CN114740124B - 一种测定中药复方制剂中对氨基酚的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种测定中成药复方制剂中对氨基酚杂质的检测方法，属于药物分析领域。本发明的方法包括以下的步骤：（1）配制对照品溶液；（2）配制待测样品溶液；（3）配制内标溶液；（4）样品的定量分析：采用液相色谱仪检测样品。采用本发明所提供的HPLC法测定中药制剂中对氨基酚的含量，样品处理的步骤简单，方法灵敏度高、准确性好，解决了难以在成分复杂的中药制剂中检测对氨基酚杂质技术问题，且相比其他检测方法，本发明的检测方法成本更低，检测限更低。

Description

一种测定中药复方制剂中对氨基酚的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种测定中药复方制剂中对氨基酚的方法，属于药物分析领域。
背景技术
对乙酰氨基酚是具有长期临床有效性和安全性数据的非甾体消炎药，具有解热镇痛的功效，常用于中药复方制剂中，对乙酰氨基酚中可能含有对氨基酚杂质，对氨基酚(4-aminopheno)的化学结构显示其具有显著毒性，化学名为4-氨基苯酚，结构式为：
中国药典2020年版对乙酰氨基酚标准中收录有对氨基酚的检测方法，该方法采用高效液相色谱(HPLC)法检测对氨基酚，并且规定其限度为0.005％。但市场中常见中药产品中，一般采用多种中药与对乙酰氨基酚组成复方使用，在复方中的对氨基酚杂质尚无较好的检测方法进行检测，存在用药安全隐患。
高效液相色谱检测对氨基酚(中国药典2020年版对乙酰氨基酚有关物质方法)。中药复方制剂成分复杂，色谱峰杂乱，无法定量检测对氨基酚。为了提高检测精度，现有技术为采用液-质谱联用方式，该方法操作较为复杂，且仪器昂贵，测定成本高，在中药成分复杂的前提下，数据分析处理也较为困难。
关于对氨基酚杂质的HPLC检测方法，以下的专利文献进行过披露：
CN112782332A披露了一种对乙酰氨基酚药品中对氨基酚杂质的HPLC检测方法，包括以下的步骤：以含有抗坏血酸的醋酸铵-甲醇溶液为溶剂溶解所述对乙酰氨基酚药品，得到待测样品溶液；再以所述醋酸铵-甲醇溶液为流动相，使用高效液相色谱仪检测所述待测样品溶液中对氨基酚杂质的含量。上述的发明所提供的HPLC检测方法在预处理待测样品时，在溶剂醋酸铵-甲醇溶液中加入了抗坏血酸，使得对氨基酚杂质稳定，不会被氧化降解，样品溶液无需临用现制，而且消除了对氨基酚杂质在溶液配制环节中即发生损失的缺点。但是其缺点是无法去除复方制剂中复杂中药成分色谱峰的干扰，不具备专属性，无法实现检测目的。
因此，需要发明一种灵敏度高、准确度好的测定中药复方制剂中对氨基酚杂质的检测方法。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供一种测定中药复方制剂中对氨基酚杂质的检测方法。本发明的方法通过对待测样品前处理，采用高效液相色谱(HPLC)法测定对氨基酚含量，样品处理简单，方法灵敏度及准确度均能满足检测要求。
本发明所提供的测定中药复方制剂中对氨基酚杂质的检测方法，包括如下步骤：
(1)配制对照品；
(2)待测样品的前处理；
(3)样品的定量分析：液相色谱检测上述待测样品；
优选的，上述的步骤中，(1)对照品的配制方法如下：取对氨基酚和苯胺适量，精准称定，用洗脱液定量稀释制成每1ml各约含3μg的溶液，精准量取1ml，加0.5％乙酸溶液1ml，混匀，作为对照品溶液。
优选的，(2)中，待测样品的配制步骤如下：取含对乙酰氨基酚的待测样品，加水稀释，溶解，加入内标溶液；加入含氨水的甲醇溶液和水活化固相萃取小柱，加入待萃取溶液；用甲醇淋洗固相萃取小柱，洗脱，收集该洗脱液，加乙酸溶液，混匀，获得待测样品溶液。
