CN107677757B - 同时测定食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时测定食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的方法，将香兰素和乙基香兰素衍生为丙酸酯后进行测定。检测步骤如下：溶液的配制、标准储备溶液的配制、样品溶液的制备、气相色谱‑质谱定性分析、定量测定。本发明可同时检测粮谷、液体乳、稀奶油、植物油、婴幼儿配方食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素，采用丙酸酐衍生，检测效率高，检测成本低，快速，简便，高效，易推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法。特别是一种同时测定食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的方法，主要用于粮谷、液体乳、稀奶油、植物油、婴幼儿配方食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的检测方法。
背景技术
香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素均具有浓郁的奶香味，其中香兰素天然存在于自然界许多植物中，后两种是化学合成物质。三种物质是食品中常用的食品增香剂，它们被广泛用于糖果、饼干、糕点和饮料中。但文献报道大剂量食用香兰素可导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至损伤肝、肾。而我国不少商家为了追求最大利益违法添加香料，以至出现“香精大米”和“香精包子”事件。随着国内外对食品安全的关注，食品中香味剂的使用的安全也被提到议事日程。
《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760-2014）中已规定较大婴儿和幼儿配方食品中香兰素和乙基香兰素的最大使用量均为5 mg/100 mL（其中100 mL以即食食品计），婴幼儿谷类辅助食品中香兰素的最大使用量为7 mg/100 g（其中100 g以即食食品计），但甲基香兰素则不得使用；对于多数食品香料按生产需要适量食用，但对于稀奶油、巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳、植物油脂、大米、和0至6个月婴幼儿配方食品等28种食品不得添加任何食品用香精。我国虽然规定了这些香味剂的使用范围和限量，但目前尚缺乏与这些香味剂相对应的标准检测方法，这就给政府、企业的生产监管和产品品质保证造成了技术上的困难。因此，有必要研制快速、准确、灵敏的国家标准检测方法，为政府法规的执行和食品安全监管提供有效的技术支持和有力保障。
文献报道检测香兰素和乙基香兰素的方法很多，有分光光度法、电化学法、高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法等。然而对于非法使用的样品基质，只有色谱-质联用法灵敏度能满足食品安全监管要求。食品基质复杂，相对于质谱法色谱法很容易遇到干扰，而液质联用法所用的仪器较昂贵，我国基层实验室和生产企业此类仪器配置较少，不易推广。另外，文献报道的前处理方法多用有毒并且易挥发乙醚等有机溶剂进行提取，也有的用顶空固相微萃取法等。常用的净化方法有液-液分配净化、固相萃取净化等方法，有时还需进行蛋白质沉淀，这些方法大都操作时间长，效率低，容易出现假阳性，对操作者危害风险较大，有的则需特殊的设备。相关的食品基质主要集中在乳制品等，对于粮谷、植物油等但尚无方法报道，也没有用气质联用法同时测定这3种物质的方法。
近年来食品安全事件频发，食品安全问题越来越受到关注，对食品中香味剂使用量和非法使用的监测迫在眉睫，因此建立食品中三种常用香精的快速、高效、易推广的测定方法标准具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便、提高效率、易推广的同时测定食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的方法，克服现有技术的不足。
本发明的同时测定食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的方法，其中食品为粮谷食品或婴幼儿配方固态食品或液体乳或稀奶油或植物油液态食品，首先将食品中香兰素和乙基香兰素衍生为丙酸酯后进行测定，步骤如下：
（1）溶液的配制
①衍生试剂溶液：取丙酸酐和吡啶，按体积比1∶1的比例混匀；
②饱和氯化钠水溶液：称取氯化钠，然后加水，利用超声方式使氯化钠充分溶解，氯化钠与水的用量比为：200g∶500mL；
（2）标准溶液的配制
①配制标准储备溶液：称取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素三种标准物质分别置于容量瓶中，均用乙腈定容至刻度，分别得到1mg/mL的香兰素标准储备溶液、甲基香兰素标准储备溶液、乙基香兰素标准储备溶液，并且避光于-18℃保存；
②配制混合标准使用溶液：分别吸取上述三种标准储备液于同一容量瓶中，用乙腈释到刻度，配制成浓度为100μg/mL的混合标准使用溶液，避光于-18℃保存；
（3）样品制备
将被测的固态食品样品粉碎成粉末，并且使其全部通过425 μm的标准网筛，或者将液态食品样品混匀；
（4）样品溶液的制备
