
图7是盐酸克仑特罗衍生化溶液、盐酸氨溴索衍生化溶液和混合衍生化溶液1的高效液相色谱图。
图8是盐酸克仑特罗衍生化溶液、盐酸氨溴索衍生化溶液和混合衍生化溶液2的高效液相色谱图。
图9是盐酸克仑特罗阴性样品溶液、对照品衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质A衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质D衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质E衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质J衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质B衍生化溶液和供试品衍生化溶液的高效液相色谱图。
图10是盐酸克仑特罗浓度与峰面积的线性图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体的实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式只是用于详细说明本专利，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
本发明提供的测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法，包括如下步骤：
S1.配制对照品衍生化溶液：取盐酸克仑特罗对照品，加溶剂溶解稀释，加入溴化钾与亚硝酸钠发生重氮化反应，然后加入氨基磺酸铵振摇，再加入盐酸萘乙二胺发生偶合反应，制得对照品衍生化溶液；
S2.配制供试品衍生化溶液：取待测氨溴特罗口服溶液样品，加溶剂稀释，加入溴化钾与亚硝酸钠发生重氮化反应，然后加入氨基磺酸铵振摇，再加入盐酸萘乙二胺发生偶合反应，制得供试品衍生化溶液；
S3.含量测定：取供试品衍生化溶液和对照品衍生化溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算待测氨溴特罗口服溶液样品中盐酸克仑特罗的含量。
其中，在步骤S3中，液相色谱中流动相A为乙酸和水的混合溶液，其中乙酸和水的体积比为(10：90)-(18：82)；流动相B为甲醇；按照如下梯度洗脱程序进行线性梯度洗脱：
Figure BDA0003335697420000061
液相色谱条件为：
色谱柱：C18柱，长250mm，内径4.6mm，填充料粒径5μm；
检测器：紫外检测器；
检测波长：445-455nm；
柱温：25-35℃；
流速：0.8-1.2mL/min；
进样量：20-100μL。
在步骤S1和步骤S2中，偶合反应温度为40-50℃。
在步骤S1和步骤S2中，重氮化反应时间为3-10min，偶合反应时间为8-12min。
溶剂为盐酸溶液。优选的，盐酸溶液的质量分数为0.4-18.5％。
配制每1mL对照品衍生化溶液中加入0.3-0.6μg盐酸克仑特罗对照品、0.02-0.06mL的质量分数为8-12％的溴化钾溶液、0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的亚硝酸钠溶液、0.02-0.06mL的质量分数为1-2％的氨基磺酸铵溶液和0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的盐酸萘乙二胺溶液。
配制每1mL供试品衍生化溶液中加入0.02-0.06mL的质量分数为8-12％的溴化钾溶液、0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的亚硝酸钠溶液、0.02-0.06mL的质量分数为1-2％的氨基磺酸铵溶液和0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的盐酸萘乙二胺溶液、以及加入的待测氨溴特罗口服溶液样品中含有盐酸克仑特罗0.3-0.6μg。
本发明先后进行多次试验，现列举一部分试验作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明：
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；以下实施例中所用的原材料、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得；所述试剂用量，如无特殊说明，均为常规实验操作中试剂用量；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例以及各评价试验中所用的氨溴特罗口服溶液样品中盐酸克仑特罗处方含量为1μg/mL。
以下实施例以及各评价试验中的盐酸克仑特罗阴性样品指不含有盐酸克仑特罗的氨溴特罗口服溶液。
以下实施例以及各评价试验中所用溶剂的制备方法如下：量取200mL水加入500mL量瓶，量取浓盐酸(37％)90mL加入量瓶，再加水稀释至刻度，摇匀。
实施例1
一种测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法，包括如下步骤：
S1.配制对照品衍生化溶液：称取盐酸克仑特罗对照品两份，分别加溶剂溶解并定量稀释制成每1mL中含1μg盐酸克仑特罗对照品的溶液，分别量取10mL置于不同的25mL量瓶中，加入溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，制得对照品衍生化溶液Ⅰ和Ⅱ；
S2.配制供试品衍生化溶液：量取两份待测氨溴特罗口服溶液样品10mL，分别置于不同的25mL量瓶中，加入溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，制得供试品衍生化溶液Ⅰ和Ⅱ；
S3.含量测定：取供试品衍生化溶液和对照品衍生化溶液各50μL，注入液相色谱仪进行检测，色谱条件如下：
色谱柱：C18柱，长250mm，内径4.6mm，填充料粒径5μm；
检测器：紫外检测器；