更具体的，(2)中，待测样品的配制步骤如下：取含对乙酰氨基酚的待测样品，加水稀释，溶解，加入内标溶液；加入含氨水的甲醇溶液和水活化固相萃取小柱，加入待萃取溶液；用依次以20％甲醇(v/v)5ml和50％甲醇(v/v)2ml淋洗固相萃取小柱，弃去淋洗液，加0.5％氨水(v/v)的甲醇溶液洗脱，收集该洗脱液，加乙酸溶液，混匀，获得待测样品溶液。
本发明中，内标溶液中内标物的选择，也是本发明所要保护的关键内容。内标溶液为含苯胺的甲醇溶液。
由于固相萃取中样品处理体积变化较大，不利于准确定量，因此需要加入内标物以提高方法的准确性。内标物的选择应考虑如下的几个因素：(1)结构上具有相似性，固相萃取中能够随目标杂质一起保留和洗脱；(2)在高效液相色谱中能够分离；(3)具有一定的稳定性。
根据上述要求，本发明中选择苯胺作为内标物，其原因如下：(1)苯胺除羟基外，与对氨基酚结构一致，并携带特征性的氨基，保留选择性接近；(2)羟基的差异使两者在高效液相色谱中能以疏水性差异进行分离；(3)苯胺性质较稳定。
具体的，(2)待测样品的配制方法如下：取待测样品适量(约含对乙酰氨基酚0.2g)，置100ml量瓶中，加水，超声使溶解，精准加入内标溶液(内标溶液的配制方法如下：取苯胺，用甲醇定量稀释制成每1ml约含苯胺0.3mg的溶液，摇匀，即得)1ml，用水稀释至刻度，摇匀，作为待萃取溶液；以二乙烯基苯聚合物为填充剂(以月旭P-SCX，200mg/6ml为固相萃取柱，或效能相当的固相萃取小柱)，依次加洗脱液0.5％氨水(v/v)的甲醇溶液6ml和水6ml活化固相萃取柱，精准加入待萃取溶液2ml，待样品吸附于固相萃取柱后，依次以20％甲醇(v/v)5ml和50％甲醇2ml淋洗，弃去淋洗液，再加洗脱液2ml，收集该洗脱液，精准量取1ml，加0.5％乙酸溶液(v/v)1ml，混匀，作为待测样品溶液；以下若未作特殊说明，关于溶液浓度均未体积比。
(3)中，液相色谱检测条件如下：
色谱柱：ACE Excel C18，4.6mm×250mm，5μm，或效能相当的色谱柱；
流动相为：A相：磷酸盐缓冲液；B相：甲醇；
磷酸盐缓冲液配制方法如下：取磷酸氢二钠8.95g，磷酸二氢钠3.9g，加水溶解至1000ml，加体积浓度为10％的四丁基氢氧化铵溶液12ml，用磷酸调节pH值至6.5；
表1梯度洗脱条件
时间min 0 15 20 40 41 55
B相(％) 15 15 40 40 15 15
A相(％) 85 85 60 60 85 85
柱温：30～40℃；优选的为35℃；
检测波长：240～255nm，优选的为245nm；
流速：1.0mL/min；
进样量：10μL。
精准量取待测样品溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，对氨基酚峰和苯胺峰与相邻色谱峰的分离度应不小于1.0。待测样品溶液的色谱图中如有与对氨基酚峰保留时间一致的色谱峰，按内标法以峰面积计算，不得过对乙酰氨基酚标示量的0.15％。
对氨基酚浓度计算公式如下：
式中：
AS1——对照品溶液中对氨基酚峰面积
AS2——对照品溶液中苯胺峰面积
AT1——待测样品溶液中对氨基酚峰面积
AT2——待测样品溶液中苯胺峰面积
m1——对照品溶液中对氨基酚质量，mg
p——对氨基酚纯度
标示量——200mg。
以市场上较为常见的典型中药复方制剂-感冒灵为例，来更进一步的阐述本发明方法的技术方案：
中药复方制剂通常采用乙醇提取药材中的有效成分，再加入适当的化学药物成分(对乙酰氨基酚、咖啡因等)，这种工艺决定了制剂中基质复杂，未经处理的待测溶液混杂有大量成分不明确的物质，需要对供试品溶液中的对氨基酚成分进行提取，以降低检测干扰。
复杂成分的常用提取方式有：蒸馏、分液萃取、固相萃取等。由于中药成分采用煎煮工艺，推测其中各中药成分沸点较高，不适用蒸馏提取。处方工艺采用水煎煮后乙醇提取，推测各中药成分在水和醇类中溶解性好，与对氨基酚溶解性一致，不适用于分液萃取。
