CN103728380A - 一种离子液体萃取/hplc检测水产品中氟罗沙星残留的方法 - Google Patents

Abstract

一种离子液体萃取/HPLC检测水产品中氟罗沙星残留的方法，其特征在于步骤：称取5-10g经匀浆处理后的水产品组织样品，置于离心管中，加入经灼烧的无水硫酸钠，用玻璃棒将样品与无水硫酸钠搅拌均匀；再加入15-25mL乙腈涡旋振荡2-8min，超声波提取5-15min，然后以2500~3500r/min的速率离心5-10min，取上清液；移取上清液至带塞的尖底离心试管中，以离子液体[HMIm]BF4作为萃取剂，上清液与离子液体[HMIm]BF4按照5-10:1的体积比置于锥形瓶中，涡旋混合0.5~1.5min，在室温条件下静置2-5min，再以8000~12000r/min离心4~6min，用微量移液器吸取下层沉积相20μL，经0.45μm微孔滤膜过滤，进HPLC检测；绘制标准曲线和加标回收率。本发明具有操作简单、准确可靠、重现性好、灵敏度高、环境友好等优点，适用于水产品中残留抗生素的检测。

Description

一种离子液体萃取/HPLC检测水产品中氟罗沙星残留的方法

技术领域

本发明涉及到食品安全检测领域，具体指一种离子液体萃取/HPLC检测水产品中氟罗沙星残留的方法。

背景技术

水产品营养丰富、味道鲜美，深受人们喜爱，由于水域环境的污染，在水产养殖过程中常使用抗生素等违禁药物，众所周知，使用抗生素会造成水产品中抗生素残留，人食用后会导致毒副作用，严重时产生致癌、致畸、致突变的“三致”作用。

离子液体（Ionic Liquid），又称室温熔融盐（Room Temperature Ionic Liquid）或有机离子液体（Organic Ionic Liquid），被称为“绿色溶解”即一类在室温或室温附近温度下由有机阴、阳离子组成的熔融盐体系，在萃取方面与其他有机溶剂相比，存在着蒸汽压低，不挥发性，无色无味，不易燃烧，具有较好的热稳定性及良好的溶解性等显著的优点而受到关注。

目前用于检测抗生素残留的方法主要有微生物法、HPLC、LC-MS/MS、液相色谱串联质谱、紫外分光光度法等。

本发明采用离子液体萃取氟罗沙星，采用HPLC检测水产品中氟罗沙星残留，对色谱分离参数以及萃取条件的优化，对流动相配比、检测波长、流速、考察萃取溶剂体积、萃取溶剂与样品溶液体积比等进行研究，建立一种萃取效率高、检测快速的水产品中氟罗沙星残留检测的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种离子液体萃取/HPLC检测水产品中氟罗沙星残留的方法，具有操作简单、萃取效率高的特点，可实现快速高效检测水产品中氟罗沙星残留。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种离子液体萃取/HPLC检测水产品中氟罗沙星残留的方法，其特征在于步骤为：

1）样品前处理：称取5-10g经匀浆处理后的水产品组织样品，置于离心管中，加入经灼烧的1-2g无水硫酸钠，用玻璃棒将样品与搅拌均匀；再加入15-25mL乙腈涡旋振荡2-8min，超声波提取5-15min，然后以2500~3500r/min的速率离心5-10min，取上清液，备用；

2）样品的萃取：移取上述得到的上清液至带塞的尖底离心试管中，上清液与离子液体[HMIm]BF₄按照5-10:1的体积比置于锥形瓶中，涡旋混合0.5~1.5min，在室温条件下静置2-5min，再以8000~12000r/min离心4~6min，用微量移液器吸取下层沉积相20μL，经0.4~0.5μm微孔滤膜过滤，进HPLC检测；

3）绘制标准曲线和加标回收率。

作为改进，所述水产品组织样品是将水产品的软组织取出，依次用去离子水和超纯水冲洗干净，组织捣碎机捣碎匀浆，在超低温冰箱中冷冻20~28h，冷冻干燥64~80h后得到的。

作为改进，所述步骤2）中的HPLC检测是采用Spherisorb C₁₈色谱柱，流动相：乙腈-水；流速：0.5ml/min；检测波长：286nm；进样量：20μl。

再改进，所述绘制标准曲线的过程为：在离心试管中准确称取匀浆好的样品10ml，放于容量瓶中，分别再加入0.24mg/ml氟罗沙星的标准溶液，按步骤1）进行前处理后，用乙腈稀释配制至浓度为0.06mg/ml、0.09mg/ml、0.12mg/ml、0.15mg/ml、0.18mg/ml；再按步骤2）对各样品进行分散液相微萃取后，用微量进样器吸取20μL待进样，各浓度平行测定2~4次，以保留时间定性，以样品峰面积与标准峰面积比值定量，以峰面积A对浓度C/mg/ml回归得标准回归曲线。