检测波长：450nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：50μL；
流动相A(体积比)：乙酸：水＝14：86；
流动相B：甲醇；
按照如下梯度洗脱程序进行线性梯度洗脱：
Figure BDA0003335697420000081
Figure BDA0003335697420000091
记录色谱图并按外标法以峰面积计算待测氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗的含量。图2和图3分别为本实施例的供试品衍生化溶液Ⅰ、对照品衍生化溶液Ⅰ的高效液相色谱图。测试结果见表1。
表1待测氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗的含量测试结果
Figure BDA0003335697420000092
测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法的相关评价试验
1.检测波长选择
检测方法包括：
(1)制备对照品衍生化溶液：称取盐酸克仑特罗对照品，加溶剂溶解并定量稀释制成每1mL中含1μg盐酸克仑特罗对照品的溶液，量取10mL，置25mL量瓶中，加入溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
(2)取对照品衍生化溶液，采用PDA检测器在190-800nm波长下进行紫外扫描，获得盐酸克仑特罗衍生化合物紫外扫描图(图4)。
检测结论如下：
由图4可知，盐酸克仑特罗衍生化后的物质在450nm波长处有最大吸收。因此，本发明提供的测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法的检测波长为445-455nm较为适宜。
2.洗脱方式选择
检测方法包括：
(1)配制盐酸克仑特罗溶液：称取盐酸克仑特罗20mg，置10mL量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，量取1mL置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为盐酸克仑特罗储备液；再量取1mL盐酸克仑特罗储备液置入20mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为盐酸克仑特罗溶液(1μg/mL)。
(2)配制盐酸氨溴索溶液：称取盐酸氨溴索30mg，置20mL量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为盐酸氨溴索溶液(1.5mg/mL)。
(3)配制盐酸克仑特罗衍生化溶液：量取盐酸克仑特罗溶液10mL，置25mL量瓶中，加入溶剂5mL、0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为盐酸克仑特罗衍生化溶液。
(4)配制盐酸氨溴索衍生化溶液：量取盐酸氨溴索溶液10mL，置25mL量瓶中，加入溶剂5mL、0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为盐酸氨溴索衍生化溶液。
量取上述盐酸克仑特罗衍生化溶液、盐酸氨溴索衍生化溶液，分别在如下两种色谱条件进行检测并记录色谱图。
色谱条件1
流动相(体积比)：14％(体积百分数)乙酸水溶液：甲醇＝80：20；
检测波长：450nm；
流速：1.0mL/min；
进样量：50μL。
色谱条件2
流动相A(体积比)：乙酸：水＝14：86；
流动相B：甲醇；
检测波长：450nm；
流速：1.0mL/min；
进样量：50μL；
梯度洗脱表如下：
Figure BDA0003335697420000111
盐酸克仑特罗衍生化溶液和盐酸氨溴索衍生化溶液在色谱条件1下检测的高效液相色谱图见图5。
盐酸克仑特罗衍生化溶液和盐酸氨溴索衍生化溶液在色谱条件2下检测的高效液相色谱图见图6。
检测结论如下：
色谱条件1下盐酸氨溴索衍生化没有出峰，需提高有机相比例将其洗脱下来，而提高有机相比例又会导致盐酸克仑特罗衍生化峰出峰时间太早，容易与溶剂峰之间产生干扰。
色谱条件2下盐酸克仑特罗衍生化峰和盐酸氨溴索衍生化峰均出峰，且峰型良好。
因此本发明提供的测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法适合采用色谱条件2。
3.衍生化试剂选择
检测方法包括：
(1)配制盐酸克仑特罗溶液：称取盐酸克仑特罗20mg，置10mL量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，量取1mL置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为盐酸克仑特罗储备液；再量取1mL盐酸克仑特罗储备液置入20mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为盐酸克仑特罗溶液(1μg/mL)。
(2)配制盐酸氨溴索溶液：称取盐酸氨溴索30mg，置20mL量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为盐酸氨溴索溶液(1.5mg/mL)。
(3)配制盐酸克仑特罗衍生化溶液：量取盐酸克仑特罗溶液10mL，置25mL量瓶中，加入溶剂5mL、0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为盐酸克仑特罗衍生化溶液。
(4)配制盐酸氨溴索衍生化溶液：量取盐酸氨溴索溶液10mL，置25mL量瓶中，加入溶剂5mL、0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为盐酸氨溴索衍生化溶液。
(5)配制混合衍生化溶液1：量取盐酸氨溴索溶液10mL，置25mL量瓶中，加入0.5mL盐酸克仑特罗储备液，加入溶剂5mL和0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合衍生化溶液1。