《复方感冒灵颗粒HPLC指纹图谱建立及化学成分鉴定》文献中查得，感冒灵颗粒中已识别的中药成分多为芳香族类有机酸或酚类物质，典型分子结构为酚羟基或羧基。与之相比，对氨基酚的仲氨基显著区别于以上结构，可以利用该结构的区别，合理设计固相萃取方法，以实现较好的提取效果。
本发明的有益效果在于：
本发明对含对乙酰氨基酚的中成药复方制剂进行前处理(分步骤洗脱)、在洗脱时采用特定的填充剂，并且通过加入苯胺作为内标物，使得采用HPLC法检测该类药物中的对氨基酚杂质成为可能，显著降低检测成本，方法准确度高。
本发明所提供的样品前处理的步骤简单，但是整体的方法灵敏度高、准确性好。
附图说明
图1为本发明实施例1的待测样品溶液的HPLC图谱；
图2为Welchrom C18E填料洗脱的色谱图；
图3为萃取前后对比色谱图；整体靠上的线条为萃取前的结果，整体靠下的线条为萃取后的结果；
图4为Welchrom P-SCX填料洗脱的色谱图；
图5为标准条件下与偏移后的洗脱结果的对比色谱图。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
本发明中，测定中药复方制剂中对氨基酚杂质的检测方法为高效液相色谱法，检测方法的步骤如下：
(1)对照品溶液的制备：对照品的配制方法如下：取对氨基酚和苯胺，精准称定，用洗脱液定量稀释制成每1mL各约含3μg的溶液，精准量取1mL，加0.5％乙酸溶液1mL，混匀，作为对照品溶液；
(2)待测样品溶液的配制：待测样品的配制方法如下：
S1：取待测样品(约含对乙酰氨基酚0.2g)，置100mL量瓶中，加水，超声溶解，精准加入内标溶液1mL，用水稀释至刻度，摇匀，作为待萃取溶液；其中，内标溶液的配制步骤如下：取苯胺，用甲醇定量稀释制成每1mL含苯胺0.3mg的溶液，摇匀，即得；
S2：以二乙烯基苯聚合物为填充剂(以月旭P-SCX，200mg/6ml为固相萃取小柱，或效能相当的固相萃取小柱)，依次加0.5％氨水(v/v)的甲醇溶液6mL和水6mL活化萃取小柱，精准加入S1中的待萃取溶液2mL；
S3：待样品吸附于固相萃取小柱后，依次以20％甲醇(v/v)5mL和50％甲醇(v/v)2mL淋洗，弃去淋洗液，再加洗脱液，收集该洗脱液，精准量取1mL，加0.5％乙酸溶液(v/v)，混匀，作为待测样品溶液；
(3)样品的定量分析：液相色谱仪检测上述样品；参照(中国药典2015年版四部通则0512)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料(ACE Excel C18，4.6mm×250mm，5μm，或效能相当的色谱柱)；以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠8.95g，磷酸二氢钠3.9g，加水溶解至1000ml，加10％四丁基氢氧化铵溶液12ml，用磷酸调节pH值至6.5)为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱；
上述的方法中，色谱条件为：
色谱柱：ACE Excel C18，4.6mm×250mm，5μm，或效能相当的色谱柱；
流动相为：A相：磷酸盐缓冲液；B相：甲醇；
表2梯度洗脱条件
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
15 85 15
20 60 40
40 60 40
41 85 15
55 85 15
柱温：30～40℃；优选的柱温为35℃；
检测波长：240～255nm；优选的，为245nm；
流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
A相的磷酸盐缓冲液制备方法为：取磷酸氢二钠8.95g，磷酸二氢钠3.9g，加水溶解至1000mL，加10％(体积浓度)四丁基氢氧化铵溶液12mL，用磷酸调节pH值至6.5。
对氨基酚浓度计算公式见发明内容。
实施例1