将固态食品加水，再加入乙腈，食品、水、乙腈的用量比为2 g∶5 mL∶10 mL，涡旋振荡30 s，在室温下超声提取20 min；再加入氯化钠，氯化钠与食品的用量比为1∶1，剧烈摇振30 s，超声10 min，涡旋混匀，以5 000 r/min离心2 min，取上层提取液于具塞磨口玻璃离心管中，加入正己烷和衍生试剂溶液，提取液与正己烷、衍生试剂溶液的用量比为2 mL∶1mL∶20 μL，涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入无水硫酸镁后涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，提取液与无水硫酸镁的用量比为1 mL∶100 mg，取下层乙腈用微孔滤膜过滤后待测；所述的微孔滤膜为0.22 μm有机相；
或者将液体乳加入乙腈，液体乳与乙腈的用量比为5 g∶10 mL，涡旋振荡30 s，在室温下超声提取20 min，再加入氯化钠，液体乳与氯化钠的用量比为5 g∶2 g，剧烈摇振30s，超声10 min，涡旋混匀，以5 000 r/min离心2 min，取上层提取液于具塞磨口玻璃离心管中，加入正己烷和衍生试剂溶液，提取液与正己烷和衍生试剂溶液的用量比为 2 mL∶1 mL∶20μL，涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入无水硫酸镁，提取液与无水硫酸镁的用量比为1mL∶100 mg 并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜过滤后待测，所述的微孔滤膜为0.22 μm有机相；
所述的液体乳为巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳；
或者将稀奶油加入乙腈，稀奶油与乙腈的用量比为2 g, ∶10 mL，涡旋振荡30 s，在室温下超声提取20 min，再加入氯化钠，液体乳与氯化钠的用量比为5 g∶2 g，剧烈摇振30 s，超声10 min，涡旋混匀，以5 000 r/min离心2 min，取上层提取液于具塞磨口玻璃离心管中，加入正己烷和衍生试剂溶液，提取液与正己烷和衍生试剂溶液的用量比为 2 mL∶1mL∶20μL，涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入无水硫酸镁，提取液与无水硫酸镁的用量比为1mL∶100 mg 并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜过滤后待测，所述的微孔滤膜为0.22 μm有机相；
或者将植物油置于玻璃离心管中，加入饱和氯化钠溶液和乙腈，植物油、饱和氯化钠溶液、乙腈的用量比为1 g∶1 mL∶5 mL，涡旋混合30 s，在-18 ℃下冷冻20 min，以5 000r/min离心1min，取上层提取液于具塞磨口玻璃离心管中，加入正己烷和衍生试剂溶液，提取液、正己烷、衍生试剂溶液的用量比为2 mL∶1 mL∶20μL，涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入无水硫酸镁，提取液与 无水硫酸镁的用量比为2 mL∶200 mg，并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜过滤后待测，所述的微孔滤膜为0.22 μm有机相；
（5）气相色谱-质谱仪器条件
色谱柱：DB-35MS石英毛细管柱，30 m×0.32 mm（i.d），膜厚0.25μm，或相当者；
色谱柱温度：100 ℃起始，以12 ℃/min升至 220 ℃，再以30 ℃/min升至 280 ℃（保持5 min）；
进样口温度：230 ℃；
色谱-质谱接口温度：280 ℃；
载气：氦气，纯度大于等于99.999 %，1.5 mL/min；
进样量：1 μL；
进样方式：不分流进样，0.75 min后开阀；
所述的质谱条件如下：
电离方式：EI；
检测方式：选择离子监测方式（SIM）；
溶剂延迟：3.0 min；
电离能量:70 eV
监测离子（m/z）：定量、定性离子和监测时间分组如表1：
表1香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的定量、定性离子和监测时间表
（6）标准工作曲线制作
采用与上述相同处理方法对空白基质进行处理，不加衍生试剂，用处理后的空白基质溶液将混合标准溶液稀释为0.04μg/mL 、0.10μg/mL、0.20μg/mL、1.0 μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL标准系列工作溶液，并且分别取标准系列工作溶液加入衍生试剂溶液，标准系列工作溶液与衍生试剂溶液的用量比为1 mL∶20μL，并且涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10min，冷却至室温后进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以每种化合物的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；
（7）样品测定
①定性分析：将样品溶液按照和标准工作溶液相同的仪器条件进行测定；若试样中检出的色谱峰的保留时间与相应标准物质色谱峰的保留时间一致，允许偏差小于±0.05min；扣除本底后试样中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差在表2规定的范围之内，可判定样品中存在对应的待测物；
表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