(6)配制混合衍生化溶液2：量取盐酸氨溴索溶液10mL，置25mL量瓶中，加入0.5mL盐酸克仑特罗储备液，加入溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL和0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合衍生化溶液2。
(7)取上述盐酸克仑特罗衍生化溶液、盐酸氨溴索衍生化溶液、混合衍生化溶液1各50μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。结果见图7。
(8)取上述盐酸克仑特罗衍生化溶液、盐酸氨溴索衍生化溶液、混合衍生化溶液2各50μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。结果见图8。
检测结论如下：
由图7可知，混合衍生化溶液1在盐酸克仑特罗衍生化峰位置没有出峰，说明混合衍生化溶液1中的盐酸克仑特罗没有被衍生化。这是因为浓度为盐酸克仑特罗1500倍的盐酸氨溴索对衍生化试剂存在竞争作用，而盐酸氨溴索结构中伯胺基团周围存在较大的位阻，致使其衍生化速度较慢，也就是说需要等盐酸氨溴索衍生化完全后，盐酸克仑特罗才会被衍生化，故需要加入溴化钾以加速衍生化过程。
分别计算图8中混合衍生化溶液2和盐酸克仑特罗衍生化溶液中的盐酸克仑特罗衍生化峰峰面积，结果见表2。
表2盐酸克仑特罗衍生化峰峰面积对比表
溶液名称 衍生化峰峰面积
盐酸克仑特罗衍生化溶液 79354
混合衍生化溶液2 77428
由表2可知，混合衍生化溶液2中盐酸克仑特罗衍生化峰峰面积与盐酸克仑特罗衍生化溶液中盐酸克仑特罗衍生化峰的峰面积基本相当，说明混合衍生化溶液2中的盐酸克仑特罗衍生化完全。因此，加入10％的溴化钾溶液可以有效加速衍生化过程，使盐酸克仑特罗衍生化完全。
4.专属性评价
检测方法包括：
(1)配制盐酸克仑特罗阴性样品溶液：量取盐酸克仑特罗阴性样品10mL，置25mL量瓶中，加溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为盐酸克仑特罗阴性样品溶液。
(2)配制对照品衍生化溶液：称取盐酸克仑特罗对照品20mg，置100mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，量取1mL，置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，量取5mL，置25mL量瓶中，加溶剂10mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品衍生化溶液。
(3)配制杂质贮备液：称取盐酸氨溴索杂质A、盐酸氨溴索杂质D、盐酸氨溴索杂质E、盐酸氨溴索杂质J各5mg，盐酸氨溴索杂质B 7.5mg，分别置入不同的50mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为杂质A贮备液、杂质D贮备液、杂质E贮备液、杂质J贮备液和杂质B贮备液。(杂质B贮备液浓度为0.15mg/mL，其余杂质储备液浓度为0.1mg/mL)
(4)配制杂质衍生化溶液：量取杂质A贮备液、杂质D贮备液、杂质E贮备液、杂质J贮备液和杂质B贮备液各3mL，分别置于不同的100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为各杂质定位溶液(杂质B定位溶液浓度为4.5μg/mL，其余杂质定位溶液浓度为3μg/mL)。量取上述各杂质定位溶液各1mL，分别置于不同的25mL量瓶中，分别加入溶剂10mL、10％溴化钾1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为盐酸氨溴索杂质A衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质D衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质E衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质J衍生化溶液和盐酸氨溴索杂质B衍生化溶液。
(5)配制供试品衍生化溶液：量取待测氨溴特罗口服溶液样品10mL，置25mL量瓶中，加溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品衍生化溶液。
(6)取上述盐酸克仑特罗阴性样品溶液、对照品衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质A衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质D衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质E衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质J衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质B衍生化溶液和供试品衍生化溶液各50μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。结果见图9。图9中的峰图从上到下依次代表阴性样品溶液、对照品衍生化溶液、盐酸氨溴索杂质A、D、E、J、B的衍生化溶液及供试品衍生化溶液。
盐酸氨溴索杂质A、D、E、J、B的化学结构式如下：
Figure BDA0003335697420000151
/>
Figure BDA0003335697420000161
检测结论如下：
由图9可知，盐酸克仑特罗阴性样品溶液、盐酸氨溴索杂质A、盐酸氨溴索杂质D、盐酸氨溴索杂质E、盐酸氨溴索杂质J、盐酸氨溴索杂质B衍生化溶液，在盐酸克仑特罗衍生化峰位置都没有峰检出，均不会干扰盐酸克仑特罗的检测，本发明提供的测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法的专属性良好。