参照如上的方法对对氨基酚杂质进行检测，在(2)中的S2中，参照如下的条件对待测样品进行洗脱，具体的步骤见表3：
表3实施例1中的洗脱步骤
上机检测时的柱温为35℃；波长为245nm，上机检测即上述的步骤(3)样品的定量分析。
实施例2
与实施例1的不同在于，待测样品洗脱时的具体参数与实施例1不同(具体为洗脱液的用量与实施例1不同)，其它与实施例1相同。
表4实施例2中的洗脱步骤
洗脱步骤1 加洗脱液(0.5％氨水的甲醇溶液)6ml，待滴尽
洗脱步骤2 加水6ml，待滴尽
洗脱步骤3 精准加入待萃取溶液2ml，待滴尽
洗脱步骤4 20％甲醇5ml，待滴尽
洗脱步骤5 50％甲醇2ml，待滴尽
洗脱步骤6 洗脱液1.8ml，收集溶液
样品稀释 精准量取1ml，加0.5％乙酸溶液1ml，混匀
检测 上机检测
实施例3
与实施例1的不同在于，待测样品洗脱时的具体参数与实施例1不同(具体为洗脱液的用量与实施例1不同)，其它与实施例1相同。
表5实施例3中的洗脱步骤
洗脱步骤1 加洗脱液(0.5％氨水的甲醇溶液)6ml，待滴尽
洗脱步骤2 加水6ml，待滴尽
洗脱步骤3 精准加入待萃取溶液2ml，待滴尽
洗脱步骤4 20％甲醇5ml，待滴尽
洗脱步骤5 50％甲醇2ml，待滴尽
洗脱步骤6 洗脱液2.2ml，收集溶液
样品稀释 精准量取1ml，加0.5％乙酸溶液1ml，混匀
检测 上机检测
实施例4
与实施例1的不同在于，待测样品洗脱时的具体参数与实施例1不同(具体为洗脱液的用量与实施例1不同、乙酸溶液用量与实施例1不同)，其它与实施例1相同。
表6实施例4中的洗脱步骤
洗脱步骤1 加洗脱液(0.5％氨水的甲醇溶液)6ml，待滴尽
洗脱步骤2 加水6ml，待滴尽
洗脱步骤3 精准加入待萃取溶液2ml，待滴尽
洗脱步骤4 20％甲醇5ml，待滴尽
洗脱步骤5 50％甲醇2ml，待滴尽
洗脱步骤6 洗脱液2.2ml，收集溶液
样品稀释 精准量取1ml，加0.5％乙酸溶液0.9ml，混匀
检测 上机检测
实施例5
与实施例1的不同在于，待测样品洗脱时的具体参数与实施例1不同(具体为洗脱液的用量与实施例1不同、乙酸溶液用量与实施例1不同)，其它与实施例1相同。
表7实施例5中的洗脱步骤
洗脱步骤1 加洗脱液(0.5％氨水的甲醇溶液)6ml，待滴尽
洗脱步骤2 加水6ml，待滴尽
洗脱步骤3 精准加入待萃取溶液2ml，待滴尽
洗脱步骤4 20％甲醇5ml，待滴尽
洗脱步骤5 50％甲醇2ml，待滴尽
洗脱步骤6 洗脱液2.2ml，收集溶液
样品稀释 精准量取1ml，加0.5％乙酸溶液1.1ml，混匀
检测 上机检测
实施例6
实施例1～5的测定结果如表8所示：
表8回收率试验结果
名称 回收率(％)
实施例1 100.0
实施例2 101.0
实施例3 100.3
实施例4 96.7
实施例5 101.0
从表8中的结果可得，回收率范围均在96.7～101.0之间，方法发生微小变动，回收率均良好。
实施例7
当实施发生偏移，具体的洗脱步骤如下表9以及附图5所示：
表9偏移后的洗脱结果
洗脱步骤1 加洗脱液(0.5％氨水的甲醇溶液)6ml，待滴尽
洗脱步骤2 加水6ml，待滴尽
洗脱步骤3 精准加入待萃取溶液2ml，待滴尽
洗脱步骤4 20％甲醇5ml，待滴尽
洗脱步骤5 50％甲醇2ml，待滴尽
洗脱步骤6 洗脱液1ml，收集溶液
样品稀释 精准量取1ml，加0.5％乙酸溶液1.1ml，混匀
检测 上机检测
上机检测的条件同实施例1，从附图5中可以看出，靠上的线条为标准条件下的洗脱结果，靠下的线条为偏移后的洗脱结果。
结果显示，对氨基酚杂质未洗脱，仍保留在固相萃取柱上。
实施例8
本发明中，固相萃取方法的核心为：(1)选择适当的固相萃取填料；(2)发明适当的洗脱方法。固相萃取填料的性质决定了目标杂质和其他物质的保留和分离效果。
关于填料的选择，本发明人进行了如下的实验：
填料1：Welchrom C18E(十八烷基硅烷键合硅胶)
C18E填料是利用疏水性的差异来分离不同物质，是最常见的填料。