②定量分析：记录样品溶液中各目标化合物的定量离子的峰面积，根据标准曲线得到待测液中各组分的浓度；试样中各待测组分的响应值应在标准曲线的线性响应范围内，如果含量超出范围，重新取样分析，将衍生前的样品提取液用乙腈稀释后再进行衍生和测定；
（8）结果计算：
计算公式：
……………………………………(1)
式（1）中：
X —样品中待测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
c—从标准曲线中读出的测定液中各待测组分的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
m —试样称取的质量，单位为克（g）；
V —试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）。
本发明的有益效果在于，基于衍生化-气相色谱-质谱选择离子模式建立的粮谷、液体乳、稀奶油、植物油、婴幼儿配方食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的同时检测方法，样品经乙腈/水混合溶液超声提取，提取液经衍生和正己烷液-液分配净化后，进行气质分析，三种化合物的平均回收率在85% - 100%之间，检出限为0.2 mg/kg（液体乳0.07mg/kg），该方法具有前处理简单、基质干扰小、衍生条件温和、准确度高、易于推广等特点，能够满足日常检测工作的需要。
附图说明
图1为本发明实施例甲基香兰素的质谱图（定性和定量离子选择图）；
图2为本发明实施例香兰素衍生产物的质谱图（定性和定量离子选择图）；
图3为本发明实施例乙基香兰素衍生产物的质谱图（定性和定量离子选择图）；
图4为本发明实施例混合标准工作溶液的总离子流图（TIC）。
具体实施方式
本发明的食品中3种香味剂同时检测的方法，所述香味剂为甲基香兰素、香兰素和乙基香兰素，具体检测步骤如下：
（1）溶液的配制
①衍生试剂溶液：丙酸酐-吡啶（1+1，体积比）溶液：吸取1 mL丙酸酐和1 mL吡啶混匀（保存期不宜超过5天）；
②饱和氯化钠水溶液：称取氯化钠 200 g，加水500 mL，超声使其充分溶解；
（2）标准溶液的配制
①配制标准储备溶液：分别准确称取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素0.1g（精确至0.000 1g）的标准物质于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，分别得到1 mg/mL的标准储备溶液。避光于-18℃保存，保存期为6个月。
②配制混合标准使用溶液：分别吸取上述三种标准储备液1.00 mL于同一10 mL容量瓶中，用乙腈释到刻度配制成浓度为100 μg/mL的标准工作溶液，避光于-18℃保存，保存期为1个月。
（3）样品制备
婴幼儿谷类辅助食品和粮谷样品直接粉碎至全部通过使其全部可以通过425 μm的标准网筛，液体样品混匀即可。
（4）样品溶液的制备
①婴乳粉幼儿谷类辅助食品、婴幼儿配方乳粉、粮谷样品称取2 g预处理的样品，加入5 mL水，再加入10 mL乙腈，涡旋振荡30 s，在室温下超声提取20 min，再加入2g氯化钠，剧烈摇振30 s，超声10 min，涡旋混匀，以5 000 r/min离心2 min，取上层提取液2 mL于具塞磨口玻璃离心管中，加入1 mL正己烷和20 μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入200 mg无水硫酸镁并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜（0.22 μm，有机相）过滤后待测。
②液体乳（巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳等）样品称取5 g，稀奶油样品称取2 g,加入10 mL乙腈，涡旋振荡30 s，在室温下超声提取20 min，再加入2 g氯化钠（稀奶油样品加1g），剧烈摇振30 s，超声10 min，涡旋混匀，以5 000 r/min离心2 min，取上层提取液2 mL于具塞磨口玻璃离心管中，加入1 mL正己烷和20μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入200 mg无水硫酸镁并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜（0.22 μm，有机相）过滤后待测。
③植物油称取1 g试样于玻璃离心管中，加入1 mL饱和氯化钠溶液和5 mL乙腈，涡旋混合30 s，在-18 ℃下冷冻20 min，以5 000 r/min离心1min，取上层提取液2 mL于具塞磨口玻璃离心管中，加入1 mL正己烷和20μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入200 mg无水硫酸镁并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1min，取下层乙腈用微孔滤膜（0.22 μm，有机相）过滤后待测。
（5）气相色谱-质谱仪器条件
色谱柱：DB-35MS石英毛细管柱，30 m×0.32 mm（i.d），膜厚0.25 μm，或相当者；
色谱柱温度：100 ℃起始，以12 ℃/min升至 220 ℃，再以30 ℃/min升至 280 ℃（保持5 min）；
进样口温度：230 ℃；
色谱-质谱接口温度：280 ℃；