5.稳定性评价
检测方法包括：
(1)配制供试品衍生化溶液：量取待测氨溴特罗口服溶液样品10mL，置25mL量瓶中，加入溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品衍生化溶液。
(2)配制对照品衍生化溶液：称取盐酸克仑特罗对照品，加溶剂溶解并定量稀释制成每1mL中含1μg盐酸克仑特罗对照品的溶液，量取10mL，置25mL量瓶中，加入溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品衍生化溶液。
(3)取上述供试品衍生化溶液与对照品衍生化溶液，4℃下放置，分别在0h、4h、8h、12h分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图，考察峰面积的变化情况，检测结果见表3。
表3溶液稳定性试验结果
Figure BDA0003335697420000171
检测结论如下：
由表3可知，对照品衍生化溶液和供试品衍生化溶液在4℃条件下，12小时内峰面积变化率均小于2％，对照品衍生化溶液和供试品衍生化溶液稳定性良好，满足检测需求。
6.线性评价
检测方法包括：
(1)配制线性贮备液：称取盐酸克仑特罗对照品5mg，置50mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，量取1mL，置100mL量瓶中用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性贮备液。
(2)配制溶液：按照表4用线性贮备液配制各相应浓度的线性溶液。
表4线性溶液配制
编号 相对浓度(％) 移取贮备液体积(mL) 终体积(mL) 浓度(μg/mL)
L1 50 5 25 0.2000
L2 80 8 25 0.3200
L3 100 10 25 0.4000
L4 120 12 25 0.4800
L5 150 15 25 0.6000
(3)配制衍生化线性溶液：量取各相应浓度的线性溶液各10mL，分别置入不同的25mL量瓶中，加入溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为衍生化线性溶液。
(4)取各相应浓度的衍生化线性溶液各50μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。以浓度(C)为横坐标(X轴)，以峰面积(A)为纵坐标(Y轴)，进行线性回归分析。线性图见图10。检测结果见表5。
表5线性试验结果
Figure BDA0003335697420000181
检测结果如下：
由表5可知，盐酸克仑特罗在0.2-0.6μg/mL浓度范围内，线性回归方程为y＝249,759.6112x+182.1034，相关系数为0.9999，大于0.999，Y轴截距占100％浓度峰面积的0.20％，小于2.0％，线性关系良好。
7.准确度评价
检测方法包括：
(1)配制对照品衍生化溶液：称取盐酸克仑特罗对照品10mg，置100mL量瓶中，加乙腈用少量水助溶，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，量取1mL，置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，量取上述溶液10mL，置25mL量瓶中，加入溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品衍生化溶液。平行配制两份。
(2)配制准确度贮备液：称取盐酸克仑特罗对照品15mg，置100mL量瓶中，加乙腈用少量水助溶，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，量取2.5mL，置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为准确度贮备液。
(3)配制80％回收率溶液：量取浓配盐酸克仑特罗阴性样品(浓配指所有成分浓度为正常盐酸克仑特罗阴性样品浓度的1.66倍)6mL，置25mL量瓶中，加入准确度贮备液4mL，摇匀，加入溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为80％回收率溶液。平行配制3份。
(4)配制100％回收率溶液：量取浓配盐酸克仑特罗阴性样品6mL，置25mL量瓶中，加入准确度贮备液5mL，摇匀，加入溶剂4mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为100％回收率溶液。平行配制3份。
(5)配制120％回收率溶液：量取浓配盐酸克仑特罗阴性样品6mL，置25mL量瓶中，加入准确度贮备液6mL，摇匀，加入溶剂3mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加入1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加入0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为120％回收率溶液。平行配制3份。
(6)取对照品衍生化溶液、80％回收率溶液、100％回收率溶液和120％回收率溶液各50μl，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。重复操作两次，测试结果分别见表6和表7。
表6准确度试验结果1
Figure BDA0003335697420000191
Figure BDA0003335697420000201
表7准确度试验结果2
Figure BDA0003335697420000202
计算平均回收率，结果见表8。
表8准确度试验平均结果
回收率1(％) 回收率2(％) 平均回收率(％) RSD(％)
96.7 97.6 97.1 0.70
检测结论如下：