但是本发明人发现，采用该填料，用2ml水洗脱时，固相萃取小柱已不能保留主成分，检测图谱见图2，因此无法与其他天然药物成分分离，该填料不适用。
填料2：Welchrom P-SCX
该填料为阳离子交换混合疏水作用的填料，对碱性结构(对氨基酚的氨基)具有选择性保留作用，推测该填料具有较好分离效果。
采用该填料洗脱时，对氨基酚、对乙酰氨基酚和内标物保留好，检测图谱见图4，其他天然成分基本洗脱，该填料适用于本发明。
Welchrom P-SCX具有强的阳离子保留能力，需要采用氨水进行饱和后，才能将待测物(对氨基酚和苯胺)洗脱下来，因此在洗脱程序中，首先采用水和甲醇溶液分别洗去水溶性和醇溶性的杂质，然后用含氨水的甲醇溶液将待测物洗脱并收集。由于对氨基酚结构中具有酚羟基，在强碱性条件下易水解，因此需要将洗脱液用弱酸调至中性范围，以保证溶液稳定。对调节后的待测样品溶液和对照品溶液进行稳定性测试，显示低温(4℃)下24小时内稳定，结果如下：
表10待测样品溶液和对照品溶液的稳定性测试
从以上表格中的结果可以看出，将调节后的供试品溶液和对照品溶液进行的稳定性测试结果表明，在低温(4℃)下24小时内稳定。本发明所选择的填料、色谱柱以及洗脱方法均能有效的实现对中药复方制剂中对氨基酚杂质的检测。

Claims (5)

1.一种测定中药复方制剂中对氨基酚杂质的检测方法，其特征在于，所述检测方法为高效液相色谱法，所述的中药复方制剂为感冒灵，其检测方法的步骤如下：
（1）配制对照品溶液；
（2）配制待测样品溶液：
S1：取含对乙酰氨基酚的待测样品，置100mL量瓶中，加水，超声溶解，精准加入内标溶液1mL，用水稀释至刻度，摇匀，作为待萃取溶液；内标溶液为含苯胺的甲醇溶液；
S2：以二乙烯基苯聚合物为填充剂，以月旭P-SCX，200mg/6ml为固相萃取小柱，依次加0.5%v/v氨水的甲醇溶液6mL和水6mL活化固相萃取小柱，精准加入待萃取溶液2mL；
S3：待样品吸附于固相萃取小柱后，依次以20%v/v甲醇 5mL和50%v/v甲醇2mL淋洗，弃去淋洗液，再加洗脱液2mL，收集该洗脱液，精准量取1mL，加0.5%v/v乙酸溶液1mL，混匀，作为待测样品溶液；洗脱液为0.5%v/v氨水的甲醇溶液；
（3）样品的定量分析：采用液相色谱仪检测待测样品；
色谱条件为：
色谱柱：ACE Excel C18，4.6mm×250mm，5μm；
流动相为：A相：磷酸盐缓冲液；B相：甲醇；
梯度洗脱条件：
时间，min 0 15 20 40 41 55 B相，% 15 15 40 40 15 15 A相，% 85 85 60 60 85 85
柱温：30~40℃；
检测波长：240~255nm；
流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
A相的磷酸盐缓冲液配制方法为：取磷酸氢二钠8.95g，磷酸二氢钠3.9g，加水溶解至1000mL，加体积浓度为10%的四丁基氢氧化铵溶液12mL，用磷酸调节pH值至6.5。
2.如权利要求1所述的一种测定中药复方制剂中对氨基酚杂质的检测方法，其特征在于，（1）中，对照品的配制步骤如下：取对氨基酚和苯胺，精准称定，用洗脱液定量稀释制成每1mL各含3μg的溶液，精准量取1mL，加0.5%乙酸溶液1mL，混匀，作为对照品溶液。
3.如权利要求1所述的一种测定中药复方制剂中对氨基酚杂质的检测方法，其特征在于，S1中，内标溶液的制备步骤为：取苯胺，用甲醇定量稀释制成每1mL含苯胺0.3mg的溶液，摇匀，即得。
4.如权利要求1所述的一种测定中药复方制剂中对氨基酚杂质的检测方法，其特征在于，（3）中，柱温为35℃。
5.如权利要求1所述的一种测定中药复方制剂中对氨基酚杂质的检测方法，其特征在于，（3）中，检测波长为245nm。
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