载气：氦气，纯度大于等于99.999 %，1.5 mL/min；
进样量：1 μL；
进样方式：不分流进样，0.75 min后开阀；
所述的质谱条件如下：
电离方式：EI。
检测方式：选择离子监测方式（SIM）。
溶剂延迟：3.0 min。
电离能量:70 eV
监测离子（m/z）：定量、定性离子和监测时间分组见表1。
表1香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的定量、定性离子和监测时间表
（6）标准工作曲线制作
采用与上述相同处理方法对空白基质进行处理（不加衍生试剂），用处理后的空白基质溶液将混合标准溶液稀释为0.04 μg/mL 、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL标准系列工作溶液，各取1 mL，加入20 μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以每种化合物的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
（7）样品测定
①定性分析：将样品溶液按照和标准工作溶液相同的仪器条件进行测定。若试样中检出的色谱峰的保留时间与相应标准物质色谱峰的保留时间一致，允许偏差小于±0.05min；扣除本底后试样中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。
表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
②定量分析：记录样品溶液中各目标化合物的定量离子的峰面积，根据标准曲线得到待测液中各组分的浓度。试样中各待测组分的响应值应在标准曲线的线性响应范围内，如果含量超出范围，则重新取样分析，将衍生前的样品提取液用乙腈稀释后再进行衍生和测定。
（8）结果计算：
计算公式：
……………………………………(1)
式（1）中：
X —样品中待测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
c—从标准曲线中读出的测定液中各待测组分的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
m —试样称取的质量，单位为克（g）；
V —试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）。
具体实例如下：
实例1、实验方法的优化
（1）前处理方法的优化
①提取条件的优化
三种目标物易溶于极性的有机溶剂如乙醚、醇类、丙酮、乙酸乙酯、乙腈等，文献报道用气相色谱分析的提取溶剂多采用乙醚。但食品基质大多含有较多的脂肪等物质，易溶于乙醚，这些物质会污染色谱柱，需要额外的净化方法除掉这些物质才能进行检测；若采用醇类溶剂食品中的水分会被溶出，醇中的水分很难去除，糖类和盐分会随水分进入提取液，造成仪器的严重污染，醇类溶剂还可能会和酸酐衍生试剂反应；丙酮和乙酸乙酯对脂肪等非极性物质的溶解性也较好，在测定时会引入太多的杂质。近年来农药多残留检测多采用乙腈作提取溶剂，对中等极性物质和极性物质均有较高的提取效率。乙腈作为提取溶剂有以下优点：乙腈对脂肪的溶解性较差，提取食品基质时乙腈中含有少量水分和盐分能进一步降低脂肪，低温也能降低其中脂肪的溶解度；乙腈易与水相分离且分离后体积损失少；乙腈中的水容易除去，同时其中溶解的少量糖类和淀粉、无机盐类等大部分同时被除去，可以直接进行色谱测定；乙腈的沸点较高，在操作过程中不易挥发损失而影响定量结果；乙腈能促使蛋白质沉淀，无需额外加入蛋白质沉淀剂；乙腈不易挥发，操作过程中人员吸入风险较低，所以采用乙腈作提取溶剂。
对含有微量香兰素的大米、谷类辅助食品、婴幼儿配方乳粉等样品进行了多次实验，发现提取时加入水能显著提高对香兰素的提取效率，当2 g样品加入水量为2、4、6、10mL水时测定结果无明显变化，所以当粉末样品称样量2 g时，提取前加水5 mL；稀奶油和液体乳本身含水量较高，提取时不加水；植物油在提取时加入饱和氯化钠溶液主要是使乙腈中含有一定的水分和盐分，降低其对油脂的溶解能力，同时也能溶解一定量的极性成分，在离心前经过冷冻进一步降低乙腈中的脂肪含量。
超声辅助提取既可以提高工作效率，又有助于提高提取效果，所以确定采用超声提取的方法。选择含有香兰素的乳粉样品和米粉样品进行实验，分别超声5 min、10 min、15min、20 min和25 min，随着超声时间的延长，乙腈对三种化合物的提取率增加，时间到达20min时，测定值不再有明显的变化，所以将超声时间定为20 min。液体乳、稀奶油加入乙腈后均有絮状沉淀，均采用超声辅助提取。提取完毕后加入氯化钠促使乙腈和水相分离，再次超声使氯化钠充分溶解。
②衍生条件的优化
三种化合物中香兰素和乙基香兰素均含有酚羟基，在分析过程中易被系统吸附损失并形成拖尾峰形，影响定量结果，所以分析前进行衍生。若采用酸酐/吡啶体系衍生成本最低，副反应少，条件较温和，残余衍生试剂基本不会对设备、环境和人员造成危害，衍生反应完成后直接进样测定即可。对衍生时间和温度进行了研究，最后确定衍生条件为60 ℃下衍生10 min。考查了衍生产物的稳定性，结果表明香兰素和乙基香兰素的衍生产物和甲基香兰素在室温下放置72 h无明显变化。
③色谱条件的优化
三种目标化合物中均含有醛基，香兰素和乙基香兰素还含有酚羟基，极性较大，用非极性或弱极性的固定相如HP-1、HP-5等色谱柱分析时拖尾现象严重，不利于测定，而极性较大的含氰基的固定相如DB-1701或聚乙二醇固定相由于最高使用温度较低，高温时固定相易流失，在气质联用上应用较少，一般情况下色谱柱的内径越大越耐污染，所以选用0.32mm内径的极性稍大并且较常用的含35%苯基固定相的毛细管气相色谱柱作为分析柱，程序升温方法进行测定。