两次试验共18份样品回收率均在96.0-98.4％之间，平均回收率为97.1％，在95-105％之间，RSD值为0.70％，小于2％。因此，本发明提供的测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法具有良好的准确度和重复性。
8.重复性评价
检测方法包括：
(1)配制盐酸克仑特罗阴性样品溶液：量取盐酸克仑特罗阴性样品10mL，置25mL量瓶中，加溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为盐酸克仑特罗阴性样品溶液。
(2)配制对照品衍生化溶液：称取盐酸克仑特罗对照品20mg，置100mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，量取1mL，置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，量取5mL，置25mL量瓶中，加溶剂10mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品衍生化溶液。
(3)配制重复性溶液：量取待测氨溴特罗口服溶液样品10mL，置25mL量瓶中，加溶剂5mL、10％溴化钾溶液1mL与0.3％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置3分钟，加1.5％氨基磺酸铵溶液1mL，时时振摇10分钟，再加0.3％盐酸萘乙二胺溶液1mL，摇匀，50℃水浴中放置10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为重复性溶液。平行配制6份。
(4)取盐酸克仑特罗阴性样品溶液、对照品衍生化溶液、重复性溶液各30μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。测试结果分别见表9。
表9重复性试验结果
Figure BDA0003335697420000211
Figure BDA0003335697420000221
注：表中“N/A”表示无此项。
检测结论如下：
平行配制的6份样品含量检测结果RSD值为0.72％，小于1％，表明本发明提供的测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法的重复性良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量的方法，其特征在于，包括：
配制对照品衍生化溶液：取盐酸克仑特罗对照品，加溶剂溶解稀释，加入溴化钾与亚硝酸钠发生重氮化反应，然后加入氨基磺酸铵振摇，再加入盐酸萘乙二胺发生偶合反应，制得对照品衍生化溶液；
配制供试品衍生化溶液：取待测氨溴特罗口服溶液样品，加溶剂稀释，加入溴化钾与亚硝酸钠发生重氮化反应，然后加入氨基磺酸铵振摇，再加入盐酸萘乙二胺发生偶合反应，制得供试品衍生化溶液；
含量测定：取供试品衍生化溶液和对照品衍生化溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算待测氨溴特罗口服溶液样品中盐酸克仑特罗的含量；
在所述含量测定的步骤中，液相色谱中流动相A为乙酸和水的混合溶液，其中乙酸和水的体积比为(10：90)-(18：82)；流动相B为甲醇；按照如下梯度洗脱程序进行线性梯度洗脱：
Figure FDA0004107691980000011
色谱柱：C18柱，长250mm，内径4.6mm，填充料粒径5μm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述含量测定的步骤中，液相色谱条件为：
检测器：紫外检测器；
检测波长：445-455nm；
柱温：25-35℃；
流速：0.8-1.2mL/min；
进样量：20-100μL。
3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述溶剂为盐酸溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述盐酸溶液的质量分数为0.4-18.5％。
5.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，配制每1mL所述对照品衍生化溶液中加入0.3-0.6μg盐酸克仑特罗对照品、0.02-0.06mL的质量分数为8-12％的溴化钾溶液、0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的亚硝酸钠溶液、0.02-0.06mL的质量分数为1-2％的氨基磺酸铵溶液和0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的盐酸萘乙二胺溶液。
6.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，配制每1mL所述供试品衍生化溶液中加入0.02-0.06mL的质量分数为8-12％的溴化钾溶液、0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的亚硝酸钠溶液、0.02-0.06mL的质量分数为1-2％的氨基磺酸铵溶液和0.02-0.06mL的质量分数为0.15-0.45％的盐酸萘乙二胺溶液、以及加入的待测氨溴特罗口服溶液样品中含有盐酸克仑特罗0.3-0.6μg。
7.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，在所述配制对照品衍生化溶液和配制供试品衍生化溶液的步骤中，偶合反应温度为40-50℃。
8.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，在所述配制对照品衍生化溶液和配制供试品衍生化溶液的步骤中，重氮化反应时间为3-10min，偶合反应时间为8-12min。
9.一种如权利要求1-8中任一所述的方法在测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗含量中的应用。
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