最后，所述加标回收率的测定步骤为：移取氟罗沙星0.24mg/ml标准溶液，分别用乙腈稀释配制成浓度分别为0.08、0.16、0.24mg/ml的溶液，按照离子液体与待萃取溶液1:10的体积比按步骤2）进行萃取，将萃取后得到的离子液体用乙腈稀释至原体积的十倍，过0.4~0.5μm微孔滤膜过滤，进样20μl，测定；每个浓度检测4~6个批次，每个批次4~6个重复，测定方法的回收率及日内和日间精密度。

与现有技术相比，本发明的优点在于：以离子液体作为萃取剂来萃取抗生素，采用HPLC检测水产品中抗生素的残留，通过对色谱分离参数以及萃取条件的优化，对流动相配比、检测波长、流速、考察萃取溶剂体积、萃取溶剂与样品溶液体积比等进行研究，建立一种富集率高、检测方便的水产品抗生素残留检测的方法。本发明具有操作简单、准确可靠、重现性好、灵敏度高、环境友好等优点，适用于水产品中残留抗生素的检测。

附图说明

图1是氟罗沙星标准品色谱图；

图2离子液体[HMIm]BF₄溶液色谱图；

图3离子液体萃取氟罗沙星后的色谱图（1:离子液体[HMIm]BF₄,2：氟罗沙星）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

仪器与试剂：

UV1201-紫外-可见检测器、P1201(大连依利特仪器有限公司)；

Spherisorb C18色谱柱(4mm×250mm)；

Balseline-810型色谱工作站；

UPWS-1-20型超纯水器；

SK5200HP型超声波清洗器；

BS323S型电子天平；

DHG-9023A型电热鼓风干燥箱；

氟罗沙星标准品（>98%）；

乙腈（色谱纯）；

1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[HMIm]BF₄>99℅）

配制用水均为去离子水。

本实施例的水产样品为南美白对虾，一种离子液体萃取/HPLC检测水产品中氟罗沙星残留的方法，其具体步骤为：

1、氟罗沙星标准储备液的配制：精密称取氟罗沙星适量，加水溶解并稀释，定容至50ml使成0.24mg/ml；

2、样品前处理：取出南美白对虾软组织，依次用去离子水和超纯水冲洗干净，组织捣碎机捣碎，在-20℃的超低温冰箱中冷冻24h，冷冻干燥72h，准确称取10.000g组织样品，置于100mL聚丙烯离心管中，加入经灼烧的2g无水硫酸钠，用干净玻璃棒将样品与无水硫酸钠搅拌均匀。再加入25mL乙腈涡旋振荡2min，超声波提取15min，然后以3000r/min的速率离心5min，提取上清液，备用；

3、样品的萃取：移取上述得到的上清液至10ml带塞的尖底离心试管中，上清液与离子液体[HMIm]BF₄(萃取剂)按照10:1的体积比置于锥形瓶中，涡旋混合1min,，混合溶液形成水/[HMIm]BF₄的乳浊液体系，在室温条件下静置2.0min，再以10000r/min离心5min。均匀分散在水相中的萃取剂[HMIm]BF₄经过离心沉积至尖底试管底部，用微量移液器吸取下层沉积相20μL，再经0.45μm微孔滤膜过滤，待进样；

4、色谱条件

色谱柱：Spherisorb C₁₈色谱柱(4mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈-水；流速：0.5ml/min；检测波长：286nm；进样量：20μl。

5、标准曲线绘制

在离心试管中准确称取匀浆好的样品，放于10ml容量瓶中，分别再加入0.24mg/ml氟罗沙星的标准溶液。按上述步骤2进行前处理，用乙腈稀释配制至浓度为0.06mg/ml、0.09mg/ml、0.12mg/ml、0.15mg/ml、0.18mg/ml。按上述步骤3对各样品进行分散液相微萃取后,用微量进样器吸取20μL待进样。各浓度平行测定3次，以保留时间定性，以样品峰面积与标准峰面积比值定量，以峰面积A对浓度C（mg/ml）回归得标准回归曲线。

6、加标回收率

移取氟罗沙星0.24mg/ml标准溶液，分别用乙腈稀释至线性范围内高、中、低3个浓度，配制成浓度分别为0.08、0.16、0.24mg/ml的溶液，按照离子液体与待萃取溶液1:10的体积比进行萃取，萃取过程同上述样品的萃取处理过程。将萃取后等到的离子液体用乙腈稀释至原体积的十倍，过0.45μm疏水性微孔滤膜，进样20μl，测定；检测每个浓度检测5个批次，每个批次5个重复，测定方法的回收率及日内和日间精密度。

下面通过实验数据对检测结果进行分析：

1、色谱图分析

本发明选用的萃取剂[HMIm]BF₄具有疏水性，但在水中有一定的溶解度，当萃取剂的体积小于1ml时，振荡提取后的体积无法满足仪器进样要求，而萃取剂的体积大于1ml时对富集倍数影响较大，故选择离子液体[HMIm]BF₄的最佳体积为1ml。图1至图3分别为乙腈配制的氟罗沙星标准溶液色谱图、离子液体[HMIm]BF₄溶液色谱图和离子液体萃取氟罗沙星后的色谱图，从图中对比可以看出，离子液体产生的特征峰不影响待测组分的测定，其中氟罗沙星保留时间：8.53min；离子液体保留时间：4.03min。