在仪器的最佳工作状态下，通过对浓度较大的混合标准溶液进行全扫描检测，在确定的气相色谱条件下进行进一步的优化，能满足分离和保证杂质全部出完的前提下缩短出峰时间。同时选择丰度较大的离子作为定量、定性离子并根据出峰时间确定监测离子分组。
实例2、本发明的方法验证实验
（1）线性范围与相关系数
用含有样品基质的乙腈溶液将三种物质的标准储备液配制成0.04，0.10，0.20，1.0，2.0，5.0 μg/mL的混合标准工作溶液并加入10μL衍生试剂溶液，在60℃下衍生20min后冷却至室温，在仪器的最佳状态下分别进样，以每种化合物定量离子的积分面积为纵坐标（Y），每种化合物的浓度（X，μg/mL）为横坐标作图，得到三种目标物在此浓度范围内的线性方程和线性相关系数r，可知，在0.04~10μg/mL的浓度范围内，三种化合物的浓度和其定量离子的积分面积线性关系良好，具体数据见表3。
表3 甲基香兰素、香兰素和乙基香兰素的线性范围、线性方程和相关系数
（2）回收率和精密度
称取液体乳、婴幼儿配方乳粉、婴幼儿谷类辅助食品（米粉）、稀奶油、植物油和粮谷（大米）空白样品，分别添加适量的三种化合物标准品，使其折合成液体乳样品三水平浓度分别为0.08、0.20、2.0 mg/kg，其它样品三水平浓度分别为0.20、0.50、5.0 mg/kg，每个水平做6个平行样，按照方法规定的操作步骤进行测定，考察方法的回收率和精密度，具体数据见表4。结果表明：在乳粉、婴幼儿谷类辅助食品、稀奶油、大米和植物油五种基质中，三种化合物添加水平在0.20 mg/kg ~ 5.0 mg/kg时，回收率介于88.4% ~ 99.6 %，相对标准偏差（RSD）介于1.8 % ~ 4.8 %；在液体乳基质中添加水平在0.08 mg/kg ~ 2.0 mg/kg时，回收率介于94.5 % ~ 99.6 %，相对标准偏差（RSD）介于2.7 % ~ 4.6 %，均满足分析方法要求，如表4。
表4甲基香兰素、香兰素和乙基香兰素在六种基质中的添加回收率和相对标准偏差（n=6）
（3）定量限和检出限
当乳粉、婴幼儿谷类辅助食品、稀奶油、植物油和大米5种基质中添加浓度为0.20mg/kg，液体乳添加浓度为0.08 mg/kg时，香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素三种物质的平均回收率在91.2 % ~ 99.6 %，此时每种化合物的定量离子的信噪比（S/N）均≥10；分别在乳粉、婴幼儿谷类辅助食品、稀奶油、植物油和大米5种基质中添加浓度为0.20 mg/kg，液体乳添加浓度为0.07 mg/kg时，三种化合物的定量离子的信噪比（S/N）均≥3。考虑到三种化合物在不同品牌和型号的质谱仪存在响应差异，所以将方法的检出限（LOD）定为液体乳0.03 mg/kg，其它5种基质定为0.07 mg/kg，将方法的检出限（LOQ）定为液体乳0.08 mg/kg，其它5种基质定为0.20 mg/kg。
实例3、液体乳实际样品检测
（1）溶液的配制
①衍生试剂溶液：丙酸酐-吡啶（1+1，体积比）溶液：吸取1 mL丙酸酐和1 mL吡啶混匀（保存期不宜超过5天）；
②饱和氯化钠水溶液：称取氯化钠 200 g，加水500 mL，超声使其充分溶解；
（2）标准溶液的配制
①配制标准储备溶液：分别准确称取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素0.1g（精确至0.000 1g）的标准物质于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，分别得到1 mg/mL的标准储备溶液。避光于-18℃保存，保存期为6个月。
②配制混合标准使用溶液：分别吸取上述三种标准储备液1.00 mL于同一10 mL容量瓶中，用乙腈释到刻度配制成浓度为100 μg/mL的标准工作溶液，避光于-18℃保存，保存期为1个月。
（3）样品制备
液体样品混匀即可。
（4）样品溶液的制备
称取液体乳（巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳等）样品5 g，加入10 mL乙腈，涡旋振荡30 s，在室温下超声提取20 min，再加入2 g氯化钠，剧烈摇振30 s，超声10 min，涡旋混匀，以5 000 r/min离心2 min，取上层提取液2 mL于具塞磨口玻璃离心管中，加入1 mL正己烷和20μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入200 mg无水硫酸镁并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜（0.22 μm，有机相）过滤后待测。
（5）气相色谱-质谱仪器条件
色谱柱：DB-35MS石英毛细管柱，30 m×0.32 mm（i.d），膜厚0.25 μm，或相当者；
色谱柱温度：100 ℃起始，以12 ℃/min升至 220 ℃，再以30 ℃/min升至 280 ℃（保持5 min）；
进样口温度：230 ℃；
色谱-质谱接口温度：280 ℃；
载气：氦气，纯度大于等于99.999 %，1.5 mL/min；
进样量：1 μL；
进样方式：不分流进样，0.75 min后开阀；
所述的质谱条件如下：
电离方式：EI。
检测方式：选择离子监测方式（SIM）。
溶剂延迟：3.0 min。
电离能量:70 eV
监测离子（m/z）：定量、定性离子和监测时间分组见表1。
表1香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的定量、定性离子和监测时间表
（6）标准工作曲线制作
采用与上述相同处理方法对空白基质进行处理（不加衍生试剂），用处理后的空白基质溶液将混合标准溶液稀释为0.04 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL标准系列工作溶液，各取1 mL，加入20 μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以每种化合物的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
（7）样品测定
①定性分析：将样品溶液按照和标准工作溶液相同的仪器条件进行测定。若试样中检出的色谱峰的保留时间与相应标准物质色谱峰的保留时间一致，允许偏差小于±0.05min；扣除本底后试样中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。
表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
②定量分析：记录样品溶液中各目标化合物的定量离子的峰面积，根据标准曲线得到待测液中各组分的浓度。试样中各待测组分的响应值应在标准曲线的线性响应范围内，如果含量超出范围，则重新取样分析，将衍生前的样品提取液用乙腈稀释后再进行衍生和测定。
（8）结果计算：
计算公式：
……………………………………(1)
式（1）中：
X —样品中待测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
c—从标准曲线中读出的测定液中各待测组分的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
m —试样称取的质量，单位为克（g）；
V —试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）。
实例4、大米实际样品检测
（1）溶液的配制
同实例3。
（2）标准溶液的配制
同实例3。
（3）样品制备
将样品粉碎至全部通过使其全部可以通过425 μm的标准网筛。
（4）样品溶液的制备
称取2 g预处理的样品，加入5 mL水，再加入10 mL乙腈，涡旋振荡30 s，在室温下超声提取20 min，再加入2g氯化钠，剧烈摇振30 s，超声10 min，涡旋混匀，以5 000 r/min离心2 min，取上层提取液2 mL于具塞磨口玻璃离心管中，加入1 mL正己烷和20 μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入200 mg无水硫酸镁并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜（0.22 μm，有机相）过滤后待测。
（5）气相色谱-质谱仪器条件
同实例3。
（6）标准工作曲线制作
采用与上述相同处理方法对空白大米基质进行处理（不加衍生试剂），用处理后的空白基质溶液将混合标准溶液稀释为0.04 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL标准系列工作溶液，各取1 mL，加入20 μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以每种化合物的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
（7）样品测定
①定性分析：将样品溶液按照和标准工作溶液相同的仪器条件进行测定。试样中检出保留时间与香兰素标准物质色谱峰的保留时间一致的物质；扣除本底后试样该峰的离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中香兰素的离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，判定样品中存在香兰素。
②定量分析：记录样品溶液中香兰素的定量离子的峰面积，根据标准曲线得到该物质的浓度为0. 06612 μg/mL。
（8）结果计算：
。
实例5、植物油（芝麻油）实际样品检测
（1）溶液的配制
同实例3。
（2）标准溶液的配制
同实例3。
（3）样品制备
均匀液体无需处理。
（4）样品溶液的制备
称取1 g试样于玻璃离心管中，加入1 mL饱和氯化钠溶液和5 mL乙腈，涡旋混合30s，在-18 ℃下冷冻20 min，以5 000 r/min离心1min，取上层提取液2 mL于具塞磨口玻璃离心管中，加入1 mL正己烷和20μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入200 mg无水硫酸镁并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜（0.22 μm，有机相）过滤后待测。
（5）气相色谱-质谱仪器条件
同实例3。
（6）标准工作曲线制作
采用与上述相同处理方法对空白植物油基质进行处理（不加衍生试剂），用处理后的空白基质溶液将混合标准溶液稀释为0.04 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL标准系列工作溶液，各取1 mL，加入20 μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以每种化合物的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