2、方法的线性范围、保留时间的重现性和回收率

标准曲线回归方程为y=43961x-2366.7，相关系数R²=0.9988，样品浓度在0.06mg/ml~0.18mg/ml的范围内线性关系良好。

从表1看出氟罗沙星和离子液体在选定流动相中十分稳定，48h内吸收光谱不变，在选定的色谱条件下，两者保留时间的重现性良好，其中RSD分别为0.75%和0.41%。

表1氟罗沙星和离子液体保留时间的重现性

Table 1 Reproducibility of retention time of sparfloxacin and [HMIm]BF₄

从表2、表3中可以看出每个样品分别在日内和日间重复进样5次，测得日内及日间精密度相对标准差，其回收率介于88.7%-93.0%之间,相对标准偏差介于3.1%～4.8%之间，日内RSD分别为3.7%、2.5%和2.5%，日间RSD分别为3.7%、3.1%和2.1%。

表2标准添加回收率

Table 2The recovery of sparfloxacin

表3方法的日内与日间精密度

Table 3the intra-and inter day precisions of the method

结论

本发明研究了离子液体萃取/HPLC测定水产品中残留药物的方法和色谱优化条件。离子液体（[HMIm]BF₄）是一种良好的萃取剂，对水产品中残留的药物具有良好的萃取性能，并可利用高效液相色谱测定药物的含量。

优化的实验条件为：以[HMIm]BF₄为萃取剂，采用反相Spherisorb C18色谱柱(4mm×250mm)，流动相为乙腈，流速：0.5ml/min，检测波长：298nm。萃取剂与氟罗沙星以1:10的比例进行萃取，氟罗沙星浓度为0.06mg/ml~0.18mg/ml时，相关系数r²为0.9988，萃取回收率达到89%以上。

该实验对市售中的南美白对虾进行检测，没有检测到氟罗沙星的残留中，测定水产品氟罗沙星含量的加标回收率为89.6%~93.3%，RSD为3.1%~4.8%。本方法具有准确可靠、重现性好、灵敏度高、准确、环境友好等优点，适用于水产品中残留抗生素的检测。

Claims (5)

1.一种离子液体萃取/HPLC检测水产品中氟罗沙星残留的方法，其特征在于步骤为：

1）样品前处理：称取5-10g经匀浆处理后的水产品组织样品，置于离心管中，加入经灼烧的1-2g无水硫酸钠，用玻璃棒将样品与无水硫酸钠搅拌均匀；再加入15-25mL乙腈涡旋振荡2-8min，超声波提取5-15min，然后以2500~3500r/min的速率离心5-10min，取上清液，备用；

2）样品的萃取：移取上述得到的上清液至带塞的尖底离心试管中，以离子液体[HMIm]BF₄作为萃取剂，上清液与离子液体[HMIm]BF₄按照5-10:1的体积比置于锥形瓶中，涡旋混合0.5~1.5min，在室温条件下静置2-5min，再以8000~12000r/min离心4~6min，用微量移液器吸取下层沉积相20μL，经0.40~0.50μm微孔滤膜过滤，进HPLC检测；

3）绘制标准曲线和加标回收率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述水产品组织样品是将水产品的软组织取出，依次用去离子水和超纯水冲洗干净，组织捣碎机捣碎匀浆，在超低温冰箱中冷冻20~28h，冷冻干燥64~80h后得到的。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2）中的HPLC检测是采用反相Spherisorb C₁₈色谱柱，流动相：乙腈-水；流速：0.5ml/min；检测波长：286nm；进样量：20μl。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述绘制标准曲线的过程为：在离心试管中准确称取匀浆好的样品，放于10ml容量瓶中，分别再加入0.24mg/ml氟罗沙星的标准溶液，按步骤1）进行前处理后，用乙腈稀释配制至浓度为0.06mg/ml、0.09mg/ml、0.12mg/ml、0.15mg/ml、0.18mg/ml；再按步骤2）对各样品进行分散液相微萃取后，用微量进样器吸取下层沉积相20μL待进样，各浓度平行测定2~4次，以保留时间定性，以样品峰面积与标准峰面积比值定量，以峰面积A对浓度C/mg/ml回归得标准回归曲线。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述加标回收率的测定步骤为：移取氟罗沙星0.24mg/ml标准溶液，分别用乙腈稀释配制成浓度分别为0.08、0.16、0.24mg/ml的溶液，按照离子液体与待萃取溶液1:10的体积比按步骤2）进行萃取，将萃取后得到的离子液体用乙腈稀释至原体积的十倍，过0.4~0.5μm微孔滤膜过滤，进样20μl，测定；每个浓度检测4~6个批次，每个批次4~6个重复，测定方法的回收率及日内和日间精密度。

Images