（7）样品测定
①定性分析：将样品溶液按照和标准工作溶液相同的仪器条件进行测定。试样中检出保留时间与香兰素标准物质色谱峰的保留时间一致的物质；扣除本底后试样该峰的离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中香兰素的离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，判定样品中存在香兰素。
②定量分析：记录样品溶液中香兰素的定量离子的峰面积，根据标准曲线得到该物质的浓度为0. 17223 μg/mL。
（8）结果计算：
。
实例6、婴幼儿配方乳粉实际样品检测
（1）溶液的配制
同实例3。
（2）标准溶液的配制
同实例3。
（3）样品制备
均匀液体无需处理。
（4）样品溶液的制备
称取2 g预处理的样品，加入5 mL水，再加入10 mL乙腈，涡旋振荡30 s，在室温下超声提取20 min，再加入2g氯化钠，剧烈摇振30 s，超声10 min，涡旋混匀，以5 000 r/min离心2 min，取上层提取液2 mL于具塞磨口玻璃离心管中，加入1 mL正己烷和20 μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入200 mg无水硫酸镁并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜（0.22 μm，有机相）过滤后待测。
（5）气相色谱-质谱仪器条件
同实例3。
（6）标准工作曲线制作
采用与上述相同处理方法对空白乳粉基质进行处理（不加衍生试剂），用处理后的空白基质溶液将混合标准溶液稀释为0.04 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL标准系列工作溶液，各取1 mL，加入20 μL衍生试剂溶液并涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以每种化合物的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
（7）样品测定
①定性分析：将样品溶液按照和标准工作溶液相同的仪器条件进行测定。试样中检出保留时间与香兰素标准物质色谱峰的保留时间一致的物质；扣除本底后试样该峰的离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中香兰素的离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，判定样品中存在香兰素。
②定量分析：记录样品溶液中香兰素的定量离子的峰面积，根据标准曲线得到该物质的浓度大于20 μg/mL，超出仪器线性范围，应稀释后重新衍生测定。采用空白基质稀释10倍后重新衍生后测定，用工作曲线定量得测定液中香兰素浓度为2.52125 μg/mL。
（8）结果计算：
。
本发明中涉及的三种化合物的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量和结构式如下表：
。
Claims (1)
1.一种同时测定食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的方法，其特征在于：所述的食品为粮谷食品或婴幼儿配方食品或液体乳或稀奶油或植物油液态食品，首先将食品中香兰素和乙基香兰素衍生为丙酸酯后进行测定，步骤如下：
（1）溶液的配制
①衍生试剂溶液：取丙酸酐和吡啶，按体积比1∶1的比例混匀；
②饱和氯化钠水溶液：称取氯化钠，然后加水，利用超声方式使氯化钠充分溶解，氯化钠与水的用量比为：200g∶500mL；
（2）标准溶液的配制
①配制标准储备溶液：称取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素三种标准物质分别置于容量瓶中，均用乙腈定容至刻度，分别得到1mg/mL的香兰素标准储备溶液、甲基香兰素标准储备溶液、乙基香兰素标准储备溶液，并且避光于-18℃保存；
②配制混合标准使用溶液：分别吸取上述三种标准储备液于同一容量瓶中，用乙腈释到刻度，配制成浓度为100μg/mL的混合标准使用溶液，避光于-18℃保存；
（3）样品制备
将被测的固态食品样品粉碎成粉末，并且使其全部通过425 μm的标准网筛，或者将液态食品样品混匀；
（4）样品溶液的制备
将粮谷类食品或婴幼儿配方食品加水，再加入乙腈，食品、水、乙腈的用量比为2 g∶5mL∶10 mL，涡旋振荡30 s，在室温下超声提取20 min；再加入氯化钠，氯化钠与食品的用量比为1∶1，剧烈摇振30 s，超声10 min，涡旋混匀，以5 000 r/min离心2 min，取上层提取液于具塞磨口玻璃离心管中，加入正己烷和衍生试剂溶液，提取液与正己烷、衍生试剂溶液的用量比为2 mL∶1 mL∶20 μL，涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入无水硫酸镁后涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，提取液与无水硫酸镁的用量比为1mL∶100 mg，取下层乙腈用微孔滤膜过滤后待测；所述的微孔滤膜为0.22 μm有机相滤膜；
所述的粮谷类食品包括大米和小麦粉，婴幼儿配方食品包括乳粉和米粉；
或者将液体乳加入乙腈，液体乳与乙腈的用量比为5 g∶10 mL，涡旋振荡30 s，在室温下超声提取20 min，再加入氯化钠，液体乳与氯化钠的用量比为5 g∶2 g，剧烈摇振30 s，超声10 min，涡旋混匀，以5 000 r/min离心2 min，取上层提取液于具塞磨口玻璃离心管中，加入正己烷和衍生试剂溶液，提取液与正己烷和衍生试剂溶液的用量比为 2 mL∶1 mL∶20μL，涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入无水硫酸镁，提取液与无水硫酸镁的用量比为1mL∶100 mg 并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜过滤后待测，所述的微孔滤膜为0.22 μm有机相滤膜；
所述的液体乳为巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳；
或者将稀奶油加入乙腈，稀奶油与乙腈的用量比为2 g∶10 mL，涡旋振荡30 s，在室温下超声提取20 min，再加入氯化钠，稀奶油与氯化钠的用量比为5 g∶2 g，剧烈摇振30 s，超声10 min，涡旋混匀，以5 000 r/min离心2 min，取上层提取液于具塞磨口玻璃离心管中，加入正己烷和衍生试剂溶液，提取液与正己烷和衍生试剂溶液的用量比为 2 mL∶1 mL∶20μL，涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后加入无水硫酸镁，提取液与无水硫酸镁的用量比为1mL∶100 mg 并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜过滤后待测，所述的微孔滤膜为0.22 μm有机相滤膜；
或者将植物油置于玻璃离心管中，加入饱和氯化钠溶液和乙腈，植物油、饱和氯化钠溶液、乙腈的用量比为1 g∶1 mL∶5 mL，涡旋混合30 s，在-18 ℃下冷冻20 min，以5 000 r/min离心1min，取上层提取液于具塞磨口玻璃离心管中，加入正己烷和衍生试剂溶液，提取液、正己烷、衍生试剂溶液的用量比为2 mL∶1 mL∶20μL，涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10min，冷却至室温后加入无水硫酸镁，提取液与 无水硫酸镁的用量比为2 mL∶200 mg，并涡旋混合20 s，以5 000 r/min离心1 min，取下层乙腈用微孔滤膜过滤后待测，所述的微孔滤膜为0.22 μm有机相滤膜；
（5）气相色谱-质谱仪器条件
色谱柱：DB-35MS石英毛细管柱，30 m0.32 mm（i.d），膜厚0.25 μm；
色谱柱温度：100 ℃起始，以12 ℃/min升至 220 ℃，再以30 ℃/min升至 280 ℃，保持5 min；
进样口温度：230 ℃；
色谱-质谱接口温度：280 ℃；
载气：氦气，纯度大于等于99.999 %，1.5 mL/min；
进样量：1 μL；
进样方式：不分流进样，0.75 min后开阀；
所述的质谱条件如下：
电离方式：EI；
检测方式：选择离子监测方式（SIM）；
溶剂延迟：3.0 min；
电离能量:70 eV
监测离子（m/z）：定量、定性离子和监测时间分组如表1：
表1香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的定量、定性离子和监测时间表
（6）标准工作曲线制作
采用与上述相同处理方法对空白基质进行处理，不加衍生试剂，用处理后的空白基质溶液将混合标准溶液稀释为0.04μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、1.0 μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL标准系列工作溶液，并且分别取标准系列工作溶液加入衍生试剂溶液，标准系列工作溶液与衍生试剂溶液的用量比为1 mL∶20 μL，并且涡旋混合10 s，在 60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以每种化合物的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；
（7）样品测定
①定性分析：将样品溶液按照和标准工作溶液相同的仪器条件进行测定；若试样中检出的色谱峰的保留时间与相应标准物质色谱峰的保留时间一致，允许偏差小于±0.05min；扣除本底后试样中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差在表2规定的范围之内，可判定样品中存在对应的待测物；
表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
②定量分析：记录样品溶液中各目标化合物的定量离子的峰面积，根据标准曲线得到待测液中各组分的浓度；试样中各待测组分的响应值应在标准曲线的线性响应范围内，如果含量超出范围，重新取样分析，将衍生前的样品提取液用乙腈稀释后再进行衍生和测定；
（8）结果计算：
计算公式：
……………………………………(1)
式（1）中：
X —样品中待测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
c—从标准曲线中读出的测定液中各待测组分的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
m —试样称取的质量，单位为克（g）；
V —试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）。
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